Derivation of a stable SH-SY5Y cell line expressing the fusion gene that encodes dopamine receptor D2S and mCherry fluorescent protein with the use of the Sleeping Beauty transposon system

Celem niniejszej pracy było wyprowadzenie stabilnej linii komórkowej SH-SY5Y, wykazującej ekspresję genu fuzyjnego kodującego izoformę krótką receptora dopaminowego oraz fluorescencyjne białko mCherry, z wykorzystaniem transpozonowego systemu transferu genów Sleeping Beauty oraz wizualizacja komórek z zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej.Gen DRD2 koduje transbłonowy receptor sprzężony z białkami G, zaś mutacje w jego sekwencji wiąże się ze schizofrenią, dlatego też receptor ten mógłby być celem podczas leczenia tej choroby. Z kolei komórki linii SH-SY5Y (neuroblastoma) wykazują ekspresję receptorów adrenergicznych oraz dopaminergicznych, a także charakteryzują się zdolnością do różnicowania pod wpływem kwasu retinowego – przybierają neuronopodobny fenotyp i wytwarzają neuryty, co sprawia, że są szeroko stosowanym modelem neuronalnym.W pracy wykorzystano transpozonowy system transferu genów Sleeping Beauty, ponieważ pozwala on na integrację genu z genomem gospodarza, przy pomocy transpozonów klasy drugiej, co pozwoliło na uzyskanie linii komórkowej wykazującej stabliną ekspresję wprowadzonego genu fuzyjnego. Integrację umożliwiła kontransfekcja dwoma plazmidami: zawierającym interesujący nas gen (ekspresja konstytutywna lub indukowalna) oraz kodującym transpozazę. W transfekowanych komórkach wykazano obecność białka fuzyjnego wykorzystując fluorescencyjne właściwości białka mCherry. Ponadto, przy użyciu barwników zwizualizowano jądra komórkowe oraz β-3-tubulinę, będącą markerem neuronalnym.

The aim of this study was to derive a stable SH-SY5Y cell line expressing the fusion gene that encodes the short isoform of the dopamine receptor and mCherry fluorescent protein with the use of the Sleeping Beauty transposon system, and to visualise the cells with fluorescent microscopy.Gene DRD2 encodes a G-protein coupled transmembrane receptor, and mutations in its sequence are associated with schizophrenia. Therefore, the receptor could be a target in the treatment of this disease. SH-SY5Y (neuroblastoma) cells express adrenergic and dopaminergic receptors and possess the ability to differentiate under the influence of retinoic acid – they take on a neuron-like phenotype and produce axons, which makes them a widely used neuronal model.The Sleeping Beauty transposon system was used in this study as it allows to integrate the gene with the host’s genome with the use of class II transposons, which allowed to generate a cell line with a stable expression of the fusion gene. The integration was made possible by co-transfection with two plasmids: one containing the gene of interest (constitutive or inducible expression) and the other, which encodes transposase.The presence of the fusion protein in the transfected cells was evidenced with the fluorescent properties of the mCherry protein, whereas the nuclei and the β-3-tubulin (which is a neuronal marker) were visualised with the use of fluorescent dyes.