Mateusz Jeż Rola oksygenazy hemowej-1 w kardiomiocytach otrzymanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Promotor: prof. dr hab. Józef Dulak Promotor pomocniczy: dr Jacek Stępniewski Rozprawa doktorska przygotowana w Zakładzie Biotechnologii Medycznej Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Kraków 2021 Podziękowania Serdecznie dziękuję mojemu promotorowi, prof. dr. hab. Józefowi Dulakowi za nieocenione merytoryczne wsparcie, ogromną cierpliwość i nieustanną inspirację, które okazywał podczas realizacji doświadczeń składających się na tę pracę doktorską oraz w trakcie jej pisania. Serdeczne podziękowania kieruję także do dr. Jacka Stępniewskiego, mojego promotora pomocniczego za ogromne pokłady cierpliwości i wyrozumiałości, nieustającą pomoc, zarówno merytoryczną jaki i praktyczną, oraz ogromne wsparcie podczas trwania całego doktoratu. Ogromne wyrazy podziękowania kieruję do prof. dr hab. Alicji Józkowicz za wiele cennych uwag oraz nieustające wsparcie i życzliwości od studiów licencjackich, do końca studiów doktoranckich. Specjalne podziękowania kieruję do dr Macieja Cieśli za cierpliwe wprowadzenie do świata nauki oraz bycie inspiracją. Wyrazy wdzięczności kieruję również do prof. dr. hab. Mariana H. Lewandowskiego oraz całego zespołu Zakładu Neurofizjologii i Chronobiologii, Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych, UJ, oraz dr Ewelinie Pośpiech z Małopolskiego Centrum Biotechnologii za owocną współpracę naukową. Chciałbym również podziękować koleżankom i kolegom z Zakładu Biochemii Komórki oraz Zakładu Biochemii Ogólnej. Wyrażam wielką wdzięczność wszystkim Pracownikom (obecnym i byłym), Doktorantom oraz Studentom Zakładu Biotechnologii Medycznej za ogromną pomoc w wykonywaniu doświadczeń, za życzliwość i miłą atmosferę pracy oraz za wszystkie rady i wskazówki, których mi udzielali przez wszystkie lata mojej pracy w Zakładzie. Szczególnie gorąco chciałbym podziękować dr. Krzysztofowi Szade, dr Neli Kachamkovej-Trojanowskiej, dr. Mateuszowi Tomczykowi, dr. Witoldowi Nowakowi, dr Karolinie Bukowskiej-Strakovej, dr Agacie Szade, dr. Szymonowi Czaudernie, Oldze Mucha, Izabeli Kraszewskiej, Alicji Martyniak, oraz Kalinie Andrysiak. Dziękuję bardzo Joannie Uchto-Bajołek, Agnieszce Andrychowicz-Róg oraz Ewie Werner i Karolinie Hajduk za pomoc administracyjną i techniczną bez której wiele spraw nie doczekałoby się pomyślnego końca. Dziękuję mojej Rodzinie oraz Narzeczonej, bez których wsparcia i motywacji nie powstałaby niniejsza praca doktorska. Finansowanie Badanie prezentowane w rozprawie były realizowane ze środków Narodowego Centrum Nauki w ramach projektu ”The role of Heme Oxygenase-1 in cardiomyocyte differentiation from induced pluripotent stem cells (HMOX-CARD)” HARMONIA (2014/14/M/NZ1/00010) oraz “Molekularne mechanizmy niewydolności serca w dystrofii mięśniowej Duchenne'a i Beckera” MAESTRO (10-2018/30/A/NZ3/00412), a także ze środków Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego przyznanych WBBiB UJ na działalność służącą rozwojowi młodych naukowców i uczestników studiów doktoranckich, w ramach projektu „Rola ROS oraz oksygenazy hemowej-1 (HO-1) w proliferacji oraz binukleacji kardiomiocytów” Spis treści 1. Wykaz stosowanych skrótów ........................................................................................ 8 2. Streszczenie ................................................................................................................. 10 3. Abstract ....................................................................................................................... 12 4. Wstęp .......................................................................................................................... 15 4.1. Komórki macierzyste .......................................................................................... 15 4.1.1. Typy komórek macierzystych ......................................................................... 16 4.2. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste............................................ 17 4.2.1. Zastosowanie iPSC.......................................................................................... 19 4.2.2. Zastosowanie hiPSC w medycynie spersonalizowanej ................................... 20 4.2.3. Zastosowanie hiPSC w medycynie regeneracyjnej ......................................... 21 4.2.4. Różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów ....................................................... 23 4.2.5. Charakterystyka hiPSC-CM ............................................................................ 25 4.2.6. Podsumowanie hiPSC-CM: wady i zalety niedojrzałego fenotypu ................ 27 4.3. Oksygenaza hemowa-1 ....................................................................................... 30 4.3.1. Wpływ HO-1 na komórki macierzyste oraz progenitorowe ........................... 31 4.3.2. Wpływ braku HO-1 na rozwój zarodkowy ..................................................... 32 4.3.3. Regulacja ekspresji HO-1 u ludzi.................................................................... 33 4.3.4. Wpływ HO-1 na różnicowanie komórek macierzystych do kardiomiocytów 34 5. Cele pracy ................................................................................................................... 35 6. Materiały i metody ...................................................................................................... 36 6.1. Wyprowadzanie linii hiPSC ................................................................................ 36 6.2. Hodowla hiPSCs ................................................................................................. 37 6.2.1. Opłaszczanie płytek hodowlanych macierzą zewnątrzkomórkową ................ 38 6.2.2. Zmiana pożywki i pasaż .................................................................................. 38 6.2.3. Inhibitor ROCK ............................................................................................... 38 6.2.4. Pożywki hodowlane hiPSC ............................................................................. 39 6.3. Ciałka zarodkowe i spontaniczne różnicowanie ................................................. 40 6.4. Stabilne wyciszanie HO-1 w hiPSC .................................................................... 42 6.4.1. Wyciszanie poprzez stabilną inhibicję transkryptu HMOX1 (shRNA) ........... 42 6.4.2. CRISPR/Cas9 .................................................................................................. 43 6.4.2.4. Elektroforeza DNA ......................................................................................... 45 6.5. Różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów ........................................................... 45 6.5.1. PSC Cardiomyocyte Differentiation Prototype ............................................... 45 6.5.2. Metoda z użyciem małocząsteczkowych inhibitorów (GiWi) ........................ 45 6.6. Selekcja kardiomiocytów .................................................................................... 46 6.6.1. PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit ..................................................... 46 6.6.2. Selekcja metaboliczna ..................................................................................... 47 6.7. Analiza wydajności różnicowania metodą cytometrii przepływowej ................. 48 6.7.1. Analiza wydajności różnicowania z farmakologiczną modulacją aktywności HO-1 ......................................................................................................................... 50 6.8. Barwienia immunofluorescencyjne ..................................................................... 50 6.9. Analiza ekspresji białek metodą Western Blot ................................................... 53 6.10. Izolacja RNA i odwrotna transkrypcja ................................................................ 54 6.11. Ilościowa analiza qRT-PCR ................................................................................ 54 6.12. Pomiar aktywność elektrofizjologicznej metodą whole-cell patch clamp .......... 56 6.13. Analiza transkryptomu RNA-Seq ....................................................................... 57 6.14. Seahorse XF - pomiar aktywności metabolicznej ............................................... 57 6.15. Pomiar aktywności błon mitochondrialnych ....................................................... 59 6.16. Ocena kariotypu .................................................................................................. 60 6.16.1. Analiza zmienności liczby kopii DNA ............................................................ 60 6.16.2. Analiza kariotypu ............................................................................................ 60 6.17. Wykorzystane linie hiPSC .................................................................................. 61 6.18. Wykorzystane programy komputerowe i analiza statystyczna ........................... 62 7. Wyniki ......................................................................................................................... 63 7.1. Charakterystyka uzyskanych komórek hiPSC .................................................... 63 7.1.1. Morfologia ...................................................................................................... 63 7.1.2. Ekspresja markerów specyficznych dla hESC ................................................ 63 7.1.3. Spontaniczne różnicowanie ............................................................................. 64 7.2. Optymalizacja różnicowania hiPSC do kardiomiocytów .................................... 67 7.2.1. Metoda PSC .................................................................................................... 67 7.2.2. Metoda GiWi ................................................................................................... 67 7.3. Wyciszenie HO-1 za pomocą shRNA i wpływ na wydajność różnicowania ...... 68 7.4. Wpływ SnPP, CoPP i heminy na wydajność różnicowania ................................ 71 7.5. Wyłączenie HMOX1 za pomocą systemu CRISPR/Cas9 ................................... 72 7.6. Wpływ braku HO-1 na transkryptom hiPSC ....................................................... 77 7.7. Wpływ braku HO-1 na wydajność różnicowania................................................ 79 7.8. Wpływ braku HO-1 na spontaniczne różnicowanie – analiza markerów mezodermy i mezodermy sercowo-specyficznej............................................................ 79 7.9. Optymalizacja selekcji kardiomiocytów ............................................................. 81 7.9.1. PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit ..................................................... 81 7.9.2. Selekcja metaboliczna ..................................................................................... 81 7.10. Wpływ braku HO-1 na transkryptom hiPSC-CM ............................................... 83 7.11. Wpływ braku HO-1 na ekspresję kanałów jonowych w hiPSC-CM .................. 86 7.12. Elektrofizjologiczne pomiary potencjału czynnościowego metodą whole-cell patch clamp .................................................................................................................... 87 7.12.1. Pomiar hiPSC-CM HO-1 KO .......................................................................... 87 7.12.2. Pomiar hiPSC-CM WT stymulowanych CoPP ............................................... 88 7.12.3. Pomiar hiPSC-CM HO-1 KO stymulowanych CoPP ..................................... 89 7.12.4. Pomiar hiPSC-CM WT stymulowanych CORM ............................................ 91 7.12.5. Pomiar hiPSC-CM HO-1 KO stymulowanych CORM ................................... 91 7.13. Wpływ HO-1 na metabolizm hiPSC-CM ............................................................ 92 7.13.1. Pomiar konsumpcji tlenu – Seahorse .............................................................. 92 7.13.2. Pomiar aktywności błon mitochondrialnych - TMRM ................................... 94 7.14. Analiza rozmiaru i hiPSC-CM HO-1 KO ........................................................... 94 7.15. Ocena kariotypu .................................................................................................. 95 8. Dyskusja ...................................................................................................................... 96 8.1. Wykorzystane linie hiPSC .................................................................................. 96 8.2. Różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów i ich selekcja ..................................... 99 8.2.1. Selekcja kardiomiocytów .............................................................................. 101 8.3. Modulacja HO-1 nie wpływa na pluripotencję i wydajność różnicowania ....... 104 8.4. Indukcja HO-1 nie wpływa na metabolizm hiPSC-CM .................................... 107 8.5. Brak HO-1 wpływa na potencjał czynnościowy kardiomiocytów .................... 108 8.6. Potencjalny wpływ braku HO-1 na regenerację serca po zawale ..................... 112 8.6.1. Potencjalny wpływ braku HO-1 na bliznowacenie ....................................... 113 8.6.2. Potencjalny wpływ braku HO-1 w dłuższej perspektywie czasowej ............ 114 8.6.3. Regulacja ekspresji HO-1 u ludzi a zawał serca ........................................... 115 9. Wnioski ..................................................................................................................... 115 10. Bibliografia ............................................................................................................... 117 1. Wykaz stosowanych skrótów AFP ang. alpha fetoprotein, alfa fetoproteina B27+ins Suplement B27 z insuliną B27-ins Suplement B27 bez insuliny BSA ang. bovine serum albumin, albumina z surowicy bydlęcej CM ang. complete medium, pełna pożywka CNV ang. copy number variation, zmienność liczby kopii DNA CO ang. carbon monoxide, tlenek węgla CoPP Protoporfiryna IX kobaltu CORM2 ang. CO-releasing molecule II, Tricarbonyldichlororuthenium(II), związek uwalniający CO CRISPR ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, zgrupowane, regularnie rozproszone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromiczne DAPI 4',6-diamidyno-2-fenyloindol DMSO ang. dimethyl sulfoxide, dimetylosulfotlenek E6 ang. Essential 6, pożywka hodowlana E7 ang. Essential 7, pożywka hodowlana E8 ang. Essential 8, pożywka hodowlana EDTA ang. ethylenediaminetetraacetic acid, kwas etylenodiaminotetraoctowy EEF2 ang. eukaryotic elongation factor 2, eukariotyczny czynnik elongacyjny 2 ESC ang. embryonic stem cells, zarodkowe komórki macierzyste FACS ang. fluorescence activated cell sorting, sortowanie komórek aktywowane flurescencją FBS ang. fetal bovine serum, bydlęca surowica płodowa FCCP ang. Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone FGF ang. Fibroblast Growth Factor, czynnik wzrostu fibroblastów GATA ang. GATA binding protein, białko wiążące GATA G-CSF ang. granulocyte colony stimulating factor, czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów GiWi ang. GSK3b inhibition, Wnt inhibition GSK3β ang. Glycogen synthase kinase 3β, kinaza syntazy glikogenu 3β HEPES ang. 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid hESC ang. human embryonic stem cells, ludzkie zarodkowe komórki macierzyste HRE ang. hypoxia response element, element odpowiedzi na niedotlenienie hiPSC ang. human iPSC, ludzkie iPSC hiPSC-CM kardiomiocyty otrzymane z hiPSC HO-1 oksygenaza hemowa-1 HO-1 KO ang. HO-1 knock-out, komórki pozbawione HO-1 HSC ang. hematopoietic stem cells, hematopoetyczne komórki macierzyste iCORM ang. inactivated CORM, inaktywowany CORM IGF ang. insulin-like growth factor, insulinopodobny czynnik wzrostu IHD ang. ischemic heart disease, choroba niedokrwienna serca iPSC ang. induced pluripotent stem cells, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mESC ang. mousce ESC, mysie ESC miPSC ang. murine induced pluripotent stem cells, mysie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste MOI ang. multiplicity of infection, mnogość infekcji NFH ang. neurofilament heavy chain, łańcuch ciężki neurofilamentu OCT-3/4 ang. Octamer binding transcription factor -3/4), czynnik transkrypcyjny PBMC ang. peripheral blood mononuclear cells, monojądrzaste komórki krwi obwodowej PBS ang. phosphate buffered saline, buforowany fosforanami roztwór soli fizjologicznej PBST 0,05% Tween-20 w buforze PBS PFA paraformaldehyd PVA ang. polyvinyl alcohol, alkohol poliwinylowy ROCK ang. Rho-associated protein kinase, kinaza związana z białkiem Rho ROS ang. reactive oxygen species, reaktywne formy tlenu scr ang. scrambled, kontrola mieszana SDS ang. sodium dodecyl sulfate, dodecylosiarczan sodu sgRNA ang. single guide RNA, pojedyncze, przewodnie RNA SNP ang. single nucleotide polymorphism, polimorfizm pojedynczego nukleotydu SnPP Protoporfiryna IX cyny Sox2 ang. SRY-Box Transcription Factor 2, czynnik transkrypcyjny SSEA-4 ang. Stage-specific embryonic antigen-4 STEMCCA ang. stem cell cassette TGFβ1 ang. transforming growth factor β1, transformujący czynnik wzrostu β1 TMRM tetrametylorodamina TNNT2 ang. cardiac troponin T2, sercowo-specyficzna troponina T TRA ang. tumor-related antigen α-SMA ang. alpha smooth muscle actin, aktyna α mięśni gładkich shRNA ang. short hairpin RNA WT ang. wild type, komórki kontrolne qRT-PCR ang. quantitative real-time polymerase chain reaction, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym. 2. Streszczenie Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ang. human induced pluripotent stem cells – hiPSC) mogą być otrzymane z łatwo dostępnych komórek somatycznych, takich jak fibroblasty czy jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, uzyskanych od konkretnego pacjenta. hiPSC ze względu na morfologię oraz profil ekspresji genów przypominają ludzkie zarodkowe komórki macierzyste (ang. human embryonic stem cells – hESC). hiPSC, podobnie jak hESC, charakteryzują się również zdolnością do różnicowania do praktycznie wszystkich typów komórek, w tym do kardiomiocytów. Stwarza to zatem nieocenioną możliwość badania m.in. chorób serca o podłożu genetycznym oraz potencjału regeneracyjnego serca. Potrzebne jednak są dalsze badania w celu lepszego poznania procesu różnicowania hiPSC do kardiomiocytów (ang. hiPSC-derived cardiomyocytes – hiPSC-CM), zwłaszcza biorąc pod uwagę niedojrzały fenotyp tak uzyskanych komórek. Niemniej jednak, pomimo nie w pełni poznanej biologii różnicowania hiPSC do kardiomiocytów, tak uzyskane komórki są obecnie powszechnie stosowane m.in. w badaniach nad kardiotoksycznością leków. Jednym z enzymów, który może być kluczowy dla omawianego procesu jest oksygenaza hemowa-1 (HO-1, kodowana przez gen HMOX1). HO-1 jest cytoprotekcyjnym enzymem degradującym hem do tlenku węgla (CO), Fe2+ oraz biliwerdyny. Wykazano, że HO 1 wpływa na różnicowanie mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych, reguluje metabolizm w dorosłych mysich kardiomiocytach oraz ma wpływ na regenerację serca po zawale. Niemniej jednak wpływ HO-1 na kardiogenezę ani właściwości elektromechaniczne ludzkich kardiomiocytów nie został do tej pory opisany. Dlatego celem tej pracy było zbadanie roli HO 1 w różnicowaniu hiPSC do hiPSC-CM. Komórki hiPSC uzyskano poprzez reprogramowanie ludzkich fibroblastów oraz jednojądrzastych komórek z krwi obwodowej, z wykorzystaniem wektorów Sendai. Otrzymane w ten sposób linie wykazywały morfologię oraz ekspresję markerów charakterystycznych dla hESC, a także zdolność do różnicowania in vitro w kierunku komórek pochodzących z trzech listków zarodkowych. W celu sprawdzenia roli HO-1 w procesie kardiogenezy, w pierwszym etapie zoptymalizowano otrzymywanie hiPSC-CM wykorzystując dwie metody: komercyjnie dostępny zestaw pożywek oraz metodę opartą na związkach drobnocząsteczkowych regulujących ścieżkę sygnałową WNT (ang. GSK3β inhibition, WNT inhibition – GiWi). Przeprowadzone doświadczenia wykazały, że protokół GiWi bardziej nadaje się do doświadczeń z genetycznym wyciszeniem ekspresji HMOX1 za pomocą shRNA (ang. small hairpin RNA). W związku z tym w dalszych analizach zastosowano tę metodę. W pierwszej kolejności sprawdzono wpływ związków modulujących ekspresję i aktywność HO-1 na wydajność różnicowania hiPSC w kierunku hiPSC-CM. Otrzymane wyniki wskazywały jednak na brak oddziaływania badanego białka na ten proces. Brak różnic w wydajności różnicowania zaobserwowano również w przypadku genetycznego obniżenia ekspresji HMOX1 za pomocą shRNA anty-HMOX1 oraz całkowitego wyłączenia osiągniętego dzięki zastosowaniu technologii CRISPR/Cas9 (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Spontaniczne różnicowanie poprzez ciałka zarodkowe nie wykazało zmian w ekspresji markerów mezodermy i mezodermy sercowo-specyficznej w komórkach kontrolnych oraz pozbawionych HO-1, niemniej, w tych ostatnich nie zaobserwowano jednego z markerów mezodermy – wimentyny. Następnie, optymalizacja procesu selekcji kardiomiocytów pozwoliła na uzyskanie praktycznie czystej populacji hiPSC CM w każdym różnicowaniu, co przyczyniło się do powtarzalności pomiędzy doświadczeniami. Analiza pomiaru konsumpcji tlenu oraz aktywności błon mitochondrialnych nie wykazały zmian w metabolizmie hiPSC-CM po zastosowaniu aktywatora HO-1. Porównawcza analiza transkryptomu za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (RNA-seq) nie wykazała zmian pomiędzy niezróżnicowanymi hiPSC kontrolnymi (ang. Wild type – WT) oraz HO-1 KO hiPSC (ang. HO-1 knock-out hiPSC). Natomiast WT oraz HO-1 KO hiPSC-CM charakteryzowały się odmienną ekspresją ponad 1000 genów. Pięć pośród 15 najbardziej zmienionych procesów biologicznych było związanych z elektrofizjologią serca. Następnie analiza qRT-PCR potwierdziła podwyższony poziom kanału potasowego KCNQ1 w hiPSC-CM pozbawionych HO-1. Zwiększona ekspresja kanału potasowego KCNQ1 znalazła spodziewane odzwierciedlenie w aktywności elektrofizjologicznej HO-1 KO hiPSC-CM, co zostało wykazane za pomocą funkcjonalnej analizy patch-clamp. Niemniej jednak dokładniejsza analiza jednego z procesów biologicznych związanego z przewodnictwem w kardiomiocytach wykazała brak jednolitego kierunku w zmianach poziomu innych kanałów jonowych: pozostałe kanały potasowe charakteryzowały się obniżoną ekspresją, kanały wapniowe podwyższoną ekspresją, a w przypadku kanałów sodowych nie zaobserwowano żadnych prawidłowości. Sugeruje to zaburzoną regulację aktywności elektrofizjologicznej. Przeprowadzone badania nie wykazały istotnej roli HO-1 w procesie różnicowania hiPSC do hiPSC-CM. Inaczej niż w przypadku kardiomiocytów mysich Nie potwierdzono również wpływu HO-1 na metabolizm kardiomiocytów. Mogło to wynikać z istotnych różnic pomiędzy komórkami ludzkimi i mysimi. Analiza transkryptomu wykazała wpływ HO-1 na liczne procesy związane z potencjałem elektrofizjologicznym hiPSC-CM, co zostało następnie potwierdzone przez funkcjonalną analizę patch clamp. Dogłębna analiza transkryptomu wskazywała na możliwość wpływu HO-1 na proces regeneracji serca. Uzyskane wyniki wskazują na dalsze możliwe kierunki badań roli HO-1 w ludzkich kardiomiocytach. 3. Abstract Human induced pluripotent stem cells (hiPSC) can be generated from readily available somatic cells such as fibroblasts or peripheral blood mononuclear cells obtained from an individual patient. hiPSC, due to the morphology and gene expression profile, resemble human embryonic stem cells (hESC). hiPSC, like hESC, are also characterized by the ability to differentiate into virtually all cell types, including cardiomyocytes. Therefore, it creates an invaluable opportunity to study the regenerative potential of the heart. However, further studies are needed to better understand the differentiation process of hiPSC into cardiomyocytes (hiPSC-CM), particularly considering the immature phenotype of the obtained cells. Nevertheless, despite the not fully understood biology of hiPSC differentiation into hiPSC-CM, the cardiomyocytes obtained in this way are now widely used in studies on drug cardiotoxicity. One of the enzymes that may be crucial for this process is heme oxygenase-1 (HO-1, encoded by the HMOX1 gene). HO-1 is a cytoprotective enzyme that degrades heme to carbon monoxide (CO), Fe2+ and biliverdin. HO-1 has been shown to influence the cardiac differentiation of murine pluripotent stem cells, regulate metabolism in adult murine cardiomyocytes, and affect heart regeneration after infarction. However, the effect of HO-1 on cardiogenesis and the electromechanical properties of human cardiomyocytes has not been described so far. Therefore, the aim of this study was to investigate the role of HO-1 in the differentiation of hiPSC to cardiomyocytes. hiPSCs were generated by reprogramming human fibroblasts and peripheral blood mononuclear cells using Sendai vectors. Obtained hiPSC showed the morphology and expression of markers characteristic of hESC, as well as the ability to differentiate in vitro towards cells derived from three germ layers. In order to test the role of HO-1 in the cardiogenesis process, at first, cardiac differentiation of hiPSC was optimized using two methods: a commercially available set of media and a method based on small-molecule compounds regulating the WNT signal path (GiWi, GSK3β inhibition, WNT inhibition). Performed analyses showed that the GiWi protocol is more suitable for experiments with genetic silencing of HMOX1 expression with shRNA (small hairpin RNA). Therefore, this method was used in further experiments. First, the effect of compounds modulating the expression and activity of HO-1 on the efficiency of hiPSC differentiation towards hiPSC-CM was tested. The obtained results indicated no influence of HO-1 on the differentiation efficiency. No differences in differentiation efficiency were also observed in the case of genetic reduction of HMOX1 expression with anti-HMOX1 shRNA. The complete knock-out of HMOX1 was achieved through the CRISPR/Cas9 technology. Spontaneous differentiation through embryonic bodies showed no changes in the expression of mesoderm and cardiac-mesoderm markers. Interestingly, one of the mesoderm markers – vimentin was not observed in spontaneously differentiated embryonic bodies lacking HO-1. Subsequently, optimization of the cardiomyocyte selection process resulted in a virtually pure hiPSC-CM population at each differentiation, which contributed to reproducibility between experiments. Application of the HO-1 activator showed no effect of this enzyme on the metabolism of hiPSC-CM, as demonstrated by measurement of oxygen consumption rate and the activity of mitochondrial membranes. Comparative analysis of the transcriptome using next-generation sequencing (RNA-seq) showed no changes between undifferentiated control hiPSC (WT) and hiPSC HO-1 KO. On the other hand, the differentiated WT and HO-1 KO hiPSC-CM were characterized by over 1000 differentially expressed genes. Five of the 15 most altered biological processes were related to hiPSC-CM electrophysiology. Subsequently, qRT-PCR analysis confirmed the increased level of the KCNQ1 potassium channel in the HO-1 deficient hiPSC-CM which was then reflected in the electrophysiological activity of HO-1 KO hiPSC-CM, as demonstrated by functional patch clamp analysis. Nevertheless, a more detailed analysis of one of the biological processes related to cardiomyocyte conductivity revealed a lack of uniform direction in the changes in the level of other ion channels: the other potassium channels were characterized by decreased expression, calcium channels by increased expression, and no clear pattern was observed in the case of sodium channels. This suggests a disturbed regulation of electrophysiological activity in HO-1 KO hiPSC-CM. The conducted studies did not show a significant role of HO-1 in the differentiation process from hiPSC to hiPSC-CM. Unlike in murine cardiomiocytes, the effect of HO-1 on the metabolism of human cardiomyocytes has also not been confirmed. This could be due to significant differences between human and mouse cardiomiocytes. Transcriptome analysis showed that the absence of HO-1 affected numerous processes related to the electrophysiological potential of hiPSC-CM, which was confirmed by functional patch clamp analysis. An in-depth analysis of the transcriptome indicated a possible influence of HO-1 on the process of heart regeneration. The obtained results indicate further possible directions of research into the role of HO-1 in human cardiomyocytes. 4. Wstęp 4.1. Komórki macierzyste Komórki macierzyste są typem komórek pierwotnych, których cechami charakterystycznymi jest zdolność do samoodnowy oraz różnicowania do określonych typów komórek [1]. Termin „komórka macierzysta” pojawił się po raz pierwszy prawie pół wieku temu i dotyczył komórek krwiotwórczych [2]. Obecnie wiadomo, że komórki macierzyste występują w wielu typach tkanek w dorosłym organizmie i odpowiadają za ich regenerację oraz utrzymanie prawidłowej homeostazy. Aktywność ta jest możliwa dzięki asymetrycznym podziałom komórek macierzystych, w których trakcie jedna komórka potomna w dalszym ciągu wykazuje cechy komórki macierzystej, natomiast w drugiej komórce potomnej, pod wpływem np. zmiany niszy, następuje aktywacja szlaków sygnałowych odpowiedzialnych za różnicowanie i ostatecznie za wykształcenie wyspecjalizowanych funkcji, typowych dla danej tkanki. Alternatywną metodą podziałów, zapewniającą utrzymanie stałej puli komórek macierzystych, są podziały symetryczne. W tym przypadku obie komórki potomne zachowują cechy komórki macierzystej. W warunkach fizjologicznych zazwyczaj mamy do czynienia z oboma typami podziałów. W pierwszym etapie, gdy na skutek różnego rodzaju bodźców pojawia się ubytek w tkance, przeważają podziały asymetryczne. Zapewnia to możliwość względnie szybkiego zróżnicowania komórek i jej odnowy. Następnie, gdy homeostaza tkanki zostaje już przywrócona, zaczynają dominować podziały symetryczne, prowadzące do uzupełnienia puli komórek macierzystych [3]. Ze względu na dużą aktywność mitotyczną, komórki progenitorowe, wywodzące się z komórek macierzystych, są szczególnie wrażliwe na mutacje. W szczególności zaburzenie ścisłej kontroli proliferacji w warunkach patologicznych (np. transformacji nowotworowej), prowadzi do nadmiernych podziałów niewyspecjalizowanych komórek. Najczęstszymi nowotworami wywodzącymi się z komórek macierzystych są nowotwory krwi, ze względu na ich bardzo dużą aktywność – dziennie komórki hematopoetyczne produkują około 500 miliardów komórek krwi [4]. Rozwój choroby nowotworowej nie jest jedynym możliwym skutkiem dysfunkcji komórek macierzystych. W przypadku dystrofii mięśniowej Duchenne’a, mięśnie osób dotkniętych tą chorobą są osłabione ze względu na brak ekspresji białka dystrofiny, które jest kluczowe dla integralności włókien mięśniowych. Na stale pogarszający się obraz kliniczny pacjentów dodatkowo wpływ mają zaburzone podziały komórek satelitarnych mięśni, odpowiedzialnych za ich regenerację [5–7]. 4.1.1. Typy komórek macierzystych Definicję komórki macierzystej, opierającej się o zdolność do samoodnowy i odtwarzania wyspecjalizowanych komórek potomnych, spełnia wiele typów komórek. Mogą być one podzielone ze względu na zdolność do różnicowania na: • pluripotencjalne – mogą różnicować do komórek wywodzących się z trzech listków zarodkowych, jednak bez możliwości tworzenia łożyska. Przykładem są zarodkowe komórki macierzyste (ang. embryonic stem cells – ESC) [8], • multipotencjalne – zdolne do zróżnicowania do komórek, wywodzących się z jednego listka zarodkowego. Przykładem mogą być krwiotwórcze hematopoetyczne komórki macierzyste (ang. hematopoietic stem cells – HSC) [9], • unipotencjalne – zdolne do zróżnicowania tylko do jednego typu komórek. Przykładem są komórki satelitarne mięśni [10]. Co więcej, na szczycie tej hierarchii wymieniana jest zygota jako komórka totipotencjalna, która wykazuje zdolność do różnicowania do komórek wywodzących się z trzech listków zarodkowych, a także łożyska. Niemniej jednak zygota nie charakteryzuje się samoodnową, co jest kluczową cechą komórek macierzystych [11]. Komórki macierzyste można również podzielić ze względu na sposób ich pozyskiwania: • zarodkowe komórki macierzyste – pozyskiwane z węzła zarodkowego blastocysty [8], • somatyczne komórki macierzyste – pozyskiwane z dorosłego organizmu; multi-, bądź unipotencjalne – np. multipotencjalne HSC, lub unipotencjalne komórki satelitarne mięśni [10], • indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ang. induced pluripotent stem cells – iPSC) – komórki macierzyste o pluripotencjalnym fenotypie uzyskane na drodze odróżnicowania dorosłych komórek somatycznych [12,13]. Ze względu na największą wszechstronność ESC, są one najlepszym kandydatem do badań in vitro. Jednak w procesie pozyskiwania ludzkich ESC (ang. human ESC – hESC), zniszczeniu ulega zarodek, co rodzi uzasadnione wątpliwości natury etycznej. W związku z tym badania z wykorzystaniem hESC są zakazane w wielu państwach, w tym w Polsce [14,15]. Do badań in vitro nad procesem regeneracji ludzkiego organizmu mogą natomiast być wykorzystywane somatyczne komórki macierzyste. Dobrym przykładem są HSC. Opracowane zostały wydajne metody mobilizacji takich komórek z fizjologicznej niszy do krwioobiegu, co pozwala na ich pobranie i hodowlę in vitro, bądź wykorzystanie w terapii leczenia nowotworów krwi [16–18]. HSC charakteryzują się relatywnie łatwym sposobem izolacji, niemniej w przypadku somatycznych komórek macierzystych z innych tkanek, pojawia się problem dostępności, która wymaga zastosowania bardziej inwazyjnych metod. O ile pobranie komórek macierzystych skóry mogłoby się jedynie wiązać z lekkim dyskomfortem pacjenta, o tyle pobieranie komórek macierzystych mięśni lub innych organów wewnętrznych (np. mózgu), jest bardzo trudne w przypadku żywego organizmu. Uniemożliwia to przeprowadzenie badań in vitro w modelu ludzkim na dużą skalę. Oba wspomniane problemy - natury etycznej w przypadku ludzkich zarodków oraz dostępności w przypadku somatycznych komórek macierzystych pozyskiwanych z dorosłego organizmu, zostały rozwiązane dzięki przełomowej metodzie otrzymywania iPSC [12,13]. 4.2. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste W 1962 roku Sir John Gurdon opublikował przełomową pracę, w której opisał w modelu płazim (Xenopus) proces transplantacji jądra komórki somatycznej do pozbawionej jądra komórki jajowej, która była następnie w stanie rozwinąć się w pełni funkcjonalną kijankę [19]. Dużo bardziej medialnym kamieniem milowym w badaniach nad klonowaniem komórek somatycznych był przypadek owcy Dolly, otrzymanej w wyniku transplantacji jądra komórki somatycznej do pozbawionej jądra komórki jajowej ponad 30 lat po doświadczeniach opisanych przez Sir John’a Gurdon’a [20]. Z naukowego punktu widzenia, najważniejszymi wnioskami płynącymi ze wspomnianych badań jest fakt, że w trakcie specjalizacji, komórka somatyczna nie traci żadnej informacji genetycznej oraz nie dochodzi do nieodwracalnych zmian w chromosomach, które mogłyby być istotne dla ponownego rozwoju zarodkowego. Oprócz tego można było wnioskować, że w cytoplazmie komórek jajowych są obecne czynniki mające możliwość ponownego uruchomienia szlaków sygnałowych wyciszanych w trakcie różnicowania komórek somatycznych. Dlatego następnym krokiem była identyfikacja i zbadanie poszczególnych czynników transkrypcyjnych biorących udział w tym procesie. W ciągu kolejnych dwóch dekad badań zostały zidentyfikowane kluczowe czynniki odpowiadające za utrzymanie pluripotencjalnego fenotypu komórek macierzystych: Oct3/4 (ang. Octamer binding transcription factor 3/4) [21], Sox2 (ang. SRY-Box Transcription Factor-2) [22] oraz Nanog [23]. Również lepsze zrozumienie biologii nowotworów przyczyniło się do pogłębienia wiedzy na temat czynników transkrypcyjnych istotnych dla zachowania właściwości komórek macierzystych oraz ich proliferacji w hodowlach in vitro. Tymi czynnikami były: Stat3 [24], E-Ras [25], C-myc [26], Klf4 [27] oraz β-katenina [28]. Gdy już poznano szereg białek kluczowych dla komórek macierzystych, Shinya Yamanaka wraz z Kazutoshi Takahashi przystąpili do weryfikacji, które z nich mogą być kluczowe dla cofnięcia komórki somatycznej z powrotem do stadium pluripotencji, tak jak to miało miejsce w przypadku jądra komórki somatycznej w niezapłodnionym oocycie [19,20]. W 2006 roku wspomniana dwójka naukowców opublikowała wyniki swoich badań, w których przebadali łącznie 24 czynniki transkrypcyjne, mogące potencjalnie mieć wpływ na fenotyp komórek macierzystych. Po wprowadzeniu wszystkich 24 czynników do mysich fibroblastów otrzymali tak zwane indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. W następnym kroku, w żmudnym procesie stopniowego wykluczania czynników nieistotnych dla opisanej transformacji, otrzymano zestaw czterech białek pozwalających na otrzymanie iPSCs. Tak zwanymi czynnikami Yamanaki są: Oct3/4, Klf4, Sox2 oraz c-Myc. Proces przemiany w pełni zróżnicowanej komórki somatycznej do komórki macierzystej został nazwany reprogramowaniem. Co istotne, iPSC cechowały się podobną do ESC morfologią: miały okrągły kształt, relatywnie duże jądra komórkowe, małą zawartość cytoplazmy i rosły w charakterystycznych koloniach. Również analiza transkryptomu wykazała, że komórki te mają podobny do ESC profil ekspresji genów [12]. Opracowana technologia okazała się być uniwersalną i rok później, wykorzystując czynniki Yamanaki, otrzymano ludzkie iPSC (ang. human iPSC- hiPSC)[13]. Sir John Gurdon udowodnił, że zróżnicowana komórka somatyczna, w odpowiednich warunkach, może zostać cofnięta do stadium komórki macierzystej. Natomiast badania Shinya Yamanaki były zwieńczeniem zapoczątkowanych pięć dekad wcześniej prac nad plastycznością komórek somatycznych. Japoński naukowiec wskazał, które czynniki były kluczowe dla procesu reprogramowania, oraz, co również niezwykle istotne, przeprowadził go w warunkach in vitro. Doniosły charakter omawianych odkryć został doceniony przez społeczność naukową, co przełożyło się na przyznanie nagrody Nobla obu naukowcom w 2012 roku w dziedzinie fizjologii lub medycyny za ich wkład w rozwój badań nad komórkami macierzystymi. 4.2.1. Zastosowanie iPSC Komórki iPSC, podobnie jak ESC, znajdują szereg zastosowań w badaniach podstawowych umożliwiających poznanie molekularnych mechanizmów rozwoju poszczególnych tkanek, w badaniach chorób o podłożu genetycznym czy też w testowaniu nowych leków pod względem toksykologicznym. Oprócz użyteczności w analizach, które wcześniej były prowadzone przy wykorzystaniu ESC, opracowanie metody otrzymywania iPSC otworzyło zupełnie nowe możliwości. Po pierwsze, brak potrzeby niszczenia ludzkiego zarodka w celu pozyskania ludzkich komórek pluripotencjalnych rozwiązał problemy natury etycznej. Odtąd badania nad takimi komórkami mogły być prowadzone w krajach, w których praca z ESC jest prawnie zakazana, w tym w Polsce [14,15]. Kolejnym istotnym aspektem technologii iPSC, jest łatwość w pozyskiwaniu materiału biologicznego do reprogramowania. Pobranie fragmentu skóry w celu izolacji fibroblastów jest techniką mało inwazyjną. Dodatkowo dalsze badania w tym obszarze skutkowały opracowaniem wydajnych protokołów umożliwiających użycie relatywnie niewielkiej liczby monojądrzastych komórek krwi obwodowej (ang. peripherial blood mononuclear cells – PBMC) do otrzymania iPSC [29]. Stwarza to możliwość łatwego uzyskania komórek somatycznych, nadających się do reprogramowania, od konkretnego pacjenta. Opisano nawet metodę reprogramowania komórek nabłonka izolowanych z moczu [30]. Możliwość wyprowadzenia hiPSC z łatwych do izolacji komórek stworzyło z kolei zupełnie nowe możliwości w badaniach nad wykorzystaniem komórek macierzystych w medycynie spersonalizowanej oraz medycynie regeneracyjnej. 4.2.2. Zastosowanie hiPSC w medycynie spersonalizowanej ESC, po zróżnicowaniu do pożądanego typu komórek, mogą być stosowane do badań nad chorobami o znanym podłożu genetycznym – przy zastosowaniu narzędzi inżynierii genetycznej [np. CRISPR/Cas9 (ang. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – zgrupowane, regularnie rozproszone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromiczne) [31]] istnieje możliwość wprowadzenia specyficznych zmian w genach odpowiedzialnych za rozwój badanej choroby, a następnie przeprowadzenie doświadczeń na tak uzyskanych komórkach. W przypadku chorób o nieznanej etiologii genetycznej, takie podejście z wykorzystaniem ESC jest niemożliwe. Technologia iPSC, natomiast, umożliwia otrzymanie komórek macierzystych z identycznym obciążeniem genetycznym, co u pacjenta. Znajduje to zastosowanie zwłaszcza w badaniu chorób neurologicznych o nieznanej, wielogenowej etiologii, takich jak autyzm czy schizofrenia [32–34]. Kolejnym atutem iPSC jest fakt, że badania mogą być prowadzone na komórkach o specyficznym dla pacjenta podłożu genetycznym, co pozwala na dobranie optymalnej strategii leczenia dla konkretnej osoby. Możliwość zróżnicowania hiPSC do kardiomiocytów (ang. hiPSC-derived cardiomyocytes – hiPSC-CM), z drugiej strony, może znaleźć zastosowanie w badaniach nad kardiotoksycznością powszechnie stosowanych chemoterapeutyków [35]. Jednym z szeroko badanych w takim kontekście związków jest doksorubicyna, używana w terapii nowotworów piersi. U części pacjentek leczonych doksorubicyną dochodzi do uszkodzenia mięśnia sercowego [36], niemniej nie są znane dokładne molekularne mechanizmy odpowiedzialne za rozwinięcie się kardiotoksyczności jedynie u niektórych kobiet. W związku z tym, niemożliwym jest wcześniejsze wytypowanie osób, o podwyższonym ryzyku uszkodzenia serca na skutek terapii omawianym związkiem. Wykorzystanie hiPSC-CM specyficznych dla pacjentek, u których doszło do rozwoju kardiomiopatii wywołanej doksorubicyną, pozwoliło zaobserwować, że komórki te są bardziej podatne na cytotoksyczne właściwości tego związku w porównaniu z kontrolą [37]. Tego typu badania mają na celu zidentyfikowanie charakterystycznych markerów, których to analiza przed rozpoczęciem terapii pozwoli na przewidzenie możliwości uszkodzenia serca i umożliwi dobranie terapii przeciwnowotworowej tak, aby zminimalizować efekty uboczne. 4.2.3. Zastosowanie hiPSC w medycynie regeneracyjnej Szacuje się, że w 2015 roku na choroby układu sercowo-naczyniowego chorowało prawie pół miliarda ludzi [38]. Pośród chorób związanych z układem krwionośnym, choroba niedokrwienna serca (ang. ischemic heart diseases – IHD) jest jedną z głównych przyczyn zgonów w krajach rozwiniętych [39]. IHD rozwija się na skutek zaburzonego przepływu krwi w mięśniu sercowym, co prowadzi do niedotlenienia komórek serca. W skrajnych przypadkach, gdy pojawia się zator w tętnicy wieńcowej, część mięśnia sercowego odcięta jest od dopływu tlenu i dochodzi do zawału mięśnia sercowego. W jego następstwie obumiera nawet do miliarda kardiomiocytów, co stanowi około 25% wszystkich kardiomiocytów w lewej komorze serca [40]. W wyniku utraty tak dużej liczby komórek oraz faktu, że ludzkie serce ma jedynie znikome zdolności regeneracyjne, dochodzi do trwałego uszkodzenia mięśnia sercowego [41]. Pozostała część serca wystawiona zostaje w konsekwencji na zwiększone obciążenie, co prowadzi ostatecznie do niewydolności tego narządu. Pomimo stosowania nowoczesnej farmakoterapii, często pacjenci nie są w stanie powrócić do normalnego funkcjonowania w społeczeństwie. U takich osób może rozwinąć się zagrażająca życiu arytmia, a w najcięższych przypadkach dochodzi do zgonu. Dlatego wciąż jedynym ratunkiem dla pacjentów z ciężką niewydolnością serca jest przeszczep. Niestety, liczba przeszczepów serca jest w dużym stopniu ograniczona przez niewystarczającą liczbę dawców. Nawet gdy dojdzie do przeszczepu serca, pacjent do końca życia zmuszony jest przyjmować leki immunosupresyjne, aby jego układ odpornościowy nie odrzucił przyjętego organu. Natomiast długotrwałe przyjmowanie leków immunosupresyjnych może mieć wiele niebezpiecznych dla życia skutków ubocznych [42]. Dlatego wykorzystanie kardiomiocytów otrzymanych z komórek macierzystych w medycynie regeneracyjnej jest niezwykle obiecującym podejściem i od lat jest obiektem intensywnych badań. Pierwsze badania nad wykorzystaniem kardiomiocytów otrzymanych z hESC bądź hiPSC w terapii zawału serca były przeprowadzane na modelu gryzoni (myszy, szczury, świnki morskie) o obniżonej odporności immunologicznej. W wyniku podania ludzkich kardiomiocytów bezpośrednio do mięśnia sercowego, u badanych zwierząt po pewnym czasie dochodziło do poprawy jego funkcjonowania [43–45]. Obiecujące wyniki badań na modelu małych gryzoni, zachęciły naukowców do przeprowadzenia doświadczeń z wykorzystaniem większych zwierząt laboratoryjnych, których fizjologia jest bardziej zbliżona do fizjologii ludzkiej. Również w przypadku modelu świńskiego oraz małpiego, zastosowanie hiPSC-CM dało pozytywne rezultaty. Pomimo przejściowych problemów z arytmią po wstrzyknięciu ludzkich kardiomiocytów [46], technologia hiPSC-CM okazała się przede wszystkim bezpieczna w badanych modelach zwierzęcych, co stwarza duży potencjał wykorzystania w terapii niewydolności serca u ludzi [47,48]. Na początkowych etapach rozwoju tej nowej dziedziny medycyny regeneracyjnej, do badań na gryzoniach wykorzystywano kardiomiocyty otrzymane głównie z ESC. Podyktowane to było przede wszystkim dostępnością zoptymalizowanych protokołów różnicowania właśnie dla tych komórek pluripotencjalnych. Podkreślić należy również, że pierwsze protokoły umożliwiające ukierunkowane różnicowanie hESC do kardiomiocytów pojawiły się w 2003 roku, czyli na 3 lata przed opisaniem metody reprogramowania komórek somatycznych z wykorzystaniem zdefiniowanych czynników transkrypcyjnych [49]. Niemniej, ze względu na podobieństwo otrzymywanych w tym procesie hiPSC do hESC, te same metody pozwoliły na wydajne uzyskiwanie hiPSC-CM. Do badań podstawowych wygodniejszą platformą są hESC, ze względu na ich większą stabilność genetyczną [50]. Niemniej jednak, w przyszłości to technologia hiPSC ma większe szanse na wykorzystanie w badaniach klinicznych, a następnie w terapiach. Podyktowane to jest łatwością otrzymania hiPSCs od konkretnego pacjenta oraz brakiem problemów natury etycznej, które to blokowały do tej pory postępy w pracy nad ludzkimi komórkami pluripotencjalnymi [14,15]. Biorąc pod uwagę wczesny etap badań nad możliwością wykorzystania hiPSC-CM w leczeniu chorób układu krążenia, nie było do tej pory przesłanek do szybkiego wdrożenia terapii opartych na tych komórkach u ludzi. Jednak, ku zaskoczeniu międzynarodowej społeczności naukowej, w maju ub. roku pojawiły się doniesienia medialne o pierwszych dwóch pacjentach w Chinach, poddanych terapii z wykorzystaniem hiPSC-CM. Do tych doniesień jednak należy podejść z pewną dozą sceptycyzmu, gdyż nie zostały one opublikowane do tej pory w żadnym czasopiśmie naukowym [51]. Interesujące sygnały płyną również z Japonii, gdzie w styczniu 2020 r. doniesiono o wydaniu zgody na przeprowadzenie badań klinicznych z wykorzystaniem trójwymiarowych płatów składających się z hiPSC-CM, umieszczonych na biodegradowalnym rusztowaniu. W tym podejściu, jednak efekt terapeutyczny ma zostać uzyskany na drodze aktywności parakrynnej, poprzez wydzielanie specyficznych czynników przez wprowadzony płat kardiomiocytów [52,53]. 4.2.4. Różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów Jedną z najważniejszych cech pluripotencjalnych komórek macierzystych jest zdolność do różnicowania do komórek wywodzących się ze wszystkich trzech listków zarodkowych. Dlatego podstawowym testem sprawdzającym taką zdolność jest test spontanicznego różnicowania in vitro poprzez ciałka zarodkowe [8]. W pełni pluripotencjalne komórki poddane takiej analizie powinny wykształcić komórki wywodzące się z ektodermy, endodermy oraz mezodermy, w tym kardiomiocyty [54]. Nieukierunkowane, spontaniczne różnicowanie poprzez ciałka zarodkowe nie jest jednak wydajną metodą otrzymywania kardiomiocytów. W związku z tym podjęto próbę opracowania protokołu ukierunkowanego różnicowania hESC do tego typu komórek. Zespół naukowców z Holandii, bazując na wiedzy na temat rozwoju zarodkowego płazów, oparł swoje podejście o kokulturę monowarstwy komórek macierzystych z komórkami pochodzenia endodermalnego [49]. Następne udoskonalenia protokołu doprowadziły do zrezygnowania z bydlęcej surowicy płodowej (ang. fetal bovine serum – FBS), która mogła być źródłem zmienności pomiędzy doświadczeniami, wykluczeniem insuliny na początkowym etapie różnicowania, ze względu na jej udział w rozwoju ektodermy, oraz dodaniem kwasu askorbinowego [55,56]. Równolegle trwały intensywne badania mające na celu poznanie molekularnych mechanizmów kardiomiogenezy w trakcie rozwoju zarodkowego ssaków. Zidentyfikowano najważniejsze szlaki sygnałowe biorące udział w tym procesie u myszy. Jego kluczowymi punktami są: indukcja różnicowania mezodermalnego, przejście epitelialno-mezenchymalne, a następnie różnicowanie w kierunku progenitorów komórek serca (omówione w pracach przeglądowych [57–59]). Następnie przystąpiono do modyfikacji protokołów ukierunkowanego różnicowania do kardiomiocytów, opierając się o tę wiedzę. Początkowe badania wskazywały na pozytywny efekt aktywacji szlaku sygnałowego Wnt/β-katenina za pomocą czynnika BMP4 (ang. Bone morphogenetic protein 4) oraz WNT3A (ang. Wingless-related integration site 3A) na indukcję rozwoju mezodermy [60,61]. W następnym etapie tego procesu, poprzez zastosowanie drobnocząsteczkowego inhibitora IWR-1, zahamowano uprzednio aktywowany szlak sygnałowy Wnt/β-katenina, co kierowało różnicowanie w stronę mezodermy sercowo- specyficznej [61]. Dalsze optymalizacje doprowadziły do powstania protokołu opierającego o zastosowanie drobnocząsteczkowych związków modulujących aktywność szlaku sygnałowego Wnt/β-katenina, w pełni zdefiniowanej pożywce hodowlanej [62,63]. Równolegle do omawianego protokołu bazującego na hodowli komórek w monowarstwie, rozwijano również metodę ukierunkowanego różnicowania z wykorzystaniem ciałek zarodkowych [64]. Obie strategie opierają się jednak o ten sam mechanizm – modulację szlaku sygnałowego Wnt/β-katenina. Przez kilkanaście lat pracy nad metodami ukierunkowanego różnicowania, opartymi na dokładnie poznanym procesie kardiomiogenezy w czasie rozwoju zarodkowego myszy, osiągnięto znaczne postępy w wydajności różnicowania. W 2001 roku I. Kehat i współpracownicy donosili o obserwacji kurczących się komórek jedynie w około 8% ze wszystkich spontanicznie zróżnicowanych ciałek zarodkowych, co oznacza, że kardiomiocyty stanowiły zaledwie ułamek procenta całej populacji [54]. Natomiast protokół opublikowany w 2013, a następnie udoskonalony w 2015 roku przez X. Lian i współpracowników, pozwala osiągnąć niemal 100% wydajności różnicowania [62,63]. Jednak w wielu laboratoriach zajmujących się tematyką komórek macierzystych i kardiomiocytów, tak wysoka oraz powtarzalna wydajność różnicowania jest rzadkością. Potrafi to znacząco opóźnić każde doświadczenia, dlatego grupa naukowców z Singapuru dokładnie zbadała, co jest powodem tak dużej zmienności. Opublikowane w 2018 roku badania wskazują, że w dużej mierze wynikać ona może z różnic w tempie proliferacji wykorzystywanych linii hiPSC [65]. Istotnym czynnikiem, negatywnie wpływającym na wydajność otrzymywania hiPSC-CM, jest również zbyt długa hodowla hiPSC (za wysoki pasaż) [65]. Wprowadzanie zmian w genomie hiPSC za pomocą inżynierii genetycznej, gdzie na wielu etapach należy rozbić kolonie na pojedyncze komórki, również negatywnie wpływa na ich zdolność do różnicowania w kierunku hiPSC-CM. Dlatego powstało wiele metod pozwalających na zwiększenie czystości otrzymanej populacji kardiomiocytów: wirowanie w gradiencie stężeń [44,66], modyfikacje genetyczne pozwalające na selekcję antybiotykową bądź sortowanie [67–70], metoda barwienia mitochondriów za pomocą estra metylowego tetrametylorodaminy (ang. Tetramethylrhodamine, methyl ester – TMRM) [71] oraz metody opierające się na sortowaniu na podstawie specyficznych markerów powierzchniowych [72,73]. Część z tych sposobów pozwala na wydajne i szybkie oczyszczenie populacji kardiomiocytów, jednak ze względu na potencjalną genotoksyczność czy potrzebę zastosowania przeciwciał oraz sortowania komórek, metody te nie nadają się do zastosowania w celach terapeutycznych. Obecnie, gdy istnieje potrzeba zwiększenia czystości populacji hiPSC-CM, stosuje się metodę opierającą się o biologiczne właściwości kardiomiocytów. W szczególności, w przeciwieństwie do innych komórek, są one w stanie wykorzystać mleczan jako źródło energii. Możliwe jest to dzięki wyższej ekspresji enzymów wchodzących w skład cyklu Krebsa. Pozostałe typy komórek nie są wstanie wykorzystać w ten sposób mleczanu i pod nieobecność glukozy obumierają [74,75]. Niemniej jednak należy zwrócić uwagę, że proces kardiomiogenezy jest procesem złożonym, wymagającym m.in. przestrzennego oddziaływania z innymi typami komórek, a przede wszystkim znacznie dłuższego czasu. Wszystkie opublikowane protokoły zakładają otrzymanie kardiomiocytów gotowych do dalszych analiz w około 2-3 tygodnie. W przypadku ludzi serce osiąga pełną dojrzałość dopiero w wieku około 20 lat [76]. Oczywiste więc jest, że w trakcie tak krótkiego różnicowania in vitro, wykształcone kardiomiocyty nie będą w pełni dojrzałe. 4.2.5. Charakterystyka hiPSC-CM Stosowane protokoły różnicowania ukierunkowanego do kardiomiocytów odzwierciedlają molekularne mechanizmy odpowiadające za kardiomiogenezę na początkowym etapie ontogenezy. Analizy porównawcze transkryptomu wykazały, że hiPSC-CM swoim profilem ekspresji genów przypominają kardiomiocyty obecne w pierwszym trymestrze rozwoju zarodkowego [77]. 4.2.5.1. Metabolizm hiPSC-CM Metabolizm kardiomiocytów ulega drastycznej zmianie krótko po narodzinach, kiedy dochodzi do znaczących przemian w mikrośrodowisku serca. W trakcie rozwoju płodowego głównym źródłem ATP w tym narządzie jest beztlenowa glikoliza, wykorzystująca jako substraty energetyczne głównie glukozę oraz mleczan [78]. Po narodzinach wzrasta poziom tlenu w sercu a cukry proste, jako źródło energii, zastępowane są kwasami tłuszczowymi obecnymi w mleku matki [79]. Zmiany te przyczyniają się do przejścia z beztlenowej glikolizy na dużo wydajniejszą energetycznie β-oksydację kwasów tłuszczowych, jako głównego źródła energii [80]. Również mitochondria ulegają znacznym przekształceniom w trakcie dojrzewania zapoczątkowanego narodzinami. Kardiomiocyty płodowe charakteryzują się małymi i nielicznymi mitochondriami o nieuporządkowanym rozmieszczeniu w komórce. Dodatkowo, grzebienie mitochondrialne charakteryzują się mniejszą złożonością, co wskazuje na niższą aktywność metaboliczną kardiomiocytów płodowych [81,82]. Z wiekiem dochodzi do zwiększenia liczby i objętości mitochondriów (w trakcie rozwoju płodowego mitochondria kardiomiocytów zajmują około 5% objętości komórki, podczas gdy w dojrzałych kardiomiocytach stanowią około 30% objętości [82]) oraz ich ułożenia w charakterystyczne struktury wokół miofibryli i pod sarkolemmą, co zapewnia szybki dostęp do ATP maszynerii kurczliwej oraz licznym pompom jonowym [83,84]. Podsumowując, hiPSC-CM charakteryzują się niedojrzałym metabolizmem, posiadając nieliczne i niewielkie mitochondria o nieskomplikowanej strukturze wewnętrznej oraz używając glukozy jako substratu do produkcji ATP [85]. 4.2.5.2. Potencjał czynnościowy hiPSC-CM Kardiomiocyty charakteryzują się aktywnością elektrofizjologiczną, wynikającą z ciągłej, naprzemiennej aktywacji oraz dezaktywacji szeregu kanałów jonowych, odpowiedzialnych za rytmiczne zmiany stężeń poszczególnych jonów wewnątrz komórki. W trakcie rozwoju serca w okresie płodowym, potencjał czynnościowy komórek serca ulega zmianie w wyniku zmiany poziomu ekspresji poszczególnych kanałów jonowych, ich lokalizacji oraz aktywności [86]. Jedną z najbardziej charakterystycznych cech dla niedojrzałych hiPSC-CM jest spontaniczna kurczliwość. Dorosłe kardiomiocyty komorowe nie są w stanie samoistnie wywołać potencjału czynnościowego, a ich aktywność elektrofizjologiczna jest koordynowana przez wyspecjalizowane komórki rozrusznikowe serca znajdujące się w węźle zatokowo-przedsionkowym oraz węźle przedsionkowo-komorowym. Charakterystyczna, spontaniczna, kurczliwość hiPSC-CM jest spowodowana wysokim poziomem ekspresji kanału jonowego HCN4, charakterystycznego dla komórek rozrusznikowych oraz niekontrolowanym przeciekiem jonów wapnia, co prowadzi do spontanicznej depolaryzacji [87]. Kolejną różnicą w aktywności elektrofizjologicznej jest szybkość narastania potencjału czynnościowego. Dojrzałe kardiomiocyty charakteryzują się wyższą ekspresją kanałów sodowych SCN5A, których to większa liczba oraz aktywność zapewnia szybszy czas narastania potencjału [88]. Po osiągnięciu maksymalnej depolaryzacji w dorosłych kardiomiocytach następuje faza plateau, w której trakcie napływ jonów wapniowych poprzez kanały wapniowe CACNA jest tymczasowo równoważony poprzez odpływ jonów potasowych przez kanały potasowe (KCNH i KCNQ). Po inaktywacji kanałów wapniowych następuje gwałtowna repolaryzacja w wyniku ciągłego wyrzutu jonów potasowych. W niedojrzałych hiPSC-CM proces ten nie jest równoważony w początkowym etapie przez napływ jonów wapniowych, ze względu na niską ekspresję CACNA. Co więcej, w hiPSC-CM dominują tzw. szybkie kanały potasowe, które również przyczyniają się do znacznego skrócenia czasu repolaryzacji, w porównaniu do dojrzałych kardiomiocytów [89,90]. Schematyczne przedstawienie omawianego potencjału czynnościowego znajduje się na Rycinie 31 A. 4.2.6. Podsumowanie hiPSC-CM: wady i zalety niedojrzałego fenotypu Komórki hiPSC-CM o fenotypie zarodkowym są mniejsze od w pełni dojrzałych kardiomiocytów, nie mają charakterystycznego wrzecionowatego kształtu, ich mitochondria są mniej liczne oraz mają mniej rozwinięte grzebienie mitochondrialne. Co ciekawe, pomimo to, mitochondria niedojrzałych hiPSC-CM i tak charakteryzują się dużo większą aktywnością niż mitochondria innych, niekurczliwych komórek [71], co było podstawą m.in. do opracowania metody oczyszczania populacji hiPSC-CM, bazując na intensywności barwienia mitochondrialnego za pomocą związku TMRM [71]. Dodatkowo metabolizm hiPSC-CM opiera się o glukozę jako źródła energii (należy podkreślić, że glukoza jest standardowym źródłem energii w stosowanych pożywkach do hodowli komórek). Ze względu na niższą ekspresję kanałów jonowych, krzywa potencjału czynnościowego znacząco różni się od krzywej dorosłych kardiomiocytów, a profil ekspresji genów wskazuje, że również wiele innych mechanizmów molekularnych w hiPSC-CM nie jest w pełni rozwiniętych [77,91]. Zastosowanie hiPSC-CM, które nie odzwierciedlają całkowicie kardiomiocytów dorosłego człowieka, niesie ryzyko błędnej interpretacji wyników, np. w przypadku próby oceny toksyczności leków. Dobrym przykładem jest doksorubicyna, będąca chemoterapeutykiem, którego mechanizm działania opiera się głównie o hamowanie topoizomerazy IIα [92], odpowiedzialnej za rozplatanie podwójnej nici DNA przed replikacją bądź transkrypcją. Zablokowanie jej aktywności w szybko proliferujących komórkach (np. komórki rakowe, ale również HSC czy komórki mieszka włosowego) prowadzi do ich śmierci [93]. Dojrzałe kardiomiocyty nie są aktywne proliferacyjnie i mają przewagę topoizomerazy IIβ, która nie jest aż tak podatna na działanie doksorubicyny [94,95]. Dlatego zastosowanie do badań mniej dojrzałych hiPSC-CM, które charakteryzują się wyższym poziomem topoizomerazy IIα, może prowadzić do błędnych wniosków. Co więcej, wykazano, że doksorubicyna wykazuje działanie kardiotoksyczne poprzez uszkadzanie mitochondriów w kardiomiocytach. Dlatego prowadzenie badań nad kardiotoksycznością doksorubicyny stosując hiPSC-CM o niedojrzałych mitochondriach, może nie odzwierciedlać faktycznego obrazu klinicznego. Rozwiązaniem wydaje się indukcja dojrzewania hiPSC-CM, gdyż wykazano, że poziom wpływu doksorubicyny na komórki zależy od stopnia dojrzałości hiPSC-CM [96]. Podobną zależność wykazano również w przypadku badań nad innymi lekami: tamoksyfenem, klozapiną czy chinidyną [97]. Negatywnym skutkiem zastosowania niedojrzałych hiPSC-CM w medycynie regeneracyjnej może być ryzyko wykształcenia arytmii. hiPSC-CM charakteryzujące się spontaniczną kurczliwością oraz znacząco niższą ekspresją kanałów jonowych, mogą nie być w stanie zsynchronizować się z komórkami gospodarza, doprowadzając do wykształcenia zaburzeń rytmu serca, co w następstwie może prowadzić do śmierci pacjenta. Tak było w przypadku jednego z przedklinicznych badań nad zastosowaniem kardiomiocytów otrzymanych z hESC (ang. hESC-derived cardiomyocytes – hESC-CM) w terapii zawału serca na modelu małpim. U części zwierząt w tym badaniu doszło do wykształcenia arytmii. Jako możliwy powód, naukowcy wskazali nieoptymalną liczbę wszczepionych hESC-CM [46]. W tym samym roku inna grupa naukowców opublikowała wyniki badań z zastosowaniem hiPSC-CM w terapii zawału mięśnia sercowego w modelu świńskim, stosując jednak bardziej zaawansowaną technologię. Do uszkodzonego narządu podano bowiem mieszaninę hiPSC-CM, komórek śródbłonka oraz komórek mięśni gładkich w ściśle określonych proporcjach. Całość była uzupełniona przez trójwymiarowy płat fibrynowo-trombinowy zawierający mikrokapsułki z IGF1 (ang. insulin-like growth factor 1, insulino-podobny czynnik wzrostu). Dodatkowa obecność komórek śródbłonka i mięśni gładkich oraz długotrwałe uwalnianie IGF1 z mikrokapsułek przyczyniło się do znaczącego zmniejszenia apoptozy wprowadzonych komórek, zwiększenia angiogenezy oraz unormowało aktywność elektrofizjologiczną serca i produkcję ATP. Co istotne, nie zaobserwowano arytmii [47]. Badania te dowodzą, że odpowiednio dopracowana technologia może przyczynić się do bezpiecznego stosowania hiPSC-CM w medycynie regeneracyjnej. Z drugiej strony, w jednej z kolejnych prac nad zastosowaniem hiPSC-CM w terapii zawału serca, naukowcy wskazali na pozytywny wpływ ich niedojrzałości. W badaniu tym naukowcy skupili się na sprawdzeniu stopnia retencji podawanych komórek. Co ciekawe, długotrwałe analizy wykazały, że to właśnie mniej dojrzałe, 20-dniowe hiPSC-CM charakteryzowały się większą przeżywalnością, w porównaniu do bardziej dojrzałych, 30-dniowych (należy zaznaczyć, że przedłużona hodowla in vitro jest uważana za jedną z metod dojrzewania hiPSC-CM) [98]. Jako uzasadnienie naukowcy wskazali mniej zorganizowaną strukturę zewnątrzkomórkową, której rozbicie w trakcie przygotowania komórek do podania nie miało istotnego wpływu na ich przeżywalność. Co niezwykle istotne, wykazali również, że po podaniu do serca niedojrzałe hiPSC-CM przez następne pół roku ulegały stopniowemu dojrzewaniu. A pozytywny efekt był dodatkowo osiągnięty dzięki zdolności niedojrzałych hiPSC-CM do proliferacji. Niemniej jednak nie zaobserwowano synchronizacji wszczepionych komórek z mysimi kardiomiocytami [99]. Wskazywało to na potrzebę zweryfikowania tych odkryć w modelu bliższym fizjologicznie ludzkiemu sercu, w celu wykluczenia możliwości wykształcenia arytmii. Kolejne badania potwierdziły dojrzewanie hiPSC-CM po podaniu do mięśnia sercowego w modelu szczurzym oraz wykazały, że proces ten zachodzi w większym stopniu w sercu dorosłych zwierząt, w porównaniu z nowonarodzonymi osobnikami [100]. Większy stopień dojrzałości wstrzykniętych hiPSC-CM w przypadku dorosłych szczurów może być wytłumaczony lepiej rozwiniętą strukturą serca, która zapewnia odpowiednio sztywne rusztowanie dla komórek [101]. Trójwymiarowa hodowla hiPSC-CM oraz hodowla na odpowiednio sztywnym podłożu są powszechnie stosowanymi technikami zwiększania stopnia dojrzałości hiPSC-CM in vitro [102]. W omawianym badaniu na szczurach naukowcy zaobserwowali wykształcenie arytmii, która jednak zanikała w miarę dojrzewania hiPSC-CM in vivo [100]. Omawiane badania wskazują, że niedojrzałość hiPSC-CM może być atutem w medycynie regeneracyjnej. Kardiomiocyty krótko po narodzinach tracą zdolność proliferacji na skutek akumulacji uszkodzeń DNA wynikających z nagłego przejścia z niewydajnej energetycznie beztlenowej glikolizy na dużo wydajniejszą β-oksydację kwasów tłuszczowych, która generuje również więcej reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species – ROS) [103]. Na skutek uszkodzeń DNA zablokowana zostaje prawidłowa cytokineza, co prowadzi do powstania dwujądrzastych kardiomiocytów [104]. Istnieją doniesienia wskazujące, że zdolność regeneracyjna serca zanika właśnie ze względu na binukleację kardiomiocytów [105]. Sugeruje się również, że szczepy myszy, które charakteryzują się większą proporcją kardiomiocytów jednojądrzastych, mają większą zdolność regeneracji serca [106]. Możliwość prowadzenia badań podstawowych nad mechanizmami regeneracji i dojrzewania kardiomiocytów in vitro, jako dwóch wzajemnie wykluczających się procesów, wykorzystując niedojrzałe, monojądrzaste hiPSC-CM stwarza nowe, fascynujące możliwości dla badań nad poprawą funkcji mięśnia sercowego po zawale. Aby w pełni wykorzystać potencjał oferowany przez technologię hiPSC-CM, należy jednak lepiej zrozumieć proces różnicowania hiPSC do kardiomiocytów in vitro, zbadać jakie czynniki i w jaki sposób mogą wpływać na podstawowe parametry kardiomiocytów, takie jak proliferacja, dojrzałość metaboliczna czy potencjał czynnościowy. Jednym z enzymów o wszechstronnym działaniu jest oksygenaza hemowa-1 (ang. heme oxygenase-1 – HO-1). Liczne prace naszego oraz innych zespołów wskazują na ważną rolę HO-1 w mysich komórkach satelitarnych mięśni oraz proliferacji komórek mięśniowych [107], różnicowaniu mysich iPSC (ang. mouse iPSC, miPSC) do kardiomiocytów [108], czy wpływie na metabolizm kardiomiocytów [109]. Ze względu na różnice fizjologiczne i anatomiczne pomiędzy mysim i ludzkim sercem, istotne jest, aby zweryfikować te doniesienia w modelu hiPSC-CM. 4.3. Oksygenaza hemowa-1 Enzymy z grupy oksygenaz hemowych (HO) są kluczowymi białkami cytoprotekcyjnymi i wpływają na wiele procesów komórkowych. Ich aktywność enzymatyczna polega na degradacji toksycznego wolnego hemu na trzy prostsze związki. Hem jest rozkładany przez HO na cząsteczkę tlenku węgla (CO), jony Fe2+ oraz biliwerdynę, która następnie ulega konwersji w bilirubinę [110,111]. HO-1 poprzez produkty swojej aktywności enzymatycznej wpływa m.in. na angiogenezę [112,113], hamuje apoptozę, obniża stres komórkowy oraz działa przeciwzapalnie [114]. Wpływa również na rozwój nowotworów poprzez indukcję nadmiernej proliferacji [107]. Rycina 1. Schematyczne przedstawienie działania HO-1. Wyróżnia się dwie izoformy HO: indukowalną HO-1 oraz HO-2, która ulega konstytutywnej ekspresji. HO-1 jest białkiem zakotwiczonym w siateczce śródplazmatycznej i jej poziom wzrasta w odpowiedzi na szereg stymulantów takich jak hem [115], promieniowanie ultrafioletowe [116], metale ciężkie [117] czy związki farmakologiczne, takie jak protoporfiryna IX kobaltu (CoPP) [118] lub kwas walproinowy [119]. Schematyczne przedstawienie działania HO-1 znajduje się na Rycinie 1. 4.3.1. Wpływ HO-1 na komórki macierzyste oraz progenitorowe Wyniki badań naszej grupy wskazują na istotny wpływ HO-1 na proces proliferacji i dojrzewania komórek satelitarnych mięśni [107]. Linia mysich mioblastów C2C12 z nadekspresją HO-1 poddana dojrzewaniu in vitro charakteryzowała się mniejszą liczbą wydłużonych, wielojądrzastych miotub charakterystycznych dla rozwijających się mięśni. Obserwacje te zostały dodatkowo poparte poprzez wykazanie niższej ekspresji markerów dojrzewania – myoD, miogeniny oraz łańcucha ciężkiego miozyny w porównaniu z kontrolą. Co więcej, po domięśniowym podaniu myszom komórek C2C12 z nadekspresją HO-1, zaobserwowano ich intensywną proliferację, co skutkowało wytworzeniem struktury podobnej do guza. Badania nad mechanizmem wpływu HO-1 na dojrzewanie mioblastów wykazały, że efekt ten nie jest zależny od cytoprotekcyjnych właściwości HO-1, ale od produkowanego przez nią CO, który hamuje przyłączanie się jednego z kluczowych czynników transkrypcyjnych do promotora myoD, wpływając na zahamowanie procesu dojrzewania [107]. Należy podkreślić, że CO, pomimo iż jest silnie trującym gazem, to w niskich stężeniach pełni istotne role w regulowaniu molekularnych szlaków sygnałowych. Wykazano, że CO działa przeciwzapalnie oraz obniża ciśnienia krwi poprzez wpływ na szlaki sygnałowe w mięśniach gładkich, oraz modulację aktywności kanałów potasowych [120]. Co istotne, wykazano, że brak HO-1 znacząco wpływa na różnicowanie iPSC. Grupa naukowców z Japonii zaobserwowała, że poziom jednego z głównych markerów pluripotencji – Oct3/4 ulega znacznie szybszemu spadkowi w początkowych etapach spontanicznego różnicowania w miPSC pozbawionych HO-1 (ang. HO-1 knock-out – HO-1 KO), w porównaniu do komórek kontrolnych. Wykazano, że związane to było z większym poziomem ROS pod nieobecność HO-1 [121]. W kolejnym badaniu ta sama grupa naukowców opisała, że brak HO-1 ułatwia spontaniczne różnicowanie miPSC do mezodermy, co jest początkowym etapem różnicowania do kardiomiocytów [122]. W obu przypadkach iPSC były poddawane spontanicznemu różnicowaniu, a wpływ HO-1 bezpośrednio na zdolność do rozwoju kardiomiocytów nie został zbadany. 4.3.2. Wpływ braku HO-1 na rozwój zarodkowy Wpływ braku ekspresji HO-1 na funkcjonowanie ludzkiego organizmu nie został dokładnie przebadany. Wiąże się to z faktem, że udokumentowane są jedynie trzy przypadki pacjentów całkowicie pozbawionych HO-1. Te młode osoby cierpiały na liczne dolegliwości, takie jak: anemia, leukocytoza, hemoliza czy zaburzenia pracy serca. We wszystkich przypadkach pacjenci zmarli w wieku dziecięcym [123–125]. Tak mała liczba udokumentowanych przypadków pacjentów pozbawionych HO-1 może wskazywać na krytyczną rolę omawianego enzymu i pozwala sądzić, iż brak HO-1 może być letalny na etapie rozwoju płodowego. Badania nad HO-1 u gryzoni potwierdzają te przypuszczenia, gdyż około 5% potomstwa pary rozrodczej HO-1+/- i HO-1+/- jest pozbawionych HO-1, co jest dużo niższe od spodziewanego, mendlowskiego rozkładu cech [126]. Podobna wydajność uzyskiwania myszy HO-1 KO została również zaobserwowana w naszym zakładzie (wyniki nieopublikowane). W 2002 r. zespół prof. Phyllis A. Dennery w modelu szczurzym wykazał, iż farmakologiczna modulacja HO-1 istotnie wpływa na rozwój zarodkowy poprzez oddziaływanie na łożyskowy czynniki wzrostu [127]. Wyniki wskazujące na istotną rolę HO-1 w tym procesie, a w szczególności rozwoju łożyska, zostały następnie potwierdzone przez inny zespół w 2004 r. [128]. W przywołanych tutaj pracach [126–128] zaobserwowano zmniejszoną masę ciała noworodków myszy HO-1 KO i wykazano, iż wynika to z zaburzonego rozwoju układu sercowo-naczyniowego w płodach pozbawionych HO-1. Wyniki te wskazują na kluczową rolę HO-1 w rozwoju m.in. serca. 4.3.3. Regulacja ekspresji HO-1 u ludzi Poziom HO-1 może być regulowany przez szereg czynników, opisanych w rozdziale 4.3: wolny hem [115], promieniowanie ultrafioletowe [116], metale ciężkie [117] czy związki farmakologiczne [118,119]. 4.3.3.1. Polimorfizm promotora HMOX1 Oprócz czynników środowiskowych, na poziom HO-1 wpływa również długość promotora HMOX1 [129]. W badaniach przeprowadzonych przez N. Yamada i współpracowników wykazano, że negatywnie koreluje ona z poziomem indukcji HO-1 przez dym tytoniowy [129]. Długość promotora HMOX1 jest uzależniona od liczby powtórzeń dinukleotydu guanina-tymina [129]. Badania naszego zespołu wskazują na korelację pomiędzy krótszym wariantem promotora HMOX1 a wyższą ekspresją HO-1 w ludzkich komórkach śródbłonka [130]. Zwiększona ekspresja HO-1 skutkowała zwiększonymi właściwościami cytoprotekcyjnymi, proangiogennymi oraz przeciwzapalnymi [130]. Co istotne wykazano również, że zwiększona ekspresja HMOX1 wynikająca z krótszego wariantu promotora koreluje z lepszym obrazem klinicznym u pacjentów z chorobami układu sercowo-naczyniowego, co zostało wykazane na podstawie badania kohortowego [131]. 4.3.3.2. Związki farmakologiczne Powszechnie stosowany do badań in vitro nad właściwościami HO-1 jest CoPP, który zwiększa ekspresję oraz aktywność omawianego enzymu. Związek ten nie jest jednak obecnie stosowany u ludzi. W przyszłości wyjątkiem może być zastosowanie CoPP w celu mobilizacji HSC ze szpiku kostnego do krwi u dawców komórek macierzystych. Wykazano bowiem, iż działa wydajniej w porównaniu do powszechnie stosowanego czynnika mobilizującego HSC: G-CSF (ang. granulocyte colony stimulating factor – czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów). Niemniej jednak, w tym wypadku jest to efekt niezależny od HO-1 [18]. HO-1 jest istotnym enzymem cytoprotekcyjnym, mającym również właściwości proangiogenne [113], przeciwapoptotyczne oraz przeciwzapalne [107,114] w różnych układach biologicznych. Nie jest zatem zaskakującym fakt, iż wiele leków stosowanych np. w leczeniu chorób układu sercowo-naczyniowego, działa m.in. poprzez indukcję HO-1 (omówione w pracy przeglądowej [132]). Wyjątkiem pośród związków farmakologicznych stosowanych długotrwale są leki na bazie kwasu walproinowego, stosowane w leczeniu padaczki [133] oraz choroby dwubiegunowej [134]. Praca naszego zespołu wykazała bowiem, iż kwas walproinowy obniża poziom HO-1, co jest odwrotnym efektem, w porównaniu do wielu leków na schorzenia układu sercowo-naczyniowego [132]. 4.3.4. Wpływ HO-1 na różnicowanie komórek macierzystych do kardiomiocytów Wpływ HO-1 na proces kardiomiogenezy został wykazany w modelu mysim. W pierwszej kolejności potwierdzono, że układ HO-1/CO ma istotny wpływ na biogenezę mitochondriów w szczurzych kardiomiocytach, [109]. Następnie ta sama grupa badawcza wykazała podobne działanie układu HO-1/CO w trakcie różnicowania mysich ESC (ang. mousce ESC – mESC) do kardiomiocytów, gdzie również zaobserwowano pozytywny wpływ HO-1 na biogenezę mitochondriów [135]. W tym samym badaniu potwierdzono, że w trakcie początkowego etapu różnicowania, komórki miPSC bez HO-1 wykazywały szybszy spadek poziomu Oct3/4. Nie wykazano natomiast wpływu HO-1 na samą wydajność różnicowania. Natomiast wyniki naszych badań wskazują, że brak HO-1 znacząco obniża zdolność różnicowania miPSC oraz mESC do kardiomiocytów [108]. Wszystkie omawiane badania były przeprowadzone w modelu mysim. Biorąc pod uwagę różnice fizjologiczne i anatomiczne pomiędzy ludzkim a mysim sercem oraz przeciwstawne działanie HO-1 w zależności od typu komórki (HO-1 hamuje dojrzewanie mioblastów, a promuje dojrzewanie mitochondriów w kardiomiocytach), uzasadnionym jest zweryfikowanie roli HO-1 w modelu ludzkich komórek macierzystych. 5. Cele pracy hiPSC-CM stanowią bardzo obiecującą platformę do badań nad efektywnością działania leków. Mogą również mieć zastosowanie w medycynie regeneracyjnej. Jednak, żeby w pełni wykorzystać ten potencjał, należy dokładniej poznać proces ich rozwoju oraz późniejszego dojrzewania. Dotychczasowe doniesienia wskazują na istotną rolę HO-1 w różnicowaniu i dojrzewaniu kardiomiocytów, regulacji ich metabolizmu oraz możliwy wpływ na aktywność elektrofizjologiczną. Proces ten jednak nie został przebadany w ludzkich komórkach. Z przedstawionych powyżej powodów celem pracy było zbadanie wpływu HO-1 na: 1. Różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów. 2. Procesy metaboliczne w ludzkich kardiomiocytach. 3. Aktywność elektrofizjologiczną kardiomiocytów. 6. Materiały i metody Wszystkie doświadczenia z genetycznie modyfikowanymi organizmami odbyły się zgodnie z ustawą z dnia 22 czerwca 2001 r. o mikroorganizmach i organizmach genetycznie modyfikowanych (Dz. U. z 2015. poz. 806) oraz art. 104 ustawy z dnia 14 czerwca 1960 r. – Kodeksu postępowania administracyjnego (Dz. U. z 2016 r. poz. 23). Numer zgody 48/2016. 6.1. Wyprowadzanie linii hiPSC Linie hiPSC zostały wyprowadzone z ludzkich fibroblastów BJ (ATCC) za pomocą zestawu do reprogramowania CytoTuneTM-IPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Schemat reprogramowania przedstawiono na Rycinie 2. A screen shot of a social media post Description automatically generated Rycina 2. Schemat przedstawiający proces wyprowadzania linii hiPSCs. Schemat zmodyfikowany z protokołu producenta. W skrócie: na dwa dni przed transdukcją wysiano 105 fibroblastów BJ na dołek płytki 6-dołkowej. W dniu transdukcji, gdy konfluencja wynosiła około 50%, przeprowadzono transdukcję trzema wektorami Sendai CytoTune™ 2.0: KOS (MOI = 5; ang. multiplicity of infection, mnogość infekcji), hc-Myc (MOI = 5) oraz hKLF4 (MOI = 3), zawierającymi tzw. czynniki Yamanaki: OCT3/4, SOX2, KLF4 oraz c-MYC [12]. Po 24 godzinach komórki przemyto dwukrotnie PBS (ang. phosphate buffered saline, buforowany fosforanami roztwór soli fizjologicznej) z jonami i dodano świeżej pożywki DMEM CM [pożywka DMEM suplementowana 10% FBS i 1% mieszaniną penicyliny (100 U/mL końcowe stężenie) i streptomycyny (100 µg/mL końcowe stężenie); CM, ang. complete]. Następnie pożywkę wymieniano na świeżą co 2 dni. Dnia 7. komórki przemyto dwukrotnie PBS bez jonów, dodano 0,5 mL trypsyny i inkubowano 5 minut w inkubatorze w temperaturze 37oC. Następnie, w celu inaktywacji trypsyny oraz zebrania odczepionych komórek, dodano 2 mL DMEM CM i przeniesiono do probówki typu Falcon 15 ml. Komórki zwirowano przy przeciążeniu 200 g, przez 5 minut. Nadsącz usunięto a pelet rozpipetowano w 1 mL pożywki DMEM CM. Przy użyciu komory Bürkera policzono i następnie wysiano 100 tysięcy komórek na dołek płytki 6 dołkowej opłaszczonej mieszaniną białek macierzy zewnątrzkomórkowej (geltrex). Następnego dnia wymieniono pożywkę DMEM CM na pożywkę E7 (ang. Essential 7) lub E8 (ang. Essential 8). Po mniej więcej dwóch tygodniach zaobserwowano pierwsze kolonie hiPSC (Rycina 3). A picture containing building, outdoor, standing, stone Description automatically generated Rycina 3. Zdjęcie powstających kolonii hiPSC. Odcinek skali reprezentuje 100 µm. Po mniej więcej czterech tygodniach przeniesiono powstałe pojedyncze kolonie hiPSCs na dołek płytki 96 dołkowej opłaszczonej odczynnikiem geltrex. Kolonie hiPSC przenoszono poprzez odciągnięcie pożywki, zdrapanie kolonii końcówką 100 µL i przeniesienie na dołek płytki 96-dołkowej opłaszczonej odczynnikiem geltrex. Dokładnie rozpipetowane kolonie przez pierwsze 24 godzin hodowano w pożywce E8 wraz z dodatkiem 10 µM inhibitora kinazy związanej z białkiem Rho (ang. Rho-associated protein kinase, kinaza związana z białkiem Rho – ROCK) (Y-27632, Abcam). Następnie codziennie wymieniano pożywkę E8 na świeżą, aż kolonie osiągnęły około 60-70% konfluencji. Po tym czasie przesiewano kolonie na większe powierzchnie, zamrażano w obecności 10% DMSO (ang. dimethyl sulfoxide, dimetylosulfotlenek), oraz wysiewano hiPSC do dalszej analizy. 6.2. Hodowla hiPSCs Wszystkie hodowle komórkowe były prowadzone w inkubatorze w standardowych warunkach, tj. 37 °C, 5% CO2 oraz 95% wilgotności. 6.2.1. Opłaszczanie płytek hodowlanych macierzą zewnątrzkomórkową Odczynnik geltrex rozcieńczano 1:100 w pożywce DMEM/F12 i przechowywano w temperaturze 4oC. W celu opłaszczenia płytki hodowlanej dodawano na dołek połowę standardowej objętości dla danej płytki: płytka o średnicy 10 cm – 5ml, dołek płytki 6 dołkowej – 1 ml, 12 dołkowej – 0,5 ml, 24 dołkowej 0,25 ml, 48 dołkowej – 0,125 mL oraz 96 dołkowej – 0,05 ml. Płytki inkubowano w inkubatorze w 37oC przez minimum godzinę, a następnie odsysano rozcieńczony odczynnik geltrex i wysiewano komórki w pożywce E8 wraz z dodatkiem inhibitora ROCK. 6.2.2. Zmiana pożywki i pasaż Ze względu na niską stabilność w 37oC jednego z kluczowych składników pożywki E8 – FGF2 (ang. Fibroblast Growth Factor 2, czynnik wzrostu fibroblastów 2), pożywkę wymieniano codziennie na świeżą. hiPSC pasażowano co 4-5 dni, gdy osiągnały około 70-80% konfluencji. Niezwykle istotne dla zachowania pluripotencjalnego fenotypu hiPSC jest utrzymanie komórek w stadium aktywnej proliferacji oraz niedopuszczenie do nadmiernego przerośnięcia kolonii. W celu odczepienia komórek od podłoża i rozbiciu kolonii hiPSC na mniejsze fragmenty, dołek płytki hodowlanej z komórkami przemywano PBS bez jonów, a następnie inkubowano około 5-8 minut w temperaturze pokojowej z 0,5 mM EDTA (ang. Ethylenediaminetetraacetic acid, kwas etylenodiaminotetraoctowy) rozpuszczonym w PBS bez jonów. EDTA odpowiedzialny jest za chelatowanie jonów dwuwartościowych, Ca2+ oraz Mg2+, niezbędnych dla prawidłowego działania białek adhezyjnych hiPSC. Gdy zaobserwowano charakterystyczne przerwy w ciągłości kolonii, odsysano EDTA, a komórki zbierano poprzez trzykrotne przemycie dołka pożywką E8 wraz z dodatkiem 10 µM inhibitora ROCK. Do dalszej hodowli pasażowano komórki w proporcji od 1:10 do 1:20 lub liczono w komorze Bürkera i wysiewano do dalszych analiz w pożywce E8 z dodatkiem inhibitora ROCK. 6.2.3. Inhibitor ROCK Komórki hiPSC w normalnych warunkach rosną w koloniach osadzonych w mieszaninie białek macierzy zewnątrzkomórkowej. W trakcie pasażu kolonie hiPSCs odczepiane są od podłoża oraz rozbijane na mniejsze fragmenty i pojedyncze komórki, co indukuje anoiks w komórkach macierzystych (apoptoza wywołana brakiem interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową lub innymi komórkami) [136]. W 2007 r. K. Watanabe wraz ze współpracownikami wykazali, że zastosowanie inhibitora ROCK o nazwie Y-27632, w dużym stopniu zwiększało przeżywalność hESC po pasażu [137]. Serynowo/treoninowa kinaza Rho pełni istotną funkcję w wielu procesach komórkowych, takich jak apoptoza czy rearanżacja cytoszkieletu aktynowego [138]. Małocząsteczkowy związek Y-27632 hamuje aktywność tego enzymu poprzez kompetycyjną inhibicję miejsca wiązania ATP [139]. W celu zahamowania apoptozy w hiPSC po pasażu, do pożywki E8 dodawano 10 µM Y-27632. Komórki po wysianiu były inkubowane w pożywce E8 z dodatkiem inhibitora przez 24 godzin. Po tym czasie wymieniano pożywkę na świeżą, bez dodatku inhibitora ROCK. 6.2.4. Pożywki hodowlane hiPSC 6.2.4.1. Pożywka Essential 8 Pożywka Essential 8 (E8) powstała na bazie pożywki mTeSR, w skład której oprócz DMEM/F12 wchodzi 18 składników. Powodem do zmiany składu pożywki do hodowli komórek macierzystych była obecność w składzie albuminy z surowicy bydlęcej (BSA, ang. bovine serum albumin, albumina z surowicy bydlęcej). BSA przyczyniało się do zmienności pomiędzy partiami mTESR i negatywnie wpływało na powtarzalność przeprowadzanych analiz z wykorzystaniem komórek macierzystych. G. Chen wraz ze współpracownikami poprzez testowanie różnych wariantów mTeSR, w pierwszej kolejności wykluczył BSA oraz β-merkaptoetanol, który pod nieobecność BSA stawał się toksyczny dla komórek. Następnie, krok po kroku eliminując kolejne składniki, otrzymano pożywkę składającą się z ośmiu czynników niezbędnych dla wzrostu i zachowania pluripotencjalnego fenotypu hESC [140]. W jej skład wchodzą: i) pożywka DMEM/F12 stanowiąca podstawę; ii) fosforan kwasu askorbinowego, promujący proliferację ludzkich komórek pluripotencjalnych; iii) selenian sodu, niezbędny do utrzymania długotrwałej hodowli; iv) FGF2 odpowiedzialny za utrzymanie niezróżnicowanego stanu hESC i hiPSC oraz za proliferację; v) insulina odpowiedzialna za proliferację oraz przeżywalność; vi) wodorowęglan sodu NaHCO3, pełniący funkcję buforu; vii) transferryna odpowiedzialna za przeżywalność hiPSC na początkowym etapie i wzrost klonalny; oraz viii) transformujący czynnik wzrostu β1 (ang. tumor growth factor β1, TGFβ1) zwiększający ekspresję NANOG i zapewniający stabilność komórek pluripotencjalnych. 6.2.4.2. Pożywka Essential 7 Pożywka Essential 7 (E7) jest pozbawiona czynnika wzrostu TGFβ1, który blokuje proces reprogramowania komórek somatycznych do hiPSC poprzez zahamowanie przejścia mezenchymalno-epitelialnego [141]. Pożywka E7 była używana w trakcie wyprowadzania linii hiPSC.4, według schematu na Rycinie 2. W toku dalszych badań okazało się, że hamujące działanie czynnika wzrostu TGFβ1 jest wydajnie niwelowane przez czynnik c-MYC [141], wchodzący w skład zestawu do reprogramowania CytoTuneTM-IPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit. Pożywkę E8 wykorzystano zatem do otrzymania linii hiPSC.1 oraz hiPSC.2 6.2.4.3. Pożywka Essential 6 Pożywka Essential 6 (E6) pozbawiona jest zarówno czynnika TGFβ1, jak i FGF2. Oba czynniki są w głównej mierze odpowiedzialne za utrzymanie hiPSC w stadium pluripotencjalności. Brak tych białek umożliwia stworzenie na bazie E6 pożywek umożliwiających różnicowanie do komórek wywodzących się ze wszystkich trzech linii zarodkowych: endodermy, mezodermy oraz ektodermy [142]. W przypadku gdy hESC bądź hiPSC hodowane w E6 nie zostaną ukierunkowane w stronę pożądanego typu komórek za pomocą dodatkowych czynników, powinno dojść do spontanicznego różnicowania do komórek wywodzących się ze wszystkich trzech listków zarodkowych. Jest to jeden z podstawowych testów in vitro pozwalających potwierdzić pluripotencjalny fenotyp komórek macierzystych [143]. 6.3. Ciałka zarodkowe i spontaniczne różnicowanie W celu uformowania ciałek zarodkowych przetestowano trzy protokoły, opisane przez Y. Lin i G. Chen [144]: metodę wiszącej kropli, metodę samoagregacji oraz metodę z nieadherentną płytką 96-dołkową o U-kształtnym dnie. Każda z nich zaczynała się od pasażu hiPSC oraz dokładnego rozbicia kolonii na pojedyncze komórki poprzez rozpipetowanie. W przypadku metody wiszącej kropli, 5x103 komórek zawieszonych w 100 µL pożywki E8 z inhibitorem ROCK, nakładanych było na wewnętrzną stronę wieczka szalki hodowlanej o średnicy 10 cm. Następnie płynnym ruchem wieczko było obracane i nakładane na spodnią część płytki zawierającej 10 mL PBS. PBS jest istotny dla zachowania odpowiedniej wilgotności w płytce. Po 48 godzinach hodowli w inkubatorze krople przenoszone są na nieadherentną szalkę o średnicy 10 cm. Uformowane ciałka zarodkowe były następnie hodowane w pożywce E6 do dnia piątego. Metoda samoagregacji polega na pasażu komórek hiPSC w proporcji 1:1 i wysianiu na nieadherentną szalkę o średnicy 10 cm w pożywce E8 z 4 mg/mL alkoholu poliwinylowego (ang. polivinyl alcohol, PVA), dodawanego w celu zwiększenia gęstości pożywki i ułatwienia formowania ciałek zarodkowych. Na następny dzień, gdy ciałka zarodkowe o różnej wielkości są już uformowane, pożywka jest wymieniana na pożywkę E6 i hodowla jest kontynuowana do dnia piątego. Formowanie ciałek zarodkowych z wykorzystaniem płytki 96-dołkowej o U-kształtnym dnie polegało na zawieszeniu 5x103 komórek w 100 µL pożywki E8 z inhibitorem ROCK oraz 4 mg/mL PVA. Płytki następnie były wirowane przy przeciążeniu 110 g, przez 3 minuty. Po 2 dniach hodowli w inkubatorze pożywka wymieniana była na pożywkę E6 i hodowla kontynuowano do dnia piątego. Dnia piątego uformowane ciałka zarodkowe przesiewane były na dołek płytki 48-dołkowej opłaszczonej odczynnikiem geltrex w pożywce E6. Pożywkę wymieniano co 2-3 dni. Czternastego dnia spontanicznego różnicowania komórki utrwalono i wykonano barwienie immunofluorescencyjne na markery wszystkich trzech linii zarodkowych (opis barwienia w rozdziale 6.8). W przypadku spontanicznego różnicowania mającego na celu ocenę zdolności różnicowania hiPSC do mezodermy oraz mezodermy sercowo-specyficznej (rozdział 7.8), dnia drugiego, zamiast pożywki E6 stosowano DMEM suplementowany 20% FBS. 6.4. Stabilne wyciszanie HO-1 w hiPSC 6.4.1. Wyciszanie poprzez stabilną inhibicję transkryptu HMOX1 (shRNA) 6.4.1.1. Produkcja wektorów lentiwirusowych kodujących shRNA przeciw HMOX1 Cztery plazmidy kodujące 29-merowe konstrukty (shHO-1 A-D) rozpoznające specyficznie transkrypt HMOX1 wraz z sekwencją kontrolną, nierozpoznającą sekwencji występujących w ludzkim genomie (kontrola scr – ang. scrambled), zostały zakupione z firmy OriGene (nr. kat. TL312388V). Komórki HEK 293T zostały transfekowane poszczególnymi plazmidami wraz z plazmidami pomocniczymi: pMD2.G (zawierający gen białka otoczki wirusowej) oraz psPAX2 (zawierający geny białek odpowiedzialnych za maszynerię replikacyjną lentiwirusów) zgodnie z protokołem opublikowanym przez J. Szulc wraz ze współpracownikami [145]. W skrócie: wysiano 1,4x107 komórek HEK293T na płytkę hodowlaną o średnicy 10 cm w pożywce DMEM z dodatkiem 10% FBS. Następnego dnia, gdy komórki miały ok. 70% konfluencji, wymieniono pożywkę na świeżą i dodano mieszaninę transfekcyjną składającą się z mieszaniny A: pMD2.G 6 µg, psPAX2 15 µg, plazmid z shRNA 20 µg w 450 µL 150 mM NaCl oraz mieszaniny B: 41 µL PEI (polietylenoimina, 2.58 µg/ml, Polysciences) uprzednio inkubowanym w 72oC przez 10 minut, w 450 µL 150 mM NaCl. Mieszaninę B dodano do mieszaniny A, wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po tym czasie mieszaninę transfekcyjną rozprowadzono równomiernie na całą powierzchnię płytki hodowlanej. Po 2 dniach zebrano pierwszą pulę wektorów lentiwirusowych w pożywce znad komórek HEK293T i dodano 10 mL świeżej pożywki. Przefiltrowaną (filtry 0,45 µm, Merck Millipore) pożywkę przechowywano w 4oC. Po 24 godzinach zebrano drugą partię wektorów w pożywce znad komórek HEK293T. Przefiltrowano jak w poprzednim kroku i całość oczyszczono poprzez ultrawirowanie (3 godziny przy przeciążeniu 23 000 g). Nadsącz odrzucono, a pelet wektorów zawieszono w 1 mL pożywki E8 i przechowywano w temperaturze -80oC. Pracując z wektorami wirusowymi, stosowano odpowiednie, dodatkowe zabezpieczenia a płyny mające z nimi styczność inaktywowano poprzez inkubację w podchlorynie sodu. 6.4.1.2. Transdukcja hiPSC wektorami lentiwirusowymi z shRNA Wysiano 2x104 hiPSC na dołek płytki 24-dołkowej, opłaszczonej odczynnikiem geltrex. Następnego dnia przygotowano mieszaninę transdukcyjną: 0,5 mL pożywki E8, polibren (końcowe stężenie 5 µg/ml, Sigma) oraz 50 µl pożywki z oczyszczonymi wirusami. Po dodaniu mieszaniny transdukcyjnej, komórki wirowano przez godzinę przy przeciążeniu 800 g. Następnego dnia komórki przemyto dwukrotnie PBS z jonami i dodano świeżą pożywkę E8. Selekcję antybiotykową (0,5 µg/mL puromycyna, Sigma) transdukowanych komórek rozpoczęto 48 godzin po transdukcji. Wyciszenie HMOX1 na poziomie mRNA potwierdzono na podstawie analizy qRT-PCR. 6.4.2. CRISPR/Cas9 W celu edycji genomu, prowadzącej do całkowitego wyłączenia ekspresji HMOX1, wykorzystano system CRISPR wraz z nukleazą Cas9 [146]. Plazmidy pX459 zawierające gen oporności na puromycynę, nukleazę Cas9 oraz sekwencje sgRNA (ang. single guide RNA, pojedyncze, przewodnie RNA), specyficznie rozpoznające egzon drugi genu HMOX1 (odpowiednio sgRNA 1 i sgRNA 2) otrzymano dzięki uprzejmości mgr Marii Czarnek oraz prof. Berety [147]. 6.4.2.1. Elektroporacja Plazmidy pX459 z sgRNA 1, sgRNA 2 oraz kontrolny, bez sgRNA zostały wprowadzone do hiPSCs na drodze nukleofekcji, przy użyciu zestawu Human Stem Cell NucleofectorTM Kit-1 (Lonza), zgodnie z zaleceniami producenta. W skrócie: 5 µg plazmidu dodano do 100 µL mieszaniny Nucleofector® Solution, zawierającej 5x105 komórek. Całość przeniesiono do aluminiowej kuwety i przeprowadzono elektroporację na urządzeniu Nucleofector™ 2b (Lonza), wykorzystując program A-023. Następnie całość wysiano na dołek płytki 6-dołkowej opłaszczonej odczynnikiem geltrex w pożywce E8 z inhibitorem ROCK. Po 24 godzinach wymieniono pożywkę na świeżą E8, z dodatkiem puromycyny (0.5 µg/ml). Po kolejnych 24 godzinach wymieniono pożywkę na E8 bez dodatku puromycyny. Pożywkę wymieniano codziennie, aż do osiągnięcia około 60-70% konfluencji. 6.4.2.2. Klony z pojedynczych komórek Po 4-5 dniach od elektroporacji i selekcji antybiotykowej, gdy komórki osiągnęły około 60-70% konfluencji, przemyto je dwukrotnie PBS bez jonów, a następnie inkubowano 10-15 minut z 0,5 mM EDTA w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Następnie, wysiano 103 hiPSC na szalkę o średnicy 10 cm, opłaszczonej odczynnikiem geltrex w pożywce E8 z inhibitorem ROCK. Komórki hodowano przez około 2 tygodnie, aż kolonie wyrosłe z pojedynczych komórek były widoczne makroskopowo. Następnie przy użyciu końcówki do pipety 10 µl zdrapano kolonie i przeniesiono na dołek płytki 96 dołkowej, opłaszczonej odczynnikiem geltrex. Komórki hodowano w E8 aż do osiągnięcia ok. 60-70% konfluencji. 6.4.2.3. Trawienie nukleazą heterodupleksów DNA - analiza Surveyor nuclease assay W celu potwierdzenia wprowadzenia mutacji w genie HMOX1 przez CRISPR/Cas9, przeprowadzono analizę typu Surveyor nuclease assay. Nukleaza z ekstraktu z selera [147] rozpoznaje niesparowane fragmenty DNA i przecina je, co jest podstawą omawianej analizy. Ekstrakt z selera został użyczony dzięki uprzejmości mgr Marii Czarnek oraz prof. Berety z Zakładu Biochemii Komórki, UJ. W pierwszym kroku namnożono reakcją PCR fragment egzonu drugiego, w którym spodziewano się mutacji, przy użyciu pary starterów HO1_surv: F 5` AGC CAG CTT TGT GTT CAC CT 3` oraz R 5` GAG GCA CCC TCA GTC TCA CT 3`: wstępna denaturacja 95oC, 3 minuty; 35 cykli: 95oC, 20 sekund; 60oC, 15 sekund; 72oC, 45 sekund; końcowa inkubacja 72oC, 2 minuty. Następnie przystąpiono zmieszano 4,5 µL produktu reakcji PCR z komórek kontrolnych, 4,5 µL produktu reakcji PCR z komórek poddanych modyfikacji oraz 1,5 µL 10x buforu (100 mM HEPES pH 7.5, 100 mM MgSO4, 200 mM KCl, 0.2% Triton X-100, 2 μg/mL BSA) i przystąpiono do formowania heterodupleksów stosując następujący program: 95oC przez 10 minut, schładzanie z 95 do 85oC z prędkością 2oC/s, następnie schładzanie z 85 do 25oC z prędkością 0.25oC/s oraz inkubacją w 25oC przez 1 minutę. Powstałe heterodupleksy zostały pocięte nukleazą z ekstraktu selera – do mieszaniny z poprzedniego etapu dodano 3,5 µL H2O oraz 1 µL ekstraktu. Reakcję prowadzono przez 45 minut w temperaturze 45oC. Otrzymane produkty rozdzielano poprzez elektroforezę w 2% żelu agarozowym. 6.4.2.4. Elektroforeza DNA W celu rozdzielenia produktów PCR oraz końcowych produktów analizy Surveyor nuclease assay przeprowadzano elektroforezę w żelu agarozowym. Żel agarozowy o stężeniu 2% przygotowywano poprzez dodanie 2g agarozy (Sigma) do 100 mL buforu Tris-borate-EDTA (TBE – 890 mM Tris, 890 mM kwas borowy oraz 2 mM EDTA). W celu rozpuszczenia agarozy ogrzewano mieszaninę w kuchence mikrofalowej. Po całkowitym rozpuszczeniu agarozy i częściowym ochłodzeniu mieszaniny dodawano bromek etydyny (końcowe stężenie 0,2 µg/mL), w celu wizualizacji DNA przy użyciu transiluminatora UV. Próbki PCR mieszano z buforem obciążającym DNA Gel Loading Dye (6X; Thermofisher). Jako wzorca mas używano markera DNA M100-1000 (DNA Gdańsk). Elektroforezę przeprowadzano przy napięciu 10 V/cm. 6.5. Różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów 6.5.1. PSC Cardiomyocyte Differentiation Prototype Różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów przy użyciu zestawu PSC Cardiomyocyte Differentiation Prototype (Gibco) zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami producenta: cztery dni przed rozpoczęciem różnicowania hiPSC wysiano na dołek płytki opłaszczonej odczynnikiem geltrex w pożywce E8 z dodatkiem inhibitora ROCK. Na następny dzień pożywkę wymieniano na świeżą, bez dodatku inhibitora ROCK. Wymienianie E8 kontynuowano do rozpoczęcia właściwego różnicowania. Po czterech dniach od wysiania komórek pożywkę wymieniano na pożywkę A. Następnie po dwóch dniach pożywkę A wymieniano na pożywkę B. Po kolejnych dwóch dniach pożywkę B wymieniano na pożywkę Cardiomyocyte Maitenance Medium (w dalszej części nazywana pożywką C). Zmianę pożywki C przeprowadzano co drugi dzień, aż do dnia 15, gdy kurczące się kardiomiocyty poddawane były dalszym analizom. 6.5.2. Metoda z użyciem małocząsteczkowych inhibitorów (GiWi) Różnicowanie metodą GiWi (ang. GSK3b inhibition, Wnt inhibition - GiWi) przeprowadzono zgodnie z protokołem opublikowanym przez X. Lian i współpracowników [62]: Cztery dni przed rozpoczęciem różnicowania hiPSC wysiano na dołek płytki opłaszczonej odczynnikiem geltrex w pożywce E8 z dodatkiem inhibitora ROCK. Na następny dzień pożywkę wymieniano na świeżą, bez dodatku inhibitora ROCK. Wymienianie pożywki E8 kontynuowano do rozpoczęcia właściwego różnicowania. Po czterech dniach, gdy komórki osiągały konfluencję 85-95%, E8 wymieniano na pożywkę RPMI 1640 (Thermofisher) z dodatkiem suplementu B27 bez insuliny (Thermofisher; w skrócie RPMI+B27-ins) oraz 8-12 µM CHIR99021 (Sigma), będącego inhibitorem kinazy GSK3β (ang. Glycogen synthase kinase 3β). Po 24 godzinach zmieniano pożywkę na RPMI+B27-ins, bez dodatku CHIR99021. Dnia 3 stymulowano komórki 5-7 µM IWR-1 (inhibitor szlaku Wnt/β-katenina, Abcam) w pożywce kondycjonowanej (połowa pożywki znad komórek oraz połowa świeżej pożywki). Po 2 dniach wymieniano pożywkę na RPMI+B27-ins. Od dnia 7 i następnie co 3 dni wymieniano pożywkę na RPMI+B27 z insuliną (RPMI+B27+ins). Komórki były gotowe do dalszych analiz 20 dnia różnicowania. Schemat różnicowania hiPSC do kardiomiocytów metodą GiWi przedstawiono na Rycinie 4. Rycina 4. Schematyczne przedstawienie protokołu różnicowania hiPSC do kardiomiocytów metodą GiWi. 6.6. Selekcja kardiomiocytów 6.6.1. PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit Selekcja na podstawie markerów powierzchniowych przy użyciu sortowania magnetycznego została przeprowadzona za pomocą zestawu PSC-Derived Cardiomyocyte isolation kit (Miltenyi Biotec). Protokół podzielony był na dwa etapy. W pierwszym etapie wyznakowaniu i odrzuceniu ulegają komórki niebędące kardiomiocytami. Drugi etap zakłada specyficzne wyznakowanie hiPSC-CM i pozwala na dodatkowe oczyszczenie populacji. W dniu 20 różnicowania przemywano komórki dwukrotnie PBS bez jonów, a następnie inkubowano 10 minut z Multi Tissue Digestion kit 3 w inkubatorze. Po tym czasie zbierano komórki w RPMI 1640 z dodatkiem 20% FBS i wirowano przez 5 minut przy przeciążeniu 200 g. Nadsącz odrzucano, a pelet komórek (do 5x106) zawieszano w buforze (PBS, 0.5% BSA oraz 2 mM EDTA). Następnie dodawano 20 µL Non-Cardiomyocyte Depletion Cocktail. Po dokładnym wymieszaniu poprzez pipetowanie, próbki inkubowano 5 minut w lodówce. Niespecyficznie związane przeciwciała odpłukiwano dodając 1 mL buforu i wirując 5 minut przy przeciążeniu 200 g. Nadsącz odrzucano, a pelet wyznakowanych komórek zawieszano w 80 µL buforu. Do mieszaniny komórek dodawano 20 µL Anti-Biotin MicroBeads i po dokładnym wymieszaniu inkubowano 10 minut w lodówce. Po tym czasie dodawano 400 µL buforu i całość nakładano na kolumny LS (Miltenyi Biotec), uprzednio przemyte 3 mL buforu, znajdujące się na stojaku magnetycznym. Przesącz, stanowiący wzbogaconą populację kardiomiocytów, zbierano do osobnej probówki. Kolumnę przemywano trzykrotnie 3 mL buforu i również zbierano przesącz. Otrzymaną zawiesinę wirowano 5 min przy przeciążeniu 200 g. Nadsącz odrzucano, a pelet komórek zawieszano w 80 µL buforu. Następnie dodawano 20 µL Cardiomyocyte Enrichment Cocktail i po dokładnym wymieszaniu inkubowano 10 minut w lodówce. Po tym czasie dodano 400 µL buforu i mieszaninę przeniesiono na kolumny LS znajdujące się na stojaku magnetycznym tak jak w poprzednim etapie. Po trzykrotnym przepłukaniu kolumn przesącz odrzucano, a związane do kolumny wyznakowane hiPSC-CM zebrano poprzez odłączenie stojaka magnetycznego i energiczne przemycie za pomocą 5 mL buforu. Następnie mieszaninę wirowano 5 minut przy przeciążeniu 200 g i wysiewano na płytki opłaszczone odczynnikiem geltrex, bądź utrwalano w celu wybarwienia na TNNT2 6.6.2. Selekcja metaboliczna Stosowana w tej pracy metoda selekcji metabolicznej opiera się na pracy opublikowanej przez A. Sharma i współpracowników [75], w której odpowiednio zmodyfikowano protokół różnicowania GiWi. W szczególności, 10 dnia różnicowania, gdy kurczące kardiomiocyty są już obserwowane, pożywka wymieniana jest na RPMI 1640 bez glukozy (Thermofisher), z dodatkiem suplementu B27 z insuliną oraz 6 mM mleczanem sodu (Sigma). Po 3 dniach hodowli w pożywce pozbawionej glukozy, w celu odpłukania obumierających komórek niebędących kardiomiocytami, przeprowadzano pasaż z użyciem trypsyny. Komórki przemywano się dwukrotnie PBS bez jonów, a następnie inkubowano z 0,25% trypsyną (Thermofisher) 30 minut w inkubatorze. Następnie zawiesina pojedynczych komórek była przenoszona do probówki z RPMI 1640 z 20% FBS. Po odwirowaniu (5 minut, 200 g) nadsącz usuwano, a pelet komórek zawieszano w RPMI bez glukozy z suplementem B27 i mleczanem sodu. Komórki wysiewano na nowe płytki opłaszczone odczynnikiem geltrex i kontynuowano selekcję metaboliczną przez kolejne 3 dni. Po łącznie 6 dniach tego procesu przywracano standardową pożywkę z glukozą (RPMI+B27+insulina). Po 4 dniach hodowli w standardowych warunkach oczyszczona populacja kardiomiocytów była wykorzystywana do dalszych analiz. Schemat zmodyfikowanego protokołu GiWi przedstawiono na Rycinie 5. A picture containing meter Description automatically generated Rycina 5. Schematyczne przedstawienie zmodyfikowanego protokołu GiWi. 6.7. Analiza wydajności różnicowania metodą cytometrii przepływowej Dwudziestego dnia różnicowania komórki hiPSC-CM przemywano dwukrotnie PBS bez jonów, a następnie inkubowano 30 minut z 0,25% trypsyną w inkubatorze. Po tym czasie zbierano komórki w RPMI 1640 z dodatkiem 20% FBS. Wirowano 5 minut przy przeciążeniu 200 g. Nadsącz odrzucano, a pelet komórek zawieszano w PBS bez jonów i ponownie płukano. Następnie pelet zawieszano w 250 µL PBS z dodatkiem 4% FBS i utrwalano poprzez dodanie 250 µL 4% paraformaldehydu (PFA, Sigma), przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano 2 mL buforu FACS (ang. fluorescence activated cell sorting, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją; PBS+4%FBS) i wirowano 5 minut przy przeciążeniu 850 g. Komórki permeabilizowano poprzez zawieszenie peletu komórek w 200 µL 0,1% roztworu Triton X-100 (BioShop) w PBS, przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano 2 mL buforu FACS i wirowano 5 minut przy przeciążeniu 850 g. Pelet komórek zawieszano w 100 µL mieszaniny z przeciwciałem pierwszorzędowym rozpoznającym ludzką sercowo-specyficzną troponinę T, zawieszonym w buforze FACS (1:500, nr. kat. MA5-12960, Thermofisher). Komórki inkubowano 45 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie dodawano 2 mL buforu FACS i wirowano 5 minut przy przeciążeniu 850 g. Następnie inkubowano komórki z przeciwciałem drugorzędowym zawieszonym w buforze FACS (1:1000, przeciw-mysie AlexaFluor488 lub AlexaFluor568, Invitrogen) przez 30 minut w ciemności, w temperaturze pokojowej. Komórki przemywano poprzez dodanie 2 mL buforu FACS i zwirowanie 5 min przy przeciążeniu 200 g. Pelet zawieszano w 400 µL PBS z dodatkiem DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol, końcowe stężenie 200 ng/mL, Sigma), w celu wybarwienia jąder komórkowych. Kontrolę negatywną stanowiły próbki wybarwione jedynie przeciwciałem drugorzędowym. Tak przygotowane próbki mierzono przy pomocy cytometru przepływowego LSRFortessa (Beckton Dickinson). W pierwszym kroku ustawiono bramkę na całą mierzoną populację na podstawie parametrów SSC (ang. side-scattered light) vs. FSC (ang. forward-scattered light), odrzucając małe obiekty i artefakty. Następnie na podstawie parametrów FSC-W (ang. FSC-width) vs. FSC-H (ang. FSC-height) oraz SSC-W (ang. SSC-width) vs. SSC-H (ang. SSC-height) wyodrębniano pojedyncze komórki. Dodatkowe wyznakowanie barwnikiem DAPI, wiążącym się do DNA, pozwoliło wyodrębnić jądrzaste komórki, odrzucając artefakty pozostałe po bramkowaniu w poprzednich etapach. Na podstawie kontroli negatywnej (próbka barwiona jedynie przeciwciałem drugorzędowym, bez pierwszorzędowego) ustalano bramkę na komórki wykazujące ekspresję sercowo-specyficznej troponiny T (ang. cardiac troponin T2, TNNT2). Strategia bramkowania została przedstawiona na Rycinie 6. Rycina 6. Strategia bramkowania komórek TNNT2 pozytywnych. Opis w tekście. 6.7.1. Analiza wydajności różnicowania z farmakologiczną modulacją aktywności HO-1 Komórki hiPSC w trakcie różnicowania, podczas każdej zmiany pożywki, były dodatkowo stymulowane jednym z trzech związków: CoPP (protoporfiryna IX kobaltu), heminą (protoporfiryna IX żelaza Fe3+) lub SnPP (protoporfiryną IX cyny). Dwa pierwsze (CoPP i hemina) indukują ekspresję HO-1, natomiast SnPP jest inhibitorem aktywności HO-1 [107]. Rozpuszczalnikiem dla CoPP i SnPP był DMSO, natomiast dla heminy NaOH w PBS (końcowe stężenie 2 µM). 20 dnia różnicowania została przeprowadzona analiza cytometryczna obecności sercowo-specyficznego markera TNNT2 zgodnie z opisem 6.7. 6.8. Barwienia immunofluorescencyjne W celu wykonania barwienia immunofluorescencyjnego, w pierwszym etapie komórki były dwukrotnie przemywane PBS bez jonów, a następnie utrwalane w 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej. PFA odpłukiwano poprzez trzykrotne przemycie komórek PBS bez jonów, po 5 minut w temperaturze pokojowej, na kołysce. W celu permeabilizacji błony komórkowej, komórki inkubowano z 0.1% roztworem Triton X-100 przez 10 minut. Następnie, po trzykrotnym płukaniu PBS, niespecyficzne miejsca wiązań były blokowane poprzez godzinną inkubację w 3% roztworze BSA w PBS bez jonów, w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano roztwór przeciwciał (lista przeciwciał, wraz z rozcieńczeniami, znajduje się w Tabeli 1) w buforze blokującym (3% BSA w PBS bez jonów). Komórki inkubowano przez noc w temperaturze 4oC, na kołysce. Następnego dnia komórki przepłukiwano trzykrotnie PBS bez jonów i dodawano odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (Tabela 2), wraz z dodatkiem Hoechst 33342 (1 µg/ml, Thermofisher), w celu wizualizacji jąder komórkowych. Komórki inkubowano 2 godziny w temperaturze pokojowej, następnie trzykrotnie przepłukiwano PBS bez jonów. Kontrolę negatywną stanowiły komórki inkubowane jedynie z przeciwciałami drugorzędowymi, bez uprzedniej inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Zdjęcia wybarwionych komórek wykonano na mikroskopie fluorescencyjnym Nikon Eclipse TS100. Tabela 1. Pierwszorzędowe przeciwciała użyte do barwień immunofluorescencyjnych. Markery pluripotencji Przeciwciało Typ przeciwciała Rozcieńczenie Producent (nr katalogowy) OCT3/4 Kozie, poliklonalne 1:200 Santa Cruz (sc8628) NANOG Królicze, poliklonalne 1:100 Santa Cruz (sc33759) SSEA4 Mysie, monoklonalne 1:100 Millipore (90231) TRA 1-61 Mysie, monoklonalne 1:100 Millipore (90232) TRA 1-81 Mysie, monoklonalne 1:100 Millipore (90233) Markery trzech linii zarodkowych NFH Królicze, poliklonalne 1:200 Abcam (ab8135) Wimentyna Królicze, monoklonalne 1:250 Abcam (ab92547) GATA4 AFP Mysie, monoklonalne Kozie, poliklonalne 1:200 1:200 Santa Cruz (sc25310) Santa Cruz (sc-8108) α-SMA Królicze, poliklonalne 1:200 Abcam (ab5694) TNNT2 Mysie, monoklonalne 1:200 Thermofisher (MA5-12960) Tabela 2. Drugorzędowe przeciwciała użyte do barwień immunofluorescencyjnych. Przeciwciała drugorzędowe Przeciwciało Typ przeciwciała Rozcieńczenie Producent (nr katalogowy) Anty-mysie AlexaFluor488 Kozie, poliklonalne 1:400 Thermofisher (A10667) Anty-mysie AlexaFluor568 Kozie, poliklonalne 1:400 Thermofisher (A11036) Anty-królicze AlexaFluor 488 Kozie, poliklonalne 1:400 Thermofisher (A1008) Anty-królicze AlexaFluor 568 Kozie, poliklonalne 1:400 Thermofisher (A11011) Anty-kozie AlexaFluor488 Królicze, poliklonalne 1:400 Thermofisher (A11078) 6.9. Analiza ekspresji białek metodą Western Blot W celu półilościowej analizy ekspresji badanych białek użyto metody Western Blot. Komórki zebrane w trakcie pasażu dwukrotnie przemywano PBS i wirowano 5 minut w temperaturze 4oC, 200 g. Następnie pelet komórek zawieszano w 50-80 µL buforu lizującego zawierającego 1% roztwór detergentu Triton X-100 oraz inhibitory proteaz (Roche). Po 30-minutowej inkubacji na lodzie komórki wirowano w temperaturze 4oC przez 10 minut, 10 000 g. Lizat białkowy znajdujący się w nadsączu przenoszono do nowego, schłodzonej probówki typu eppendorf. Wyizolowane białko przechowywano w temperaturze -20oC do czasu dalszych analiz. Do pomiaru stężenia wyizolowanego białka używano testu z kwasem bicynchoninowym (BCA) i siarczanem miedzi (Sigma), zgodnie z zaleceniami producenta. Do przygotowania próbek używano 5-40 µg białka. Próbki w buforze obciążającym [5x stężonym - 50% glicerol, 10% SDS (ang. sodium dodecyl sulfate, dodecylosiarczan sodu), 0,25% błękitu bromofenolowego oraz 25% β-merkaptoetanolu] denaturowano (95oC, 5 minut), a następnie schładzano i nakładano na dołek studzienki 12% żelu poliakrylamidowego. Jako wzorca mas użyto Prestained Protein Molecular Weight Marker (Thermofisher). Rozdział elektroforetyczny (SDS-PAGE) prowadzono w buforze elektrodowym (25 mM Tris-HCL, 192 mM glicyna, 0,5% SDS, pH 8.3) początkowo przez 15 minut przy napięciu 80 V, a następnie napięcie zwiększano do 160 V i kontynuowano rozdział przez 40 minut. W kolejnym kroku przenoszono rozdzielone białka z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową za pomocą mokrego transferu (100 V, 1 godzina) w buforze do transferu (25 mM Tris-HCl, 192 mM glicyna, pH 8.3 20% v/v metanolu). Niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał blokowano przez 2 godziny w 5% roztworze odtłuszczonego mleka (SM Gostyń) w buforze PBST [0,05% Tween-20 (POCH) w buforze PBS]. Następnie membrany inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi (rozcieńczone w buforze blokującym) przez noc w temperaturze 4oC: anty-HO-1 (Enzo, ADI-SPA-894, 1:250) oraz anty-tubulina (Merck, DM1A, 1:1000). Na drugi dzień membrany płukano trzykrotnie po 10 minut w PBST i inkubowano 1 godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałami drugorzędowymi, sprzęgniętymi z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonymi w buforze blokującym [kozie anty-królicze (BD Biosciences 1:10 000) oraz kozie anty-mysie (Cell Signalling, 1:10 000)]. Po trzykrotnym przepłukaniu w buforze PBST, membrany inkubowano 5 minut w substracie dla HRP (Immobilian Western Chemiluminescent HRP substrate, Millipore), a następnie przeprowadzano detekcję sygnału chemiluminescencyjnego przy użyciu urządzenia ChemiDoc (Bio-Rad). 6.10. Izolacja RNA i odwrotna transkrypcja Izolację RNA przeprowadzono przy użyciu zmodyfikowanej metody Chomczyńskiego [148] z wykorzystaniem Fenozolu (A&A Biotechnology). Stężenie i czystość uzyskanego RNA określano za pomocą spektrofotometru NanoDrop N-1000 (Thermofischer) poprzez pomiar absorbancji przy długości fal 230 nm, 260 nm oraz 280 nm. 300-1000 ng RNA poddawano reakcji odwrotnej transkrypcji zestawem RevertAid Reverse Transcriptase (Thermofischer), zgodnie z zaleceniami producenta. 6.11. Ilościowa analiza qRT-PCR W celu ilościowej analizy badanych transkryptów, przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji z uzyskanego RNA, przy użyciu zestawu firmy Thermofisher, zgodnie z zaleceniami producenta. Otrzymane w wyniku odwrotnej transkrypcji cDNA używano jako matrycy do reakcji qRT-PCR (ang. quantitative real-time polymerase chain reaction, ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym) przy użyciu zestawu SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (Sigma), zgodnie z zaleceniami producenta. Lista specyficznych dla danego transkryptu par starterów znajduje się w Tabeli 3. Po każdej reakcji przeprowadzano analizę krzywych topnienia produktów, w celu wykluczenia powstawania niespecyficznych produktów lub dimerów starterów. W trakcie analizy wyników, jako odniesienia, używano transkrypt genu metabolizmu podstawowego - eukariotycznego czynnika elongacji 2 (EEF2 – ang. eukaryotic elongation factor 2) dla hiPSC oraz genu TNNT2 dla hiPSC-CM. Następnie obliczano różnicę wartości CT (numer cyklu, w którym fluorescencja barwnika wiążącego się ilościowo do powstającego produktu przekracza wartość graniczną) pomiędzy genem referencyjnym, a badanym genem, zgodnie z równaniem: ΔCT = CT(badanego genu) - CT(genu referencyjnego) Na podstawie obliczonej wartości ΔCT wyznaczano względną ekspresję badanego genu na podstawie wzoru: względny poziom ekspresji = 2-ΔCT Tabela 3. Startery użyte w analizie qRT-PCR Gen Starter 1 Starter 2 EEF2 TCAGCACACTGGATAGAGG GACATCACCAAGGGTGTGCA TNNT2 ATCCAGAACGCCCAGACAGA GCTGCTTGAACTTCTCCTGC NANOG GAAGACAAGGTCCCGGTCAA ACCATTGCTATTCTTCGGCCA DPPA2 CCGTCCCCGCAATCTCCTTCCATC ATGATGCCAACATGGCTCCCGGTG SALL4 TGTGGCGGAGAGGGCAAATA GTGGCTTCATCCTCACTCGC DNMT3B GGAGAAAGCTAGGGTGCGAG AATTCCCTACTGCCTGCAGGA GATA6 TCCCCCACAACACAACCTAC TGTAGAGCCCATCTTGACCC ISL1 TGATGAAGCAACTCCAGCAG GGACTGGCTACCATGCTGTT MIXL1 GGTACCCCGACATCCACTT GAGACTTGGCACGCCTGT KCNQ TCTGTCTTTGCCATCTCCTTC CCTCCATGCGGTCTGAATG KCNH AATCGCCTTCTACCGGAAAG CACCATGTCCTTCTCCATCAC SCN5A GAGCTCTGTCACGATTTGAGG GAAGATGAGGCAGACGAGGA CACNA CAGAGGCTACGATTTGAGGA GCTTCACAAAGAGGTCGTGT 6.12. Pomiar aktywność elektrofizjologicznej metodą whole-cell patch clamp Elektrofizjologiczne pomiary potencjału czynnościowego hiPSC-CM metodą whole-cell patch clamp zostały przeprowadzone we współpracy z Zakładem Neurofizjologii i Chronobiologii z Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych UJ. Dwudziestego dnia różnicowania przesiewano hiPSC-CM na szkiełka opłaszczone odczynnikiem geltrex. Po 3 dniach od wysiania stymulowano komórki przez 3 dni 10 µM CoPP lub CORM2 (ang. CO-releasing molecule II, Tricarbonyldichlororuthenium(II), związek uwalniający CO, Sigma). Kontrolę dla CoPP stanowił rozpuszczalnik (DMSO), natomiast dla CORM2 kontrolę stanowiły: rozpuszczalnik (DMSO) oraz iCORM (ang. inactivated CORM, inaktywowany CORM). Dla uzyskania iCORM inaktywowano CORM2 poprzez całonocną inkubację w 37oC i worteksowanie przez 5 minut. Aktywność elektryczna hiPSC-CM została zmierzona pipetą ze szkła borokrzemowego (7-9 MΩ), uzyskaną na wyciągarce horyzontalnej (Sutter Instruments, Novato, USA), zawierającą sztuczny roztwór wewnątrzkomórkowy o składzie: 125 mM K-glukonian, 20 mM KCl, 5 mM NaCl, 10 mM HEPES [ang. 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid]. Komórki były rejestrowane w ciągłym przepływie pożywki zewnątrzkomórkowej (roztworu Tyrode'a) o składzie: 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2 x 2H2O, 1 mM MgCl2 x 6H2O, 5.5 mM glukoza oraz 5 mM HEPES (pH = 7.4) i temperaturze 37oC. Sygnał był wzmacniany przez wzmacniacz SC 05LX (NPI), filtrowany filtrem dolnoprzepustowym 2 kHz i próbkowany z częstotliwością 20 kHz. Potencjał złącza wynoszący -15 mV był odejmowany od rejestrowanych wartości potencjału błonowego. Rejestracje whole-cell patch clamp prowadzone były w programie Signal (Cambridge Electronic Design Inc.). W trybie current clamp badany był kształt wywołanego potencjału czynnościowego, przez stymulację krótkimi pulsami prądowymi (czas trwania: ~10 milisekund, amplituda: 180~pA), powtarzanymi dziesięć razy w interwałach 1-sekundowych (1Hz). Prąd utrzymania był manualnie dostosowywany, tak aby potencjał błonowy wynosił -75 mV. 6.13. Analiza transkryptomu RNA-Seq Analiza transkryptomu komórek niezróżnicowanych oraz zróżnicowanych WT (ang. wild type, kontrolne) i HO-1 KO hiPSC została przeprowadzona we współpracy z Laboratorium ds. Badań nad Zmiennością Genomu Ludzkiego z Małopolskiego Centrum Biotechnologii. Wszystkie odczynniki i urządzenia wykorzystane do analizy transkryptomu zostały zakupione z firmy Thermofisher. W celu wykrycia zmian wynikających wyłącznie z braku HO-1, a nie wynikających z podłoża genetycznego linii macierzystej, do pomiarów wykorzystano dwie linie hiPSC. hiPSC.1 próbki: WT4, KO3 i KO4. hiPSC.2 próbki: WT1, WT2, WT3, KO1, KO2. RNA przeznaczone na analizę transkryptomu wyizolowano z wykorzystaniem zestawu mirVana™ miRNA Isolation Kit zgodnie z zaleceniami producenta. Przed sporządzeniem bibliotek, jakość RNA została sprawdzona na urządzeniu Agilent 2100 Bioanalyzer przy użyciu zestawu RNA 6000 Nano Kit (Agilent). Biblioteki RNA dla łącznie 16 próbek zostały przygotowane z użyciem zestawu Ion AmpliSeq™ Transcriptome Human Gene Expression Kit (Thermofisher), zgodnie z protokołem dołączonym przez producenta. Jako materiał wyjściowy wykorzystano próbki o zawartości 60 ng RNA. Następnie biblioteki połączono w równomolowych ilościach i poddano sekwencjonowaniu z wykorzystaniem sekwenatora Ion Prot Sequencer, przy użyciu zestawu odczynników do sekwencjonowania Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit oraz chipów Ion PI Chip v3. Analiza bioinformatyczna została przeprowadzona na serwerze Torrent Suite Server v5.12.1. Odczyty dopasowano do bazy referencyjnej hg19 AmpliSeq Transcriptome ERCC v1 i zliczone przez program Torrent Coverage Analysis Plugin. Otrzymane wyniki ekspresji genów znormalizowano, a analizę różnicową wykonano przy pomocy pakietu DESeq2 dostępnego w oprogramowaniu R wersji 3.3.3. 6.14. Seahorse XF - pomiar aktywności metabolicznej W celu określenia aktywności metabolicznej hiPSC-CM wykorzystano urządzenie mierzące zużycie tlenu Seahorse XF (Agilent). 104 hiPSC-CMs wysiewano na dołek płytki 96 dołkowej Seahorse XF96 Cell Culture Microplate w pożywce RPMI+B27+ins. Następnie, hiPSC-CM były stymulowane 10 µM CoPP przez 24, 48 oraz 72 godzin. Bezpośrednio przed pomiarem zmieniano pożywkę na DMEM, bez substancji buforującej. Następnie płytki były inkubowane w 37oC w inkubatorze bez CO2 przez godzinę. Urządzenie Seahorse XF zostało zaprogramowane tak, aby w pierwszej kolejności przeprowadzić 3 pomiary w odstępach 10 min, bez żadnej stymulacji, co pozwoliło na wyznaczenie oddychania podstawowego. Następnie przez odpowiednie porty w nakładce na płytki Seahorse XF96 wprowadzano najpierw oligomycynę (końcowe stężenie 1.5 µg/ml). Po 10 minutach inkubacji przeprowadzono serię 3 pomiarów co 10 minut, co pozwoliło obliczyć poziom produkcji ATP. Następnie, wprowadzono FCCP [ang. Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone] w końcowym stężeniu 800 µM. Po inkubacji i serii pomiarów jak w poprzednim kroku można było wyznaczyć oddychanie maksymalne. Na końcu wprowadzono mieszaninę składającą się z rotenonu (końcowe stężenie 1 µM) oraz antymycyny A (końcowe stężenie 1 µM) i przeprowadzono pomiary jak w poprzednich krokach. Wszystkie zastosowane inhibitory zostały zakupione w firmie Sigma. Schematyczne przedstawienie przeprowadzanego doświadczenia znajduje się na Rycinie 7. Sposób obliczania poszczególnych parametrów został przedstawiony w Tabeli 4. Rycina 7. Schematyczne przedstawienie doświadczenia z użyciem urządzenia Seahorse XF. Opis znajduje się w tekście. Schemat zaadaptowany z www.agilient.com. Tabela 4. Tabela przedstawiająca sposób obliczania poszczególnych parametrów aktywności metabolicznej. Tabela została zaadaptowana z www.agilentl.com. Parametr Sposób obliczenia Pozamitochondrialne oddychanie Najniższy odczyt po dodaniu rotenonu i antymycyny A Oddychanie podstawowe (ostatni odczyt przed dodaniem oligomycyny) – pozamitochondrialne oddychanie Oddychanie maksymalne (najwyższy odczyt po dodaniu FCCP) – (pozamitochondrialne oddychanie) Przeciek protonów (najniższy odczyt po dodaniu oligomycyny) – (pozamitochondrialne oddychanie) Produkcja ATP (ostatni odczyt przed dodaniem oligomycyny) – (najniższy odczyt po dodaniu oligomycyny) Zapasowa pojemność oddechowa [%] (oddychanie maksymalne) / (oddychanie podstawowe) x 100 6.15. Pomiar aktywności błon mitochondrialnych W celu pośredniego zmierzenia potencjału błonowego mitochondriów wykorzystano związek TMRM (Thermofisher), który wiążę się do błon aktywnych mitochondriów. W pierwszym kroku hiPSC-CM zbierano za pomocą trypsyny. Następnie 5x104 komórek zawieszano w 500 µL pożywki RPMI+B27+ins z TMRM (końcowe stężenie 20 nM) i inkubowano 30 minut w inkubatorze. Po tym czasie do probówki dodawano 2 mL pożywki RPMI+B27+ ins, bez TMRM, i wirowano przez 5 minut przy przeciążeniu 200 g. Nadsącz odrzucano, a pelet komórek zawieszano w 400 µL pożywki RPMI+B27+ins. Następnie przeprowadzono analizę przy użyciu cytometru przepływowego LSRFortessa. Strategię bramkowania przedstawiono na Rycinie 8. Bramkowanie nieutrwalonych hiPSC-CM przeprowadzono podobnie jak przedstawiono na Rycinie 6, ale bez etapu wyodrębniania komórek jądrzastych. Barwienie DAPI posłużyło do wyodrębnienia komórek żywych. Potencjał błonowy mitochondriów określano jako medianę wartości intensywności zmierzonej fluorescencji TMRM. A close up of a map Description automatically generated Rycina 8. Strategia bramkowania komórek TMRM pozytywnych. Opis w tekście. 6.16. Ocena kariotypu 6.16.1. Analiza zmienności liczby kopii DNA Analiza zmienności liczby kopii DNA (CNV, ang. copy number variation, zmienność liczby kopii DNA) komercyjnie dostępnej linii HPSI1013i-kuxp_1 (http://www.hipsci.org/, nazywanej w pracy hIPSC.2) została wykonana przez producenta, zgodnie z protokołem opublikowanym przez P. Danecek i współpracowników [149]. Metoda ta opiera się na metodzie analizy polimorfizmu SNP (ang. – single nucleotide polymorphism, polimorfizm pojedynczego nukleotydu) pojedynczego genu w skali całego genomu. Zmodyfikowana metoda SNP pozwala na wykluczenie aneuploidyzmu w testowanej linii oraz oszacowanie liczby chromosomów. 6.16.2. Analiza kariotypu Analiza kariotypu linii hiPSC.2 została przeprowadzona przez zewnętrzną pracownię cytogenetyczną Kariogen. Szczegółowa analiza chromosomów polega na zablokowaniu podziałów aktywnie proliferujących komórek za pomocą kolchicyny. Alkaloid ten blokuje powstawanie mikrotubul wrzeciona kariokinetycznego, blokując tym samym rozdzielanie chromosomów podczas podziału komórkowego. Następnie, za pomocą roztworu KCl, ciągłość błon komórkowych jest przerywana, a chromosomy są utrwalane w roztworze kwasu octowego i metanolu. Utrwalone chromosomy poddawane są barwieniu prążków G. Wybarwione prążki są następnie analizowane przy użyciu mikroskopu świetlnego i odpowiedniego oprogramowania [150]. 6.17. Wykorzystane linie hiPSC Łącznie w trakcie powstawania pracy doktorskiej wykorzystano 5 linii hiPSC: linia H1 oraz hiPSC.1-4. Linia H1 została wyprowadzona i scharakteryzowana przez mgr Ewę Janosz [151]. Linią wyjściową były fibroblasty BJ, a do reprogramowania użyto wektorów lentiwirusowych z policistronową sekwencją STEMCCA [ang. stem cell cassette] kodującą czynniki Yamanaki (OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC) [152]. Pomimo iż zastosowano metodę skutkującą integracją tej sekwencji do genomu, w trakcie kolejnych pasaży doszło do wyciszenia transgenu, co zostało potwierdzone reakcją PCR. Linia H1 była wykorzystywana na początkowym etapie do porównania protokołów różnicowania GiWi oraz PSC. Następnie wyprowadzono i scharakteryzowano linie hiPSC.1 oraz hiPSC.4. Zakupiono również komercyjnie dostępną linię HPSI1013i-kuxp_1 (nazywaną w pracy hiPSC.2). Wszystkie omawiane linie zostały otrzymane przy użyciu nieintegrujących wektorów Sendai. Linią wyjściową dla hIPSC.1 oraz hIPSC.4 były fibroblasty BJ, natomiast dla hiPSC.2 donorem fibroblastów był zdrowy, biały mężczyzna w przedziale wiekowym 25-29 lat. Ze względu na niską wydajność różnicowania, linia hiPSC.4 nie była wykorzystywana w dalszych badaniach. Linia hiPSC.3 została wyprowadzona i scharakteryzowana przez mgr Kalinę Andrysiak. Komórkami wyjściowymi były leukocyty krwi obwodowej, pobrane od zdrowego mężczyzny (zgoda Komisji Bioetycznej UJ nr 122.6120.303.2016). Do reprogramowania również wykorzystano nieintegrujące wektory Sendai. W opisie doświadczeń wyszczególniono, która linia hiPSC została wykorzystana do danego doświadczenia. 6.18. Wykorzystane programy komputerowe i analiza statystyczna Wykresy oraz analiza statystyczna zostały przygotowane w programie GraphPad Prism 8. W celu określenia istotności statystycznej, gdy porównywano więcej niż 2 grupy, wykorzystywano jednostronny test ANOVA. W przypadku porównywania dwóch grup badawczych wykorzystywano jednostronny test t-Studenta. Wyniki, o ile nie zaznaczono inaczej, przedstawiono jako średnia (z wyszczególnionymi poszczególnymi pomiarami) wraz z odchyleniem standardowym. Liczba niezależnych powtórzeń została podana przy każdej rycinie. 7. Wyniki 7.1. Charakterystyka uzyskanych komórek hiPSC 7.1.1. Morfologia Komórki hiPSC są bardzo podobne do hESC zarówno pod względem profilu ekspresji genów, jak i morfologii. Niezróżnicowane hiPSC rosną w płaskich koloniach z wyraźnie widocznymi granicami, co zostało zaobserwowane przy pomocy mikroskopii jasnego pola (Ryc. 9 A. i B.). Rycina 9. Morfologia uzyskanych linii hiPSC. Zdjęcie (A.) hiPSC.1 oraz (B.) hiPSC.4 w jasnym polu. Odcinek skali reprezentuje 100 µm. 7.1.2. Ekspresja markerów specyficznych dla hESC Wykorzystywane w doświadczeniach linie hiPSC wykazywały ekspresję markerów charakterystycznych dla ludzkich komórek pluripotencjalnych: OCT3/4, SSEA-4 (ang. Stage-specific embryonic antigen), TRA-1-60, TRA-1-81 [ang. tumor-related antigen] oraz NANOG [13] (Ryc. 10 A. i B.). Rycina 10. Charakterystyka uzyskanych linii hiPSC. Barwienie immunofluorescencyjne markerów pluripotencji (NANOG, OCT3/4, SSEA4, TRA-1-61, TRA-1-80) linii (A.) hiPSC.1 oraz (B.) linii hiPSC.4. Odcinek skali reprezentuje 100 µm. 7.1.3. Spontaniczne różnicowanie Jedną z najważniejszych cech pluripotencjalnych komórek macierzystych, zarówno hESC, jak i hiPSC, jest zdolność różnicowania do komórek wywodzących się ze wszystkich trzech listków zarodkowych. Uniwersalnym testem, pozwalającym ocenić taką zdolność jest test spontanicznego różnicowania in vitro. Pierwszym jego etapem jest najczęściej formowanie tzw. ciałek zarodkowych, w których obrębie komórki mogą w ograniczonym zakresie odtwarzać wczesne stadia rozwoju zarodkowego i, przy braku czynników utrzymujących pluripotencjalny fenotyp komórek macierzystych, rozwijać się do pochodnych ektodermy, mezodermy i endodermy. W celu otrzymania ciałek zarodkowych przetestowano trzy metody: metodę wiszącej kropli, metodę samoagregacji oraz metodę z płytką 96-dołkową, o U-kształtnym dnie [144]. Ciałka zarodkowe zostały uformowane w przypadku każdej z trzech wykorzystanych metod (Ryc. 11 A.-C.). Jednak najwydajniejszą metodą okazała się metoda z wykorzystaniem płytki 96-dołkowej o U-kształtnym dnie. Na 24 wysiane dołki, we wszystkich zaobserwowano charakterystyczne trójwymiarowe struktury. Metoda wiszącej kropli cechowała się niższą wydajnością. Jedynie w 9 z 24 kropel uformowały się ciałka zarodkowe. Najmniej wydajnym sposobem okazała się metoda samoagregacji. Gdy wysiano podobną liczbę komórek jak w przypadku dwóch pierwszych metod, zaobserwowano jedynie 6 ciałek zarodkowych. W dalszych badaniach wykorzystujących proces spontanicznego różnicowania stosowano metodę z płytką 96-dołkową o U-kształtnym dnie. Ciałka zarodkowe uformowane z linii hiPSC.1 oraz hiPSC.4, pod nieobecność czynników wzrostu FGF2 i TGFβ1 zróżnicowały spontanicznie (Ryc. 11 D. – zdjęcia poglądowe), tworząc złożone struktury. Analiza immunofluorescencyjna potwierdziła ekspresję markerów charakterystycznych dla wszystkich trzech linii zarodkowych: mezodermy [wimentyna i α-SMA (ang. alpha smooth muscle actin – alfa aktyna mięśni gładkich)], endodermy [GATA4 (ang. GATA binding protein 4 – białko wiążące GATA) i AFP (ang. alpha fetoprotein – alfa fetoproteina)] oraz ektodermy [NFH (ang. neurofilament heavy chain – łańcuch ciężki neurofilamentu)] w obu przetestowanych liniach (Ryc. 11 E. i F.). Rycina 11. Formowanie ciałek zarodkowych i spontaniczne różnicowanie. Zdjęcie jasnego pola ciałek zarodkowych uformowanych z wykorzystaniem: (A.) płytek 96-dołkowych o U-kształtnym dnie, (B.) metody wiszącej kropli, (C.) nieadherentnej szalki o średnicy 10 cm i wytrząsania. (D.) Zdjęcia jasnego pola spontanicznie zróżnicowanych ciałek zarodkowych. Barwienie immunofluorescencyjne markerów trzech linii zarodkowych: wimentyna, α-SMA, GATA4, AFP (alfa fetoproteina) i NFH (łańcuch ciężki neurofilamentu), w liniach (E.) hiPSC.1 oraz (F.) hiPSC.4. Odcinek skali reprezentuje 100 µm. 7.2. Optymalizacja różnicowania hiPSC do kardiomiocytów Po wyprowadzeniu linii hiPSC oraz potwierdzeniu ich pluripotencjalnego fenotypu, przystąpiono do optymalizacji metody różnicowania hiPSC do kardiomiocytów. Spośród kilku opisanych do 2015 roku metod, zdecydowano się przetestować dwie: komercyjnie dostępny zestaw prototypowy PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit Prototype (metoda PSC) oraz metodę GiWi opracowaną przez X. Lian i współpracowników [62]. 7.2.1. Metoda PSC Zgodnie z wytycznymi producenta, dla wydajnego różnicowania komórek pluripotencjalnych do kardiomiocytów, należało zoptymalizować jedynie gęstość początkowego wysiewania. W celu znalezienia optymalnej, wyjściowej, liczby hiPSC różnicowanie rozpoczynano przy gęstościach wysiewania w przedziale 5-17,5x103 komórek na cm2 płytki opłaszczonej odczynnikiem geltrex (Ryc. 12). Rycina 12. Optymalizacja różnicowania metodą PSC. Analiza cytometryczna procentowego udziału komórek wykazujących ekspresję TNNT2. W przypadku najniższej testowanej gęstości (5x103 komórek na cm2), wydajność różnicowania była poniżej jednego procenta. Zwiększenie konfluencji do 7,5x103 komórek na cm2 skutkowało znaczącym wzrostem wydajności, niemniej największy procentowy udział komórek TNNT2-pozytywnych uzyskano przy wysianiu 10 i 12,5 x103 hiPSC na cm2 (57%). Dalsze zwiększanie gęstości okazało się nie być optymalne. Do dalszych analiz z wykorzystaniem zestawu PSC wybrano gęstość 104 komórek na cm2. 7.2.2. Metoda GiWi W przypadku metody GiWi, autorzy opublikowanego protokołu [62] sugerują rozpoczęcie różnicowania przy niemal pełnej konfluencji (około 95%). W następnych krokach należy dodatkowo zoptymalizować stężenia małocząsteczkowych inhibitorów – CHIR99021 (w skrócie CHIR) oraz IWR-1 (w skrócie IWR). W celu uzyskania 95% konfluencji po czterech dniach hodowli wysiewano 104 hiPSC na cm2. Rycina 13. Optymalizacja różnicowania metodą GiWi. (A.) Schematyczne przedstawienie doświadczenia. Czerwone krzyżyki oznaczają dołki, w których nie obserwowano kurczących się komórek, bądź wydajność była bardzo niska. (B.) Analiza cytometryczna procentowego udziału komórek wykazujących ekspresję TNNT2. Z szerszego spektrum testowanych stężeń CHIR oraz IWR (Ryc. 13 A.), analizie cytometrycznej poddano jedynie te dołki, gdzie można było zaobserwować kurczące się kardiomiocyty. W przypadku testowanej linii hiPSC najwyższą wydajność różnicowania osiągnięto przy stężeniu 10 µM CHIR oraz 6 µM IWR (Ryc. 13 A. i B.). Podsumowując, oba protokoły charakteryzowały się podobną wydajnością różnicowania (odpowiednio 57% i 58.3%), dlatego zdecydowano się użyć każdego z nich w następnym doświadczeniu (rozdział 7.3). 7.3. Wyciszenie HO-1 za pomocą shRNA i wpływ na wydajność różnicowania W celu zbadania roli HO-1 w różnicowaniu hiPSC do kardiomiocytów, zdecydowano się na stabilne wyciszenie ekspresji HMOX1 za pomocą shRNA. Przeprowadzono transdukcję wektorami lentiwirusowymi z sekwencjami shRNA specyficznymi dla HMOX1, wraz z kontrolną sekwencją, nierozpoznającą żadnego transkryptu w ludzkim genomie (kontrola scrambled – scr). Po selekcji antybiotykowej (puromycyna 0,5 µg/ml), przeprowadzono analizę qRT-PCR w celu określenia stopnia wyciszenia (Ryc. 14). A picture containing clock Description automatically generated Rycina 14. Wyciszenie ekspresji HMOX1 za pomocą shRNA. Analiza qRT-PCR poziomu mRNA HMOX1 w hiPSC H1 transdukowanych shRNA anty-HMOX1, n=1. Spośród czterech przetestowanych sekwencji (A-D), hiPSC transdukowane sekwencją C charakteryzowały się znacząco spowolnioną proliferacją, dlatego nie zostały uwzględnione w dalszych analizach. W pozostałych przypadkach analiza qRT-PCR wykazała wyciszenie ekspresji HMOX1 z wydajnością 87-94%, w zależności od zastosowanej sekwencji shRNA (Ryc. 14). W następnym kroku przeprowadzono różnicowanie do kardiomiocytów tak otrzymanych linii ze stabilnym wyciszeniem HMOX1. Wykorzystano w tym celu protokół PSC oraz GiWi, a następnie badano poziom ekspresji markerów mezodermy oraz mezodermy sercowo-specyficznej (Ryc. 15 A. i B.) ostatniego dnia różnicowania (GiWi – dzień 20, PSC, - dzień 15). Do analizy wykorzystano dwie linie z najwyższym poziomem wyciszenia HMOX1 (sh HO-1 B i sh HO-1 D). Rycina 15. Analiza ekspresji markerów sercowo-specyficznych w hiPSC H1-CM z wyciszoną ekspresją HMOX-1 za pomocą shRNA. Poziom ekspresji markerów mezodermy oraz mezodermy sercowo-specyficznej (MIXL1, ISL-1, GATA4, MEF2C, MYH6 i TNNT2) w kardiomiocytach zróżnicowanych metodą (A.) GiWi oraz (B.) PSC. n=3, kropki reprezentują poszczególne pomiary, słupki reprezentują uśredniony wynik ± SD, jednostronny test ANOVA. Ze względu na znaczący rozrzut poziomu badanych transkryptów, zarówno z wykorzystaniem metody PSC, jak i GiWi, nie można wyciągnąć jednoznacznych wniosków na podstawie tej analizy. Równolegle do analizy poziomu ekspresji markerów charakterystycznych dla mezodermy oraz mezodermy sercowo-specyficznej, przeprowadzono również analizę poziomu ekspresji HMOX1. Wyciszenie tego genu utrzymało się w trakcie różnicowania jedynie w przypadku protokołu GiWi (Ryc. 16 A. i B.). Niemniej jednak poziom ekspresji HMOX1 komórek zróżnicowanych, w porównaniu do komórek kontrolnych, wynosił 32,8% i 29,31% (odpowiednio sh HO-1 B i sh HO-1 D, Ryc. 16 A), w porównaniu do 6 i 8% na etapie hiPSC, mimo iż komórki transdukowane wektorami kodującymi shRNA były poddawane selekcji antybiotykowej przed każdym różnicowaniem. Ze względu na wyciszenie kasety z shRNA anty-HMOX1 w trakcie różnicowania metodą PSC, do dalszych doświadczeń zdecydowano się używać protokołu GiWi. A picture containing clock Description automatically generated Rycina 16. Analiza ekspresji HMOX1 w hiPSC.2-CM z wyciszoną HO-1 za pomocą shRNA. Poziom ekspresji HMOX1 w kardiomiocytach zróżnicowanych metodą (A.) GiWi oraz (B.) PSC. n=3, kropki reprezentują poszczególne pomiary, słupki reprezentują uśredniony wynik ± SD, **** - p<0.001, jednostronny test ANOVA. 7.4. Wpływ SnPP, CoPP i heminy na wydajność różnicowania hiPSC w trakcie różnicowania do kardiomiocytów były stymulowane różnymi stężeniami inhibitora aktywności (SnPP), bądź aktywatorami ekspresji HO-1 (CoPP, hemina). Po 20 dniach wydajność różnicowania została oceniona poprzez analizę cytometryczną procentowego udziału komórek pozytywnych na sercowo-specyficzną troponinę T (Ryc. 17.). Przeprowadzona analiza wskazuje na brak wpływu farmakologicznej aktywacji bądź inhibicji HO-1 na wydajność różnicowania hiPSC do kardiomiocytów. Rycina 17. Analiza FACS wydajności różnicowania linii hiPSC.2 do kardiomiocytów. Farmakologiczna modulacja aktywności HO-1. CoPP i hemina – zwiększenie aktywności, SnPP – inhibicja. n=3. 7.5. Wyłączenie HMOX1 za pomocą systemu CRISPR/Cas9 Ze względu na ograniczone wyciszenie HMOX1 przy wykorzystaniu wektorów lentiwirusowych kodujących shRNA anty-HMOX1 oraz możliwe działanie niespecyficzne protoporfiryn, w następnym etapie zdecydowano się wykorzystać metodę CRISPR/Cas9 w celu całkowitej inaktywacji HMOX1. Schematyczne przedstawienie mRNA HMOX1 oraz miejsc rozpoznawanych przez sgRNA znajduje się na Rycinie 18 A. Analiza typu Surveyor nuclease assay komórek hiPSC poddanych nukleofekcji plazmidami kodującymi nukleazę Cas9, oraz specyficzne sgRNA (1-3) wykazała powstawanie heterodupleksów w przypadku sgRNA 1 oraz sgRNA 2. Nie zaobserwowano natomiast dwóch prążków, świadczących o wprowadzeniu mutacji, w przypadku sgRNA 3 w hiPSC.1 (Ryc. 18 B.). Do wyprowadzenia linii pozbawionych HO-1 w kolejnych liniach hiPSC (Ryc. 18 D. i E.) użyto zatem sgRNA 1 oraz sgRNA 2. Rycina 18. Całkowite wyciszenie HMOX1 za pomocą CRISPR/Cas9. Analiza typu Surveyor nuclease assay. (A.) Schematyczne przedstawienie mRNA HMOX1 wraz z zaznaczonymi miejscami rozpoznawanymi przez sgRNA. (B.) Rozdział elektroforetyczny fragmentu HMOX1 namnożonego za pomocą PCR z komórek kontrolnych hiPSC.1, po nukleofekcji plazmidami z kodującymi nukleazę Cas9 i sgRNA (panel lewy) oraz rozdział elektroforetyczny po nukleofekcji z użyciem sgRNA 1-3 (panel środkowy i prawy). (C.) Analiza typu Surveyor nuclease assay klonów otrzymanych z pojedynczych komórek hiPSC.1. Rozdział elektroforetyczny fragmentu HMOX1 namnożonego za pomocą PCR z komórek kontrolnych oraz po nukleofekcji plazmidami kodującymi nukleazę Cas9 oraz sgRNA w linii (D.) hiPSC.2 oraz (E.) hiPSC.3. W przypadku linii hiPSC.1 przeprowadzono również analizę typu Surveyor nuclease assay w przypadku klonów otrzymanych z pojedynczych komórek (Ryc. 18 C.). Wykonana analiza sugerowała, że 6 na 11 przetestowanych kolonii ma mutację w badanym regionie. Niemniej jednak dalsza analiza z wykorzystaniem metody Western Blot potwierdziła na poziomie białka wprowadzenie mutacji typu knock-out jedynie w 3 klonach (Ryc. 19 A.). Dlatego w toku dalszych badań w celu funkcjonalnego potwierdzenia braku HO-1, skupiono się na pół-ilościowej analizie Western Blot klonów pochodzących z pojedynczych komórek, stymulowanych heminą w celu indukcji ekspresji HO-1 (Ryc. 19 B.-E). Rycina 19. Całkowite wyciszenie HMOX1 za pomocą CRISPR/Cas9. Analiza Western Blot – badania przesiewowe klonów otrzymanych z pojedynczych komórek. Linia hiPSC.1 (A.) oraz (B.) sgRNA 1, (C.) sgRNA2. Linia hiPSC.2 (D.) oraz (F.) sgRNA 1, (E.) oraz (G.) sgRNA2. Linia hiPSC.3 (H.) sgRNA 1 oraz (I.) sgRNA2. Na czerwono zaznaczono klony wytypowane do dalszej analizy. Ze względu na niską częstotliwość występowania mutacji wprowadzanej za pomocą metody CRISPR/Cas9 w populacji hiPSC, była potrzeba przetestowania dużej liczby klonów pochodzących z pojedynczych komórek, w celu wytypowania odpowiedniej liczby klonów bez HO-1 do dalszej analizy. Stymulacja każdej kolonii heminą na etapie wstępnej analizy przesiewowej była procesem pracochłonnym, znacząco spowalniającym badania. Dlatego, aby zwiększyć liczbę klonów poddanych wstępnej analizie przesiewowej, zrezygnowano w kolejnych doświadczeniach ze stymulacji heminą na tym etapie. Endogenny poziom białka HO-1 w hiPSC jest na wystarczającym poziomie, aby wykryć go metodą Western Blot. Wszystkie klony, w których nie wykryto HO-1, były typowane do dalszych analiz (Ryc. 19 F.-I.). Rycina 20. Całkowite wyciszenie HMOX1 za pomocą CRISPR/Cas9. Analiza Western Blot wytypowanych klonów. Linia hiPSC.1 (A.) sgRNA 1 oraz (B.) sgRNA 2. Linia hiPSC.2 (C.) sgRNA 1 oraz (D.) sgRNA 2. Linia hiPSC.3 (E.) sgRNA 1 i 2. W celu ostatecznego, funkcjonalnego, potwierdzenia braku HO-1, klony wytypowane do dalszych badań były stymulowane 1 µM heminą przez 24 godzin. Analiza Western Blot potwierdziła, że wytypowane klony są pozbawione HO-1 na poziomie białka (Ryc. 20). Po wyprowadzeniu wszystkich klonów HO-1 KO hiPSC w pierwszej kolejności sprawdzono, czy brak HO-1 wpływa na poziom ekspresji GATA6, który może służyć jako wyznacznik potencjału różnicowania do kardiomiocytów [153] oraz wybranych markerów pluripotencji w hiPSC. Rycina 21. Analiza qRT-PCR poziomu ekspresji GATA6 oraz markerów pluripotencji w hiPSC.3 WT oraz HO-1 KO. (A.) GATA6, (B.) TERT, (C.) DPPA2, (D.) SALL4, (E.) NANOG oraz (F.) DNMT3B. n=3, kropki reprezentują poszczególne pomiary, słupki reprezentują uśredniony wynik ± SD, jednostronny test ANOVA. Analiza qRT-PCR nie wykazała wpływu braku HO-1 na poziomu ekspresji GATA6 oraz markerów pluripotencji w niezróżnicowanych hiPSC (Ryc. 21). Brak HO-1 nie wpłynął również na zdolność hiPSC do spontanicznego różnicowania w kierunku komórek wywodzących się ze wszystkich trzech linii zarodkowych: mezodermy, endodermy oraz ektodermy (Ryc. 22). Niemniej jednak, w spontanicznie zróżnicowanych ciałkach zarodkowych pozbawionych HO-1, nie wykryto jednego z markerów mezodermy - wimentyny. Co istotne, związek pomiędzy HO-1 a wimentyną został dowiedziony w badaniach nad angiogenezą [154]. Rycina 22. Spontanicznie zróżnicowane ciałka zarodkowe hiPSC.3 WT i HO-1 KO. Barwienie immunofluorescencyjne markerów trzech linii zarodkowych w spontanicznie zróżnicowanych ciałkach zarodkowych (Wimentyna, α-SMA, GATA4, AFP i NFH). Odcinek skali reprezentuje 100 µm. Podsumowując, na podstawie niezmienionej ekspresji markerów pluripotencji oraz możliwości spontanicznego różnicowania do komórek wywodzących się z trzech listków zarodkowych, brak HO-1 nie wpływa na pluripotencję hiPSC. 7.6. Wpływ braku HO-1 na transkryptom hiPSC Następnym krokiem było sprawdzenie jaki wpływ ma brak HO-1 na transkryptom niezróżnicowanych WT oraz HO-1 KO hiPSC. W tym celu wykonano analizę RNA-seq. Rycina 23. Analiza porównawcza transkryptomu hiPSC WT oraz HO-1 KO (hiPSC.1 oraz hiPSC.2). (A.) Wykres przedstawiający zmianę transkrypcji genów w hiPSC HO-1 KO, na wykresie podano liczbę genów regulowanych pozytywnie i negatywnie (istotnie statystycznie, p. adj) genów (B.) Wykres przedstawiający znormalizowane odczyty dla genu Aneksyny A6 (ANXA6). (C.) Wykres przedstawiający znormalizowane odczyty dla genu FRMD4A. n = 4. Analiza porównawcza transkryptomu niezróżnicowanych hiPSCs WT oraz hiPSCs HO-1 KO nie wykazała istotnych statystycznie zmian poziomu ekspresji genów (Ryc. 23 A.). Niemniej jednak, na podstawie dostępnej literatury, zwrócono uwagę na geny ANXA6 (kodujący aneksynę A6; Ryc. 23 B.) oraz FRMD4A (Ryc. 23 C.). Zmiany poziomu ekspresji tych genów są charakterystyczne dla procesów patologicznych związanych z zaburzeniami przewodnictwa elektrofizjologicznego w sercu [155,156]. ANXA6 charakteryzowała się tendencją spadkową w HO-1 KO hiPSC (Ryc. 23 B.), natomiast FRMD4A cechował się tendencją wzrostową w komórkach pozbawionych HO-1 (Ryc. 23 C.). Pomimo braku istotności statystycznej wyniki te stanowiły ważną wskazówkę do dalszych badań. 7.7. Wpływ braku HO-1 na wydajność różnicowania Kolejnym krokiem było ustalenie, czy całkowity brak HO-1 wpłynie na wydajność różnicowania hiPSC do kardiomiocytów. Rycina 24. Zmienna wydajność różnicowania HO-1 KO hiPSC.1. Analiza cytometryczna procentowego udziału komórek wykazujących ekspresję TNNT2 w zróżnicowanych hiPSC WT oraz HO-1 KO. (A.) Doświadczenie pierwsze, (B.) doświadczenie drugie. Kropki reprezentują poszczególne pomiary, słupki reprezentują uśredniony wynik ± SD. Przeprowadzono dwie serie różnicowań komórek kontrolnych (poddanych nukleofekcji plazmidem bez sekwencji sgRNA) oraz łącznie czterech klonów HO-1 KO – po dwa na każde zastosowane sgRNA. Z analizy cytometrycznej TNNT2 wynikło jedynie, że różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów może być procesem bardzo zmiennym i na tej podstawie nie można określać, jak wpływa na niego całkowity brak HO-1 (Ryc. 24 A. i B.). 7.8. Wpływ braku HO-1 na spontaniczne różnicowanie – analiza markerów mezodermy i mezodermy sercowo-specyficznej Biorąc pod uwagę, że na drodze ukierunkowanego różnicowania hiPSC do kardiomiocytów nie udało się określić czy całkowity brak HO-1 w komórkach wpływa na ten proces, zdecydowano się zastosować pośrednią metodę z wykorzystaniem spontanicznego różnicowania ciałek zarodkowych hiPSC WT oraz HO-1 KO. Rycina 25. Ekspresja markerów mezodermy w spontanicznie zróżnicowanych ciałkach zarodkowych hiPSC.3 WT i HO-1 KO. Analiza qRT-PCR ekspresji markerów mezodermy i mezodermy sercowo-specyficznej spontanicznie zróżnicowanych ciałek zarodkowych hiPSC.3 WT oraz HO-1 KO (A.) MIXL1, (B.) ISL1, (C.) GATA6 oraz (D.) TNNT2. n = 3, kropki reprezentują poszczególne pomiary, słupki reprezentują uśredniony wynik ± SD, jednostronny test ANOVA. Co istotne, wariancja wyników pomiędzy poszczególnymi doświadczeniami była na niższym poziomie niż w przypadku doświadczeń z ukierunkowanym różnicowaniem. Analiza qRT-PCR wykazała brak różnic w poziomie transkryptów charakterystycznych dla mezodermy (Ryc. 25 A.-C.) i mezodermy sercowo-specyficznej (Ryc. 25 D.) w grupie HO-1 KO, w porównaniu do grupy kontrolnej. Jedynie w przypadku genu MIXL1 zaobserwowano istotny statystycznie wzrost w jednym z czterech testowanych klonów HO-1 KO. Jednak biorąc pod uwagę, że w pozostałych klonach pozbawionych HO-1 nie zaobserwowano podobnej zależności oraz że poziom najważniejszego z przetestowanych markerów – TNNT2 – pozostał niezmieniony, można stwierdzić, że brak HO-1 nie wpłynął na zdolność spontanicznego różnicowania do mezodermy oraz mezodermy sercowo-specyficznej. 7.9. Optymalizacja selekcji kardiomiocytów Doświadczenie z próbą określenia wpływu braku HO-1 na wydajność ukierunkowanego różnicowania hiPSC do kardiomiocytów wykazało dużą zmienność wydajności tego procesu pomiędzy poszczególnymi doświadczeniami. Wskazało to na potrzebę opracowania metody pozwalającej na znormalizowanie doświadczeń, tak aby wydajność poszczególnych różnicowań była bardziej powtarzalna. W tym celu postanowiono przetestować dwie metody polegające na aktywnej selekcji kardiomiocytów z populacji komórek uzyskanych na drodze różnicowania: i) komercyjnie dostępny zestaw do magnetycznego sortowania na podstawie obecności na powierzchni komórek sercowo-specyficznych markerów oraz ii) metodę selekcji metabolicznej opublikowaną przez A. Sharma i współpracowników [75]. 7.9.1. PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit Analiza cytometryczna sercowo-specyficznej troponiny T wykazała (Ryc. 26), że metoda opierająca się na sortowaniu magnetycznym, pozwala na 1,5-2,4-krotne zwiększenie czystości populacji hiPSC-CM, do maksymalnie około 80%. Rycina 26. Analiza cytometryczna hiPSC.2-CM sortowanych magnetycznie. Panel górny przedstawia wynik po selekcji. Panel dolny przedstawia tabelę z podsumowaniem stopnia czystości populacji przed i po sortowaniu. 7.9.2. Selekcja metaboliczna Optymalizując metodę selekcji metabolicznej, oprócz różnych stężeń mleczanu (2, 4, 6, 8, i 70 mM), przetestowano dwa warianty: 3+3 polegający na hodowli hiPSC-CM w pożywce bez glukozy, z dodatkiem mleczanu, przez trzy dni najpierw od dnia 10 do dnia 13 różnicowania, a następnie od dnia 20 do 23. W drugim wariancie komórki były hodowane w pożywce bez glukozy, z dodatkiem mleczanu, bez przerw przez dwa tygodnie. Rycina 27. Analiza cytometryczna hiPSC.2-CM poddanych sortowaniu metabolicznemu. (A.) Schemat doświadczenia zakładający ciągłą, dwutygodniową selekcję metaboliczną, (B.) Schemat doświadczenia zakładający przerywaną selekcję metaboliczną, z dwoma cyklami po trzy dni. (C.) Analiza cytometryczna hiPSC-CM poddanych selekcji metabolicznej, (D.) Schemat selekcji metabolicznej stosowany w dalszych doświadczeniach. Analiza cytometryczna sercowo-specyficznej troponiny T wykazała, że optymalną metodą jest metoda ciągłej, dwutygodniowej selekcji metabolicznej (schematyczne przedstawienie procedury na Rycinie 27 A.). W przypadku kardiomiocytów hodowanych w pożywce pozbawionej glukozy, ale z dodatkiem 6 mM mleczanu, czystość otrzymanej populacji przekraczała 95% (Ryc. 27 C.; w porównaniu do 64,2% w próbce kontrolnej, niepoddanej selekcji). Metoda selekcji 3+3 (schematyczne przedstawienie procedury na Rycinie 27 B.) okazała się mniej skuteczna (Ryc. 27 C.). Jedynie w przypadku próbek z dodatkiem 2 mM oraz 6 mM mleczanu zaobserwowano wzrost czystości populacji (do 84,5 i 77,1%). W pozostałych testowanych stężeniach mleczanu zaobserwowano spadek czystości populacji, co sugeruje, że w tym wariancie selekcji metabolicznej to kardiomiocyty były najbardziej wrażliwe na manipulacje źródłem energii w pożywce. Do dalszych doświadczeń zdecydowano się użyć pośredniej metody selekcji metabolicznej: kardiomiocyty były poddawane ciągłej, sześciodniowej selekcji z dodatkowym etapem przesiania komórek w czasie trwania selekcji metabolicznej (schematyczne przedstawienie procedury na Rycinie 27 D.). Podyktowane było to doniesieniami o negatywnym wpływie selekcji metabolicznej również na same hiPSC-CM, co prowadziło do zmniejszonej liczby komórek uzyskiwanych z różnicowania [75]. Skrócony wariant selekcji metabolicznej z przesianiem komórek również charakteryzował się wysokim stopniem oczyszczenia (wyniki niepokazane). 7.10. Wpływ braku HO-1 na transkryptom hiPSC-CM Zoptymalizowanie metody selekcji metabolicznej pozwoliło na uzyskiwanie praktycznie czystej populacji kardiomiocytów za każdym różnicowaniem. Umożliwiło to przeprowadzenie analizy transkryptomu zróżnicowanych WT oraz HO-1 KO hiPSC-CM. Rycina 28. Analiza transkryptomu hiPSC.3-CM WT oraz HO-1 KO. (A.) Grupowanie hierarchiczne hiPSC-CM WT oraz HO-1 KO. (B) Wykres przedstawiający zmianę transkrypcji genów w hiPSC-CM HO-1 KO, na wykresie podano liczbę genów regulowanych pozytywnie i negatywnie (istotnie statystycznie, p. adj). (C.) Analiza głównych składowych. n=4 Analiza porównawcza transkryptomu hiPSC-CM WT oraz HO-1 KO wykazała istotnie statystyczną zmianę poziomu ekspresji 1026 genów, spośród których 449 charakteryzowało się wyższą, a 577 niższą ekspresją (Ryc. 28 B.). Zmienione istotnie statystycznie geny grupowały się hierarchicznie, na podstawie genotypu HO-1 (Ryc. 28 A.). Analiza czynnikowa głównych składowych również wskazuje na grupowanie próbek na podstawie genotypu HO-1 (Ryc. 28 C.). Rycina 29. Analiza transkryptomu hiPSC.3-CM WT oraz HO-1 KO. Analiza funkcjonalna procesów biologicznych dla wszystkich statystycznie istotnych zmian, n = 4. Zestawienie 15 najbardziej zmienionych procesów biologicznych z wyszczególnionymi procesami związanymi z przewodnictwem pokazano na Rycinie 29. Oprócz procesów związanych z elektrofizjologią również znacząco były zmienione geny odpowiedzialne za regenerację. Rycina 30. Analiza transkryptomu hiPSC.3-CM WT oraz HO-1 KO: (A.) Zmiany poziomu ekspresji poszczególnych genów związanych z regeneracją. (B). Znormalizowane odczyty transkryptu genu S100A4. n = 4 Analiza zmian ekspresji genów związanych z regeneracją (Ryc. 30 A.) wskazuje na możliwe zaburzenia tego procesu w hiPSC-CM HO-1 KO. W szczególności, poziom genu S100A4, również odgrywającego istotną rolę w regeneracji mięśnia sercowego (poprzez zwiększenie przeżywalności kardiomiocytów [157] oraz ochronę przed uszkodzeniami wywołanymi niedotlenieniem [158]), jest obniżony w hiPSC-CM HO-1 KO (Ryc. 30 B.). 7.11. Wpływ braku HO-1 na ekspresję kanałów jonowych w hiPSC-CM Analiza funkcjonalna procesów biologicznych (rozdział 7.10, Rycina 29) wskazuje na zmiany w licznych procesach związanych z potencjałem elektrofizjologicznym serca. Dlatego postanowiono dokładniej zanalizować wpływ braku HO-1 na właściwości elektromechaniczne hiPSC-CM pozbawionych HO-1. Rycina 31. Analiza ekspresji kanałów jonowych w WT oraz HO-1 KO hiPSC.3-CM. Analiza RNA-seq: (A.) Zmiany poziomu ekspresji poszczególnych genów związanych z potencjałem czynnościowym zaangażowanym w kurczliwość serca, (B.) Znormalizowany odczyt transkryptu genu CACNA1c. Analizy qRT-PCR kanałów jonowych: potasowych (C.) KCNQ1 i (D.) KCNH2, (E.) kanał sodowy SCN5a, oraz (F.) kanał wapniowy CACNA1c. n=3, kropki reprezentują poszczególne pomiary, słupki reprezentują uśredniony wynik ± SD, *- p<0.05, jednostronny test ANOVA. Analiza funkcjonalna procesów biologicznych wskazała na istotnie statystycznie zmiany w procesie: „potencjał czynnościowy komórek serca zaangażowany w kurczliwość”. Część genów zaangażowanych w ten proces charakteryzuje się wyższą ekspresją (PKP2. CACNA2d, FGF12,CACNA1d, SCN3B, KCNQ1), natomiast geny KCNE3, BIN1, DSC2, SCN1b, KCNE2 oraz KCNA5 charakteryzują się niższą ekspresją (Ryc. 31 A.). Znormalizowany odczyt transkryptu genu CACNA1c wskazuje na wyższą ekspresję w hiPSC-CM HO-1 KO (Ryc. 31 B.). Analiza qRT-PCR potwierdziła wyższą ekspresję genu kanału potasowego KCNQ1 (Ryc. 31 C.), natomiast poziom ekspresji genu kanału potasowego KCNH2 pozostał bez zmian (Ryc. 31 D.). Wzrost ekspresji genu kanału sodowego SCN5a nie jest istotny statystycznie, lecz zauważalna jest tendencja wzrostowa (Ryc. 31 E.). Analiza qRT-PCR nie potwierdziła jednak zmian w ekspresji genu kanału wapniowego CACNA1c (Ryc. 31 F.) 7.12. Elektrofizjologiczne pomiary potencjału czynnościowego metodą whole-cell patch clamp Analiza transkryptomu jasno wskazywała, iż hiPSC-CM pozbawione HO-1 charakteryzują się istotnymi zmianami w elektrofizjologii, co następnie częściowo zostało potwierdzone przez analizę qRT-PCR. W następnym kroku, aby funkcjonalnie potwierdzić zaobserwowane zmiany, postanowiono przeprowadzić analizę potencjału czynnościowego patch clamp. 7.12.1. Pomiar hiPSC-CM HO-1 KO Pomiar czynności elektrofizjologicznych hiPSC-CM pozbawionych HO-1 wykazał znacząco skrócony czas repolaryzacji w komórkach HO-1 KO (Ryc. 32 A.-D.). Pozostałe zmierzone parametry – szybkość narastania potencjału czynnościowego, potencjał w nadstrzale oraz maksymalna hiperpolaryzacja następcza pozostały bez zmian (Ryc. 32 E.-G.). Reprezentatywny kształt potencjału czynnościowego hiPSC-CM WT oraz HO-1 KO, wraz z zaznaczonymi mierzonymi wartościami został przedstawiony na Rycinie 32 A. Rycina 32. Analiza potencjału czynnościowego hiPSC.1-CM WT oraz HO-1 KO metodą whole-cell patch clamp. (A.) Kształt potencjału czynnościowego kardiomiocytów WT oraz HO-1 KO, wraz ze schematycznym przedstawieniem pozostałych pomiarów. Czas (B.) 20%, (C.) 50% oraz (D.) 90% repolaryzacji hiPSC-CM. Parametry potencjału błonowego: (E.) szybkość narastania potencjału czynnościowego, (F.) potencjał w nadstrzale oraz (G.) maksymalna hiperpolaryzacja następcza. n=32-38 pomiarów, kropki reprezentują poszczególne pomiary, ** - p<0.01, *** - p<0.005, jednostronny test ANOVA. 7.12.2. Pomiar hiPSC-CM WT stymulowanych CoPP W celu zweryfikowania, czy zaobserwowane zmiany w potencjale czynnościowym hiPSC-CM HO-1 KO są zależne od HO-1, postanowiono zastosować aktywator HO-1 –CoPP. Rycina 33. Analiza potencjału czynnościowego hiPSC.2-CM WT stymulowanych CoPP metodą whole-cell patch clamp. Czas (A.) 20%, (B.) 50% oraz (C.) 90% repolaryzacji hiPSC-CM. Parametry potencjału błonowego: (D.) szybkość narastania potencjału czynnościowego, (E.) potencjał w nadstrzale oraz (F.) maksymalna hiperpolaryzacja następcza. (H.) Analiza Western blot potwierdzająca indukcję HO-1 przez CoPP. n=27-31 pomiarów, kropki reprezentują poszczególne pomiary, * - p<0.05, ** - p<0.01, jednostronny test t-Studenta. Pomiar potencjału czynnościowego hiPSC-CM, z farmakologicznie indukowaną ekspresją HO-1 wykazał efekt odwrotny do kardiomiocytów pozbawionych HO-1. W przypadku czasu 50% repolaryzacji (Ryc. 33 B.) zaobserwowano istotny statystycznie wzrost tego parametru. W przypadku czasu 20% oraz 90% repolaryzacji (Ryc. 33 A. i C.) zaobserwować można było podobną tendencję. Co ciekawe, zaobserwowano wpływ stymulacji za pomocą CoPP na wzrost szybkości narastania potencjału czynnościowego (Ryc. 33 D.). Parametr ten zależy m.in. od aktywności kanałów sodowych. Pozostałe parametry pozostały bez zmian (Ryc. 31 E. i F.). Analiza Western Blot potwierdziła indukcję HO-1 poprzez stymulację komórek za pomocą CoPP (Ryc. 33 G.). 7.12.3. Pomiar hiPSC-CM HO-1 KO stymulowanych CoPP W następnym kroku przeprowadzono pomiary hiPSC-CM HO-1 KO stymulowanych CoPP. Rycina 34. Analiza potencjału czynnościowego hiPSC2-CM HO-1 KO stymulowanych CoPP metodą whole-cell patch clamp. Czas (A.) 20%, (B.) 50% oraz (C.) 90% repolaryzacji hiPSC-CM. Parametry potencjału błonowego: (D.) szybkość narastania potencjału czynnościowego, (E.) potencjał w nadstrzale oraz (F.) maksymalna hiperpolaryzacja następcza. (H.) Analiza Western blot potwierdzająca brak indukcji HO-1 przez CoPP w komórkach HO-1 KO. n=30-34 pomiarów, kropki reprezentują poszczególne pomiary, * - p<0.05, *** - p<0.005, jednostronny test t-Studenta. W przypadku hiPSC-CM HO-1 KO stymulacja CoPP miała niespodziewany efekt. Pomimo braku HO-1, nastąpił wzrost czasu repolaryzacji (Ryc. 34 A.-C.), podobnie jak w hiPSC-CM WT z wyindukowaną ekspresją HO-1. Sugerować to może niezależny od HO-1 efekt CoPP. Niemniej jednak, w przypadku hiPSC-CM HO-1 KO nie zaobserwowano wpływu CoPP na wzrost szybkości narastania potencjału czynnościowego (Ryc. 34 D.). Pozostałe parametry potencjału czynnościowego pozostały bez zmian (Ryc. 34 E. i F.). Analiza Western Blot potwierdziła całkowity brak HO-1, zarówno w warunkach kontrolnych, jak i po stymulacji CoPP w hiPSC-CM HO-1 KO (Ryc. 34 G.). 7.12.4. Pomiar hiPSC-CM WT stymulowanych CORM HO-1 oddziałuje na wiele procesów biologicznych głównie poprzez produkty swojej aktywności enzymatycznej. Hem przez HO-1 jest rozkładany m.in do tlenku węgla, o którym wiadomo, że może wpływać na aktywność kanałów potasowych w kardiomiocytach [159]. Dlatego następnym krokiem było sprawdzenie wpływu CO na aktywność elektrofizjologiczną hiPSC-CM Rycina 35. Analiza potencjału czynnościowego hiPSCs-CM.2 WT stymulowanych CORM-2 metodą whole-cell patch clamp. Czas (A.) 20%, (B.) 50% oraz (C.) 90% repolaryzacji hiPSC-CM. Parametry potencjału błonowego: (D.) Szybkość narastania potencjału czynnościowego, (E.) Potencjał w nadstrzale oraz (F.) Maksymalna hiperpolaryzacja następcza. n = 30-32 pomiarów, kropki reprezentują poszczególne pomiary, * - p<0.05, ** - p<0.01, **** p<0.001, jednostronny test ANOVA. Stymulacja komórek związkiem uwalniającym CO – CORM2, miała jednak efekt odwrotny do CoPP. Zaobserwowano spadek czasu repolaryzacji (Ryc. 35 A.-C.). Co interesujące, podobnie jak w przypadku stymulacji CoPP, CORM wpłynął na wzrost szybkości narastania potencjału czynnościowego. W tym przypadku jedna z kontroli (inaktywowany CORM2) również miał podobny efekt (Ryc. 35 D.). Również maksymalna repolaryzacja następcza uległa nieznacznej zmianie (Ryc. 35 F.). Potencjał w nadstrzale pozostał bez zmian (Ryc. 35 E.). 7.12.5. Pomiar hiPSC-CM HO-1 KO stymulowanych CORM Podobnie, doświadczenie ze związkiem uwalniającym CO przeprowadzono na hiPSC-CM pozbawionych HO-1. Rycina 36. Analiza potencjału czynnościowego hiPSC.2-CM HO-1 KO stymulowanych CORM-2 metodą whole-cell patch clamp. Czas (A.) 20%, (B.) 50% oraz (C.) 90% repolaryzacji hiPSC-CM. Parametry potencjału błonowego: (D.) szybkość narastania potencjału czynnościowego, (E.) potencjał w nadstrzale oraz (F.) maksymalna hiperpolaryzacja następcza. n=30-32 pomiarów, kropki reprezentują poszczególne pomiary, *-p<0.05, ** -p<0.01, ***-p<0.005, ****-p<0.001, jednostronny test ANOVA. W tym przypadku niespecyficzny efekt inaktywowanej formy CORM był jeszcze bardziej widoczny (Ryc. 36 A.-D.), co nie pozwala na wiarygodną analizę otrzymanych wyników. W komórkach HO-1 KO potencjał w nadstrzale (Ryc. 36 E.) oraz maksymalna hiperpolaryzacja następcza (Ryc. 36 F.) zachowały się podobnie jak w komórkach WT (Ryc. 35 E. i F.) 7.13. Wpływ HO-1 na metabolizm hiPSC-CM Wcześniejsze prace wskazywały na ważną rolę HO-1 w regulacji metabolizmu mysich kardiomiocytów, niemniej efekt ten nie został do tej pory sprawdzony w ludzkich komórkach. W związku z tym w następnym etapie postanowiono sprawdzić wpływ HO-1 na metabolizm hiPSC-CM. 7.13.1. Pomiar konsumpcji tlenu – Seahorse W pierwszej kolejności zmierzono poziom konsumpcji tlenu w hiPSC-CM stymulowanych CoPP. Rycina 37. Analiza oddychania mitochondrialnego hiPSC.2-CM WT stymulowanych CoPP. (A.) Diagram przedstawiający zmiany poziomu konsumpcji tlenu w trakcie pomiarów z wykorzystaniem urządzenia Seahorse XFe96. Parametry obliczone na podstawie otrzymanych wyników: (B.) oddychanie podstawowe, (C.) oddychanie maksymalne, (D.) produkcja ATP, (E.) oddychanie poza mitochondrialne, (F.) zapasowa pojemność oddechowa oraz (G.) przeciek protonów. n = 2, kropki reprezentują poszczególne pomiary, słupki reprezentują uśredniony wynik ± SD, jednostronny test ANOVA. Farmakologiczna indukcja HO-1 za pomocą CoPP nie miała wpływu na aktywność mitochondrialną kardiomiocytów, bazując na niezmienionym poziomie konsumpcji tlenu (Ryc. 37 A.). Zarówno 48- jak i 72-godzinna stymulacja nie wpłynęła na żaden z mierzonych parametrów: oddychanie podstawowe, oddychanie maksymalne, produkcja ATP, oddychanie pozamitochondrialne czy zapasową pojemność oddechową (Ryc. 37 B.-F.). CoPP nie miała również cytotoksycznego efektu na badane kardiomiocyty, co zostało potwierdzone przez niezmieniony poziom przecieku protonów (Ryc. 37 G.). 7.13.2. Pomiar aktywności błon mitochondrialnych - TMRM Innym, pośrednim testem mogącym dać wgląd w aktywność mitochondrialną badanych komórek, jest test TMRM. A close up of a clock Description automatically generated Rycina 38. Analiza aktywności mitochondriów hiPSC-CM.3 WT stymulowanych CoPP. Analiza cytometryczna aktywności błon mitochondrialnych z wykorzystaniem TMRM. n = 2, kropki reprezentują poszczególne pomiary, słupki reprezentują uśredniony wynik ± SD, jednostronny test ANOVA. Również w tym przypadku przeprowadzone analizy nie wykazały zmian w aktywności błon mitochondrialnych w hiPSC-CM stymulowanych CoPP (Ryc. 38). 7.14. Analiza rozmiaru i hiPSC-CM HO-1 KO Poprzednie prace naszego zespołu wskazują na zwiększoną hipertrofię kardiomiocytów u myszy pozbawionych HO-1 [160]. Dlatego w kolejnym etapie sprawdzono, czy podobną zależność będzie można zaobserwować w modelu hiPSC-CM in vitro. Rycina 39. Analiza rozmiaru hiPSC.3-CM WT i HO-1 KO. (A.) Porównanie rozmiaru hiPSC-CM WT i HO-1 KO. (B.) Znormalizowany odczyt transkryptu genu IGF2. n = 3, kropki reprezentują poszczególne pomiary,** - p<0.01, jednostronny test t-Studenta Analiza immunofluorescencyjna hiPSC-CM wysianych w niskiej gęstości wykazała, że hiPSC-CM HO-1 KO charakteryzują się większą powierzchnią, w porównaniu do hiPSC-CM WT (Ryc. 39 A.). Analiza transkryptomu wykazała również podwyższoną ekspresję czynnika odpowiedzialnego za hipertrofię kardiomiocytów – IGF2 (Ryc. 39 B.). 7.15. Ocena kariotypu W toku prowadzonych badań, zaobserwowano znaczący spadek wydajności różnicowania klonów pochodzących z linii hiPSC.2. Po wykluczeniu ewentualnych problemów związanych z odczynnikami stosowanymi do różnicowania zdecydowano się przeprowadzić analizę kariotypu. Rycina 40. Analiza kariotypu komercyjnie dostępnej linii HPSI1013i-kuxp_1 (hiPSC.2). (A.) Analiza liczby kopii chromosomów. Oś X wskazuje liczbę chromosomów, oś Y numer chromosomu. Czerwone punkty na wykresie reprezentują linię fibroblastów, z której pochodzi linia hiPSC. Punkty zielone odpowiadają linii hiPSC. (B.) Szczegółowa analiza kariotypu. Strzałkami wskazano translokację zrównoważoną między chromosomami 6. i 15. pary z punktami złamań 6p.21.1 i 15q15. Analiza zmienności liczby kopii DNA (Ryc. 40 A.), przeprowadzona przez producenta po wyprowadzeniu linii nie wykazała niepożądanych zmian liczby kopii chromosomów zarówno w komórkach somatycznych, z których wyprowadzono hiPSC, jak i w samych hiPSC. Bardziej szczegółowa analiza polegająca na wybarwieniu i wizualizacji chromosomów wskazała na aberrację chromosomową polegającą na translokacji zrównoważonej pomiędzy chromosomami 6. i 15. pary z punktami złamań 6p.21.1 i 15q15 (Ryc. 40 B., punkty złamań zaznaczone strzałkami). 8. Dyskusja W zaprezentowanej pracy przedstawiono badania dotyczące roli HO-1 w biologii kardiomiocytów różnicowanych z hiPSC. Opisano proces otrzymywania i charakterystyki hiPSC, a następnie wybór i optymalizację metody różnicowania do kardiomiocytów. Opisano również optymalizację metody selekcji metabolicznej kardiomiocytów. Na podstawie doświadczeń z farmakologiczną modulacją aktywności HO-1 oraz genetycznym wyciszeniem HO-1 stwierdzono, iż HO-1 nie wpływa na wydajność różnicowania hiPSC do hiPSC-CM. Wykazano również, że HO-1 nie wpływa na aktywność metaboliczną kardiomiocytów. Następnie, bazując na wynikach analizy transkryptomu hiPSC-CM WT oraz HO-1 KO, skupiono się na właściwościach elektrofizjologicznych omawianych komórek. Funkcjonalna analiza potencjału czynnościowego patch-clamp, wraz z testem qRT-PCR, pozwoliły na potwierdzenie istotnego wpływu HO-1 na aktywność elektrofizjologiczną. Jednak dokładniejsze badanie mechanizmu tego zjawiska z wykorzystaniem CoPP oraz CORM2 okazały się utrudnione, ze względu na nieopisany do tej pory niezależny od HO-1 wpływ CoPP na aktywność elektrofizjologiczną hiPSC-CM. Dogłębniejsza analiza wyników RNA-seq, natomiast, rzuciła nowe światło na rolę HO-1 w biologii kardiomiocytów. Pośród ponad tysiąca zmienionych transkryptów pomiędzy hiPSC-CM WT oraz HO-1 KO były geny odpowiedzialne m.in. za regenerację oraz adhezję, co zdaje się potwierdzać opublikowane wyniki naszego zespołu nt. istotnej roli HO-1 w zawale mięśnia sercowego [160]. Ponadto, przedstawione wyniki mogą stanowić dodatkowe wyjaśnienie mechanizmu zjawisk opisanych we wspomnianej pracy. 8.1. Wykorzystane linie hiPSC W toku badań, do zweryfikowania hipotez postawionych w tej pracy, wykorzystano łącznie pięć różnych linii hiPSC – linię hiPSC H1 oraz linie hiPSC.1-4. Na początkowym etapie, podstawową metodę wykorzystywaną w przeprowadzonych doświadczeniach – różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów, optymalizowano przy użyciu linii hiPSC H1. Linia H1 została wyprowadzona i scharakteryzowana przez mgr Ewę Janosz [151]. Komórkami somatycznymi, użytymi do reprogramowania, była linia komercyjnie dostępnych fibroblastów BJ. W celu wprowadzenia czynników Yamanaki [12] posłużono się metodą transdukcji przy wykorzystaniu wektorów lentiwirusowych. Powodem, dla którego obecnie odchodzi się od wykorzystania tego typu wektorów jako nośnika dla czynników Yamanaki, jest fakt, że wbudowują się one do genomu gospodarza, co prowadzi do stałej ekspresji białek odpowiedzialnych za proces reprogramowania (OCT3/4, SOX2, KLF4 oraz C-MYC). Ich wysoki poziom na etapie wyprowadzania hiPSC jest pożądany. Gdy linia hiPSC zostanie już wyprowadzona i ustabilizowana, za utrzymanie pluripotencjalnego fenotypu komórek odpowiadają jednak składniki pożywki E8 (rozdział 6.2.4.1) i dalsza ekspresja czynników Yamanaki jest zbędna. W przypadku, gdy tak otrzymane hiPSC mają zostać poddane różnicowaniu, spontanicznemu czy ukierunkowanemu do konkretnego typu komórek, rozpoczyna się ich hodowlę w pożywce pozbawionej składników utrzymujących je w stadium pluripotencjalnym. Na tym etapie stała ekspresja OCT3/4, SOX2, KLF4 oraz C-MYC mogłaby stanowić istotną przeszkodę dla wydajnego różnicowania, zatrzymując komórki w niezróżnicowanym fenotypie. Jednym ze sposobów na obejście tego problemu jest wycięcie sekwencji STEMCCA z hiPSC, co znacząco podnosi wydajność różnicowania tak zmodyfikowanej linii [161]. Druga metoda, bardziej pasywna, zakłada samoistne wyciszenie wprowadzonego transgenu. Wykazano, że stosując wektory retrowirusowe i lentiwirusowe do przenoszenia czynników Yamanaki, zwłaszcza w połączeniu z promotorem wirusowym, po pewnym czasie dochodzi do samoistnego zaniku ekspresji wbudowanego materiału genetycznego [162]. Do samoistnego wyciszenia sekwencji STEMCCA doszło również przypadku linii H1 – wyniki pokazane w pracy magisterskiej Ewy Janosz [151]. W związku z tym linia hiPSC H1 wydajnie różnicowała w sposób spontaniczny lub do konkretnego typu komórek, np. kardiomiocytów (rozdział 7.2). Jednak innym, również bardzo istotnym problemem związanym z wykorzystaniem wektorów lentiwirusowych do indukcji procesu reprogramowania, jest sam fakt integracji do genomu, ponieważ zachodzi on w sposób niekontrolowany, w losowym miejscu. W przypadku stosowania takich wektorów w terapiach u ludzi może prowadzić to do niepożądanej transformacji nowotworowej. Natomiast w przypadku wykorzystania tak otrzymanych hiPSC do badań in vitro, miejsce integracji może wpłynąć na badany proces, prowadząc do błędnych wniosków [163]. Obecnie powszechnie stosowanymi wektorami wprowadzającymi czynniki Yamanaki do komórek somatycznych w celu reprogramowania są wektory Sendai, wywodzące się z jednoniciowych wirusów RNA. Najważniejszą zaletą wektorów Sendai jest fakt, iż nie ulegają one integracji do genomu. Dzięki temu są one bezpieczne w kontekście mutagenezy insercyjnej. Kolejną, istotną cechą wektorów Sendai jest translacja w cytoplazmie. Metodami inżynierii genetycznej wektory dodatkowo zostały zmodyfikowane tak, aby nie ulegały replikacji w komórkach gospodarzy [164]. Oznacza to, że nieintegrujący i niereplikujący wektor przebywa cały czas w cytoplazmie zainfekowanej komórki i w miarę kolejnych podziałów komórkowych ulega stopniowemu rozcieńczeniu [165]. Po serii kilkunastu podziałów wprowadzony transgen jest niewykrywalny za pomocą metody qRT-PCR – co zostało również potwierdzone w przypadku wyprowadzonych linii hiPSC.1-4, wykorzystanych w tej pracy. hiPSC.2 – potwierdzone przez producenta (HipSci), hiPSC.3 – w poprzednich badaniach naszego zespołu [166], hiPSC.1 i hiPSC.4 – wyniki niepokazane. Wszystkie stosowane w tej pracy linie hiPSC wykazywały cechy charakterystyczne dla pluripotencjalnych komórek macierzystych: 1. Morfologia: hiPSC rosły w koloniach o wyraźnie zaznaczonych granicach, co jest charakterystyczne również dla hESC [13]. 2. Ekspresja czynników odpowiedzialnych za uzyskanie i utrzymanie pluripotencji: jednego z najważniejszych – NANOG (biorący udział m.in. w reaktywacji chromosomu X w trakcie rozwoju zarodkowego [167]), OCT3/4 (jeden z głównych czynników odpowiedzialnych za pluripotencję, jego zbyt wysoki lub zbyt niski poziom może doprowadzić do różnicowania hESC i hiPSC [168]), SSEA-4 (zewnątrzkomórkowy marker, istotny w kontekście adhezji i interakcji z macierzą zewnątrzkomórkową [169]) oraz TRA-1-60 i TRA-1-81 (zewnątrzkomórkowe białka adhezyjne charakterystyczne dla komórek pluripotencjalnych [170]). 3. Zdolność do spontanicznego różnicowania in vitro poprzez ciałka zarodkowe do komórek wywodzących się ze wszystkich trzech linii zarodkowych. Jest to funkcjonalny test potwierdzający pluripotencjalny fenotyp hiPSC. Wykorzystywane w tych badaniach komórki były w stanie w sposób spontaniczny zróżnicować w kierunku: mezodermy, endodermy i ektodermy, co zostało wykazane na podstawie analizy immunofluorescencyjnej odpowiednich markerów: wimentyny i α-SMA (mezoderma), GATA4 i AFP (endoderma) oraz NFH (ektoderma). W trakcie trwania doświadczeń zaobserwowano nagły spadek wydajności różnicowania zarówno klonów WT, jak i HO-1 KO pochodzących z linii hiPSC.2. Po dokładnym zweryfikowaniu wszystkich odczynników stosowanych w hodowli komórek oraz różnicowaniu do hiPSC-CM zdecydowano się na analizę kariotypu, we współpracy z firmą Kariogen. Szczegółowa analiza kariotypu wykazała aberrację chromosomową polegającą na zrównoważonej translokacji pomiędzy chromosomami 6. i 15. pary z punktami złamań 6p.21.1 i 15q15 (Ryc. 39 B.). Niezaobserwowanie wspomnianych zmian w przypadku analizy liczby chromosomów, przeprowadzonych przez producenta, mogło wynikać z dwóch rzeczy: i) test zastosowany przez producenta polega na poddaniu amplifikacji konkretnych fragmentów chromosomów i pozwala jedynie na ocenienie, czy doszło do duplikacji lub delecji. W przypadku translokacji zrównoważonej nie dochodzi do zmiany liczby chromosomów [171]; ii) drugą możliwością jest nabycie wspomnianej mutacji w trakcie hodowli. Przemawiać za tym może fakt, iż przez pewien czas wspomniane klony hiPSC różnicowały wydajnie do hiPSC-CM. Niestabilność genetyczna hiPSC skutkująca aberracjami chromosomowymi jest jedną z negatywnych cech hiPSC [172]. Niemniej jednak linia hiPSC.2 oraz klony z niej otrzymane zostały wyłączone z dalszych badań. Wyniki otrzymane przy użyciu komórek hiPSC.2 oraz hiPSC.2-CM zostały następnie potwierdzone przy użyciu innych linii hiPSC. 8.2. Różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów i ich selekcja Kluczową techniką, będącą podstawą większości doświadczeń w tej pracy było wydajne i powtarzalne różnicowanie hiPSC do kardiomiocytów. Dlatego, mając do dyspozycji scharakteryzowaną pod kątem pluripotencji linię hiPSC H1, w pierwszej kolejności przystąpiono do wyboru metody różnicowania. W tym celu zdecydowano się porównać dwa protokoły: komercyjnie dostępny zestaw PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit Prototype oraz opublikowany przez X. Lian i współpracowników protokół opierający się o wykorzystanie małocząsteczkowych inhibitorów szlaków sygnałowych kluczowych dla powstawania kardiomiocytów (metoda GiWi) [62]. Przeprowadzając wstępną optymalizację obu metod, uzyskano zbliżone wartości wydajności różnicowania (około 60% komórek wykazujących ekspresję TNNT2, Rycina 12. i 13.). Biorąc pod uwagę, że w przypadku zestawu PSC wystarczyło jedynie dobrać odpowiednią gęstość wysiewania, a następnie co dwa dni dodawać gotową do użycia pożywkę, metoda ta zdawała się optymalna. W przeciwieństwie do niej protokół GiWi wymagał optymalizacji na każdym etapie otrzymywania hiPSC-CM. W pierwszej kolejności należało dobrać odpowiednią konfluencję, następnie należało zoptymalizować stężenia dwóch inhibitorów: CHIR99021 oraz IWR-1, odpowiedzialnych za modulację ścieżki Wnt/β-katenina i w konsekwencji odpowiednie nakierowanie procesu różnicowania hiPSC. Potrzeba samodzielnego przygotowywania pożywki, która nie mogła być przechowywana przez dłuższy czas, dodatkowo zwiększała pracochłonność metody GiWi. Mając na względzie jedynie niski nakład pracy oraz porównywalną wydajność otrzymywania hiPSC-CM, metoda PSC mogłaby wydawać się optymalnym wyborem. Różnice między oboma protokołami uwidoczniły się jednak w trakcie bardziej szczegółowych analiz. Jednym ze sposobów określenia roli HO-1 w procesie powstawania kardiomiocytów z hiPSC było wyciszenie HO-1 na drodze stabilnej ekspresji sekwencji kodującej shRNA specyficznie rozpoznającej transkrypt HMOX1. Metoda z wykorzystaniem wektorów lentiwirusowych okazała się wydajnie wyciszać badany gen. Analiza qRT-PCR wskazała na obniżenie transkryptu HMOX1 w hiPSC o około 90% (Ryc. 14). Tak otrzymane linie poddano różnicowaniu do kardiomiocytów, stosując wcześniej zoptymalizowane metody PSC oraz GiWi. Nie zaobserwowano wpływu wyciszenia HO-1 na poziom ekspresji markerów mezodermy i mezodermy sercowo-specyficznen, zarówno w kardiomiocytach otrzymanych metodą GiWi, jak i PSC (Ryc. 15 A. i B.). Ponowna analiza qRT-PCR hiPSC-CM otrzymanych z linii shHO-1 z wykorzystaniem protokołu GiWi wykazała utrzymanie się wyciszenia HO-1, jednak w mniejszym stopniu (ok. 70-80%, Rycina 15 A.). Natomiast różnicowanie tych linii za pomocą zestawu PSC niespodziewane doprowadziło do utraty aktywności shRNA w uzyskanych hiPSC-CM (Ryc. 15 B.). Jednym z możliwych wytłumaczeń zaobserwowanego zjawiska są znaczące zmian epigenetyczne, które zachodzą w trakcie różnicowania hiPSC do kardiomiocytów [173]. Utrata wyciszenia ekspresji HO-1 jedynie w przypadku metody PSC, ale nie GiWi, wskazuje na różnice w molekularnym mechanizmie obu protokołów. Z tego względu, pomimo większej pracochłonności, do dalszych badań wybrano protokół GiWi. Dodatkowo do wyboru tego protokołu przyczyniły się problemy z przeżywalnością kardiomiocytów otrzymanych metodą PSC po przesianiu do dalszych analiz, czego nie zaobserwowano w przypadku stosowania metody GiWi (wyniki niepokazane). Kolejnym istotnym powodem, dla którego komercyjna metoda PSC może okazać się nieoptymalna, jest nieznany skład stosowanych pożywek. Brak możliwości dowolnej manipulacji składem pożywki uniemożliwiłby w przyszłości użycie tej metody do bardziej wnikliwych badań nad mechanizmem różnicowania, np. badań z wykorzystaniem progenitorów kardiomiocytów, gdzie niezwykle istotna jest modulacja aktywności czynnika c-MYC na wczesnym etapie rozwoju hiPSC-CM [174,175]. Natomiast pożywką bazową w metodzie GiWi jest RPMI 1640 (o znanym składzie) z dodatkiem suplementu B27, który został stworzony z myślą o różnicowaniu komórek macierzystych do neuronów [176]. Suplement ten okazał się również optymalny w przypadku różnicowania do kardiomiocytów. Co istotne, znany jest jego skład, a producent oferuje również szereg wariantów, takich jak B27 pozbawione insuliny (B27-ins). Jest to kluczowe z punktu widzenia wydajnego otrzymywania hiPSC-CM, gdyż insulina na początkowych etapach, poprzez oddziaływanie na Akt oraz IGF-1, blokuje różnicowanie do mezodermy sercowo-specyficznej, równolegle indukując rozwój linii ektodermalnych [56]. Oprócz wariantu pozbawionego insuliny, producent oferuje również warianty pozbawione witaminy A czy przeciwutleniaczy. Możliwość większej kontroli składu stosowanej pożywki pozwala na przeprowadzenie bardziej wnikliwych analiz. Niemniej jednak należy podkreślić, że omawiane optymalizacje były przeprowadzane w 2015 roku, gdy na rynku dostępny był jedynie prototyp PSC Cardiomyocyte Differentiation kit. Przez ten czas producent dopracował produkt, czego przykładem są prace naukowe wykorzystujące tę metodę do otrzymywania kardiomiocytów [98,177]. 8.2.1. Selekcja kardiomiocytów Pomimo zoptymalizowania protokołu różnicowania hiPSC do kardiomiocytów przy użyciu metody GiWi, wydajność tego procesu w dalszym ciągu nie wynosiła 100%, a dodatkowo była bardzo zmienna pomiędzy poszczególnymi różnicowaniami (Ryc. 23). Duża zmienność procentowego udziału komórek wykazujących ekspresję TNNT2 była obserwowana zwłaszcza w liniach hiPSC całkowicie pozbawionych ekspresji HO-1 po zastosowaniu metody CRISPR/Cas9 i otrzymanych z pojedynczych komórek. To mogłoby sugerować, że brak HO-1 wpływa na obniżenie wydajności różnicowania, jednak podobne zjawisko zaobserwowano w przypadku kontroli Cas9, czyli izogenicznych hiPSC transfekowanych plazmidem kodującym nukleazę Cas9, ale pozbawionym sekwencji kodującej sgRNA przeciwko HMOX1. Należy podkreślić, że sam proces nukleofekcji, a następnie hodowli pojedynczych komórek w celu wyprowadzenia klonów, może indukować odpowiedź stresową w hiPSC oraz hESC, co z kolei może przełożyć się na spadek ich właściwości pluripotencjalnych [178]. W celu miarodajnej analizy doświadczeń pojawiła się zatem potrzeba opracowania metody pozwalającej na większą standaryzację pomiędzy kolejnymi powtórzeniami w obrębie jednego eksperymentu. W szczególności zmienna proporcja hiPSC-CM pomiędzy poszczególnymi doświadczeniami mogłaby w sposób znaczący wpłynąć na otrzymywane wyniki. W początkowym etapie badań przetestowano dwie metody selekcji kardiomiocytów: komercyjnie dostępny zestaw opierający się na magnetycznym sortowaniu na podstawie sercowo-specyficznych markerów powierzchniowych oraz selekcja metaboliczna wykorzystująca mleczan sodu, oraz pożywkę pozbawioną glukozy. Oferowany przez Miltenyi Biotec zestaw do sortowania kardiomiocytów daje możliwość szybkiego oczyszczenia populacji zawierającej hiPSC-CM (rozdział 7.9.1). W toku przeprowadzonych testów zaobserwowano znaczący wzrost czystości populacji zróżnicowanych kardiomiocytów (1.5-2.4-krotnie, Ryc. 26). Niemniej jednak, w dalszym ciągu, pomiędzy poszczególnymi różnicowaniami czystość ta była zmienna i nie przekraczała 80% [75]. Druga przetestowana metoda selekcji kardiomiocytów opiera się na ich właściwościach biologicznych. W szczególności, komórki te zamiast glukozy jako źródła energii są w stanie wykorzystywać mleczan [179]. Zjawisko to jest charakterystyczne jedynie dla kardiomiocytów. Pozostałe typy komórek, głównie komórki śródbłonka oraz fibroblasty sercowe [180], powstające w trakcie różnicowania, nie mają takiej możliwości i po odpowiednim czasie głodzenia powinny ulec apoptozie. W trakcie optymalizacji tej metody przetestowano dwa modele: ciągły, dwutygodniowy okres pozbawienia glukozy, oraz przerywany system 3+3, gdzie komórki poddawano selekcji najpierw dnia 10 przez 3 dni, następnie na tydzień przywracano standardową pożywkę, a w ostatnim kroku przeprowadzano drugą rundę trzydniowej selekcji. Powodem wprowadzenia drugiego modelu był fakt, że hiPSC-CM charakteryzują się niedojrzałym fenotypem i pozbawienie glukozy również może niekorzystnie na nie wpłynąć [75]. Niemniej jednak najwydajniejszą metodą okazał się wariant z ciągłą, dwutygodniową selekcją metaboliczną. Przy wszystkich testowanych stężeniach mleczanu (2, 4, 6, 10 oraz 70 mM) czystość populacji po przeprowadzeniu selekcji wynosiła ponad 90%. Biorąc pod uwagę, że metoda ta oferowała powtarzalną oraz bardzo skuteczną metodę selekcji kardiomiocytów, w dalszych badaniach zdecydowano się na rutynowe wykorzystanie selekcji metabolicznej w celu ustandaryzowania wydajności różnicowania pomiędzy doświadczeniami. Protokół jednak zmodyfikowano, wprowadzając metodę „3 dni, pasaż, 3 dni” (Ryc. 27), polegającej na prowadzeniu selekcji przez 3 dni, pasażu komórek i kontynuacji selekcji przez 3 kolejne dni. Następnie przywracano standardową pożywkę na minimum 3 kolejne dni, przed przystąpieniem do dalszych analiz. Skrócenie czasu ciągłej deprywacji glukozy było podyktowane jej negatywnym wpływem na niedojrzałe fenotypowo kardiomiocyty [75]. Natomiast pasażowanie hiPSC-CM w trakcie selekcji metabolicznej miało na celu pozbycie się z hodowli obumierających komórek niebędących kardiomiocytami, które nie przeżywały tej procedury ze względu na brak glukozy. Otrzymana, niezadawalająca, wydajność oczyszczania populacji kardiomiocytów przy zastosowaniu zestawu firmy Miltenyi Biotec mogła wynikać z faktu, że w jej przypadku do selekcji wykorzystywane są zewnątrzkomórkowe markery, podatne na trawienie enzymami wykorzystywanymi do pasażu kardiomiocytów. W celu wydajnego oczyszczania należy uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, co wymaga długotrwałej ekspozycji na enzymy proteolityczne. Zestaw enzymów dostarczanych przez producenta oprócz ułatwienia dysocjacji na pojedyncze komórki ściśle połączonych kardiomiocytów, prawdopodobnie trawił również zewnątrzkomórkowe markery używane następnie do selekcji magnetycznej. Aby proces ten zachodził wydajnie, wystarczy, że zachowa się około 20% ze wszystkich markerów (informacja podana przez producenta), co sugeruje, że odpowiednia optymalizacja czasu trawienia i metody pasażu mogłaby umożliwić skuteczniejszą selekcję przy użyciu tego sposobu. Jednak ze względu na znacznie wyższy koszt komercyjnego zestawu, w porównaniu do selekcji metabolicznej, nie zdecydowano się na dalsze optymalizacje tej metody. 8.3. Modulacja HO-1 nie wpływa na pluripotencję i wydajność różnicowania W celu określenia roli HO-1 w procesie powstawania kardiomiocytów z hiPSC postanowiono sprawdzić, jaki będzie wpływ modulacji aktywności HO-1 na wydajność różnicowania. W tym celu wykorzystano trzy podejścia o różnym mechanizmie działania. Pierwszą z metod była farmakologiczna stymulacja aktywatorami (hemina i CoPP) i inhibitorem (SnPP) aktywności HO-1 w trakcie różnicowania. Efektywność zarówno CoPP, jak i SnPP, została dowiedziona przez nasz zespół w doświadczeniach in vitro oraz in vivo [18,181]. Hemina, pomimo że jest silnym induktorem HO-1 [115], nie jest powszechnie stosowana, ze względu na jej toksyczność. Do badań jednak włączono ją jako dodatkowy aktywator HO-1, biorąc pod uwagę możliwe, niezależne od HO-1, działanie CoPP [18]. Drugą wykorzystaną metodą pomagającą zrozumieć rolę HO-1 w powstawaniu kardiomiocytów była stabilna transdukcja hiPSC przy użyciu wektorów lentiwirusowych kodujących specyficzne sekwencje shRNA anty-HMOX1. Zablokowanie translacji, a w efekcie brak obecności białka również jest istotny dla zrozumienia roli HO-1 w procesie powstawania kardiomiocytów, ze względu na szerokie spektrum niekanonicznych funkcji HO-1, np. nieenzymatyczne działanie tego białka w jądrze [182]. Dodatkowo długotrwała inhibicja aktywności enzymatycznej poprzez zastosowanie SnPP prowadzi do wzrostu ekspresji HO-1, co dodatkowo mogłoby uwypuklić nieenzymatyczne działanie tego białka i prowadzić do błędnych wniosków [183]. Ostatnia zastosowana metoda – CRISPR/Cas9, pozwala na zmodyfikowanie genomu komórki tak, aby całkowicie wyłączyć ekspresję HMOX1. Taki rodzaj modyfikacji jest istotny ze względu na szereg zmian epigenetycznych, zachodzących w hiPSC w trakcie różnicowania do kardiomiocytów [173], które mogłyby doprowadzić do wyciszenia ekspresji wbudowanej sekwencji kodującej shRNA anty-HMOX1. Stymulacja różnicujących komórek zarówno aktywatorami (CoPP i hemina), jak i inhibitorem (SnPP) HO-1 w stężeniach 0,5, 1 i 5 µM nie miało wpływu na wydajność różnicowania (Ryc. 17). W trakcie pilotażowego doświadczenia testowano również stężenie 10 µM wszystkich badanych związków, lecz ze względu na efekt toksyczny zrezygnowano z niego w dalszych badaniach (wyniki niepokazane). Jednym z potencjalnych powodów, dla którego nie zaobserwowano żadnego wpływu modulacji aktywności HO-1 na wydajność różnicowania, może być fakt, że HO-1 nie odgrywa istotnej roli w tym procesie. Jednak wyniki naszego oraz innych zespołów wskazują na istotną rolę HO-1 w powstawaniu kardiomiocytów w modelu mysim [108,135]. Analizując proces rozwoju hiPSC-CM, należy mieć na uwadze jego złożony charakter. W trakcie różnicowania kluczowa jest odpowiednio przeprowadzona w czasie modulacja szlaku sygnałowego Wnt [63] – w pierwszym etapie silna indukcja tego szlaku prowadzi do rozwoju mezodermy, a następnie jego zahamowanie kieruje komórki do mezodermy sercowo-specyficznej. Biorąc pod uwagę, że kluczowy dla różnicowania szlak sygnałowy Wnt jest zupełnie odmiennie regulowany, zwłaszcza na początkowym etapie, można przypuszczać, że również inne czynniki, w tym HO-1, będą wpisywały się w podobny schemat. Istnieje szereg przeciwstawnych doniesień na temat wpływu ROS na różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów (omówione w pracy przeglądowej [184]). Mogą one wynikać z braku jednej, ustandaryzowanej metody do przeprowadzania tego procesu. Jednak na podstawie tych, niejednokrotnie sprzecznych, doniesień można wyciągnąć wniosek, że odpowiedni poziom ROS jest istotny dla rozwoju kardiomiocytów i podobnie jak szlak Wnt, ROS również jest odmiennie regulowany na poszczególnych etapach różnicowania. Z tego względu potencjalny efekt aktywacji bądź inhibicji HO-1 w jednym etapie różnicowania, może zostać rozmyty przez odwrotny efekt HO-1 w kolejnym etapie powstawania kardiomiocytów. Aby dokładnie odpowiedzieć na pytanie, jaką funkcję pełni HO-1 w kardiomiogenezie, należałoby rozdzielić ten proces na poszczególne etapy i sprawdzać m.in. poziom ekspresji markerów dla nich charakterystycznych. Innym wyjaśnieniem może być fakt zbyt niskiego stężenia stosowanych związków. W badaniach in vitro zazwyczaj stosuje się 10-20 µM stężenia protoporfiryn w zdecydowanie krótszych eksperymentach [181]. W przypadku długotrwałego różnicowania (20 dni) zastosowanie 10 µM stężenia każdego badanego związku wykazywało efekt toksyczny w około 7 dniu różnicowania (wyniki niepokazane). Ostatnie zastosowane podejście – CRISPR/Cas9, pozwalała na ominięcie problemu utraty wyciszenia HMOX1 na drodze zmian epigenetycznych w trakcie różnicowania oraz oferowała możliwość całkowitego wyłączenia ekspresji HMOX1, co nie było możliwe w przypadku zastosowania metody z shRNA. Wstępne dwie serie różnicowań czterech klonów HO-1 KO oraz klonu kontrolnego Cas9 (Ryc. 24) wskazały jedynie na dużą zmienność wydajności różnicowania pomiędzy doświadczeniami, charakterystyczną również dla klonu kontrolnego Cas9. Zaobserwowane zjawisko nie mogło zatem wynikać z braku HO-1. Prawdopodobnym wyjaśnieniem takich problemów może być negatywny wpływ samej nukleofekcji, a następnie hodowli hiPSC jako pojedynczych komórek, na ich pluripotencjalny fenotyp. Niezwykle istotna dla hiPSC jest hodowla w odpowiednich warunkach, tj. koloniach o odpowiednich rozmiarach. Wysianie komórek zbyt rzadko lub doprowadzenie do przerostu kolonii negatywnie wpływa na pluripotencję. Po wyprowadzeniu klonów z pojedynczych hiPSC oraz funkcjonalnym potwierdzeniu braku HO-1 (Ryc. 19 i 20) sprawdzono, jak wpływa on na poziom markerów specyficznych dla ludzkich komórek pluripotencjalnych (Ryc. 21 B.-F.). Co prawda analiza qRT-PCR nie wykazała ich obniżonej ekspresji, ale należy mieć na uwadze, że jako kontroli użyto kontrolnego klonu Cas9, który również przeszedł nukleofekcję, a następnie proces wyprowadzania klonów z pojedynczej komórki. Dodatkowa kontrola w postaci wyjściowej linii hiPSC mogłaby ewentualnie potwierdzić omawianą hipotezę. Opisane problemy ze zmiennością wydajności różnicowania stały się podstawą do opracowania metody pozwalającej na wzbogacenie populacji kardiomiocytów (rozdział 7.9, Ryc. 26 i 27). Niemniej jednak, w przypadku badania wpływu HO-1 na wydajność różnicowania, dodatkowa selekcja metaboliczna rozmyłaby ewentualny efekt HO-1 na ten proces. Zdecydowano się dlatego na próbę pośredniego określenia zdolności różnicowania hiPSC HO-1 KO do kardiomiocytów. Pierwszą metodą było określenie poziomu czynnika transkrypcyjnego GATA6, gdyż wykazano, że w hiPSC koreluje on ze zdolnością do różnicowania do hiPSC-CM [153]. Analiza qRT-PCR nie wykazała jednak różnicy w ekspresji GATA6 w klonach HO-1 KO w porównaniu z kontrolą (Ryc. 21 A.). Drugą metodą, pozwalającą pośrednio określić potencjał hiPSC HO-1 KO do rozwoju kardiomiocytów, było zmierzenie poziomu markerów charakterystycznych dla mezodermy i mezodermy sercowo-specyficznej w spontanicznie zróżnicowanych ciałkach zarodkowych. Wstępna analiza wykazała, że zarówno klon kontrolny Cas9, jak i cztery klony HO-1 KO, po dwa z każdego zastosowanego sgRNA, wydajnie różnicują do komórek wywodzących się z trzech linii zarodkowych (Ryc. 22). Nie zaobserwowano jednak wimentyny, jednego z markerów mezodermy, w spontanicznie zróżnicowanych klonach HO-1 KO. Zależność pomiędzy HO-1 a wimentyną została już wcześniej udokumentowana [154]. Z drugiej strony wykazano powszechną ekspresję innego białka charakterystycznego dla mezodermy – α-SMA – we wszystkich klonach, co pozwala stwierdzić, że brak HO-1 nie wpłynął znacząco na zdolność do spontanicznego rozwoju mezodermy. Oprócz analizy immunofluorescencyjnej przeprowadzono analizę qRT-PCR, która również potwierdziła, że HO-1 nie jest kluczowa dla poziomu ekspresji markerów mezodermy oraz mezodermy sercowo-specyficznej (Ryc. 25 A.-D.). Jedynie w przypadku MIXL1 zaobserwowano wzrost w jednym z klonów (Ryc. 25 A.), jednak biorąc pod uwagę, że trzy pozostałe linie HO-1 KO nie różniły się pod tym względem z kontrolą, można przypuszczać, że efekt ten jest artefaktem. Podsumowując, na podstawie trzech różnych strategii nie stwierdzono, by HO-1 wpływała na wydajność różnicowania hiPSC do kardiomiocytów. 8.4. Indukcja HO-1 nie wpływa na metabolizm hiPSC-CM HO-1, poprzez produkty swojej aktywności enzymatycznej, posiada szerokie spektrum działania. H. Suliman wraz ze współpracownikami wykazali, że farmakologiczna indukcja ekspresji HO-1 poprzez stymulację CoPP zwiększa syntezę mitochondriów w rozwijających się kardiomiocytach w modelu mysim [135]. Uzasadnionym zatem było sprawdzenie wpływu HO-1 na metabolizm ludzkich kardiomiocytów otrzymanych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Jednym z badań pozwalającym na potwierdzenie hipotezy o zwiększeniu metabolizmu hiPSC-CM przez produkty aktywności enzymatycznej HO-1, mogłoby być zaobserwowanie przeciwstawnego efektu w przypadku komórek HO-1 KO, lub w przypadku zastosowania SnPP. Do badań nad wpływem HO-1 na metabolizm hiPSC-CM nie zdecydowano się jednak wykorzystać wyprowadzonych klonów HO-1 KO ani zastosować farmakologiczną inhibicję HO-1. Podyktowane to było faktem, że hiPSC-CM cechują się zarodkowym fenotypem i są mało dojrzałe, w porównaniu do w pełni rozwiniętych kardiomiocytów [77]. Jedną z cech charakterystycznych dla niedojrzałych kardiomiocytów jest nierozwinięta w pełni maszyneria energetyczna komórki (omówione w pracy przeglądowej [91]). Biorąc pod uwagę, że w przypadku hiPSC-CM wyjściowa aktywność mitochondrialna jest już na niskim poziomie, dalsze jej obniżanie poprzez wyłączenie ekspresji bądź zahamowanie aktywności HO-1 mogłoby okazać się trudne do wykrycia/pomiaru. Dlatego, w celu potwierdzenia hipotezy o wpływie HO-1 na metabolizm kardiomiocytów, zdecydowano się na zwiększenie poziomu HO-1 za pomocą CoPP. Doświadczenia z wykorzystaniem urządzenia Seahorse XF, mierzącego zużycie tlenu (Ryc. 37), nie wykazały niemniej zmian w żadnym z analizowanych parametrów w hiPSC-CM stymulowanych CoPP w porównaniu z kontrolą – na stałym poziomie był parametr oddychania podstawowego, oddychania maksymalnego, produkcji ATP, oddychania poza mitochondrialnego oraz zapasowej pojemności oddechowej. Co istotne, niezmieniony poziom przecieku protonów wskazywał, że stymulacja 10 µM CoPP IX nie była toksyczna dla kardiomiocytów, tak jak miało to miejsce w przypadku zastosowania tego stężenia w trakcie różnicowania (wyniki niepokazane). Dodatkowo obserwacje te zostały potwierdzone w teście TMRM, który pośrednio mierzy aktywność błon mitochondrialnych (Ryc. 38). Potencjalnym wyjaśnieniem zaobserwowanego braku wpływu CoPP na ludzkie kardiomiocyty, podczas gdy w modelu mysim efekt ten był znaczący [135], mogą być istotne różnice fizjologiczne pomiędzy sercem ludzkim i mysim. Rytm pracy serca myszy jest około 10 razy szybszy (500-700 uderzeń na minutę) w porównaniu do serca ludzkiego (57-100 uderzeń na minutę)[185]. Wskazuje to na zdecydowanie większe zapotrzebowanie energetyczne serca mysiego i pozwala wnioskować, że metabolizm będzie w nim regulowany w odmienny sposób niż w przypadku ludzkich kardiomiocytów. 8.5. Brak HO-1 wpływa na potencjał czynnościowy kardiomiocytów Podstawą do postawienia hipotezy badawczej o wpływie HO-1 na aktywność elektrofizjologiczną hiPSC-CM jest dobrze udokumentowany efekt jednego z produktów reakcji katalizowanej przez HO-1 – tlenku węgla – na aktywność kanałów jonowych (podsumowane w pracy przeglądowej [186]) Analiza porównawcza transkryptomu niezróżnicowanych HO-1 KO i WT hiPSC nie wykazała istotnych statystycznie zmian w transkrypcji genów (p. adj.) (Ryc. 23 A.). Jednak, na podstawie danych literaturowych, zwrócono uwagę na dwa geny: ANXA6 (Ryc. 23 B.), który cechował się tendencją spadkową oraz FRMD4A (Ryc. 23 C.), który cechował się tendencją wzrostową w hiPSC HO-1 KO. ANXA6 oraz FRMD4A mogą być zaangażowane w różnego rodzaju kardiomiopatie o podłożu elektrofizjologicznym [155,156]. Następnie, analiza RNA-seq hiPSC-CM, kontrolnych i pozbawionych HO-1, wykazała istotne statystycznie zmiany w poziomie ekspresji ponad tysiąca genów (Ryc. 28 B.). Co ważne, geny charakteryzujące się zarówno podniesioną, jak i obniżoną ekspresją grupowały się w sposób hierarchiczny (Ryc. 28 A.). Również analiza głównych składowych wskazała na grupowanie się próbek na podstawie genotypu HO-1 (Ryc. 28 C.). Pośród zmienionych genów nie znalazły się jednak ANXA6 oraz FRMD4A, co mogła sugerować analiza transkryptomu niezróżnicowanych hiPSC. Niemniej, analiza funkcjonalna procesów biologicznych wykonana z uwzględnieniem wszystkich genów o zmienionej ekspresji wskazała, że wiele spośród nich zaangażowanych jest w procesy związane z przewodnictwem: i) regulacja tętna poprzez przewodnictwo sercowe, ii) potencjał czynnościowy komórek serca zaangażowany w kurczliwość, iii) kurczliwość komórki związana z włóknami aktynowymi, iv) regulacja napięcia mięśni, czy v) procesy sercowe (Ryc. 29). Dokładniejsza analiza drugiego z wymienionych procesów wykazała m.in. wzrost ekspresji genu kodującego kanał potasowy KCNQ1 (Ryc. 31 A.), co zostało następnie potwierdzone analizą qRT-PCR (Ryc. 31 C.). Analiza transkryptomu wskazywała również zwiększoną ekspresję kanału wapniowego CACNA1c (Ryc. 30 B.), co jednak nie zostało potwierdzone analizą qRT-PCR (Ryc. 31 F.). Analiza innych, również kluczowych dla aktywności elektrofizjologicznej hiPSC-CM kanałów jonowych: KCNH2, jak i SCN5a nie wykazała zmian, zarówno w teście qRT-PCR (Ryc. 31 D. i E.) jak i RNA-seq (KCNH2 zmiana 0,81-krotna. p adj.= 0,69; SCN5a zmiana 1,03-krotna, p adj.= 0,97). Następnym krokiem było sprawdzenie, czy zmiany na poziomie transkryptu mają przełożenie funkcjonalne w badanych hiPSC-CM HO-1 KO. W tym celu wykonano pomiar potencjału czynnościowego metodą patch clamp, który wykazał znacząco skrócony czas repolaryzacji w komórkach pozbawionych HO-1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 32 A.-D.). Parametry szybkości narastania potencjału, potencjału w nadstrzale oraz maksymalnej hiperpolaryzacji następczej pozostały bez zmian (Ryc. 32 E.-G.) Na czas trwania etapu repolaryzacji w głównej mierze wpływa gradient przepływu jonów potasowych. Wzrost szybkości przepływu jonów potasowych na tym etapie potencjału czynnościowego prowadzi do skrócenia czasu repolaryzacji. Może to być efektem większej aktywności kanałów potasowych bądź ich zwiększonej ekspresji. Zaobserwowany obraz skróconego czasu repolaryzacji jest więc zgodny z powyżej wspomnianymi zmianami na poziomie ekspresji genów (Ryc. 31 A. i C.). W celu dalszego potwierdzenia, że obserwowane zmiany są zależne od HO-1, przeprowadzono testy z wykorzystaniem związku zwiększającego poziom HO-1 – CoPP. Indukcja HO-1 w hiPSC-CM WT (Ryc. 33 G.), zgodnie z oczekiwaniami, nieznacznie wydłużyła czas repolaryzacji (istotnie statystycznie tendencja wzrostowa, Ryc. 33 A.-C.). Co ciekawe, zaobserwowano również znaczący wzrost szybkości narastania potencjału czynnościowego (Ryc. 33 D.). Parametr ten zależy od przepływu jonów sodowych. Na skutek zwiększonego przepływu jonów Na+, co może wynikać ze zwiększonej ekspresji kanałów sodowych lub ich większej aktywności, następuje wzrost szybkości narastania potencjału czynnościowego. Badania na poziomie transkryptu nie wykazały jednak zmian w ekspresji kanału sodowego SNC5a w hiPSC-CM HO-1 KO w porównaniu z kontrolą. Może to być wyjaśnione niedojrzałym, zarodkowym fenotypem hiPSC-CM, który charakteryzuje się m.in. niskim poziomem omawianych kanałów jonowych [187]. Zatem niezaobserwowanie spadku ekspresji SCN5a oraz brak zmian parametru szybkości narastania potencjału czynnościowego w hiPSC-CM HO-1 KO, może być wyjaśnionym wyjściowo niskim poziomem ekspresji omawianego kanału jonowego. Następnym krokiem było zweryfikowanie, czy obserwowane zmiany są specyficzne i wynikają z modulacji aktywności HO-1. W tym celu przeprowadzono analizę patch-clamp hiPSC-CM HO-1 KO stymulowanych CoPP. Ku zaskoczeniu, parametr czasu repolaryzacji w kardiomiocytach pozbawionych HO-1 również uległ zwiększeniu w wyniku stymulacji CoPP. Świadczyć to może o niezależnym od HO-1 efekcie działania tego związku. Co istotne, w literaturze naukowej udokumentowane są przypadki takiego działania metaloprotoporfiryn. Wyniki naszego zespołu wskazują na niezależny od HO-1, przeciwstawny efekt dwóch inhibitorów HO-1 – SnPP i ZnPP – na produkcję tlenku azotu [188]. Co więcej, wykazano, że zastosowanie CoPP jako aktywatora oraz SnPP jako inhibitora HO-1 tak samo wpływa na kaspazę-3 i kaspazę-8 w linii limfocytów T Jurkat [189]. W innym badaniu zaobserwowano natomiast niezależną od HO-1 indukcję cyklooksygenazy-2 w komórkach mikrogleju [190]. Do tej pory niezależny od HO-1 efekt działania CoPP na aktywność elektrofizjologiczną kardiomiocytów nie został opisany. Z drugiej strony, stymulacja CoPP kardiomiocytów pozbawionych HO-1 nie wpłynęła na szybkości narastania potencjału czynnościowego (Ryc. 34 D.), jak miało to miejsce w przypadku hiPSC-CM WT (Ryc. 33 D.). Oznacza to, że zmiany omawianego parametru pod wpływem stymulacji CoPP są zależne od HO-1. Mając na uwadze niezależne od HO-1 działanie CoPP oraz fakt, że HO-1 pełni swoją funkcję głównie poprzez produkty aktywności enzymatycznej, postanowiono skupić się w następnym kroku na tlenku węgla. Tak jak wspomniano na początku tego rozdziału, wpływ CO na kanały jonowe jest szeroko udokumentowany [186]. Dlatego, do dalszych badań nad potencjałem czynnościowym, wykorzystano związek uwalniający CO – CORM2. Niemniej zaobserwowano znaczny, niespecyficzny efekt w komórkach stymulowanych inaktywowanym CORM zarówno w grupie kontrolnej (Ryc. 35 A-D.), jak i HO-1 KO (Ryc. 36 D.). Świadczyć to może o silnym działaniu trójkarbonylo-dichloro-rutenu, będącego rdzeniem związku CORM2, na kanały jonowe, bądź też o problemach technicznych w trakcie przygotowywania nieaktywnej formy CORM2. Zaobserwowana, niespecyficzna aktywność iCORM2 nie pozwala na wiarygodną analizę uzyskanych wyników. Podsumowując, badania na poziomie transkryptomu wykazały wzrost ekspresji kanału potasowego KCNQ1 w kardiomiocytach pozbawionych HO-1. Funkcjonalna analiza potencjału czynnościowego wykazała skrócony czas repolaryzacji w hiPSC-CM HO-1 KO, co może być właśnie wytłumaczone wyższą ekspresją KCNQ1. Ze względu na nieopisany do tej pory w literaturze, niezależny od HO-1, efekt działania CoPP na hiPSC-CM, niemożliwym było dokładniejsze zbadanie zaobserwowanego zjawiska. Zastosowanie modelu z genetyczną nadekspresją HO-1 mogłoby być w tym przypadku bardziej pomocne. Niemniej jednak skrócony czas repolaryzacji i wzrost ekspresji KCNQ1 może być ciekawy z punktu widzenia stopnia dojrzałości omawianych hiPSC-CM. Liczne badania nad dojrzewaniem hiPSC-CM wykazały, że jedną z oznak zwiększenia stopnia dojrzałości kardiomiocytów jest zwiększenie ekspresji kanałów jonowych i skrócenie czasu repolaryzacji [97,187,191]. Zaobserwowany w tej pracy wzrost ekspresji KCNQ1 oraz skrócony czas repolaryzacji mógłby wskazywać na większy stopień dojrzałości hiPSC-CM HO-1 KO, w porównaniu do hiPSC-CM WT. Jednak biorąc pod uwagę fakt, że ekspresja pozostałych, kluczowych kanałów jonowych (KCNH2, SCN5a oraz CACNA1c) nie wzrosła, należy skłonić się do stwierdzenia, że brak HO-1 nie ma przełożenia na całościowy poziom dojrzałości hiPSC-CM, oraz że obserwowany wpływ braku HO-1 na czas repolaryzacji jest ograniczony jedynie do kanałów potasowych. Drugim efektem, zależnym od HO-1, był wzrost szybkości narastania potencjału czynnościowego, co zostało wykazane w doświadczeniach z hiPSC-CM WT oraz hiPSC-CM HO-1 KO stymulowanych CoPP (Ryc. 33 D. i Ryc. 34 D.). Co ciekawe, istnieje doniesienie naukowe wskazujące, że wzrost omawianego parametru może być związany ze zwiększeniem stopnia dojrzałości hiPSC-CM hodowanych w strukturach trójwymiarowych. [192]. Niemniej jednak, w tym przypadku, niezależne od HO-1 działanie CoPP oraz niespecyficzne działanie nieaktywnej formy CORM2 nie pozwoliło na dokładniejsze zbadanie tego procesu. Również tutaj pomocny okazałby się model z genetyczną nadekspresją HO-1. Przeprowadzone w tej pracy funkcjonalne analizy potencjału czynnościowego postawiły więcej znaków zapytania, niż dostarczyły klarownych odpowiedzi. Wyjaśnienie pozornie sprzecznych obserwacji można znaleźć jednak dzięki dokładniejszej analizie wyników RNA-seq. Rycina 29. przedstawiająca analizę funkcjonalną procesów biologicznych dla wszystkich statystycznie istotnych zmian jasno wskazuje, że brak HO-1 znacząco wpłynął w dużej mierze na procesy związane z przewodnictwem. Natomiast po bardziej wnikliwym przyjrzeniu się jednemu z procesów: potencjał czynnościowy zaangażowany w kurczliwość serca (Ryc. 30), dostrzec można niespójny wzorzec zmian ekspresji. Część kanałów jonowych oraz genów związanych z przewodnictwem ulega zwiększonej ekspresji (PKP2, CACNA2d, FGF12, CACNA1d, SCN3b oraz KCNQ1), podczas gdy pozostałe charakteryzują się obniżoną ekspresją (KCNE3, BIN1, DSC2, SCN1b, KCNE2,KCNA5). Dlatego na podstawie pozornie niespójnych wyników analizy patch clamp oraz wnikliwej analizy transkryptomu można wyciągnąć konkluzję o rozregulowanej maszynerii związanej z przewodnictwem w kardiomiocytach pozbawionych HO-1. 8.6. Potencjalny wpływ braku HO-1 na regenerację serca po zawale W celu lepszego zrozumienia, jaki skutek może mieć brak HO-1 na kardiomiocyty, należy z jednej strony bardziej zagłębić się w wyniki analizy transkryptomu hiPSC-CM WT oraz HO-1 KO, a z drugiej strony spojrzeć całościowo na wyniki przedstawione w tej pracy i w publikacji dotyczącej roli HO-1 w zawale serca w modelu mysim, opublikowanej przez nasz zespół [160]. Tomczyk i współpracownicy wykazali w niej dwojaką rolę HO-1 w regeneracji mięśnia sercowego po zawale, zależną od etapu tego procesu. W badanym modelu, po trwałym zablokowaniu przedniej zstępującej gałęzi lewej tętnicy wieńcowej niespodziewanie zaobserwowano, że myszy pozbawione HO-1 charakteryzują się wyższym odsetkiem przeżywalności w pierwszych dniach po operacji, w porównaniu do myszy kontrolnych. Przyczyną śmierci zwierząt, które nie przeżyły pierwszych dni po wywołanym zawale, niezależnie od genotypu, było pęknięcie wolnej ściany serca, w pobliżu miejsca podwiązania tętnicy. Jako jeden z możliwych mechanizmów zaobserwowanego zjawiska została wskazana silna indukcja HO-1 krótko po zawale mięśnia sercowego u myszy kontrolnych, która to w następstwie obniża poziom ekspresji genów (Mcp1, Icam1, Esel oraz Vcam1) związanych z infiltracją komórek w odpowiedzi na stan zapalny. Do kluczowych komórek naciekających miejsce uszkodzenia tkanki sercowej są fibroblasty, które następnie ulegają przemianie w miofibroblasty i zaczynają intensywną produkcję kolagenu [193]. Powstająca w następstwie blizna pozawałowa chroni uszkodzoną ścianę serca przed pęknięciem. W przypadku myszy pozbawionych HO-1 wykazano wyższą produkcję kolagenu typu I w miejscu zawału, co miało przełożenie na zaobserwowaną większą przeżywalność w pierwszych dniach po zawale. Z drugiej strony jednak, myszy HO-1 KO w późniejszych punktach czasowych charakteryzowały się większym upośledzeniem funkcji serca w porównaniu do zwierząt kontrolnych. Zaobserwowano również zwiększoną hipertrofię kardiomiocytów u myszy HO-1 KO [160]. 8.6.1. Potencjalny wpływ braku HO-1 na bliznowacenie W wyżej wspomnianej pracy, dotyczącej roli HO-1 w gojeniu uszkodzonego mięśnia sercowego u myszy, wskazano na pozytywny wpływ braku HO-1 na przeżywalność zwierząt w pierwszych dniach po zawale. Wynikał on z wyższej ekspresji genów odpowiedzialnych za infiltrację komórek w odpowiedzi na stan zapalny i co za tym idzie – ochronę wolnej ściany mięśnia sercowego przed pęknięciem. W omawianej pracy skupiono się na roli makrofagów w tym procesie. Opisane natomiast w przedstawionej pracy doktorskiej doświadczenie ze spontanicznym różnicowaniem ciałek zarodkowych otrzymanych z hiPSC WT oraz HO-1 KO mogą stanowić uzupełnienie omawianego procesu. Zaobserwowano bowiem brak ekspresji białka wimentyny w spontanicznie zróżnicowanych komórkach HO-1 KO (Ryc. 22). Istnieje doniesienie naukowe opisujące mechanizm wzrostu ruchliwości fibroblastów pozbawionych wimentyny [194]. Co istotne, wykazano również, że wimentyna jest regulowana przez HO-1 [154]. Przedstawione wyniki, w zestawieniu ze wspomnianymi publikacjami, mogą sugerować, że zwiększenie infiltracji w miejsce uszkodzenia tkanki sercowej może być ułatwione zmniejszonym poziomem wimentyny, która zwiększa ruchliwość fibroblastów. Analiza porównawcza transktyptomu hiPSC-CM HO-1 KO i WT wykazała znaczne zmiany w ekspresji genów zaangażowanych w adhezję (Ryc. 29). Zaburzona adhezja może z kolei ułatwiać ruchliwość komórek, co wpisuje się w hipotezę o zwiększonej ruchliwości fibroblastów pozbawionych wimentyny. Wiadomo również, że poziom wimentyny może być regulowany przez HO-1 [154]. Analiza RNA-seq nie wykazała jednak zmian w poziomie transkryptu genu kodującego wimentynę w hiPSC-CM HO-1 KO. Wyjaśnieniem tej pozornej sprzeczności może być degradacja białka lub fakt, iż spontanicznie różnicowane ciałka zarodkowe, użyte do barwienia immunofluorescencyjnego stanowią heterogenną populację komórek, a do analizy transkryptomu użyto relatywnie homogennej populacji hiPSC-CM. W tej sytuacji możliwe jest, że brak spójności pomiędzy wynikami dla regulacji transkryptu oraz poziomu białka wimentyny w komórkach HO-1 KO mogą wynikać z różnego typu badanych komórek. Widome jest, że HO-1 może mieć przeciwstawny efekt w zależności od typu komórek [107,135]. 8.6.2. Potencjalny wpływ braku HO-1 w dłuższej perspektywie czasowej Tomczyk i współpracownicy w swojej pracy wskazują, iż zwiększona produkcja kolagenu w sercach myszy HO-1 KO, która jest protekcyjna w pierwszych dniach po zawale, w późniejszych punktach czasowych odpowiedzialna jest za pogorszenie funkcji serca. Przedstawione w tej rozprawie wyniki również zdają się potwierdzać opisane negatywne zjawisko. Bardziej dogłębna analiza transkryptomu hiPSC-CM HO-1 KO i WT wykazała, że wśród procesów biologicznych, których transkrypcja została znacząco zaburzona, znajduje się ścieżka sygnałowa odpowiedzialna za regenerację (Ryc. 30 A.). Dodatkowo ekspresja genu S100A4 również była znacząco obniżona w komórkach pozbawionych HO-1 (Ryc. 30 B.). Jest to niezwykle istotne, gdyż wykazano, że transkrypcja genu S100A4 znacząco rośnie w sercu po zawale i jest istotna w odpowiedzi na niedokrwienie, chroniąc mięsień sercowy przed dalszym uszkodzeniem związanym z rozwojem ischemii [157,158]. Przedstawione w tej pracy wyniki transkryptomu hiPSC HO-1 KO i WT (proces regeneracji i ekspresja genu S100A4) mogą być wyjaśnieniem molekularnych mechanizmów odpowiedzialnych za pogarszanie się funkcji serca po zawale u myszy pozbawionych HO-1. Dodatkowo obok zaburzonego procesu regeneracji, obraz ten uzupełniony może być o rozregulowaną aktywność elektrofizjologiczną kardiomiocytów (omówione w rozdziale 8.5). Częściowym potwierdzeniem wspomnianych obserwacji może być również, opisany w przedstawionej pracy doktorskiej, wzrost powierzchni hiPSC-CM HO-1 KO w porównaniu z kardiomiocytami kontrolnymi. Co ważne, komórki pozbawione HO-1 wykazywały wyższą ekspresją czynnika IGF2, który jest jednym z kluczowych białek odpowiedzialnych za hipertrofię kardiomiocytów [195] (Ryc. 39). Przedstawione wyniki zdają się współgrać z doniesieniem o zwiększonej hipertrofii kardiomiocytów w pozawałowych sercach myszy HO-1 KO. 8.6.3. Regulacja ekspresji HO-1 u ludzi a zawał serca Wiele długotrwale stosowanych leków na choroby układu sercowo-naczyniowego działa poprzez indukcję poziomu HO-1 (omówione w rozdziale 4.3.3.) [132]. Z drugiej strony, kwas walproinowy stosowany w przypadku epilepsji czy choroby dwubiegunowej obniża HO-1 [119]. HO-1 natomiast wykazuje dwojaką, przeciwstawną rolę na proces regeneracji mięśnia sercowego, w zależności od czasu, który minął od zawału [160]. W pracy tej wykorzystano myszy pozbawione ekspresji Hmox1, niemniej w przypadku ludzi całkowity brak HO-1 jest rzadkością (omówione w rozdziale 4.3.2.). Niemniej jednak, na podstawie badań kohortowych, znaleziono związek pomiędzy stosowaniem leków obniżających stan zapalny a zwiększoną liczbą pęknięć wolnej ściany serca w wyniku zawału [196,197]. Biorąc pod uwagę fakt, iż wiele leków stosowanych w przypadku chorób układu sercowo-naczyniowego działa poprzez indukcję HO-1, można przypuszczać, że jednym z powodów nagłej śmierci na skutek pęknięcia wolnej ściany serca jest zaburzenie zależnego od HO-1 mechanizmu bliznowacenia (omówiony w rozdziale 8.6.1.) Innym zjawiskiem, niezależnym od wpływu środowiska zewnętrznego, mającym wpływ na poziom HO-1 jest polimorfizm promotora HMOX1 (omówiony w rozdziale 4.3.3.1.). Osoby posiadające mniej powtórzeń dinukleotydu guanina-tymina (tzw. krótki promotor) w promotorze HMOX1 wykazują wyższą ekspresję HO-1 [129], co pozwala sądzić, iż takie osoby mogą być bardziej narażone na pęknięcie wolnej ściany serca w wyniku zawału. Z drugiej strony, jeżeli taki pacjent przeżyje pierwsze dni po zawale, długofalowe mechanizmy regeneracyjne zależne od HO-1 (omówione w poprzednim rozdziale) mogą przyczynić się do lepszej regeneracji mięśnia sercowego, w porównaniu do pacjentów posiadających tzw. długi promotor HMOX1. 9. Wnioski Przedstawione w tej pracy wyniki dotyczące roli HO-1 w biologii kardiomiocytów nie potwierdziły, iż HO-1 wpływa na wydajność różnicowania hiPSC do tego typu komórek. Nie potwierdziły również tezy, że HO-1 ma wpływ na aktywność metaboliczną hiPSC-CM, jak to ma miejsce w przypadku mysich iPSC-CM [108,135]. Może to wynikać ze znacznych różnic w rozmiarze i fizjologii serca mysiego i ludzkiego (omówione w rozdziale 8.4), a tym samym właściwości kardiomiocytów. Zaprezentowane wyniki wskazują jednak na istotny wpływ braku HO-1 na potencjał czynnościowy hiPSC-CM, co może konsekwencje kliniczne, ze względu na polimorfizm promotora HO-1. Dodatkowo analiza transkryptomu wskazuje na możliwość wpływu HO-1 na proces gojenia się serca po zawale. Niemniej jednak proces ten powinien być lepiej zbadany z wykorzystaniem ludzkich komórek. 10. Bibliografia 1. Ding, S.; Schultz, P.G. A Role for Chemistry in Stem Cell Biology. Nature Biotechnology 2004, 22, 833–840, doi:10.1038/nbt987. 2. Pillow, R.P.; Epstein, R.B.; Buckner, C.D.; Giblett, E.R.; Thomas, E.D. Treatment of Bone-Marrow Failure by Isogeneic Marrow Infusion. The New England journal of medicine 1966, 275, 94–97, doi:10.1056/NEJM196607142750209. 3. Yamashita, Y.M.; Yuan, H.; Cheng, J.; Hunt, A.J. Polarity in Stem Cell Division: Asymmetric Stem Cell Division in Tissue Homeostasis. Cold Spring Harbor perspectives in biology 2010, 2, doi:10.1101/cshperspect.a001313. 4. Fliedner, T.M.; Graessle, D.; Paulsen, C.; Reimers, K. Structure and Function of Bone Marrow Hemopoiesis: Mechanisms of Response to Ionizing Radiation Exposure. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals 2002, 17, 405–426, doi:10.1089/108497802760363204. 5. Pietraszek-Gremplewicz, K.; Kozakowska, M.; Bronisz-Budzynska, I.; Ciesla, M.; Mucha, O.; Podkalicka, P.; Madej, M.; Glowniak, U.; Szade, K.; Stepniewski, J.; et al. Heme Oxygenase-1 Influences Satellite Cells and Progression of Duchenne Muscular Dystrophy in Mice. Antioxid Redox Signal 2018, 29, 128–148, doi:10.1089/ars.2017.7435. 6. Dumont, N.A.; Wang, Y.X.; von Maltzahn, J.; Pasut, A.; Bentzinger, C.F.; Brun, C.E.; Rudnicki, M.A. Dystrophin Expression in Muscle Stem Cells Regulates Their Polarity and Asymmetric Division. Nature medicine 2015, 21, 1455–1463, doi:10.1038/nm.3990. 7. Chang, N.C.; Chevalier, F.P.; Rudnicki, M.A. Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity. Trends in Molecular Medicine 2016, 22, 479–496, doi:10.1016/j.molmed.2016.04.002. 8. Thomson, J.A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 1998, 282, 1145–1147, doi:10.1126/science.282.5391.1145. 9. Haas, S.; Trumpp, A.; Milsom, M.D. Causes and Consequences of Hematopoietic Stem Cell Heterogeneity. Cell Stem Cell 2018, 22, 627–638, doi:10.1016/j.stem.2018.04.003. 10. MAURO, A. Satellite Cell of Skeletal Muscle Fibers. The Journal of biophysical and biochemical cytology 1961, 9, 493–495, doi:10.1083/jcb.9.2.493. 11. Condic, M.L. Totipotency: What It Is and What It Is Not. Stem Cells Dev 2014, 23, 796–812, doi:10.1089/scd.2013.0364. 12. Takahashi, K.; Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 2006, 126, 663–76, doi:10.1016/j.cell.2006.07.024. 13. Takahashi, K.; Tanabe, K.; Ohnuki, M.; Narita, M.; Ichisaka, T.; Tomoda, K.; Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 2007, 131, 861–872, doi:10.1016/j.cell.2007.11.019. 14. Gruen, L.; Grabel, L. Concise Review: Scientific and Ethical Roadblocks to Human Embryonic Stem Cell Therapy. Stem Cells 2006, 24, 2162–2169, doi:10.1634/stemcells.2006-0105. 15. Kulawik, T. Science Policy and Public Accountability in Poland: The Case of Embryonic Stem-Cell Research. Science and Public Policy 2009, 36, 469–482, doi:10.3152/030234209X460999. 16. Lapid, K.; Glait-Santar, C.; Gur-Cohen, S.; Canaani, J.; Kollet, O.; Lapidot, T. Egress and Mobilization of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells: A Dynamic Multi-Facet Process. 2012, doi:10.3824/STEMBOOK.1.91.1. 17. Souza, L.M.; Boone, T.C.; Gabrilove, J.; Lai, P.H.; Zsebo, K.M.; Murdock, D.C.; Chazin, V.R.; Bruszewski, J.; Hsieng, L.; Chen, K.K.; et al. Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor: Effects on Normal and Leukemic Myeloid Cells. Science 1986, 232, 61–65, doi:10.1126/science.2420009. 18. Szade, A.; Szade, K.; Nowak, W.N.; Bukowska‐Strakova, K.; Muchova, L.; Gońka, M.; Żukowska, M.; Cieśla, M.; Kachamakova‐Trojanowska, N.; Rams‐Baron, M.; et al. Cobalt Protoporphyrin IX Increases Endogenous G‐ CSF and Mobilizes HSC and Granulocytes to the Blood. EMBO Molecular Medicine 2019, 11, doi:10.15252/emmm.201809571. 19. Gurdon, J.B. The Developmental Capacity of Nuclei Taken from Intestinal Epithelium Cells of Feeding Tadpoles. Development 1962, 10, 622–640. 20. Campbell, K.H.S.; McWhir, J.; Ritchie, W.A.; Wilmut, I. Sheep Cloned by Nuclear Transfer from a Cultured Cell Line. Nature 1996, 380, 64–66, doi:10.1038/380064a0. 21. Nichols, J.; Zevnik, B.; Anastassiadis, K.; Niwa, H.; Klewe-Nebenius, D.; Chambers, I.; Schöler, H.; Smith, A. Formation of Pluripotent Stem Cells in the Mammalian Embryo Depends on the POU Transcription Factor Oct4. Cell 1998, 95, 379–391, doi:10.1016/S0092-8674(00)81769-9. 22. Avilion, A.A.; Nicolis, S.K.; Pevny, L.H.; Perez, L.; Vivian, N.; Lovell-Badge, R. Multipotent Cell Lineages in Early Mouse Development Depend on SOX2 Function. Genes and Development 2003, 17, 126–140, doi:10.1101/gad.224503. 23. Chambers, I.; Colby, D.; Robertson, M.; Nichols, J.; Lee, S.; Tweedie, S.; Smith, A. Functional Expression Cloning of Nanog, a Pluripotency Sustaining Factor in Embryonic Stem Cells. Cell 2003, 113, 643–655, doi:10.1016/S0092-8674(03)00392-1. 24. Niwa, H.; Burdon, T.; Chambers, I.; Smith, A. Self-Renewal of Pluripotent Embryonic Stem Cells Is Mediated via Activation of STAT3. Genes and Development 1998, 12, 2048–2060, doi:10.1101/gad.12.13.2048. 25. Takahashi, K.; Mitsui, K.; Yamanaka, S. Role of ERas in Promoting Tumour-like Properties in Mouse Embryonic Stem Cells. Nature 2003, 423, 541–545, doi:10.1038/nature01646. 26. Cartwright, P.; McLean, C.; Sheppard, A.; Rivett, D.; Jones, K.; Dalton, S. LIF/STAT3 Controls ES Cell Self-Renewal and Pluripotency by a Myc-Dependent Mechanism. Development 2005, 132, 885–896, doi:10.1242/dev.01670. 27. Li, Y.; McClintick, J.; Zhong, L.; Edenberg, H.J.; Yoder, M.C.; Chan, R.J. Murine Embryonic Stem Cell Differentiation Is Promoted by SOCS-3 and Inhibited by the Zinc Finger Transcription Factor Klf4. Blood 2005, 105, 635–637, doi:10.1182/blood-2004-07-2681. 28. Kielman, M.F.; Rindapää, M.; Gaspar, C.; Van Poppel, N.; Breukell, C.; Van Leeuwen, S.; Taketo, M.M.; Roberts, S.; Smits, R.; Fodde, R. Apc Modulates Embryonic Stem-Cell Differentiation by Controlling the Dosage of β-Catenin Signaling. Nature Genetics 2002, 32, 594–605, doi:10.1038/ng1045. 29. Churko, J.M.; Burridge, P.W.; Wu, J.C. Generation of Human IPSCs from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Non-Integrative Sendai Virus in Chemically Defined Conditions. Methods in Molecular Biology 2013, 1036, 81–88, doi:10.1007/978-1-62703-511-8_7. 30. Zhou, T.; Benda, C.; Duzinger, S.; Huang, Y.; Li, X.; Li, Y.; Guo, X.; Cao, G.; Chen, S.; Hao, L.; et al. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Urine. Journal of the American Society of Nephrology 2011, 22, 1221–1228, doi:10.1681/ASN.2011010106. 31. Jinek, M.; Chylinski, K.; Fonfara, I.; Hauer, M.; Doudna, J.A.; Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 2012, 337, 816–821, doi:10.1126/science.1225829. 32. DeRosa, B.A.; Van Baaren, J.M.; Dubey, G.K.; Lee, J.M.; Cuccaro, M.L.; Vance, J.M.; Pericak-Vance, M.A.; Dykxhoorn, D.M. Derivation of Autism Spectrum Disorder-Specific Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Mononuclear Cells. Neuroscience Letters 2012, 516, 9–14, doi:10.1016/j.neulet.2012.02.086. 33. Marchetto, M.C.; Belinson, H.; Tian, Y.; Freitas, B.C.; Fu, C.; Vadodaria, K.C.; Beltrao-Braga, P.C.; Trujillo, C.A.; Mendes, A.P.D.; Padmanabhan, K.; et al. Altered Proliferation and Networks in Neural Cells Derived from Idiopathic Autistic Individuals. Molecular Psychiatry 2017, 22, 820–835, doi:10.1038/mp.2016.95. 34. Noh, H.; Shao, Z.; Coyle, J.T.; Chung, S. Modeling Schizophrenia Pathogenesis Using Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells (IPSCs). Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease 2017, 1863, 2382–2387, doi:10.1016/j.bbadis.2017.06.019. 35. Stack, J.P.; Moslehi, J.; Sayed, N.; Wu, J.C. Cancer Therapy-Induced Cardiomyopathy: Can Human Induced Pluripotent Stem Cell Modelling Help Prevent It? Eur Heart J 2019, 40, 1764–1770, doi:10.1093/eurheartj/ehx811. 36. Chatterjee, K.; Zhang, J.; Honbo, N.; Karliner, J.S. Doxorubicin Cardiomyopathy. Cardiology 2010, 115, 155–162, doi:10.1159/000265166. 37. Burridge, P.W.; Li, Y.F.; Matsa, E.; Wu, H.; Ong, S.-G.; Sharma, A.; Holmström, A.; Chang, A.C.; Coronado, M.J.; Ebert, A.D.; et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell–Derived Cardiomyocytes Recapitulate the Predilection of Breast Cancer Patients to Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity. Nature Medicine 2016, 22, 547–556, doi:10.1038/nm.4087. 38. Roth, G.A.; Johnson, C.; Abajobir, A.; Abd-Allah, F.; Abera, S.F.; Abyu, G.; Ahmed, M.; Aksut, B.; Alam, T.; Alam, K.; et al. Global, Regional, and National Burden of Cardiovascular Diseases for 10 Causes, 1990 to 2015. Journal of the American College of Cardiology 2017, 70, 1–25, doi:10.1016/j.jacc.2017.04.052. 39. Naghavi, M.; Abajobir, A.A.; Abbafati, C.; Abbas, K.M.; Abd-Allah, F.; Abera, S.F.; Aboyans, V.; Adetokunboh, O.; Ärnlöv, J.; Afshin, A.; et al. Global, Regional, and National Age-Sex Specifc Mortality for 264 Causes of Death, 1980-2016: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet 2017, 390, 1151–1210, doi:10.1016/S0140-6736(17)32152-9. 40. Xin, M.; Olson, E.N.; Bassel-Duby, R. Mending Broken Hearts: Cardiac Development as a Basis for Adult Heart Regeneration and Repair. Nature reviews. Molecular cell biology 2013, 14, 529–41, doi:10.1038/nrm3619. 41. Bergmann, O.; Bhardwaj, R.D.; Bernard, S.; Zdunek, S.; Barnabé-, F.; Walsh, S.; Zupicich, J.; Alkass, K.; Buchholz, B.A.; Jovinge, S.; et al. Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans. Science 2010, 324, 98–102, doi:10.1126/science.1164680.Evidence. 42. Stehlik, J.; Edwards, L.B.; Kucheryavaya, A.Y.; Benden, C.; Christie, J.D.; Dipchand, A.I.; Dobbels, F.; Kirk, R.; Rahmel, A.O.; Hertz, M.I. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 29th Official Adult Heart Transplant Report—2012. The Journal of Heart and Lung Transplantation 2012, 31, 1052–1064, doi:10.1016/j.healun.2012.08.002. 43. Caspi, O.; Huber, I.; Kehat, I.; Habib, M.; Arbel, G.; Gepstein, A.; Yankelson, L.; Aronson, D.; Beyar, R.; Gepstein, L. Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Improves Myocardial Performance in Infarcted Rat Hearts. Journal of the American College of Cardiology 2007, 50, 1884–1893, doi:10.1016/j.jacc.2007.07.054. 44. Laflamme, M.A.; Chen, K.Y.; Naumova, A. V.; Muskheli, V.; Fugate, J.A.; Dupras, S.K.; Reinecke, H.; Xu, C.; Hassanipour, M.; Police, S.; et al. Cardiomyocytes Derived from Human Embryonic Stem Cells in Pro-Survival Factors Enhance Function of Infarcted Rat Hearts. Nature Biotechnology 2007, 25, 1015–1024, doi:10.1038/nbt1327. 45. van Laake, L.W.; Passier, R.; Doevendans, P.A.; Mummery, C.L. Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes and Cardiac Repair in Rodents. Circulation Research 2008, 102, 1008–1010, doi:10.1161/CIRCRESAHA.108.175505. 46. Chong, J.J.H.; Yang, X.; Don, C.W.; Minami, E.; Liu, Y.W.; Weyers, J.J.; Mahoney, W.M.; Van Biber, B.; Cook, S.M.; Palpant, N.J.; et al. Human Embryonic-Stem-Cell-Derived Cardiomyocytes Regenerate Non-Human Primate Hearts. Nature 2014, 510, 273–277, doi:10.1038/nature13233. 47. Ye, L.; Chang, Y.H.; Xiong, Q.; Zhang, P.; Zhang, L.; Somasundaram, P.; Lepley, M.; Swingen, C.; Su, L.; Wendel, J.S.; et al. Cardiac Repair in a Porcine Model of Acute Myocardial Infarction with Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiovascular Cells. Cell Stem Cell 2014, 15, 750–761, doi:10.1016/j.stem.2014.11.009. 48. Pecha, S.; Yorgan, K.; Röhl, M.; Geertz, B.; Hansen, A.; Weinberger, F.; Sehner, S.; Ehmke, H.; Reichenspurner, H.; Eschenhagen, T.; et al. Human IPS Cell-Derived Engineered Heart Tissue Does Not Affect Ventricular Arrhythmias in a Guinea Pig Cryo-Injury Model. Scientific Reports 2019, 9, doi:10.1038/s41598-019-46409-z. 49. Mummery, C.; Ward-van Oostwaard, D.; Doevendans, P.; Spijker, R.; van den Brink, S.; Hassink, R.; van der Heyden, M.; Opthof, T.; Pera, M.; de la Riviere, A.B.; et al. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Cardiomyocytes: Role of Coculture With Visceral Endoderm-Like Cells. Circulation 2003, 107, 2733–2740, doi:10.1161/01.CIR.0000068356.38592.68. 50. Turinetto, V.; Orlando, L.; Giachino, C. Induced Pluripotent Stem Cells: Advances in the Quest for Genetic Stability during Reprogramming Process. International Journal of Molecular Sciences 2017, 18, doi:10.3390/ijms18091952. 51. Mallapaty, S. Revealed: Two Men in China Were First to Receive Pioneering Stem-Cell Treatment for Heart Disease. Nature 2020, 581, 249–250, doi:10.1038/d41586-020-01285-w. 52. Masumoto, H.; Matsuo, T.; Yamamizu, K.; Uosaki, H.; Narazaki, G.; Katayama, S.; Marui, A.; Shimizu, T.; Ikeda, T.; Okano, T.; et al. Pluripotent Stem Cell-Engineered Cell Sheets Reassembled with Defined Cardiovascular Populations Ameliorate Reduction in Infarct Heart Function through Cardiomyocyte-Mediated Neovascularization. Stem Cells 2012, 30, 1196–1205, doi:10.1002/stem.1089. 53. Kawamura, M.; Miyagawa, S.; Fukushima, S.; Saito, A.; Miki, K.; Ito, E.; Sougawa, N.; Kawamura, T.; Daimon, T.; Shimizu, T.; et al. Enhanced Survival of Transplanted Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes by the Combination of Cell Sheets with the Pedicled Omental Flap Technique in a Porcine Heart. Circulation 2013, 128, doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.000366. 54. Kehat, I.; Kenyagin-Karsenti, D.; Snir, M.; Segev, H.; Amit, M.; Gepstein, A.; Livne, E.; Binah, O.; Itskovitz-Eldor, J.; Gepstein, L. Human Embryonic Stem Cells Can Differentiate into Myocytes with Structural and Functional Properties of Cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation 2001, 108, 407–414, doi:10.1172/jci12131. 55. Passier, R.; Oostwaard, D.W.; Snapper, J.; Kloots, J.; Hassink, R.J.; Kuijk, E.; Roelen, B.; de la Riviere, A.B.; Mummery, C. Increased Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells in Serum-Free Cultures. Stem Cells 2005, 23, 772–780, doi:10.1634/stemcells.2004-0184. 56. Freund, C.; Ward-van Oostwaard, D.; Monshouwer-Kloots, J.; van den Brink, S.; van Rooijen, M.; Xu, X.; Zweigerdt, R.; Mummery, C.; Passier, R. Insulin Redirects Differentiation from Cardiogenic Mesoderm and Endoderm to Neuroectoderm in Differentiating Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells 2008, 26, 724–733, doi:10.1634/stemcells.2007-0617. 57. Arnold, S.J.; Robertson, E.J. Making a Commitment: Cell Lineage Allocation and Axis Patterning in the Early Mouse Embryo. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2009, 10, 91–103, doi:10.1038/nrm2618. 58. Buckingham, M.; Meilhac, S.; Zaffran, S. Building the Mammalian Heart from Two Sources of Myocardial Cells. Nature Reviews Genetics 2005, 6, 826–835, doi:10.1038/nrg1710. 59. Tam, P.P.L.; Loebel, D.A.F. Gene Function in Mouse Embryogenesis: Get Set for Gastrulation. Nature Reviews Genetics 2007, 8, 368–381, doi:10.1038/nrg2084. 60. Takei, S.; Ichikawa, H.; Johkura, K.; Mogi, A.; No, H.; Yoshie, S.; Tomotsune, D.; Sasaki, K. Bone Morphogenetic Protein-4 Promotes Induction of Cardiomyocytes from Human Embryonic Stem Cells in Serum-Based Embryoid Body Development. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology 2009, 296, doi:10.1152/ajpheart.01288.2008. 61. Ren, Y.; Lee, M.Y.; Schliffke, S.; Paavola, J.; Amos, P.J.; Ge, X.; Ye, M.; Zhu, S.; Senyei, G.; Lum, L.; et al. Small Molecule Wnt Inhibitors Enhance the Efficiency of BMP-4-Directed Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 2011, 51, 280–287, doi:10.1016/j.yjmcc.2011.04.012. 62. Lian, X.; Zhang, J.; Azarin, S.M.; Zhu, K.; Hazeltine, L.B.; Bao, X.; Hsiao, C.; Kamp, T.J.; Palecek, S.P. Directed Cardiomyocyte Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells by Modulating Wnt/β-Catenin Signaling under Fully Defined Conditions. Nature protocols 2013, 8, 162–75, doi:10.1038/nprot.2012.150. 63. Lian, X.; Bao, X.; Zilberter, M.; Westman, M.; Fisahn, A.; Hsiao, C.; Hazeltine, L.B.; Dunn, K.K.; Kamp, T.J.; Palecek, S.P. Chemically Defined, Albumin-Free Human Cardiomyocyte Generation. Nature Methods 2015, 12, 595–596, doi:10.1038/nmeth.3448. 64. Burridge, P.W.; Thompson, S.; Millrod, M.A.; Weinberg, S.; Yuan, X.; Peters, A.; Mahairaki, V.; Koliatsos, V.E.; Tung, L.; Zambidis, E.T. A Universal System for Highly Efficient Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells That Eliminates Interline Variability. PLoS ONE 2011, 6, e18293, doi:10.1371/journal.pone.0018293. 65. Laco, F.; Woo, T.L.; Zhong, Q.; Szmyd, R.; Ting, S.; Khan, F.J.; Chai, C.L.L.; Reuveny, S.; Chen, A.; Oh, S. Unraveling the Inconsistencies of Cardiac Differentiation Efficiency Induced by the GSK3β Inhibitor CHIR99021 in Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports 2018, 10, 1851–1866, doi:10.1016/j.stemcr.2018.03.023. 66. Xu, C.; He, J.-Q.; Kamp, T.J.; Police, S.; Hao, X.; O’Sullivan, C.; Carpenter, M.K.; Lebkowski, J.; Gold, J.D. Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Can Be Maintained in Defined Medium without Serum. Stem Cells and Development 2006, 15, 931–941, doi:10.1089/scd.2006.15.931. 67. Fijnvandraat, A.C.; Van Ginneken, A.C.G.; Schumacher, C.A.; Boheler, K.R.; Lekanne Deprez, R.H.; Christoffels, V.M.; Moorman, A.F.M. Cardiomyocytes Purified from Differentiated Embryonic Stem Cells Exhibit Characteristics of Early Chamber Myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 2003, 35, 1461–1472, doi:10.1016/j.yjmcc.2003.09.011. 68. Gassanov, N.; Er, F.; Zagidullin, N.; Hoppe, U.C. Endothelin Induces Differentiation of ANP‐EGFP Expressing Embryonic Stem Cells towards a Pacemaker Phenotype. The FASEB Journal 2004, 18, 1710–1712, doi:10.1096/fj.04-1619fje. 69. Hidaka, K.; Lee, J.; Kim, H.S.; Ihm, C.H.; Iio, A.; Ogawa, M.; Nishikawa, S.; Kodama, I.; Morisaki, T. Chamber‐specific Differentiation of Nkx2.5‐positive Cardiac Precursor Cells from Murine Embryonic Stem Cells. The FASEB Journal 2003, 17, 740–742, doi:10.1096/fj.02-0104fje. 70. Klug, M.G.; Soonpaa, M.H.; Koh, G.Y.; Field, L.J. Genetically Selected Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells Form Stable Intracardiac Grafts. Journal of Clinical Investigation 1996, 98, 216–224, doi:10.1172/JCI118769. 71. Hattori, F.; Chen, H.; Yamashita, H.; Tohyama, S.; Satoh, Y.S.; Yuasa, S.; Li, W.; Yamakawa, H.; Tanaka, T.; Onitsuka, T.; et al. Nongenetic Method for Purifying Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Nature Methods 2010, 7, 61–66, doi:10.1038/nmeth.1403. 72. Dubois, N.C.; Craft, A.M.; Sharma, P.; Elliott, D.A.; Stanley, E.G.; Elefanty, A.G.; Gramolini, A.; Keller, G. SIRPA Is a Specific Cell-Surface Marker for Isolating Cardiomyocytes Derived from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology 2011, 29, 1011–1018, doi:10.1038/nbt.2005. 73. Uosaki, H.; Fukushima, H.; Takeuchi, A.; Matsuoka, S.; Nakatsuji, N.; Yamanaka, S.; Yamashita, J.K. Efficient and Scalable Purification of Cardiomyocytes from Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells by VCAM1 Surface Expression. PLoS ONE 2011, 6, e23657, doi:10.1371/journal.pone.0023657. 74. Tohyama, S.; Hattori, F.; Sano, M.; Hishiki, T.; Nagahata, Y.; Matsuura, T.; Hashimoto, H.; Suzuki, T.; Yamashita, H.; Satoh, Y.; et al. Distinct Metabolic Flow Enables Large-Scale Purification of Mouse and Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Cell Stem Cell 2013, 12, 127–137, doi:10.1016/j.stem.2012.09.013. 75. Sharma, A.; Li, G.; Rajarajan, K.; Hamaguchi, R.; Burridge, P.W.; Wu, S.M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-Modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. Journal of visualized experiments : JoVE 2015, doi:10.3791/52628. 76. Maillet, M.; van Berlo, J.H.; Molkentin, J.D. Molecular Basis of Physiological Heart Growth: Fundamental Concepts and New Players. Nature reviews. Molecular cell biology 2013, 14, 38–48, doi:10.1038/nrm3495. 77. Van Den Berg, C.W.; Okawa, S.; Chuva De Sousa Lopes, S.M.; Van Iperen, L.; Passier, R.; Braam, S.R.; Tertoolen, L.G.; Del Sol, A.; Davis, R.P.; Mummery, C.L. Transcriptome of Human Foetal Heart Compared with Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells. Development (Cambridge) 2015, 142, 3231–3238, doi:10.1242/dev.123810. 78. Werner, J.C.; Sicard, R.E.; Schuler, H.G. Palmitate Oxidation by Isolated Working Fetal and Newborn Pig Hearts. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism 1989, 256, doi:10.1152/ajpendo.1989.256.2.e315. 79. VASICKA, A.; QUILLIGAN, E.J.; AZNAR, R.; LIPSITZ, P.J.; BLOOR, B.M. Oxygen Tension in Maternal and Fetal Blood, Amniotic Fluid, and Cerebrospinal Fluid of the Mother and the Baby. American Journal of Obstetrics and Gynecology 1960, 79, 1041–1047, doi:10.1016/0002-9378(60)90508-1. 80. Lopaschuk, G.D.; Spafford, M.A.; Marsh, D.R. Glycolysis Is Predominant Source of Myocardial ATP Production Immediately after Birth. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology 1991, 261, doi:10.1152/ajpheart.1991.261.6.h1698. 81. Dai, D.F.; Danoviz, M.E.; Wiczer, B.; Laflamme, M.A.; Tian, R. Mitochondrial Maturation in Human Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Stem Cells International 2017, 2017, doi:10.1155/2017/5153625. 82. Scuderi, G.J.; Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology 2017, 5, doi:10.3389/fcell.2017.00050. 83. Palmer, J.W.; Tandler, B.; Hoppel, C.L. Biochemical Properties of Subsarcolemmal and Interfibrillar Mitochondria Isolated from Rat Cardiac Muscle. Journal of Biological Chemistry 1977, 252, 8731–8739. 84. Saks, V.; Kuznetsov, A.V.; Gonzalez-Granillo, M.; Tepp, K.; Timohhina, N.; Karu-Varikmaa, M.; Kaambre, T.; Santos, P.D.; Boucher, F.; Guzun, R. Intracellular Energetic Units Regulate Metabolism in Cardiac Cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 2012, 52, 419–436, doi:10.1016/j.yjmcc.2011.07.015. 85. Karakikes, I.; Ameen, M.; Termglinchan, V.; Wu, J.C. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Insights into Molecular, Cellular, and Functional Phenotypes. Circulation Research 2015, 117, 80–88, doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.305365. 86. Liu, J.; Laksman, Z.; Backx, P.H. The Electrophysiological Development of Cardiomyocytes. Advanced Drug Delivery Reviews 2016, 96, 253–273, doi:10.1016/j.addr.2015.12.023. 87. Carmeliet, E. Pacemaking in Cardiac Tissue. From IK2 to a Coupled-Clock System. Physiological Reports 2019, 7, doi:10.14814/phy2.13862. 88. Veerman, C.C.; Mengarelli, I.; Lodder, E.M.; Kosmidis, G.; Bellin, M.; Zhang, M.; Dittmann, S.; Guan, K.; Wilde, A.A.M.; Schulze-Bahr, E.; et al. Switch from Fetal to Adult SCN5A Isoform in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Unmasks the Cellular Phenotype of a Conduction Disease-Causing Mutation. Journal of the American Heart Association 2017, 6, doi:10.1161/JAHA.116.005135. 89. Zhao, Z.; Lan, H.; El-Battrawy, I.; Li, X.; Buljubasic, F.; Sattler, K.; Yücel, G.; Lang, S.; Tiburcy, M.; Zimmermann, W.-H.; et al. Ion Channel Expression and Characterization in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells International 2018, 2018, doi:10.1155/2018/6067096. 90. Doss, M.X.; Di Diego, J.M.; Goodrow, R.J.; Wu, Y.; Cordeiro, J.M.; Nesterenko, V. V.; Barajas-Martínez, H.; Hu, D.; Urrutia, J.; Desai, M.; et al. Maximum Diastolic Potential of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Depends Critically on IKr. PLoS ONE 2012, 7, e40288, doi:10.1371/journal.pone.0040288. 91. Karbassi, E.; Fenix, A.; Marchiano, S.; Muraoka, N.; Nakamura, K.; Yang, X.; Murry, C.E. Cardiomyocyte Maturation: Advances in Knowledge and Implications for Regenerative Medicine. Nature Reviews Cardiology 2020, 17, 341–359, doi:10.1038/s41569-019-0331-x. 92. Bodley, A.; Liu, L.F.; Israel, M.; Seshadri, R.; Koseki, Y.; Giuliani, F.C.; Kirschenbaum, S.; Silber, R.; Potmesil, M. DNA Topoisomerase II-Mediated Interaction of Doxorubicin and Daunorubicin Congeners with DNA. Cancer Res 1989, 49, 5969–5978. 93. Nitiss, J.L. Targeting DNA Topoisomerase II in Cancer Chemotherapy. Nature Reviews Cancer 2009, 9, 338–350, doi:10.1038/nrc2607. 94. Maillet, A.; Tan, K.; Chai, X.; Sadananda, S.N.; Mehta, A.; Ooi, J.; Hayden, M.R.; Pouladi, M.A.; Ghosh, S.; Shim, W.; et al. Modeling Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity in Human Pluripotent Stem Cell Derived-Cardiomyocytes. Scientific Reports 2016, 6, doi:10.1038/srep25333. 95. Zhao, L.; Zhang, B. Doxorubicin Induces Cardiotoxicity through Upregulation of Death Receptors Mediated Apoptosis in Cardiomyocytes. Scientific Reports 2017, 7, doi:10.1038/srep44735. 96. Cui, N.; Wu, F.; Lu, W.-J.; Bai, R.; Ke, B.; Liu, T.; Li, | Lei; Lan, F.; Cui, M. Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity Is Maturation Dependent Due to the Shift from Topoisomerase IIα to IIβ in Human Stem Cell Derived Cardiomyocytes. J Cell Mol Med 2019, 00, 1–13, doi:10.1111/jcmm.14346. 97. da Rocha, A.M.; Campbell, K.; Mironov, S.; Jiang, J.; Mundada, L.; Guerrero-Serna, G.; Jalife, J.; Herron, T.J. HiPSC-CM Monolayer Maturation State Determines Drug Responsiveness in High Throughput Pro-Arrhythmia Screen. Scientific Reports 2017, 7, 13834, doi:10.1038/s41598-017-13590-y. 98. Lewandowski, J.; Rozwadowska, N.; Kolanowski, T.J.; Malcher, A.; Zimna, A.; Rugowska, A.; Fiedorowicz, K.; Łabędź, W.; Kubaszewski, Ł.; Chojnacka, K.; et al. The Impact of in Vitro Cell Culture Duration on the Maturation of Human Cardiomyocytes Derived from Induced Pluripotent Stem Cells of Myogenic Origin. Cell Transplantation 2018, 27, 1047–1067, doi:10.1177/0963689718779346. 99. Funakoshi, S.; Miki, K.; Takaki, T.; Okubo, C.; Hatani, T.; Chonabayashi, K.; Nishikawa, M.; Takei, I.; Oishi, A.; Narita, M.; et al. Enhanced Engraftment, Proliferation, and Therapeutic Potential in Heart Using Optimized Human IPSC-Derived Cardiomyocytes. Scientific reports 2016, 6, 19111, doi:10.1038/srep19111. 100. Kadota, S.; Pabon, L.; Reinecke, H.; Murry, C.E. In Vivo Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes in Neonatal and Adult Rat Hearts. Stem Cell Reports 2017, 8, 278–289, doi:10.1016/j.stemcr.2016.10.009. 101. Schwach, V.; Passier, R. Native Cardiac Environment and Its Impact on Engineering Cardiac Tissue. Biomaterials Science 2019, 7, 3566–3580, doi:10.1039/c8bm01348a. 102. Guo, Y.; Pu, W.T. Cardiomyocyte Maturation: New Phase in Development. Circulation Research 2020, 1086–1106, doi:10.1161/CIRCRESAHA.119.315862. 103. Puente, B.N.; Kimura, W.; Muralidhar, S.A.; Moon, J.; Amatruda, J.F.; Phelps, K.L.; Grinsfelder, D.; Rothermel, B.A.; Chen, R.; Garcia, J.A.; et al. The Oxygen-Rich Postnatal Environment Induces Cardiomyocyte Cell-Cycle Arrest through DNA Damage Response. Cell 2014, 157, 565–579, doi:10.1016/j.cell.2014.03.032. 104. Paradis, A.N.; Gay, M.S.; Zhang, L. Binucleation of Cardiomyocytes: The Transition from a Proliferative to a Terminally Differentiated State. Drug Discovery Today 2014, 19, 602–609, doi:10.1016/j.drudis.2013.10.019. 105. Yutzey, K.E. Cardiomyocyte Proliferation. Circulation Research 2017, 120, 627–629, doi:10.1161/CIRCRESAHA.116.310058. 106. Windmueller, R.; Leach, J.P.; Babu, A.; Zhou, S.; Morley, M.P.; Wakabayashi, A.; Petrenko, N.B.; Viatour, P.; Morrisey, E.E. Direct Comparison of Mononucleated and Binucleated Cardiomyocytes Reveals Molecular Mechanisms Underlying Distinct Proliferative Competencies. Cell Reports 2020, 30, 3105-3116.e4, doi:10.1016/j.celrep.2020.02.034. 107. Kozakowska, M.; Ciesla, M.; Stefanska, A.; Skrzypek, K.; Was, H.; Jazwa, A.; Grochot-Przeczek, A.; Kotlinowski, J.; Szymula, A.; Bartelik, A.; et al. Heme Oxygenase-1 Inhibits Myoblast Differentiation by Targeting Myomirs. Antioxidants & Redox Signaling 2012, 16, 113–127, doi:10.1089/ars.2011.3964. 108. Stepniewski, J.; Pacholczak, T.; Skrzypczyk, A.; Ciesla, M.; Szade, A.; Szade, K.; Bidanel, R.; Langrzyk, A.; Grochowski, R.; Vandermeeren, F.; et al. Heme Oxygenase-1 Affects Generation and Spontaneous Cardiac Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells. IUBMB life 2018, 70, 129–142, doi:10.1002/iub.1711. 109. Piantadosi, C.A.; Carraway, M.S.; Babiker, A.; Suliman, H.B. Heme Oxygenase-1 Regulates Cardiac Mitochondrial Biogenesis via Nrf2-Mediated Transcriptional Control of Nuclear Respiratory Factor-1. Circulation Research 2008, 103, 1232–1240, doi:10.1161/01.RES.0000338597.71702.ad. 110. Coburn, R.F.; Williams, W.J.; White, P.; Kahn, S.B. The Production of Carbon Monoxide from Hemoglobin in Vivo. The Journal of clinical investigation 1967, 46, 346–56, doi:10.1172/JCI105536. 111. Tenhunen, R.; Marver, H.S.; Schmid, R. The Enzymatic Conversion of Heme to Bilirubin by Microsomal Heme Oxygenase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1968, 61, 748–55. 112. Deramaudt, B.M.; Braunstein, S.; Remy, P.; Abraham, N.G. Gene Transfer of Human Heme Oxygenase into Coronary Endothelial Cells Potentially Promotes Angiogenesis. J Cell Biochem 1998, 68, 121–127, doi:10.1002/(sici)1097-4644(19980101)68:1<121::aid-jcb12>3.0.co;2-k. 113. Dulak, J.; Deshane, J.; Jozkowicz, A.; Agarwal, A. Heme Oxygenase-1 and Carbon Monoxide in Vascular Pathobiology: Focus on Angiogenesis. Circulation 2008, 117, 231–241, doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.107.698316. 114. Mylroie, H.; Dumont, O.; Bauer, A.; Thornton, C.C.; Mackey, J.; Calay, D.; Hamdulay, S.S.; Choo, J.R.; Boyle, J.J.; Samarel, A.M.; et al. PKCε-CREB-Nrf2 Signalling Induces HO-1 in the Vascular Endothelium and Enhances Resistance to Inflammation and Apoptosis. Cardiovascular research 2015, 106, 509–19, doi:10.1093/cvr/cvv131. 115. Yoshida, T.; Biro, P.; Cohen, T.; Müller, R.M.; Shibahara, S. Human Heme Oxygenase CDNA and Induction of Its MRNA by Hemin. European journal of biochemistry / FEBS 1988, 171, 457–61. 116. Keyse, S.M.; Applegate, L.A.; Tromvoukis, Y.; Tyrrell, R.M. Oxidant Stress Leads to Transcriptional Activation of the Human Heme Oxygenase Gene in Cultured Skin Fibroblasts. Mol Cell Biol 1990, 10, 4967–4969, doi:10.1128/mcb.10.9.4967. 117. Alam, J.; Wicks, C.; Stewart, D.; Gong, P.; Touchard, C.; Otterbein, S.; Choi, A.M.; Burow, M.E.; Tou, J. Mechanism of Heme Oxygenase-1 Gene Activation by Cadmium in MCF-7 Mammary Epithelial Cells. Role of P38 Kinase and Nrf2 Transcription Factor. The Journal of biological chemistry 2000, 275, 27694–702, doi:10.1074/jbc.M004729200. 118. Sinclair, P.; Gibbs, A.H.; Sinclair, J.F.; de Matteis, F. Formation of Cobalt Protoporphyrin in the Liver of Rats. A Mechanism for the Inhibition of Liver Haem Biosynthesis by Inorganic Cobalt. The Biochemical journal 1979, 178, 529–38, doi:doi.org/10.1042/bj1620213. 119. Jez, M.; Ciesla, M.; Stepniewski, J.; Langrzyk, A.; Muchova, L.; Vitek, L.; Jozkowicz, A.; Dulak, J. Valproic Acid Downregulates Heme Oxygenase-1 Independently of Nrf2 by Increasing Ubiquitination and Proteasomal Degradation. Biochemical and Biophysical Research Communications 2017, 485, 160–166, doi:10.1016/j.bbrc.2017.02.041. 120. Zuckerbraun, B.S.; Beek, Y.C.; Wegiel, B.; Billiar, T.R.; Czsimadia, E.; Rao, J.; Shimoda, L.; Ifedigbo, E.; Kanno, S.; Otterbein, L.E. Carbon Monoxide Reverses Established Pulmonary Hypertension. Journal of Experimental Medicine 2006, 203, 2109–2119, doi:10.1084/jem.20052267. 121. Lin, C.Y.; Peng, C.Y.; Huang, T.T.; Wu, M.L.; Lai, Y.L.; Peng, D.H.; Chen, P.F.; Chen, H.F.; Yen, B.L.; Wu, K.K.; et al. Exacerbation of Oxidative Stress-Induced Cell Death and Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells Lacking Heme Oxygenase-1. Stem Cells and Development 2012, 21, 1675–1687, doi:10.1089/scd.2011.0304. 122. Lai, Y.L.; Lin, C.Y.; Jiang, W.C.; Ho, Y.C.; Chen, C.H.; Yet, S.F. Loss of Heme Oxygenase-1 Accelerates Mesodermal Gene Expressions during Embryoid Body Development from Mouse Embryonic Stem Cells. Redox Biology 2018, 15, 51–61, doi:10.1016/j.redox.2017.11.019. 123. Yachie, A.; Niida, Y.; Wada, T.; Igarashi, N.; Kaneda, H.; Toma, T.; Ohta, K.; Kasahara, Y.; Koizumi, S. Oxidative Stress Causes Enhanced Endothelial Cell Injury in Human Heme Oxygenase-1 Deficiency. J Clin Invest 1999, 103, 129–135, doi:10.1172/JCI4165. 124. Radhakrishnan, N.; Yadav, S.P.; Sachdeva, A.; Pruthi, P.K.; Sawhney, S.; Piplani, T.; Wada, T.; Yachie, A. Human Heme Oxygenase-1 Deficiency Presenting with Hemolysis, Nephritis, and Asplenia. J Pediatr Hematol Oncol 2011, 33, 74–78, doi:10.1097/MPH.0b013e3181fd2aae. 125. Tahghighi, F.; Parvaneh, N.; Ziaee, V. Post-Mortem Diagnosis of Heme Oxygenase-1 Deficiency by Whole Exome Sequencing in an Iranian Child. Int J Mol Cell Med 2019, 8, doi:10.22088/IJMCM.BUMS.8.4.300. 126. Zhuang, T.; Zhang, M.; Zhang, H.; Dennery, P.A.; Lin, Q.S. Disrupted Postnatal Lung Development in Heme Oxygenase-1 Deficient Mice. Respir Res 2010, 11, 142, doi:10.1186/1465-9921-11-142. 127. Kreiser, D.; Nguyen, X.; Wong, R.; Seidman, D.; Stevenson, D.; Quan, S.; Abraham, N.; Dennery, P.A. Heme Oxygenase-1 Modulates Fetal Growth in the Rat. Laboratory Investigation 2002, 82, 687–692, doi:10.1097/01.LAB.0000017167.26718.F2. 128. Watanabe, S.; Akagi, R.; Mori, M.; Tsuchiya, T.; Sassa, S. Marked Developmental Changes in Heme Oxygenase-1 (HO-1) Expression in the Mouse Placenta: Correlation between HO-1 Expression and Placental Development. Placenta 2004, 25, 387–395, doi:10.1016/j.placenta.2003.10.012. 129. Yamada, N.; Yamaya, M.; Okinaga, S.; Nakayama, K.; Sekizawa, K.; Shibahara, S.; Sasaki, H. Microsatellite Polymorphism in the Heme Oxygenase-1 Gene Promoter Is Associated with Susceptibility to Emphysema. Am J Hum Genet 2000, 66, 187–195, doi:10.1086/302729. 130. Taha, H.; Skrzypek, K.; Guevara, I.; Nigisch, A.; Mustafa, S.; Grochot-Przeczek, A.; Ferdek, P.; Was, H.; Kotlinowski, J.; Kozakowska, M.; et al. Role of Heme Oxygenase-1 in Human Endothelial Cells – Lesson from the Promoter Allelic Variants. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010, 30, 1634–1641, doi:10.1161/ATVBAHA.110.207316. 131. Leaf, D.E.; Body, S.C.; Muehlschlegel, J.D.; McMahon, G.M.; Lichtner, P.; Collard, C.D.; Shernan, S.K.; Fox, A.A.; Waikar, S.S. Length Polymorphisms in Heme Oxygenase-1 and AKI after Cardiac Surgery. J Am Soc Nephrol 2016, 27, 3291–3297, doi:10.1681/ASN.2016010038. 132. Li, C.; Hossieny, P.; Wu, B.J.; Qawasmeh, A.; Beck, K.; Stocker, R. Pharmacologic Induction of Heme Oxygenase-1. Antioxid Redox Signal 2007, 9, 2227–2239, doi:10.1089/ars.2007.1783. 133. Williams, A.J.; Tortella, F.C.; Lu, X.M.; Moreton, J.E.; Hartings, J.A. Antiepileptic Drug Treatment of Nonconvulsive Seizures Induced by Experimental Focal Brain Ischemia. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 2004, 311, 220–7, doi:10.1124/jpet.104.069146. 134. Cipriani, A.; Reid, K.; Young, A.H.; Macritchie, K.; Geddes, J. Valproic Acid, Valproate and Divalproex in the Maintenance Treatment of Bipolar Disorder. Cochrane Database Syst Rev 2013, CD003196, doi:10.1002/14651858.CD003196.pub2. 135. Suliman, H.B.; Zobi, F.; Piantadosi, C.A. Heme Oxygenase-1/Carbon Monoxide System and Embryonic Stem Cell Differentiation and Maturation into Cardiomyocytes. Antioxidants & Redox Signaling 2016, 24, 345–360, doi:10.1089/ars.2015.6342. 136. Frisch, S.M.; Screaton, R.A. Anoikis Mechanisms. Current Opinion in Cell Biology 2001, 13, 555–562, doi:10.1016/S0955-0674(00)00251-9. 137. Watanabe, K.; Ueno, M.; Kamiya, D.; Nishiyama, A.; Matsumura, M.; Wataya, T.; Takahashi, J.B.; Nishikawa, S.; Nishikawa, S.I.; Muguruma, K.; et al. A ROCK Inhibitor Permits Survival of Dissociated Human Embryonic Stem Cells. Nature Biotechnology 2007, 25, 681–686, doi:10.1038/nbt1310. 138. Riento, K.; Ridley, A.J. Rocks: Multifunctional Kinases in Cell Behaviour. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003, 4, 446–456, doi:10.1038/nrm1128. 139. Davies, S.P.; Reddy, H.; Caivano, M.; Cohen, P. Specificity and Mechanism of Action of Some Commonly Used Protein Kinase Inhibitors. Biochemical Journal 2000, 351, 95–105, doi:10.1042/0264-6021:3510095. 140. Chen, G.; Gulbranson, D.R.; Hou, Z.; Bolin, J.M.; Probasco, M.D.; Smuga-otto, K.; Howden, S.E.; Nicole, R.; Propson, N.E.; Wagner, R.; et al. Chemically Defined Conditions for Human IPSC Derivation and Culture. Nat Methods. 2011, 8, 424–429, doi:10.1038/nmeth.1593.Chemically. 141. Li, R.; Liang, J.; Ni, S.; Zhou, T.; Qing, X.; Li, H.; He, W.; Chen, J.; Li, F.; Zhuang, Q.; et al. A Mesenchymal-to-Epithelial Transition Initiates and Is Required for the Nuclear Reprogramming of Mouse Fibroblasts. Cell stem cell 2010, 7, 51–63, doi:10.1016/j.stem.2010.04.014. 142. Lippmann, E.S.; Estevez-Silva, M.C.; Ashton, R.S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells 2014, 32, 1032–1042, doi:10.1002/stem.1622. 143. Smith, K.P.; Luong, M.X.; Stein, G.S. Pluripotency: Toward a Gold Standard for Human ES and IPS Cells. Journal of Cellular Physiology 2009, 220, 21–29, doi:10.1002/jcp.21681. 144. Lin, Y. Embryoid Body Formation from Human Pluripotent Stem Cells in Chemically Defined E8 Media. StemBook 2014, doi:10.3824/stembook.1.98.1. 145. Szulc, J.; Wiznerowicz, M.; Sauvain, M.O.; Trono, D.; Aebischer, P. A Versatile Tool for Conditional Gene Expression and Knockdown. Nature Methods 2006, 3, 109–116, doi:10.1038/nmeth846. 146. Burstein, D.; Harrington, L.B.; Strutt, S.C.; Probst, A.J.; Anantharaman, K.; Thomas, B.C.; Doudna, J.A.; Banfield, J.F. New CRISPR-Cas Systems from Uncultivated Microbes. Nature 2017, 542, 237–241, doi:10.1038/nature21059. 147. Czarnek, M.; Bereta, J. SmartFlares Fail to Reflect Their Target Transcripts Levels. Scientific Reports 2017, 7, 1–10, doi:10.1038/s41598-017-11067-6. 148. Chomczynski, P.; Sacchi, N. Single-Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extrac1. Chomczynski P, Sacchi N (1987) Single-Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction. Anal Biochem 162:156–9. Doi: 10. Anal. Biochem. 1987, 162, 156–9, doi:10.1006/abio.1987.9999. 149. Danecek, P.; McCarthy, S.A.; Consortium, H.S.; Durbin, R. A Method for Checking Genomic Integrity in Cultured Cell Lines from Snp Genotyping Data. PLoS ONE 2016, 11, 1–13, doi:10.1371/journal.pone.0155014. 150. Huc, T.; Sapierzyński, R.; Rygier, J.; Pieńkowska-Grela, B. Diagnostyka Cytogenetyczna - Kliniczne Zastosowanie w Medycynie Weterynaryjnej. Życie Weterynaryjne 2015, 90, 652–656. 151. Janosz, E. Optimization of Human Induced Pluripotent Stem Cells Generation and Differentiation into Cardiomyocytes, Jagiellonian University, 2015. 152. Sommer, C.A.; Stadtfeld, M.; Murphy, G.J.; Hochedlinger, K.; Kotton, D.N.; Mostoslavsky, G. Induced Pluripotent Stem Cell Generation Using a Single Lentiviral Stem Cell Cassette. Stem Cells 2009, 27, 543–549, doi:10.1634/stemcells.2008-1075. 153. Yoon, C.-H.; Kim, T.-W.; Koh, S.-J.; Choi, Y.-E.; Hur, J.; Kwon, Y.-W.; Cho, H.-J.; Kim, H.-S. Gata6 in Pluripotent Stem Cells Enhance the Potential to Differentiate into Cardiomyocytes. BMB reports 2018, 51, 85–91, doi:10.5483/BMBRep.2018.51.2.176. 154. Bauer, A.; Mylroie, H.; Thornton, C.C.; Calay, D.; Birdsey, G.M.; Kiprianos, A.P.; Wilson, G.K.; Soares, M.P.; Yin, X.; Mayr, M.; et al. Identification of Cyclins A1, E1 and Vimentin as Downstream Targets of Heme Oxygenase-1 in Vascular Endothelial Growth Factor-Mediated Angiogenesis. Scientific Reports 2016, 6, 1–16, doi:10.1038/srep29417. 155. Camors, E.; Monceau, V.; Charlemagne, D. Annexins and Ca2+ Handling in the Heart. Cardiovascular Research 2005, 65, 793–802, doi:10.1016/j.cardiores.2004.11.010. 156. Marroni, F.; Pfeufer, A.; Aulchenko, Y.S.; Franklin, C.S.; Isaacs, A.; Pichler, I.; Wild, S.H.; Oostra, B.A.; Wright, A.F.; Campbell, H.; et al. A Genome-Wide Association Scan of RR and QT Interval Duration in 3 European Genetically Isolated Populations: The EUROSPAN Project. Circulation: Cardiovascular Genetics 2009, 2, 322–328, doi:10.1161/CIRCGENETICS.108.833806. 157. Schneider, M.; Kostin, S.; Strøm, C.C.; Aplin, M.; Lyngbæk, S.; Theilade, J.; Grigorian, M.; Andersen, C.B.; Lukanidin, E.; Lerche Hansen, J.; et al. S100A4 Is Upregulated in Injured Myocardium and Promotes Growth and Survival of Cardiac Myocytes. Cardiovascular Research 2007, 75, 40–50, doi:10.1016/j.cardiores.2007.03.027. 158. Doroudgar, S.; Quijada, P.; Konstandin, M.; Ilves, K.; Broughton, K.; Khalafalla, F.G.; Casillas, A.; Nguyen, K.; Gude, N.; Toko, H.; et al. S100A4 Protects the Myocardium against Ischemic Stress. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 2016, 100, 54–63, doi:10.1016/j.yjmcc.2016.10.001. 159. Liang, S.; Wang, Q.; Zhang, W.; Zhang, H.; Tan, S.; Ahmed, A.; Gu, Y. Carbon Monoxide Inhibits Inward Rectifier Potassium Channels in Cardiomyocytes. Nature Communications 2014, 5, 1–7, doi:10.1038/ncomms5676. 160. Tomczyk, M.; Kraszewska, I.; Szade, K.; Bukowska-strakova, K.; Meloni, M.; Jozkowicz, A. Splenic Ly6C Hi Monocytes Contribute to Adverse Late Post-Ischemic Left Ventricular Remodeling in Heme Oxygenase-1 Deficient Mice. Basic Research in Cardiology 2017, 112, 1–19, doi:10.1007/s00395-017-0629-y. 161. Sommer, C.A.; Sommer, A.G.; Longmire, T.A.; Christodoulou, C.; Thomas, D.D.; Gostissa, M.; Alt, F.W.; Murphy, G.J.; Kotton, D.N.; Mostoslavsky, G. Excision of Reprogramming Transgenes Improves the Differentiation Potential of IPS Cells Generated with a Single Excisable Vector. Stem Cells 2010, 28, 64–74, doi:10.1002/stem.255. 162. Hotta, A.; Ellis, J. Retroviral Vector Silencing during IPS Cell Induction: An Epigenetic Beacon That Signals Distinct Pluripotent States. Journal of Cellular Biochemistry 2008, 105, 940–948. 163. Cavazza, A.; Moiani, A.; Mavilio, F. Mechanisms of Retroviral Integration and Mutagenesis. Human Gene Therapy 2013, 24, 119–131, doi:10.1089/hum.2012.203. 164. Nakanishi, M.; Otsu, M. Development of Sendai Virus Vectors and Their Potential Applications in Gene Therapy and Regenerative Medicine. Curr Gene Ther 2012, 12, 410–416, doi:10.2174/156652312802762518. 165. Fusaki, N.; Ban, H.; Nishiyama, A.; Saeki, K.; Hasegawa, M. Efficient Induction of Transgene-Free Human Pluripotent Stem Cells Using a Vector Based on Sendai Virus, an RNA Virus That Does Not Integrate into the Host Genome. Proceedings of the Japan Academy Series B: Physical and Biological Sciences 2009, 85, 348–362, doi:10.2183/pjab.85.348. 166. Kachamakova-trojanowska, N.; Stepniewski, J.; Dulak, J. Mutation in HNF1A as a Model of Maturity-Onset Diabetes of the Young. Cells 2019, 8, 1–18, doi:10.3390/cells8111440. 167. Silva, J.; Nichols, J.; Theunissen, T.W.; Guo, G.; van Oosten, A.L.; Barrandon, O.; Wray, J.; Yamanaka, S.; Chambers, I.; Smith, A. Nanog Is the Gateway to the Pluripotent Ground State. Cell 2009, 138, 722–737, doi:10.1016/j.cell.2009.07.039. 168. Niwa, H.; Miyazaki, J.I.; Smith, A.G. Quantitative Expression of Oct-3/4 Defines Differentiation, Dedifferentiation or Self-Renewal of ES Cells. Nature Genetics 2000, 24, 372–376, doi:10.1038/74199. 169. Sivasubramaniyan, K.; Harichandan, A.; Schilbach, K.; Mack, A.F.; Bedke, J.; Stenzl, A.; Kanz, L.; Niederfellner, G.; Bühring, H.-J. Cell Biology Expression of Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Defines Spontaneous Loss of Epithelial Phenotype in Human Solid Tumor Cells. Glycobiology 2015, 25, 902–917, doi:10.1093/glycob/cwv032. 170. Schopperle, W.M.; DeWolf, W.C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS 2007, 25, 723–730, doi:10.1634/stemcells.2005-0597. 171. Xie, C.; Tammi, M.T. CNV-Seq, a New Method to Detect Copy Number Variation Using High-Throughput Sequencing. BMC Bioinformatics 2009, 10, 80, doi:10.1186/1471-2105-10-80. 172. Martins‐Taylor, K.; Xu, R.-H. Concise Review: Genomic Stability of Human Induced Pluripotent Stem Cells. STEM CELLS 2012, 30, 22–27, doi:https://doi.org/10.1002/stem.705. 173. Parmacek, M.S.; Epstein, J.A. An Epigenetic Roadmap for Cardiomyocyte Differentiation. Circulation Research 2013, 112, 881–883, doi:10.1161/CIRCRESAHA.113.301134. 174. Birket, M.J.; Ribeiro, M.C.; Verkerk, A.O.; Ward, D.; Leitoguinho, A.R.; den Hartogh, S.C.; Orlova, V. V; Devalla, H.D.; Schwach, V.; Bellin, M.; et al. Expansion and Patterning of Cardiovascular Progenitors Derived from Human Pluripotent Stem Cells. Nature Biotechnology 2015, 1–12, doi:10.1038/nbt.3271. 175. Schwach, V.; Gomes Fernandes, M.; Maas, S.; Gerhardt, S.; Tsonaka, R.; Van Der Weerd, L.; Passier, R.; Mummery, C.L.; Birket, M.J.; Salvatori, D.C.F. Expandable Human Cardiovascular Progenitors from Stem Cells for Regenerating Mouse Heart after Myocardial Infarction. Cardiovascular Research 2020, 116, 545–553, doi:10.1093/cvr/cvz181. 176. Brewer, G.J. Serum‐free B27/Neurobasal Medium Supports Differentiated Growth of Neurons from the Striatum, Substantia Nigra, Septum, Cerebral Cortex, Cerebellum, and Dentate Gyrus. Journal of Neuroscience Research 1995, 42, 674–683, doi:10.1002/jnr.490420510. 177. Altomare, C.; Pianezzi, E.; Cervio, E.; Bolis, S.; Biemmi, V.; Benzoni, P.; Camici, G.G.; Moccetti, T.; Barile, L.; Vassalli, G. Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes from Cardiac Progenitor Cells: Effects of Selective Ion Channel Blockade. Europace : European pacing, arrhythmias, and cardiac electrophysiology : journal of the working groups on cardiac pacing, arrhythmias, and cardiac cellular electrophysiology of the European Society of Cardiology 2016, 18, iv67–iv76, doi:10.1093/europace/euw352. 178. Chen, Y.H.; Pruett-Miller, S.M. Improving Single-Cell Cloning Workflow for Gene Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Research 2018, 31, 186–192, doi:10.1016/j.scr.2018.08.003. 179. Grynberg, A.; Demaison, L. Fatty Acid Oxidation in the Heart. J Cardiovasc Pharmacol 1996, 28 Suppl 1, S11-17, doi:10.1097/00005344-199600003-00003. 180. Mills, R.J.; Titmarsh, D.M.; Koenig, X.; Parker, B.L.; Ryall, J.G.; Quaife-Ryan, G.A.; Voges, H.K.; Hodson, M.P.; Ferguson, C.; Drowley, L.; et al. Functional Screening in Human Cardiac Organoids Reveals a Metabolic Mechanism for Cardiomyocyte Cell Cycle Arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences 2017, 201707316, doi:10.1073/pnas.1707316114. 181. Ciesla, M.; Marona, P.; Kozakowska, M.; Jez, M.; Seczynska, M.; Loboda, A.; Bukowska-Strakova, K.; Szade, A.; Walawender, M.; Kusior, M.; et al. Heme Oxygenase-1 Controls an HDAC4-MIR-206 Pathway of Oxidative Stress in Rhabdomyosarcoma. Cancer Research 2016, 76, 5707–5718, doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-1883. 182. Lin, Q.; Weis, S.; Yang, G.; Weng, Y.H.; Helston, R.; Rish, K.; Smith, A.; Bordner, J.; Polte, T.; Gaunitz, F.; et al. Heme Oxygenase-1 Protein Localizes to the Nucleus and Activates Transcription Factors Important in Oxidative Stress. Journal of Biological Chemistry 2007, 282, 20621–20633, doi:10.1074/jbc.M607954200. 183. Kaizu, T.; Tamaki, T.; Tanaka, M.; Uchida, Y.; Tsuchihashi, S.I.; Kawamura, A.; Kakita, A. Preconditioning with Tin-Protoporphyrin IX Attenuates Ischemia/Reperfusion Injury in the Rat Kidney. Kidney International 2003, 63, 1393–1403, doi:10.1046/j.1523-1755.2003.00882.x. 184. Wei, H.; Cong, X. The Effect of Reactive Oxygen Species on Cardiomyocyte Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Free Radical Research 2018, 52, 150–158, doi:10.1080/10715762.2017.1420184. 185. Kaese, S.; Verheule, S. Cardiac Electrophysiology in Mice: A Matter of Size. Frontiers in physiology 2012, 3, 345, doi:10.3389/fphys.2012.00345. 186. Wilkinson, W.J.; Kemp, P.J. Carbon Monoxide: An Emerging Regulator of Ion Channels. Journal of Physiology 2011, 589, 3055–3062, doi:10.1113/jphysiol.2011.206706. 187. Garg, P.; Garg, V.; Shrestha, R.; Sanguinetti, M.C.; Kamp, T.J.; Wu, J.C. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes as Models for Cardiac Channelopathies: A Primer for Non-Electrophysiologists. Circulation Research 2018, 123, 224–243, doi:10.1161/CIRCRESAHA.118.311209. 188. Józkowicz, A.; Dulak, J. Effects of Protoporphyrins on Production of Nitric Oxide and Expression of Vascular Endothelial Growth Factor in Vascular Smooth Muscle Cells and Macrophages. Acta Biochimica Polonica 2003, 50, 69–79, doi:10.18388/abp.2003_3715. 189. Blumenthal, S.B.; Kiemer, A.K.; Tiegs, G.; Seyfried, S.; Höltje, M.; Brandt, B.; Höltje, H.; Zahler, S.; Vollmar, A.M. Metalloporphyrins Inactivate Caspase‐3 and ‐8. The FASEB Journal 2005, 19, 1272–1279, doi:10.1096/fj.04-3259com. 190. Lin, H.-Y.; Tsai, C.-H.; Lin, C.; Yeh, W.-L.; Tsai, C.-F.; Chang, P.-C.; Wu, L.-H.; Lu, D.-Y. Cobalt Protoporphyrin Upregulates Cyclooxygenase-2 Expression Through a Heme Oxygenase-Independent Mechanism. Molecular Neurobiology 2016, 53, 4497–4508, doi:10.1007/s12035-015-9376-y. 191. Birket, M.J.; Ribeiro, M.C.; Kosmidis, G.; Ward, D.; Leitoguinho, A.R.; van de Pol, V.; Dambrot, C.; Devalla, H.D.; Davis, R.P.; Mastroberardino, P.G.; et al. Contractile Defect Caused by Mutation in MYBPC3 Revealed under Conditions Optimized for Human PSC-Cardiomyocyte Function. Cell Reports 2015, 13, 733–745, doi:10.1016/j.celrep.2015.09.025. 192. Lemoine, M.D.; Mannhardt, I.; Breckwoldt, K.; Prondzynski, M.; Flenner, F.; Ulmer, B.; Hirt, M.N.; Neuber, C.; Horváth, A.; Kloth, B.; et al. Human IPSC-Derived Cardiomyocytes Cultured in 3D Engineered Heart Tissue Show Physiological Upstroke Velocity and Sodium Current Density. Scientific Reports 2017, 7, 1–11, doi:10.1038/s41598-017-05600-w. 193. Bochaton-Piallat, M.-L.; Gabbiani, G.; Hinz, B. The Myofibroblast in Wound Healing and Fibrosis: Answered and Unanswered Questions. F1000Res 2016, 5, doi:10.12688/f1000research.8190.1. 194. Patteson, A.E.; Pogoda, K.; Byfield, F.J.; Mandal, K.; Ostrowska‐Podhorodecka, Z.; Charrier, E.E.; Galie, P.A.; Deptuła, P.; Bucki, R.; McCulloch, C.A.; et al. Loss of Vimentin Enhances Cell Motility through Small Confining Spaces. Small 2019, 15, 1903180–1903180, doi:10.1002/smll.201903180. 195. Wang, K.C.W.; Brooks, D.A.; Thornburg, K.L.; Morrison, J.L. Activation of IGF-2R Stimulates Cardiomyocyte Hypertrophy in the Late Gestation Sheep Fetus. Journal of Physiology 2012, 590, 5425–5437, doi:10.1113/jphysiol.2012.238410. 196. Silverman, H.S.; Pfeifer, M.P. Relation between Use of Antiinflammatory Agents and Left Ventricular Free Wall Rupture during Acute Myocardial Infarction. American Journal of Cardiology 1987, 59, 363–364, doi:10.1016/0002-9149(87)90817-4. 197. Huang, S.; Frangogiannis, N.G. Anti‐inflammatory Therapies in Myocardial Infarction: Failures, Hopes and Challenges. Br J Pharmacol 2018, 175, 1377–1400, doi:10.1111/bph.14155.