Cíala jądrowe w oogenezie owadów Mariusz Jaglarz Ciała jądrowe w oogenezie owadów Analiza cytochemiczna i immunocytochemiczna Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego Rozprawy Habilitacyjne Uniwersytetu Jagiellońskiego Nr 367 Publikacja dofinansowana przez Uniwersytet Jagielloński ze środków Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi oraz Instytutu Zoologii RECENZENT Dr hab. Teresa Szklarzewicz REDAKCJA I KOREKTA Jerzy Hrycyk PROJEKT OKŁADKI Marcin Bruchnalski Na okładce pęcherzyk zarodkowy z ciałami Cajala w oocycie biegacza fioletowego (Carabus violaceus). Mikroskop interferencyjny (optyka Nomarskiego). Fot. M. Jaglarz SKŁAD I ŁAMANIE Wojciech Wojewoda © Copyright by Mariusz Jaglarz & Wydawnictwo Uniwefsytetu Jagiellońskiego Wydanie 1, Kraków 2006 All rights reserved ISBN 83-233-2174-4 ISSN 0239-782X www. wuj. pl Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego Redakcja: ul. Michałowskiego 9/2, 31-126 Kraków tel. 012-631-18-81, 012-631-18-82, fax 012-631-18-83 Dystrybucja: ul. Wrocławska 53, 30-011 Kraków tel. 012-631 -01 -97. tel. /fax 012-631-01-98 tel. kom. 0506-006-674, e-mail: wydaw@if. uj. edu. pl Konto: BPH PBK SA 1V/O Kraków, nr 62 1060 0076 0000 3200 0047 8769 Spis treści 1. WSTĘP .......................................................................... 9 1. 1. Jądro komórki i ciałajądrowe............................................... 9 1. 1. 1. Male jądrowe RNA................................................... 10 1. 1. 2. Organizacja jądra oocytu .......................................... 11 1. 1. 3. Budowa molekularna i funkcje ciała Cąjala.......................... 13 1. 1. 4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA.... 15 1. 2. Pęcherzyk zarodkowy owadów ............................................... 17 1. 2. 1. Jądra dodatkowe ................................................... 20 1. 2. 2. Ciała jądrowe ..................................................... 21 1. 3. Cel badań................................................................. 21 2. MATERIAŁY I METODY............................................................. 23 2. 1. Owady .................................................................... 23 2. 2. Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym i transmisyjnym mikroskopie elektronowym.......................................................... 23 2. 3. Przygotowanie materiału do analizy histochemicznej ....................... 24 2. 3. 1. Wykrywanie kwasów nukleinowych (DNA, RNA) metodą fluorescencyjną .. 24 2. 3. 2. Wykrywanie białek srebrochłonnych metodą Ag-NOR.................... 24 2. 4. Przygotowanie materiału do analizy immunocytochemicznej................... 25 2. 5. Hybrydyzacja in situ na poziomic ultrastrukturalnym....................... 27 3. WYNIKI ........................................................................ 29 3. 1. Jajniki i owariole ....................................................... 29 3. 2. Pęcherzyk zarodkowy....................................................... 30 3. 3. Ciałajądrowe w pęcherzykach zarodkowych chrząszczy (Coleóptera) .......... 31 3. 3. 1. Charakterystyka ciał jądrowych w oocytach biegaczowatych (Carabidae). 31 3. 3. 1. 1. Analiza cytochcmiczna i immunocytochemiczna ............... 32 3. 3. 2. Ciałajądrowe i powstawanie kapsuły kariosomu w pęcherzyku zarodkowym kwieciaka jablkowca (Anthonomus pomorum) ............................... 33 3. 3. 2. 1. Analiza cytochemiczna i immunocytochemiczna ............... 34 3. 4. Ciałajądrowe w pęcherzyku zarodkowym Phthiraptera......................... 35 3. 4. 1. Pęcherzyk zarodkowy wszy świńskiej (Haematopinus suis) ............ 35 3. 4. 1. 1. Analiza cytochemiczna i immunocytochemiczna ............... 36 3. 4. 2. Pęcherzyk zarodkowy wszola gołębiego (Columbicola columbae) ....... 36 3. 5. Inkluzje w jądrach dodatkowych osy 1'espula germánica..................... 37 3. 5. 1. Ciała Cąjala w jądrach dodatkowych ................................ 37 4. DYSKUSJA ...................................................................... 39 4. 1. Ciałajądrowe w pęcherzyku zarodkowym Carabidae............................ 39 4. 2. Ciałajądrowe i kapsuła kariosomu w pęcherzyku zarodkowym Anthonomuspomorum.... 41 4. 3. Ciałajądrowe w pęcherzyku zarodkowym Phthiraptera......................... 43 6 4. 3. 1. Osłonka jądrowa pęcherzyków zarodkowych Phthiraptera i jej związek zjądrami dodatkowymi...................................... 45 4. 4. Ciała Cajala w jądrach dodatkowych blonkówek..................... 45 4. 4. 1. Białko SMN i jego rola w metabolizmie komórki ............. 46 4. 4. 2. Rola jąder dodatkowych i ciał Cajala w oocytach blonkówek . 47 5. PODSUMOWANIE.......................................................... 49 5. 1. Rola ciał Cajala w pęcherzyku zarodkowym.......................... 49 6. PODZIĘKOWANIA......................................................... 51 7. PIŚMIENNICTWO......................................................... 55 8. STRESZCZENIE.......................................................... 75 9. SUMMARY............................................................... 77 10. OBJAŚNIENIA DO RYCIN................................................. 79 11. FIGURĘ LEGENDS ...................................................... 81 12. OBJAŚNIENIA DO TABLIC................................................ 83 13. PLATĘ LEGENDS ....................................................... 91 Monografia ta jest rozprawą habilitacyjną powstałą na podstawie wymienionych niżej publikacji i danych niepublikowanych Jaglarz M. K. (2001) Nuclear bodies in the oocyte nucleus of ground beetles are enriched in snRNPs. Tissue and Cell 33: 395-401. Świątek P., Jaglarz M. K. (2004) snRNPs are present in the karyosome capsule in the weevil germinal vesicle. Tissue and Cell 36: 253-262. Żelazowska M., Jaglarz M. K. (2004) Oogenesis in phthirapterans (Insecta: Phthirapte-ra). I. Morphological and histochemical characterization of the oocyte nucleus and its inclusions. Arthropod Structure and Development 33: 161-172. Jaglarz M. K., Biliński S. M., Kloc M. (2005) Assembly and breakdown of Cajal bodies in accessory nuclei of Hymenoptera. Differentiation 73: 99-108. Prace te były finansowane z grantów Komitetu Badań Naukowych: BW/IZ/16/95 i 6 P04C 110 21. 1. WSTĘP 1.1. Jądro komórki i ciała jądrowe Badania ostatnich lat ujawniły, że jądro komórki w okresie interfazy ma wysoce uporządkowaną organizację przestrzenną, porównywalną pod względem komplikacji z organizacją cytoplazmy. Ta złożona wewnętrzna architektura jądra jest odbiciem nierównomiernego rozmieszczenia czynników, które zaangażowane są w określone procesy biochemiczne, takie jak np. replikacja, transkrypcja, modyfikacja produktów genów (zob. artykuły przeglądowe: Spector, 1996, 2001, 2003; Berezney i wsp., 2000; Lewis i Tollervey, 2000; Stein i wsp., 2003; Fakan, 2004; Zimber i wsp., 2004; Foster i Bridger, 2005). Dzięki zastosowaniu nowoczesnych technik mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej oraz zaawansowanych metod biologii molekularnej wykazano, że w jądrze interfazowym występuje co najmniej kilka wyraźnie odrębnych morfologicznie i różniących się składem molekularnym struktur, zwanych organellami jądrowymi (nukleoplazmatycznymi), domenami lub ciałami jądrowymi (zob. artykuły przeglądowe: Brasch i Ochs, 1992; Spector, 1993, 1996, 2001; Driel i wsp., 1995; Roth, 1995; Adamska i Biliński, 1997; Lamond i Earnshaw, 1998; Matera, 1999; Lewis i Tollervey, 2000; Dundr i Misteli, 2001; Chubb i Bickmore, 2003; Lamond i Sleeman, 2003; Zimber i wsp., 2004; Foster i Bridger, 2005; Handwerger i Gall, 2006). Organelle jądrowe, w przeciwieństwie do większości organelli cytoplazmatycznych, nie są otoczone błoną i stanowią duże kompleksy zbudowane z rybonukleoprotein i (lub) białek. Domeny te uczestniczą w różnych aspektach metabolizmu jądra, a w szczególności w syntezie, modyfikacji i transporcie RN A (zob. artykuły przeglądowe: Brasch i Ochs, 1992; Spector, 1993, 2001; Driel i wsp., 1995; Roth, 1995; Adamska i Biliński, 1997; Lamond i Earnshaw, 1998; Matera, 1999; Lewis i Tollervey, 2000; Dundr i Misteli, 2001; Misteli, 2001, 2005; Chubb i Bickmore, 2003; Lamond i Sleeman, 2003; Stein i wsp., 2003; Zimber i wsp., 2004; Handwerger i Gall, 2006). Podział jądra na odrębne strukturalnie i funkcjonalnie obszary (kompartmenty) ma istotny wpływ na jego funkcjonowanie. Podział ten powoduje m.in., że rybonukleo-proteiny i białka jądrowe muszą być transportowane, a następnie lokalizowane w ściśle określonych kompartmentach, aby mogły w prawidłowy sposób wypełniać swe specyficzne funkcje (zob. artykuły przeglądowe: Carmo-Fonseca, 2002b; Misteli, 2001; Beimont, 2003; Chubb i Bickmore, 2003; Jackson, 2003; Spector, 2003; Stein i wsp., 2003; Bubulya i Spector, 2004; Fakan, 2004). Tak więc, transport wewnątrzjądrowy wraz z transportem jądrowo-cytoplazmatycznym, a także obróbka i precyzyjna kon 10 trola rozmieszczenia cząsteczek RNA i białek w jądrze stanowią ważny element regulacji ekspresji genów. 1.1.1. Małe jądrowe RNA W każdym jądrze komórkowym występuje znaczna ilość różnych RNA, wśród których odrębną grupę tworzą małe jądrowe RNA, zwane w skrócie snRNA (ang. smali nuclear RNAs). Cząsteczki snRNA zbudowane są z 60-450 nukleotydów i z reguły występują w kompleksach z określonymi białkami, tworząc cząstki rybonukleoprote-inowe, zwane snRNP (ang. smali nuclear Ribonucleoprotein Particles) (Yu i wsp., 1999). Ze względu na pełnione funkcje i miejsce występowania na terenie jądra, snRNA podzielono na trzy główne klasy: U snRNA, snoRNA i scaRNA. U snRNA (np. Ul, U2, U4, U5, U6) to wysoce konserwatywne, bogate w nukleotydy urydylowe cząsteczki RNA, występujące głównie w zespołach ziaren międzychromatynowych (tzw. speckles), włóknach okołochromatynowych oraz w ciałach Cajala (zob. rozdz. 1.1.3. Budowa molekularna i funkcje ciała Cajala). Biorą one udział przede wszystkim w dojrzewaniu (składaniu, ang. splicing) pre-mRNA (zob. artykuły przeglądowe: Will i Luhrmann, 2001; Zhou i wsp., 2002; Lamond i Spector, 2003). Drugą klasę snRNA tworzą małe jąderkowe RNA, w skrócie snoRNA (ang. smali nucleolar RNAs) występujące przede wszystkim na terenie jąderka, gdzie uczestniczą w modyfikowaniu rybosomowych RNA (Kiss-Laszlo i wsp., 1996; Smith i Steitz, 1997; Tollervey i Kiss, 1997; Weinstein i Steitz, 1999; Jady i Kiss, 2001; Kiss, 2001, 2002; Filipowicz i Pogacic, 2002; Tems i Tems, 2002; Meier, 2005). Trzecią klasę snRNA stanowią, niedawno odkryte, małe RNA swoiste dla ciał Cajala, w skrócie scaRNA (ang. smali Cajal body-specific RNAs). Są one zaangażowane w potranskryp-cyjną modyfikację ściśle określonych nukleotydów w cząsteczkach Ul, U2, U4 i U5 snRNA (Darzacą i wsp., 2002; Kiss i wsp., 2002; Jady i wsp., 2003; Richard i wsp., 2003; zob. rozdz. 1.1.3. Budowa molekularna i funkcje ciała Cajala). W komórkach zwierząt większość snoRNA i scaRNA kodowana jest przez sekwencje leżące wewnątrz intronów genów kodujących mRNA (Kiss i Filipowicz, 1995; Filipowicz i Pogacic, 2002; Hirose i wsp., 2003; Tycowski i wsp., 2004). Te dwie klasy snRNA cechuje też duże podobieństwo w budowie molekularnej, m.in. zawierają kasety C/D i H/ACA, do których przyłączane są specyficzne białka regulujące aktywność tych RNA i ich lokalizację w odpowiednich domenach jądrowych (Darzacą i wsp., 2002; Kiss i wsp., 2002; Richard i wsp., 2003; Meier, 2005). Pełnią też podobną funkcję wjądrze: (1) wybierają nukleotydy w cząsteczkach określonych RNA (tworząc z nimi czasowe połączenia na zasadzie komplementamości par zasad), które następnie podlegają modyfikacji: metylacji i pseudourydylacji; (2) „przyciągają” do rejonu RNA mającego podlegać modyfikacji białka enzymatyczne, które tę modyfikację (np. przekształcenie urydyny w pseudourydynę) przeprowadzają (Limbach i wsp., 1994; Massenet i wsp., 1998; Kiss, 2001; Filipowicz i Pogacic, 2002; Tems i Tems, 2002). 1.1.2. Organizacja jądra oocytu Ze względu na duże rozmiary i zawartość różnorodnych struktur, jądro oocytu zwierząt, tradycyjnie zwane pęcherzykiem zarodkowym, jest szczególnie dogodnym obiektem badań morfologicznych i cytochemicznych. Aktywność pęcherzyka zarodkowego ukierunkowana jest nie tylko na doraźne potrzeby oocytu, lecz także, w znacznej mierze, na potrzeby przyszłego zarodka, który rozwinie się po zapłodnieniu lub aktywacji partenogenetycznej oocytu. Aby sprostać tym wymaganiom, pęcherzyk zarodkowy wykazuje z reguły znaczną aktywność transkrypcyjną. Jądro oocytu, podobnie jak jądro komórki somatycznej w okresie interfazy, jest oddzielone od cytoplazmy osłonką jądrową z kompleksami porowymi. Wypełniająca jądro nukleoplazma zróżnicowana jest na chromatynę (o różnym stopniu skondensowania) i przestrzeń międzychromatynową, w której występują liczne, różniące się strukturalnie i biochemicznie wyspecjalizowane domeny (kompartmenty), takie jak ziarna i włókna okołochromatynowe (perychromatynowe), ziarna międzychromatyno-we, ciała jądrowe oraz jąderko z rejonem wokółjąderkowym (zob. artykuły przeglądowe: Brasch i Ochs, 1992; Spector, 1993, 2001; Driel i wsp., 1995; Roth, 1995; Adamska i Biliński, 1997; Lamond i Eamshaw, 1998; Matera, 1999; Lewis i Tollervey, 2000; Dundr i Misteli, 2001; Misteli, 2001; Chubb i Bickmore, 2003; Stein i wsp., 2003; Zimber i wsp., 2004; Handwerger i Gall, 2006). W większości komórek, w tym w oocytach, to właśnie jąderko jest najbardziej widoczną i stosunkowo najlepiej poznaną domeną jądrową (zob. artykuły przeglądowe: Melese i Xue, 1995; Shaw i Jordan, 1995; Scheer i Hock, 1999; Carmo-Fonseca i wsp., 2000; Olson i wsp., 2000, 2002; Gerbi i wsp., 2003; DiMario, 2004; Lam i wsp., 2005). Jąderka są dynamicznymi strukturami, których liczba, rozmiary i kształt zależą od typu komórki, jej aktywności metabolicznej i stadium cyklu komórkowego (Dundr i wsp., 2000; Leung i Lamond, 2003; DiMario, 2004; Leung i wsp., 2004). Organelle te formują się w okresie telofazy wokół wysoce powtarzalnych zespołów (tandemów) genów (rDNA) kodujących rybo-somowe RNA (rRNA). Geny te zlokalizowane są w tzw. organizatorze jąderka, w skrócie NOR (ang. Nucleolar Organizer Region) (zob. artykuły przeglądowe: Melese i Xue, 1995; Scheer i Hock, 1999; DiMario, 2004). Organizacja jąderka w znacznym stopniu odzwierciedla jego aktualny stopień zaangażowania w syntezę rRNA w komórce (zob. artykuły przeglądowe: Olson i wsp., 2000, 2002; Gerbi i wsp., 2003; DiMario, 2004). Aktywne jąderko zróżnicowane jest zwykle na trzy rejony: centrum włókniste (ang. fibrillar center), gęsty składnik włóknisty (ang. dense fibrillar component) i składnik ziarnisty (ang. granular component) (zob. artykuły przeglądowe: Melese i Xue, 1995; Scheer i Hock, 1999; Olson i wsp., 2002; DiMario, 2004; Thiry i Lafontaine, 2005). Ostatnio wykazano, że różnice w budowie ultrastrukturalnej jąderka w komórkach różnych grup zwierząt są znaczne i że trójdzielna organizacja jąderka jest charakterystyczna jedynie dla wyższych kręgowców (owodniowców) (Thiry i Lafontaine, 2005). Skład molekularny jąderka jest dobrze poznany, zwłaszcza u tych gatunków, u których zbadano proteom tej organelli. Obecnie wiadomo, że w jąderkach komórek ludzkich, oprócz rybosomowych RNA i małych jąderkowych RNA, występuje blisko 700 różnych białek (Pederson, 2002; Scherl i wsp., 2002; Andersen i wsp., 2002, 2005; Brunet i wsp., 2003). Oprócz białek zaangażowanych w proces obróbki pre-rRNA, 12 których występowanie na terenie jąderka było znane od dawna, takich jak nukleolina (białko C23), nukleofosmina (białko B23, numatryna) i fibrylaryna, wykazano w tej organelli obecność kilku czynników transkrypcyjnych, a także białek strukturalnych, takich jak laminy, keratyna i tubulina (Shaw i Jordan, 1995; Szymczyk i Kiliańska, 1997; Andersen i wsp., 2002; Fox i wsp., 2002). Wiadomo również, że część czynników występuje na terenie jąderka tylko okresowo i że zmiany w aktywności transkryp-cyjnej komórki wywołują modyfikację jego składu molekularnego. Charakterystyczną cechą funkcjonowania jąderka jest też wymiana składników i współdziałanie z innymi kompartmentami jądra, w szczególności z ciałami Cajala (zob. rozdz. 1.1.3. Budowa molekularna i funkcje ciała Cajala). Podstawową funkcją jąderka jest biogeneza rybosomów, złożony proces obejmujący transkrypcję genów kodujących prekursorowe cząsteczki rybosomowego RNA (pre-rRNA), dojrzewanie pre-rRNA polegające na wycinaniu cząsteczek 5.8S, 18S i 28S rRNA i łączenie tych cząsteczek z białkami rybosomowymi w podjednostki ryboso-mowe (zob. artykuły przeglądowe: Werner, 1990; Melese i Xue, 1995; Shaw i Jordan, 1995; Wilczyński, 1995; Scheer i Hock, 1999; Peculis, 2002; Fromont-Racine i wsp., 2003; Shaw i Doonan, 2005). Jąderko jest także zaangażowane w procesy transportu wewnątrzjądrowego i jądrowo-cytoplazmatycznego, w tym import białek rybosomo-wych i cząsteczek 5S rRNA, które u większości eukariontów transkrybowane są poza jąderkiem (zob. artykuły przeglądowe: Olson i wsp., 2000; Pederson i Politz, 2000). Chociaż główną funkcją jąderka jest synteza podjednostek rybosomowych, wyniki badań z ostatnich kilku lat wskazują, że rola jąderka jest bardziej złożona i że organella ta pełni wiele funkcji w komórce (zob. artykuły przeglądowe: Pederson, 1998; Garcia i Pillus, 1999; Pederson i Politz, 2000; Olson i wsp., 2002; Gerbi i wsp., 2003; Lam i wsp., 2005). Wykazano, że jąderko bierze udział m.in.: (1) w dojrzewaniu niektórych snRNA (Gerbi i Lange, 2002; Gerbi i wsp., 2003); (2) w transkrypcji i obróbce tRNA (Thompson i wsp., 2003; Paushkin i wsp., 2004); (3) w kontroli cyklu komórkowego przez regulowanie stabilności białek, w tym białka p53 - białka supresorowego transformacji nowotworowej (Bachand i Elledge, 1999; Visintin i wsp., 1999; Shou i wsp., 1999; Carmo-Fonseca i wsp., 2000; Visintin i Amon, 2000; Takemura i wsp., 2002; Mekhail i wsp., 2004; Rodway i wsp., 2004; Tsai i McKay, 2005); (4) w metabolizmie telomerów - przez łączenie komponentów (RNA i białek) telomerazy (Etheridge i wsp., 2002; Gerbi i wsp., 2003; Kieffer-Kwon i wsp., 2004; Zhang i wsp., 2004a); (5) w naprawie uszkodzonego DNA (Boom i wsp., 2004; Meder i wsp., 2005), a także (6) w odpowiedzi komórki na stres (Daniely i wsp., 2002; Mayer i wsp., 2005). W przeciwieństwie do jąderka, skład molekularny i funkcje innych ciał jądrowych nie zostały jeszcze w pełni poznane. Badania immunocytochemiczne na poziomie ul-trastrukturalnym i z zastosowaniem immunofluorescencji wykazały, że jedna klasa ciał jądrowych jest wzbogacona w czynniki zaangażowane w obróbkę pre-mRNA. Organelle te określane są wspólnym terminem - ciała Cajala (zob. artykuły przeglądowe: Gall i wsp., 1999; Gall, 2000, 2001, 2003; Sacharczuk i wsp., 2004; Zienkiewicz i Niedojadło, 2004; Cioce i Lamond, 2005). 13 1.1.3. Budowa molekularna i funkcje ciała Cajala Badania ciał Cajala mają ponad stuletnią historię. Struktury te odkrył w 1903 r. w neuronach ssaków Santiago Ramon y Cajal. Badacz ten zauważył, że w jądrach komórek nerwowych występują charakterystyczne kuliste ciała o średnicy ok. 0,5 pm, które impregnują się solami srebra (Cajal, 1903). Ponieważ struktury te zwykle towarzyszyły jąderku, nazwał je ciałami akcesorycznymi jąderka (hiszp. cuerpo accesorio). Gdy w wyniku późniejszych badań ultrastrukturalnych okazało się, że ciała te w komórkach ssaków zbudowane są z silnie zwiniętych włókien o średnicy 40-60 nm, wprowadzono termin „ciała zwinięte” (ang. coiled bodieś) (Hardin i wsp., 1969; Mon-neron i Bernhard, 1969; Almeida i wsp., 1998). W końcu, w 1999 r. Gall i wsp. zaproponowali, by dla uczczenia odkrywcy nazwać kuliste ciała jądrowe ciałami Cajala i obecnie nazwa ta jest powszechnie przyjęta. Ciała Cajala są konserwatywnymi ewolucyjnie organellami jądrowymi, w których występuje szczególnie wysokie (w porównaniu z innymi strukturami jądrowymi i nu-kleoplazmą) nagromadzenie U snRNP biorących udział w obróbce mRNA (Carmo--Fonseca i wsp., 1991; 1992; 1993; Huang i Spector, 1992; Matera i Ward, 1993; Fer-reira i wsp., 1994; Gall i wsp., 1999; Gall, 2000, 2001, 2003). Domeny te zawierają również U7 snRNA, niezbędny w dojrzewaniu mRNA kodującego histony, a także cząsteczki RNA wchodzące w skład telomerazy (Frey i Matera, 1995; Wu i wsp., 1996; Muller i Schumperli, 1997; Bellini i Gall, 1998; Dominski i Marzluff, 1999; Jady i wsp., 2004; Pederson, 2004; Zhu i wsp., 2004). Dodatkowo, na terenie ciał Cajala występuje wiele rodzajów białek zaangażowanych w różnorodne procesy komórkowe, w tym podstawowe czynniki transkrypcji (TF1IF, TFIIH, EAF1), białka TBP wiążące się z kasetą TATA, czynnik elongacji transkrypcji ELL, topoizomeraza 1, podjednostki trzech eukariotycznych polimeraz RNA, kompleksy cyklin E i H, a także białka: Sm, Lsm, SLBP1, Gar 1, SART3/pll0, p53 i SMN (zob. artykuły przeglądowe: Matera, 1999, 2003; Dundr i Misteli, 2001; Ogg i Lamond, 2002; Gall, 2000, 2003; Zimber i wsp., 2004; Cioce i Lamond, 2005). Wiadomo również, że w ciałach Cajala występują niektóre białka uczestniczące w procesie transformacji nowotworowej. Jednym z nich jest białko pigpen należące do rodziny czynników TET z grupy onkoprotein mięsaka Ewinga (Alliegro i Alliegro, 1996; Morohoshi i wsp., 1998). Białka z tej grupy wiążą się z określonymi cząsteczkami RNA i regulują ich metabolizm (Morohoshi i wsp., 1998; Arvand i Denny, 2001). Ciała Cajala zawierają także składniki występujące w jąderku: U3 i U8 małe jąderkowe rybonukleoproteiny (snoRNP, ang. smali nucleolar ribonucleoproteinś), fibrylarynę oraz białka Noppl40 i NAP57 (Raska i wsp., 1990; Isaac i wsp., 1998; Gall, 2000, 2003; Verheggen i wsp., 2002). Molekularnym znacznikiem (markerem) ciał Cajala jest fosfoproteina p80 koiłina (ang. coilin), choć białko to występuje także w nukleoplazmie i w cytoplazmie (Andra-de i wsp., 1991, 1993; Raska i wsp., 1991; Carmo-Fonseca i wsp., 1993; Alliegro i Alliegro, 1998; Matera, 1998; Schul i wsp., 1998; Bellini i Gall, 1999; Bellini, 2000; Morgan i wsp., 2000; Lam i wsp., 2002; Ogg i Lamond, 2002). Analiza budowy molekularnej cząsteczek koiliny ujawniła istnienie domen odpowiedzialnych m.in. za lokalizację tego białka w ciałach Cajala i interakcje z innymi składnikami tych organelli jądrowych (Tuma i wsp., 1993; Chan i wsp., 1994; Wu i wsp., 1994; Bellini, 2000; Hebert i wsp., 2001; Tucker i wsp., 2001). Wykazano również, że ściśle określony 14 rejon w obrębie ewolucyjnie konserwatywnego końca karboksylowego koiliny odgrywa kluczową rolę w regulowaniu liczby ciał Cajala powstających w nukleoplazmie (Shpargel i wsp., 2002). Choć funkcja koiliny w metabolizmie komórki nie została całkowicie wyjaśniona, uważa się, że białko to uczestniczy w transportowaniu cząstek U snRNP do ciał Cajala (Bauer i Gall, 1977; Bellini i Gall, 1998; Bellini, 2000). Na taką funkcję koiliny wskazują wyniki badań komórek myszy z nieczynnym genem kodującym koilinę (Tucker i wsp., 2001; Jady i wsp., 2003), jak również biochemicznie potwierdzone oddziaływania między koiliną a U snRNP, białkiem SMN oraz białkami Sm (Hebert i wsp., 2001, 2002; Xu i wsp., 2005; zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA). Dzięki zastosowaniu zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej: GFP (ang. Green Fluorescence Protein) i FRAP (ang. Fluorescence Recovery After Photobleaching) stwierdzono, że pula koiliny w ciałach Cajala pozostaje w stanie dynamicznej równowagi z pulą koiliny w nukleoplazmie i że białko to nieustannie krąży między tymi przedziałami jądra (Snaar i wsp., 2000; Handwerger i wsp., 2003; Sleeman i wsp., 2003; Dundr i wsp., 2004, Deryusheva i Gall, 2004; Stanek i Neugebauer, 2004). Pomimo intensywnych, zwłaszcza w ostatnich latach, badań funkcja ciał Cajala wciąż nie jest ostatecznie wyjaśniona. W komórkach interfazowych ssaków organelle te często przylegają do rejonów chromosomów zawierających geny kodujące histony, niektóre U snRNA i snoRNA (Frey i Matera, 1995; Smith i wsp., 1995; Frey i wsp., 1999; Jacobs i wsp., 1999; Schul i wsp., 1999; Frey i Matera, 2001; Shopland i wsp., 2001). Wydaje się jednak, że ciała Cajala nie są miejscem transkrypcji ani składania pre-mRNA, gdyż nie inkorporują znakowanej urydyny, nie zawierają DNA, tran-skryptów pre-mRNA ani czynników niezbędnych do obróbki pre-mRNA, np. czynnika SC-35, z grupy białek SR (Raska i wsp., 1991; Carmo-Fonseca i wsp., 1992; Lamond i Carmo-Fonseca; 1993a, b; Spector, 1993). W badaniach in vivo wykazano, że występuje ciągły przepływ nowo powstających cząstek U snRNP i snoRNP przez ciała Cajala, co wskazuje, że domeny te mogą uczestniczyć w biogenezie, modyfikacji (dojrzewaniu), sortowaniu lub transporcie tych kompleksów rybonukleoproteinowych (Sleeman i Lamond, 1999a; Gall, 2000). Organellom tym przypisuje się też ważną rolę w regulowaniu przepływu cząstek U snRNP i snoRNP pomiędzy różnymi kompart-mentami jądra (Bauer i Gall, 1997; Carvalho i wsp., 1999; Gall i wsp., 1999; Sleeman i Lamond, 1999a; Gall, 2001; Carmo-Fonseca, 2002a; Ogg i Lamond, 2002; Verheg-gen i wsp., 2002; Gerbi i wsp., 2003; Stanek i wsp., 2003). Ciała Cajala biorą również udział w obróbce końca 3' pre-mRNA kodującego histony (Frey i Matera, 1995; Wu i wsp., 1996; Bellini i Gall, 1998; Dominski i Marzluff, 1999). Wykazano, że w tych domenach jądrowych odbywa się hipermetylacja czapeczki na końcu 5' i dojrzewanie końca 3' w cząsteczkach U3 snoRNA (Verhegen i wsp., 2002). Zaproponowano również, że na terenie ciał Cajala dochodzi do łączenia się w duże kompleksy molekularne czynników zaangażowanych w transkrypcję i potranskrypcyjną obróbkę różnych typów RNA (Gall i wsp., 1999; Matera, 1999; Morgan i wsp., 2000; Gall, 2000, 2001, 2003; Doyle i wsp., 2002; Ogg i Lamond, 2002). Nowe światło na funkcję ciał Cajala rzuciło odkrycie scaRNA - małych jądrowych RNA, które występują jedynie w tych organellach jądrowych (Darzacq i wsp., 2002; Kiss i wsp., 2002; Jady i wsp., 2003; Richard i wsp., 2003). Modyfikacja określonych nukleotydów w cząsteczkach U snRNA, zachodząca z udziałem scaRNA, jest niezbędna do właściwych oddziaływań molekularnych i konieczna do prawidłowego funkcjo 15 nowania spliceosomu (Segault i wsp., 1995; Yu i wsp., 1998; zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA). Należy dodać, że ciała Cajala są strukturami dynamicznymi. W żywych komórkach przemieszczają się w nukleoplazmie i mogą łączyć się ze sobą w ciała o większej średnicy (Boudonck i wsp., 1999; Płatani i wsp., 2000, 2002). Wchodzą także w interakcje z innymi domenami jądrowymi. W jądrach niektórych komórek ssaków ciała Cajala występują w bliskim sąsiedztwie jąderka, a niekiedy nawet mogą stanowić jego integralną część (Ochs i wsp., 1994; Malatesta i wsp., 1994b; Bohmann i wsp., 1995; Ma-tera, 1999; Verhegen i wsp., 2002). Ponieważ jąderko i ciała Cajala dzielą ze sobą wiele składników zaangażowanych w biogenezę U snRNP (zob. rozdz. 1.1.4. Biogene-za cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA), uważa się, że organelle te współdziałają ze sobą i że pierwszy etap modyfikacji cząstek U snRNP zachodzi w ciałach Cajala, a dalsza obróbka, przynajmniej niektórych rodzajów U snRNP, odbywa się na terenie jąderka (Bohmann i wsp., 1995; Sleeman i wsp., 1998; Sleeman i Lamond, 1999a; Olson i wsp., 2000). Ciała Cajala są też powiązane funkcjonalnie z domenami jądrowymi, zwanymi ciałami bliźniaczymi ciał Cajala lub gems (ang. gemini of Cajal bodies). Te dwie organelle jądrowe mają podobną wielkość i kształt; zwykle też sąsiadują ze sobą (Liu i Dreyfuss, 1996; Matera, 1998; Matera i Frey, 1998; Carvalho i wsp., 1999; Young i wsp., 2000; Paushkin i wsp., 2002; Navascues i wsp., 2004). Gems, w przeciwieństwie do ciał Cajala, nie zawierają U snRNP i koiliny, wykazują natomiast wysoką koncentrację białek: SMN i gemin (Liu i Dreyfuss, 1996; Young i wsp., 2000; Hebert i wsp., 2001; Charroux i wsp., 1999, 2000; Malatesta i wsp., 2004). Wy-daje się, że te domeny jądrowe oddziałują ze sobą dzięki bezpośredniej interakcji białka SMN i koiliny (Hebert i wsp., 2001). Jak już wcześniej wspomniano, ważnym składnikiem ciał Cajala są cząstki U snRNP biorące udział w obróbce pre-mRNA. Zanim cząstki te znajdą się na terenie ciała Cajala, przechodzą złożony proces dojrzewania. Kolejne stadia tego procesu najlepiej poznano w komórkach ssaków. Dotychczasowe wyniki badań wskazują, że zarówno przebieg poszczególnych etapów formowania cząstek U snRNP, jak i czynniki biorące w nich udział są w znacznej mierze ewolucyjnie konserwatywne. Dlatego przyjmuje się, że biogeneza cząstek U snRNP zachodzi podobnie w komórkach wszystkich zwierząt (Ohno i wsp., 2000). Poniżej przedstawiono ważniejsze procesy prowadzące do powstania cząstek U snRNP i ich związki z określonymi domenami jądrowymi. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA Proces powstawania cząstek U snRNP obejmuje kilka precyzyjnie kontrolowanych etapów, które przebiegają w dwóch odrębnych kompartmentach komórki: w nukleoplazmie i w cytoplazmie (zob. ryc. 1-1). Na terenie jądra kolejno zachodzą: 16 (1) transkrypcja genów kodujących cząsteczki LJ snRNA z udziałem polimerazy RNA klasy II (Eliceiri i Sayavedra, 1976; Wieben i wsp., 1985; Uguen i Murphy, 2003; Jacobs i wsp., 2004); (2) dołączanie do końca 5' cząsteczki U snRNA charakterystycznego nukleozydu, 7-metyloguanozyny, zwanego czapeczką monometylową (Fischer i Luhrmann, 1990; Hamm i Mattaj, 1990); (3) transport cząsteczki U snRNA z jądra komórki, via kompleksy porowe w osłonce jądrowej, do cytoplazmy (Fischer i Luhrmann, 1990; Hamm i Mattaj, 1990; Jarmo-lowski i wsp., 1994). W transporcie tym uczestniczy tzw. kompleks eksportujący, który przyłącza się do czapeczki monometylowej. Kompleks eksportujący zbudowany jest z białek CBP 20, CBP 80, PHAX (ang. Phosphorylated Adaptor for RNA Export) iCRMl/RanGTP (Zieve i wsp., 1988; Izaurralde i wsp., 1994; 1995; Ohno i wsp., 2000; Segref i wsp., 2001). Kolejne etapy biogenezy cząstek U snRNP przebiegająjuż na terenie cytoplazmy: (4) rozpad kompleksu eksportującego (wskutek defosforylacji czynnika PHAX i hydrolizy GTP). Czynniki biorące udział w transporcie do cytoplazmy, po odłączeniu od cząsteczki U snRNA, powracają do jądra (Ohno i wsp., 2000); (5) przyłączenie specyficznych białek i formowanie się cząstki rybonukleo-proteinowej U snRNP. Proces ten przebiega dwustopniowo: najpierw do U snRNA przyłącza się tzw. kompleks SMN, który zbudowany jest z białka SMN (ang. Survival of Motor Neurons) i kilku białek z grupy gemin (Liu i Dreyfuss, 1996; Fischer i wsp., 1997; Liu i wsp., 1997; Mattaj 1998; Carvalho i wsp., 1999; Charroux i wsp., 1999, 2000; Gubitz i wsp., 2002, 2004; Yong i wsp., 2002, 2004a). Następnie, do ściśle określonych sekwencji w pobliżu końca 3' cząsteczki U snRNA, zostaje przyłączony tzw. kompleks rdzeniowy. Zbudowany jest on z siedmiu białek Sm: B/B', Dl, D2, D3, E, F i G tworzących pierścień (Branlant i wsp., 1982; Raker i wsp., 1996, 1999; Lamond, 1999; Kambach i wsp., 1999; Stark i wsp., 2001; Urlaub i wsp., 2001). Białka Sm są wysoce konserwatywne ewolucyjnie i zawierają domenę Sm, która odpowiada za oddziaływania pomiędzy białkami Sm (Hermann i wsp., 1995). Za interakcje pomiędzy kompleksem SMN i białkami rdzeniowymi odpowiedzialna jest domena Tudor w białku SMN i domeny sDMA, które zawierają symetrycznie metylowaną argininę (dime-tyloargininę) i występują blisko końca C białek SmB, SmDl i SmD3 (Buhler i wsp., 1999; Brahms i wsp., 2000; 2001; Friesen i wsp., 2000, 2001a, b; Jones i wsp., 2001; Meister i wsp., 2001, 2002; Selenko i wsp., 2001; Meister i Fischer, 2002; Pellizoni i wsp., 2002; Yong i wsp., 2004a; Renvoise i wsp., 2006); (6) dojrzewanie polegające na hipermetylacji (przy udziale transferazy metylowej Tgs 1) czapeczki monometylowej na końcu 5' i jej przekształcenie w 2,2,7--trimetyloguanozynę, dalej zwaną czapeczką TMG (ang. trimethylguanosine) (Mattaj, 1986; Fischer i wsp., 1993; Ro-Choi, 1999; Plessel i wsp., 1994); (7) transport dojrzałej cząstki U snRNP do nukleoplazmy (Bringmann i wsp., 1983; Mattaj, 1986; Fischer i Luhrmann, 1990; Hamm i wsp., 1990; Fischer i wsp., 1993; Massenet i wsp., 2002; Mouaikel i wsp., 2003; Girard i wsp., 2004). W procesie tym uczestniczą białka - snurportyna 1 i P importyna, przy czym pierwsze białko wiąże się z czapeczką TMG, a drugie przyłącza się do snurportyny 1 (Palacios i wsp., 1997; Huber i wsp., 1998; Nakielny i Dreyfuss, 1999; Narayanan i wsp., 2002). Na terenie jądra komórkowego białka transportujące zostają odłączone, a cząstki U snRNP są przejściowo lokalizowane w ciałach Cajala dzięki oddziaływaniu charak 17 terystycznych dla koiliny domen RG (arginina - glicyna) z białkiem SMN (Carmo-Fonseca i wsp., 1992; Matera i Ward, 1993; Sleeman i Lamond, 1999a; Carvalho i wsp., 1999; Hebert i wsp., 2001, 2002; Sleeman i wsp., 2001; Boisvert i wsp., 2002). W ciałach Cajala ściśle określone nukleotydy w cząsteczkach Ul, U2, U4 i U5 snRNA podlegają dalszej modyfikacji (pseudourydylacji i metylacji) przy udziale scaRNA (Jady i Kiss, 2001; Darzacq i wsp., 2002; Jady i wsp., 2003; Richard i wsp., 2003). Prawdopodobnie również w ciałach Cajala do cząstek U snRNP przyłączane są kolejne, specyficzne dla każdego typu U snRNA, białka (Yu i wsp., 1998; Kramer i wsp., 1999; Will i wsp., 2002; Nesic i wsp., 2004). W trakcie tych procesów dochodzi do odłączenia kompleksu SMN, który wędruje do gems (Carvalho i wsp., 1999). Zmodyfikowane U snRNP gromadzą się w zespołach ziaren międzychromatynowych, tzw. speckles (Spector, 1996; Sleeman i Lamond, 1999a; Lamond i Spector, 2003). Z ziaren międzychromatynowych cząstki U snRNP są transportowane do miejsc, w których powstają spliceosomy - duże kompleksy rybonukleoproteinowe katalizujące usuwanie sekwencji intronowych z prekursorów mRNA (pre-mRNA) i łączenie egzonów w dojrzałe cząsteczki mRNA (zob. artykuły przeglądowe: Staley i Guthrie, 1998; Sleeman i Lamond, 1999b; Will i Luhrmann, 2001; Zhou i wsp., 2002; Jurica i Moore, 2003; Lamond i Spector, 2003; Sanford i Caceres, 2004). Szczegółowy opis procesów zachodzących w trakcie biogenezy cząstek U snRNP zawierają artykuły przeglądowe: Kambach i wsp., 1999; Will i Luhrmann, 2001; Car-mo-Fonseca, 2002a; Meister i wsp., 2002; Paushkin i wsp., 2002; Gubitz i wsp., 2004; Kiss, 2004; Yong i wsp., 2004b. Warto zaznaczyć, że w przeciwieństwie do innych cząsteczek U snRNA, cząsteczki U6 snRNA nie są eksportowane z jądra do cytoplazmy i w konsekwencji cały proces dojrzewania U6 snRNP zachodzi na terenie nukleoplazmy (Will i Luhrmann, 2001; Gerbi i wsp., 2003). U6 snRNA jest wyjątkowy także pod kilkoma innymi względami: 1) powstaje przy udziale polimerazy RNA typu III, 2) nie wiąże się białkami Sm, tylko podobnymi do nich białkami Lsm (ang. like Sm), 3) podlega modyfikacji (pseudourydylacji i metylacji) przy udziale snoRNP w jąderku (Massenet i wsp., 1998; Tycowski i wsp., 1998; Achsel i wsp., 1999; Ganot i wsp., 1999; Lange i Gerbi, 2000; Gerbi i Lange, 2002). Należy dodać, że dojrzałe cząstki U4 i U6 snRNP łączą się ze sobą a następnie z cząstką U5 snRNP, tworząc dużą cząstkę U4-U5-U6- tri-snRNP. W łączeniu U4 z U6 snRNP zaangażowane jest białko SART3/pl 10, które występuje w ciałach Cajala (Bell i wsp., 2002; Stanek i wsp., 2003; Stanek i Neugebauer, 2004). Wydaje się więc, że do połączenia U6 i U4 snRNP dochodzi właśnie na terenie tej domeny jądrowej. 1.2. Pęcherzyk zarodkowy owadów U owadów metabolizm pęcherzyka zarodkowego w znacznej mierze zależy od typu jajnika, w którym rozwija się oocyt. Jajniki owadów z reguły zbudowane są z rurek jajnikowych (owariol), w których można rozróżnić część przednią zwaną germarium, 18 i część tylną, witelarium (zob. artykuły przeglądowe: Biliński i Klag, 1994; Biining, 1994, 1998; Biliński, 1998a, b). W germarium zachodzą podziały mitotyczne oogo-niów, a w witelarium występują ułożone liniowo pęcherzyki jajnikowe, które zbudowane są z komórek linii płciowej otoczonych przez komórki somatyczne (folikularne). Biorąc pod uwagę organizację morfologiczną, Brandt (1874) wyróżnił dwa główne typy rurek jajnikowych: panoistyczne i meroistyczne. W owariolach panoistycznych wszystkie oogonia przekształcają się w oocyty i w konsekwencji pęcherzyki jajnikowe zawierają tylko oocyty, otoczone komórkami folikulamymi. W jajniku meroistycznym jedynie część oogoniów rozwija się w oocyty, a pozostałe różnicują się w komórki pomocnicze, zwane trofocytami albo komórkami odżywczymi. Ze względu na przestrzenne rozmieszczenie trofocytów, rozróżnia się dwa typy owariol meroistycznych: politroficzne i telotroficzne (Gross, 1903). W typowych owariolach politroficznych w witelarium występują pęcherzyki jajnikowe, zwane komorami jajowymi, które zbudowane są z różnej liczby komórek odżywczych i jednego oocytu; oba typy komórek otoczone są komórkami somatycznymi. Cechą charakterystyczną owariol telotroficz-nych jest zgromadzenie wszystkich komórek odżywczych w germarium, nazywanym w tym przypadku trofarium lub komorą odżywczą (troficzną). W konsekwencji, w witelarium występują jedynie oocyty otoczone komórkami folikulamymi. Szczegółową charakterystykę owariol owadów przedstawiono w artykułach przeglądowych: Śtys i Biliński, 1990; Biining, 1994, 1998; Biliński, 1998a, b. We wszystkich typach owariol rozwój pęcherzyków jajnikowych przebiega podobnie i obejmuje trzy częściowo zachodzące na siebie fazy: 1) prewitelogenezę - okres intensywnej syntezy różnych klas RNA, białek i namnażania organelli cytoplazma-tycznych (głównie rybosomów, mitochondriów, diktiosomów, siateczki śródplazma-tycznej), 2) witelogenezę - okres gromadzenia materiałów zapasowych (tzw. żółtka) i 3) choriogenezę - okres formowania osłon jajowych (zob. artykuły przeglądowe: Biliński i Klag, 1994; King i Biining, 1985; Biining, 1994, 1998; Biliński, 1998a, b). Należy podkreślić, że w jajniku meroistycznym przynajmniej niektóre podziały mitotyczne komórek płciowych są niezupełne, co prowadzi do powstania zespołów (gron) komórek połączonych mostkami cytoplazmatycznymi (międzykomórkowymi) (zob. artykuły przeglądowe: Telfer, 1975; King i wsp., 1982; King i Biining, 1985; Biining, 1994, 1998; Biliński, 1998a, b). W jajniku politroficznym mostki cytopla-zmatyczne łączą komórki odżywcze z oocytem. Natomiast w jajniku telotroficznym oocyty utrzymują łączność z trofocytami (zgromadzonymi w trofarium) za pomocą silnie wydłużonych mostków międzykomórkowych, zwanych sznurami odżywczymi. Dzięki istniejącym połączeniom cytoplazmatycznym pomiędzy komórkami grona możliwe jest przekazywanie różnorodnych substancji, np. białek i różnych typów RNA (głównie rRNA i mRNA) oraz organelli (głównie rybosomów i mitochondriów), z trofocytów do oocytu (zob. artykuły przeglądowe: King i Biining, 1985; Biining, 1994, 1998; Cooley i Theurkauf, 1994; Mahajan-Miklos i Cooley, 1994; Biliński, 1998a, b). W jądrach trofocytów dochodzi z reguły do zwielokrotnienia (poliploidyzacji) genomu, co znacząco zwiększa liczbę kopii genów do transkrypcji i skraca czas zaopatrywania oocytu w różne klasy RNA niezbędne do rozwoju przyszłego zarodka (zob. artykuły przeglądowe: King i Biining, 1985; Biining, 1994, 1998; Kubrakiewicz, 1997). Jak już wcześniej wspomniano, występuje zależność między typem jajnika, w którym rozwija się oocyt, a aktywnością transkrypcyjną pęcherzyka zarodkowego. W jajniku panoistycznym jądro oocytu aktywnie uczestniczy w syntezie różnych ty 19 pów RNA, zwłaszcza w okresie prewitelogenicznego wzrostu oocytu. Wysoka aktywność transkrypcyjna pęcherzyka zarodkowego manifestuje się przede wszystkim występowaniem chromosomów szczoteczkowych zaangażowanych w syntezę matrycowego RNA, a także obecnością silnie rozwiniętego jąderka wytwarzającego podjed-nostki rybosomowe. U niektórych gatunków dochodzi też do zwielokrotnienia (ampli-fikacji) genów rybosomowych, czego wyrazem jest pojawienie się w nukleoplazmie zwartego, gęstego ciała, zwanego pozachromosomowym ciałem DNA lub ciałem ekstra DNA, zawierającego liczne kopie rDNA (zob. artykuły przeglądowe: Bier i wsp., 1967; Trendelenburg i wsp., 1973; Cave, 1982; King i Biining, 1985; Biining, 1994; Kubrakiewicz, 1997). Transkrypcja zamplifikowanych genów prowadzi ostatecznie do powstania dużej liczby tzw. jąderek wielokrotnych (zob. artykuły przeglądowe: Bier i wsp., 1967; Trendelenburg i wsp., 1973; Cave, 1982; King i Biining, 1985; Biining, 1994; Kubrakiewicz, 1997). Natomiast w jajniku meroistycznym oocyt uzyskuje mRNA i odpowiednią ilość rybosomów głównie z komórek odżywczych (zob. artykuły przeglądowe: Bier i wsp., 1967; Berry, 1985; King i Biining, 1985; Biining, 1994; Kubrakiewicz, 1997). Tylko u nielicznych owadów posiadających ten typ jajnika (np. u niektórych chrząszczy, siatkoskrzydłych, dwuskrzydłych i pcheł) w jądrach oocytów dochodzi do amplifikacji genów rybosomowych (Bayreuther, 1956; Lima-de-Faria i Moses, 1966; Gall i wsp., 1969; Urbani, 1970; Gruzova i wsp., 1972; Urbani i Russo-Caia, 1972; Trendelenburg, 1974; Matuszewski i Hoser, 1975; Kloc, 1976; 1980; Matuszewski i Kloc, 1976; Kloc i Matuszewski, 1977; Trendelenburg i wsp., 1977; Cave, 1982; Biining i Sohst, 1988, 1989; Kloc i wsp., 1995; Kubrakiewicz i Biliński, 1995; Kubrakiewicz, 1998, 2002; Kubrakiewicz i wsp., 1998; Mazurkiewicz i Kubrakiewicz, 2002). Poza tymi rzadkimi przypadkami, jądro oocytu w jajniku meroistycznym wykazuje w różnym stopniu ograniczoną aktywność transkrypcyjną, a zawarta w nim chro-matyna, stosunkowo wcześnie (tj. w okresie prewitelogenezy, w profazie pierwszego podziału mejotycznego) podlega kondensacji, tworząc zwartą strukturę, zwaną kario-somem (Gruzova, 1962; 1966; 1979; Roth, 1966; Bier i wsp., 1967; King, 1970; Fiil i Moens, 1972; Gruzova i wsp., 1972, 1995; Matuszewski i Kloc, 1976; Gruzova i Batalova, 1979; Szklarzewicz i wsp., 1992; Gruzova i Parfenov, 1993; Kloc i wsp., 1995; Kubrakiewicz i Biliński, 1995; Kubrakiewicz, 1998). Badania autoradiograficzne jajników meroistycznych z różnych grup owadów wykazały, że jądro oocytu jest z reguły transkrypcyjnie aktywne jedynie w początkowej fazie powstawania kariosomu (Bier, 1965; Chandley, 1966; Gruzova, 1966; Bier i wsp. 1967; Biining, 1972; Ull-mann, 1973; Ray i Ramamurty, 1979; Tsvetkov i wsp., 1997). Stwierdzono także, że w czasie formowania kariosomu w nukleoplazmie pojawiają się liczne ciała jądrowe o zróżnicowanej wielkości i budowie. Skład molekularny i funkcja tych ciał nie zostały ostatecznie wyjaśnione (zob. artykuł przeglądowy: Gruzova i Parfenov, 1993). W pęcherzykach zarodkowych niektórych przedstawicieli siatkoskrzydłych (Neuroptera), dwuskrzydłych (Díptera) i chrząszczy (Coleóptera) kariosom otacza warstwa gęstego, włóknistego materiału, nazwana kapsułą kariosomu (Gruzova, 1966, 1979; Gruzova i wsp., 1972; Fiil i Moens, 1972; Gruzova i Batalova, 1979; Alexandrova, 1992; Szklarzewicz i wsp., 1992; Świątek, 1999; Riibsam i Biining, 2001). Zarówno skład molekularny, jak i znaczenie kapsuły kariosomu dla metabolizmu pęcherzyka zarodkowego pozostają nieznane. Spekuluje się, że struktura ta może odgrywać rolę w ochronie skondensowanej chromatyny i (lub) jej zakotwiczaniu w określonym rejonie jądra oocytu (Gruzova i Parfenov, 1993). 20 1.2.1. Jądra dodatkowe W oocytach niektórych owadów (i niektórych innych zwierząt) pęcherzyk zarodkowy otoczony jest przez charakterystyczne pęcherzykowate struktury, zwane jądrami dodatkowymi albo akcesorycznymi (ang. accessory nuclei). Organelle te po raz pierwszy opisał Blochmann (1886) w cytoplazmie oocytów mrówek i os. Późniejsze badania wykazały, że jądra dodatkowe występują także w oocytach innych błonkówek oraz w oocytach niektórych skoczogonków, pluskwiaków (czerwców), wszołów, wojsiłek i dwuskrzydłych (Ries, 1932; Hopkins, 1964; Buchner, 1966; King i Richards, 1968; King i Fordy, 1970; Cassidy i King, 1972; Palevody, 1972; Meyer i wsp., 1979; Zissler i Sander, 1982; Billen, 1985; Biliński i Jankowska, 1987; Biliński, 1989, 1991a, b; Szklarzewicz i wsp., 1993; Biliński i wsp., 1993, 1995a, b; Zawadzka, 1996; Jabłońska i Biliński, 2001; Biliński i Kloc, 2002). Organelle te znaleziono również w oocytach innych bezkręgowców: nicieni (Goldstein, 1981), skorupiaków (Kubrakiewicz i wsp., 1991), wijów (Kubrakiewicz, 1991) i pijawek (Świątek, 2005). Poza oocytami, struktury przypominające jądra dodatkowe opisano w komórkach odżywczych towarzyszących oocytom u błonkówek (Klag i Biliński, 1994), w zarodkach owadów (Zissler i Sander, 1982) i nicieni (Goldstein, 1981), a także w zygocie i w blastomerach ssaków (Szollósi i Szóllósi, 1988). Zazwyczaj jądra dodatkowe wypełnione są przejrzystą substancją podstawową w której występują gęste kuliste inkluzje, tradycyjnie zwane pseudojąderkami (ang. pseudonucleoli) (Hopkins, 1964; King i Fordy, 1970; Cassidy i King, 1972; Biliński, 1989; Kubrakiewicz i wsp., 1991; Szklarzewicz i wsp., 1993; Biliński i Kloc, 2002). Szczególnie dobrze rozwinięte jądra dodatkowe występują w oocytach błonkówek (Hymenoptera) (Blochmann, 1886; Hopkins, 1964; King i Richards, 1968; King i Fordy, 1970; Cassidy i King, 1972; Billen, 1985; Biliński, 1991 a, b; Biliński i wsp., 1993, 1995b; Szklarzewicz i wsp., 1993; Jabłońska i Biliński, 2001; Biliński i Kloc, 2002). Badania ultrastrukturalne wykazały, że organelle te powstają przez fałdowanie osłonki jądra oocytu i w rezultacie otoczone są podwójną poprzebijaną kompleksami porowymi osłonką(King i Fordy, 1970; Biliński, 1991 a; Biliński i wsp., 1995b). W jądrach dodatkowych błonkówek występują zazwyczaj dwa pseudojąderka (Hopkins, 1964; Cassidy i King, 1972; Biliński, 1991a; Jabłońska i Biliński, 2001; Biliński i Kloc, 2002). Badania immunocytochemiczne ujawniły, że w jądrach dodatkowych osy Ve-spula germánica jedno z pseudojąderek zawiera koilinę, snRNA i białka Sm (Biliński i Kloc, 2002). Wyniki te sugerują że niektóre pseudojąderka i ciała Cajala mogą być strukturami homologicznymi. Funkcja jąder dodatkowych w oocycie nie jest wyjaśnioną ale na podstawie badań ultrastrukturalnych i histochemicznych postuluje się udział tych organelli m.in. w gromadzeniu żółtka (Hopkins, 1964), w magazynowaniu błon cytoplazmatycznych (Meyer i wsp., 1979), w syntezie prekursorów osłon jajowych (Hopkins, 1964) oraz w gromadzeniu i deponowaniu rybonukleoprotein i (lub) białek w określonych rejonach oopla-zmy (Biliński, 1991a; Biliński i wsp., 1993; Biliński i Kloc, 2002). 21 1.2.2. Ciała jądrowe W pęcherzykach zarodkowych owadów, oprócz jąderek, występują także charakterystyczne kuliste ciała jądrowe, zwane w literaturze angielskojęzycznej endobodies, a w niemieckojęzycznej Binnenkórper (Jorgensen, 1913; Bier i wsp., 1967). Skład molekularny i funkcja tych ciał jądrowych pozostawały niewyjaśnione aż do połowy lat 90. XX w., kiedy to za pomocą metod immunocytochemicznych wykazano, że w jajniku panoistycznym świerszcza domowego (Acheta domesticus), w transkrypcyj-nie aktywnych pęcherzykach zarodkowych, ciała te zawierają m.in. p80-koilinę i U snRNP, natomiast nie zawierają czynników niezbędnych do składania pre-mRNA (Gall i wsp., 1995; Tsvetkov i wsp., 1997). Taki skład molekularny wskazuje na podobieństwo tych domen jądrowych do ciał Cajala występujących w pęcherzykach zarodkowych płazów i w jądrach komórek somatycznych ssaków (Gall i wsp., 1995, 2004; Gall, 2003). Podobieństwo to potwierdziły też badania ultrastrukturalne (Gall i wsp., 1995; Filek i wsp., 2002). Natomiast niewiele wiadomo o budowie molekularnej i funkcji „endobodies” w jądrach oocytów w jajniku meroistycznym owadów. 1.3. Cel badań Celem niniejszych badań było poznanie składu molekularnego ciał jądrowych w nieaktywnych transkrypcyjnie pęcherzykach zarodkowych owadów, a także poznanie budowy molekularnej i morfogenezy tzw. pseudojąderek w jądrach dodatkowych. Do badań wybrano gatunki, których pęcherzyki zarodkowe zawierają liczne, duże i (lub) silnie morfologicznie zróżnicowane ciała jądrowe, oraz gatunek, u którego w oocytach występują jądra dodatkowe z dobrze rozwiniętymi pseudojąderkami. Badania te pozwoliły wyciągnąć wnioski dotyczące natury, powstawania, a także ostatecznego losu różnych ciał jądrowych i pseudojąderek w procesie oogenezy. Doprowadziły też do zaproponowania funkcji tych struktur. 2. MATERIAŁY I METODY 2.1. Owady Badania przeprowadzono na jajnikach owadów należących do następujących grup: - chrząszcze drapieżne (Coleoptera-Adephaga), rodzina biegaczowate (Carabidae): biegacz fioletowy (Carabus violaceus) i szykoń (Pterostichus oblongopunctatusy, - chrząszcze wielożerne (Coleoptera-Polyphaga), rodzina ryjkowcowatych (Curcu-lionidae): kwieciak jabłkowiec (Anthonomus pomorum)', - Phthiraptera: wszy (Anoplura): wesz świńska (Haematopinus suis), wszoły (Mallophaga): wszoł gołębi (Columbicola columbae)', - błonkówki (Hymenoptera): osa (Yespula germanica). Samice chrząszczy z rodziny biegaczowatych zbierano w maju i w czerwcu w okolicach Krakowa. Samice kwieciaka jabłkowca zbierano wczesną wiosną z jabłoni w okolicach Wadowic. Matki (królowe) osy V. germanica zbierano wczesną wiosną w Krakowie lub w okolicach Krakowa. Samice wszy świńskiej zbierano ze świń hodowanych w gospodarstwie w pobliżu Krakowa, a samice wszoła gołębiego - z gołębi. 2.2. Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym i transmisyjnym mikroskopie elektronowym Jajniki lub pojedyncze owariole preparowano i utrwalano w 2,5% aldehydzie gluta-rowym w 0,1 M buforze fosforanowym (pH = 7,4) w temperaturze pokojowej przez 2 godz. lub przez kilka dni. Po kilkakrotnym płukaniu buforem fosforanowym z sacharozą (0,17 M), materiał dalej utrwalano w 1% roztworze czterotlenku osmu w buforze fosforanowym (pH = 7,4), a następnie odwadniano we wzrastających stężeniach alkoholu etylowego i w acetonie, przepajano i zatapiano w żywicy epoksydowej Epon 812 (Fullam łnc., Latham, Nowy Jork, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Bloczki polimeryzowano przez 48 godz. w temperaturze 60°C. Skrawki półcienkie (o grubości ok.l Jim) krojono na mikrotomie Reichert-Jung Ultracut E ( Reichert, De-pew, USA), barwiono 1% roztworem błękitu metylenowego w 1% boraksie i analizo 24 wano w mikroskopie świetlnym Jenalumar (Zeiss, Jena, Niemcy). Skrawki ultracienkie (ok. 90 nm grubości) przenoszono na siatki miedziane i kontrastowano w nasyconym wodnym roztworze octanu uranylu oraz cytrynianem ołowiu (standardową metodą wg Reynoldsa, 1963). Skrawki analizowano w transmisyjnych mikroskopach elektronowych Philips 300 lub Jeol 100 SX, przy napięciu przyspieszającym 60 lub 80 kV. 2.3. Przygotowanie materiału do analizy histochemicznej Jajniki lub pojedyncze owariole utrwalano w 4% aldehydzie mrówkowym (świeżo przygotowanym z paraformaldehydu), w buforze fosforanowym (pH = 7,4), przez 20--30 min w temperaturze pokojowej. Po kilkakrotnym płukaniu w buforze fosforanowym, materiał odwadniano we wzrastających stężeniach alkoholu etylowego, przepajano i zatapiano w żywicy akrylowej Histocryl (Agar Scientific Ltd., Stansted, Wielka Brytania) zgodnie z instrukcją producenta. 2.3.1. Wykrywanie kwasów nukleinowych (DNA, RNA) metodą fluorescencyjną Seryjne skrawki półcienkie (o grubości 1-1,5 pm) barwiono jodkiem propydyny (1 pg/ml; Sigma, Chemical Co., St. Louis, USA) w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) i rozcieńczonym w stosunku 1:500-1:800, przez ok. 30^10 min. Następnie te same skrawki lub kolejne skrawki seryjne traktowano roztworem 0,2-1 pg/ml odczynnika DAPI (dwuchlorowodorek 4, 6'-diamidyno-2-fenyloindol) (Sigma) w PBS przez 30 min. Oba barwienia przeprowadzano w temperaturze pokojowej, w ciemności. Preparaty płukano kilka razy w PBS i zamykano albo w glicerolu w buforze Mcllvaina o pH = 4,2, albo w mieszaninie o składzie: 80% glicerol, 20% bufor Tris o pH = 9,0 i 50% galusan propylu. Preparaty analizowano w mikroskopie fluorescencyjnym Jenalumar (Zeiss, Jena, Niemcy) lub Leica DMR (Leica, Wetzlar, Niemcy) wyposażonych w odpowiednie filtry. 2.3.2. Wykrywanie białek srebrochlonnych metodą Ag-NOR Barwienie metodą Ag-NOR (srebrzenia organizatorów jąderkowych) wykonywano według procedury Howella i Blacka (1980) lub w wersji zmodyfikowanej z równoczesnym barwieniem odczynnikiem DAPI (wg Bilińskiego i Bilińskiej, 1996). Seryjne skrawki histokrylowe, o grubości 1 pm, barwiono mieszaniną roztworu A (2% żelatyna 25 w 1% kwasie mrówkowym) i roztworu B (50% azotan srebra) zmieszanych w stosunku 1:1 lub 1:2 i inkubowano w komorze wilgotnej przez 10-35 min w temperaturze 37°C. Po kilkakrotnym płukaniu w wodzie destylowanej, preparaty zamykano w glicerolu i analizowano w mikroskopie świetlnym Jenalumar. Metoda Ag-NOR pozwala wykryć białka redukujące sole srebra (tzw. białka argy-rofilne), związane z rejonem organizatora jąderkowego i najprawdopodobniej biorące udział w dekondensacji rDNA oraz obróbce pre-rRNA (Biggiogera i wsp., 1991). Najważniejsze białka z tej grupy to nukleolina (białko C23) i nukleofosmina (białko B23, numatryna) (Ochs i Bush, 1984; Smetana i wsp., 1984). 2.4. Przygotowanie materiału do analizy immunocytochemicznej Jajniki utrwalano dwoma sposobami: 1) w 2% aldehydzie glutarowym w 0,1 M buforze fosforanowym (pH = 7,4) lub 2) w mieszaninie zawierającej 0,5-1% aldehyd gluta-rowy i 2% aldehyd mrówkowy (świeżo przygotowany z paraformaldehydu) w buforze fosforanowym (pH = 7,4). W obu przypadkach materiał utrwalano przez 20-30 min w temperaturze pokojowej. Dalsze postępowanie było zgodne z procedurą przygotowania materiału do badań w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (zob. rozdz. 2.2) z dwoma wyjątkami: 1) jajników nie utrwalano czterotlenkiem osmu; 2) polimeryzację bloczków eponowych przeprowadzano w temperaturze 50°C przez 36 godz. Seryjne skrawki ultracienkie zbierano na siatki niklowe pokryte błoną formwarową i trawiono w kropli 0,5% NaOH w etanolu przez 4-7 min (trawienie i wszystkie następne etapy przeprowadzano w komorze wilgotnej). Po kilkakrotnym płukaniu wodą destylowaną, siatki umieszczano w kropli 5% roztworu H2O2 na ok. 5 min, a następnie starannie kilkakrotnie płukano wodą destylowaną, zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS) i blokowano przez 15-20 min w 2-5% roztworze albuminy wołowej (BSA; Sigma) lub 2^1% roztworze żelatyny rybiej (Sigma) w PBS z dodatkiem 0,1% NaN₃ i 0,05 M glicyny. Siatki inkubowano z przeciwciałem pierwszorzędowym (zob. tab. 1) rozcieńczonym w stosunku 1:50-1:800 w 1-2% roztworze albuminy wołowej (lub 1% roztworze żelatyny rybiej) w PBS z dodatkiem 0,1% NaN₃ w temperaturze 4°C, przez noc. Po kilkakrotnym płukaniu w PBS, siatki inkubowano przez 2 godz. w temperaturze pokojowej z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym, połączonym z ziarnami złota koloidalnego o średnicy 10 lub 18 nm i rozcieńczonym w stosunku 1:50-1:100 w 1% roztworze albuminy wolowej lub żelatyny rybiej w PBS z dodatkiem 0,1% NaN₃ i 0,01% Tween. Zastosowano następujące przeciwciała drugorzędowe: przeciwciała kozie przeciw mysim i króliczym IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA); przeciwciało kozie przeciw mysim IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA, USA) oraz przeciwciało ośle przeciw kozim IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Po zakończonej inkubacji, siatki kilkakrotnie płukano w PBS i w wodzie destylowanej, a następnie kontrastowano octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Skrawki analizowano w mikroskopie elektronowym JEOL 100 SX lub Hitachi H 500 przy napięciu przyspieszającym 60 lub 80 kV. 26 Tabela 1. Przeciwciała pierwszorzędowe zastosowane w analizie immunocytochemicznej Przeciwciało Rozpoznawany antygen Źródło monoklonalne (mysz) ab817 [8WG16] polimeraza RNA typu II Abeam Ltd., Cambridge, Wielka Brytania anty-SC-35 czynnik spiicingu SC-35 Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY, USA anty-Xenopus coilin koilina (Xenopus) Zymed Laboratories. Inc., San Francisco, CA, USA K-121 czapeczka 2,2,7-trimetylo- Calbiochem, Oncogene Research guanozyny (TMG) na końcu Products, Cambridge, MA, USA 5' U snRNP1 P2G3 fibrylaryna2 dar U. Scheera, Theodor-Boveri- Institute (Biocenter), Uniwersytet w Würzburgu, Würzburg, Niemcy Y-12 epitop Sm3 dar J.G. Galla, Carnegie Institu- tion, Baltimore, MD, USA poliklonalne (królik) anty-pigpen pigpen4 dar M.C. Alliegro, Louisiana State University Medical Center, New Orleans, LA, USA H-195 białko SMN Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA H-250 nukleolina Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA R288 koilina (p80-coi/m), konser- dary J.G. Galla, Carnegie Institu- watywny rejon (14 kDa) blisko tion, Baltimore, MD, USA i E.K.L. końca karboksylowego5 Chana, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA poliklonalne (koza) A-16 fibrylaryna Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA ¹ Bochnig i wsp., 1987; Krainer, 1988; ² Christensen i Banker, 1992; ³ Lerner i wsp., 1981; ⁴ Alliegro i Alliegro, 1996; ⁵ Andrade i wsp., 1991. 27 W trakcie przeprowadzania wszystkich reakcji immunocytochemicznych równocześnie wykonywano standardowe eksperymenty kontrolne. W tzw. kontroli negatywnej skrawki poddawano takim samym zabiegom, jak przedstawiono wyżej, ale pomijano przeciwciało pierwszorzędowe. W tzw. kontroli pozytywnej analizowano wynik reakcji immunocytochemicznej w innych niż oocyt komórkach jajnika, tzn. w komórkach odżywczych i komórkach folikularnych. Każdą reakcję (właściwą i kontrolną) powtarzano przynajmniej dwa razy dla danego przeciwciała i danej fazy oogenezy. W kilku niezależnych badaniach wykazano, że przeciwciała zastosowane w niniejszych analizach immunocytochemicznych rozpoznają antygeny występujące w oocy-tach owadów (Gall i wsp., 1995; Tsvetkov i wsp., 1997; Batalova i wsp., 2000; Bogolyubov i wsp., 2000; Bogolyubov i Parfenov, 2001; Biliński i Kloc, 2002; Batalova i wsp., 2005). W szczególności, wykazano techniką Western biot, że przeciwciało R288 rozpoznaje u owadów białko homologiczne z koiliną (p80-coiliri) ssaków (Bogolyubov i Parfenov, 2001; Batalova i wsp., 2005). 2.5. Hybrydyzacja in situ na poziomie ultrastrukturalnym Plazmid pBluescript o długości 79 nukleotydów zawierający fragment restrykcyjny EcoRI-XbaI genu kodującego U5 snRNA Xenopus laevis (dar J.G. Galla, Department of Embryology, Carnegie Institution, Baltimore, Maryland, USA) cięto enzymem Xbal. Antysensowną sondę RNA wyznakowaną digoksygeniną (DIG) syntetyzowano za pomocąT3 polimerazy RNA. Owariole do hybrydyzacji utrwalano w roztworze MEMFA (100 mM buforu MOPS (pH = 7,4), 2 mM EGTA, 1 mM MgSO₄, 3,7% aldehyd mrówkowy) w temperaturze 20°C przez 2 godz. Utrwalony materiał płukano kilkakrotnie w PBS i 0,01% Tween 20. Hybrydyzację ze zdenaturowaną sondą RNA prowadzano przez ok. 15 godz. w temperaturze 50°C. Po kilkakrotnym płukaniu w PBS z Tween 20, owariole inku-bowano przez 15 min w buforze G1 (Roche, Indianapolis, IN, USA), a następnie inku-bowano przez noc w temperaturze 4°C w buforze G2 (Roche) z przeciwciałem anti-DIG połączonym z 0,8 nm ziarnami złota koloidalnego (Roche) i rozcieńczonym w stosunku 1:30. Po kilkakrotnym płukaniu w PBS z dodatkiem Tween 20, owariole utrwalano w 2% roztworze aldehydu glutarowego w PBS z Tween 20, płukano w wodzie destylowanej i stosowano tzw. wzmocnienie srebrowe produktu hybrydyzacji za pomocą zestawu Light Insensitive Silver Enhancer (Nanoprobes, Stony Brook, NY, USA) przez ok. 45 min. Po kilkakrotnym płukaniu w wodzie destylowanej, owariole utrwalano w roztworze zawierającym 4% aldehyd mrówkowy, 2% aldehyd glutarowy, 100 mM KC1, 3 mM MgCh, 10 mM HEPES, 150 mM sacharozy i 0,1% Triton X-100 (pH = 7,6). Po odwodnieniu, owariole zatapiano w żywicy Epon 812. Ultracienkie skrawki seryjne kontrastowano octanem uranylu i cytrynianem ołowiu. Skrawki analizowano w mikroskopie elektronowym JEOL 100 SX przy napięciu przyspieszającym 80 kV. 3. WYNIKI 3.1. Jajniki i owa rióle Jajniki wszystkich badanych owadów są parzyste. Każdy jajnik zbudowany jest z niewielkiej liczby owariol: 2 u Anthonomus pomorum, 5 u Haematopinus suis i Co-lumbicola columbae, 5-7 u Vespula germánica, 6-8 u Pterostichus oblongopunctatus i 10-11 u Carabus violaceus. Wzdłuż przednio-tylnej (długiej) osi każdej z owariol można wyróżnić cztery rejony: filament końcowy, germarium, witelarium i nóżkę owa-rioli. Analiza histologiczna wykazała, że owariole badanych gatunków są meroistyczne i poza oocytami zawierają także komórki odżywcze (trofocyty). Przestrzenne rozmieszczenie komórek linii płciowej (tzn. trofocytów i oocytów) w owariolach wskazuje, że u badanych gatunków występują dwa wyraźnie odrębne typy owariol mero-istycznych: politroficzne u C. violaceus, P. oblongopunctatus, H. suis, C. columbae i V. germánica i telotroficzne u A. pomorum. W owariolach poi ¡troficznych witelaria wypełnione są ułożonymi liniowo, kolejno coraz większymi pęcherzykami jajnikowymi (komorami jajowymi). Pęcherzyki te mają organizację typową i zbudowane są z grupy komórek odżywczych oraz pojedynczego oocytu (tabl. 1A, 2A, 3A, 11A). Komórki linii płciowej (oocyty i trofocyty) otoczone są somatycznymi komórkami folikularnymi (tabl. 1A, 2A, 3A, 11A). Komory jajowe badanych gatunków różnią się przede wszystkim liczbą komórek odżywczych towarzyszących oocytowi. U przedstawicieli Phthiraptera w każdej komorze jajowej występuje 7 komórek odżywczych, u P. oblongopunctatus - 15, natomiast komory jajowe C. violaceus i V. germánica zawierają kilkadziesiąt tych komórek. W obrębie komory jajowej trofocyty zawsze zajmują jej rejon przedni, a oocyt - rejon tylny (tabl. 1 A, 3A, 11A). Komórki odżywcze przylegające do oocytu połączone są z nim mostkami cyto-plazmatycznymi (tabl. 2A, gwiazdki). Ten typ połączeń międzykomórkowych występuje też pomiędzy sąsiadującymi komórkami odżywczymi. W telotroficznych owariolach A. pomorum, podobnie jak w jajnikach innych chrząszczy z grupy Polyphaga, trofocyty występują tylko w obrębie silnie wydłużonego germarium (trofarium), a witelarium zawiera jedynie oocyty otoczone komórkami folikularnymi. Trofocyty połączone są z oocytami za pomocą sznurów odżywczych. Bez względu na typ owarioli, zachodzący w nich proces rozwoju oocytu (oogenezę) można podzielić na kolejno następujące po sobie stadia: prewitelogenezę, witelogenezę i choriogenezę; w obrębie tych stadiów rozróżniono fazę wczesną i późną. Przebieg oogenezy u badanych gatunków został już wcześniej opisany (Jaglarz, 1992, 1998; Zawadzka i wsp., 1997; Świątek, 1999, 2001, 2002; Żelazowska i Biliński, 1999, 2001; 30 Jabłońska i Biliński, 2001) i nie będzie szczegółowo prezentowany w niniejszym opracowaniu. W kolejnych podrozdziałach przedstawiona zostanie budowa pęcherzyka zarodkowego (jądra oocytu) (rozdz. 3.2) i charakterystyka zawartych w nim struktur: ciał jądrowych i kariosomu (rozdz. 3.3-3.4). Jądra dodatkowe i występujące w nich inkluzje opisane są w rozdz. 3.5. 3.2. Pęcherzyk zarodkowy U wszystkich badanych gatunków w oocytach wczesnoprewitelogenicznych pęcherzyk zarodkowy jest duży, kulisty lub jajowaty i leży blisko przedniego (tj. skierowanego ku trofocytom) bieguna oocytu (tabl. 1A, 3A, HA). W czasie prewitelogenezy osłonka jądrowa ulega pofałdowaniu, a całe jądro powiększa się i wydłuża (tabl. 2A, 2D). W tym samym okresie jądro przemieszcza się najpierw do środkowego, a następnie tylnego rejonu ooplazmy; pod koniec prewitelogenezy pęcherzyk zarodkowy lokuje się zwykle w warstwie korowej (powierzchniowej) oocytu (tabl. 2E, ryc. 3-1B). W wypełnionych materiałami zapasowymi oocytach (stadium witelogene-zy) pęcherzyk zarodkowy zachowuje mniej lub bardziej nieregularny kształt, a także powierzchniową lokalizację (tabl. 9B). W pęcherzykach zarodkowych badanych owadów chromatyna pozostaje rozproszona jedynie podczas wczesnej prewitelogenezy. W kolejnych fazach oogenezy chromatyna oddziela się od osłonki jądrowej, kondensuje i tworzy w optycznie przejrzystej nukleoplazmie zwartą strukturę, zwaną kariosomem (tabl. 2A, strzałka; 6A, gwiazdka; 9A, gwiazdka; 10B, strzałka). W oocytach późnoprewitelogenicznych i witelogenicz-nych skondensowana chromatyna zajmuje tylko niewielki rejon w obrębie pęcherzyka zarodkowego i zwykle występuje w pobliżu osłonki jądrowej (tabl. 2C, strzałka; 9D, gwiazdka). U wszystkich badanych gatunków kariosom wykazuje fluorescencję po barwieniu odczynnikiem DAPI i (lub) roztworem jodku propydyny (tabl. 2B, 2C, strzałka; 9C, 9D, gwiazdka; 10B, strzałka). Jedynie w jądrze oocytu A. pomorum kariosom otacza dodatkowa struktura - kapsuła kariosomu (tabl. 6A, strzałka; zob. rozdz. 3.3.2. Ciała jądrowe i powstawanie kapsuły kariosomu w pęcherzyku zarodkowym kwieciaka jabłkowca (Anthonomus pomorum)). W nukleoplazmie pęcherzyków zarodkowych występują mniej lub bardziej liczne i w różnym stopniu morfologicznie zróżnicowane inkluzje, zwane dalej ciałami jądrowymi. Ciała te pojawiają się w pęcherzykach zarodkowych już w stadium wczesnej prewitelogenezy, ale stają się szczególnie dobrze widoczne po powstaniu kariosomu. W trakcie oogenezy zmienia się morfologia i rozmieszczenie ciał jądrowych. Dodatkowo, u poszczególnych gatunków ciała te wykazują różne własności cytochemiczne i immunocytochemiczne. Z tego względu, szczegółowa analiza ciał jądrowych zostanie przedstawiona osobno dla każdej z badanych grup owadów. Należy zaznaczyć, że jądra siostrzanych względem oocytu komórek odżywczych mają odmienną organizację. Chromatyna w jądrach tych komórek jest rozproszona, a nukleoplazma zawiera liczne i dobrze rozwinięte jąderka (tabl. 1A, 2A, 3A). Wśród badanych owadów jedynie w oocytach V. germanica pęcherzykowi zarodkowemu towarzyszą charakterystyczne organelle, zwane jądrami dodatkowymi (akce- 31 sorycznymi) (tabl. 11 A, strzałki; ryc. 3-l.A, 3-1.B). W substancji podstawowej jąder dodatkowych występują inkluzje przypominające ciała jądrowe (tabl. 11A, 11C, 12A--12C, 14A-14C). Szczegółową charakterystykę tych ciał przedstawiono w rozdz. 3.5. Inkluzje w jądrach dodatkowych osy Vespula germanica. Skład molekularny inkluzji występujących w pęcherzykach zarodkowych i w jądrach dodatkowych analizowano za pomocą metod cytochemicznych i immunocyto-chemicznych. Rozmieszczenie DNA i RNA w jądrze oocytu badano w mikroskopie fluorescencyjnym, stosując barwienia odczynnikiem DAPI i (lub) roztworem jodku propydyny. Przeprowadzono także analizę występowania w badanych strukturach białek srebrochłonnych organizatora jąderkowego (metoda Ag-NOR). Badania immunocytochemiczne przeprowadzono na poziomie ultrastrukturalnym techniką immunogold polegającą na wykrywaniu antygenów za pomocą przeciwciał połączonych z ziarnami złota koloidalnego. Zastosowano przeciwciała rozpoznające dojrzałe cząstki U snRNP oraz białka charakterystyczne dla różnych struktur jądrowych: jąderka (nukleolina, fibrylaryna), ciała Cajala (koilina, SMN, pigpen, białka zepitopem Sm), a także spliceosomu (czynnik SC-35). Szczegółowy wykaz zastosowanych przeciwciał zawiera tab. 1 (zob. rozdz. 2.4. Przygotowanie materiału do analizy immunocytochemicznej). 3.3. Ciała jądrowe w pęcherzykach zarodkowych chrząszczy (Coleóptera) 3.3.1. Charakterystyka ciał jądrowych w oocytach biegaczowatych (Carabidae) W oocytach prewitelogenicznych, w optycznie przejrzystej nukleoplazmie pęcherzyka zarodkowego, oprócz kariosomu występuje od kilku do kilkudziesięciu ciał jądrowych (tabl. 1A, grot strzałki; 2A, groty strzałek; 3A, groty strzałek). Ciała te są silnie zróżnicowane pod względem wielkości i mierzą od 0,5 do 10 pm średnicy (tabl. IB). Wraz z rozwojem oocytu i powiększaniem się pęcherzyka zarodkowego liczba większych ciał jądrowych stopniowo maleje. W rezultacie, w oocytach późnoprewite-logenicznych i witelogenicznych występuje tylko jedno lub dwa duże, idealnie kuliste ciała, o średnicy dochodzącej do 30 pm (tabl. IB, 1C, groty strzałek; 2D, grot strzałki). Dużym ciałom jądrowym towarzyszy zmienna liczba ciał znacznie mniejszych, których średnica zwykle nie przekracza 1 pm (tabl. 1B-1D, 2D, 2E). Część ciał mniejszych bezpośrednio przylega do powierzchni ciała dużego, a niektóre z nich zagłębione są w jego warstwie korowej (tabl. ID, grot strzałki; 2D, 2E). Sugeruje to, że duże ciała jądrowe prawdopodobnie powstają w wyniku łączenia się ciał mniejszych. W czasie wczesnej prewitelogenezy ciała jądrowe zajmują centralny rejon nukleo-plazmy. Wraz z powiększaniem się objętości jądra oocytu ciała te przemieszczają się 32 i gromadzą w pobliżu jego osłonki (tabl. 1A, grot strzałki; 1C, 2A, groty strzałek; 2D). Niektóre ciała jądrowe przylegają do skondensowanej chromatyny (kariosomu), jednak większość występuje swobodnie w nukleoplazmie (tabl. 1A, 1C, 2A, groty strzałek; 3A, groty strzałek). Analiza rozmieszczenia ciał jądrowych w pęcherzykach zarodkowych oocytów w tych samych stadiach oogenezy wskazuje, że ciała te nie zajmują stałego, ściśle określonego położenia w nukleoplazmie. Badania ultrastrukturalne wykazały, że ciała jądrowe, zarówno o małej jak i dużej średnicy, zbudowane są z drobnowłóknistego materiału, mają zwartą strukturę, nie wykazują zróżnicowania na strefy lub rejony i nie zawierają ziaren przypominających rybosomy (tabl. IB, ID). 3.3.1.1. Analiza cytochemiczna i immunocytochemiczna Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym C. violaceus i P. oblongopunctatus barwią się intensywnie i równomiernie błękitem metylenowym (tabl. 1A, grot strzałki; 1C, 2A, 2D, 3A, groty strzałek), natomiast nie wykazują fluorescencji po zastosowaniu odczynnika DAPI (tabl. 2B, grot strzałki; 3C) ani roztworu jodku propydyny (tabl. 2C, grot strzałki). Dodatkowo, ciała te są pozytywne w reakcji wykrywającej białka srebro-chłonne organizatora jąderkowego metodą Ag-NOR (tabl. 2E, groty strzałek; 3B, groty strzałek). Lokalizacja czapeczki TMG (zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorą-cych udział w dojrzewaniu pre-mRNA) za pomocą przeciwciała K-l21 wykazała, że w oocytach prewitelogenicznych i witelogenicznych wszystkie ciała jądrowe, bez względu na ich wielkość, zawierają dojrzałe cząstki U snRNP (tabl. 3D, 4A, 5B, gwiazdka). Analiza rozmieszczenia ziaren złota koloidalnego ujawniła, że choć cząstki U snRNP występują na całym obszarze ciał jądrowych, nie są rozmieszczone równomiernie, lecz tworzą niewielkie lokalne zgrupowania (tabl. 3D, 4A, 5B). Sugeruje to, że cząstki U snRNP gromadzą się tylko w określonych rejonach zrębu ciał jądrowych. Podobnie nierównomiernie rozmieszczone są cząstki U snRNP także w cytoplazmie oocytu (tabl. 5B). Natomiast tylko nieliczne, pojedyncze ziarna złota występują nad nukleoplazmąpoza obrębem ciał jądrowych (tabl. 3D, 5B). Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Carabidae zawierają także białka rozpoznawane przez odpowiednie przeciwciała: pigpen (przeciwciało anty-pigpen) (tabl. 4B), koilinę (przeciwciało R288) (tabl. 3D wstawka; 4D) i białka z epitopem Sm (przeciwciało Y-12) (tabl. 4C), charakterystycznym m.in. dla białek rdzeniowych wchodzących w skład U snRNP (zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA). W analizowanych pęcherzykach zarodkowych, po zastosowaniu przeciwciał Y-12 i R288, znacznik (ziarna złota koloidalnego) występował prawie wyłącznie nad ciałami jądrowymi (tabl. 3D wstawka; 4C, 4D). Natomiast w przypadku przeciwciała rozpoznającego białko pigpen liczne ziarna złota koloidalnego występowały także nad nukleoplazmą otaczającą ciała jądrowe (tabl. 4B). Analiza skrawków seryjnych inkubowanych z wyżej wymienionymi przeciwciałami nie wykazała różnic w rozmieszczeniu znacznika nad ciałami jądrowymi, bez względu na wielkość tych ciał i ich położenie w obrębie pęcherzyka zarodkowego. W eksperymentach kontrolnych z pominięciem przeciwciał pierwszorzędowych zarówno ciała jądrowe, nukleoplazma, jak i ooplazma były negatywne (nie pokazano). 33 Należy dodać, że wynik reakcji immunocytochemicznej z zastosowaniem przeciwciał H-250 i A-16 (zob. rozdz. 2.4. Przygotowanie materiału do analizy immunocytochemicznej, tab. 1), rozpoznających odpowiednio nukleolinę i fibrylarynę w komórkach ssaków, w przypadku ciał jądrowych w pęcherzykach zarodkowych Carabidae był negatywny (nie pokazano). Dodatkowo, przeprowadzono analizę porównawczą rozmieszczenia dojrzałych cząstek U snRNP (wykrywanych metodą immunolokalizacji na poziomie ultrastruktural-nym) w oocycie i w komórkach odżywczych należących do tego samego pęcherzyka jajnikowego. Analiza skrawków seryjnych wykazała, że wzór rozmieszczenia cząstek U snRNP w cytoplazmie obu typów komórek jest podobny, natomiast istotne różnice występują w rozmieszczeniu tych cząstek na terenie jąder komórkowych (tabl. 5A, 5B). W nukleoplazmie komórek odżywczych znacznik występuje nad licznymi, niewielkimi i nieregularnymi skupieniami homogennego materiału (tabl. 5A, groty strzałek) oraz dodatkowo nad porami osłonki jądrowej, zarówno po stronie cytoplazmatycznej, jak i nukleoplazmatycznej (tabl. 5A wstawka). Jak już wcześniej wspomniano, w pęcherzyku zarodkowym znakowane są prawie wyłącznie ciała jądrowe (tabl. 5B, gwiazdka). 3.3.2. Ciała jądrowe i powstawanie kapsuły kariosomu w pęcherzyku zarodkowym kwieciaka jabłkowca (Anthonomus pomorum) W oocytach prewitelogenicznych (z wyjątkiem fazy wczesnej) i witelogenicznych występujący w pęcherzyku zarodkowym kariosom otoczony jest tzw. kapsułą kariosomu (tabl. 6A, strzałka). W oocytach wczesnoprewitelogenicznych w nukleoplazmie otaczającej formujący się kariosom występują liczne, nieregularne i różniące się wielkością skupienia elektronowo gęstego, ziarnisto-włóknistego materiału (tabl. 7A, strzałki) (Świątek, 1999; Świątek i Jaglarz, 2004). W czasie prewitelogenezy skupienia tego materiału łączą się ze sobą i tworzą wokół kariosomu cienką warstwę - zawiązek kapsuły kariosomu. Wraz z powiększaniem się jądra oocytu do już istniejącego zawiązku kapsuły kariosomu stopniowo dołączany jest nowy materiał (tabl. 7B, strzałki). W rezultacie, ściana kapsuły w oocytach późnoprewitelogenicznych i witelogenicznych osiąga ok. 2-5 pm grubości i wypełnia znaczną część pęcherzyka zarodkowego (tabl. 6A, strzałka; 7C) (Świątek, 1999; Świątek i Jaglarz, 2004). Po całkowitym uformowaniu się kapsuły kariosomu, z nukleoplazmy pęcherzyka zarodkowego znikają prawie wszystkie skupienia ziarnisto-włóknistego materiału. Badania ultrastrukturalne wykazały, że ściana kapsuły zbudowana jest z dwóch warstw: przylegającej bezpośrednio do skondensowanej chromatyny cienkiej (ok. 50--60 nm grubości) i zwartej warstwy wewnętrznej (1) oraz kontaktującej się z nukleo-plazmą, znacznie grubszej, gąbczastej warstwy zewnętrznej (2) (tabl. 7C, 8B) (Świątek, 1999; Świątek i Jaglarz, 2004). Analiza immunocytochemiczna ujawniła, że warstwy kapsuły kariosomu różnią się także składem molekularnym (zob. rozdz. 3.3.2.I. Analiza cytochemiczna i immunocytochemiczna). W okresie prewitelogenicznego wzrostu oocytu w nukleoplazmie pęcherzyka zarodkowego, oprócz nieregularnych skupień ziarnisto-włóknistego materiału, pojawiają 34 się także kuliste inkluzje o średnicy 0,1-0,5 pm, zwane dalej ciałami jądrowymi (tabl. 6B, 7B, groty strzałek) (Świątek, 1999; Świątek i Jaglarz, 2004). Analiza ultrastruktu-ralna materiału utrwalonego do badań immunocytochemicznych pozwoliła rozróżnić dwa morfologicznie odmienne typy tych ciał: ciała jądrowe zbudowane z materiału drobnoziarnisto-włóknistego (typ 1) (tabl. 6B, 7B, 8A) i ciała jądrowe zawierające charakterystyczne elektronowo gęste włókna, które na przekroju poprzecznym mają średnicę ok. 15 nm (typ 2) (tabl. 6B, 8A, 8B, groty strzałek). Choć w pęcherzyku zarodkowym A. pomorum ciała jądrowe mogą występować we wszystkich rejonach nu-kleoplazmy, najczęściej gromadzą się w pobliżu nieregularnych wypustek osłonki jądrowej (tabl. 6A, 6B) lub przylegają do zewnętrznej warstwy kapsuły kariosomu (tabl. 6A, 7B, 8A, 8B). 3.3.2.1. Analiza cytochemiczna i immunocytochemiczna Analiza skrawków półcienkich barwionych odczynnikiem DAPI ujawniła, że DNA występuje jedynie w kariosomie i że zarówno kapsuła kariosomu, jak i ciała jądrowe są DAPl-negatywne (nie pokazano; Świątek i Jaglarz, 2004). Dodatkowo, we wszystkich stadiach oogenezy kariosom, jego kapsuła i oba typy ciał jądrowych są Ag-NOR--negatywne (Świątek i Jaglarz, 2004). Analiza rozmieszczenia dojrzałych cząstek U snRNP, wykrywanych za pomocą przeciwciała K.-121, wykazała, że w prewitelogenicznych oocytach cząstki te występują w nieregularnych skupieniach materiału ziarnisto-włóknistego leżących w pobliżu lub przylegających do powstającej kapsuły kariosomu, a także na terenie kariosomu (tabl. 7A, strzałki; 7B, strzałki). W pęcherzykach zarodkowych, zawierających całkowicie uformowaną kapsułę kariosomu, znacznik (ziarna złota koloidalnego) występuje nad zewnętrzną gąbczastą warstwą kapsuły oraz jej odgałęzieniami, natomiast warstwa wewnętrzna kapsuły jest negatywna (tabl. 7C). Taki sam „wzór” rozmieszczenia znacznika nad kapsułą kariosomu utrzymuje się także w późniejszych stadiach rozwoju oocytu. Ciała jądrowe, zarówno typu pierwszego jak i drugiego, we wszystkich stadiach oogenezy były negatywne (tabl. 6B, groty strzałek; 7B, groty strzałek; 8A, groty strzałek). W eksperymentach kontrolnych z pominięciem przeciwciała pierwszorzędo-wego obie warstwy kapsuły kariosomu, skupienia ziarnisto-włóknistego materiału w nukleoplazmie oraz ciała jądrowe były zawsze negatywne (nie pokazano). Należy dodać, że analiza skrawków inkubowanych z przeciwciałem K.-121 ujawniła występowanie dojrzałych cząstek U snRNP także w cytoplazmie prewitelogenicznych i witelogenicznych oocytów (tabl. 6B). Prowadzona równolegle analiza rozmieszczenia białek z epitopem Sm, wykrywanych za pomocą przeciwciała Y-12 metodą immunogold, wykazała, że białka te występują jedynie w zewnętrznej, gąbczastej warstwie kapsuły kariosomu (tabl. 8B). W eksperymentach kontrolnych z pominięciem przeciwciała pierwszorzędowego kapsuła kariosomu była zawsze negatywna (nie pokazano). W ostatnich latach wykazano, że przeciwciało Y-12 rozpoznaje symetrycznie me-tylowane powtórzenia dwupeptydowe (zbudowane z argininy i glicyny), które, oprócz białek Sm, występują także w koilinie, znaczniku molekularnym ciał Cajala (Brahms i wsp., 2000; Hebert i wsp., 2002). Chcąc dokładniej określić, jakie białka, występują 35 w kapsule kariosomu, zastosowano przeciwciała rozpoznające koilinę. Zarówno mo-noklonalne, jak i poliklonalne przeciwciała (zob. rozdz. 2.4. Przygotowanie materiału do analizy immunocylochemicznej, tab. 1) wykazały obecność tego białka w ooplazmie i wolnej od inkluzji nukleoplazmie, natomiast ciała jądrowe i kapsuła kariosomu były negatywne (nie pokazano). Ponieważ białka Sm są składnikami dojrzałych cząstek U snRNP biorących udział w składaniu pre-mRNA (zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA), interesujące wydawało się sprawdzenie, czy także inne czynniki zaangażowane w obróbkę pierwotnych transkryptów występują w kapsule kariosomu. W tym celu użyto przeciwciało rozpoznające czynnik SC-35 (zob. rozdz. 2.4. Przygotowanie materiału do analizy immunocylochemicznej, tab. 1), który jest niezbędny do prawidłowego składania cząsteczek pre-mRNA (Fu i Maniatis, 1990). Analiza przeprowadzonej reakcji immunocytochemicznej wykazała, że czynnik SC-35 występuje w nukleoplazmie jąder komórek folikulamych, ale nie w żadnej ze struktur pęcherzyka zarodkowego (nie pokazano). 3.4. Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Phthiraptera Phthiraptera obejmują dwie grupy owadów: wszy (Anoplura) i wszoły (Mallopha-ga). Badania przeprowadzono na gatunkach należących do obu tych grup: wszy świńskiej i wszole gołębim. Ze względu na istotne różnice, budowa pęcherzyka zarodkowego zostanie przedstawiona oddzielnie dla każdego gatunku. 3.4.1. Pęcherzyk zarodkowy wszy świńskiej (Haematopinus suis) W pęcherzyku zarodkowym, oprócz skondensowanej chromatyny (kariosomu), występują także liczne, mniej lub bardziej kuliste ciała jądrowe (tabl. 9A, groty strzałek) (Żelazowska, 2000). W oocytach wczesnoprewitelogenicznych struktury te mają średnicę 2-4 pm, rozmieszczone są nieregularnie w nukleoplazmie i, jak wykazały badania ultrastrukturalne, zawierają rejony o różnej gęstości elektronowej (Żelazowska, 2000; Żelazowska i Jaglarz, 2004). Pod koniec prewitelogenezy ciała jądrowe migrują w pobliże kariosomu (tabl. 9A, groty strzałek). Dodatkowo, w oocytach późnoprewitelogenicznych w pęcherzykach zarodkowych występują kuliste skupienia drobnoziarnistego, elektronowo gęstego materiału, które początkowo przylegają do osłonki jądrowej lub występują w jej pobliżu (tabl. 9A, strzałki). Dla odróżnienia od pozostałych ciał jądrowych struktury te zostały nazwane gęstymi ciałami peryferycznymi (Żelazowska, 2000). W okresie witelogenezy gęste ciała peryferyczne przemieszczają się ku środkowej części pęcherzyka zarodkowego i wraz z kariosomem oraz pozostałymi ciałami jądrowymi tworzą nieregularną, poli-morficzną strukturę (Żelazowska i Jaglarz, 2004). 36 3.4.1.1. Analiza cytochemiczna i immunocytochemiczna Analiza cytochemiczna wykazała, że zarówno ciała jądrowe, jak i gęste ciała pery-feryczne są Ag-NOR-pozytywne (tabl. 9B, groty strzałek i strzałka), DAPI-negatywne (tabl. 9C) i wykazują fluorescencję po barwieniu roztworem jodku propydyny (tabl. 9D, groty strzałek i strzałka). Porównanie wyników barwienia seryjnych skrawków półcienkich metodą Ag-NOR, odczynnikiem DAPI i roztworem jodku propydyny potwierdziło, że przynajmniej część ciał jądrowych występuje w kontakcie z kariosomem (tabl. 9D, groty strzałek). Dalszą analizę składu molekularnego ciał jądrowych przeprowadzono za pomocą kilkunastu przeciwciał (lista przeciwciał w tab. 1, rozdz. 2.4. Przygotowanie materiału do analizy immunocytochemicznej), stosując metodę immunogold. W przypadku wszystkich przeciwciał, bez względu na sposób utrwalenia materiału (zob. rozdz. 2.4), ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym były negatywne (tabl. 9F). Jednocześnie jednak w przypadku przeciwciała K.-121 ziarna złota koloidalnego występowały nad cytoplazmą oocytu i komórek folikularnych otaczających oocyt (tabl. 9E, grot strzałki). Dodatkowo, znacznik występował także nad skupieniami nukleoplazmy w jądrach komórek folikularnych (tabl. 9E, strzałki). W eksperymentach kontrolnych z pominięciem przeciwciała pierwszorzędowego cytoplazma i nukleoplazma zarówno w oocy-tach, jak i komórkach folikularnych były negatywne (nie pokazano). 3.4.2. Pęcherzyk zarodkowy wszola gołębiego (Columbicola columbae) Badania ultrastrukturalne wykazały, że w nukleoplazmie pęcherzyka zarodkowego, oprócz kariosomu, występują także różnej wielkości skupiska elektronowo gęstego, drobnoziarnistego materiału (tabl. 10C, groty strzałek). Materiał ten jest Ag-NOR--pozytywny (tabl. 10A, groty strzałek) i nie wykazuje fluorescencji po zastosowaniu odczynnika DAPI (tabl. 10B). Podobnie jak u innych badanych gatunków, w pęcherzyku zarodkowym jedynie kariosom jest DAPI-pozytywny (tabl. 10B, strzałka). W czasie witelogenezy osłonka jądra oocytu ulega silnemu pofałdowaniu. Powstające fałdy mają kształt kopuł szeroko połączonych z jądrem (tabl. 10C). W wypełniającej fałdy nukleoplazmie występują owalne obszary o niskiej gęstości elektronowej (tabl. 10C, gwiazdka), którym towarzyszą wspomniane wcześniej skupiska materiału drobnoziarnistego (tabl. 10C, groty strzałek). Dodatkowo, w nukleoplazmie, tuż pod osłonką jądrową, występują regularnie rozmieszczone niewielkie skupienia ziarnisto--włóknistego materiału (tabl. 10C, strzałki). 37 3.5. Inkluzje w jądrach dodatkowych osy Vespula germanica W oocytach wczesnoprewitelogenicznych w cytoplazmie otaczającej pęcherzyk zarodkowy występują różnej wielkości, mniej lub bardziej kuliste jądra dodatkowe (tabl. 11 A, strzałki). Te charakterystyczne organelle otoczone są podwójną, przebitą porami osłonką, która oddziela ich zawartość od przylegającej ooplazmy (tabl. 1 IB, 11C, 12A--12C, groty strzałek). W „cyklu życiowym” jąder dodatkowych można wyróżnić kilka stadiów, które schematycznie przedstawiono na ryc. 3-1 i 3-2A. Organelle te pączkują z jądra oocytu i początkowo utrzymują z nim łączność za pomocą wydłużonej szypuły (stadium 1; ryc. 3-2A, tabl. 1 IB). W okresie wczesnej prewitelogenezy jądra dodatkowe oddzielają się od pęcherzyka zarodkowego, jednak jeszcze przez pewien czas pozo-stają w otaczającej go cytoplazmie (stadium 2; ryc. 3-2A, tabl. 11 A, 1 IB). W tym okresie dochodzi także do zmian w substancji podstawowej wypełniającej jądra dodatkowe (podstadia: 2a i 2b; zob. dalej). W kolejnych fazach oogenezy jądra dodatkowe, podobnie jak pęcherzyk zarodkowy, przemieszczają się do warstwy korowej oocytu (stadium 3; ryc. 3-1B, 3-2A), gdzie pozostają przynajmniej do momentu reinicjacji mejozy (stadium 4). U V. germanica jądra akcesoryczne nie występują jedynie w warstwie korowej tylnego bieguna oocytu (ryc. 3-1B). Pod koniec stadium 2 każde jądro dodatkowe zawiera dwie gęste inkluzje zanurzone w substancji podstawowej (tabl. 11C). Jedna z tych inkluzji ma złożoną budowę i składa się z idealnie kulistego, jednorodnie drobnoziarnistego ciała, do którego przylega elektronowo gęste skupisko gruboziarnistego materiału, o nieregularnym, półkuli-stym zarysie (tabl. 11C, strzałka; 12A, strzałka; 12B, strzałka). Druga inkluzja, także o kształcie kulistym, zbudowana jest z materiału drobnowlóknistego (tabl. 11C, grot strzałki; 12C, strzałka). Z wcześniejszych badań Bilińskiego i Kloc (2002) wynika, że idealnie kuliste ciało występujące w jądrach dodatkowych V. germanica jest homologiczne z ciałem Cajala. 3.5.1. Ciała Cajala w jądrach dodatkowych Analiza immunocytochemiczna oocytów w różnych stadiach oogenezy, przeprowadzona za pomocą kilkunastu przeciwciał (zob. rozdz. 2.4. Przygotowanie materiału do analizy immunocytochemicznej, tab. 1), wykazała, że struktury występujące w jądrach dodatkowych zawierają antygeny rozpoznawane przez cztery z tych przeciwciał: R288, Y-12, K-121 i H-195 (tabl. 11C, 12A, 12B; zob. też Biliński i Kloc, 2002). Przeciwciała te rozpoznają odpowiednio: koilinę, białka z epitopem Sm, dojrzałe cząstki U snRNP i białko SMN. Takie same wyniki uzyskano w przypadku oocytów utrwalanych różnymi metodami (zob. rozdz. 2.4. Przygotowanie materiału do analizy immu-nocytochem icznej). W obrębie jąder dodatkowych przeciwciało H-195, podobnie jak przeciwciała R288, Y-12 i K-121, silnie znakuje ciało Cajala (tabl. 11C, 12A). Pozostałe inkluzje, w tym półkulista ziarnista struktura przylegająca do ciała Cajala, są negatywne i ich 38 skład molekularny pozostaje nieznany (tabl. 11C, 12C). Przykładowo, przy zastosowaniu przeciwciała P2G3, rozpoznającego fibrylarynę, znacznik występuje nad jąderkiem w jądrach komórek folikulamych, natomiast inkluzje w jądrach dodatkowych są negatywne (tabl. 12C, 12D). Biorąc pod uwagę rezultaty uzyskane metodą immunogold, w dalszych badaniach skupiono się tylko na ciałach Cajala i prześledzono, wykorzystując przeciwciała H-195 i K-121, powstawanie tych struktur w jądrach dodatkowych, a także ich dalsze losy podczas oogenezy. W oocytach wczesnoprewitelogenicznych nowo powstałe jądra dodatkowe (stadium 1) nie zawierają ciał Cajala (tabl. 1 IB), a wypełniająca je substancja podstawowa jest negatywna przy zastosowaniu metody immunogold (nie pokazano). W oocytach zawierających jądra dodatkowe w stadium 2a antygeny rozpoznawane przez przeciwciała H-195 i K-121 występują w niewielkich (ok. 20 nm średnicy), nieregularnych skupieniach materiału drobnoziarnistego leżących zarówno w cytoplazmie otaczającej jądra dodatkowe, jak i w substancji podstawowej wypełniającej jądra dodatkowe (tabl. 13A, 13B; strzałki). Analiza skrawków seryjnych ujawniła, że skupienia materiału zawierającego białko SMN i dojrzałe cząstki U snRNP często występują w pobliżu zewnętrznej (tzn. przylegającej do cytoplazmy) i wewnętrznej (tzn. przylegającej do substancji podstawowej) błony osłonki jąder dodatkowych (tabl. 13A, 13B; owale). W substancji podstawowej jąder dodatkowych w stadium 2a występują także większe (ok. 250 nm średnicy) nagromadzenia materiału drobnoziarnistego, o zarysie nieregularnym. Nagromadzenia te reprezentują prawdopodobnie inicjalne ciała Cajala (tabl. 14A, gwiazdka). Antygeny rozpoznawane zarówno przez przeciwciało K-121, jak i H-195 występują głównie w peryferyjnym rejonie inicjalnego ciała Cajala (tabl. 14A), a także w niewielkich skupieniach materiału drobnoziarnistego przylegających do tego ciała lub leżących w jego pobliżu (tabl. 14A, strzałki). W jądrach dodatkowych w stadiach 2b i 3 ciała Cajala mają zwartą strukturę, są prawie idealnie kuliste i zawierają białko SMN i dojrzałe cząstki U snRNP (tabl. 14B, 14C). Antygeny te występują także w krótkich pasmach drobnoziarnistego materiału łączących się z powierzchnią ciał Cajala (tabl. 14B, strzałki; 14C, strzałki). Warto w tym miejscu dodać, że w cytoplazmie otaczającej jądra dodatkowe (stadium 2) występują liczne mikrotubule (tabl. 13C, strzałki). Niewielkie, nieregularne skupienia materiału drobnoziarnistego przylegające do tych mikrotubul zawierają zarówno białko SMN, jak i dojrzałe cząstki U snRNP (tabl. 13C wstawka). Chcąc ustalić dalsze losy ciał Cajala, przeprowadzono analizę ultrastrukturalną jąder dodatkowych występujących w warstwie korowej oocytów późnoprewitelogenicz-nych i witelogenicznych (stadium 4, ryc. 3-2B). Badania te wykazały, że pod koniec prewitelogenezy ciała Cajala tracą swą zwartą strukturę i stopniowo rozpadają się na mniejsze, połączone ze sobą fragmenty (tabl. 15B). Zastosowanie przeciwciała K-121 i metody immunogold pozwoliło stwierdzić, że rozproszony materiał pochodzący z ciała Cajala nadal zawiera dojrzałe cząstki U snRNP (tabl. 15B). Początkowo, rozpadające się ciało Cajala zajmuje ograniczony rejon w obrębie jądra dodatkowego (tabl. 15A, 15B), w końcu jednak jego składniki całkowicie rozpraszają się w substancji podstawowej jądra dodatkowego (tabl. 15C; procesy te przedstawiono schematycznie na ryc. 3-2B). Hybrydyzacja in situ z sondą dla U5 snRNA ujawniła, że po rozpadzie ciała Cajala, w substancji podstawowej jąder dodatkowych występują cząsteczki U5 snRNA (tabl. 15D). Choć cząsteczki U5 snRNA rozproszone są w całej objętości jądra dodatkowego, nie przedostają się przez jego osłonkę i nie są wykrywane w otaczającej cytoplazmie, nawet w oocytach późnowitelogenicznych (tabl. 15D). 4. DYSKUSJA Przeprowadzone badania ultrastrukturalne, cytochemiczne i immunocytochemiczne wykazały, że w pęcherzykach zarodkowych owadów występują co najmniej dwie klasy ciał jądrowych. Pierwszą klasę tworzą silnie morfologicznie zróżnicowane ciała jądrowe, które są DAPI-negatywne, wykazują fluorescencję po barwieniu roztworem jodku propydyny i z reguły zawierają białka srebrochłonne organizatora jąderkowego. Ciała te nie znakują się przeciwciałami rozpoznającymi koilinę i dojrzałe cząstki U snRNP. Do tej klasy należą przede wszystkim ciała jądrowe występujące w pęcherzykach zarodkowych Phthiraptera, ciała towarzyszące kapsule kariosomu A. pomorum (ciała te są Ag-NOR negatywne), a także niektóre inkluzje (pseudojąderka) w jądrach dodatkowych błonkówek. Skład molekularny i rola tych struktur pozostają nieznane. Ciała jądrowe należące do drugiej klasy charakteryzują się idealnie kulistym kształtem i stosunkowo jednorodną budową ultrastrukturalną. Organelle te wykazują fluorescencję po barwieniu odczynnikiem DAP1 i roztworem jodku propydyny oraz barwią się solami srebra po zastosowaniu metody Ag-NOR. Analiza immunocytoche-miczna wykazała, że ciała te zawierają koilinę, dojrzałe cząstki U snRNP oraz białka wiążące się z RNA: pigpen, Sm i SMN. Struktury reprezentujące tę klasę ciał jądrowych występują w pęcherzyku zarodkowym chrząszczy z rodziny biegaczowatych oraz w jądrach dodatkowych błonkówek. Zarówno cechy morfologiczne, własności cytochemiczne, jak i skład molekularny wskazują na podobieństwo tych struktur do ciał Cajala. Zanim przedstawiona zostanie rola tych organelli w pęcherzyku zarodkowym (zob. rozdz. 5.1. Rola ciał Cajala w pęcherzyku zarodkowym), przedyskutowane zostaną wyniki prezentowanych w niniejszym opracowaniu badań cytochemicznych i immunocytochemicznych różnych struktur występujących w jądrach oocytów owadów. Struktury te schematycznie przedstawiono na ryc. 4-1. 4.1. Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Carabidae Analiza ultrastrukturalna i cytochemiczna ciał jądrowych w pęcherzykach zarodkowych Carabus violaceus i Pterostichus oblongopunctatus wykazała, że struktury te są idealnie kuliste, zbudowane z jednorodnego, drobnowłóknistego materiału i zawierają białka srebrochłonne organizatora jąderkowego. Występowanie w analizowanych ciałach jądrowych białek srebrochłonnych sugeruje ich podobieństwo do jąderek, gdyż 40 właśnie te organelle barwią się intensywnie przy zastosowaniu metody Ag-NOR. Jednakże ciała jądrowe Carabidae nie wykazują typowego dla jąderek zróżnicowania na składnik włóknisty i ziarnisty; nie zawierają też DNA. Z badań Raska i wsp. (1990) wynika, że w jądrach komórek ssaków Ag-NOR-pozytywne, oprócz włóknistego składnika jąderka, są także ciała Cajala. Wskazuje to, że kuliste ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Carabidae mogą odpowiadać ciałom Cajala. Założenie to zostało potwierdzone w badaniach immunocytochemicznych, które wykazały, że ciała jądrowe Carabidae zawierają dojrzałe cząstki U snRNA oraz charakterystyczne dla ciał Cajala białka: koilinę, pigpen i białka Sm kompleksu rdzeniowego (zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA). W pęcherzykach zarodkowych Carabidae białka te występują prawie wyłącznie w ciałach jądrowych. W przypadku przeciwciała rozpoznającego białko pigpen znacznik dodatkowo występował nad nukleoplazmą poza ciałami jądrowymi. Jest to zgodne z rozmieszczeniem białka pigpen w komórkach interfazowych ssaków. W jądrach tych komórek białko pigpen występuje w nukleoplazmie, przy czym wyraźnie kumuluje się w ciałach Cajala i nie występuje w jąderku (Alliegro i Alliegro, 1996). Immunolokalizacja cząstek U snRNP za pomocą przeciwciała K.-121 ujawniła, że cząstki te występują zarówno w ciałach jądrowych (ciałach Cajala), jak i w cytopla-zmie oocytu. Wynik ten jest zgodny z obecnie przyjętym modelem biogenezy U snRNP (zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA). Należy zaznaczyć, że przeciwciało K-121 rozpoznaje jedynie dojrzałe cząstki U snRNP, zawierające na końcu 5' czapeczkę TMG. Prawie zupełny brak znakowania w nukleoplazmie może wskazywać, że dojrzałe cząstki U snRNP, po wniknięciu do pęcherzyka zarodkowego, są stosunkowo szybko transportowane do ciał Cajala. Wskazują na to również różnice w rozmieszczeniu dojrzałych cząstek U snRNP w jądrze oocytu i jądrach komórek odżywczych. W nukleoplazmie komórek odżywczych cząstki U snRNP występują w drobnych, nieregularnych skupieniach elektronowo gęstego materiału, które prawdopodobnie odpowiadają zespołom ziarnistości inter-chromatynowych (ang. speckles) w jądrach interfazowych komórek ssaków (Lamond i Carmo-Fonseca, 1993b; Spector, 1993). Wyniki te dobrze obrazują różnice w aktywności metabolicznej jądra w komórkach odżywczych i w oocycie w politroflcznym jajniku Carabidae. W pęcherzyku zarodkowym tych chrząszczy chromatyna wcześnie kondensuje w kariosom (Bier, 1965; Bier i wsp., 1967). Badania autoradiograficzne wykazały, że w tej grupie owadów pęcherzyk zarodkowy, w przeciwieństwie do jąder komórek odżywczych, nie inkorporuje znakowanej urydyny i jest aktywny transkryp-cyjnie jedynie na początku prewitelogenezy (Bier, 1965; Bier i wsp., 1967). Występowanie na terenie ciał jądrowych antygenów rozpoznawanych zarówno przez przeciwciało K-121, jak i Y-12 wskazuje, że przynajmniej część cząstek U snRNP zlokalizowanych w tych ciałach należy do klasy U snRNP uczestniczących w obróbce mRNA (zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA). Biorąc pod uwagę, że w trakcie oogenezy w pęcherzyku zarodkowym Carabidae nie ma dużego zapotrzebowania na czynniki związane z obróbką pierwotnych transkryptów, można przypuszczać, że U snRNP gromadzone są w ciałach Cajala do późniejszego wykorzystania (zob. też rozdz. 5.1. Rola ciał Cajala w pęcherzyku zarodkowym). Podsumowując, kuliste ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym chrząszczy z rodziny biegaczowatych (Carabidae) przypominają ciała Cajala zarówno pod względem 41 budowy morfologicznej, własności cytochemicznych, jak i składu molekularnego. Pozwala to uznać te organelle jądrowe za struktury homologiczne. 4.2. Ciała jądrowe i kapsuła kariosomu w pęcherzyku zarodkowym Anthonomus pomorum W czasie prewitelogenezy w pęcherzyku zarodkowym A. pomorum dokoła kariosomu stopniowo powstaje kapsuła (Świątek, 1999; Świątek i Jaglarz, 2004). W trakcie tego procesu w nukleoplazmie pojawiają się dwa morfologicznie odrębne rodzaje ciał jądrowych. Barwienie odczynnikiem DAPI wykazało, że w pęcherzyku zarodkowym DNA występuje wyłącznie w kariosomie (Świątek, 1999; Świątek i Jaglarz, 2004). Dodatkowo, srebrzenie organizatorów jąderkowych (metoda Ag-NOR) ujawniło, że ani kapsuła kariosomu, ani ciała jądrowe nie zawierają białek srebrochłonnych (Świątek i Jaglarz, 2004). Ciała jądrowe są też negatywne przy zastosowaniu przeciwciał R288, K.-121 i Y-12 w metodzie immunogold. Skład molekularny tych struktur jądrowych pozostaje więc nieznany. Badania zespołu kierowanego przez Parfenova wykazały, że u chrząszcza Tenebrio molitor, podobnie jak u A. pomorum, chromatyna w pęcherzyku zarodkowym konden-suje w kariosom, który jednakże, w przeciwieństwie do kariosomu u A. pomorum, nie jest otoczony kapsułą (Tsvetkov i wsp., 1997; Bogolyubov i wsp., 2000; Bogolyubov i Parfenov, 2001, 2004). W pęcherzyku zarodkowym T. molitor czynniki zaangażowane w powstawanie i obróbkę cząsteczek RNA, takie jak polimeraza RNA klasy II, cząstki U snRNP i niezbędny czynnik splicingu SC-35, występują w różniących się morfologicznie ciałach jądrowych (Tsvetkov i wsp., 1997; Bogolubov i wsp., 2000; Bogolyubov i Parfenov, 2001, 2004). Choć w pęcherzyku zarodkowym A. pomorum występują ultrastrukturalnie podobne ciała jądrowe, jednak są one negatywne po zastosowaniu przeciwciał rozpoznających cząstki U snRNP, czynnik SC-35 i polimerazę RNA klasy II. Występowanie tych różnic sugeruje, że u omawianych gatunków chrząszczy ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym mają odmienny skład molekularny i przypuszczalnie pełnią inną funkcję. W pęcherzyku zarodkowym A. pomorum ciała jądrowe występują zarówno w pobliżu osłonki jądrowej, jak i kapsuły kariosomu, co wydaje się wskazywać na ich zaangażowanie w transport nieznanych bliżej składników z cytoplazmy do kapsuły kariosomu. Do zweryfikowania tej hipotezy niezbędne są jednak dalsze badania składu molekularnego tych organelli jądrowych. W pęcherzykach zarodkowych wielu bezkręgowców, jak i kręgowców, chromatyna kondensuje w kariosom (zob. artykuł przeglądowy: Gruzova i Parfenov, 1993). Znacznie rzadziej kariosom otoczony jest dodatkowym materiałem tworzącym kapsułę. U owadów proces powstawania kapsuły kariosomu analizowano głównie u siatko-skrzydłych (Neuroptera) (Gruzova i wsp., 1972; Gruzova i Parfenov, 1993; Riibsam i Buning, 2001). U tych owadów formowanie kapsuły zachodzi w okresie amplifikacji 42 rDNA i tworzenia się jąderek wielokrotnych (Gruzova i wsp., 1972; Gruzova i Parfenov, 1993; Kubrakiewicz i Biliński, 1995; Kubrakiewicz, 1998, 2002). Dlatego uważa się, iż w pęcherzyku zarodkowym siatkoskrzydłych kapsuła oddziela nieaktywny tran-skrypcyjnie kariosom od rejonu nukleoplazmy, w którym przebiega intensywna transkrypcja zwielokrotnionych (zamplifikowanych) genów rDNA (Gruzova i Parfenov, 1993; Riibsam i Biining, 2001). W oocytach A. pomorum funkcja kapsuły jest najprawdopodobniej inna, gdyż u tego gatunku nie stwierdzono amplifikacji genów ryboso-mowych (Świątek, 1999). W pęcherzyku zarodkowym A. pomorum zewnętrzna warstwa kapsuły kariosomu jest pozytywna przy zastosowaniu przeciwciał K-121 i Y-12, co wskazuje na występowanie dojrzałych cząstek U snRNP w tej strefie kapsuły. Tymi samymi przeciwciałami znakują się także drobne skupienia ziamisto-włóknistego materiału leżące w pobliżu lub przylegające do zewnętrznej warstwy kapsuły. Na tej podstawie można przypuszczać, że cząstki U snRNP, po wniknięciu do jądra oocytu (zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniupre-mRNA), są stopniowo gromadzone w powstającej kapsule. Nie wiadomo, w jaki sposób dochodzi do „zakotwiczenia” cząstek U snRNP w materiale kapsuły. Przypuszczalnie, w trakcie przemieszczania się w nukleoplazmie cząstki te mogą być selektywnie zatrzymywane przez gąbczasty materiał zewnętrznej warstwy kapsuły kariosomu. Nie można jednak wykluczyć, że cząstki U snRNP wiążą się z określonym składnikiem kapsuły kariosomu, np. z filamentami aktynowymi, które licznie w niej występują (Świątek, 1999). Warto w tym miejscu dodać, że F-aktynę wykryto również w kapsule kariosomu innych gatunków ryjkowców, a także u siatkoskrzydłych (Neuroptera) (Świątek, 1999; Riibsam i Biining, 2001). Nie wiadomo jednak, czy i u tych owadów w kapsule kariosomu gromadzą się dojrzałe cząstki U snRNP. Rola filamentów aktynowych w pęcherzyku zarodkowym A. pomorum jest nieznana. Wiadomo jednak, że aktyna, zarówno w formie monomerycznej tzw. G-aktyny jak i w postaci mikrofilamentów, występuje w jądrach wielu typów komórek, od drożdży do ssaków (zob. artykuły przeglądowe: Rando i wsp., 2000; Olave i wsp., 2002; Pederson i Aebi, 2003; Shumaker i wsp., 2003; Blessing i wsp., 2004). Uważa się, że aktyna jądrowa (i związane z nią białka) bierze udział m.in. w przekształcaniu organizacji chromatyny, w procesach transkrypcji zachodzących przy udziale polimeraz klas I, II i III oraz w obróbce i w transporcie różnych klas RNA (Scheer i wsp., 1984; Sauman i Berry, 1994; Parfenov i wsp., 1995; Wasser i Chia, 2000; Hofmann i wsp., 2001, 2004; Percipalle i wsp., 2001, 2002, 2003; Krauss i wsp., 2003; Bettinger i wsp., 2004; Franke, 2004; Hu i wsp., 2004; Philimonenko i wsp., 2004; Zhang i wsp., 2004b; Lane-rolle i wsp., 2005). Badania biochemiczne wykazały, że aktyna jądrowa może łączyć się kompleksami jądrowych heterogenicznych rybonukleoprotein, jak również z cząstkami U snRNP (Nakayasu i Ueda, 1984; Ueyama i wsp., 1987; Sahlas i wsp., 1993; Percipalle i wsp., 2002, 2003; Kukalev i wsp., 2005). Na tej podstawie zaproponowano, że aktyna jądrowa jest odpowiedzialna za właściwy montaż kompleksów rybonu-kleoproteinowych i (lub) za ich przemieszczanie w obrębie nukleoplazmy (De Boni, 1994; Percipalle i wsp., 2001, 2002; Bettinger i wsp., 2004; Lanerolle i wsp., 2005). Warto również dodać, że niedawno przeprowadzone badania wskazują na udział aktyny jądrowej w formowaniu kariosomu w pęcherzyku zarodkowym Drosophila mela-nogaster (Djagaeva i wsp., 2005). 43 Wydaje się, że filamenty aktynowe występujące w kapsule kariosomu Anthonomus mogą być zaangażowane w kilka procesów, m.in. mogą brać udział w końcowej fazie kondensacji chromatyny w kariosom, a następnie, wraz z innymi białkami, tworzyć warstwę ochronną dokoła materiału genetycznego. Dodatkowo, mogą też uczestniczyć w wychwytywaniu i magazynowaniu dojrzałych cząstek U snRNP. Proponowane funkcje wzajemnie się nie wykluczają. Wyniki analizy immunocytochemicznej pęcherzyka zarodkowego Anthonomus potwierdzają więc wyrażoną wcześniej ogólną sugestię, że kapsuła kariosomu może być miejscem składowania kompleksów złożonych z białek i kwasów nukleinowych (Gruzova i Parfenov, 1993). Biorąc pod uwagę, że chromatyna w pęcherzyku zarodkowym A. pomorum jest silnie skondensowana i metoda immunogold nie wykazała obecności czynnika SC-35 (niezbędnego do składania pre-mRNA) ani na terenie kariosomu, ani kapsuły, jest mało prawdopodobne, aby cząstki U snRNP wypełniały swą funkcję związaną z dojrzewaniem RNA w obrębie pęcherzyka zarodkowego. Bardziej prawdopodobna wydaje się hipoteza, że cząstki U snRNP nagromadzone w trakcie oogenezy w kapsule kariosomu zostają uwolnione w momencie rozpadu pęcherzyka zarodkowego do otaczającej ooplazmy. Kapsuła kariosomu pełniłaby więc podobną funkcję jak ciała Cajala w pęcherzykach zarodkowych innych owadów, tzn. byłaby miejscem magazynowania cząstek U snRNP (zob. rozdz. 5.1. Rola ciał Cajala w pęcherzyku zarodkowym). W tym kontekście warto dodać, że ciała Cajala w pęcherzykach zarodkowych Xenopus również mają gąbczastą strukturę, podobnie jak zewnętrzna warstwa kapsuły kariosomu (Handwerger, 2005). Istnieje więc pewne podobieństwo morfologiczne między kapsułą kariosomu a ciałami Cajala. Co więcej, badania immunofluorescencyjne jąder w komórkach ssaków wykazały, że aktyna kolokalizuje z centralną częścią ciał Cajala i że w tym rejonie występuje również profilina I - białko regulujące polimeryzację aktyny (Skare i wsp., 2003; Witkę, 2004; Gedge i wsp., 2005). Przypuszcza się, że aktyna w ciałach Cajala zaangażowana jest w transport i (lub) obróbkę różnych typów RNA (Gedge i wsp., 2005). Jest to zgodne z proponowaną funkcją filamentów aktynowych w kapsule kariosomu A. pomorum. 4.3. Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Phthiraptera W pęcherzyku zarodkowym badanych gatunków Phthiraptera chromatyna tworzy kariosom, nie występuje pozachromosomowe ciało rDNA ani jąderka wielokrotne. W nukleoplazmie pojawiają się natomiast liczne, silnie morfologicznie zróżnicowane ciała jądrowe, które zawierają białka srebrochłonne organizatora jąderkowego (Żelazowska, 2000; Żelazowska i Jaglarz, 2004). Analiza cytochemiczna wykazała, że ciała te są DAPI-negatywne, ale wykazują fluorescencję po barwieniu roztworem jodku propydyny, co wskazuje, że te organelle jądrowe zawierają RNA, ale nie DNA. W pęcherzykach zarodkowych owadów ciała jądrowe mogą być mniej lub bardziej morfologicznie zróżnicowane, ale przynajmniej niektóre z tych domen zawierają U snRNA, białka Sm i (lub) koilinę (Gall i wsp., 1995; Tsvetkov i wsp., 1997; Bogo- 44 lyubov i wsp., 2000; Bogolyubov i Parfenov, 2001, 2004; Jaglarz, 2001; Biliński i Kloc, 2002; Batalova i wsp., 2000, 2005). Analiza immunocytochemiczna ciał jądrowych w pęcherzykach zarodkowych H. suis nie wykazała obecności na ich terenie żadnych antygenów charakterystycznych dla ciał Cajala. Należy jednak rozważyć możliwość, że przeciwciała (z wyjątkiem K-121, zob. niżej), które stosowane są z powodzeniem w analizie ciał jądrowych u innych owadów, mogą nie rozpoznawać epito-pów występujących w oocytach wszy. W tym kontekście warto zaznaczyć, że niedawne badania molekularne wykazały, iż wszy charakteryzują się wysokim poziomem zmian nukleotydów w genach mitochondrialnych (Shao i wsp., 2001; Page i wsp., 2002; Johnson i wsp., 2003). Podczas gdy u większości owadów DNA mitochondrial-ny podlega zmianom średnio 10-20 razy szybciej niż DNA jądrowy, to u wszy zmiany te zachodzą ponad 100 razy szybciej (Johnson i wsp., 2003). Tak szybkie zmiany genomu mitochondrialnego nie są znane u żadnego innego organizmu. Postuluje się, że u wszy również genom jądrowy, a w konsekwencji proteom, podlega zmianom ewolucyjnym szybciej niż u pozostałych owadów (Cruickshank i wsp., 2001; Page i wsp., 2002; Johnson i wsp., 2003). W przeciwieństwie do innych przeciwciał użytych w analizie ciał jądrowych wszy, przeciwciało K-121 (rozpoznające czapeczkę TMG w dojrzałych cząstkach U snRNP) znakuje ooplazmę, a także cytoplazmę i nukleoplazmę komórek folikularnych. Rozmieszczenie znacznika (metoda immunogold) nad jądrem komórek folikularnych H. suis, przy zastosowaniu tego przeciwciała, nie odbiega od „wzoru” znakowania w komórkach innych owadów (Gall i wsp., 1995; Tsvetkov i wsp., 1997; Bogolyubov i wsp., 2000; Jaglarz, 2001; Biliński i Kloc, 2002). Tym bardziej więc jest zaskakujące, że przeciwciało to nie znakuje ciał jądrowych w pęcherzyku zarodkowym. Sugeruje to, że organelle te nie zawierają cząstek U snRNP zaopatrzonych w czapeczkę TMG. Możliwe jednak, że U snRNP, choć obecne w ciałach jądrowych, są maskowane np. przez wiążące się z nimi białka. Maskowanie epitopów rozpoznawanych przez określone przeciwciała wykazano m.in. w przypadku lamin, strukturalnych białek jądrowych (Hozak i wsp., 1995). Nie można też wykluczyć, że cząstki U snRNP nie są wykrywane ze względu na ich bardzo gęste upakowanie w ciałach jądrowych, na co mogłaby wskazywać wyjątkowo duża gęstość elektronowa ciał jądrowych w pęcherzykach zarodkowych H. suis. Szczegółowy skład molekularny ciał jądrowych w pęcherzyku zarodkowym Phthi-raptera nie został poznany i można jedynie spekulować o ich przypuszczalnej funkcji. W czasie oogenezy ciała jądrowe i gęste ciała peryferyczne, które początkowo występują w pobliżu osłonki jądrowej, migrują do kariosomu i ostatecznie łączą się z nim, tworząc polimorflczną strukturę (Żelazowska i Jaglarz, 2004). Przemieszczanie ciał jądrowych w obrębie pęcherzyka zarodkowego opisano także u innych owadów (Gruzova i Parfenov, 1993; Świątek, 1999; Jaglarz, 2001). Postuluje się, że migracja ciał jądrowych związana jest zaangażowaniem tych struktur w transport jądrowo--cytoplazmatyczny. Biorąc pod uwagę, że ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym H. suis zawierają RNA i białka srebrochłonne organizatora jąderkowego, można przypuszczać, że są miejscem gromadzenia rybonukleoprotein. Możliwe także, że ciała te, podobnie jak analogiczne struktury w pęcherzykach zarodkowych innych owadów, gromadzą rybonukleoproteiny do wykorzystania we wczesnych stadiach rozwoju zarodkowego (zob. rozdz. 5.1. Rola ciał Cajala w pęcherzyku zarodkowym). 45 4.3.1. Osłonka jądrowa pęcherzyków zarodkowych Phthiraptera i jej związek z jądrami dodatkowymi Jak już wspomniano (zob. rozdz. 1.2.1. Jądra dodatkowe), w oocytach wszołów występują tzw. jądra dodatkowe zawierające gęste pseudojąderka (Ries, 1932; Biliński i Jankowska, 1987; Biliński, 1989, 1991a, b). W oocytach tych owadów jądra dodatkowe otaczają pęcherzyk zarodkowy, nie migrują do warstwy korowej oocytu i przynajmniej niektóre połączone są z jądrem oocytu szerokimi szypułkami aż do stadium choriogenezy (Biliński i Jankowska, 1987; Biliński, 1989). Choć w oocytach badanych w niniejszej pracy gatunków Phthiraptera jądra dodatkowe nie występują, w pęcherzyku zarodkowym C. columbae osłonka jądrowa tworzy charakterystyczne szerokie fałdy, które zawierają skupiska Ag-NOR-pozytywnego, ziarnisto-włóknistego materiału (Żelazowska i Jaglarz, 2004). Fałdy te nie oddzielają się od jądra oocytu w trakcie oogenezy i są morfologicznie podobne do początkowych stadiów powstawania jąder dodatkowych w oocytach wszolów (zob. Biliński, 1989). Skłania to do przypuszczenia, że z wypustek jądra oocytu, podobnych do tych u C. columbae, mogły w trakcie ewolucji Phthiraptera powstać jądra dodatkowe. Występujące w tych wypustkach inkluzje mogły dać początek pseudojąderkom. 4.4. Ciała Cajala w jądrach dodatkowych blonkówek Wyniki wcześniejszych i prezentowanych tutaj badań wskazują, że przynajmniej niektóre pseudojąderka w jądrach dodatkowych błonkówek są homologiczne z ciałami Cajala (Biliński i Kloc, 2002). Analiza ultrastrukturalna z zastosowaniem przeciwciał rozpoznających składniki specyficzne dla ciał Cajala wykazała, że organelle te po-wstają w jądrach dodatkowych, stopniowo z niewielkich skupień materiału zawierającego białko SMN i dojrzałe U snRNP. Prawdopodobnie materiał ten transportowany jest z cytoplazmy do jąder dodatkowych via pory w osłonce jąder dodatkowych, gdyż podobne ultrastrukturalnie i tak samo znakujące się przeciwciałami skupienia materiału występują po obu stronach tej osłonki. Obecność w cytoplazmie otaczającej jądra dodatkowe niewielkich skupień materiału, które zawierają białko SMN oraz cząstki U snRNP i pozostają w kontakcie z mikrotubulami, sugeruje, że cytoszkielet mikrotubularny oocytu zaangażowany jest w transport dojrzałych cząstek U snRNP z miejsca ich powstawania do jąder dodatkowych. Obecnie wiadomo, że mikrotubule uczestniczą m.in. w przenoszeniu i lokalizowaniu cząsteczek mRNA i związanych z nim białek (zob. artykuły przeglądowe: Biliński, 1992; Jansen, 2001; Kloc i wsp., 2001, 2002; Heredia i Jansen, 2004; Kloc i Etkin, 2005). Prezentowane w niniejszym opracowaniu wyniki po raz pierwszy wskazują, że mikrotubule mogą być też zaangażowane w transport dojrzałych cząstek U snRNP. 46 W trakcie kolejnych etapów morfogenezy jąder dodatkowych w oocytach błonkó-wek do inicjalnych ciał Cajala stopniowo dołączane są kolejne skupienia materiału zawierającego U snRNP. Zwraca uwagę, że w podobny sposób tworzą się ciała Cajala w jądrach komórek somatycznych ssaków (Raska i wsp., 1991; Malatesta i wsp., 1994a; Ferreira i Carmo-Fonseca, 1995). Sugeruje to, że geneza ciał Cajala jest oparta na podobnym mechanizmie molekularnym zarówno w jądrze komórkowym, jak i w jądrach dodatkowych. Analiza rozmieszczenia dojrzałych cząstek U snRNP w oocytach V. germanica wskazuje, że przynajmniej część tych cząstek wędruje z cytoplazmy wprost do jąder dodatkowych, z pominięciem pęcherzyka zarodkowego. Przemawiają za tym także wyniki eksperymentu z antybiotykiem - leptomycyną B, który blokuje m.in. eksport cząsteczek U snRNA z jądra do cytoplazmy (Nishi i wsp., 1994; Wolff i wsp., 1997; Carvalho i wsp., 1999). W oocytach poddanych działaniu leptomycyny B w jądrach dodatkowych powstają pseudojąderka o wyraźnie mniej zwartej strukturze i zawierające elektronowo przejrzyste obszary (Biliński i Kloc, 2002). Pomimo iż w oocytach V. germanica (i prawdopodobnie innych błonkówek; zob. rozdz. 4.4.2. Rola jąder dodatkowych i ciał Cajala w oocytach błonkówek) wędrówka U snRNP jest zmodyfikowana, początkowe etapy biogenezy tych rybonukleoprotein wydają się przebiegać zgodnie z aktualnie przyjętym modelem: cząsteczki U snRNA eksportowane są z jądra do ooplazmy, gdzie łączą się z kompleksem SMN i innymi białkami, tworząc cząstki U snRNP; po hipermetylacji czapeczki na końcu 5', U snRNP gromadzone są w ciałach Cajala powstających w obrębie jąder dodatkowych, a jedynie pewna ich część wraca do jądra oocytu (zob. też rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorą-cych udział w dojrzewaniu pre-mRNA). Porównanie wędrówki cząstek U snRNP w oocytach zawierających pęcherzyk zarodkowy i w oocytach, w których występują też jądra dodatkowe, przedstawiono schematycznie na ryc. 4-2. 4.4.1. Białko SMN i jego rola w metabolizmie komórki Obecność białka SMN w oocytach owadów nie jest zaskakująca. Białko to stwierdzono w komórkach wszystkich do tej pory badanych gatunków zwierząt, co sugeruje, że uczestniczy w podstawowych procesach w komórce (zob. artykuły przeglądowe: Paushkin i wsp., 2002; Gubitz i wsp., 2004; Yong i wsp., 2004b). Rola białka SMN jest obecnie intensywnie analizowana, gdyż mutacje genu kodującego to białko u człowieka prowadzą do ciężkiego schorzenia polegającego na degeneracji rdzeniowych neuronów motorycznych i stopniowym zaniku mięśni rejonu kręgosłupa (Lefebvre i wsp., 1995, 1997; Melki, 1997). Mutacje genu smn są też najczęstszą genetycznie uwarunkowaną przyczyną śmiertelności noworodków (Peam, 1980; Lefebvre i wsp., 1995). Białko SMN stanowi część kompleksu SMN, którego rola w biogenezie cząstek U snRNP jest dobrze udokumentowana (zob. artykuły przeglądowe: Meister i wsp., 2002; Paushkin i wsp., 2002; Gubitz i wsp., 2004; Yong i wsp., 2004b). Jak już wcześniej wspomniano, kompleks SMN wiąże się bezpośrednio z białkami Sm (zob. rozdz. 1.1.4. Biogeneza cząstek U snRNP biorących udział w dojrzewaniu pre-mRNA). Należy podkreślić, że to białka kompleksu SMN przez wiązanie się zarówno z białkami rdze 47 niowymi (białkami Sm), jak i z określonymi sekwencjami nukleotydów w cząsteczkach U snRNA umożliwiają odpowiednie przestrzenne dopasowanie tych makrocząsteczek i zapewniają swoistość tych oddziaływań. Jeżeli białko SMN nie występuje, białka rdzeniowe samoistnie łączą się z dowolnymi cząsteczkami RNA (Pellizzoni i wsp., 2002). Niedawno wykazano także, że kompleks SMN pełni dodatkową funkcję: bezpośrednio wiąże się z syntazą trimetyloguanozyny, enzymem odpowiedzialnym za hipermetylację czapeczki na końcu 5' U snRNP (Mouaikel i wsp., 2003). Odkrycie to dobitnie potwierdza, że kompleks SMN odgrywa kluczową rolę w biogenezie cząstek U snRNP, ściśle kontrolując i koordynując ich dojrzewanie w cytoplazmie komórki (Massenet i wsp., 2002; Narayanan i wsp., 2002). Wiadomo również, że białko SMN odpowiada za lokalizowanie dojrzałych cząstek U snRNP w ciałach Cajala przez wiązanie się z koiliną(Hebert i wsp., 2001; Narayanan i wsp., 2004). Dodatkowo wykazano, że kompleks SMN wchodzi w interakcje także z innymi białkami, np. fibrylaryną, nukleoliną, GAR 1, helikazą A RNA, telomerazą, białkami Lsm i jądrowymi heterogenicznymi rybonukleoproteinami (Friesen, 200la; Jones i wsp., 2001; Mourelatos i wsp., 2001; Pellizzoni i wsp., 2001a, b; Bachand i wsp., 2002; Yong i wsp., 2002; Meier, 2005). W związku z tym uważa się, że kompleks SMN jest uniwersalnym składnikiem wielu klas cząstek rybonukleoproteinowych i uczestniczy w różnych aspektach metabolizmu RNA: (1) w transkrypcji i biogenezie U snRNP oraz snoRNP, (2) w formowaniu cząstek U7 snRNP, biorących udział w obróbce końca 3' mRNA histonów, (3) w dojrzewaniu pre-mRNA i rybosomów, a także (4) w transporcie jądrowo-cytoplazmatycznym (Pellizzoni i wsp., 1998; Becha-de i wsp., 1999; Strasswimmer i wsp., 1999; Campbell i wsp., 2000; Gall, 2000; Terns i Terns, 2001; Meister i wsp., 2002; Paushkin i wsp., 2002; Pellizzoni i wsp., 2002; Pillai i wsp., 2003; Yong i wsp., 2004b). 4.4.2. Rola jąder dodatkowych i ciał Cajala w oocytach błonkówek Dalsze losy ciał Cajala w jądrach dodatkowych błonkówek obejmują dwa procesy: (1) transport w jądrach dodatkowych do warstwy korowej oocytu oraz (2) rozpraszanie w substancji podstawowej jąder dodatkowych. Procesy te przedstawiono schematycznie na ryc. 3-1B i 3-2. Po umiejscowieniu się jąder dodatkowych w warstwie korowej oocytu, ciała Cajala rozpadają się, a ich składniki rozpraszają się w substancji podstawowej jąder dodatkowych (Jaglarz i wsp., 2005). Zwraca uwagę fakt, że rozproszony materiał pochodzący z ciał Cajala pozostaje wewnątrz jąder dodatkowych i nie jest uwalniany do otaczającej cytoplazmy, przynajmniej do końca witelogenezy. W tym świetle wydaje, że U snRNP zatrzymywane są w jądrach dodatkowych najprawdopodobniej aż do momentu zapłodnienia. Za hipotezą tą przemawia występowanie jąder dodatkowych w zapłodnionych jajach niektórych owadów, a także w zarodkach w stadium komórek biegunowych (pierwotnych komórek płciowych) (Zissler i Sander, 1982). Biorąc pod uwagę, że jądra dodatkowe błonkówek otoczone są osłonką identyczną z osłonką jądrową, uwolnienie zmagazynowanych w tych strukturach U snRNP do cytoplazmy korowej oocytu może 48 wywoływać ten sam sygnał, który inicjuje rozpad pęcherzyka zarodkowego. Weryfikacja tej hipotezy wymaga dalszych badań. Migracja jąder dodatkowych do warstwy korowej oocytu występuje również u innych niż osy błonkówek, np. u Chrysis ígnita z rodziny złotolitkowatych (Chrysididae) i u Cosmoconus meridionator z rodziny gąsienicznikowatych (Ichneumonidae) (Biliński i wsp., 1993; Szklarzewicz i wsp., 1993; Jaglarz i wsp., 2005). W oocytach tych gatunków, podobnie jak w oocytach V. germánica, jądra dodatkowe wypełnione są elektronowo przejrzystą substancją podstawową, w której występują dwie morfologicznie odrębne i elektronowo gęste inkluzje (Biliński i wsp., 1993; Szklarzewicz i wsp., 1993). Jedna z tych inkluzji jest w przybliżeniu kulista i, podobnie jak ciała Cajala w jądrach akcesorycznych V. germánica, rozpada się w trakcie oogenezy oraz stopniowo rozprasza się w substancji podstawowej jądra dodatkowego. Składniki tej inkluzji pozostają jednak w obrębie jąder dodatkowych i nie są wykrywane w otaczającej cytoplazmie (Jaglarz i wsp., 2005). Przeprowadzone badania ultrastrukturalne i cytochemiczne sugerują że jądra dodatkowe u wszystkich gatunków błonkówek pełnią podobną funkcję (Biliński i wsp., 1993; Szklarzewicz i wsp., 1993; Biliński i Kloc, 2002; Jaglarz i wsp., 2005). Służą jako miejsce gromadzenia i magazynowania dużych ilości U snRNP, a także są organellami transportującymi zmagazynowane w ciałach Cajala cząstki U snRNP do warstwy korowej oocytu (Biliński i Kloc, 2002; Jaglarz i wsp., 2005). W oocytach V. germánica jądra dodatkowe nie występują jedynie w cytoplazmie tylnego bieguna. Znaczenie tego faktu nie jest jasne. Wiadomo jednak, że u wielu owadów w tej części oocytu dochodzi do formowania tzw. oosomu lub plazmy płciowej (biegunowej) - rejonu ooplazmy, w którym deponowane są czynniki odpowiedzialne za powstanie komórek linii płciowej (zob. artykuły przeglądowe: Zissler, 1992; Büning, 1994; Klag, 1994; Jaglarz, 1997; Saffman i Lasko, 1999; Mahowald, 2001; Kloc i Biliński, 2003; Kloc i wsp., 2004). Dotychczas nie wyjaśniono, czy jądra dodatkowe występujące w oocytach innych owadów (i w oocytach innych zwierząt; zob. 1.2.1. Jądra dodatkowe) są również zaangażowane w magazynowanie i transport kompleksów rybonukleoproteinowych zawierających U snRNA. Niewiele również wiadomo o transporcie i rozmieszczaniu cząstek U snRNP w oocytach (lub jajach), w których jądra dodatkowe nie występują. W tym kontekście warto wspomnieć, że w oocytach Panorpa communis (Mecoptera) materiał pochodzący z ciał Cajala, po rozpadzie pęcherzyka zarodkowego, wykrywany jest w warstwie korowej oocytu (Batalova i wsp., 2005; zob. też rozdz. 5.1. Rola ciał Cajala w pęcherzyku zarodkowym). 5. PODSUMOWANIE 5.1. Rola ciał Cajala w pęcherzyku zarodkowym Cytochemiczna i immunocytochemiczna analiza ciał jądrowych w pęcherzykach zarodkowych różnych owadów wykazała, że na terenie przynajmniej niektórych z tych domen gromadzone są dojrzałe cząstki U snRNP i występują epitopy charakterystyczne dla koiliny (lub białka odpowiadającego koilinie), białek Sm i SMN. Taki skład molekularny jednoznacznie wskazuje, że te organelle jądrowe są homologiczne z ciałami Cajala (Gall i wsp., 1995; Tsvetkov i wsp., 1997; Bogolubov i wsp., 2000; Bogolyubov i Parfenov, 2001, 2004; Jaglarz, 2001; Biliński i Kloc, 2002; Batalova i wsp., 2005; Jaglarz i wsp., 2005). Ciała Cajala lub struktury do nich podobne występują w jądrach komórek roślin, grzybów (drożdży), zwierząt oraz człowieka, zarówno w komórkach somatycznych jak i płciowych (zob. artykuły przeglądowe: Gall 2000, 2003; Matera, 2003; Cioce i La-mond, 2005). Uważa się, że organelle te zaangażowane są w podstawowe procesy metaboliczne i występują powszechnie w jądrach komórkowych (zob. artykuły przeglądowe: Gall, 2000, 2001, 2003; Ogg i Lamond, 2002; Cioce i Lamond, 2005). Rezultaty badań jąder komórek somatycznych, przeprowadzonych w ostatnich latach, wskazują, że ciała Cajala są wielofunkcyjnymi domenami jądrowymi zaangażowanymi m.in.: (1) w biogenezę i dojrzewanie U snRNP oraz snoRNP, (2) w transkrypcję i dojrzewanie mRNA kodującego białka histonowe, a także (3) w regulację przemieszczania się kompleksów rybonukleoproteinowych między cytoplazmą a różnymi kompartmentami nukleoplazmy, w szczególności jąderkiem (zob. artykuły przeglądowe: Gall 2000, 2001, 2003; Ogg i Lamond, 2002; Cioce i Lamond, 2005; zob. rozdz. 1.1.3. Budowa molekularna i funkcje ciała Cajala). W tym kontekście pojawia się pytanie, czy ciała Cajala w pęcherzykach zarodkowych owadów (a także innych zwierząt) pełnią funkcję taką jak w jądrach komórek somatycznych? Przeprowadzone badania wskazują, że organelle te w pęcherzykach zarodkowych owadów są szczególnie liczne i osiągają wielokrotnie większe rozmiary niż odpowiadające im struktury w jądrach komórek somatycznych. Dotyczy to także ciał Cajala w jądrach dodatkowych błonkówek. Ponadto, u badanych gatunków owadów i płazów ciała Cajala obserwowano we wszystkich (nawet końcowych) fazach oogenezy, także w tych pęcherzykach zarodkowych, które pozostają transkrypcyjnie nieaktywne (Gall i wsp., 1995; Tsvetkov i wsp., 1997; Bogolubov i wsp., 2000; Bogolyubov i Parfenov, 2001, 2004; Jaglarz, 2001; Biliński i Kloc, 2002; Filek i wsp., 2002; Batalova i wsp., 2005; Jaglarz i wsp., 2005). Przesłanki te sugerują, że ciała Cajala w pęcherzykach zarodkowych nie tylko uczestniczą w metabolizmie oocytu, ale 50 także magazynują cząstki U snRNP, które mogą być wykorzystane podczas wczesnych etapów rozwoju zarodkowego. U większości owadów wczesne stadia embriogenezy (bruzdkowanie) zachodzą przede wszystkim w powierzchniowej (korowej) strefie zapłodnionego jaja. Należy podkreślić, że pod koniec oogenezy właśnie w tej strefie oocytu lokuje się zarówno pęcherzyk zarodkowy, jak i jądra dodatkowe (u błonkówek). Po rozpadzie osłonki pęcherzyka zarodkowego i jąder dodatkowych, nagromadzone w nich rybonukle-oproteiny zostają uwolnione do otaczającej ooplazmy. Potwierdzają to badania im-munocytochemiczne oocytów Panorpa communis, w których, po rozpadzie osłonki jądrowej, pozostałości ciał Cajala wykrywane są w warstwie korowej oocytu (Batalova i wsp., 2005). Warto w tym miejscu przypomnieć, że u wielu zwierząt, w tym u owadów, rejon cytoplazmy korowej oocytu odgrywa istotną (i dobrze udokumentowaną) rolę w lokalizacji tzw. matczynych RNA i białek, które są niezbędne do prawidłowego przebiegu wczesnych etapów rozwoju zarodkowego (zob. artykuły przeglądowe: Jeffery, 1989; Mickiem, 1995; Cooperstock i Lipshitz, 2001; Jansen, 2001; Johnstone i Lasko, 2001; Kloc i wsp., 2001, 2002; Kloc i Biliński, 2000, 2003; Palacios i St Johnston, 2001; Riechmann i Ephrussi, 2001; Heredia i Jansen, 2004; St Johnston, 2005; Kloc i Etkin, 2005). Należy również dodać, że u owadów synteza RNA nie rozpoczyna się natychmiast po zapłodnieniu i inicjacji embriogenezy (Berry, 1982, 1985; Andeol, 1994; Tadros i Lipshitz, 2005). W trakcie szybko przebiegających podziałów mitotycznych jądra zygotycznego transkrypcja genów zarodka jest całkowicie zablokowana. Dopiero gdy w warstwie korowej zarodka gromadzą się jądra potomne jądra zygotycznego i formowana jest tzw. blastoderma, gwałtownie zwiększa się tempo transkrypcji (Berry, 1982; Andeol, 1994). W tym świetle wydaje się, że wcześniejsze nagromadzenie (w czasie oogenezy) dużych ilości snRNP w korowej warstwie oocytu pozwala sprostać zwiększonemu zapotrzebowaniu na czynniki zaangażowane w obróbkę pierwotnych transkryptów w tym szczególnym okresie rozwoju zarodkowego. Można przypuszczać, że mechanizm ten działa najbardziej efektywnie w oocytach zawierających peryferycznie rozmieszczone jądra dodatkowe. Podobnie jak u owadów, w pęcherzykach zarodkowych płazów występują liczne i duże ciała Cajala (Gall, 1991, 2000, 2003; Gall i wsp., 1995, 2004; Parfenov i wsp., 1996). Wykazano też, że uXenopus czynniki związane z obróbką RNA magazynowane są w oocycie, a całkowita ilość nagromadzonych podczas oogenezy cząstek snRNP jest wystarczająca do podtrzymania rozwoju zarodkowego, aż do stadium zaawansowanej blastuli (Forbes i wsp., 1983). Potwierdza to tezę, że wyjątkowo dobrze rozwinięte ciała Cajala w pęcherzykach zarodkowych (lub w jądrach dodatkowych) owadów i płazów zawierają znaczne ilości snRNP, które odgrywają istotną rolę w czasie początkowych etapów rozwoju zarodkowego (Gall, 1991; Gall i wsp., 1995; Parfenov i wsp., 1996; Tsvetkov i wsp., 1997; Batalova i wsp., 2000, 2005; Bogolyubov i wsp., 2000; Bogolyubov i Parfenov, 2001; Jaglarz, 2001; Biliński i Kloc, 2002). W tym świetle zmagazynowane w ciałach Cajala snRNP można uznać za swoistą i odrębną klasę tzw. czynników matczynych, które syntetyzowane są w czasie oogenezy i wykorzystywane dopiero po rozpoczęciu rozwoju zarodkowego. 6. PODZIĘKOWANIA Pragnę serdecznie podziękować Panu Profesorowi dr. hab. Szczepanowi Bilińskiemu za stymulujące dyskusje, uwagi krytyczne i zachęty przez lata współpracy, a także za dzielenie się niepublikowanymi wynikami badań i przemyśleniami nie tylko o oogenezie owadów. Recenzentowi, Pani dr hab. Teresie Szklarzewicz, jestem wdzięczny za wszystkie uwagi. Dziękuję moim współpracownikom: Paniom mgr Adzie Jankowskiej, dr Beacie Szymańskiej i dr Monice Żelazowskiej oraz Panu dr. Piotrowi Świątkowi za pomoc w realizacji projektu badawczego dotyczącego ciał jądrowych. Pani mgr Elżbiecie Kisiel dziękuję za wykonanie elektronicznej wersji schematów, a Panu dr. Jackowi Goduli za „spory nomenklaturowe”. Wszystkim Pracownikom Zakładu Zoologii Systematycznej i Zoogeografii Uniwersytetu Jagiellońskiego składam podziękowanie za okazywaną pomoc i miłą atmosferę pracy. Panom Profesorom: M.C. Alliegrowi (Louisiana State University Medical Center, New Orleans, LA, USA), E.K.L. Chanowi (Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA), J.G. Gallowi (Carnegie Institution, Baltimore, MD, USA), U. Scheerowi (The-odor-Boveri-Institute (Biocenter), Uniwersytet w Wiirzburgu, Wurzburg, Niemcy) dziękuję za udostępnienie przeciwciał. NOTA DODANA PODCZAS KOREKTY W czasie, gdy niniejsze opracowanie było przygotowywane do druku, ukazały się dwa artykuły dotyczące ciał Cajala i innych struktur w jądrach komórek somatycznych i w pęcherzyku zarodkowym muszki owocowej {Drosophila melanogaster) (Liu i wsp., 2006a, b). W jądrach komórkowych u tego owada występuje kilka klas ciał jądrowych, w tym ciała Cajala i nowe ciała, nazwane histone locus bodies. Tylko te nowo odkryte ciała, przylegające do zespołu genów kodujących białka histonowe, akumulują U7 snRNP. Tak więc, u Drosophila czynniki związane z obróbką pre--mRNA histonów występują nie w ciałach Cajala, jak w jądrach komórkowych kręgowców, a w wyraźnie odrębnych organellach jądrowych. Inna publikacja, poświęcona pochodzeniu centrosomów we wczesnym rozwoju zarodkowym błonkówek, wskazuje na związek białek centrosomu z jądrami dodatkowymi (Ferree i wsp., 2006). Wykazano m.in., że w obrębie jąder dodatkowych występuje pojedyncze skupisko y-tubuliny. Jest to szczególnie interesujące w kontekście występowania dwóch odrębnych strukturalnie inkluzji w jądrach dodatkowych błonkówek. Przedstawione w niniejszej monografii wyniki wskazują, że jedna z tych inkluzji jest homologiczna z ciałem Cajala. Skład molekularny drugiej inkluzji nie jest znany, ale jest wysoce prawdopodobne, że zawiera ona czynniki związane z powstawaniem centrosomu. Warto także odnotować ukazanie się kolejnych prac przeglądowych poświęconych ciałom Cajala i najnowszym poglądom na ich rolę w jądrze komórkowym (Matera, 2006; Matera i Shpargel, 2006). Prace te poruszają m.in. ciekawe zagadnienie zmian funkcji ciał Cajala zachodzących podczas ewolucji organizmów eukariotycznych. Ferree P.M., McDonald K., Fasulo B., Sullivan W. (2006) The origin of centrosomcs in parthenogenctic hymenoptcran insects. Curr. Biol. 16: 801-807. Liu J.-L., Murphy C., Buszczak M., Claltcrbuck S., Goodman R.. Gall J.G. (2006a) The Drosophila melanogaster Cajal body. J. Cell Biol. 172: 875-884. Liu J.-L., Buszczak M., Gall J.G. (2006b) Nuclear bodies in the Drosophila germinal vesicle. Chromosome Res. (w druku). Matera A.G. (2006) Drosophila Cajal bodies: accessories not included. J. Cell Biol. 172: 791-793. Matera A.G., Shpargel K.B. (2006) Pumping RNA: nuclear bodybuilding along the RNP pipeline. Curr. Opin. Cell Biol. 18: 317-324. 7. PIŚMIENNICTWO Achsel T., Brahm H., Kastner B., Bachi A., Wilm M., Luhrmann R. (1999) A doughnut-shaped hete-romer of human Sm-like proteins binds to the 3’-end of U6 snRNA, thereby facilitating U4/U6 duplex formation in vitro. EMBO J. 18: 5789-5802. Adamska M., Biliński S.M. (1997) Domeny jądrowe zawierające snRNP-struktura i aktualne poglądy na funkcje. Post. Biol. Kom. 24, supl. 9: 93-102. Alexandrova O.A. (1992) Intranuclear bodies and karyosphere capsule formation in the oocytes of Tentyria nomas taurica. Tsitologiya 34: 30-37. Alliegro M.C., Alliegro M.A. (1996) Identification of a new coiled body component. Exp. Cell Res. 227: 386-390; Erratum, Exp. Cell Res. (1997) 231: 373. Alliegro M.C., Alliegro M.A. (1998) Protein heterogeneity in the coiled body compartment. Exp. Cell Res. 239: 60-68. Almeida F., Saffrich R., Ansorge W., Carmo-Fonseca M. (1998) Microinjection of anti-coilin antibodies affects the structure of coiled bodies. J. Cell Biol. 142: 899-912. Andeol Y. (1994) Early transcription in different animal species: implication for transition from maternal to zygotic control in development. Roux's Arch. Dev. Biol. 204: 3-10. Andersen J.S., Lam Y.W., Leung A.K.L., Ong S.E., Lyon C.E., Lamond A.I., Mann M. (2005) Nucleolar proteome dynamics. Nature 433: 77-78. Andersen J.S., Lyon C.E., Fox A.H., Leung A.K., Lam Y.W., Steen H., Mann M., Lamond A.l. (2002) Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12: 1-11. Andrade L E.C., Chan E.K.L., Raska I., Peebles C.L., Roos G., Tan E.M. (1991) Human autoantibody to a novel protein of the nuclear coiled body: Immunological characterization and cDNA cloning of p80 coilin. J. Exp. Med. 173: 1407-1419. Andrade L.E., Tan E.M., Chan E.K. (1993) Immunocytochemical analysis of the coiled body in the cell cycle and during proliferation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1947-1951. Arvand A., Denny C.T. (2001) Biology of EWS/ETS fusions in Ewing's family tumors. Oncogene 20: 5747-5754. Bachand F., Boisvert F., Cote J., Richard S., Autexier C. (2002) The product of the survival of motor nuron (SMN) gene is a human telomerase associated protein. Mol. Biol. Cell 13: 3192-3202. Bachand J.B., Elledge S.J. (1999) Mitotic treasures in the nucleolus. Nature 398: 757-758. Batalova F.M., Stepanova I. S., Bogolyubov D.S. (2000) Cajal bodies in oocyte nuclei of the scorpion fly Panorpa comunis. Tsitologyia 41: 1037-1047. Batalova F.M., Stepanova I.S., Skovorodkin I.N., Bogolyubov D.S., Parfenov V.N. (2005) Identification and dynamics of Cajal bodies in relation to karyosphere formation in scorpionfly oocytes. Chromosoma 113: 428-439. Bauer D.W., Gall J.G. (1997) Coiled bodies without coilin. Mol. Biol. Cell 8: 73-82. Bayreuther K. (1956) Die Oogenese der Tipuliden. Chromosoma 7: 508-557. Bechade C., Rostaing P., Cistemi C., Kalisch R., La Bella V., Pettmann B., Triller A. (1999) Subccl-lular distribution of survival of motor neuron (SMN) protein: Possible involvement in nucleocy-toplasmic and dendritic transport. Eur. J. Neurosci. 11: 293-304. 56 Bell M., Schreiner S., Damianov A., Reddy R., Bindereif A. (2002) pl 10, a novel U6 snRNP protein and U4/U6 snRNP recycling factor. EMBOJ. 21: 2724-2735. Bellini M. (2000) Coilin, more than a molecular marker of the Cajal (coiled) body. BioEssays 22: 861-867. Bellini M., Gall J.G. (1998) Coilin can form a complex with the U7 small nuclear ribonucleoprotein. Mol. Biol. Cell 9: 2987-3001. Bellini M., Gall J.G. (1999) Coilin shuttles between the nucleus and cytoplasm in Xenopus oocytes. Mol. Biol. Cell 10: 3425-3434. Belmont A. (2003) Dynamics of chromatin, proteins, and bodies within the cell nucleus. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 304-310. Berezney R., Dubey D.D., Huberman J.A. (2000) Heterogeneity of eukaryotic replicons, replicon clusters, and replication foci. Chromosoma 108: 471 —484. Berry S.J. (1982) Maternal direction of oogenesis and early embryogenesis in insects. Ann. Rev. Entom. 27: 205-227. Berry S.J. (1985) RNA synthesis and storage during insect oogenesis, [w:] Developmental Biology. A comprehensive synthesis. L.W. Browder (red.), tom 1: Oogenesis, s. 351-384. New York: Plenum Press. Bellinger B.T., Gilbert M., Amberg D C. (2004) Acting up in the nucleus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5: 410-415. Bier K. (1965) Zur Funktion der Nährzellen in meroistischcn Insektenovar unter besonderer Berücksichtigung der Oogenese adephager Colcopteren. Zool. J. Physiol. 71: 371-384. Bier K., Kunz W., Ribbert D. (1967) Structur und Funktion der Oocytenchromosomen und Nukleolen sowie der Extra-DNS während der Oogenese panoistischer und mcroistischcr Insecten. Chromosoma 23:214-254. Biggiogera M., Kaufman S.M., Sharper J.M., Gas N., Amalric F., Fakan S. (1991) Distribution of nucleolar proteins B-23 and nucleolin during mouse spermatogenesis. Chromosoma 100: 162— -172. Biliński S.M. (1989) Formation and function of accessory nuclei in the oocytes of the bird louse, Eomenacanthus stramineus (Insecta: Mallophaga). I. Ultrastructural and histochemical studies. Chromosoma 97: 321-326. Biliński S.M. (1991a) Are accessory nuclei involved in the establishment of developmental gradients in hymenopteran oocytes? Ultrastructural studies. Roux's Arch. Dev. Biol. 199: 423—426. Biliński S.M. (1991b) Morphological markers of anterioposterior and dorsoventral polarity in developing oocytes of the hymenopteran Cosmoconus meridionator (Ichneumonidae). Roux 's Arch. Dev. Biol. 200: 330-335. Biliński S.M. (1992) Powstawanie i depozyeja matczynych czynników rozwojowych w oocytach bezkręgowców. Post. Biol. Kom. 19: 23-34. Biliński S.M. (1998a) Filogeneza owadów a struktura i ultrastruktura ich jajników. Przeg. Zool. 42: 35-51. Biliński S.M. (1998b) Ovaries, oogenesis and insect phylogeny. Introductory remarks. Folia Histo-chem. Cytobiol.36: 143-145. Biliński S.M., Bilińska В. (1996) A new version of the Ag-NOR technique. A combination with DAPI staining. Histochem. J. 28: 651-656. Biliński S.M., Jankowska W. (1987) Oogenesis in the bird louse Eomenacanthus stramineus (Insecta: Mallophaga). I. General description and structure of the egg capsule. Zool. Jb. Anat. 116: 1-12. Biliński S.M., Klag J. (1994) Budowa jajników i zarys przebiegu oogenezy owadów, [w:] Ultrastruktura i funkcja komórki. S. Biliński, Z. Bielańska-Osuchowska, J. Kawiak, A. Przelęcka (red.), tom 6: Oogeneza, s. 30-34. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN. Biliński S.M., Klag J., Kubrakiewicz J. (1993) Morphogenesis of accessory nuclei during final stages of oogenesis in Cosmoconus meridionator (Hymenoptera: Ichneumonidae). Roux’s Arch. Dev. Biol. 203: 100-103. 57 Biliński S.M., Klag J., Kubrakiewicz J. (1995a) Subcortical microtubule network separates the periplasm from the endoplasm and is responsible for maintaining the position of accessory nuclei in hymenopteran oocytes. Roux’s Arch. Dev. Biol. 205: 54-61. Biliński S.M., Kloc M. (2002) Accessory nuclei revisited: the translocation of snRNPs from the germinal vesicle to the periphery of the future embryo. Chromosoma 111: 62-68. Biliński S.M., Zawadzka M., Büning J. (1995b) Visualization of accessory nuclei from oocytes of the sawfly, Athalia rosae (Hymenoptera: Tenthridinidae) by a spreading technique. Folia Histochem. Cytobiol. 33: 197-200. Billen J. (1985) Ultrastructure of the worker ovarioles in Formica ants (Hymenoptera'. Formicidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 14: 21-32. Blessing C.A., Ugrinova G.T., Goodson H.V. (2004) Actin and ARPs: action in the nucleus. Trends Cell Biol. 14: 435—442. Blochmann F. (1886) liber die Reifung der Eier bei Ameiscn und Wcspen. Festschrift Naturh. Med. Vercin Heilderberg. Bochnig P., Reuter R., Bringmann P., Lührmann R. (1987) A monoclonal antibody against 2,2,7--trimethylguanosine that reacts with intact, class U, small nuclear ribonucleoproteins as well as with 7-methyl guanosine-capped RNAs. Eur. J. Biochem. 168: 461—467. Bogolyubov D., Alexandrova O., Tsvetkov A., Parfenov V. (2000) An immunoelectron study of karyosphere and nuclear bodies in oocytes of mealworm beetle, Tenebrio molitor (Coleóptera: Polyphaga). Chromosoma 109: 415-425. Bogolyubov D., Parfenov V. (2001) Immunogold localization of RNA polymerase II and pre-mRNA splicing factors in Tenebrio molitor oocyte nuclei with special emphasis on kary osphere development. Tissue Cell 33: 549-561. Bogolyubov D., Parfenov V. (2004) Do nuclear bodies in oocytes of Tenebrio molitor (Coleóptera: Polyphaga, Tenebrionidae) contain two forms of RNA polymerase 11? Tissue Cell 36: 13-17. Bohmann K., Ferreira J.A., Lamond A.I. (1995) Mutational analysis of p80 coilin indicates a functional interaction between coiled bodies and the nucleolus. J. Cell Biol. 131: 817-831. Boisvert F.-M., Cote J., Boulanger M.-C., Cleroux P., Bachand F., Autexier C., Richard S. (2002) Symmetrical dimelhylarginine methylation is required for the localization of SMN in Cajal bodies and pre-mRNA splicing. J. Cell Biol. 159: 957-969. Boom van den V., Cittcrio E.. Hoogstraten D., Zotter A., Egly J.M., van Cappcllcn W.A., llocijma-kers J.H., Houtsmuller A.B., Vermeulen W. (2004) DNA damage stabilizes interaction of CSB with the transcription elongation machinery. J. Cell Biol. 166: 27-36. Boudonck K., Dolan L., Shaw P.J. (1999) The movement of coiled bodies visualized in living plant cells by the green fluorescent protein. Mol. Biol. Cell 10: 2297-2307. Brahms H., Meheus L., de Brabanderc V., Fischer U., Lührmann R. (2001) Symctrical dimcthylation of arginine residues in spliceosomal Sm protein B/B’ and the Sm-like protein LSm4, and their interaction with the SMN protein. RNA 7: 1531-1542. Brahms IL, Raymackers J., Union A., de Keyser F., Meheus L., Lührmann R. (2000) The C-terminal RG dipeptide repeats of the spliceosomal Sm proteins DI and D3 contain symmetrical dimethylarginines, which form a major B-cell epitope for anti-Sm autoantibodies. J. Biol. Cliern. 275: 17122-17129. Brandt A. (1874) Uber die Eiróhren der Blatta orientalis (Periplaneta). Mem. Acad. Imp. Sci. I'll”"' Ser. 21: 1-30. Branlant C., Krol A., Ebel J.P., Lazar E., Bernard H., Jacob M. (1982) U2 RNA shares a structural domain with Ul, U4, and U5 RNAs. EMBOJ. 1: 1259-1265. Brasch K., Ochs R.L. (1992) Nuclear bodies (NBs): a newly “rediscovered” organelle. Exp. Cell Res. 202: 211-223. Bringmann P., Rinke J., Appel B., Reuter R., Lührmann R. (1983) Purification of snRNPs Ul, U2, U4, U5 and U6 with 2,2,7-trimcthylguanosine-specific antibody and definition of their constituent proteins reacting with anti-Sm and anti-(Ul)RNP antisera. EMBO J. 2: 1129-1135. 58 Brunet S., Thibault P., Gagnon E., Kearney P., Bergeron J.J.M., Desjardins M. (2003) Organelle proteomics: looking at less to see more. Trends Cell Biol. 13: 629-638. Bubulya P.A., Spector D.L. (2004) “On the move”ments of nuclear components in living cells. Exp. Cell Res. 296:4-11. Buchner P. (1966) Endosymbiosestudien an Schildläusen. VIH. Die Symbiosen der Palaeococcoidea. Z. Morph. Ökol. Tiere 56: 275-362. Buhler D., Raker V., Lührmann R., Fischer U. (1999) Essential role for the tudor domain of SMN in spliceosomal U snRNP assembly: implications for spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 8: 2351-2357. Büning J. (1972) Untersuchungen am Ovar von Bruchidius obtectus Say. (Coleoptera-Polyphaga) zur Klärung des Oocytenwachstums in der Prävitellogenese. Z. Zellforsch. 128: 241-282. Büning J. (1994) The insect ovary. Ultrastructure, previtellogenic growth and evolution. London: Chapman and Hall. Büning J. (1998) The ovariole: structure, type, and phylogeny, [w:] Microscopic Anatomy of Invertebrates. F.W. Harrison, M. Locke (red.), tom 11C: Insecto, s. 897-932. New York: Wiley-Liss, Inc. Büning, J., Sohst S. (1988) The flea ovary: ultrastructurc and analysis of cell clusters. Tissue Cell 20: 783-795. Büning, J., Sohst S. (1989) The ovary of Hystrichopsylla: structure and previtellogenic growth, [w:] Regulation of Insect Reproduction IV. M. Tonner, T. Soldán, B. Bennettova (red.), Proceedings of Symposium, Zinkovy, 1987, s. 113-124. Praha: Czechoslovak Academy of Sciences. Cajal S.R. (1903) Un sencillo método de coloración selectiva del retículo protoplasmico y sus efectos en los diversos órganos nerviosos de vertebrados e invertebrados. Trab. Lab. Invest. Biol. 2: 129--221. Campbell L., Hunter K.M., Mohaghegh P., Tinsley J.M., Brasch M.A., Davies K.E. (2000) Direct interaction of SMN with dp 103, a putative RNA helicase: a role for SMN in transcription regulation? Hum. Mol. Genet. 9: 1093-1100. Carmo-Fonseca M. (2002a) New clues to the function of the Cajal body. EMBO Reports 3: 726-727. Carmo-Fonseca M. (2002b) The contribution of nuclear compartmentalization to gene regulation. Cell 108: 513-521. Carmo-Fonseca M., Ferreira J., Lamond A.I. (1993) Assembly of snRNP-containing coiled bodies is regulated in interphase and mitosis - evidence that the coiled body is a kinetic nuclear structure. J. Cell Biol. 120: 841-852. Carmo-Fonseca M., Mendes-Soares L., Campos 1. (2000) To be or not to be in the nucleolus. Nat. Cell Biol. 2: E107-E112. Carmo-Fonseca M., Pepperkok R., Carvalho M.T., Lamond A.l. (1992) Transcription-dependent colocalization of the Ul, U2, U4/U6 and U5 snRNPs in coiled bodies. J. Cell Biol. 117: 1-14. Carmo-Fonseca M., Tollervey D., Pepperkok R., Barabino S.M.L., Merdes A., Brunner C., Zamorc P.D., Green M.R., Hurt E.C., Lamond A.L (1991) Mammalian nuclei contain foci which are highly enriched in components of the pre-mRNA splicing machinery. EMBO J. 10: 195-206. Carvalho T., Almeida F., Calapez A., Lafarga M., Bercian M.T., Carmo-Fonseca M. (1999) The spinal muscular atrophy disease gene product, SMN: a link between snRNP biogenesis and the Cajal (coiled) body. J. Cell Biol. 147: 715-727. Cassidy J.D., King R.C. (1972) Ovarian development in Habrobracon juglandis (Ashmead) (Hyme-noptera: Braconidae). I. The origin and differentiation of the oocyte - nurse cell complex. Biol. Bull. 143: 483-505. Cave M.D. (1982) Morphological manifestations of ribosomal DNA amplification during insect oogenesis, [w:] Insect Ultrastructure. R.C. King, H. Akai (red.), tom 1, s. 86-117. New York: Plenum Press. Chan E.K.L., Takano S., Andrade L.E.C., Hamel J.C., Matera A.G. (1994) Structure, expression and chromosomal localization of the human p80-coilin gene. Nucleic Acids Res. 22: 4462-4469. 59 Chandley A.C. (1966) Studies on oogenesis in Drosophila melanogaster with ll³-thymidine label. Exp. Cell Res. 44:201-215. Charroux B., Pellizzoni L., Perkinson R.A., Shevchenko A., Mann M., Dreyfuss G. (1999) Gemin3: a novel DEAD box protein that interacts with SMN, the spinal muscular atrophy gene product, and is a component of gems. J. Cell Biol. 147: 1181-1193. Charroux B., Pellizzoni L., Perkinson R.A., Yong J., Shevchenko A., Mann M., Dreyfuss G. (2000) Gemin4: a novel component of the SMN complex that is found in both gems and nucleoli. J. Cell Biol. 148: 1177-1186. Christensen M.E., Banker N. (1992) Mapping monoclonal antibody epitopes in the nucleolar protein fibrillarin (B-36) of Physarum polycephalum. Cell Biol. Int. Rep. 16: 1119-1131. Chubb J.R., Bickmore W.A. (2003) Considering nuclear compartmentalization in the light of nuclear dynamics. Cell 112: 403-406. Cioce M., Lamond A.l. (2005) Cajal bodies: a long history of discovery. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21: 105-131. Cooley L., Theurkauf W.E. (1994) Cytoskeletal functions during Drosophila oogenesis. Science 266: 590-596. Cooperslock R.L., Lipshitz H.D. (2001) RNA localization and translational regulation during axis specification in the Drosophila oocyte. Int. Rev. Cytol. 203: 541-566. Cruickshank R.H., Johnson K.P., Smith V.S., Adams R.J., Clayton D.H., Page R.D.M. (2001) Phylogenetic analysis of partial sequences of elongation factor la identifies major groups of lice (In-secta: Phthiraptera). Mol. Phylogenet. Evol. 19: 202-215. Daniely Y., Dimitrova D.D., Borowiec J.A. (2002) Stress-dependent nucleolin mobilization mediated by p53-nucleolin complex formation. Mol. Cell. Biol. 22: 6014-6022. Darzacq X., Jady B.E., Verheggen C., Kiss A.M., Bertrand E., Kiss T. (2002) Cajal body-specific small nuclear RNAs: a novel class of 2’-O-methylation and pseudouridylation guide RNAs. EMBO J. 21: 2746-2756. De Boni U. (1994) The interphase nucleus as a dynamic structure. Int. Rev. Cytol. 150: 149-171. Deryusheva S., Gall J.G. (2004) Dynamics of coilin in Cajal bodies of the Xenopus germinal vesicle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 4810-4814. DiMario P.J. (2004) Cell and molecular biology of nucleolar assembly and disassembly. Int. Rev. Cytol. 239: 99-178. Djagaeva I., Doronkin S., Beckendorf S.K. (2005) Src64 is involved in fusome development and karyosome formation during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 284: 143-156. Dominski Z., Marzluff W.F. (1999) Formation of the 3’ end of histone mRNA. Gene 239: 1-14. Doyle O., Corden J.L., Murphy C., Gall J.G. (2002) The distribution of RNA polymerase II largest subunit (RPB1) in the Xenopus germinal vesicle. J. Struct. Biol. 140: 154—166. Driel van R., Wansink D.G., van Steensel B., Grande M.A., Schul W., de Jong L. (1995) Nuclear domains and the nuclear matrix. Int. Rev. Cytol. 162A: 151-189. Dundr M., Hebert M.D., Karpova T.S., Stanek D., Xu H., Shpargel K.B., Meier U.T., Neugebauer K.M., Matera A.G., Misteli T. (2004) In vivo kinetics of Cajal body components. J. Cell Biol. 164: 831-842. Dundr M., Misteli T. (2001) Functional architecture in the cell nucleus. Biochem. J. 356: 297-310. Dundr M., Misteli T., Olson M.O.J. (2000) The dynamics of postmitotic reassembly of the nucleolus. J. Cell Biol. 150: 433—446. Eliceiri G.L., Sayavedra M.S. (1976) Small RNAs in the nucleus and cytoplasm of HeLa cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 72: 507-512. Etheridge K.T., Banik S.S.R., Armbruster B.N., Zhu Y.S., Terns R.M., Terns M.P. Counter C.M. (2002) The nucleolar localization domain of the catalitic subunit of human telomerase. J. Biol. Chem. 277: 24764-24770. Fakan S. (2004) The functional architecture of the nucleus as analysed by ultrastructural cytochemistry. Histochem. Cell Biol. 122: 83-93. 60 Ferreira J., Carmo-Fonseca M. (1995) The biogenesis of the coiled body during early mouse development. Development 121: 601-612. Ferreira J., Carmo-Fonseca M., Lamond A.l. (1994) Differential interaction of splicing snRNPs with coiled bodies and interchromatin granules during mitosis and assembly of daughter cell nuclei. J. Cell Biol. 126: 11-23. Fiil A., Moens P.B. (1972) The development, structure and function of modified synaptonemal complexes in mosquito oocytes. Chromosoma 36: 119-130. Filek K., Jarek E., Biliński S.M. (2002) Cajal bodies (coiled bodies) in the nuclei of the house cricket (Acheta domesticus) oocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 40: 221-222. Filipowicz W., Pogacic V. (2002) Biogenesis of small nucleolar ribonucleoproteins. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 319-327. Fischer U., Lin Q., Dreyfuss G. (1997) The SMN-SIP1 complex has an essential role in spliccosomal snRNP biogenesis. Cell 90: 1023-1029. Fischer U., Liihrmann R. (1990) An essential signaling role for the m3G cap in the transport of U1 snRNP to the nucleus. Science 249: 786-790. Fischer U., Sumpter V., Sekine M., Satoh T., Liihrmann R. (1993) Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap. EMBO J. 12: 573-583. Forbes D.J., Kornberg T.B., Kirschner M.W. (1983) Small nuclear RNA transcription and ribonucleo-protcin assembly in early Xenopus embryo. J. Cell Biol. 97: 62-72. Foster I I.A., Bridger J.M. (2005) The genome and the nucleus: a marriage made by evolution. Genom organisation and nuclear architecture. Chromosoma 114: 212-229. Fox A.H., Lam Y.W., Leung A.K., Lyon C.E., Andersen J.S., Mann M., Lamond A.l. (2002) Paraspeckles: a novel nuclear domain. Curr. Biol. 12: 13-25. Franke W.W. (2004) Actin’s many actions start at the genes. Nat. Cell Biol. 6: 1013-1014. Frey M.R., Bailey A.D., Weiner A.M., Matcra A.G. (1999) Association of snRNA genes with coiled bodies is mediated by nascent snRNA transcripts. Curr. Biol. 9: 126-135. Frey M.R., Matcra A.G. (1995) Coiled bodies contain U7 small nuclear RNA and associate with specific DNA sequences in interphase human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5915-5919. Frey M.R., Matera A.G. (2001) RNA-mediated interaction of Cajal bodies and U2 snRNA genes. J. Cell Biol. 154: 499-509. Friesen W.J., Dreyfuss G. (2000) Specific sequences of the Sm and Sm-like (Lsm) proteins mediate their interaction with the spinal muscular atrophy disease gene product (SMN). J. Biol. Chem. 275: 26370-26375. Friesen W.J., Massenet S., Paushkin S., Wyce A., Drey fuss G. (2001a) SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets. Mol. Cell. 7: 1111-1117. Friesen W.J., Paushkin S., Wyce A., Massenet S., Pesiridis G.S., Van Duyn G., Rappsilber J., Mann M., Dreyfuss G. (2001b) The mcthylosome, a 20S complex containing JBP1 and pICIn, produces di-methylarginine-modified Sm proteins. Mol. Cell. Biol. 21: 8289-8300. Fromont-Racine M., Senger B., Savcanu C., Fasiolo F. (2003) Ribosome assembly in eukaryotes. Gene 313: 17^12. Fu X-D., Maniatis T. (1990) Factor required for mammalian spliceosome assembly is localized to discrete regions in the nucleus. Nature 343: 437-441. Gall J.G. (1991) Spliceosomes and snurposomes. Science 252: 1499-1500. Gall J.G. (2000) Cajal bodies: the first 100 years. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16: 273-300. Gall J.G. (2001) A role for Cajal bodies in assembly of the nuclear transcription machinery. FEBS Let. 498: 164-167. Gall J.G. (2003) The centennial of the Cajal body. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 975-980. Gall J.G., Bellini M., Wu Z., Murphy C. (1999) Assembly of the nuclear transcription and processing machinery: Cajal bodies (coiled bodies) and transcriptosomes. Mol. Biol. Cell 10: 4385-4402. 61 Gall J.G., Macgregor H.C., Kidston M.E. (1969) Gene amplification in the oocytes of dytiscid water beetles. Chromosoma 26: 169-187. Gall J.G., Tsvetkov A., Wu Z., Murphy C. (1995) Is the sphere organelle/coiled body a universal nuclear component? Dev. Genet. 16: 25-35. Gall J.G., Wu Z., Murphy C., Gao H. (2004) Structure in the amphibian germinal vesicle. Exp. Cell Res. 296: 28-34. Ganot P., Jady B.E., Bortolin M.L., Darzacq X., Kiss T. (1999) Nucleolar factors direct the 2’-O--ribose methylation and pseudouridylation of U6 spliceosomal RNA. Mol. Cell. Biol. 19: 6906--6917. Garcia S.N., Pillus L. (1999) Nel results of nucleolar dynamics. Cell 97: 825-828. Gedge L.J.E., Morrison E.E., Blair G.E., Walker J.H. (2005) Nuclear actin is partially associated with Cajal bodies in human cells in culture and relocates to the nuclear periphery after infection of cells by adenovirus 5. Exp. Cell Res. 303: 229-239. Gerbi S.A., Borovjagin A.V., Lange T.S. (2003) The nucleolus: a site of ribonucleoprotein maturation. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 318-325. Gerbi S.A., Lange T.S. (2002) All small nuclear RNAs (snRNAs) of the [U4/U6, U5] tri-snRNP localize to nucleoli; identifiication of the nucleolar localization element of U6 snRNA. Mol. Biol. Cell 13: 3123-3137. Girard C., Mouaikel J., Neel H., Bertrand E., Bordonne R. (2004) Nuclear localization properties of a conserved protuberance in the Sm core complex. Exp. Cell Res. 299: 199-208. Goldstein P. (1981) Accessory nuclei in female Ascaris suum. J. Parasitol. 67: 697-701. Gross J. (1903) Untersuchungen über die Histologie des Insectenovariums. Zool. Jb. Abt. Morph. 18: 71-186. Gruzova M.N. (1962) The karyospherc formation in the oogenesis of Panorpa (Mecoptera). Tsitologiya A'. 150-159. Gruzova M.N. (1966) Studies of the role of the nucleus in RNA and protein metabolism of the Chry-sopaperla (Insecta) oocytes. Tsitologiya 8: 713-718. Gruzova M.N. (1979) Nuclear structures in the telotrophic ovarioles of nocturnal ground beetles (Tenebrionidac, Polyphaga). III. The oocyte nucleus. Electron microscopic data. Ontogenez 10: 332-339. Gruzova M.N., Batalova F.M. (1979) Nuclear structures in telotrophic ovarioles of the nocturnal ground beetles (Tenebrionidac, Polyphaga). II. The oocyte nucleus of Blaps lethifera and Gnaptor spinimanus. Light optical data. Ontogenez 10: 323-331. Gruzova M.N., Parfenov V.N. (1993) Karyosphere in oogenesis and intranuclear morphogenesis. Int. Rev. Cytol. 144: 1-52. Gruzova M.N., Tsvetkov A.G., Pachukalina G.N., Parfenov V.N. (1995) The formation of the karyosphere in the oogenesis of insects and amphibians. Tsitologiya 37: 744-769. Gruzova M.N., Zaichikova Z.P., Sokolov 1.1. (1972) Functional organisation of the nucleus in the oogenesis of Chrysopaperla L. Chromosoma 37: 353-386. Gubitz A.K., Feng W., Dreyfuss G. (2004) The SMN complex. Exp. Cell Res. 296: 51-56. Gubitz A.K., Mourelatos Z., Abel L., Rappsilber J., Mann M., Dreyfuss G. (2002) Gemin 5, a novel WD repeat protein component of the SMN complex that binds Sm proteins. J. Biol. Chem. 277: 5631-5636. Hamm J., Darzynkiewicz E., Tahara S.M., Mattaj I.W. (1990) The trimethylguanosine cap structure of U1 snRNA is a component of a bipartite nuclear targeting signal. Cell 62: 569- 577. Hamm J., Mattaj I.W. (1990) Monomethylated cap structures facilitate RNA export from the nucleus. Cell 63: 109-118. Handwerger K.E., Cordero J.A., Gall J.G. ( 2005) Cajal bodies, nucleoli and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol. Biol. Cell 16: 202-211. Handwerger K.E., Gall J.G. ( 2006) Subnuclear organelles: new insights into form and function. Trends Cell Biol. 16: 19-26. 62 Handwerger K.E., Murphy C., Gall J.G. ( 2003) Steady-state dynamics of Cajal body components in the Xenopus germinal vesicle. J. Cell Biol. 160: 495-504. Hardin J.W., Spicer S.S., Green W.B. (1969) The paranucleolar structure, accessory body of Cajal, sex chromatin, and related structures in nuclei of rat trigeminal neurons: a cytochemical and ultra-structural study. Anat. Rec. 164: 403—432. Hebert M.D., Shpargel K.B., Ospina J.K., Tucker K.E., Matera A.G. (2002) Coilin methylation regulates nuclear body formation. Dev. Cell 3: 329-337. Hebert M.D., Szymczyk P.W., Shpargel K.B., Matera A.G. (2001) Coilin forms the bridge between Cajal bodies and SMN, the spinal muscular atrophy protein. Genes Dev. 15: 2720-2729. Heredia M.L., Jansen R.P. (2004) mRNA localization and the cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 16: 80-85. Hermann H., Fabrizio P., Raker V.A., Foulaki K., Hornig H., Brahms IL, Löhrmann R. (1995) snRNP Sm proteins share two evolutionary conserved sequence motifs which arc involved in Sm protein-protein interactions. EMBOJ. 14: 2076-2088. Hirose T., Shu M.D., Steitz J.A. (2003) Splicing-dependent and -independent modes of assemby for intron-encoded box C/D snoRNPs in mammalian cells. Mol. Cell 12: 113-123. Hofmann W., Reichart B., Ewald A., Muller E., Schmitt I., Stäuber R.H., Lottspeich F., Jockusch J.M., Scheer U., Hauber J., Dabauvalle M.C. (2001) Cofactor requirements for nuclear export of Rev response elements (RRE)- and constitutive transport element (CTE)- containing retroviral RNAs: An unexpected role for actin. J. Cell Biol. 152: 859-910. Hofmann W.A., Stojiljkovic L., Fuchsova B., Vargas G.M., Mavrommatis E., Philimonenko V., Kyselä K., Goodrich J.A., Lessard J.L., Hope T.J., Hozak P., de Lanerolle P. (2004) Actin is part of pre-initiation complexes and is necessary for transcription by RNA polymerase II. Nat. Cell Biol. 6: 1094-1101. Hopkins C.R. (1964) The histochemistry and fine structure of the accessory nuclei in the oocyte of Bombus terrestris. Quart. J. Microsc. Sei. 105: 475-480. Howell W.M., Black D.A. (1980) Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a l-step method. Experientia 36: 1014. Hozak P., Sasseville A.M., Raymond Y., Cook P.R. (1995) Lamin proteins form an internal nucleo-skeleton as well as a peripheral lamina in human cells. J. Cell Sei. 108: 635-644. Hu P., Wu S., Hernandez N. (2004) A role for ß-actin in RNA polymerase III transcription. Genes Dev. 18:3010-3015. Huang S., Spector D.L. (1992) U1 and U2 small nuclear RNAs are present in nuclear species. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 305-308. Huber J., Cronshagen U., Kadokura M., Marshallsay C., Wada T., Sckine M., Löhrmann R. (1998) Snurportin 1, an m3G-cap-specific nuclear import receptor with a novel domain structure. EMBO J. 17: 4114—4126. Isaac C., Yang Y., Meier U.T. (1998) Nopp 140 functions as a molecular link between the nucleolus and the coiled bodies. J. Cell Biol. 142: 319-329. Izaurralde E., Lewis J., Gamberi C., Jarmolowski A., McGuigan C., Mattaj I.W. (1995) A capbinding protein complex mediating U snRNA export. Nature 376: 709-712. Izaurralde E., Lewis J., McGuigan C., Jankowska M., Darzynkiewicz E., Mattaj I.W. (1994) A nuclear cap-binding protein complex involved in pre-mRNA splicing. Cell 78: 657-668. Jabłońska A., Biliński S.M. (2001) Structure of ovarioles in adult queens and workers of the common wasp, Vespula germanica (Hymenoptera: Vespidae). Folia Biol. (Kraków) 49: 191-198. Jackson D.A. (2003) The principles of nuclear structure. Chromosome Res. 11: 387-401. Jacobs E.Y., Frey M.R., Wu W., Ingledue T.C., Gebühr T.C., Gao L., Marzluff W.F., Matera A.G. (1999) Coiled bodies preferentially associate with U4, Ul 1, and U12 small nuclear RNA genes in interphase HeLa cells but not with U6 and U7 genes. Mol. Biol. Cell 10: 1653-1663. Jacobs E.Y., Ogiwara I., Weiner A.M. (2004) Role of the C-terminal domain of RNA polymerase II in U2 snRNA transcription and 3’ processing. Mol. Cell. Biol. 24: 846-855. 63 Jady B.E., Bertrand E., Kiss T. (2004) Human telomerase and box H/ACA scaRNAs share a common Cajal body-specific localization signal. J. Cell Biol. 164: 647-652. Jady B.E., Darzacq X., Tucker K.E., Matera A.G., Bertrand E., Kiss T. (2003) Modification of Sm small nuclear RNAs occurs in the nucleoplasmic Cajal body following import from the cytoplasm. EMBO J. 22: 1878-1888. Jady B.E., Kiss T. (2001) A small nucleolar guide RNA functions both in 2’-O-ribose methylation and pseudouridylation of the U5 spliceosomal RNA. EMBO J. 20: 541-551. Jaglarz M. (1992) Peculiarities of the organization of egg chambers in carabid ground beetles and their phylogenetic implications. Tissue Cell 24: 397-409. Jaglarz M. (1997) Molekularne podłoże różnicowania linii płciowej i formowanie gonady zarodkowej Drosophila melanogaster. Post. Biot. Kom. 25: 263-282. Jaglarz M.K. (1998) The number that counts. Phylogenetic implications of the number of nurse cells in ovarian follicles of Coleoptera-Adephaga. Folia Histochem. Cytobiol. 36: 167-178. Jaglarz M.K. (2001) Nuclear bodies in the oocyte nucleus of ground beetles are enriched in snRNPs. Tissue Cell 33: 395^401. Jaglarz M.K., Biliński S.M., Kloc M. (2005) Assembly and breakdown of Cajal bodies in accessory nuclei of Hymenoptera. Differentiation 73: 99-108. Jansen R.P. (2001) mRNA localization: message on the move. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 247-256. Jarmolowski A., Boelens W.C., Izaurralde E., Mattaj l.W. (1994) Nuclear export of different classes of RNA is mediated by specific factors. J. Cell Biol. 124: 627-635. Jeffery W.R. (1989) Localized mRNA and the egg cytoskeleton. Int. Rev. Cytol. 119: 151-195. Johnson K.P., Cruickshank R.H., Adams R.J., Smith V.C., Page R.D.M., Clayton D.H. (2003) Dramatically elevated rate of mitochondrial substitution in lice (Insecta: Phthiraptera). Mol. Phyloge-net. Evol. 26: 231-242. Johnstone O., Lasko P. (2001) Translational regulation and RNA localization in Drosophila oocytes and embryos. Annu. Rev. Genet. 35: 365^106. Jones K.W., Górzyński K., Hales C.M., Fischer U., Badbanchi F., Terns R.M., Terns M.P. (2001) Direct interaction of the spinal muscular atrophy disease protein SMN with the small nucleolar RNA-associated protein fibrillarin. J. Biol. Chem. 276: 38645-38651. Jorgensen M. (1913) Zellenstudien I. Morphologische Beitrage zum Problem des Eiwachstums. Arch. Zellforsch. 10: 1-126. Jurica M.S., Moore M.J. (2003) Pre-mRNA splicing: awash in a sea of proteins. Mol. Cell 12: 5-14. Kambach C., Walkę S., Nagai K. (1999) Structure and assembly of the spliceosomal small nuclear ribonucleoprotein particles. Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 222-230. Kieffer-Kwon P., Martianov I., Davidson I. (2004) Cell-specific nucleolar localization of TBP-related factor 2. Mol. Biol. Cell 15: 4356—4368. King P.E., Fordy M.R. (1970) The formation of “accessory nuclei” in the developing oocytes of parasitoid hymenopterans Ophion luteus (L.) and Apanteles glomeratus (L.). Z. Zellforsch. 109: 158-170. King P.E., Richards J.G. (1968) Accessory nuclei and annulate lamellae in hymenopteran oocytes. Nature 218: 488. King R.C. (1970) Ovarian development in Drosophila melanogaster. New York: Academic Press. King R.C., Biining J. (1985) The origin and functioning of insect oocytes and nurse cells. [w:J Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. G.A. Kerkut i L.I. Gilbert (red ), tom 1, s. 37-82. Oxford: Pergamon Press. King R.C., Cassidy J.D. , Rousset A. (1982) The formation of clones of interconnected cells during gametogenesis in insects, [w:] Insect Ultrastructure. R.C. King i H. Akai (red.), tom 1, s. 3-31. New York: Plenum Press. Kiss A.M., Jady B.E., Darzacq X., Verheggen C., Bertrand E., Kiss T. (2002) A Cajal body-specific pseudouridylation guide RNA is composed of two box H/ACA snoRNA-like domains. Nucleic Acids Res. 30: 4643^1649. 64 Kiss-Laszlo Z., Henry Y., Bachellerie J.-P., Caizergucs-Ferrer M., Kiss T. (1996) Site-specific ribose methylation of preribosomal RNA: a novel function for small nucleolar RNAs. Cell 85: 1077— -1088. Kiss T. (2001) Small nucleolar RNA-guided post-transcriptional modification of cellular RNAs. EMBO J. 20:3617-3622. Kiss T. (2002) Small nucleolar RNAs: an abundant group of noncoding RNAs with diverse celular functions. Ce// 109: 145-148. Kiss T. (2004) Biogenesis of small nuclear RNPs. J. Cell Science 117: 5949-5951. Kiss T., Filipowicz W. (1995) Exonucleolitic processing of small nucleolar RNAs from pre-mRNA introns. Genes Dev. 9: 1411-1424. Klag J. (1994) Pochodzenie komórek płciowych, [w:] Ultrastruktura i funkcja komórki. S. Biliński, Z. Bielańska-Osuchowska, J. Kawiak, A. Przelęcka (red.), tom 6: Oogeneza, s. 16-29. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN. Klag J., Biliński S.M. (1994) Germ cell cluster formation and oogenesis in the hymenopteran Cole-ocentrotus soldanskii. Tissue Cell 26: 699-706. Kloc M. (1976) Extrachromosomal DNA and RNA-synthesis in oocytes of Creophilus maxillosus (Staphylinidae, Coleoptera, Polyphaga). Experientia 32: 375-377. Kloc M. (1980) Extrachromosomal DNA and its activity in RNA synthesis in oogonia and oocytes in the pupal ovary of Creophilus maxillosus (Staphylinidae, Coleoptera-Polyphaga). Eur. J. Cell Biol. 21: 328-334. Kloc M., Biliński S. (2000) Lokalizacja morfogenów w oocytach kręgowców. Post. Biol. Kom. 27, supl. 15: 121-132. Kloc M., Biliński S. (2003) RNA localization and its role in the spatially restricted protein synthesis. Folia Histochem. Cytobiol. 41: 3-11. Kloc M., Biliński S., Chan A.P., Allen L.H., Zcarfoss N.R., Elkin L.D. (2001) RNA localization and germ cell determination in Xenopus. Int. Rev. Cytol. 203: 63-91. Kloc M., Biliński S., Elkin L.D. (2004) The Balbiani body and germ cell determinants: 150 years later. Curr. Top. Dev. Biol. 59: 1-36. Kloc M., Elkin L.D. (2005) RNA localization mechanisms in oocytes. J. Cell Sci. 118: 269-282. Kloc M., Matuszewski B. (1977) Extrachromosomal DNA and the origin of oocytes in the tclo-trophic-meroistic ovary of Creophilus maxillosus (Staphylinidae, Coleoptera-Polyphaga). Roux's Arch. Dev. Biol. 183: 351-368. Kloc M., Matuszewski B., Nurkowska B. (1995) Ribosomal gene amplification in the oocytes of Creophilus maxillosus (Staphylinidae, Coleoptera: Polyphaga) - an insect with telolrophic ovaries. Folia Histochem. Cytobiol. 33: 267-276. Kloc M., Zearfoss N.R., Elkin L.D. (2002) Mechanisms of subcellular mRNA localization. Cell 108: 533-544. Krainer A. (1988) Pre-mRNA splicing by complementation with purified human U1, U2, U4/U6 and U5 snRNPs. Nucleic Acids Res. 16: 9415-9429. Kramer A., Gruter P., Groning K., Kastner B. (1999) Combined biochemical and electron microscopic analyses reveal the architecture of the mammalian U2 snRNP. J. Cell Biol. 145: 1355-1368. Krauss S.W., Chen C., Penman S., Heald R. (2003) Nuclear actin and protein 4.1: Essential interactions during nuclear assembly in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 10752-10757. Kubrakiewicz J. (1991) Ovary structure and oogenesis of Polyxenus lagurus (L.) (Diplopoda, Psela-phognatha). An ultrastructural study. Zool. JbAnat. 121: 81-93. Kubrakiewicz J. (1997) Strategie gromadzenia rRNA w komórkach jajowych zwierząt. Post. Biol. Korn. 24, supl. 9: 65-79. Kubrakiewicz J. (1998) Struktura i funkcja zespołów komórek płciowych w politroficznych owario-lach sieciarek (Insecta: Neuroptera). Wydawnictwo Uniwersytetu Wrocławskiego, Wroclaw. Kubrakiewicz J. (2002) Extrachromosomal rDNA amplification in the oocytes of Polystoechotes punctatus (Fabricius) (Insecta, Neuroptera: Polystoechotidae). Arthr. Struct. Dev. 31: 23-31. 65 Kubrakiewicz J., Adamski R.T., Biliński S.M. (1991) Ultraslructural studies on accessory nuclei in developing oocytes of the crustacean, Siphonophanes grubei. Tissue Cell 23: 903-907. Kubrakiewicz J., Biliński S.M. (1995) Extrachromosomal amplification of rDNA in oocytes of Heme-robius spp. (Insecta, Neuroptera). Chromosoma 103: 606-612. Kubrakiewicz J., Jędrzejowska I., Biliński S.M. (1998) Neuropteroidea - different ovary structure in related groups. Folia Histochem. Cytobiol. 36: 179-187. Kukalev A., Nord Y., Palmberg C., Bergman T., Percipalle P. (2005) Actin and hnRNP U cooperate for productive transcription by polymerase II. Nat. Struct. Mol. Biol. 12: 238-244. Lam Y.W., Lyon C.E., Lamond A.I. (2002) Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells. Mol. Biol. Cell 13: 2461-2473. Lam Y.W., Trinkle-Mulcahy L., Lamond A. I. (2005) The nucleolus. J. Cell Sci. 118: 1335-1337. Lamond A.I. (1999) Running rings around RNA. Nature 397: 655-656. Lamond A.I., Carmo-Fonseca M. (1993a) The coiled body. Trends Cell Biol. 3: 198-204. Lamond A.I., Carmo-Fonseca M. (1993b) Localization of splicing snRNPs in mammalian cells. Mol. Biol. Rep. 18: 127-133. Lamond A. I., Eamshaw W.C. (1998) Structure and function in the nucleus. Science 280: 547-553. Lamond A.I., Sleeman J.E. (2003) Nuclear substructure and dynamics. Curr. Biol. 13: R825-R828. Lamond A.I., Spector D.L. (2003) Nuclear speckles: a model for nuclear organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4: 605-612. Lanerolle P., Johnson T., Hofmann W.A. (2005) Actin and myosin I in the nucleus: what next? Nat. Struct. Molec. Biol. 12: 742-746. Lange T.S., Gerbi S.A. (2000) Transient nucleolar localization of U6 small nuclear RNA. Mol. Biol. Cell 11: 2419-2428. Lefebvre S., Biirglen L., Reboullet S., Clermont O., Burlet P., Viollet L., Bcnichou B., Cruaud C., Mil-lasseau P., Zeviani M., Le Paslier D., Frezal J., Cohen D., Weissenbach J., Munnich A., Melki J. (1995) Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell 80: 155-165. Lefebvre S., Burlet P., Liu Q., Bertrandy S., Clermont O., Munnich A., Dreyfuss G., Melki J. (1997) Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 16: 265-269. Lerner E.A., Lerner M.R., Janeway C.A., Stcitz J.A. (1981) Monoclonal antibodies to nucleic acidcontaining cellular constituents: probes for molecular biology and autoimmune disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2737-2741. Leung A.K., Gerlich D., Miller G., Lyon C., Lam Y.W., Lleres D., Daigle N., Zomerdijk J., Ellenberg J., Lamond A.I. (2004) Quantitative kinetic analysis of nucleolar breakdown and reassembly during mitosis in live human cells. J. Cell Biol. 166: 787-800. Leung A.K., Lamond A.I. (2003) The dynamics of the nucleolus. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 13: 39-54. Lewis J.D., Tollervey D. (2000) Like attracts like: getting RNA processing together in the nucleus. Science 288: 1385-1389. Lima-de-Faria A., Moses M.J. (1966) Ultrastructure and cytochemistry of metabolic DNA in Tipula. J. Cell Biol. 30: 177-192. Limbach P.A., Crain P.F., McCloskey J.A. (1994) Summary: the modified nucleosides of RNA. Nucleic Acids Res. 22: 2183-2196. Liu Q., Dreyfuss G. (1996) A novel nuclear structure containing the survival of motor neurons protein. EMBOJ. 15:3555-3565. Liu Q., Fischer U., Wang F., Dreyfuss G. (1997) The spinal muscular atrophy disease gene product, SMN, and its associated protein S1P1 are in a complex with spliceosomal snRNP proteins. Cell 90: 1013-1021. Mahajan-Miklos S., Cooley L. (1994) Intercellular cytoplasm transport during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 165:336-351. 66 Mahowald A.P. (2001) Assembly of Drosophila germ plasm. Int. Rev. Cytol. 203: 187-213. Malatesta M., Scassellati C., Meister G., Plóttner O., Buhler D., Sowa G., Martin T.E., Keidel E., Fischer U., Fakan S. (2004) Ultrastructural characterisation of a nuclear domain highly enriched in survival of motor neuron (SMN) protein. Exp. Cell Res. 292: 312-321. Malatesta M., Zancanaro C., Marlin T.E., Chan E.K.L., Amalric F., Liihrmann R., Vogel P., Fakan S. (1994a) Cytochemical and immunocytochemical characterization of nuclear bodies during hibernation. Eur. J. Cell Biol. 65: 82-93. Malatesta M., Zancanaro C., Martin T.E., Chan E.K.L., Amalric F., Liihrmann R., Vogel P., Fakan S. (1994b) Is the coiled body involved in nucleolar functions? Exp. Cell Res. 211: 415-419. Massenet S., Mougin A., Branlant C. (1998) Posttranscriptional modifications in the U small nuclear RNAs. [w:] The Modification and Editing of RNA. H. Grosjean, R. Benne (red.), s. 201-227. Washington DC: ASM Press. Massenet S., Pellizzoni L., Paushkin S., Mattaj I.W., Dreyfuss G. (2002) The SMN complex is associated with snRNPs throughout their cytoplasmic assembly pathway. Mol. Cell. Biol. 22: 6533— -6541. Matera A.G. (1998) Of coiled bodies, gems, and salmon. J. Cell Biochem. 70: 181-192. Matera A.G. (1999) Nuclear bodies: multifaceted subdomains of the interchromatin space. Trends Cell Biol. 9: 302-309. Matera A.G. (2003) Cajal bodies. Curr. Biol. 13: R503. Matera A.G., Frey M.R. (1998) Coiled bodies and gems: janus or gemini? Am. J. Hum. Genet. 63: 317-321. Matera A.G., Ward D.C. (1993) Nucleoplasmic organization of small nuclear ribonucleoproteins in cultured human cells. J. Cell Biol. 121: 715-727. Mattaj I.W. (1986) Cap trimethylation of U snRNA is cytoplasmic and dependent on U snRNP protein binding. Cell 46: 905-911. Mattaj I.W. (1998) Ribonucleoprotein assembly: clues from spinal muscular atrophy. Curr. Biol. 8: R93-R95. Matuszewski B., Hoser P. (1975) Gene amplification and its effect on the structure and function of the oocyte nucleus in the whirligig beetle, Gyrinus natator (Gyrynidae, Coleoptera: Adephaga). Experiential: 431—432. Matuszewski B., Kloc M. (1976) Gene amplification in oocytes of the rove beetle Creophilus maxil-losus Staphylinidae, (Coleoptera-Polyphaga). Experientia 32: 34-36. Mayer C., Bierhoff H., Grummt I. (2005) The nucleolus as a stress sensor: JNK2 inactivates the transcription factor TIF-IA and down-rcgulates rRNA synthesis. Gen. Dev. 19: 933-941. Mazurkiewicz M., Kubrakiewicz J. (2002) Nucleolar activity of germ cells in polytrophic ovaries of crane flies (Diptera: Tipulidac). Ultrastructural and cytochemical studies. Folia Histochem. Cyto-biol. 40: 47-50. Meder V.S., Boeglin M., de Murcia G., Schreiber V. (2005) PARP-1 and PARP-2 interact with nuc-leophosmin/B23 and accumulate in transcriptionally active nucleoli. J. Cell Sci. 118: 211-222. Meier U.T. (2005) The many facets of H/ACA ribonucleoproteins. Chromosoma 114: 1-14. Meister G., Eggert C., Buhler D., Brahms H., Kambach C., Fischer U. (2001) Methylation of Sm proteins by a complex containing PRMT5 and the putative U snRNP assembly factor plCln. Curr. Biol. 11: 1990-1994. Meister G., Eggert C., Fischer U. (2002) SMN-mediated assembly of RNPs: a complex story. Trends Cell Biol. 12: 472—478. Meister G., Fischer U. (2002) Assisted RNP assembly: SMN and PRMT5 complexes cooperate in the formation of spliceosomal U snRNPs. EMBOJ. 21: 5853-5863. Mekhail K., Gunaratnam L., Bonicalzi M.E., Lee S. (2004) HIF activation by pH-depcndent nucleolar sequestration of VHL. Nat. Cell Biol. 6: 642-647. Melese T., Xue Z. (1995) The nucleolus: an organelle formed by the act of building a ribosome. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 319-324. 67 Melki J. (1997) Spinal muscular atrophy. Curr. Opin. Neurol. 10: 381-385. Meyer G.F., Sokoloff S., Wolf B.E., Brand B. (1979) Accessory nuclei (nuclear membrane balloons) in the oocytes ofdipteran Phryne. Chromosoma 75: 89-99. Micklem D R. (1995) mRNA localisation during development. Dev. Biol. 172: 377-395. Misteli T. (2001) Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science 291: 843-847. Misteli T. (2005) Concepts in nuclear architecture. BioEssays 27: 477-487. Monneron A., Bernhard W. (1969) Fine structural organization of the interphase nucleus in some mammalian cells. J. Ultrastruct. Res. 27: 266-288. Morgan G.T., Doyle O., Murphy C., Gall J.G. (2000) RNA polymerase II in Cajal bodies of amphibian oocytes. J. Struct. Biol. 129: 258-268. Morohoshi F., Ootsuka Y., Arai K., Ichikawa H., Mitani S., Munakata N., Ohki M. (1998) Genomic structure of the human RBP56/hTAFII68 and FUS/TLS genes. Gene 221: 191-198. Mouaikel J., Narayanan U., Verheggen C., Matera A.G., Bertrand E., Tazi J., Bordonne R. (2003) Interaction between the small-nuclear-RNA cap hypermethylasae and the spinal muscular atrophy protein, survival of motor nuron. EMBO Rep. 4: 616-622. Mourelatos Z., Abel L., Yong J., Kataoka N., Dreyfuss G. (2001) SMN interacts with a novel family of hnRNP and spliceosomal proteins. EMBO J. 20: 5443-5452. Muller B., Schumperli D. (1997) The U7 snRNP and the hairpin binding protein: key players in histone mRNA metabolism. Semin. Cell Dev. Biol. 8: 567-576. Nakayasu H., Ueda K. (1984) Small nuclear RNA-protein complex anchors on the actin filaments in bovine lymphocyte nuclear matrix. Cell Struct. Fund. 9: 317-325. Nakielny S., Dreyfuss G. (1999) Transport of proteins and RNAs in and out of the nucleus. Cell 99: 677-690. Narayanan U., Achsel T., Lilhrmann R., Matera A.G. (2004) Coupled in vitro import of U snRNPs and SMN, the spinal muscular atrophy protein. Mol. Cell 16: 223-234. Narayanan U., Ospina J. K.., Frey M.R., Hebert M.D., Matera A.G. (2002) SMN, the spinal muscular atrophy protein, forms a pre-import snRNP complex with snurportin 1 and importin B. Hum. Mol. Genet. 11: 1785-1795. Navascues J., Berciano M.T., Tucker K.E., Lafarga M., Matera A.G. (2004) Targeting SMN to Cajal bodies and nuclear gems during neuritogenesis. Chromosoma 112: 398^409. Nesic D., Tanackovic G., Kramer A. (2004) A role for Cajal bodies in the final steps of U2 snRNP biogenesis. J. Cell Sci. 117: 4423^4433. Nishi K., Yoshida M., Fujiwara D., Nishikawa M., Horinouchi S., Beppu T. (1994) Leptomycin B targets a regulatory cascade of crml, a fission yeast nuclear protein involved in control of higher order chromosome structure and gene expression. J. Biol. Chem. 269: 6320-6324. Ochs R.L., Busch H. (1984) Further evidence that phosphoprotein C23 (110kD/pI5.1) is the nucleolar silver staining protein. Exp. Cell Res. 152: 260-265. Ochs R.L., Stein T.W., Tan E.M. (1994) Coiled bodies in the nucleolus of breast cancer cells. J. Cell Sci. 107: 385-399. Ogg S.C., Lamond A.I. (2002) Cajal bodies and coilin: Moving towards function. J. Cell Biol. 159: 17-21. Ohno M., Segref A., Bachi A., Wilm M., Mattaj I.W. (2000) PHAX, a mediator of U snRNA nuclear export whose activity is regulated by phosphorylation. Cell 101: 187-198. Olave I.A., Reck-Peterson S.L., Crabtree G.R. (2002) Nuclear actin and actin-related proteins in chromatin remodeling. Annu. Rev. Biochem. 71: 755-781. Olson M.O.J., Dundr M., Szebeni A. (2000) The nucleolus: an old factory with unexpected capabilities. Trends Cell Biol. 10: 189-196. Olson M.O., Hingorani K., Szebeni A. (2002) Conventional and nonconventional roles of the nucleolus. Int. Rev. Cytol. 219: 199-266. 68 Page R.D.M., Cruickshank R., Johnson K.P. (2002) Louse (Insecta: Phthiraptera) mitochondrial 12S rRNA secondary structure is highly variable. Insect Mol. Biol. 11: 361-369. Palacios I., Hetzer M., Adam S.A., Mataj l.W. (1997) Nuclear import of U snRNPs requires importin P. EMBOJ. 16: 6783-6792. Palacios I.M., St Johnston D. (2001) Getting the message across: the intracellular localization of mRNA in higher eukaryotes. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 17: 569-614. Palevody C. (1972) Presence de noyaux accessoires dans l’ovaocyte du Collembole Folsomia candida Willem (Insecte, Apterygote). C. R. Acad. Sci. Paris 274: 3258-3261. Parfenov V.N., Davis D.S., Pochukalina G.N., Sample C.E., Bugaeva E.A., Murti K.G. (1995) Nuclear actin filaments and their topological changes in frog oocytes. Exp. Cell Res. 217: 385-394. Parfenov V.N., Davis D.S., Pochukalina G.N., Sample C.E., Murti K.G. (1996) Nuclear bodies of stage 6 oocytes of Rana temporaria contain nucleolar and coiled body proteins. Exp. Cell Res. 228: 229-236. Paushkin S., Gubitz A.K., Massenet S., Dreyfuss G. (2002) The SMN complex, an assemblyosome of ribonuclcoproteins. Curr. Opin. Cell Biol. 14: 305-312. Paushkin S.V., Patel M., Furia B.S., Peltz S.W., Trotta C.R. (2004). Identification of a human endonuclease complex reveals a link between tRNA splicing and pre-mRNA 3' end formation. Cell 117: 311-321. Pcarn J. (1980) Classification of spinal muscular atrophies. Lancet 1: 919-922. Pcculis B.A. (2002) Ribosome biogenesis: ribosomal RNA synthesis as a package deal. Curr. Biol. 12: R623-R624. Pederson T. (1998) The plurifunctional nucleolus. Nucleic Acids Res. 26: 3871-3876. Pederson T. (2002) Proteomics of the nucleolus: more proteins, more functions? Trends Biochem. Sci. 27: 111-112. Pederson T. (2004) Can telomerase be put in its place? J. Cell Biol. 164: 637-639. Pederson T., Aebi (J. (2003) Actin in the nucleus: What form and what for? J. Struct. Biol. 140: 3-9. Pederson T., Politz J. (2000) The nucleolus and four ribonucleoproteins of translation. J. Cell Biol. 148: 1091-1095. Pellizzoni L., Baccon J., Charroux B., Dreyfuss G. (2001a) The survival motor neurons (SMN) protein interacts with the snoRNP proteins fibrillarin and GAR1. Curr. Biol. 11: 1079-1088. Pellizzoni L., Charroux B., Rappsilbcr J., Mann M., Dreyfuss G. (2001b) A functional interaction between the survival motor neuron complex and RNA polymerase 11. J. Cell Biol. 152: 75-85. Pellizzoni L., Kataoka N., Charroux B., Dreyfuss G. (1998) A novel function for SMN, the spinal muscular atrophy disease gene product, in prc-mRNA splicing. Cell 95: 615-624. Pellizzoni L., Yong J., Dreyfuss G. (2002) Essential role for the SMN complex in the specificity of snRNP assembly. Science 298: 1775-1779. Pcrcipalle P., Fomproix N., Kylberg K., Miralles F., Bjorkroth B., Daneholt B., Visa N. (2003) An actin-ribonucleoprotein interaction is involved in transcription by RNA polymerase II. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6475-6480. Percipalle P., Jonsson A., Nashchekin D., Karlsson C., Bergman T., Guialis A., Daneholt B. (2002) Nuclear actin is associated with a specific subset of hnRNP A/B-type proteins. Nucleic Acids Res. 30: 1725-1734. Percipalle P., Zhao J., Pope B., Weeds A., Lindberg U., Daneholt B. (2001) Actin bound to the heterogenous nuclear ribonuclcoprotein hrp36 is associated with Balbiani ring mRNA from the gene to polysomes. J. Cell Biol. 153: 229-236. Philimoncnko V.V., Zhao J., Iben S., Dingová FL, Kyselá K., Kahle M., Zentgraf H., Hofmann W.A., de Lanerollc P., Hozák P., Grummt 1. (2004) Nuclear actin and myosin I are required for RNA polymerase I transcription. Nat. Cell Biol. 6: 1165-1172. Pillai R.S., Grimmler M., Meister G., Will C.L., Lührmann R., Fischer U., Schümperli D. (2003) Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm 11, in histone RNA processing. Genes Dev. 17: 2321-2333. 69 Platani M., Goldberg I., Lamond A.I., Swedlow J.R. (2002) Cajal body dynamics and association with chromatin are ATP-dcpendent. Nat. Cell Biol. 4: 502-508. Platani M., Goldberg 1., Swedlow J.R., Lamond A.I. (2000) In vivo analysis of Cajal body movement, separation, and joining in live human cells. J. Cell Biol. 151: 1561-1574. Plessel G., Fischer U., Lührmann R. (1994) m3G cap hypermethylation of U1 small nuclear ribonucleoprotein (snRNP) in vitro: evidence that the U1 small nuclear RNA-(-guanosine-N2)--methyltransferase is a non-snRNP cytoplasmic protein that requires a binding site on the Sm core domain. Mol. Cell. Biol. 14: 4160—4172. Raker V.A., Hartmuth K., Kastner B., Lührmann R. (1999) Spliceosomal U snRNP core assembly: Sm protein assemble onto an Sm site RNA nonanuclcotide in a specific and thermodynamically stable manner. Mol. Cell. Biol. 19: 6554-6565. Raker V.A., Plessel G., Lührmann R. (1996) The snRNP core assembly pathway: identification of stable core protein heteromeric complexes and an snRNP subcore particle in vitro. EMBO J. 15: 2256-2269. Rando O.J., Zhao K., Crabtree G.R. (2000) Searching for a function for nuclear actin. Trends Cell Biol. 108: 92-97. Raska I., Andrade L.E.C., Ochs R.L., Chan E.K.L., Chang C M., Roos G., Tan E.M. (1991) Immunological and ultrastructural studies of the nuclear coiled body with autoimmune antibodies. Exp. Cell Res. 195: 27-37. Raska I., Ochs R.L., Salamin-Michel L. (1990) Immunocytochemistry of the cell nucleus. Electron Microsc. Rev. 3: 301-353. Ray A., Ramamurty P.S. (1979) Sources of RNA supply to the oocytes in Crynodes peregrinas Fu-essly (Coleóptera, Chrysomelidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 8: 113-122. Renvoise B., Khoobarry K., Gendron M.-C., Cibert C., Viollet L., Lefebvre S. (2006) Distinct domains of the spinal muscular atrophy protein SMN are required for targeting to Cajal bodies in mammalian cells. J. Cell Sci. 119: 680-692. Reynolds E.S. (1963) The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol. \7: 208. Richard P., Darzacq X., Bertrand E., Jady B E., Verheggen C., Kiss T. (2003) A common sequence motif determines the Cajal body-specific localization of box H/ACA scaRNAs. EMBO J. 22: 4283-4293. Riechmann V., Ephrussi A. (2001) Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 11: 374-383. Ries E. (1932) Die Prozesse der Eibildung und das Eiwachstum bei Pediculiden und Mallophagen. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anal. 16: 314—388. Ro-Choi T.S. (1999) Nuclear snRNA and nuclear function (discovery of 5’cap structures in RNA). Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 9: 107-158. Rodway H., Llanos S., Rowe J., Peters G. (2004) Stability of nucleolar versus non-nuclcolar forms of human p 14 (ARF). Oncogene 23: 6186-6192. Roth M.B. (1995) Spheres, coiled bodies and nuclear bodies. Curr. Opin. Cell Biol. 7: 325-328. Roth T.F. (1966) Changes in the synaponemal complex during meiotic prophase in mosquito oocytes. Protoplasma 61: 346-386. Rübsam R., Büning J. (2001) F-actin is a component of the karyosome in neuropteran oocyte nuclei. Arthr. Struct. Dev. 30: 125-133. Sacharczuk M., Swiergiel A.H., Jaszczak K. (2004) Organizacja i funkeja cialek Cajala. Kosmos 53: 315-323. Saffman E.E., Lasko P. (1999) Germline development in vertebrates and invertebrates. Cell. Mol. Life Sci. 55: 1141-1163. Sahlas D.J., Milankov K., Park P.C., De Boni U. (1993) Distribution of snRNPs, splicing factor SC-35 and actin in interphase nuclei: immunocytochemical evidence for differential distribution during changes in functional states. J. Cell Sci. 105: 347-357. 70 Sanford J.R., Caceres J.F. (2004) Pre-mRNA splicing: life at the centre of the central dogma. J. Cell Sci. 117: 6261-6263. Sauman I., Berry S.J. (1994) An actin infrastructure is associated with eukaryotic chromosomes: structural and functional significance. Eur. J. Cell Biol. 64: 348-356. Scheer U., Hinsenn H., Franke W.W., Jockusch B.M. (1984) Microinjection of actin-binding proteins and actin antibodies demonstrates involvement of nuclear actin in transcription of lampbrush chromosomes. Cell 39: 111-122. Scheer U., Hock R. (1999) Structure and function of the nucleolus. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 385— -390. Scherl A., Coulé Y., Déon C., Callé A., Kindbeiter K., Sanchez J-C., Greco A., Hochstrasser D., Diaz J-J. (2002) Functional proteomic analysis of human nucleolus. Mol. Biol. Cell 13: 4100-4109. Schul W., Adelaar B., van Driel R., de Jong L. (1999) Coiled bodies are predisposed to a spatial association with genes that contain snoRNA sequences in their introns. J. Cell. Biochem. 75: 393— ^103. Schul W., van Driel R., de Jong L. (1998) Coiled bodies and U2 snRNA genes adjacent to coiled bodies are enriched in factors required for snRNA transcription. Mol. Biol. Cell 9: 1025-1036. Segault V., Will C.L., Sproat B.S., Lührmann R. (1995) In vitro reconstitution of mammalian U2 and U5 snRNPs active in splicing: Sm proteins are functionally interchangeable and are essential for the formation of functional U2 and U5 snRNPs. EMBOJ. 14: 4010—4021. Segref A., Mattaj I.W., Ohno M. (2001) The evolutionarily conserved region of the U snRNA export mediator PH AX is a novel RNA-binding domain that is essential for U snRNA export. RNA 7: 351-360. Selenko P., Sprangers R., Stier G., Buhler D., Fischer U., Sattler M. (2001) SMN tudor domain structure and its interaction with the Sm proteins. Nat. Struct. Biol. 8: 27-31. Shao R., Campbell N.J.H., Barker S.C. (2001) Numerous gene rearrangements in the mitochondrial genome of the wallaby louse, Heterodoxus macropus (Phthiraptera). Mol. Biol. Evol. 18: 858— -865. Shaw P., Doonan J. (2005) The nucleolus. Playing by different rules? Cell Cycle 4: 102-105. Shaw P.J., Jordan E.G. (1995) The nucleolus. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11: 93-121. Shopland L.S., Byron M., Stein J.L., Lian J.B., Stein G.S., Lawrence J.B. (2001) Replication--dependent histone gene expression is related to Cajal body (CB) association but does not require sustained CB contact. Mol. Biol. Cell 12: 565-576. Shou W., Seol J.H., Shevchenko A., Baskerville C., Moazed D., Chen Z.W.S., Jang J., Shevchenko A., Charbonneau H., Deshaies R.J. (1999) Exit from mitosis is triggered by Tern 1-dependent release of the protein phosphatase Cdcl4 from nucleolar RENT complex. Cell 97: 233-244. Shpargel K.B., Ospina J.K., Tucker K.E., Matera A.G., Hebert M.D. (2002) Control of Cajal body number is mediated by the coilin C-terminus. J. Cell Sci. 116: 303-312. Shumaker D.K., Kuczmarski E.R., Goldman R.D. (2003) The nucleoskeleton: lamins and actin are major players in essential nuclear functions. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 358-366. Skare P., Kreivi J.P., Bergstrom R., Karlsson R. (2003) Profilin I colocalizes with speckles and Cajal bodies: a possible role in pre-mRNA splicing. Exp. Cell Res. 286: 12-21. Sleeman J.E., Ajuh P., Lamond A.I. (2001) snRNP protein expression enhances the formation of Cajal bodies containing p80-coilin and SMN. J. Cell Sci. 114: 4407-4419. Sleeman J.E., Lamond A.I. (1999a) Newly assembled snRNPs associate with coiled bodies before species, suggesting a nuclear snRNP maturation pathway. Curr. Biol. 9: 1065-1074. Sleeman J.E., Lamond A.I. (1999b) Nuclear organization of pre-mRNA splicing factors. Curr. Opin. Cell Biol. 11:372-377. Sleeman J.E., Lyon C.E., Platani M., Kreivi J.P., Lamond A.I. (1998) Dynamic interactions between splicing snRNPs, coiled bodies and nucleoli revealed using snRNP protein fusions to the green fluorescent protein. Exp. Cell Res. 243: 290-304. 71 Sleeman J.E., Trinkle-Mulcahy L., Prescott A.R., Ogg S.C., Lamond A.I. (2003) Cajal body proteins SMN and Coilin show differential dynamie behaviour in vivo. J. Cell Sci. 116: 2039-2050. Smetana K., Ochs R., Lischwe M.A., Gyorkey F., Freireich E., Chudomel V., Busch H. (1984) Immunofluorescence studies on proteins B23 and C23 in nucleoli of human lymphocytes. Exp. Cell Res. 152: 195-203. Smith C.M., Steitz J.A. (1997) Sno storm in the nucleolus: new roles for myriad small RNPs. Cell 89: 669-672. Smith K.P., Carter K.C., Johnson C.V., Lawrence J.B. (1995) U2 and U1 snRNA gene loci associate with coiled bodies. J. Cell Biochem. 59: 473^185. Snaar S., Wiesmeijer K., Jochemsen A.G., Tankę H. J., Dirks R.W. (2000) Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J. Cell Biol. 151: 653-662. Spector D.L. (1993) Macromolecular domains within the cell nucleus. Annu. Rev. Cell Biol. 9: 265— -315. Spector D.L. (1996) Nuclear organization and gene expression. Exp. Cell Res. 229: 189-197. Spector D.L. (2001) Nuclear domains. J. Cell Sci. 114: 2891-2893. Spector D.L. (2003) The dynamics of chromosome organization and gene regulation. Annu. Rev. Biochem. 72: 573-608. Staley J.P., Guthrie C. (1998) Mechanical devices of the spliceosome: motors, clocks, springs, and things. Ce//92: 315-326. Stanek D., Neugebauer K.M. (2004) Detection of snRNP assembly intermediates in Cajal bodies by fluorescence resonance energy transfer. J. Cell Biol. 166: 1015-1025. Stanek D., Rader S.D., Klingauf M., Neugebauer K.M. (2003) Targeting of U4/U6 small nuclear RNP assembly factor SART3/pl 10 to Cajal bodies. J. Cell Biol. 160: 505-516. Stark H., Dube P., Lührmann R., Kastner B. (2001) Arrangement of RNA and proteins in the spliceo-somal U1 small nuclear ribonucleoprotein particle. Nature 409: 539-542. Stein G.S., Zaidi S.K., Braastad C.D., Montecino M., van Wijnen A.J., Choi J.-Y., Stein J.L., Lian J.B., Javed A. (2003) Functional architecture of the nucleus: organizing the regulatory machinery for gene expression, replication and repair. Trends Cell Biol. 13: 584-592. St Johnston D. (2005) Moving messages: the intracellular localization of mRNAs. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 363-375. Strasswimmer J., Lorson C.L., Breiding D.E., Chen J.J., Le T., Burghes A.H.M., Androphy E.J. (1999) Identification of survival motor neuron as a transcriptional activator-binding protein. Hum. Mol. Genet. 8: 1219-1226. Śtys P., Biliński S. (1990) Ovariole types and the phylogeny of hexapods. Biol. Rev. 65: 401 -429. Szklarzewicz T., Biliński S.M., Klag J., Jabłońska A. (1993) Accessory nuclei in the oocytes of the cockoo wasp, Chrysis ígnita (Hymenoptera: Aculeata). Folia Histochem. Cytobiol. 31: 227-231. Szklarzewicz T., Szlendak E., Boczek J., Biliński S.M. (1992) Oogenesis in the lesser grain borer Rhizoperta dominica (Fabricius) (Coleóptera): Bostrichidae). I nt. J. Insect Morphol. Embryol. 21: 63-76. Szollosi M.S., Szollósi D. (1988) “Blebbing” of the nuclear envelope of mouse zygotes, early embryos and hybrid cells. J. Cell Sci. 91: 257-267. Szymczyk P., Kiliańska Z. (1997) Białka zaangażowane w proces obróbki pre-rRNA. Post. Biol. Kom. 24: 491-517. Świątek P. (1999) Formation of the karyosome in developing oocytes of weevils (Coleóptera, Curcu-lionidae). Tissue Cell 31: 587-593. Świątek P. (2001) Structure and development of ovaries in the weevil Anthonomus pomorum (Coleóptera, Polyphaga). 1. Somatic tissues of the trophic chamber. Folia Biol. (Kraków) 49: 215-224. Świątek P. (2002) Structure and development of ovaries in the weevil Anthonomus pomorum (Coleóptera, Polyphaga). IL Germ cells of the trophic chamber. Folia Biol. (Kraków) 50: 153-163. Świątek P. (2005) Structure of the germinal vesicle during oogenesis in leech Glossiphonia hetero-clita (Annelida, Hirudinea, Rhynchobdellida). J. Morphol. 263: 330-339. 72 Świątek P., Jaglarz M.K. (2004) snRNPs are present in the karyosome capsule in the weevil germinal vesicle. Tissue Cell 36: 253-262. Tadros W., Lipshitz H.D. (2005) Setting the stage for development: mRNA translation and stability during oocyte maturation and egg activation in Drosophila. Dev. Dyn. 232: 593-608. Takemura M., Ohoka F., Perpelescu M., Ogawa M., Matsushita H., Takaba T., Akiyama T., Umeka-wa H., Furuichi Y., Cook P.R., Yoshida S. (2002) Phosphorylation-dependent migration of retinoblastoma protein into the nucleolus triggered by binding to nucleophosmin/B23. Exp. Cell Res. 276: 233-241. Telfer W.H. (1975) Development and physiology of the oocyte-nurse cell syncytium. Adv. Insect Physiol. 11: 223-319. Terns M.P., Terns R.M. (2001) Macromolecular complexes: SMN the master assembler. Curr. Biol. 11: R862-R864. Terns M.P., Terns R.M. (2002) Small nucleolar RNAs: versatile trans-acting molecules of ancient evolutionary origin. Gene Expr. 10: 17-39. Thiry M., Lafontaine D.L.J. (2005) Birth of a nucleolus: the evolution of nucleolar compartments. Trends Cell Biol. 15: 194-199. Thompson M., Haeusler R.A., Good P.D., Engelke D.R. (2003) Nucleolar clustering of dispersed tRNA genes. Science 302: 1399-1401. Tollervey D., Kiss T. (1997) Function and synthesis of small nucleolar RNA. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 337-342. Trendelenburg M.F. (1974) Morphology of ribosomal RNA cistrons in oocytes of water beetle, Dyti-scus marginalis L. Chromosoma 48: 119-135. Trendelenburg M.F., Franke W.W., Scheer U. (1977) Frequencies of circular units of nucleolar DNA in oocytes of two insects, Acheta domesticas and Dytiscus marginalis, and changes of nucleolar morphology during oogenesis. Differentiation 7: 133-158. Trendelenburg M.F., Scheer U., Franke W.W. (1973) Structural organization of ribosomal rDNA in oocytes of the house cricket. Nat. New Biol. 245: 167-170. Tsai R.Y., McKay R.D. (2005) A multistep, GTP-driven mechanism controlling the dynamic cycling of nucleostemin. J. Cell Biol. 168: 179-184. Tsvetkov A., Alexandrova O., Bogolyubov D., Gruzova M. (1997) Nuclear bodies from the cricket and mealworm oocytes contain splicing factors of pre-mRNA. Eur. J. Entomol. 94: 393^107. Tucker K.E., Berciano M.T., Jacobs E.Y., Le Page D.F., Shpargel K.B., Rossire J.J., Chan E.K.L., Lafarga M., Conlon R.A., Matera A.G. (2001) Residual Cajal bodies in coilin knockout mice fail to recruit Sm snRNPs and SMN, the spinal muscular atrophy gene product. J. Cell Biol. 154: 293-308. Tuma R.S., Stoik J.A., Roth M.B. (1993) Identification and characterization of a sphere organelle protein. J. Cell Biol. 122: "ICl-TTS. Tycowski K.T., Aab A., Steitz J.A. (2004) Guide RNAs with 5’ caps and novel box C/D snoRNA--like domains for modification of snRNAs in Metazoa. Curr. Biol. 14: 1985-1995. Tycowski K.T., You Z., Graham P.J., Steitz J.A. (1998) Modification of U6 spliceosomal RNA is guided by other small RNAs. Mol. Cell 2: 629-638. Ueyama H., Nakayasu H., Ueda K. (1987) Nuclear actin and transport of RNA. Cell Biol. lnt. Rep. 11: 671-677. Uguen P., Murphy S. (2003) The 3’ ends of human pre-snRNAs are produced by RNA polymerase II CTD-dependent RNA processing. EMBO J. 22: 4544—4554. Ullmann S.L. (1973) Oogenesis in Tenebrio molitor: Histological and audioradiographical observations on pupal and adult ovaries. J. Embrol. Exp. Morphol. 30: 179-217. Urbani E. (1970) A survey on some aspects of oogenesis in Dytiscus, Cybister and Hygrobia (Coleóptera). Acta Embryol. Exp. 3: 281-297. Urbani E., Russo-Caia S. (1972) A survey of morphological, cytochemical and biochemical studies on the oogenesis of Dytiscidae and other Coleóptera. Riv. Biol. 65: 321-329. 73 Urlaub H., Raker V., Kostka S., Lührmann R. (2001) Sm protein-Sm site RNA interaction within the inner ring of the spliccosomal snRNP core structure. EMBO J. 20: 1-10. Verheggen C. Lafontaine D.L., Samarsky D., Mouaikel J., Blanchard J.M., Bordonne R., Bertrand E. (2002) Mammalian and yeast U3 snoRNPs are matured in specific and related nuclear compartments. EMBO J. 21: 2736-2745. Visintin R., Amon A. (2000) The nucleolus: the magician’s hat for cell cycle tricks. Curr. Opin. Cell Biol. 12: 752. Visintin R., Hwang E.S., Amon A. (1999) Cfil prevents premature exit from mitosis by anchoring Cdcl4 phosphatase in the nucleolus. Nature 398: 818-823. Wasser M., Chia W. (2000) The EAST protein of Drosophila controls an expandable nuclear endoskeleton. Nat. Cell Biol. 2: 268-275. Weinstein L.B., Steitz J.A. (1999) Guided tours: from precursor snoRNA to functional snoRNP. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 378-384. Werner J.R. (1990) The nucleolus and ribosome formation. Curr. Opin. Cell Biol. 2: 521-527. Wieben E.D., Nenninger J.M., Pederson T. (1985) Ribonucleoprotein organization of eukaryotic RNA. XXXII. U2 small nyclear RNA precursors and their accurate 3’ processing in vitro as ribonucleoprotein particles. J. Mol. Biol. 183: 69-78. Wilczyński G. (1995) Ultrastrukturalne i molekularne aspekty ekspresji jąderkowych genów rRNA. Post. Biol. Kom. 22: 73-100. Will C.L., Lührmann R. (2001) Spliccosomal UsnRNP biogenesis, structure and function. Curr. Opin. Cell Biol. 13: 290-301. Will C.L., Urlaub H., Achsel T., Gentzel M., Wilm M., Lührmann R. (2002) Characterization of novel SF3b and 17S U2 snRNP proteins, including a human Prp5p homologue and an SF3b DEAD-box protein. EMBO J. 21: 4978-4988. Witkę W. (2004) The role of profilin complexes in cell motility and other cellular processes. Trends Cell Biol. 14:461-469. Wolff B., Sanglier J.J., Wang Y. (1997) Leptomycin B is an inhibitor of nuclear export: inibition of nucleo-cytoplasmic translocation of the human immunodeficiency virus type 1 (I IIV-1). Chem. Biol. 4: 139-147. Wu C.H., Murphy C., Gall J.G. (1996) The Sm binding site targets U7 snRNA to coiled bodies (spheres) of amphibian oocytes. RNA 2: 811-823. Wu Z., Murphy C., Gall J.G. (1994) Human p80-coilin is targeted to sphere organelles in the amphibian germinal vesicles. Mol. Biol. Cell 5: 1119-1127. Xu H., Pillai R.S., Azzouz T.N., Shpargel K. B., Kambach C., Hebert M.D., Schümperli D., Matera A.G. (2005) The C-terminal domain of coilin interacts with Sm proteins and U snRNPs. Cltromo-soma 114: 155-166. Yong J., Golembe T., Battle D.J., Pellizzoni L., Dreyfuss G. (2004a) snRNAs contain specific SMN--binding domains that are essential for snRNP assembly. Mol. Cell. Biol. 24: 2747-2756. Yong J., Pellizzoni L., Dreyfuss G. (2002) Sequence-specific interaction of U1 snRNA with the SMN complex. EMBO J. 21: 1188-1196. Yong J., Wan L., Dreyfuss G. (2004b) Why do cells need an assembly machine for RNA-protein complexes? Trends Cell Biol. 15: 226-232. Young P.J., Le T.T., Man N., Burghes A.H.M., Morris G.E. (2000) The relationship between SMN, the spinal muscular atrophy protein, and nuclear coiled bodies in differentiated tissues and cultured cells. Exp. Cell Res. 256: 365-374. Yu Y.T., Scharl E.C., Smith C.M., Steitz J.A. (1999) The growing world of small nuclear ribonucleoproteins. [w:] The RNA World. R.F. Gesteland, T.R. Cech, J.F. Atkins (red.), s. 487-524. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Yu Y.T., Shu M.D., Steitz J.A. (1998) Modifications of U2 snRNA are required for snRNP assembly and pre-mRNA splicing. EMBO J. 17: 5783-5795. 74 Zawadzka M. (1996) Distribution of accessory nuclei in the oocytes of the sawfly, Athalia rosae (Hymcnoptera: Tenthredinidae). Folia Biol. (Kraków) 44: 61-66. Zawadzka M., Jankowska W., Biliński S.M. (1997) Egg shells of mallophagans and anoplurans (Inserta: Phthiraptera): morphogenesis of specialized regions and the relation to F-actin cytoskeleton of follicular cells. Tissue Cell 29: 665-673. Zhang S., Hemmerich P., Grosse F. (2004a) Nucleolar localization of the human telomeric repeat binding factor 2 (TRF2). J. Cell Sei. 117: 3935-3945. Zhang S., Köhler C., Hemmerich P., Grosse F. (2004b) Nuclear DNA helicase 11 (RNA helicase A) binds to an F-actin containing shell that surrounds the nucleolus. Exp. Cell Res. 293: 248-258. Zhou Z., Licklidcr L.J., Gygi S.P., Reed R. (2002) Comprehensive proteomic analysis of the human spliceosome. Nature 419: 182-185. Zhu Y., Tomlinson R.L., Lukowiak A.A., Terns R.M., Tems M.P. (2004) Telomerase RNA accumulates in Cajal bodies in human cancer cells. Mol. Biol. Cell. 15: 81-90. Zienkiewicz K., Niedojadlo J. (2004) Natura i funkcje ciał Cajala w świetle nowych badań. Post. Biol. Kom. 31: 313-327. Zieve G.W., Sauterer R.A., Feeney R.J. (1988) Newly synthesized small nuclear RNAs appear transiently in the cytoplasm. J. Mol. Biol. 199: 259-267. Zimber A., Nguyen Q.-D., Gespach C. (2004) Nuclear bodies and compartments: functional roles and cellular signalling in health and disease. Cell. Signal. 16: 1085-1104. Zissler D. (1992) From egg to pole cells: ultrastructural aspects of early cleavage and germ determination in insects. Microsc. Res. Tech. 22: 49-74. Zissler D., Sander K. (1982) The cytoplasmic architecture of the insect egg cell, [w:] Insect Ultrastructure. R.C. King i H. Akai (red.), tom 1, s. 189-221. New York: Plenum Press. Żelazowska M. (2000) Badania nad oogenezą wszy świńskiej, Haematopinus suis (L.) (Anoplura, Haematopinidae). Rozprawa doktorska. Kraków: Uniwersytet Jagielloński. Żelazowska M., Biliński S.M. (1999) Distribution and transmission of endosymbiotie microorganisms in the oocytes of the pig louse, Haematopinus suis (L.) (Inserta: Phthiraptera). Protoplasma 209: 207-213. Żelazowska M., Biliński S.M. (2001) Ultrastructure and function of nurse cells in phthirapterans. Possible function of ramified nurse cell nuclei in the cytoplasm transfer. Arthr. Struct. Dev. 30: 135-143. Żelazowska M., Jaglarz M.K. (2004) Oogenesis in phthirapterans (Inserta: Phthiraptera). I. Morphological and histochemical characterization of the oocyte nucleus and its inclusions. Arthr. Struct. Dev. 33: 161-172. 8. STRESZCZENIE Badania ostatnich lat ujawniły w jądrach komórek somatycznych obecność wielu morfologicznie i funkcjonalnie odrębnych struktur, zwanych organellami, domenami lub ciałami jądrowymi. Struktury te zaangażowane są w procesy metaboliczne o kluczowym dla komórki znaczeniu. Jedna z organelli jądrowych, zwana ciałem Ca-jala, uczestniczy m.in. w biogenezie i modyfikacji małych jądrowych rybonukleopro-tein (U snRNP), niezbędnych do prawidłowej obróbki pierwotnych transkryptów. W jądrach oocytów (pęcherzykach zarodkowych) owadów występują liczne i z reguły duże (o średnicy nawet kilkudziesięciu pm), kuliste ciała, których skład molekularny i funkcja pozostają nieznane. W niniejszym opracowaniu przedstawiono wyniki analizy cytochemicznej i immunocytochemicznej ciał jądrowych, a także innych struktur, występujących w pęcherzykach zarodkowych i w tzw. jądrach dodatkowych w kilku grupach owadów. Badania przeprowadzono na gatunkach należących do chrząszczy (Coleóptera), wszy (Anoplura), wszołów (Mallophaga) i błonkówek (Hy-menoptera). U wszystkich badanych gatunków jajnik jest typu meroistycznego, a podczas oogenezy chromatyna w pęcherzyku zarodkowym podlega kondensacji i tworzy zwartą strukturę, zwaną kariosomem. Przeprowadzone badania wykazały, że kuliste ciała jądrowe w pęcherzykach zarodkowych chrząszczy z rodziny biegaczowatych (Carabidae) zawierają białka srebro-chłonne organizatora jąderkowego i nie wykazują fluorescencji po barwieniu odczynnikiem DAP1 i roztworem jodku propydyny. Struktury te zawierają małe jądrowe kwasy rybonukleinowe (U snRNA) i łączące się z nimi białka (np. białka Sm), a także białko koilinę. Zarówno budowa strukturalna, własności cytochemiczne, jak i skład molekularny wskazują, że te organelle jądrowe odpowiadają ciałom Cajala. W czasie oogenezy w jądrze oocytu ryjkowca Anthonomus pomorum (Coleóptera, Curculionidae) kariosom zostaje stopniowo otoczony tzw. kapsułą kariosomu. Podczas powstawania kapsuły kariosomu w nukleoplazmie pęcherzyka zarodkowego pojawiają się liczne ciała jądrowe. Przeprowadzona analiza cytochemiczna i immunocytochemicz-na wykazała, że, w przeciwieństwie do morfologicznie podobnych struktur w pęcherzykach zarodkowych innych owadów, ciała jądrowe Anthonomus są Ag-NOR--negatywne i nie zawierają cząsteczek U snRNA ani stowarzyszonych z nimi białek. Dojrzałe cząstki U snRNP występują natomiast w kapsule kariosomu. Uzyskane wyniki sugerują, że małe jądrowe rybonukleoproteiny podlegają magazynowaniu w kapsule kariosomu i najprawdopodobniej są wykorzystywane we wczesnej fazie rozwoju zarodkowego. W nukleoplazmie pęcherzyków zarodkowych Phthiraptera (wszy i wszołów) występują liczne i szczególnie silnie morfologicznie zróżnicowane ciała jądrowe. Struktury te są DAPl-negatywne, ale wykazują fluorescencję po barwieniu roztworem jodku 76 propydyny i są pozytywne w reakcji srebrowej (metoda Ag-NOR), co wskazuje, że zawierają rybonukleoproteiny. Analiza immunocytochemiczna z zastosowaniem przeciwciał rozpoznających U snRNP i białka swoiste dla ciał Cajala nie wykazała obecności tych antygenów w ciałach jądrowych wszy. Funkcja tych ciał pozostaje nieznana. Badania ultrastrukturalne ujawniły, że pęcherzyk zarodkowy wszoła gołębiego (Co-lumbicola columbae) ma charakterystyczne wypustki przypominające początkowe stadia formowania się tzw. jąder dodatkowych w oocytach innych wszołów. Na tej podstawie wysunięto hipotezę dotyczącą powstania jąder dodatkowych w trakcie ewolucji tej grupy owadów. W oocytach błonkówek pęcherzyk zarodkowy otaczają liczne kuliste organelle, zwane jądrami dodatkowymi. W oocytach osy Vespula germanica każda z tych organelli zawiera w wypełniającej je substancji podstawowej dwie gęste inkluzje, z których jedna jest homologiczna z ciałem Cajala. Stosując odpowiednie znaczniki molekularne, wykazano, że, oprócz małych jądrowych RNA i koiliny, ciała Cajala zawierają także białko SMN. Przeprowadzona analiza jąder dodatkowych w różnych fazach oogenezy ujawniła, że ciała Cajala powstają w substancji podstawowej jąder dodatkowych w wyniku stopniowego łączenia się niewielkich skupień materiału zawierających białko SMN oraz dojrzałe cząstki U snRNP i transportowanych z cytoplazmy do jąder dodatkowych. W transporcie tych skupień zaangażowane są mikrotubule. W pełni uformowane ciała Cajala przemieszczają się wraz z jądrami dodatkowymi z cytoplazmy wokółjądrowej do powierzchniowej strefy oocytu. Po umiejscowieniu się jąder dodatkowych w warstwie korowej oocytu, ciała Cajala rozpadają się i rozpraszają w substancji podstawowej jąder dodatkowych. Składniki nagromadzone w ciałach Cajala, w tym cząstki U5 snRNP, pozostają jednak w obrębie jąder dodatkowych, przynajmniej do końcowej fazy oogenezy. Podobny „cykl życiowy” jąder dodatkowych i zawartych w nich ciał Cajala występuje także u innych gatunków błonkówek, co sugeruje istnienie ewojycyjnie konserwatywnego mechanizmu lokalizowania cząstek U snRNP w określonym rejonie oocytu w tej grupie owadów. Przeprowadzona analiza ultrastrukturalna, cytochemiczna i immunocytochemiczna ciał jądrowych w pęcherzykach zarodkowych i w jądrach dodatkowych owadów pozwoliła stwierdzić, że przynajmniej niektóre z tych organelli odpowiadają ciałom Cajala występującym w jądrach komórek somatycznych i płciowych innych zwierząt. Ciała Cajala w pęcherzykach zarodkowych Carabidae i jądrach dodatkowych błonkówek są szczególnie dobrze rozwinięte i utrzymują się aż do końcowych etapów oogenezy. Sugeruje to, że, podobnie jak w pęcherzykach zarodkowych płazów, ciała Cajala owadów magazynują dojrzałe cząstki snRNP, które najprawdopodobniej są wykorzystywane we wczesnych fazach rozwoju zarodkowego. 9. SUMMARY Over the last decade, numerous studies revealed in the somatic cell nuclei the presence of many morphologically and functionally distinct structures termed nuclear organelles, domains or bodies. These structures are involved in significant metabolic processes within the cell. One of these nuclear organelles, termed Cajal body, is implicated in biogenesis and modification of small nuclear ribonucleoproteins that are indispensable to the proper processing of the primary transcripts. Within the oocyte nucleus (germinal vesicle) of many insect species, numerous and usually exceptionally large (several dozen pm in diameter) spherical bodies occur. Both the precise function and molecular composition of these bodies remain unknown and have been subject to speculation. In the present monograph, the results of the cytochemical and immunocytochemical analysis of the nuclear bodies and some other structures occurring in the germinal vesicles as well as in the so called accessory nuclei in several insect groups are presented. Insect species from the following groups have been investigated: beetles (Coleóptera), sucking lice (Anoplura), bird lice (Mallophaga) and hymenoptera (Hymenoptera). In all of the investigated species, the ovary is of the meroistic type and during oogenesis chromatin within the germinal vesicles condenses into a compact structure termed karyosome. Cytochemical analysis demonstrated that the perfectly spherical bodies in the oocyte nucleus in the ground (carabid) beetles (family Carabidae) are Ag-NOR-positive, however they do not stain with DAPI and/or propidium iodide. ImmunoEM studies revealed that these nuclear bodies are composed of uridine-rich small nuclear RNAs (U snRNAs) and associated proteins, including coilin. Both the structural features, cytochemical properties and the molecular composition of these nuclear organelles indicate that they correspond to Cajal bodies (=coiled bodies). In the apple blossom weevil, Anthonomus pomorum (Coleóptera, Curculionidae), the karyosome within the germinal vesicles is gradually surrounded by a karyosome capsule during oogenesis. Concurrently, within the nucleoplasm numerous variably sized spherical bodies occur. Cytochemical and immunocytochemical analysis revealed that, in contrast to morphologically similar structures in the germinal vesicles in other insect species, the nuclear bodies in Anthonomus are Ag-NOR-negative and they do not contain mature U snRNAs nor associated proteins. Unexpectedly, the mature small nuclear ribonucleoprotein particles (U snRNPs) were found to associate with the karyosome capsule material. On the basis of the obtained results, it is suggested that the karyosome capsule is a storage site for U snRNPs, which may be used during early stages of embryonic development. Within germinal vesicles in Phthiraptera (sucking lice and bird lice) numerous and exceptionally morphologically diverse nuclear bodies occur. These structures are 78 DAPI-negative, but stain with propidium iodide and are Ag-NOR-positive that indicates that they contain ribonucleoproteins. Immunocytochemical analysis revealed that these nuclear bodies do not cross-react with antibodies recognizing U snRNPs nor proteins characteristic for Cajal body. Their role remains unknown. Ultrastructural investigations of the germinal vesicle in the pigeon louse, Columbicola columbae (Mallophaga) revealed that the nuclear envelope is equipped with characteristic protrusions of striking similarity to the initial stages of the formation of accessory nuclei in other bird louse species. Based on these results it has been speculated on the possible evolutionary origin of the accessory nuclei in phthirapterans. In hymenopterans, oocytes contain numerous vesicular organelles termed accessory nuclei. In the common wasp, Vespula germanica, each of these organelles is filled with translucent matrix containing two dense inclusions. One type of these inclusions is homologous to Cajal body. It has been demonstrated, by using appropriate molecular markers that hymenopteran Cajal bodies besides coilin and small nuclear ribonucleoproteins contain also Survival of Motor Neurons (SMN) protein. Ultrastructural and immunogold analysis of accessory nuclei in various stages of oogenesis revealed, that Cajal bodies form by gradual accumulation of aggregates composed of SMN and mature U snRNPs, which are transported from the cytoplasm into the accessory nuclei. It appears that the microtubular cytoskeleton is involved in these transport events. The mature Cajal bodies migrate within accessory nuclei, which initially surround the oocyte nucleus, to the oocyte peripheral region. Following localization to the oocyte cortex, Cajal bodies break down and disperse within the accessory nucleus matrix. The components of dispersed Cajal bodies, including U5 snRNP, are retained within accessory nuclei until the end of oogenesis, which suggests that their function may be required at the onset of embryonic development. As the morphology and behaviour of accessory nuclei and their Cajal body-like inclusions appear to be conserved in other hymenopteran species, these features might be characteristic of all hymenopterans. This suggests that evolutionarily conserved mechanism of U snRNP localization in the oocyte cytoplasm exists in this group of insects. Ultrastructural, cytochemical and immunocytochemical analysis of nuclear bodies in germinal vesicles and accessory nuclei of insect revealed that at least some of these organelles correspond to Cajal bodies found in nuclei of somatic as well as germ line cells in a variety of animal species. Cajal bodies occurring in the ground beetle germinal vesicle and accessory nuclei in Hymenoptera are exceptionally prominent and remain in the oocyte until final stages of oogenesis. This suggests, that in insects, as in amphibian germinal vesicles, Cajal bodies may serve as storage sites for mature snRNPs, which are likely to be used in the early stages of embryonic development. 10. OBJAŚNIENIA DO RYCIN Rye. 1-1. Biogeneza cząstek U snRNP W jądrze komórki geny (snDNA) kodujące cząsteczki U snRNA (z wyjątkiem U6, zob. tekst) są transkrybowane z udziałem polimerazy RNA klasy 11. Powstające cząsteczki pre-U snRNA zawierają na końcu 5' czapeczkę 7-metyloguanozyny (czerwone kółko), podlegają obróbce i, po połączeniu z białkami kompleksu eksportującego, transportowane są z nukleoplazmy, przez pory jądrowe, do cytoplazmy. Po odłączeniu kompleksu eksportującego, występujący w cytoplazmie kompleks SMN (zbudowany z białek gemin i białka SMN) pośredniczy w przyłączeniu do cząsteczek snRNA pierścienia zbudowanego z siedmiu białek Sm (tzw. białek rdzeniowych). Powinowactwo białek Sm do kompleksu SMN zwiększa metylacja bogatych w argininę domen w białkach Sm przez kompleks enzymatyczny - metylosom. Cząsteczka snRNA wraz z przyłączonym kompleksem SMN i białkami Sm tworzy cząstkę U snRNP. Następnie, czapeczka na końcu 5' cząstki U snRNP zostaje przekształcona w wyniku hipermetyla-cji w czapeczkę 2,2,7-trimetyloguanozyny (TMG, czerwony prostokąt). Powstanie czapeczki TMG i przyłączenie białek Sm stanowi sygnał lokalizacji jądrowej. W transporcie dojrzałej cząstki U snRNP do jądra, via pory w osłonce jądrowej, zaangażowane są białka: snurportyna, przyłączająca się do czapeczki TMG, i importyna p. W nukleo-plazmie dzięki oddziaływaniu białka SMN i koiliny cząstka snRNP podlega lokalizowaniu w ciele Cajala i przechodzi dalszą modyfikację. Po odłączeniu od cząstki snRNP, kompleks SMN przemieszcza się do nukleoplazmy lub gromadzi się w ciele jądrowym towarzyszącym ciału Cajala, zwanym gem (ang. gemini of Cajal body). Szczegółowy opis biogenezy cząstek U snRNP zawarto w tekście (wg Massenet i wsp., 2002; zmienione). Ryc. 3-1. Schemat rozmieszczenia jąder dodatkowych w oocycie Vespula germa-nica A. Oocyt wczesnoprewitelogeniczny. Jądra dodatkowe (an) początkowo otaczają pęcherzyk zarodkowy (gv), a następnie migrują (strzałki) do warstwy korowej oocytu. B. Oocyt późnoprewitelogeniczny. Jądra dodatkowe występują w warstwie korowej oocytu, z wyjątkiem cytoplazmy bieguna tylnego. A - biegun przedni oocytu, P - biegun tylny oocytu. 80 Ryc. 3-2. Stadia rozwoju jąder dodatkowych i ciał Cajala w oocycie Vespula ger-manica A. Oocyt wczesnoprewitelogeniczny: 1 - pączkowanie jądra dodatkowego z pęcherzyka zarodkowego (gv), 2a - powstawanie inicjalnego ciała Cajala (pCB) w substancji podstawowej jądra dodatkowego; ciała Cajala powstają także w pęcherzyku zarodkowym, 2b - dojrzewanie ciała Cajala (CB), 3 - migracja jądra dodatkowego i dojrzałego ciała Cajala do warstwy korowej oocytu. B. Oocyt późnoprewitelogeniczny: 4a - „zakotwiczenie” jądra dodatkowego (wraz z ciałem Cajala) w warstwie korowej oocytu, 4b - rozpad ciała Cajala w substancji podstawowej jądra dodatkowego. Oocyt witelogeniczny: 4c—4d - stopniowe rozpraszanie ciała Cajala w substancji podstawowej jądra dodatkowego; om - błona komórkowa oocytu. Ryc. 4-1. Schematy pęcherzyków zarodkowych: A. Carabidae (Carabus violaceus, Pterostichus oblongopunctatus), B. Anthonomus pomorum, C. Haematopinus suis, D. Columbicola columbae, E. Yespula germanica; an - jądro dodatkowe. Ryc. 4-2. Schemat biogenezy cząstek U snRNP (A) w oocytach chrząszczy z rodziny biegaczowatych (Coleoptera, Carabidae) i (B) w oocytach błonkówek (Hy-menoptera) W czasie prewitelogenicznego wzrostu oocytu cząsteczki U snRNA są eksportowane z jądra oocytu do cytoplazmy, gdzie, po połączeniu z białkiem SMN i białkami Sm, tworzą cząstki U snRNP, które transportowane są do ciał Cajala w jądrze oocytu (A) i (lub) do ciał Cajala w jądrach dodatkowych (B). 11. FIGURE LEGENDS Fig. 1-1. Biogenesis of U snRNPs Within the cell nucleus, genes (snDNA) coding U snRNAs (with the exception of U6 snRNAs, see the text) are transcribed by polymerase II. The pre-U snRNAs contain a monomethylated m7G cap structure (red circle) at their 5' end, undergo processing and following binding of the export complex are transported from nucleoplasm into cytoplasm, through nuclear pores. After disassembly of the export complex, the cytoplasmic SMN complex (consisting of gemins and SMN protein) facilitates binding of a ring of seven Sm proteins (core proteins) to snRNA molecule. The binding affinity of Sm proteins to SMN complex is increased by methylation of the arginine-rich domains within Sm proteins by enzymatic complex, the methylosome. The U snRNA molecule together with bound SMN complex and Sm proteins forms the U snRNP particle. Subsequently, the 5' cap is hypermethylated and converted to 2,2,7-tri-methylguanosine (TMG, red rectangle). The newly synthesized TMG cap together with Sm proteins provide the nuclear localization signal. The import of the mature U snRNP particle into the nucleus, via nuclear pore complexes, is mediated by proteins: snurportin-1, which binds to the TMG cap, and importin 0. Within nucleoplasm, the U snRNP particle is transiently localized to Cajal body, due to interaction of SMN protein and coilin, and undergoes further processing. After dissociation from the U snRNP, the SMN complex translocates into nucleoplasm or accumulates in a specific nuclear body termed gemini of Cajal body (gem). The detailed description of the U snRNPs biogenesis is in the text (according to Massenet et al., 2002; modified). Fig. 3-1. Schematic representation of the distribution of accessory nuclei in the oocyte of Vespula germanica A. Early previtellogenic oocyte. Initially, accessory nuclei (an) surround the germinal vesicle (gv) and as oogenesis progresses migrate (arrows) toward the anterior and lateral cortical regions of the oocyte. B. Late previtellogenic oocyte. Accessory nuclei occupy the cortical layer, with the exception of the posterior pole of the oocyte. A - anterior, P - posterior. 82 Fig. 3-2. Developmental stages of accessory nuclei and their Cajal bodies in the oocyte of Vespula germánica A. Early previtellogenic oocyte: 1 - accessory nucleus budding off from the germinal vesicle (gv), 2a - formation of the primordial Cajal body (pCB) within accessory nucleus matrix, 2b - maturation of Cajal body (CB), 3 - migration of accessory nucleus with the mature Cajal body into the oocyte cortical region. B. Late previtellogenic oocyte: 4a - “anchoring” of the accessory nucleus with Cajal body in the oocyte cortical region, 4b - breaking down of Cajal body. Vitellogenic oocyte: 4c^4d - gradual dispersion of Cajal body constituents within the accessory nucleus matrix; om - oocyte membrane. Fig. 4-1. Schematic representation of the germinal vesicle in: A. Carabidae (Carabus violaceus, Pterostichus oblongopunctatus), B. Anthonomus pomorum, C. Haematopinus suis, D. Columbicola columbae, E. Vespula germánica; an - accessory nucleus. Color code: red - Cajal bodies, orange - nuclear bodies, black - dense peripheral bodies, blue - karyosome, light blue - karyosome capsule Fig. 4-2. Schematic representation of the U snRNP biogenesis (A) in the oocyte of ground beetles (Coleóptera, Carabidae) and (B) in the oocyte of hymenopte-rans (Hymenoptera) During previtellogenesis, U snRNAs are exported from the germinal vesicle into the oocyte cytoplasm and after the association with SMN and Sm proteins form the U snRNP particles, which are transported into Cajal bodies in germinal vesicles (A) and/or Cajal bodies in accessory nuclei (B). 12. OBJAŚNIENIA DO TABLIC Wykaz skrótów: FA - materiał utrwalany aldehydem mrówkowym GA - materiał utrwalany aldehydem glutarowym OSO4 - materiał utrwalany czterotlenkiem osmu M F - m i kroskop fl uorescencyj ny U snRNP - małe jądrowe rybonukleoproteiny bogate w urydynę TEM - mikroskop elektronowy transmisyjny Tabl. 1. Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Carabus violaceus A. Prewitelogeniczny pęcherzyk jajnikowy (przekrój podłużny). Liczne komórki odżywcze (nc) i pojedynczy oocyt (o) otoczone są komórkami folikularnymi (fc). W pęcherzyku zarodkowym (gv) występują liczne kuliste (1-4 pm średnicy) i silnie barwiące się ciała (grot strzałki); n - jądro komórki odżywczej. Epon, skrawek pół-cienki; błękit metylenowy. Skala: 30 pm (wg Jaglarz, 2001). B. Różnej wielkości, kuliste, homogenne i elektonowo gęste ciała jądrowe w elektronowo przejrzystej nukleoplazmie pęcherzyka zarodkowego. TEM, GA + OsO₄. Skala: 1 pm. C. Oocyt wczesnowitelogeniczny. W pęcherzyku zarodkowym (gv) widoczne dwa duże (groty strzałek) i liczne mniejsze ciała jądrowe; o - ooplazma. Epon, skrawek półcienki; błękit metylenowy. Skala: 15 pm. D. Fragment dużego ciała jądrowego z przylegającym do jego warstwy powierzchniowej znacznie mniejszym ciałem (grot strzałki). TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Skala: 400 nm. Tabl. 2. Analiza cytochemiczna ciał jądrowych w pęcherzyku zarodkowym Carabus violaceus A. Fragment pęcherzyka jajnikowego prewitelogenicznego (przekrój podłużny) z komórkami odżywczymi (nc) i oocytem (o). W optycznie przejrzystej nukleoplazmie pęcherzyka zarodkowego (gv) widoczny jest kariosom (strzałka) i przylegające do niego ciała jądrowe (groty strzałek); fc - komórki folikularne, ncn - jądro komórki odżywczej. Histokryl, skrawek półcienki; błękit metylenowy. Skala: 20 pm. B, C. Rozmieszczenie kwasów nukleinowych. Kolejne półcienkie skrawki oocytu (o) (przedstawionego na ryc. A) barwione odczynnikiem DAPI (B) i jodkiem propydy-ny (C). W pęcherzyku zarodkowym, w obu barwieniach, skondensowana chroma- 84 tyna (kariosom, strzałka) jest pozytywna, natomiast ciała jądrowe są negatywne (grot strzałki); fc - komórki folikularne, fn - jądro komórki folikulamej. Histokryl, MF. Skala: В, C = 20 pm. D. Wydłużony i nieregularny pęcherzyk zarodkowy (gv) w oocycie późnoprewiteloge-nicznym. W optycznie przejrzystej nukleoplazmie widoczne jest duże (o średnicy około 30 pm) ciało jądrowe (grot strzałki) i liczne znacznie mniejsze ciała jądrowe (o średnicy 1-2 pm). Histokryl, skrawek półcienki; błękit metylenowy. Skala: 20 pm (wg Jaglarz, 2001). E. Rozmieszczenie białek srebrochłonnych (argyrofilnych); oocyt późnoprewiteloge-niczny. Ciała jądrowe (groty strzałek) w pęcherzyku zarodkowym i jąderka w jądrach komórek folikularnych (strzałki) są Ag-NOR-pozytywne. Histokryl, skrawek półcienki; metoda Ag-NOR. Skala: 25 pm (wg Jaglarz, 2001). Tabl. 3. Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Pterostichus oblongopunctatus A-C. Prewitelogeniczna komora jajowa (przekrój podłużny, kolejne skrawki półcienkie). A. Komórki odżywcze (nc) i pojedynczy oocyt (o) otoczone są komórkami folikular-nymi (fc). Duże, kuliste jądra komórek odżywczych (n) zawierają rozproszoną chromatynę i dobrze rozwinięte jąderka. W optycznie przejrzystej nukleoplazmie pęcherzyka zarodkowego widoczne są ciała jądrowe (groty strzałek). Histokryl; błękit metylenowy. Skala: 20 pm. B. Rozmieszczenie białek srebrochłonnych. Ciała jądrowe (groty strzałek) w pęcherzyku zarodkowym, a także jąderka (strzałki) w jądrach komórek odżywczych i komórek folikularnych są Ag-NOR-pozytywne. Histokryl; metoda Ag-NOR. Skala: 20 pm. C. Rozmieszczenie DNA. Jądra komórek odżywczych (n) i komórek folikularnych (fn) są DAPI-pozytywne; ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym (gv) są DAP1--negatywne (DAPI-pozytywny kariosom nie jest widoczny na tym przekroju). Histokryl, DAP1, MF. Skala: 20 pm. D. Rozmieszczenie dojrzałych cząstek U snRNP i koiliny (wstawka) w ciałach jądrowych w pęcherzyku zarodkowym. ТЕМ, FA + GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immunogold, przeciwciało K-121 (D), przeciwciało R288 (wstawka). Skala: D, wstawka = 600 nm. Tabl. 4. Immunolokalizacja cząstek U snRNP i białek swoistych dla ciał Cajala w ciałach jądrowych w pęcherzyku zarodkowym Carabus violaceus A. Rozmieszczenie dojrzałych cząstek U snRNP (przeciwciało monoklonalne K-121). Skala: 300 nm (wg Jaglarz, 2001). B. Rozmieszczenie białka pigpen (przeciwciało poliklonalne anty-pigpen). Skala: 500 nm (wg Jaglarz, 2001). C. Rozmieszczenie białek z epitopem Sm (przeciwciało monoklonalne Y-12). Skala: 500 nm. 85 D. Rozmieszczenie koiliny (przeciwciało poliklonalne R288); ziarna złota koloidalnego występują także nad mniejszym ciałem jądrowym (gwiazdka). Skala: 500 nm (wg Jaglarz, 2001). A-D. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immu-nogold. Tabl. 5. Immunolokalizacja cząstek U snRNP w komórce odżywczej (A) i w oocy-cie (B) Carabus violaceus A-B. Dojrzałe cząstki U snRNP występują w cytoplazmie (c) zarówno komórki odżywczej, jak i oocytu. W pęcherzyku zarodkowym (gv) cząstki snRNP występują w ciele jądrowym (gwiazdka), a w jądrze komórki odżywczej (n) w drobnych, nieregularnych skupieniach nukleoplazmy (groty strzałek), a także w rejonie porów jądrowych (wstawka, groty strzałek - por jądrowy); n - nukleoplazma, strzałki -osłonka jądrowa. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immunogold, przeciwciało K.-121. Skala: A, B = 200 nm (wg Jaglarz, 2001). Tabl. 6. Kapsuła kariosomu i ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Anthono-mus pomorum A. Schemat budowy pęcherzyka zarodkowego, oocyt późnoprewitelogeniczny. Ramkami zaznaczono rejony przedstawione w: tabl. 6B (ramka 1), tabl. 7C (ramka 2) i tabl. 8B (ramka 3); groty strzałek - ciała jądrowe, gwiazdka - kariosom, strzałka - kapsuła kariosomu. B. Immunolokalizacja dojrzałych cząstek U snRNP. Fragment jądra oocytu (n) z przyległą ooplazmą (o) (ramka 1 na ryc. A). W nukleoplazmie widoczne są kuliste ciała jądrowe (groty strzałek) różniące się ultrastrukturą. Cząstki U snRNP występują w ooplazmie, ale nie w ciałach jądrowych; strzałki - pory jądrowe. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immunogold, przeciwciało K.-121. Skala = 200 nm (wg Świątek i Jaglarz, 2004; zmienione). Tabl. 7. Kapsuła kariosomu i ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Anthono-muspomorum. Immunolokalizacja dojrzałych cząstek U snRNP A. Wczesne stadium powstawania kapsuły kariosomu (oocyt wczesnoprewitelogenicz-ny). Cząstki U snRNP występują w nukleoplazmie, w niewielkich skupieniach materiału ziarnisto-włóknistego (strzałki) leżących w pobliżu wewnętrznej warstwy (puste strzałki) kapsuły kariosomu. Pozytywny jest także rejon kariosomu (k). Skala: 200 nm (wg Świątek i Jaglarz, 2004). B. Formowanie kapsuły kariosomu (oocyt prewitelogeniczny). Zewnętrzna warstwa kapsuły kariosomu (gwiazdka) i przylegające do niej pasma materiału ziarnisto--włóknistego (strzałki) zawierają cząstki U snRNP. Ciała jądrowe (groty strzałek) 86 towarzyszące kapsule kariosomu są negatywne. Skala: 200 nm (wg Świątek i Ja-glarz, 2004). C. Fragment dojrzałej kapsuły kariosomu (ramka 2 na ryc. A w tabl. 6), oocyt późno-witelogeniczny. Cząstki U snRNP występują tylko w zewnętrznej (gąbczastej) warstwie kapsuły kariosomu i jej odgałęzieniach (strzałki). Warstwa wewnętrzna kapsuły kariosomu (puste strzałki) jest negatywna. Skala: 200 nm (wg Świątek i Jaglarz, 2004). A-C. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immu-nogold, przeciwciało K-121. Tabl. 8. Kapsuła kariosomu i ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Anthono-muspomorum. Immunolokalizacja dojrzałych cząstek U snRNP i białek Sm A. Fragment zewnętrznej warstwy kapsuły kariosomu (oocyt późnowitelogeniczny) z przylegającymi ciałami jądrowymi (groty strzałek). Cząstki U snRNP występują w kapsule kariosomu; ciała jądrowe (groty strzałek) są negatywne. Skala: 200 nm (wg Świątek i Jaglarz, 2004; zmienione). B. Fragment kapsuły kariosomu (ramka 3 na ryc. A w tabl. 6). Białka Sm występują w warstwie zewnętrznej kapsuły kariosomu. Warstwa wewnętrzna kapsuły kariosomu (puste strzałki) i ciała jądrowe (groty strzałek) są negatywne; k - kariosom. Skala: 400 nm (wg Świątek i Jaglarz, 2004; zmienione). A-B. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda im-mu-nogold, przeciwciało K-121 (A), przeciwciało Y-12 (B). Tabl. 9. Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Haematopinus suis A. Schemat budowy pęcherzyka zarodkowego w oocycie późnoprewitelogenicznym; groty strzałek - ciała jądrowe, gwiazdka - kariosom, strzałki - gęste ciała peryfe-ryczne. B-D. Rozmieszczenie białek srebrochłonnych i kwasów nukleinowych w oocycie wi-telogenicznym. Fragment oocytu przedstawiony na ryc. C i D odpowiada rejonowi zaznaczonemu ramką na ryc. B. Ciała jądrowe (groty strzałek) przylegające do kariosomu (gwiazdka) i gęste ciało peryferyczne (strzałka) są Ag-NOR-pozytywne (B), barwią się roztworem jodku propydyny (D) i są DAPI-negatywne (C); c - cy-toplazma, fn - jądra komórek folikularnych z Ag-NOR-pozytywnymi jąderkami. Histokryl, kolejne skrawki półcienkie; metoda Ag-NOR (B), DAPI (C), jodek propydyny (D). C, D - MF. Skala: B-D = 10 pm (wg Żelazowska i Jaglarz, 2004; zmienione). E-F. Immunolokalizacja dojrzałych cząstek U snRNP. E. Komórka folikularna; cząstki U snRNP występują zarówno w nieregularnych skupieniach nukleoplazmy (strzałki), jak i w cytoplazmie (c, grot strzałki). F. Fragment ciała jądrowego w pęcherzyku zarodkowym. Nukleoplazma (n) i rejony o różnej gęstości elektronowej (1-3) w ciele jądrowym są negatywne. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immunogold, przeciwciało K-121. Skala: E = 500 nm; F = 1 pm (wg Żelazowska i Jaglarz, 2004; zmienione). 87 ТаЫ. 10. Ciała jądrowe w pęcherzyku zarodkowym Columbicola columbae A-B. Oocyt wczesnowitelogeniczny. Ciała jądrowe (groty strzałek) w wypustkach pęcherzyka zarodkowego są Ag-NOR-pozytywne (A) i DAPI-negatywne (B). W pęcherzyku zarodkowym tylko kariosom jest DAPI-pozytywny (biała strzałka); gwiazdki - jądra komórek folikulamych, strzałki - jąderka w jądrach komórek foli-kularnych. Histokryl, kolejne skrawki półcienkie; metoda Ag-NOR (A) i DAP1 (B, MF). Skala: А, В = 10 pm (wg Żelazowska i Jaglarz, 2004; zmienione). C. Budowa ultrastrukturalna wypustek pęcherzyka zarodkowego w oocycie wczesno-witelogenicznym. W nukleoplazmie wypustek pęcherzyka zarodkowego występują różnej wielkości skupienia materiału ziarnisto-włóknistego (groty strzałek) o dużej gęstości elektronowej i owalne obszary (gwiazdka) o małej gęstości elektronowej. Pod osłonką jądrową (ne) widoczne są regularnie rozmieszczone niewielkie skupienia materiału ziarnisto-włóknistego (strzałki); o - ooplazma. ТЕМ, GA + OsO₄. Skala: 1 pm (wg Żelazowska i Jaglarz, 2004; zmienione). Tabl. 11. Jądra dodatkowe w oocycie Vespula germanica A. Fragment pęcherzyka jajnikowego prewitelogenicznego (przekrój podłużny). Komórki odżywcze (nc) i oocyt (o) otoczone są komórkami folikularnymi (fc). Wokół pęcherzyka zarodkowego (gv) występują jądra dodatkowe (strzałki) zawierające gęste inkluzje. Epon, skrawek pólcienki; błękit metylenowy. Skala: 10 pm (wg Jaglarz i wsp., 2005). B. Oocyt wczesnoprewitelogeniczny. W ooplazmie perynuklearnej (o) widoczne są jądra dodatkowe (gwiazdki) o różnej wielkości oraz pączkujące (stadium 1) jądro dodatkowe (strzałka); gv - pęcherzyk zarodkowy. ТЕМ, FA + GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Skala: В = 400 nm. C. Immunolokalizacja białka SMN, oocyt prewitelogeniczny. W substancji podstawowej jądra dodatkowego (an) występują dwie inkluzje: ciało Cajala (strzałka) z przylegającą nieregularną, ziarnistą strukturą oraz ciało jądrowe (grot strzałki), którego funkcja nie została wyjaśniona (zob. rozdz. 3.5. Inkluzje w jądrach dodatkowych osy Vespula germanica). Białko SMN jest skoncentrowane w ciele Cajala, ale występuje także w ooplazmie (o) i w substancji podstawowej jądra dodatkowego. ТЕМ, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immu-nogold, przeciwciało H-195. Skala: 500 nm. Tabl. 12. Inkluzje w jądrach dodatkowych w oocycie prewitelogenicznym Vespula germanica A. Immunolokalizacja białka SMN. Ziarna złota koloidalnego występują nad ciałem Cajala (strzałka) i w mniejszej liczbie w substancji podstawowej jądra dodatkowego oraz w cytoplazmie oocytu (c). Przylegająca do ciała Cajala nieregularna, ziarnista struktura (zaznaczona przerywaną linią) jest negatywna; groty strzałek - osłonka jądra dodatkowego. Skala: 200 nm (wg Jaglarz i wsp., 2005). 88 B. Eksperyment kontrolny z pominięciem przeciwciała H-195; kolejny skrawek ultra-cienki jądra dodatkowego przedstawionego na ryc. A. Ciało Cajala (strzałka) jest negatywne; groty strzałek - osłonka jądra dodatkowego. Skala: 200 nm (wg Jaglarz i wsp., 2005). C-D. Immunolokalizacja fibrylaryny. C. Inkluzja (strzałka) występująca w jądrze dodatkowym jest negatywna; groty strzałek - osłonka jądra dodatkowego. D. Jądro (n) komórki folikulamej. Ziarna złota koloidalnego występują nad jąderkiem (gwiazdka); groty strzałek - osłonka jądrowa, c - cytoplazma. Skala: C = 200 nm, D = 300 nm. A-D. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immu-nogold, przeciwciało H-195 (A), przeciwciało P2G3 (C, D). Tabl. 13. Immunolokalizacja białka SMN i dojrzałych cząstek U snRNP w jądrach dodatkowych Vespula germanica A-B. Oocyt wczesnoprewitelogeniczny, fragment jądra dodatkowego (stadium 2a) wraz z przyległą cytoplazmą (c). Białko SMN (A) i cząstki U snRNP (B) występują w niewielkich skupieniach materiału drobnoziarnistego (strzałki) w cytoplazmie i w substancji podstawowej jądra dodatkowego; część skupień (zaznaczone owalem) leży w pobliżu osłonki jądra dodatkowego. Skala: A, B = 200 nm (wg Jaglarz i wsp., 2005; zmienione). C. Oocyt prewitelogeniczny. Mikrotubule (strzałki) w cytoplazmie otaczającej jądro dodatkowe. Białko SMN (C) i dojrzałe cząstki U snRNP (wstawka) występują w skupieniach materiału drobnoziarnistego przylegających do mikrotubul; groty strzałek - osłonka jądra dodatkowego. Skala: C, wstawka - 200 nm (wg Jaglarz i wsp., 2005; zmienione). A-C. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immu-nogold, przeciwciało H-195 (A, C), przeciwciało K-121 (B, C wstawka). Tabl. 14. Immunolokalizacja białka SMN (A, C) i dojrzałych cząstek U snRNP (B) w fazie formowania ciała Cajala w jądrach dodatkowych Vespula germanica A-C. Ziama złota koloidalnego występują nad inicjalnym ciałem Cajala (gwiazdka, stadium 2a) (A) i „dojrzewającym” ciałem Cajala (stadium 2b) (B, C), a także nad niewielkimi skupieniami i (lub) pasmami materiału drobnoziarnistego (strzałki) przylegającymi do ciała Cajala lub leżącymi w jego pobliżu. TEM, GA, materiał utrwalany do analizy immunocytochemicznej. Metoda immunogold, przeciwciało H-195 (A, C), przeciwciało K-121 (B). Skala: A-C = 200 nm (wg Jaglarz i wsp., 2005; zmienione). Tabl. 15. Jądra dodatkowe w warstwie korowej oocytu Vespula germanica A. Fragment oocytu póżnoprewitelogenicznego wraz z komórkami folikularnymi (fc). Jądra dodatkowe (stadium 4a) zawierają Ag-NOR-pozytywne ciała Cajala (strzał 89 ki); groty strzałek - Ag-NOR-pozytywne jąderka w jądrach komórek folikularnych. Histokryl, skrawek półcienki; metoda Ag-NOR. Skala: 5 pm (wg Jaglarz i wsp., 2005; zmienione). B. Immunolokalizacja dojrzałych cząstek U snRNP w jądrze dodatkowym (stadium 4b) w fazie rozpadu ciała Cajala. Cząstki U snRNP występują w rozproszonym materiale (strzałki) ciała Cajala. ТЕМ, GA, materiał utrwalany do analizy immunocyto-chemicznej. Metoda immunogold, przeciwciało K-121. Skala: 400 nm (wg Jaglarz i wsp., 2005; zmienione). C. Oocyt witelogeniczny, warstwa korowa. W substancji podstawowej jąder dodatkowych (stadium 4d, strzałki) nie występują gęste inkluzje; fc - komórki folikularne. Epon, skrawek półcienki; błękit metylenowy. Skala: 10 pm (wg Jaglarz i wsp., 2005; zmienione). D. Oocyt późnowitelogeniczny, warstwa korowa. Hybrydyzacja in silu na poziomie utrastrukturalnym z sondą dla U5 snRNA. Cząsteczki U5 snRNA występują w substancji podstawowej jąder dodatkowych (strzałki, stadium 4d); cytoplazma otaczająca jądra dodatkowe jest negatywna. Różna wielkość ziaren znacznika wynika ze wzmocnienia srebrowego produktu hybrydyzacji (zob. rozdz. 2.5. Hybrydyzacja in situ na poziomie ullrastrukturalnyrri). ТЕМ, FA + GA, metoda nanogold. Skala: 1 pm (wg Jaglarz i wsp., 2005; zmienione). 13. PLATE LEGENDS Abbreviations used: FA - material fixed in formaldehyde GA - material fixed in glutaraldehyde OsOj - material post-fixed in osmium tetroxide MF - fluorescence microscope U snRNPs - uridine-rich small nuclear ribonucleoprotein particles TEM -transmission electron microscope Plate 1. Nuclear bodies in the germinal vesicle of Carabus violaceus A. A previtellogenic ovarian follicle (longitudinal section). Numerous nurse cells (nc) and an oocyte (o) are surrounded by follicular cells (fc). The germinal vesicle (gv) contains numerous spherical (1^1 pm in diameter) and intensely stained bodies (arrowheads); n - nurse cell nucleus. Epon, semithin section; methylene blue. Scale bar: 30 pm (Jaglarz, 2001). B. Differently sized, spherical, homogenous and electron dense nuclear bodies in electron translucent nucleoplasm of the germinal vesicle. TEM, GA + OsO^. Scale bar: 1 pm. C. An early vitellogenic oocyte. The germinal vesicle (gv) contains two large (arrowheads) and numerous much smaller nuclear bodies; o - ooplasm. Epon, semithin section; methylene blue. Scale bar: 15 pm. D. A fragment of a large nuclear body with a much smaller body (arrowhead) adjacent to its surface. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Scale bar: 400 nm. Plate 2. Cytochemical analysis of the nuclear bodies within the germinal vesicle of Carabus violaceus A. Fragment of a previtellogenic ovarian follicle (longitudinal section) with nurse cells (nc) and an oocyte (o). The karyosome (arrow) and adjacent nuclear bodies (arrowheads) are visible within translucent nucleoplasm of the germinal vesicle (gv); fc - follicular cells, ncn - nurse cell nucleus. Histocryl, semithin section; methylene blue. Scale bar: 20 pm. B, C. Nucleic acid distribution. Serial semithin sections of the oocyte (o) (shown in Fig. A) stained with DAPI (B) and propidium iodide (C). Within the germinal ve- 92 sides, the condensed chromatin (the karyosome, arrow) is positive, in both staining methods, but the nuclear bodies are negative (arrowhead); fc - follicular cells, fn - follicular cell nucleus. Histocryl, MF. Scale bar: В, C = 20 pm. D. An elongated and irregularly shaped germinal vesicle (gv) in the late previtellogenic oocyte. The translucent nucleoplasm contains a huge (about 30 pm in diameter) nuclear body (arrowhead) that is surrounded by many much smaller bodies (1-2 pm in diameter). Histocryl, semithin section; methylene blue. Scale bar: 20 pm (Ja-glarz, 2001). E. Semithin section of the same oocyte as in Fig. IB, stained with the Ag-NOR method. Note intensely stained nuclear bodies (arrowheads) within the germinal vesicle. Also stained are nucleoli in the nuclei of the follicular cells (arrows). Histocryl. Scale bar: 25 pm (Jaglarz, 2001). Plate 3. Nuclear bodies in the germinal vesicle of Pterostichus oblongopunctatus A-C. Previtellogenic ovarian follicle (longitudinal section, consecutive semithin sections). A. Nurse cells (nc) and an oocyte (o) are surrounded by follicular cells (fc). Large and spherical nurse cell nuclei contain dispersed chromatin with prominent nucleoli. Nuclear bodies (arrowheads) are visible within translucent nucleoplasm of the germinal vesicle. Histocryl; methylene blue. Scale bar: 20 pm. B. The distribution of the Ag-NOR protein. Nuclear bodies (arrowheads) in the germinal vesicle and the nucleoli (arrows) in the nuclei of the nurse cells and follicular cells are Ag-NOR-positive. Histocryl; Ag-NOR method. Scale bar: 20 pm. C. DNA distribution. The nuclei of the nurse cells (n) and follicular cells (fn) are DAPI-positive whereas nuclear bodies in the germinal vesicles (gv) are DAP1-negative (DAPI-positive karyosome is not visible in this section). Histocryl, DAPI, MF. Scale bar: 20 pm. D. The distribution of mature U snRNPs and coilin (inset) in the germinal vesicle nuclear bodies. ТЕМ, FA + GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the K-121 antibody (D), and R288 antibody (inset). Scale bar: D, inset = 600 nm. Plate 4. Immunolocalization of U snRNPs and proteins characteristic for Cajal body in the nuclear bodies in the germinal vesicle of Carabus violaceus A. U snRNP distribution (K-121 monoclonal antibody). Scale bar: 300 nm (Jaglarz, 2001). B. Pigpen protein distribution (anti-pigpen polyclonal antibody). Scale bar: 500 nm (Jaglarz, 2001). C. The distribution of proteins with Sm epitope (Y-12 monoclonal antibody). Scale bar: 500 nm. D. Coilin distribution (R288 polyclonal p-80 coilin antibody); note a smaller nuclear body (asterisk) also labelled with this antibody. Scale bar: 500 nm (Jaglarz, 2001). 93 A-D. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold technique. Plate 5. Immunolocalization of U snRNPs in the nurse cell (A) and in the oocyte (B) of Carabus violaceus A-B. The cytoplasm (c) of both cell types is labelled. Within the germinal vesicle (gv) gold particles are concentrated over the nuclear body (asterisk), but they are spread over the nurse cell nucleus (n) and associated with many small irregular foci (arrowheads); also labelled is a nuclear pore region (inset in A, arrowheads); n - nuc-leoplazm, arrows - nuclear envelope. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the K-121 antibody. Scale bar: A, B = 200 nm (Jaglarz, 2001). Plate 6. Karyosome capsule and nuclear bodies in the germinal vesicle of Antho-nomus pomorum A. Schematic representation of the germinal vesicle in a late previtellogenic oocyte. Boxed are regions shown in Plate 6B (box 1), Plate 7C (box 2) and Plate 8B (box 3); arrowheads - nuclear bodies, asterisk - karyosome, arrow - karyosome capsule. B. Immunolocalization of the mature U snRNPs. Fragment of the oocyte nucleus (n) with adjacent ooplasm (o) (box 1 in A). Note heavily labelled ooplasm and unlabelled two types of spherical nuclear bodies (arrowheads); arrows - nuclear pores. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the K-121 antibody. Scale bar: 200 nm (Świątek and Jaglarz, 2004; modified). Plate 7. Karyosome capsule and nuclear bodies in the germinal vesicle of Antho-nomus pomorum. Immunolocalization of the mature U snRNPs A. An early stage of the karyosome capsule formation (early previtellogenic oocyte). U snRNPs are present in nucleoplasm, in small aggregates of fibrogranular material (arrows) contributing to the forming outer layer of the capsule. The inner capsule layer (open arrows), adjacent to the karyosome (k) is not labelled. Gold particles are also found over some regions of the karyosome. Scale bar: 200 nm (Świątek and Jaglarz, 2004). B. Formation of the karyosome capsule (previtellogenic oocyte). The developing outer layer of the karyosome capsule (asterisk) and adjacent strands of fibrogranular material (arrows) contain U snRNPs. The nuclear bodies (arrowheads) associated with the karyosome capsule are not labelled. Scale bar: 200 nm (Świątek and Jaglarz, 2004). C. Fragment of the mature karyosome capsule (box 2 in Plate 6A) in the late vitellogenic oocyte. The U snRNPs are localized only in the outer spongy layer of the capsule 94 and in its extensions (arrows). The inner layer of the capsule (open arrows) is not labelled. Scale bar: 200 nm (Świątek and Jaglarz, 2004). A-C. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the K-121 antibody. Plate 8. Karyosome capsule and nuclear bodies in the germinal vesicle of An-thonomus pomorum. Immunolocalization of the mature U snRNPs and Sm proteins A. A small fragment of the outer layer of the capsule with associated nuclear bodies (arrowheads) in the late vitellogenic oocyte. Only the capsule material is labelled. Scale bar: 200 nm. (Świątek and Jaglarz, 2004; modified). B. Fragment of the karyosome capsule (box 3 in Plate 6A). Only the outer layer of the capsule is labelled whereas the accompanying nuclear bodies (arrowheads) are negative; k - karyosome. Scale bar: 400 nm (Świątek and Jaglarz, 2004; modified). A-B. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the K-121 antibody (A) and Y-12 antibody (B). Plate 9. Nuclear bodies in the germinal vesicle of Haematopinus suis A. Schematic representation of the germinal vesicle in a late previtellogenic oocyte; arrowheads - nuclear bodies, asterisk - karyosome, arrows - peripheral dense bodies. B-D. Distribution of the Ag-NOR proteins and nucleic acids in a vitellogenic oocyte. The region shown in Figs. C and D corresponds to the boxed area in Fig. B. Nuclear bodies (arrowheads) in contact with the karyosome (asterisk), and a peripheral dense body (arrow) are Ag-NOR-positive (B), stain with propidium iodide (D) and are DAPI-negative (C); c - cytoplasm, fn - follicular cell nuclei with Ag-NOR-positive nucleoli. Histocryl, serial semithin sections; Ag-NOR method (B), DAP1 (C), propidium iodide (D). C, D - MF. Scale bar: B-D = 10 pm (Żelazowska and Jaglarz, 2004; modified). E-F. Immunolocalization of the mature U snRNPs. E. Fragment of a follicular cell; U snRNPs occur in irregular foci, both in the nucleoplasm (arrows) and the cytoplasm (c, arrowhead). F. Fragment of a nuclear body within the germinal vesicle. Nucleoplasm (n) and regions (indicated by 1-3) of various electron density within the nuclear body are negative. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the K-121 antibody. Scale bar: E = 500 nm; F = 1 pm (Żelazowska and Jaglarz, 2004; modified). Plate 10. Nuclear bodies in the germinal vesicle of Columbicota columbae A-B. Early vitellogenic oocyte. Nuclear bodies (arrowheads) in the nuclear envelope protrusions are Ag-NOR-positive (A) and DAPI-negative (B). Only the karyosome (white arrow) is DAPI-positive; asterisks - nuclei of follicular cells, arrows - nucleoli in the follicular cell nuclei. Histocryl, serial semithin sections, Ag-NOR- 95 -method (A), DAPI (B, MF). Scale bar: A, В = 10 pm (Żelazowska and Jaglarz, 2004; modified). C. Ultrastructure of the nuclear envelope protrusions in an early vitellogenic oocyte. Variably sized aggregations of electron-dense fibro-granular material (arrowheads) and oval electron-translucent areas (asterisk) occur within the nucleoplasm. Small aggregations of fibro-granular material (arrows) are regularly distributed beneath the nuclear envelope (ne); о - ooplasm. ТЕМ, GA + OsO₄. Scale bar: 1 pm (Żelazowska and Jaglarz, 2004; modified). Plate 11. Accessory nuclei in the oocyte of Vespula germanica A. Fragment of a previtellogenic ovarian follicle (longitudinal section). Nurse cells (nc) and an oocyte (o) are surrounded by somatic follicular cells (fc). The germinal vesicle (gv) is surrounded by accessory nuclei (arrows) containing dense inclusions. Epon, semithin section; methylene blue. Scale bar: 10 pm (Jaglarz el al., 2005). B. Early previtellogenic oocyte. In the perinuclear ooplasm (o) variably sized accessory nuclei (asterisks) and a budding (stage 1) accessory nucleus (arrow) are visible; gv - germinal vesicle. ТЕМ, FA + GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Scale bar: 400 nm. C. Immunolocalization of SMN protein, previtellogenic oocyte. There are two inclusions within the matrix of the accessory nucleus: Cajal body (arrow) with an attached irregular granular structure and a nuclear body (arrowhead) of unknown function (see Chapter 3.5 for details). SMN protein accumulates in Cajal body but is also detected in ooplasm and the matrix of the accessory nucleus. ТЕМ, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the H-195 antibody. Scale bar: 500 nm. Plate 12. Accessory nucleus inclusions in the previtellogenic oocyte of Vespula germanica A. Immunolocalization of SMN protein. Colloidal gold particles are distributed over the Cajal body and in much lower number over the accessory nucleus matrix and the oocyte cytoplasm (c). The irregular granular structure (outlined with a dashed line) attached to Cajal body is not labelled; arrowheads - accessory nucleus envelope. Scale bar: 200 nm (Jaglarz et al., 2005). B. Control experiment without H-195 antibody; a following ultrathin section of the accessory nucleus shown in A. Cajal body (arrow) is not labelled; arrowheads - accessory nucleus envelope. Scale bar: 200 nm (Jaglarz et al., 2005). C-D. Immunolocalization of fibrillarin. C. The inclusion (arrow) within the accessory nucleus matrix is not labelled; arrowheads - accessory nucleus envelope. D. Follicular cell nucleus (n), note the labelling of the nucleolus (asterisk); arrowheads -nuclear envelope, c - cytoplasm. Scale bar: C = 200 nm, D = 300 nm. А-D. ТЕМ, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the H-195 antibody (A), and P2G3 antibody (C, D). 96 Plate 13. Immunolocalization of SMN protein and the mature U snRNPs in the accessory nuclei of Vespula germanica A-B. Fragment of an accessory nucleus (stage 2a) and the surrounding cytoplasm (c) in the early previtellogenic oocyte. SMN protein and U snRNPs occur in small aggregates of fine granular material (arrows) both in the cytoplasm and the accessory nucleus matrix. Some of he labelled aggregates (encircled) are adjacent to the matrix and cytoplasmic faces of the accessory nucleus envelope. Scale bar: A, B = 200 nm (Jaglarz et al., 2005; modified). C. Previtellogenic oocyte. Microtubules (arrows) within the cytoplasm adjacent to accessory nucleus envelope (arrowheads). SMN protein and U snRNPs occur in aggregates of fine granular material in close association with the microtubules. Scale bar: C, inset = 200 nm (Jaglarz et al., 2005; modified). A-C. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the H-195 antibody (A, C), and K-121 antibody (B, C inset). Plate 14. Immunolocalization of SMN protein (A, C) and the mature U snRNPs (B) during Cajal body formation within the accessory nuclei of Vespula germanica A-C. Colloidal gold particles are distributed over the periphery of the primordial Cajal body (asterisk, stage 2a) (A), “maturing” Cajal body (stage 2b) (B, C), and over small aggregates and/or strands of fine granular material (arrows) adhering to Cajal body or occurring in its immediate vicinity. TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the H-195 antibody (A, C), and K-121 antibody (B). Scale bar: A-C = 200 nm (Jaglarz et al., 2005; modified). Plate 15. Accessory nuclei in the cortical layer of Vespula germanica oocyte A. Fragment of the late previtellogenic oocyte with the follicular cells (fc). Accessory nuclei (stage 4a) contain Ag-NOR-positive Cajal bodies (arrows); arrowheads - Ag-NOR-positive nucleoli in the follicular cell nuclei. Histocryl, semithin section; Ag-NOR method. Scale bar: 5 pm (Jaglarz et al., 2005; modified). B. Immunolocalization of the mature U snRNPs in the accessory nucleus (stage 4b). U snRNPs are present within the dispersing Cajal body material (arrows). TEM, GA, material fixed for the immunocytochemical analysis. Immunogold labelling with the K-121 antibody. Scale bar: 400 nm. (Jaglarz et al., 2005; modified). C. Vitellogenic oocyte, cortical layer. The matrix of accessory nuclei (stage 4d, arrows) stains homogenously and does not contain dense inclusions; fc - follicular cells. Epon, semithin section; methylene blue. Scale bar: 10 pm (Jaglarz et al., 2005; modified). D. Late vitellogenic oocyte, cortical layer. Electron microscopy in situ hybridization with U5 snRNA probe. U5 snRNAs are detected only within the matrix of accessory nuclei (arrows, stage 4d) and not in the surrounding cytoplasm. The variable size of the grains is due to the silver enhancement (see Chapter 2.5 for details). TEM, FA + GA, nanogold technique. Scale bar: 1 pm (Jaglarz et al., 2005; modified). Rye. 3-1 Rye. 3-2 Rye. 4-2 < Tablica 1 Tablica 3 Tablica 4 Tablica 6 Tablica 7 Tablica 9 Tablica 10 Tablica 11 о о V га с • га га с _го 1ШШ Tablica 13 Tablica 14 Tablica 15