Charakterystyka systemu flagelinowego bak­terii gram-ujemnych 
EdytaŻyłaZakładBiochemiiKomórki,Wydział Biochemii,BiofizykiiBiotechnologii,UniwersytetJagiellońskiwKrakowiezyla.edyta@doctoraj.uj.edu.plPracanapisanapodopiekądrhab.JoannyBerety
Flagela jest głównym elementem mechanizmu ruchu bakterii w środow-isku. Umożliwia przemieszczanie się bakterii w odpowiedzi na gradient zarówno atraktantów jak i repelentów. Pod wpływem bodźców ze środow-iska bakteria dokonuje zmiany kierunku rotacji flageli, dzięki czemu może zmienić kierunek ruchu. Dzięki temu bakterie są w stanie nie tylko przeżyć, ale i rozprzestrzeniać się w nowym środowisku. Flagela wydaje się być również istotna dla procesu zakażania komórek gospodarza oraz dla przetrwania w organizmie gospodarza, ponieważ ułatwia proces ad­hezji do komórek eukariotycznych oraztworzenie biofilmu w zakażonych tkantach. Dzięki swojej budowie, pełni także funkcję wyjątkowego sys­temu sekrecyjnego, odpowiadającego za transport własnych zewnątrzkomórkowych białek budujących flagelę i białek regulujących wydłużanie filamentu flageli. Składanie systemu następuje etapowo i jest ściśle regulowane. Geny systemu falgellinowego są posegregowane w klasy, które ulegają ekspresji w ściśle określonych warunkach, przy czym jedna klasa może negatywnie lub pozywtnie regulować ekspresję kolejnej. Niniejsza praca przedstawia budowę systemu falgellinowego, proces jego składania i sposób, w jaki dokonuje się zmiana kierunku rotacji flageli. Dodakowo, opisuję proces sekrecji białek przez system fla­gelinowy oraz sposób, w jaki może on być wyokorzystany w immunoterapii nowotworów. 
Wstęp 

System flagelinowy jest jednym Mechanizm ruchu polega na szybkim z mechanizmów ruchu wykorzystywa-obracaniu się filamentu flagelinowego nych przez szerokie spektrum bakterii wokół własnej osi dzięki wprawianiu zarówno gram-dodatnich, jak i gram-go w ruch przez transbłonowy motor ujemnych [1,2]. W zalezności od [3]. Sam motor flageli może kręcić się rodzaju, bakterie posiadają od jednej z prędkością nawet do 100 000 do kilku falgeli, które są roz-obrotów na minutę (rpm) [4], jednak mieszczone w różny sposób. Istnieją po dołączeniu do niego długiego fila-cztery klasy dystrybucji flageli na pow-mentu flagelinowego prędkość spada ierzchni komórki bakteryjnej (ryc. 1.). do 100 rpm. Co ciekawe, filament może obracać się zgodnie (clockwise, CW) lub przeciwnie (counterclockwise, CCW) do ruchu wskazówek zegara, wymuszając zmianę kierunku przemieszczania się bakterii (ryc. 2). Bakteria, kontrolując kierunek obrotu motoru , może szybko odpowiadać na zmiany środowiska, co pozwala na jej przeżycie i kolonizację nowych obsz­arów [5,6]. System flagelinowy jest spokrewniony z systemem sekrecyjnym typu trze­ciego (type 3 secretion system, T3SS) odpowiadającego za wydzielanie białek decydujących o inwazyjności bakterii chorobotwórczych w organ­izmie gospodarza [7,8]. Podobieństwo można odnaleźć nie tylko w planie budowy systemów, ale również w strukturze budujących ich białek [8,9]. Niestety, do tej pory nie roz­strzygnięto sporu, który z nich jest ewolucyjnie starszy [10]. 

Ryc. 1. Dystybucja wici na powierzchni 
bakterii W naszej pracy skupiamy się na omówieniu najważniejszych aspektów dotyczących systemu flagelinowego u bakterii gram-ujemnych, ponieważ większość prac nad strukturą flageli była prowadzona na bakteriach E. coli i w nich została lepiej poznana. Poza wiciami (flagelami) na swojej powierzchni bakteria posiada fimbrie ruchowe, które również pełnią funkcje motoryczne. W porównaniu do flageli są znacznie krótsze i jest ich znacznie więcej. Ich funkcją jest regulowanie przepływu płynów wokół bakterii oraz wspomaganie adhezji [11]. 

Ryc. 2. Sposób poruszania się bakterii w zależności od kierunku rotacji rotora flageli. Obrót rotora w kierunku CW powoduje, że bakteria obraca się wokół własnej osi (A). Kiedy sposób rotacji rotora zmienia się na CCW, bakteria porusza się naprzód (B). 


Budowa systemu flagelinowego 
System flagelinowy złożony jest z 30 różnych białek, w tym niektórych wys-tępujących w kilku lub wielu kopiach [4,12,13,14], zaś proces składania maszynerii ruchu wymaga transkrypcji ponad 50 różnych genów [15]. Geny systemu flagelinowego są zorganizow­ane w operony znajdujące się pod kon­trolą promotorów należących do trzech różnych klas, których aktywacja musi być ściśle kontrolowana (ze względu na ten podział możemy mówić 
o promotorach i operonach a także genach klasy pierwszej, drugiej i trze­ciej lub odpowiednio fazy wczesnej, pośredniej i późnej) [16]. W budowie systemu flagelinowego wyróżnia się trzy główne elementy: ciałko podstawowe, hak oraz filament flagelinowy (ryc. 3). 
a) Wewnątrzkomórkowe ciałko podsta­wowe składa się z dwóch typów pod­jednostek – nieruchomych statorów oraz ruchomego rotora, które są połączone ze sobą oddziaływaniami elektrostatycznymi [17] i razem tworzą tzw. motor systemu. Co więcej, ddzi-aływanie naładowanych reszt białek rotora i statora może mieć znaczenie dla wytworzenia ruchu obrotowego [18]. Rotor jest rozbudowaną strukturą składającą się z kanału i pierścieni ulokowanych w błonach komórkowych i ścianie komórki. Pierwszy pierścień – MS, (Membrane/supramembrane ring) zlokalizowany w błonie komórkowej pozostaje w kontakcie ze statorem oraz z cytoplazmatycznym pierś­cieniem C (omówionym poniżej). W części dystalnej rotora występują: znajdujący się w obrębie warstwy pep­tydoglikanowej pierścień P oraz pierś­cień L umiejscowiony w zewnętrznej błonie bakterii gram-ujemnych w blis­kim sąsiedztwie lipopolisacharydu. Bakterie gram-dodatnie nie posiadają pierścienia L i P. Każdy z pierścieni ma za zadanie utworzyć por łączący cyto-zol bakterii ze środowiskiem zewnętrznym. Dzięki temu białka tworzące zewnątrzkomórkowe ele­menty systemu flagelinowego, mogą być bezpośrednio transportowane z cytozolu do przestrzeni zewnątrz-komórkowej. Cytoplazmatyczny pierś­cień C, który nie wchodzi w skład ro­tora per se, jest zbudowany z 32-36 kompleksów białek FliG, FliM i FliN, a jego główną funkcją jest zmiana kier­unku obrotów rotora [19]. Białka FliG oraz FliM są białkami efektorowymi. Przez długi czas sądzono, że FliN stanowi rusztowanie dla pozostałych białek pierścienia C, jednak okazuje się, że bierze aktywny udział w zmi­anie kierunku obrotu rotora na CW [21,22,23,24]. Białka należące do pier-ścienia C są określane jako kompleks przełącznikowy (ang. switch-complex), który odpowiada za wprawienie rotora w ruch, zmianę kierunku rotacji, a także formowanie całego filamentu [25,26,27,29,30]. Pierścień C jest sta­bilizowany przy błonie komórkowej dz-ięki oddziaływaniu białka FliG z białkiem MotA statora oraz białkiem FliF pierścienia MS [31,32] W ciałku podstawowym występuje 10­12 statorów ułożonych wokół rotora. Każdy ze statorów zbudowany jest z czterech podjednostek MotA oraz dwóch MotB [33]. Białka MotA posi­adają cztery transbłonowe domeny, zaś MotB tylko jedną, ale w kompleksie MotA4MotB2 suma domen wynosi aż 
18. Statory tworzą kanały jonowe w błonie komórkowej; ich charak­terystyczna budowa sugeruje, że jeden stator tworzy dwa kanały jonowe [34]. Statory są zakotwiczone w błonie komórkowej przez białka MotB [35], które niekowalenycjnie oddziałują z warstwą peptydoglikanu [4], co jest istotne dla ruchu obrotowego rotora [36]. W skład ciałka podstawowego wchodzi również ATPaza, należąca do rodziny sekrecyjnych ATPaz. Poza transportem protonów przez błonę komórkową, jest jednym ze źródeł en­ergii niezbędnej do eksportu białek flageliny i niektórych białek regulują­cych utworzenie kompletnego systemu flagelinowego[37]. ATPaza flagelinowa składa się z białek FliH, FliI oraz FliJ [38, 39]. FliI, dzięki aktywności AT-Pazowej znajdującej się na C-końcu bi-ałka [40], promuje przejście białek sekrecyjnych do kanału rotora przez tzw. bramę utworzoną z białek FlhA, FlhB, FliO, FliP, FliQ i FliR. Najnowsze badania pokazują, że obecności białek FliH, FliI i FliJ zwiększa wydajność ek­sportu przez system flagelinowy, jed­nak nie jest niezbędna dla tego procesu [41], dlatego rola ATPazy fla­gelinowej nie jest dokońca poznana [41, 42]. Warto dodać, że białka fazy późnej (tj. kodowane przez operony klasy trze­ciej) wymagają przy transporcie asysty białek opiekuńczych: FlgN jest wymagane dla FlgK i FlgL, FliS dla FliC oraz FliT dla FliD [43, 44]. Te specyficzne substratowo białka opiekuńcze zapobiegają degradacji i agregacji transportowanych białek [45, 46, 47]. 
b) Zakotwiczony w błonie komórkowej hak. Jest elementem łączącym rotor z filamentem flagelinowym [27, 30] i jest zbudowany z ponad 100 kopii białka FlgE. Początkowo na jego końcu znajduje się czapeczka utworzona z białek FlgD, która po dojrzeniu haka jest zastępowana elementem łącznikowym zbudowanym z FlgK i FlgL [48]. Długość haka wynosi 55±6 nm i jest ściśle kontrolowana przez bi-ałka FliK i FlhB. Ze strukturą haka związane są białka HAP (Hook Associ­ated Proteins), do których należą m.in.: FlgK i FlgL, które uczest­niczą w jego łączeniu z filamentem fla­gelinowym [49]. Struktura haka wraz z ciałkiem podstawowym nazywana jest w skrócie HBB (ang. hook-basal body structure). 
c) Filament flagelinowy stanowi na­jwiększą część systemu flagelinowego. Jest on długą, helikalną strukturą zbudowaną z tysięcy monomerów białka flageliny ułożonych w 11 proto-filamentów [50, 51]. Helisa flageli występuje w konformacji R (right­handed) i L (left-handed), które zmi­eniają się w zależności od kierunku rotacji rotora [52]. Flagela zbudowana jest ok. 20 000 monomerów flageliny FliC lub FljB [40], a jej długość może osiągać nawet 15-20 µm. Rodzaj białka flageliny, który buduje flagelę, jest determinowy przez pewne waruniki zewnątrz-komórkowe, a aktywacja transkrypcji genu fliC lub fljB jest regulowana w procesie zwanym Flagellar Phase Variation (opisanym poniżej). Filament jest okryty czapeczką zbudowaną z monomerów białka FliD, która jest niezbędna do odpowiedniego pozycjonowania i dołączania kolejnych monomerów flageliny budujących fila­ment oraz bierze udział w kontroli jego długości [13]. Struktura flageli jest wrażliwa na różnego rodzaju czynniki środowiskowe takie jak: pH, siła jonowa, czy siły powodujące uszkodzenia mechaniczne. Również mutacje mogą powodować przyjmow­anie nieprawidłowej formy helisy fila­mentu i zaburzać ruch [53, 54]. 


Flagelar Phase Variation – koło za­pasowe bakterii 
Niektóre bakterie rodzaju Salmonella mają unikalną zdolność do zmiany rodzaju białka tworzącego filament fla­gelinowy. Cecha ta jest zależna od gat­unku, a nawet serotypu bakterii. Długi filament flagelinowy jest w zależności od warunków tworzony z flageliny FliC lub FljB. Loci obu genów znajdują się w odrębnych miejscach chromosomu bakteryjnego i w danym czasie dochodzi do ekspresji tylko jednego z nich. Flagelina fazy drugiej, kodow­ana przez gen fljB, jest używana rza­dziej niż flagelina fazy pierwszej kodowana przez fliC, dlatego prawdo­podobnie jest mniej istotna dla prz­etrwania bakterii. Przypuszczalnie flagelina fazy drugiej jest „kołem za­pasowym” bakterii, której synteza następuje w nagłych przypadkach, kiedy natychmiast musi dojść do syn­tezy flageli, a z pewnych przyczyn nie jest możliwa ekspresja FliC. To może również wyjaśniać dlaczego loci genów są rozdzielone [55]. Wraz z ekspresją genu fljB następuje ekspresja fljA, który pełni funkcję transkrypcyjnego represora genu fliC co zapobiega biosyntezie obu typów flageliny jednocześnie (ryc. 4.). Bon-ifield sugeruje, że FljA oddziałując z 5’UTR transkryptu fliC po pierwsze hamuje transkrypcję przez atenuację, a po drugie zasłania miejsce wiązania rybosomu, co hamuje translację. Pro­motor operonu fljBA może występować w dwóch konformacjach: „ON” w której następuje ekspresja genów i „OFF”, w której jest ona zahamow­ana. Kiedy promotor występuje w kon­fomacji „ON”, następuje transkrypcja genów fljB, której produkt będzie budować filament flagelinowy i fjlA, którego produkt będzie hamować eks­presję fliC na poziomie transkrypcji jak i translacji [56]. Niestety, od 1922 roku (kiedy po raz pierwszy zostało opisane zjawisko Flagelar Phase Vari­ation) nie udało się ustalić dlaczego dochodzi do zmiany rodzaju białka bu-dującego filament flagelinowy. Niek­tóre badania sugerują, że może mieć to związek z procesem patogenezy [57 za Andrewes 1922]. 


Ryc. 3. Komponenty flageli S. Typhimurium. Rysunek przedstawia strukturę systemu fla­gelinowego zakotwiczonegow błonie i ścianie komórkowej oraz w błonie zewnętrznej. Głowne elementy systemu to ciałko podsta­wowe, hak oraz filament. Kompleks ATPazy utworzony z białek FliH FliI FliJ jest jedynym rozpuszczalnym elementem systemu fla­gelinowego. Na podstawie: Chevance & Hughes Nature 2008 


Ryc. 4. Schemat regulacji ekspresji genów flageliny. Białko flagelina powstaje w wyniku ekspresji genu fliC lub fljB. Wraz z ekspresją genu kodującego flagelinę FljB następuje ekspresja białka FliA. FliA hamuje biosyntezę flageliny FliC, co zapobiega produkcji dwóch typów flageliny w jednym czasie. 

System flagelinowy jako system sekrecji 
Jak wspomniano wcześniej, system fla­gelinowy pełni funkcję systemu sekrecyjnego, który ogranicza się do eksportu białek budujących hak oraz flageliny. Wydzielane cząsteczki fla­geliny oddziałują kolejno ze sobą tworząc solenoidową strukturę otacza­jącą kanał. Na przekroju kanału znaj­duje się 11 monomerów flageliny, stąd w strukturze dojrzałej flageli wyróżnia się 11 protofilamentów [58, 59, 60]. Po ukończeniu syntezy flageli przez kanał transportowane są nadal cząsteczki flageliny potrzebne do uzupełniania zniszczonych fragmentów filamentu, a także niektóre białka regulatorowe. Według obecnej wiedzy, żadne inne białka, które nie są związane z syste­mem flagelinowym, nie są transpor­towane przez ten system sekrecji. Ponieważ średnica kanału jest bardzo mała (ok. 20 A) [61], to transportow­ane cząsteczki białek muszą pokony­wać go w postaci niesfałdowanej; prawdopodobnie proces zachodzi ko-translacyjnie [41]. Nie określono kon­sensusowej sekwencji sekrecyjnej dla białek wydzielniczych systemu fla­gelinowego [62,63,64] jednak pomimo różnic w sekwencji wiadomo, że charakteryzuje się brakiem struktury i w większości przypadków znajduje się na N-końcu białka [64,65]. Ponadto podejrzewa się, że sygnałem do roz­poczęcia sekrecji jest fragment 5’-UTR mRNA, na którym trwa translacja, a który jest rozpoznawany przez właś­ciwe białka opiekuńcze [60,66]. Praw­dopodobnie brak rozdziału transkrypcji i translacji w czasie umożliwił wytworzenie sygnału do wydzielenia jeszcze niepowstałego bi-ałka [67], a kierowanie białka do kanału sekrecyjnego zachodzi ko-translacyjnie [12]. W przypadku genu fliC, sygnał odczytywany z końca 5’­UTR mRNA jest znaczący do wydajne­go wydzielania białka flageliny na zewnątrz. Badania opierające się na mutagenezie genu fliC ujawniły, że nawet pojedyncze zmiany w sekwencji 5’-UTR mRNA fliC, mogą zaburzyć proces sekrecji białka FliC [63]. 


Generowanie ruchu 
Rotacja flageli jest zależna od kier­unku obrotów rotora znajdującego się w ciałku podstawowym. Jak wspomni­ano wcześniej może się on poruszać zgodnie lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Rotacja CCW pozwala na płynny i ruch bakterii naprzód, podczas gdy rotacja CW po­woduje obracanie się jej w okół włas­nej osi. Odpowiedź na chemoatraktanty i chemorepelenty po­woduje zmianę długości fazy ruchu i fazy obrotu, który wyznacza nowy kierunek przemieszczania się. Obrany kierunek jest przypadkowy jednak bakteria zmieni swoje położenie względem atraktanta czy repelenta. Spowoduje to, że kolejne bodźce dzi-ałające na receptory będą silniejsze lub słabsze [68]. Z tego względu, ukierunkowany ruch w gradiencie sub­stancji, wymaga aby odpowiedź miała zdolność do adaptacji otrzymywanego sygnału. Proces transdukcji sygnału w odpowiedzi na bodziec, który prowadzi do zmiany kierunku ruchu rotora zachodzi bardzo szybko (mniej niż 200 ms) [69, 70]. Jest to bardzo ważne z punktu widzenia przetrwania bakterii, ponieważ umożliwia szybką reakcję i adaptację chemotaksji w odpowiedzi na bodźce. 
Czynniki wpływające na ruch Ruchliwość i chemotaksja są niezbędne do przetrwania bakterii i adaptacji do nowych waunków śro-dowiska. Bakteria odpowiada na bodźce zewnętrzne przez zmanę kier­unku przemieszczenia się, a także zmi­anę profilu ekspresji genów systemu flagelinowego Obniżone stężenie tlenu, lekko kwaśne pH [71], wzrost gęstości zawiesiny bakteryjnej, wzrost poziomu cAMP [72,73], wysoki poziom hydratacji środowiska [74] i wiele in­nych czynników powoduje indukcję ek­spresji genów flageli u różnych gatunków bakterii. Natomiast obecność D-glukozy, wysoka temper­atura i wysokie stężenie soli, a także skrajne pH powodują zahamowanie ekspresji genów flageli [75,76,77,78]. Należy pamiętać, że różne warunki mogą zmieniać poziom ekspresji genów systemu flagelinowego w różny sposób, w zależności od gatunku bak­terii. 
Przekaz sygnału w odpowiedzi na bodźce Głównym elementem sensorycznym systemu ruchu są białka MCP (Methyl­accepting Chemotaxis Protein), należące do transbłonowych dimerycz­nych receptorów występujących w wewnętrznej błonie komórkowej [79, 80]. Bakteria może rozpoznać, czy dana substancja należy do repelentów (np. zagrażających jej życiu toksyn) czy atraktantów (np. składników odży­wczych), które w odmienny sposób będą wpływać na MCP. U bakterii 
E. coli wyróżnia się cztery główne rodzaje receptorów MCP: dla seryny (Tsr), maltozy i asparaginianu (Tar, które podobnie jak Tsr są wrażliwe również na niektóre repelenty), rybozy i galaktozy (Tgr) oraz dipeptydów (Tap) [81]. W przypadku bakterii Sal­monella odnaleziono dodatkowe chemoreceptory McpA, McpB i McpC, które nie zostały rozpoznane w żadnym innym organizmie [16, 82]. Wiadomo, że McpB i McpC są akty­wowane w odpowiedzi na L-cytseinę i L-cystynę, jednak nadal nie odnaleziono liganda dla McpA [81]. McpA i McpB występują w postaci di­merów, ale dowiedziono, że mogą tworzyć trimery, co nie wyjątkowe wśród białek MCP [16,82]. Związanie repelenta lub (uwolnienie atraktanta) przez MCP powoduje auto­fosforylację kinazy CheA, która następnie fosforyluje CheY (rys. 5). Ufosforylowany CheY dyfunduje do motoru flageli i oddziałując z jego białkami zmienia kierunek rotacji na CW. Bakteria przestaje podążać naprzód i zaczyna kręcić się w kółko. Z kolei szybka defosforylacja CheY przez fosfatazę CheZ powoduje włączenie ruchu CCW, pozwalającego na przemieszczanie się bakterii na przód, ale już w zmienionym, innym kierunku [80] (ryc. 2.) 
Adaptacja do sygnału System chemotaktyczny bakterii, który odpowiada na gradient substancji po­trafi adaptować się do nowych warun­ków. Dzięki temu bakterie są w stanie odpowiadać na bardzo szeroki zakres stężeń chemoatraktanta, jednak wraż­liwość na zmiany stężenia liganda jest wprost proporcjonalna do jego stęże­nia w otoczeniu bakterii [83]. Po roz­poczęciu transdukcji sygnału chemotaktycznego następuje regene­racja receptorów MCP. Adaptacja jest możliwa dzięki odwracalnej metylacji receptorów [80]. Poziom metylacji MCP jest uwarunkowany przez aktyw­ność metyloesterazy CheB oraz (kon­stytutywnie aktywnej) metylotransferazy CheR. CheR prefe­rencyjnie metyluje nieaktywne recep­tory, zaś CheB preferencyjnie demetyluje te, które są zaktywowane. Odwracalna metylacja białek MCP za­chodzi na 4-6 resztach glutaminianu w części cytoplazmatycznej białka. 


Ryc. 5. Transdukcja sygnału chemotaktycznego w bakteriach E. coli. Po związaniu liganda 
(L) przez chemoreceptory (R) następuje przekaz sygnału przez kinazy Che. Ufosforylowany CheY wiąże FliM znajdujący się w rotorze flageli (FR) co wywołuje zmianę kierunku jego rotacji na CW. 
Zmetylowany receptor MCP wzmaga aktywność CheA, natomiast brak me­tylacji obniża aktywność CheA. Z kolei autofosforylacja CheA aktywuje mety­loesterazę CheB, która usuwa grupy metylowe z MCP i przywraca zdolność do odpowiedzi na bodźce [80,84]. Za­tem z jednej strony CheA stymuluje przekaz sygnału przez fosforylację CheY (co zachodzi bardzo szybko), a z drugiej wygasza przekaz sygnału przez stymulację demetylacji recepto­ra MCP (co jest reakcją wolniejszą) [80]. 


Regulacja ekspresji genów klasy I, II i III odpowiedzialnych za składanie systemu flagelinowego 
Utworzenie funkcjonalnego systemu flagelinowego wymaga ekspresji przynajmniej 50 różnych białek [15]. Geny kodujące białka, które budują system flagelinowy, są zorganizowane w operony (wyróżnia się aż 17 oper­onów, których aktywacja jest niezbędna do powstania systemu fla­gelinowego). Znajdują się one pod kontrolą promotorów należących do pierwszej (wczesnej), drugiej (pośred-niej) lub trzeciej (późnej) klasy [85,82,86] (ryc. 6.). Część z genów ulega ekspresji pod kontrolą promo­torów należących zarówno do drugiej, jak i trzeciej klasy np. ekspresja flgK, flgL, flgM, flgN, fliD i fliT. Precyzyjna kontrola jest niezbędna do poprawne­go utworzenia flageli [15,87,88]. Pro­motory pierwszej i drugiej klasy są aktywowane dzięki rekrutacji czynnika sigma70, zaś promotory trzeciej klasy wiążą polimerazę RNA za pośrednict­wem czynnika sigma28. W odpowiedzi na sygnały ze środow-iska dochodzi do aktywacji promotora pierwszej klasy, który kontroluje oper­on flhDC [73]. Białka FlhD oraz FlhC tworzą kompleks FlhD4C2, który akty­wuje zależny od czynnika sigma70 pro­motor klasy drugiej [16,89]. Aktywacja promotora klasy drugiej powoduje eks­presję genów kodujących białka po­trzebne do złożenia funkcjonalnego ciałka podstawowegoi haka HBB. Do genów klasy drugiej należą m.in. geny białek FlgM i FliA. 
Aktywacja ekspresji genów pod kon­trolą promotorów klasy drugiej 
Białko FliA jest specyficznym dla sys­temu flagelinowego czynnikiem transkrypcyjnym sigma28, oddzi-ałującym z promotorami trzeciej klasy [90]. Z kolei FlgM, tzw. „czynnik anty­sigma28”, ma za zadanie inaktywować działanie FliA. Oddziaływanie FlgM z FliA zapobiega transkrypcji genów znajdujących się pod kontrolą promo­tora klasy trzeciej, zanim nie zostaną ukończone wcześniejsze etapy produk­cji białek i złożenie ciałka podsta­wowego wraz z hakiem. Operony klasy trzeciej, które ulegają ekspresji dzięki aktywności czynnika FliA (sigma28) odpowiadają za produkcję białek fazy późnej składania systemu fla­gelinowego. Jednym z punktów kon­trolnych jakie znajdują się na drodze do powstania funkcjonalnego systemu jest złożenie struktury HBB, bez której nie dojdzie do ekspresji operonów fazy późnej. Jak w takim razie komórka bakteryjna może w łatwy sposób roz­poznać, że ok. 30 różnych białek uległo ekspresji i w poprawny sposób utworzyło strukturę HBB, szczególnie, że żadne z tych białek nie jest cząsteczką sygnałową per se? Okazuje się, że białko FlgM potrafi rozpoznać stopień zaawansowania powstającej flageli i jest głównym elementem punktu kontrolnego budowania kom­pleksu. W komórkach z funkcjonalnym HBB następuje wydzielanie czynnika FlgM (anty-sigma28) do medium i dzięki temu możliwa jest aktywacja transkrypcji genów flageli późnej fazy [91]. Dlatego białko FlgM uchodzi za kontrolera integralności całego sys­temu flagelinowego [15,91]. Wydziele­nie FlgM z komórki zachodzi z minimalnymi kosztami energii dla komórki, ponieważ wydostaje się ono przez ten sam system sekrecji co białka flageliny budujące filament. Ob­niżenie stężenia FlgM w komórce ak­tywuje czynnik sigma28, który rozpoczyna traksnrypcję genów znaj-dujących się pod kontrolą promotorów klasy trzeciej [12,92]. 
Punkt kontrolny składania flageli – białko FlgM 
Chadsey i wsp. (1998) pokazali, że FlgM może wiązać FliA nawet gdy ten przyłączy się do kompleksu polimerazy RNA, dlatego po spełnieniu swojej roli FlgM musi być usuwany z bakterii, co pozwala uruchomić transkrypcję operonów klasy trzeciej [12,93]. Analiza wielowymiarowego NMR ujawniła, że białko FlgM w warunkach fizjologicznych jest w dużej mierze niesfałdowane [94]. FlgM oddziałuje 


Ryc. 6. Regulacja trankrypcji operonów sys­temu flagelinowego. Master operon flhDC jest głównym elementem regulatorowym od-powiadajacym za rozpoczęcie ekspresji ge­nów systemu flagelinowego. Jego produkt FlhD4C2 aktywuje ekspresję operonów klasy II, wśród których znajdują się geny kodujące białka FliA oraz FlgM, które regulują ekspre­sję operonów klasy III. 
z FliA (sigma28) przez swoją C­końcową domenę [87,88]. Związanie FliA powoduje, że część FlgM przybiera sfałdowaną konformację miedzy 41-97 resztą aminokwasową, podczas gdy N-końcowy fragment białka, zawierający sygnał sekrecji, pozostaje nieustrukturyzowany [73]. Karlinsey i wsp. (2000) zauważyli, że, podobnie jak gen fliA, flgM ulega transkrypcji z dwóch promotorów: klasy drugiej i klasy trzeciej [12]. Badania pokazują, że FlgM jest transportowany przez flagelinowy system sekrecji w ten sam sposób jak białka flageliny, jednak wymaga do tego obecności FlgN [12,95,96]. Sekrecja białka FlgM jest zależna od zdolności jego wiązania z FliA, dlatego istnieją przypuszczenia, że to właśnie FliA może pełnić rolę chaperonu dla FlgM [94]. Z drugiej jednak strony, produkcja stabilnego FlgM następuje przed syntezą FliA [96]. Xu i wsp. pokazali, że FliS moduluje aktywność FlgM, jednak nie jako białko opiekuńcze w klasycznym tego słowa znaczeniu. Potwierdzili hipotezę, że FliS zapobiega sekrecji i degradacji FlgM. Co ciekawe, w bakteriach fliS-zaobserwowano wzmożone wydzie­lanie FlgM, a towarzyszyła mu znacznie podwyższona aktywność promotorów klasy trzeciej [96]. Niektóre badania pokazują, że FliS może pełnić funkcję białka partnerskiego dla FlgM zanim dojdzie do produkcji FliA, mimo to, nie zostało ono uznane za białko chaperonowe dla FlgM [97]. FliS tworzy kompleks z FlgM, przysłaniając miejsce wiązania się FliA i działa jak kompetycyjny inhibitor do momentu powstania FliA [131]. FliS pełni funkcję białka opiekuńczego dla FliC, dlatego jest obecny podczas transportu flageliny do kanału systemu sekrecyjnego [96]. Nie poznano jeszcze mechanizmu uwalniania białka FliA przez FlgM, jednak zaraz po jego usunięciu rozpoczyna się transkrypcja genów 
znajdujących  się  pod  kontrolą  
promotorów  trzeciej  klasy  [96].  
Pozwala  to  na  produkcję  białka  

flageliny typu FliC lub FljB, a także całego systemu chemosensorycznego [12]. 
Pętle sprzężeń zwrotnych regulujących aktywność promotorów Białko FliZ jako pozytywny regulator promotorów klasy drugiej 
Aktywacja promotorów klasy drugiej przez kompleks FlhD4C2 rozpoczyna ekspresję operonów fliDST i fliAZ. Powstały FliZ wzmaga ekspresję operonów spod kontroli promotorów klasy drugiej przez dodatnie sprzężenie zwrotne [98]. Saini i wsp. (2010) pokazują, że FliZ może być aktywatorem FlhD4C2 [98,99]. FliZ pełni rolę represora operonu nlpC/ydiV, którego produkt YdiV jest negatywnym regulatorem operonów klasy drugiej [86]. Białko YdiV wiąże kompleks FlhD4C2 (przez interakcję z podjednostkami FlhD) i hamuje jego działanie [86,100]. 
Autoregulacja operonów klasy drugiej 
Uznaje się, że białka FliA i FlgM specyficznie regulują operony należące do klasy trzeciej. Okazuje się, że nadekspresja czynnika sigma28 (FliA) prowadzi także do wzmożonej ekspresji genów będących pod kontrolą promotorów klasy drugiej [15]. Niektóre operony klasy drugiej np.: fliAZY podlegają transkrypcji zarówno przez kompleks sigma70-FlhD4C2­polimeraza RNA jak i sigma28 (FliA)­polimeraza RNA [101]. Jest to możliwe dzięki temu, że posiadają one sekwencje promotorów klasy II i III, które są zlokalizowane tandemowo i częściowo się zazębiają [101]. Co ciekawe czynniki FlhD4C2 oraz sigma 28 (FliA) mogą ze sobą współpracować w celu ekspresji genów.Powstały dwa modele, które częściowo opisują mechanizm tego zjawiska. Pierwszy z nich sugeruje, że FliA, będący czynnikiem sigma28, wiąże się do miejsca promotorowego drugiej klasy, zaś FlhD4C2 jako pozytywny aktywator promuje stabilność kompleksu FliA i polimerazy RNA. Jeśli ta hipoteza okaże się prawdziwa, to znaczy, że transkrypcja operonów klasy drugiej może się rozpoczynać z dwóch niezależnych od siebie promotorów. Druga hipoteza zakłada, że FlgD4C2 jest czynnikiem sigma, zaś FliA pełni rolę białka asystującego w kompleksie FlgD4C2 z polimerazą RNA, a to wymusza sytuację w której każdy operon klasy drugiej może mieć tylko jeden promotor, który jest transkrybowany przez kompleks polimerazy RNA oddziałującej z FlgD4C2 i aktywowanej przez FliA [15]. 
Regulacja przez master-operon flhDC 
Głownym operonem systemu flagelinowego jest operon flhDC. Brak operonu flhDC jako jedyny powoduje całkowite zahamowanie transkrypcji pozostałych genów systemu flagelinowego, ponieważ FlhD i FlhC są głównymi regulatorami operonów wszystkich pozostałych klas. Jednym z białek, które wzmaga aktywność FlhD4C2 jest, jak wspomniano uprzednio FliZ. FliZ jest niezbędny do utrzymania poziomu białek FlhD i FlhC, a to w konsekwencji prowadzi do aktywacji ekspresji operonów pozostałych klas. W przypadku, gdy bakteria zostanie pozbawiona FliZ, następuje obniżenie ekspresji białek HBB, co prowadzi do zmniejszonej wydajności sekrecji białek, w tym białka FliD, które umożliwia budowanie filamentu flageli (Patrz podrozdział Budowa systemu flagelinowego, filament flagelinowy). Ponadto, FliD wyłapuje wolne cząsteczki białka FliT, które jest inhibitorem FlhD4C2 (Ryc. 7). FliT hamuje aktywację promotorów klasy drugiej, oddziałując z FlhC [102,103]. 

Ryc. 7. Schemat regulacji master operonu flhDC. Opis rysunku znajduje się w tekście. 


Salmonella VNP20009 i problemy z ruchem 
W Zakładzie Biochemii Komórki WBBIB UJ trwają prace nad poprawieniem właściwości przeciwno­wotworowych bakterii Salmonella Typhimurium szczepu VNP20009. Do­celowo bakterie mają zostać użyte w immunoterapii do wywołania odpowiedzi immunologicznej organ­izmu pacjenta, która będzie skierow­ana przeciwko komórkom nowotworowym. Pionierem w wyko­rzystaniu bakterii w immunoterapii przeciwnowotworowej był dr William Coley [104]. W latach 20’ ubiegłego wieku podawał swoim pacjentom tzw. toksynę Coleya, zawierającą martwe bakterie Streptococcus pyogenes 
Serratia marcescens, które miały sprowokować układ odpornościowy do wytworzenia swoistej odpowiedzi im­munologicznej również przeciwko komórkom nowotworowym. Podczas swojej pracy Coley podał toksynę prawie tysiącu pacjentów chorujących na nowotwory różnych typów. Ponieważ używał on różnych dawek, sposobów i częstości podawania tok­syny, wyniki jego pracy były trudne do oceny pod względem powtarzalności. Jednak w wielu przypadkach kilku­miesięczne – lub kilkuletnie – leczenie doprowadziło do całkowitej regresji nowotworu, a czas przeżycia pacjentów leczonych toksyną znacznie się wydłużył, nawet w przypadku pacjentów z nieoperacyjnymi nowot­worami [105]. Niestety jego praca badawcza spotkała się z dezaprobatą części środowiska medycznego ze względu na niejasność procesu i brak przewidywalności, co zatrzymało rozwój immunoterapii bakteryjnej aż do drugiej połowy lat 90. Bakterie wykazują wiele zalet w porównaniu m.in. do biernie przen­oszonych cząsteczek leków używanych w chemioterapii. Jako organizmy żywe, po poddaniu manipulacji genetycznej mogą produkować terapeutyczne bi-ałka: bezpośrednio wywołujące śmierć komórek nowotworowych albo stymu­lujące układ odpornościowy. Ponadto, bakterie charakteryzuje nie tylko zdol­ność do poruszania się, ale również możliwość przemieszczania wraz z gradientem chemicznym różnych związków, czego nie robią wyżej wymi­enione cząsteczki chemoterapeutyków. Należy również dodać, że bakterie względnie beztlenowe wykazują chemotaksję względem różnego rodzaju atraktantów występujących w tkance nowotworowej jak np. obniżone stężenie tlenu oraz szereg związków odżywczych, uwalnianych do środowiska nowotworowego z nek­rotycznych komórek [106]. Pozwala to bakterii penetrować wgłąb tkanki no­wotworowej do miejsca najbardziej sprzyjającemu jej rozwojowi, a tym samym akumulacji bakterii, co może przyczynić się do lokalnego wzrostu stężenia terapeutyku przez nie produkowanego [107]. W przypadku terapii wykorzystującej bakterie, ważną kwestią jest również ich kontro­lowane namnażanie, które można mod­ulować przez antybiotykoterapię [108] po zakończonej terapii przeciwnowot­worowej. Bakterie S. Typhimurium należą do fakultatywnych beztlenowców, które namnażają się wewnątrzkomórkowo. Mogą gromadzić się w guzie ponieważ wsytępuje tam stłumiona odpowiedź immunologiczna a dzięki tolerowaniu niskiego stężenia tlenu są w stanie przeżyć w tkance nowotworowej [128]. Salmonella Typhimurium VNP20009 jest jednym ze szczepów o potenc­jalnym zastosowaniu przeciwnowot­worowym, ponieważ spełnia dodatkowe warunki, jakie pozwalają na jego wykorzystanie w terapii prze­ciwnowotworowej. Przede wszystkim, poza wymienionymi powyżej cechami, szczep ten jest genetycznie zmody­fikowany tak, aby obniżyć jego pato­genność, co pozwala na podanie bakterii do organizmu pacjenta bez obawy o wywołanie zbyt silnej reakcji immunologicznej skierowanej prze­ciwko bakteriom. Inwazyjność bakterii została osłabiona przez zakłócenie szlaku syntezy puryn oraz przez za­burzenie poprawnej syntezy lipidu A lipopolisacharydu [127]. Ingerencja w szlak syntezy puryn spowodowała, że bakterie VNP20009 chętniej lokal­izują się w tkance nowotwrorowej, która jest bogata w substancje odżyw-cze. Warto nadmienić, że bakterie VNP20009 znalazły się w pierwszej fazie badań klinicznych, w której ustalono bezpieczną dawkę jaką można podać pacjentowi [128, 129] 
Najnowsze badania dowodzą, że bak­terie VNP20009 nie wykazują tak sil­nej chemotaksji w porównaniu do bakterii szczepu dzikiego [109]. Praca Brodway i wsp. pokazuje, że bakterie szczepu VNP20009 nie są zdolne do zmiany kierunku rotacji rotora, co tłu­maczyło obniżoną ruchliwość [109, 110, 111]. Z badań wynika, że punk­towa mutacja w, jak się okazuje, ważnej dla aktywności białka pozycji 110 proliny łańcucha polipeptydowego CheY, doprowadza do obniżenia jego aktywności [112]. Co ciekawe, przy­wrócenie funkcjonalnego białka CheY przez jego komplementację, doprowadza do poprawy ruchliwości bakterii, jednak nadal jest ona niższa niż w przypadku bakterii szczepu dzikiego [109]. Prawdopodobnie bak­terie nie mogą odzyskać pełnej zdol-ności do ruchu ze względu na jeszcze inne niezidentyfikowane mutacje mo-gące wpływać na system flagelinowy, co jest możliwe, jeśli wziąć pod uwagę dużą liczbę nagromadzonych mutacji w genomie (ok. 128 delecji w genomie i 48 polimorfizmów SNP) [113]. 
Wykorzystanie systemu flagelinowego bakterii S. Typhimurium w biotechno­logii 
Ze względu na swoje właściwości sys­tem flagelinowy może zostać zaad­aptowany do potrzeb biotech­nologicznych. Ponieważ jest on syste­mem sekrecyjnym, który wydziela tysiące cząsteczek białka flageliny, ut­worzenie białka rekombinowanego przez połączenie odpowiedniej sek­wencji sekrecyjnej FliC z białkiem rekombinowanym, pozwala na wydzielanie dużej jego ilości do medi­um hodowlanego, co z kolei upraszcza proces oczyszcznia [64, 114]. Dod­atkową zaletą wykorzystania tego sys­temu jest fakt, że wydzielane białka zachowują swoją strukturę i funkcję [63]. W 2017 roku Zheng i wsp. wykorzystali bakterie S. Typhimurium produkujące białko flageliny pochodzące z Vibrio vulnificus do badań nad terapią przeciwnowot­worową. Doświadczenia in vivo pokazały, że tak zmodyfikowane bak­terie hamowały rozrost nowotworu a nawet powodowały całkowitą jego regresję [130]. 

Wpływ flageli na adhezję i in­wazyjność bakterii 
System flagelinowy wpływa na wirulencję bakterii na wiele sposobów. Oprócz chemotaksji, flageli przypisuje się także rolę w adhezji do powerzchni komórek eukariotycznych, tworzenie biofilmu, a nawet regulację ekspresji typowych czynników wirulencji i ich sekrecji w celu rozpoczęcia inwazji komórek. Adhezja jest jednym z pierwszych kroków do kolonizacji komórek gos­podarza i nowego środowiska, przez co jest ściśle związana z patogenezą. Ist­nieją dwie hipotezy na temat bez-pośredniego wpływu flageli na patogenezę i do dnia dzisiejszego zdania na temat tego czy flagela jest czynnikiem wirulencji są podzielone [115, 116, 117, 118]. Z naszych doświadczeń wynika, że bakterie pozbawione genu fliC są znacznie mnie inwazyjne w stosunku do komórek żernych niż bakterie posiada-jące gen fliC dlatego jesteśmy przy­chylni hipotezie, że flagela ma bezpośredni wpływ na adhezję i wirulencję bakterii. Badania prowadzone na modelu zwi-erzęcym pokazały, że flagela jest zaangażowana w proces zakażania u myszy i kurcząt. Bakterie pozbawione flageli w wyniku mutacji genów takich jak: fliC, motAB czy cheA wykazują obniżony poziom ad­hezji do komórek gospodarza w stosunku do bakterii szczepu dzikiego [115]. Obniżona adhezja może być spowodowana zarówno brakiem flageli (mutacje w genie fliC) jak i za­burzeniem zdolności do chemotaksji (mutacje w genach motAB, cheA) [115]. Allen-Vercoe i wsp. (1999) pokazali, ze bakterie nieposiadające flageli są znacznie mniej adherentne niż bakterie, u których zachowano fla­gelę ale upośledzono zdolność do por­uszania się. Ponadto, niektóre obserwacje wykazały, że zarówno bak­terie nieposiadające flageli jak i te, które jedynie nie były zdolne do ruchu nie różniły się pod względem in­wazyjności. To sugeruje, że ruchliwość powoduje zwiększenie inwazyjności bakterii przez np. zwiększenie prawdo­podobieństwa spotkania się bakterii z komórką gospodarza [118]. Wszystkie wyniki badań pokazują, że flagela jest potrzebna do inwazyjności, niemniej jednak nie ma pewności co do jej bezpośredniego udziału w tym pro­cesie. Mimo istniejących rozbieżności, więk­szość prac pokazuje, że obecność fla­geli i zdolność do ukierunkowanego poruszania się bakterii jest bardzo ważna dla kolonizacji komórek gos­podarza. Rozbieżności mogą wynikać z faktu, iż flagela nie jest jedyną struk­turą zewnątrzkomórkową bakterii odpowiadającą za adhezję. Bakterie produkują różne struktury powierzch­niowe np. adhezynę FimH, która należy do typu I pilii rozpoznających terminalne mannozy glikoprotein na komórkach nabłonkowych [119]. Sprawę komplikuje fakt, że prawdo­podobnie bakterie są w stanie produkować w jednym czasie albo struktury umożliwiające przyczepianie się bakterii do powierzchni albo fla­gelę. Najprawdopodobniej jest to po­


Cholesterol jako miejsce adhezji bakterii 
Salmonella enterica serotyp Typhi i S. Typhimurium są zdolne do tworzenia biofilmu na powierzchni cholesterolu, a wydajność zakażenia komórek nabłonkowych jest ściśle związana z jego ilością w błonie komórkowej [125]. Badania przeprowadzone na S. Typhimurium wykazały, że wprowadzenie mutacji w obrębie genów odpowiedzialnych za budowanie lub regulację systemu fla­gelinowego spowodowało obniżenie adhezji bakterii do cholesterolu. Co ważne, bakterie S. Typhimurium pozbawione genu fliC nie były zdolne do tworzenia biofilmu na cholesterolu, zaś bakterie posiadające flagelę, jednak niezdolne do poruszania się (delecja motA) formowały biofilm na cholesterolu z podobną wydajnością jak bakterie szczepu dzikiego. Badania ujawniły również, że martwe bakterie szczepu dzikiego adherowały do immobilizowanego cholesterolu z porównywalną wydajnością co żywe bakterie, skutecznie tworząc rusztowanie do później dodawanych bakterii – zarówno szczepu dzikiego, jak i pozbawionych flageli. Adhezja bakterii pozbawionych genu fliC, ale posiadających fljB była mocno zredukowana w porównaniu do bakterii posiadających flagelinę FliC, ale pozbawionych flageliny fazy drugiej FjlB. Zatem flagela zbudowana z białka fla­geliny FliC bierze udział w adhezji bakterii do cholesterolu oraz w początkowych fazach tworzenia biofilmu [126]. 
dyktowane zmiennymi warunkami śro-szczepie S. Dublin, które zostały dowiskowymi (temperatura, pH, os-pozbawione genów cheA, cheB lub fliC molarność), które wymuszają na [120]. bakterii zmianę profilu ekspresji U niektórych bakterii istnieje korelacja genów, w tym master-operonu flhDC. między ekspresją genów systemu fla-Erhardt i wsp. (2015) zauważyli, że gelinowego a ekspresją genów bezpośred-funkcjonalna flagela jest nie tylko nio zaangażowanych w infekcyjność. niezbędna do zakażania komórek W przypadku bakterii Salmonella Para-nabłonkowych, ale również ma duże typhi A (ale nie bakterii S. Typhimuri-znaczenie przy fagocytozie bakterii um) brak flageli wywołany delecją fliC przez makrofagi [133]. Należy wspom-skutkuje wzrostem transkrypcji innych nieć, że proces ten nie kończy się uni-genów samego systemu flagelinowego, cestwieniem bakterii – Salmonella jak i genów należących do pierwszej zmienia fagosom w wakuolę, w której wyspy patogenności SPI-1 oraz przeżywa i namnaża się. Bakterie wzmożoną sekrecją przez system 
S. Typhimurium pozbawione genów sekrecji typu trzeciego T3SS. Jest to cheB i fliC są znacznie słabiej fagocyt-niezmiernie ciekawe zjawisko, owane przez komórki żerne w stosunku ponieważ pokazuje zależność między do bakterii szczepu dzikiego, co aktywnością T3SS, biorącego bez­również zaobserwowano w doświad-pośredni udział w infekowaniu 
czeniach przeprowadzonych na komórek, a upośledzeniem chemotak­sji. Niektóre prace pokazują, że usunięcie flageli promuje propagację bakterii wewnątrz zakażonych makrof­agów i obniżoną cytotoksyczność względem tych komórek. Bakterie S. Typhimurium pozbawione głównego elementu regulatorowego FlhD wykazują wyższy poziom zakażania tkanek myszy w porównaniu do bak­terii szczepu dzikiego oraz szybciej namnażają się wewnątrz makrofagów. Jednak w przypadku doświadczeń in vitro przeprowadzonych na ludzkich i mysich komórkach nabłonkowych za­obserwowano obniżoną wirulencję, a także obniżoną odpowiedź leuko­cytów na obecność tak zmutowanych bakterii. Obniżona odpowiedź na bak­terie pozbawione flageli może być wynikiem braku stymulacji receptorów TLR5 przez flagelinę. Nie tylko struktura falgeli zdaje się być jednym z czynników wirulencji należącym do systemu flagelinowego. Innym czynnikiem wpływającym na wirulencję bakterii jest produkt eks­presji genu flgM, będący negatywnym regulatorem syntezy flageli. Niestety istnieje niewiele badań dotyczących analizy funkcji FlgM w kontekście wirulencji, jednak wiadomo, że wydajny proces zakażania komórek myszy jest ściśle uzależniony od obecności FlgM. Istnieje tu pozorna sprzeczność – zarówno flagela, jak i negatywny regulator jej syntezy wzmagają wirulencję. Prawdopodobnie FlgM działa przez modulację akty­wności FliA, który z kolei jest odpow­iedzialny za regulację ekspresji genów fliC i fljB oraz genów SPI-1 [132]. Kinazy histydynowe z rodziny Che także przyczyniają się do zachowania równowagi w procesie wirulencji bak­terii. Bakterie S. Tymphimurium pozbawione białek CheA, CheW, CheR oraz CheY wykazują wzmożoną in­wazyjność in vitro [121]. Prawdo­podobnie skrócenie czasu obracania się bakterii wokół własnej osi na rzecz wydłużenia ruchu prostoliniowego spowodował zmiany, w których bakter­ia rzadziej spotyka komórki w doświadczeniach in vitro. Z kolei brak budujących statory białek Mot oraz białka CheB skutkuje obniżoną wirulencją względem komórek nabłonkowych [118]. Kim i wsp. (2009) pokazują, że połączenia między ścieżkami wirulencji i chemotaksji u bakterii 
S. Typhimurium są bardzo skomp­likowane, bowiem na wirulencję wpły-wa również (pośrednio przez system flagelinowy) białko TdcA [122]. TdcA jest aktywatorem operonu tdc, który koduje enzymy zaangażowane w ścieżki degradacji L-seryny i L-treoniny[122]. Mutacje w białku TdcA mają negatywny wpływ na inwazyjność oraz syntezę flageli w S. Typhimurium, ponieważ powodują zahamowanie produkcji odpowiedniej formy funkc­jonalnego białka flageli FliC, a przez to obniżenie ruchliwości. Ponadto, eks­presja genów z SPI-1 jest hamowana w bakteriach ze zmutowanym TdcA, co jest związane z obniżeniem ekspresji FliZ, który z kolei jest pozytywnym regulatorem HilA – aktywatora genów SPI-1 [122, 123, 124]. Podsumowując, większość prac pokazuje, że flagela jest zaangażowana w adhezję i wirulencję bakterii albo pośrednio przez zdolność do przemieszczania się w pobliże komórek gospodarza albo bezpośred­nio np. przez oddziaływanie z ele­mentami komórki eukariotycznej. Ponieważ wykazano, że mutacje w obębie białek odpowiedzialnych za poprawne funkcjonowanie systemu fla­gelinowego mogą powodować obn-iżenie wirulencji, ale również ku zaskoczeniu odkywców hiper­wirulencję bakterii, można śmiało stwierdzić, że system regulacyjny chemotaksji bakterii i niektóre mech­anizmy wirulencji są ze sobą ściśle powiązane. Niestety mała ilość prze­prowadzonych do tej pory badań nie pozwoliła na poznanie mechanizmów tych zależności. Ten rozdział pokazuje, że zależność wirulencji od obecności flageli i zdolności chemotaksji może być różna w różnych rodzajach/sero-typach bakterii [13,123]. 


Podsumowanie 
System flagelinowy jest strukturą bardzo skomplikowaną pod względem budowy, a jego złożenie wymaga precyzyjnej regulacji na wielu etapach. Ze względu na to flagela stanowi szer­oki obszar badań, w którym istnieje jeszcze wiele niewiadomych czekają­cych na odkrycie. Do dzisiaj nie pozn­ano dokłdanych mechanizmów działania rotora. Podobnie jak szczegłóy dotyczące oddziaływania bi-ałek opiekuńczych z FlgM, a także sposób w jaki uwalnia FliA przed opuszczeniem komórki nadal stanowią tajemnicę. Dotychczasowe publikacje pokazują, że system flagelinowy może być wykorzystany w biotechnologii w celu sekrecji dużej ilości białek do medium. Może to mieć wiele za­stosowań począwszy od produkcji bi-ałek rekombinowanych do medium hodowlanego (co ułatwia ich oczyszczanie), aż po produkcję białek terapeutycznych uwalnianych w miejs­cu nowotworu. 
Bibliografia 
[1] Hayashi F, Smith KD, Ozinsky A, Hawn TR,Yi E, Goodlett DG, Eng JK, Akira S, UnderhilL DM & Aderem A. (2001).The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 410, 1099-1103 
[2] Choi, Y., Shin, H., Lee, J.-H., & Ryu, S. (2013). Identification and Characterization of a Novel Flagellum-Dependent Salmonella-Infecting Bacteriophage, iEPS5. Applied and Environmental Microbiology, 79(16), 4829–4837. 
[3] Berg, H. C., and Anderson, R. A. (1973). Bacteria swim by rotating their flagellar filaments.Nature 245, 380–382 
[4] Kojima S, Blair DF. 2004. The bacterial flagellar motor: structure and function of a complex molecular machine.Int Rev Cytol 233: 93–134 
[5] Larsen, S. H., Reader, R. W., Kort, E. N., Tso, W.-W., and Adler, J. (1974). Change in direction of flagellar rotation is the basis of the chemotactic response in E. coli. Nature 249,74–77. 
[6] Silverman, M., and Simon, M. (1974). Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature 249,73–74. 
[7] Galan JE, Collmer A (1999) Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science 284: 1322–1328 
[8] Cornelis GR. 2006. The type III secretion injectisome. Nat Rev Microbiol 4: 811–825 
[9] Cordes FS, Komoriya K, Larquet E, Yang S, Egelman EH, Blocker A, Lea SM. 2003. Helical structure of the needle of the type III secretion system of Shigella flexneri. J Biol Chem 278: 17103–17107. 
[10] Saier MH Jr, 2004. Evolution of bacteria type III protein secretion system TrendsMicrobiol 12(3):113-5 
[11] Proft T, Backer EN (2009) Pili in Gram-negative and Gram-positive bacteria – structure, assembly, and their role in disease. Cell Mol Life Sci 66(4)613-35 
[12] Karlinsey JE, Tanaka S, Bettenworth V, Yamaguchi S, Boos W, Aizawa SI, Hughes KT. 2000. Completion of the hook-basal body complex of the Salmonella typhimurium flagellum is coupled to FlgM secretion and fliC transcription. Mol. Microbiol. 37:1220–1231. 
[13] Haiko, J., & Westerlund-Wikström, B. (2013). The Role of the Bacterial Flagellum in Adhesion and Virulence. Biology, 2(4), 1242–1267 
[14] Chevance FFV, Hughes KT. 2008. Coordinating assembly of a bacterial macromolecular machine. Nat Rev Micro 6: 455–465. 
[15] Kutsukake K, Okada T, Yokoseki T, Iino T. (1994) Sequence analysis of the flgA gene and its adjacent region in Salmonella typhimurium, and identification of another flagellar gene, flgN. Gene 143(1):49-54. 
[16] Wang S, Fleming RT, Westbrook EM, Matsumura P, McKay DB (2006) Structure of the Escherichia coli FlhDC complex, a prokaryotic heteromeric regulator of transcription. J Mol Biol. 355(4):798-808. 
[17] Zhou J, Sharp LL, Tang HL, Lloyd SA,Billings S, et al. 1998. Function of protonatable residues in the flagellar motor ofEscherichia coli: a critical role for Asp 32 of MotB. J. Bacteriol. 180:2729–35 
[18] Thormann KM, Paulick A. 2010. Tuning the flagellar motor. Microbiology 156:1275–1283. 
[19] 
Thomas, D. R., Morgan, D. G., and DeRosier, 

D. 
J. (1999). Rotational symmetry of the C ring 


[20] and mechanism for the flagellar rotary motor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 10134–10139 
[21] Sarkar, M. K., Paul, K., & Blair, D. (2010). Chemotaxis signaling protein CheY binds to the rotor protein FliN to control the direction of flagellar rotation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(20), 9370–9375 
[22] Zhao, R., Pathak, N., Jaffe, H., Reese, T. S., and Khan, S. (1996). FliN is a major structural protein of the C-ring in the Salmonella typhimurium flagellar basal body. J. Mol. Biol. 261, 195–208. 
[23] Sockett H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., and Macnab, R. M (1992). Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella Typhimurium. J. Bacteriol. 174, 793-806 
[24] Lloyd, S. A., Tang, H., Wang, X., Billings, S., and Blair, D. F. (1996). Torque generation in the flagellar motor of Escherichia coli: Evidence of a direct role for FliG but not for FliM or FliN. J. Bacteriol. 178, 223–231. 
[25] Yamaguchi S., Fujita, H., Ishihara, A., Aizawa, S.-I., and Macnab, R. M. (1986b). Subdivision of flagellar genes of Salmonella Typhimurium into regions responsible for assembly, rotation, and switching. J. Bacteriol 166. 187-193 
[26] Yamaguchi S Aizawa, S.-I., Kihara, M., Isomura, M., Jones, C. J., and Macnab R.M. (1986a). Genetic evidence for a switching and energy-transducing complex in the flagella rotor of Salmonella Typhimurium. J. Bacteriol. 168. 1172-1179 
[27] Francis, N. R., Sosinsky, G. E., Thomas, D., and DeRosier, D. J. (1994). Isolation,characterization and structure of bacterial flagellar motors containing the switch complex.J. Mol. Biol. 235, 1261–1270 
[28] 
Thomas, D., Morgan, D. G., and DeRosier, D. 

J. 
(2001). Structures of bacterial flagellar motors from two FliF–FliG gene fusion mutants. J. Bacteriol. 183, 6404–6412. 


[29] Aizawa, S.-I. (2000). Flagella. In ‘‘Encyclopedia of Microbiology,’’ 2nd Ed., pp. 380–389.Academic Press, San Diego, CA. 
[30] Khan, I. H., Reese, T. S., and Khan, S. (1992). The cytoplasmic component of the bacterial flagellar motor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5956–5960. 
[31] Oosawa, K., Ueno, T., and Aizawa, S.-I. (1994). Overproduction of the bacterial flagellar switch proteins and their interactions with the MS ring complex in vitro. J. Bacteriol. 176, 3683–3691. 
[32] Zhou, J., Lloyd, S. A., & Blair, D. F. (1998). Electrostatic interactions between rotor and stator in the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95(11), 6436–6441. 
[33] Reid SW, Leake MC, Chandler JH, Lo CJ, Armitage JP, Berry RM 2006. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A 103:8066–8071. 10.1073/pnas.0509932103 
[34] Kim, E. A., Price-Carter, M., Carlquist, W. C., & Blair, D. F. (2008). Membrane Segment Organization in the Stator Complex of the Flagellar Motor: Implications for Proton Flow and Proton-Induced Conformational Change. Biochemistry, 47(43), 11332–11339. http://doi.org/10.1021/bi801347a 
[35] Kojima, S., Imada, K., Sakuma, M., Sudo, Y., Kojima, C., Minamino, T., Homma, M. and Namba, K. (2009), Stator assembly and activation mechanism of the flagellar motor by the periplasmic region of MotB. Molecular Microbiology, 73: 710–718. doi:10.1111/j.1365­2958.2009.06802.x 
[36] Muramoto, K. and Macnab, R. M. (1998), Deletion analysis of MotA and MotB, components of the force-generating unit in the flagellar motor of Salmonella. Molecular Microbiology, 29: 1191–1202. doi:10.1046/j.1365­2958.1998.00998.x 
[37] T. Minamino, K. NambaDistinct roles of the FliI ATPase and proton motive force in bacterial flagellar protein exportNature, 451 (2008), pp. 485-488 
[38] Vogler A. P., Homma, M., Irikura, V. M., & Macnab, R. M. (1991). Salmonella Typhimurium mutants defective In flagellar filament regrowth and sequence similarity of FliL to F0F1, vacuolar, and archaebacterial ATPase subunits Journal of Bacteriology, 173(11), 3564–3572 
[39] Dreyfus G., Williams, A. W., Kawagishi, I., & Macnab, R. M. (1993) Genetic and biochemical analysis of Salmonella Typhimurium FliL a flagellar protein related to the catalytic subunit of the F0F1 ATPase and to virulence proteins of mammalian and plant pathogens Journal of Bacteriology, 175(10), 3131–3138 
[40] Fan F. & Macnab, R.M. (1996) Enzymatic characterization of FliI: an ATPase involved in flagellar assembly in Salmonella typhimurium. J Biol Chem 271: 31981–31988 
[41] Minamino T,(2014) Protein export through the bacterial flagellar type III export pathway 1843(8):1642-8 
[42] Bai F., Morimoto YV., Yoshimura SDJ., Hara N., Kami-jke N., Namba K., Minamino T., (2014) Assembly dynamics and the roles of FliI ATPase of the bacterial flagellar export apparatus, Nature 
[43] G.M. Fraser, J.C.Q. Bennett, C. HughesSubstrate-specific binding of hook­associated proteins by FlgN and FliT, putative chaperones for flagellum assembly Mol. Microbiol., 32 (1999), pp. 569-580 
[44] F. Auvray, J. Thomas, G.M. Fraser, C. HughesFlagellin polymerisation control by a cytosolic export chaperone J. Mol. Biol., 308 (2001), pp. 221-229 
[45] P. Aldridge, J.E. Karlinsey, K.T. Hughes (2003)The type III secretion chaperone FlgN regulates flagellar assembly via a negative feedback loop containing its chaperone substrates FlgK and FlgLMol. Microbiol., 49 (pp. 1333-1345 
[46] J. Thomas, G.P. Stafford, C. HughesDocking of cytosolic chaperone–substrate complexes at the membrane ATPase during flagellar type III protein exportProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 101 (2004), pp. 3945-3950 
[47] 
Kinoshita, M., Hara, N., Imada, K., Namba, 

K. 
and Minamino, T. (2013), Interactions of bacterial flagellar chaperone–substrate complexes with FlhA contribute to co-ordinating assembly of the flagellar filament. Molecular Microbiology, 90: 1249–1261. doi:10.1111/mmi.12430 


[48] Bennett J.C., Hughes C. (2000) From flagellum assembly to virulence: The extended family of type III export chaperones. Trends Microbiol. 8:202–204. 
[49] Hirano T, Yamaguchi S, Oosawa K. et al. Roles of FliK and FlhB in determination of flagellar hook length in Salmonella typhimurium. J Bacteriol. 1994;176:5439–5449 
[50] Simon, Y., Curtis, B., Deumic, V., Nicki, J., Tennant SM., Pasetti, MF., Lees, A., Wills PW., Chacon M., Levine MM. (2014). A scalable method for biochemical purification of Salmonella flagellin. Protein Expr Purif 201: 1-7 
[51] Ikeda, T., Oosawa, K., Yamaguchi, S. & Hotani, H. (1996). Self-assembly of the Filament Capping protein FliD of Bacterial Flagella into an Annular Structure. J. Mol. Biol. 259, 679-686. 
[52] Samatey, Fadel A; Imada, Katsumi; Nagashima, Shigehiro; Vonderviszt, Ferenc; et al. Nature; London 410.6826 (Mar 15, 2001): 331-7 
[53] Calladine, C. R., Luisi, B. F., & Pratap, J. V. (2013). A “Mechanistic” Explanation of the Multiple Helical Forms Adopted by Bacterial Flagellar Filaments. Journal of Molecular Biology, 425(5), 914–928. 
[54] Kanto, S., Okino, H., Aizawa, S.-I., and Yamaguchi, S. (1991). Amino acids responsible for flagellar shape are distributed in terminal regions of flagellin. J. Mol. Biol. 219, 471–480. 
[55] McQuiston JR, Parrenas R, Ortiz-Rivera M, Gheesling L, Brenner F, Fields PI. 2004. Sequencing and comparative analysis of flagellin genes fliC, fljB, and flpA from Salmonella. J. Clin. Microbiol. 42:1923–1932 
[56] Bonifield, H. R., & Hughes, K. T. (2003). Flagellar Phase Variation in Salmonella enterica Is Mediated by a Posttranscriptional Control Mechanism. Journal of Bacteriology, 185(12), 3567–3574 
[57] Ikeda, J. S., Schmitt, C. K., Darnell, S. C., Watson, P. R., Bispham, J., Wallis, T. S., … O’Brien, A. D. (2001). Flagellar Phase Variation of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Contributes to Virulence in the Murine Typhoid Infection Model but Does Not Influence Salmonella-Induced Enteropathogenesis. Infection and Immunity, 69(5), 3021–3030 
[58] Mimori, Y., Yamashita, I., Murata, K., Fujiyoshi, Y., Yonekura, K., Toyoshima, C., and Namba, K. (1995). The structure of the R-type straight flagellar filament of Salmonella at 9 A ° resolution by electron cryomicroscopy. J. Mol. Biol. 249, 69–87. 
[59] Trachtenberg S., and DeRosier, D. J. (1987). Three-dimensional structure of the frozenhydrated flagellar filament: The left­handed filament of Salmonella typhimurium. J. Mol Biol 195, 581-601 
[60] Toke, O., & Vonderviszt, F. (2016). Amphipathic helical ordering of the flagellar secretion signal of Salmonella flagellin. Biochemical and Biophysical Research Communications 
[61] Yonekura K, Maki-Yonekura S, Namba K (2003) Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy. Nature. 424(6949):643-50. 
[62] Hirano T, Minamino T, Namba K, and Macnab RM. (2003) Substrate Specificity Classes and the Recognition Signal for Salmonella Type III Flagellar Export J. Bacteriol. 185:8 2485-2492; 
[63] Singer, H. M., Erhardt, M. and Hughes, K. T. (2014), Comparative analysis of the secretion capability of early and late flagellar type III secretion substrates. Molecular Microbiology, 93: 505–520. doi:10.1111/mmi.12675 
[64] Vegh BM, Dobo GJ, Zavodszky P, Vondervisazt F. (2006). Localization of the flagellum-specific secretion signal in Salmonella flagellin. Biochem Biophys Res Commun. 345(1):93-8 
[65] Weber-Sparenberg C. Poplau P. Brookman H (2006) Characterization of the type III export signal of the flagellar hook scaffolding protein FlgD of Escherichia coliArchives of Microbiology 186(4):307 
[66] Guo, S., Alshamy, I., Hughes, K. T., & Chevance, F. F. V. (2014). Analysis of Factors That Affect FlgM-Dependent Type III Secretion for Protein Purification with Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology, 196(13), 2333–2347 
[67] Cheng, L.W and Schneewind, O.. 2000 Type III machines of Gram-negative bacteria (delivering the goods) . Trends Microbiol 8: 214–220 
[68] Blair DF. (2003) Flagellar movement driven by proton tranlocation, FEBS Letters 545: 86-95, edited by Trumpower 
[69] Segall, J. E.. Manson, M. D., and Berg, H. C. (1982). Signal processing times in bacterial chemotaxis. Nature 296, 855-857. 
[70] Bray, D., Levin, MD., Lipkow, K., (2007) The chemotactic behaviour of computer-based surrogate bacteria. Curr.Biol. 17, 12-19 
[71] Walker SL. Sojka M. Dibb-Fuller M. Woodward M (1999) Effect of pH, temperature and surface contact on the elaboration of fimbriae ad flagella by Salmonella serotype Enteridis. J. Med. Microbiol. 48,253-261 
[72] Yokota, T., & Gots, J. S. (1970). Requirement of Adenosine 3', 5'-Cyclic Phosphate for Flagella Formation in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology, 103(2), 513–516. 
[73] Chilcott, G. S., & Hughes, K. T. (2000). Coupling of Flagellar Gene Expression to Flagellar Assembly in Salmonella enterica Serovar Typhimurium and Escherichia coli. Microbiology and Molecular Biology Reviews, [64(4), 694–708. 
[74] Partridge, J. D., & Harshey, R. M. (2013). More than Motility: Salmonella Flagella Contribute to Overriding Friction and Facilitating Colony Hydration during Swarming. Journal of Bacteriology, 195(5), 919–929 
[75] Li C. Shi W. Louise CJ. Adler J (1993). Mechanism of adverse conditions causing lack of flagella=a in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175(8):2236-40 
[76] Soutourina OA, Karin E, Laurent-Winter C, Hommais F, Danchin A, Bertin P.N(2002) Regulation of bacterial motility in response to low pH in Escherichia coli: the role of H-NS protein. Microbiology148, 1543–1551 
[77] AdlerJTempletonB(1967) The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 46, 175–184. 
[78] LandiniPZehnderA.J(2002) The global regulatory hns gene negatively affects adhesion to solid surfaces by anaerobically grown Escherichia coli by modulating expression of flagellar genes and lipopolysaccharide production. J. Bacteriol .184, 1522–1529 
[79] Salah Ud-Din, AIM 2017, '' Cellular and Molecular Life Sciences. 
[80] Bi S, Lai L (2015) Bacterial chemoreceptors and chemoeffec-tors. Cell Mol Life Sci 72:691–708 
[81] Lazova, M. D., Butler, M. T., Shimizu, T. S., & Harshey, R. M. (2012). Salmonella chemoreceptors McpB and McpC mediate a repellent response to L-cystine: a potential mechanism to avoid oxidative conditions. Molecular Microbiology, 84(4), 697–711 
[82] Frye, J., Karlinsey, J.E., Felise, H.R., Marzolf, B., Dowidar, N., McClelland, M., Hughes, K.T. (2006) Identyfication of new flagellar genes of Salmonella eterica serovar Typhimurium J.Bacteriol. 188, 2233-2243 
[83] Sourjik, V., & Wingreen, N. S. (2012). Responding to Chemical Gradients: Bacterial Chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology, 24(2), 262–268. 
[84] Parkinson JS, Hazelbauer GL, Falke JJ (2015) Signaling and sensory adaptation in Escherichia colichemoreceptors: 2015 update. Trends Microbiol 23:257–266 
[85] Kutsukake K, Ohya Y, Iino T. 1990. Transcriptional analysis of the flagellar regulon of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 172:741–747. 
[86] Wada T, Tanabe Y, Kutsukake K (2011) FliZ acts as a repressor of the ydiV gene, which encodes an anti-FlhD4C2 factor of the flagellar regulon in Salmonella enterica serovar typhimurium. J Bacteriol. 193(19):5191-8. 
[87] Gillen KL, Hughes KT (1991) Molecular characterization of flgM, a gene encoding a negative regulator of flagellin synthesis in Salmonella typhimurium. J Bacteriol. 1991 173(20):6453-9. 
[88] Iyoda S, Kutsukake K (1995) Molecular dissection of the flagellum-specific anti-sigma factor, FlgM, of Salmonella typhimurium.Mol Gen Genet. 249(4):417-24. 
[89] Liu X, Matsumura P. 1994. The FlhD/FlhC complex, a transcriptional activator of the Escherichia coli flagellar class II operons. J. Bacteriol. 176:7345–7351 
[90] Ohnishi K, Kutsukake K, Suzuki H, Lino T. 1992. A novel transcriptional regulation mechanism in the flagellar regulon of Salmonella typhimurium: an antisigma factor inhibits the activity of the flagellum-specific sigma factor, sigma F. Mol. Microbiol. 6:3149–3157. 
[91] Hughes KT, Gillen KL, Semon MJ, Karlinsey JE (1993)Sensing structural intermediates in bacterial flagellar assembly by export of a negative regulator. Science. 262(5137):1277­80. 
[92] Karlinsey JE, Tsui HC, Winkler ME, Hughes KT (1998) Flk couples flgM translation to flagellar ring assembly in Salmonella typhimurium. J Bacteriol. 180(20):5384-97. 
[93] 
Chadsey, M. S., Karlinsey, J. E., & Hughes, K. 

T. 
(1998). The flagellar anti-. factor FlgM actively dissociates Salmonella typhimurium .28 RNA polymerase holoenzyme. Genes & Development, 12(19), 3123–3136 


[94] Daughdrill GW, Chadsey MS, Karlinsey JE, Hughes KT, Dahlquist FW. 1997. The C-terminal half of the anti-sigma factor, FlgM, becomes structured when bound to its target, sigma 28. Nat. Struct. Biol. 4:285–291 
[95] Yokoseki T, Iino T, Kutsukake K. 1996. Negative regulation by fliD, fliS, and fliT of the export of the flagellum-specific anti-sigma factor, FlgM, in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 178:899–901 
[96] Aldridge PD, Karlinsey JE, Aldridge C, Birchall C, Thompson D, Yagasaki J, Hughes KT. 2006. The flagellar-specific transcription factor, sigma28, is the type III secretion chaperone for the flagellar-specific anti-sigma28 factor FlgM. Genes Dev. 20:2315–2326 
[97] Xu S, Peng Z, Cui B, Wang T, Song Y, Zhang L, Wei G, Wang Y, Shen X.2013. FliS modulates FlgM activity by acting as a non-canonical chaperone to control late flagellar gene expression, motility and biofilm formation in Yersinia pseudotuberculosis. Environ. Microbio 
[98] Saini S, Koirala S, Floess E, Mears PJ, Chemla YR, Golding I, Aldridge C, Aldridge PD, Rao CV (2010) FliZ induces a kinetic switch in flagellar gene expression J Bacteriol. 192(24):6477-81 
[99] Saini S, Brown JD, Aldridge PD, Rao CV. ( 2008) FliZ Is a posttranslational activator of FlhD4C2-dependent flagellar gene expression. J BacteriolJul; 190(14):4979-88. 
[100] Wada T, Morizane T, Abo T, Tominaga A, Inoue-Tanaka K, Kutsukake K (2011) EAL domain protein YdiV acts as an anti-FlhD4C2 factor responsible for nutritional control of the flagellar regulon in Salmonella enterica Serovar Typhimurium. J Bacteriol.193(7):1600-11. 
[101] Liu, X. and Matsumura, P. (1996), Differential regulation of multiple overlapping promoters in flagellar class II operons in Escherichia coli. Molecular Microbiology, 21: 613–620 
[102] Yamamoto S, Kutsukake K (2006) FliT acts as an anti-FlhD2C2 factor in the transcriptional control of the flagellar regulon in Salmonella enterica serovar typhimurium. J Bacteriol. 188(18):6703-8. 
[103] Aldridge C, Poonchareon K, Saini S, Ewen T, Soloyva A, Rao CV, Imada K, Minamino T, Aldridge PD (2010) The interaction dynamics of a negative feedback loop regulates flagellar number in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Mol Microbiol. 2010 Dec; 78(6):1416-30. 
[104] McCarthy EF (2006) The toxins of William B Coley and the treatment of bone and soft-tissue sarcomas. Iowa Orthop J 26: 154–148. 
[105] Green PN, Hoption Cann SA (2007) Bacterial anti-cancer vaccines: a science frozen in time. Microbiologist 8: 29–34. 
[106] Dang LH, Bettegowda C, Huso DL, Kinzler KW, Vogelstein B (2001) Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors. Proc Natl Acad Sci USA 98: 15155–15160 
[107] Toley BJ, Forbes NS (2012) Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integr Biol (Camb) 4: 165–176. 
[108] Guidance for Industry: Early Clinical Trials with Live Biotherapeutic Products, US Food and Drug Administration, 2012; Environmental Risk Assessments for Medicinal Products containing, or consisting of, Genetically Modified Organisms, European Medicines Agency, 2007 
[109] Brodway KM., Denson EAP., Jensen RV., Scharf BE., 2015 Rescuing chemotaxis of the anticancer agent Salmonella eterica serovar Typhimurium VNP20009 Journal of Biotechnology 211, 117-120 
[110] Terashima, H., Kojima, S., Homma, M., 2008. Flagellar motility in bacteria structure and function of flagellar motor. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 39–85. 
[111] Morimoto, Y.V., Minamino, T., 2014. Structure and function of the bi-directional bacterial flagellar motor. Biomolecules 4, 217–234. 
[112] Volz, K., Matsumura, P., 1991. Crystal structure of Escherichia coli CheY refined at 1.7­A resolution. J. Biol. Chem. 266, 15511–15519 
[113] Brodway KM. Modise T. Jensen RV. Scharf BE (2014) Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009, a strain engineered for tumor targeting. J. Biotechnol 192, 177-8 
[114] Dobó, J., Varga, J., Sajó, R., Végh, B. M., Gál, P., Závodszky, P., & Vonderviszt, F. (2010). Application of a Short, Disordered N-Terminal Flagellin Segment, a Fully Functional Flagellar Type III Export Signal, to Expression of Secreted Proteins . Applied and Environmental Microbiology, 76(3), 891–899. 
[115] Allen-Vercoe E. Woodward, M.J. (1999) The role of flagella, but not fimbriae, in the adherence of Salmonella enterica serotype Enteritidis to chick gut explant. J. Med. Microbiol 48, 771-780 
[116] Allen-Vercoe E. Sayers, A.R., Woodward, 
M.J. (1999) Virulence of Salmonella enterica serotype Enteritidis aflagellate and afimbriate mutants in a day-old chickmodel. Epidemiol. Infect. 122, 395-402 
[117] Elhadad D, Desai P, Rahav G, McClelland M, Gal-Mor O. 2015. Flagellin is required for host cell invasion and normal Salmonella pathogenicity island 1 expression by Salmonella enterica serovar Paratyphi A. Infect Immun 83:3355–3368. 
[118] Khoramian-Falsafi T, Harayama S, Kutsukake K, Pechere JC. (1990) Effect of motility and chemotaxis on the invasion of Salmonella typhimurium into HeLa cells. Microb Pathog;9(1):47–53. 
[119] Sauer, M. M., Jakob, R. P., Eras, J., Baday, S., Eriş, D., Navarra, G., … Glockshuber, R. (2016). Catch-bond mechanism of the bacterial adhesin FimH. Nature Communications, 7, 10738. http://doi.org/10.1038/ncomms10738 
[120] Olsen JE, Hoegh-Andersen KH, Casadesús J, Rosenkranzt J, Chadfield MS, Thomsen LE BMC Microbiol. 2013 Mar 25; 13():67. 
[121] Jones, B. D., Lee, C. A., & Falkow, S. (1992). Invasion by Salmonella typhimurium is affected by the direction of flagellar rotation. Infection and Immunity, 60(6), 2475–2480. 
[122] Kim M, Lim S, Kim S, Choy HE, Sangryeol A (2009) tdcA Mutation Reduces the Invasive Ability of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Ryu Mol. Cells 28(4): 389~395 
[123] Lucas, R. L., Lostroh, C. P., DiRusso, C. C., Spector, M. P., Wanner, B. L., & Lee, C. A. (2000). Multiple Factors Independently Regulate hilA and Invasion Gene Expression in Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology, 182(7), 1872–1882. 
[124] Ikebe T, Iyoda S, Kutsukake K. Structure and expression of the fliA operon of Salmonella typhimurium. Microbiology. 1999;145:1389–1396 
[125] Zhou M. Duan Q. Li Y. Yang Y. Hardwidge PR. Zhu G (2015) Membrane cholesterol plays an important role in enteropathogen adhesion and the activation of innate immunity via flagellin­TLR5 signaling. Arch Microbiol 197(6):797-803 
[126] Crawford RW, Reeve KE, Gunn JS J Bacteriol. 2010 Jun; 192(12):2981-90. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. 
[127] Low KB, Ittensohn M, Luo X, Zheng LM, King I, Pawelek JM, Bermudes D (2004) Construction of VNP20009: a novel, genetically stable antibiotic-sensitive strain of tumor-targeting Salmonella for parental administration in humans. Methods Mol Med 90: 47–60. 
[128] Toso JF, Gill VJ, Hwu P, Marincola FM, Restifo NP, Schwartzentruber DJ (2002) Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol 20:142–152 
[129] Coutermarsh-Ott, S. L., Broadway, K. M., Scharf, B. E., & Allen, I. C. (2017). Effect of Salmonella enterica serovar Typhimurium VNP20009 and VNP20009 with restored chemotaxis on 4T1 mouse mammary carcinoma progression. Oncotarget, 8(20), 33601–33613. http://doi.org/10.18632/oncotarget.16830 
[130] Zheng JH, Nguyen VH, Jiang SN, Park SH, Wan W, Hong SH, Shin MG, Chung IJ, Hong Y, Bom HS, Choy HE, Lee SE, Rhee JH, Min JJ (2017) Two-step enhanced cancer immunotherapy with engineered Salmonella Typhimurium secreting heterologous flagellin. 
Sci Transl Med. 9(356) 
[131] 
Galeva, A., Moroz, N., Yoon, Y.-H., Hughes, 

K. 
T., Samatey, F. A., & Kostyukova, A. S. (2014). Bacterial Flagellin-Specific Chaperone FliS Interacts with Anti-Sigma Factor FlgM. Journal of Bacteriology, 196(6), 1215–1221. http://doi.org/10.1128/JB.01278-13 


[132] Guo, S., Alshamy, I., Hughes, K. T., & Chevance, F. F. V. (2014). Analysis of Factors That Affect FlgM-Dependent Type III Secretion for Protein Purification with Salmonella enterica Serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology, 196(13), 2333–2347. http://doi.org/10.1128/JB.01572-14 
[133] Erhardt, M., & Dersch, P. (2015). Regulatory principles governing Salmonella and Yersinia virulence. Frontiers in Microbiology, 6, 949. http://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00949