Uniwersytet Jagielloński 
Wydział Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej 

ROZPRAWA DOKTORSKA 
Oddziaływanie digitoniny z 
cholesterolem błony komórkowej – 
badania fizykochemiczne i 
modelowanie teoretyczne 

Autor: 
Maria Janikowska-Sagan 

Promotor: dr hab. Beata Korchowiec, prof UJ 
Kraków, wrzesień 2019 

Wydział Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej Uniwersytet Jagielloński 
Oświadczenie 
Ja niżej podpisana Maria Janikowska-Sagan (nr indeksu: 1029816) doktorantka Wydziału Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej Uniwersytetu Jagiellońskiego oświadczam, że przedłożona przeze mnie praca doktorska pt. „Oddziaływanie digitoniny z cholesterolem błony komórkowej – badania fizykochemiczne i modelowanie teoretyczne” przedstawia wyniki badań wykonanych przeze mnie osobiście, pod kierunkiem dr hab. Beaty Korchowiec. Pracę napisałam samodzielnie. 
Oświadczam, że moja praca dyplomowa została opracowana zgodnie z Ustawą o prawie autorskim i prawach pokrewnych z dnia 4 lutego 1994 r. (Dziennik Ustaw 1994 nr 24 poz. 83 wraz z późniejszymi zmianami). 
Jestem świadoma, że niezgodność niniejszego oświadczenia z prawdą ujawniona w dowolnym czasie, niezależnie od skutków prawnych wynikających z ww. ustawy, może spowodować unie-ważnienie tytułu nabytego na podstawie tej pracy. 
Kraków, dnia .............. ............................... podpis autora 
Praca powstała we współpracy z prof. Marie-Paule Mingeot-Leclercq z Louvain Drug 
Research Institute na Université Catholique de Louvain w Louvain-la-Neuve w Belgii. 

Praca doktorska została wykonana z wykorzystaniem Infrastruktury PL-Grid. 
Niniejszym chciałabym podziękować mojej Promotorce Pani dr hab. Beacie Korchowiec za opiekę i cenne wskazówki w pisaniu pracy. 
Dziękuję Panu prof. dr hab. Jackowi Korchowiec 
Za opiekę naukową, życzliwość, cenne wskazówki 
i poświęcony czas podczas studiów doktoranckich. 

Serdecznie dziękuję prof. Marie-Paule Mingeot-Leclercq za możliwość odbycia stażu w laboratorium na Université Catholique de Louvain w Louvain-la-Neuve w Belgii. 
Serdecznie dziękuję dr Annie Stachowicz-Kuśnierz za owocne dyskusje naukowe, dzielenie się swoją wiedzą i doświadczeniem z zakresu modelowania molekularnego. 
Serdecznie dziękuję Sandrine Verstraeten i kolegom z zespołu na UCL w Belgii za miłą atomosferę, nieocenioną pomoc udzieloną mi w trakcie mojego pobytu w Belgii. 
Serdecznie dziękuję doktorantom z Zakładu Chemii Teoretycznej na Wydziale Chemii za wspaniałą atmosferę pracy i wszelką pomoc. 
Serdecznie dziękuję mgr Sonii Trojan i mgr Katarzynie Pustule za wszelką pomoc i przyjaźń. 
Mojemu mężowi Filipowi, mojemu bratu Adamowi i mojej rodzinie za wszystko. 

Spis treści 

1 Wprowadzenie i cel pracy 3 
2 Część literaturowa 5 
2.1 Błonakomórkowa................................. 5 

2.2 Lipidy ....................................... 7 

2.2.1 Fosfolipidy................................. 7 

2.2.2 Sfingolipidy ................................ 8 

2.2.3 Sterole................................... 9 

2.2.4 Kwasytłuszczowe............................. 10 

2.3 Modelebłony ................................... 11 

2.3.1 MonowarstwyLangmuira......................... 11 

2.3.2 Liposomy ................................. 18 

2.3.3 Modelowanie in silico ........................... 24 

2.4 Saponiny...................................... 34 

2.4.1 Digitonina................................. 35 

2.4.2 Diosgenina................................. 39 

2.4.3 GinsenozydRh2.............................. 40 


3 Materiał badawczy i metody 42 
3.1 Materiały ..................................... 42 

3.2 Metody ...................................... 43 

3.2.1 MonowarstwyLangmuira......................... 43 

3.2.2 Liposomy ................................. 44 

3.2.3 Mikroskopiafluorescencyjna ....................... 45 

3.2.4 Statyczne obliczenia kwantowo-chemiczne . . . . . . . . . . . . . . . . 47 
3.2.5 Klasycznadynamikamolekularna .................... 47 



4 Wyniki pomiarów 49 
4.1 Przygotowaniedynamiki ............................. 49 

4.2 Oddziaływaniemonowarstwzdigitoniną . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 
4.2.1 Izotermy ciśnienia powierzchniowego Π − A .............. 51 

4.2.2 ModelowanieMD............................. 54 

4.2.3 Porównanie ................................ 65 

4.3 Pomiaryprzystałejpowierzchni......................... 67 

4.3.1 Izotermyadsorpcji ............................ 68 

4.3.2 Modelowanie MD -układ cholesterol -digitonina . . . . . . . . . . . 69 
4.3.3 Porównanie parametrów monowarstw cholesterolu i dosgeniny, dyskusja 77 
4.4 LiposomyLUV .................................. 78 

4.5 Badaniamikroskopowe-GUV.......................... 82 

4.6 Oddziaływaniedigitoninyzlipidami....................... 85 


4.6.1 Oddziaływanie digitoniny z monowarstwą POPC/SM . . . . . . . . . 86 
4.6.2 Oddziaływanie digitoniny z monowarstwą POPC/SM/CHOL . . . . . 94 
4.6.3 Porównanie ................................ 103 

5 Wnioski 105 
6 Bibliografia 106 
7 Streszczenie rozprawy doktorskiej 118 
8 Spis publikacji i wystąpień konferencyjnych 120 




Wykaz ważniejszych skrótów i oznaczeń stosowanych w pracy 
A średnie pole powierzchni cząsteczki w monowarstwie Acoll średnie pole powierzchni cząsteczki w punkcie załamania monowarstwy A12 średnie pole powierzchni zajmowane przez cząsteczkę w monowarstwie mieszanej ATP adenozynotrifosforan BCP punkt krytyczny wiązania (ang. bond critical point) CHOL cholesterol Cs−1 współczynnik ściśliwości monowarstwy Cs−1 maksymalna wartość współczynnika ściśliwości 
max 
DFT teoria funkcjonału gęstości (ang. density functional theory) DIG digitonina DIOS diosgenina DLS dynamiczne rozpraszanie światła (ang. dynamic light scattering) DMF dimetyloformamid DMSO dimetylosulfotlenek DNA kwas deoksyrybonukleinowy ePC fosfatydylocholina z jaja kurzego GPI glikofosfatydyloinozytol GUV olbrzymie jednowarstwowe liposomy kb stała Boltzmana 
1 

L długość łańcuchów kwasów tłuszczowych LC faza ciekła skondensowana monowarstwy LE faza ciekła rozprężona monowarstwy LUV duże jednowarstwowe liposomy NBD-DHPE dipalmitynofosfatydyloetanolamino-N-(nitrobenzoksadiazyl) pN ciśnienie normalne POPC palmitynooleinofosfatydylocholina QTAIM kwantowa teoria atomów w cząsteczkach RDF radialna funkcja rozkładu Rho-DOPE dioleoinofosfatydyloetanolamina rodaminy S faza stała monowarstwy Smol parametr uporządkowania łańcuchów lipidowych SM sfingomielina SOPC stearynooleinofosfatydylocholina SUV małe jednowarstwowe liposomy T temperatura t czas U parametr upakowania V objętość części hydrofobowej cząsteczki X ułamek molowy γ napięcie powierzchniowe c0 przenikalność dielektryczna próżni θ kąt odchylenia od normalnej monowarstwy λ długość fali Π ciśnienie powierzchniowe Πcoll ciśnienie powierzchniowe w punkcie załamania monowarstwy 

Wprowadzenie i cel pracy 
Saponiny są wtórnymi metabolitami roślinnymi, posiadającymi ogromne znaczenie biologiczne [1]. Charakteryzują się działaniem antyzapalnym, antywirusowym, a także antybakteryjnym [1, 2, 3]. Ponadto są używane w terapii nowotwórów gdyż wykazują aktywność cytotoksyczną i cytostatyczną w kierunku komórek nowotworowych [4]. Wiadomym jest, że saponiny oddziałują z błonami komórkowymi bogatymi w cząsteczki cholesterolu, podczas gdy ich efekt jest znacznie mniejszy gdy błona pozbawiona jest sterolu. Digitonina, steroidowa saponina, jest często kojarzona z jej właściwościami litycznymi w stosunku do erytrocytów [5, 6]. Wiadomo, że digitonina ma znacznie większe powinowactwo do steroli niż do pozostałych lipidów występujących w natywnej błonie komórkowej, jednakże szczegółowy mechanizm molekularny oddziaływania między cząsteczkami sterolu, a digitoniny nie został jak dotąd szczegółowo opisany. Interesujące jest czy cząsteczki oddziałują tylko na zasadzie oddziaływań fizycznych: oddziaływań van der Waalsa, oddziaływań krótkiego i dalekiego zasięgu; czy jest to oddziaływanie typu chemicznego, jak na przykład wytwarzanie kompleksu czy wiązań chemicznych między cząsteczkami cholesterolu i digitoniny. Ponadto w literaturze można znaleźć dwa podejścia do sposobu działania digitoniny na błonę komórkową. Pierwsze znacznie bardziej rozpowszechnione głosi, iż digitonina wiążąc się z cholesterolem błonowym tworzy addukt, bądź kompleks, który jest usuwany z błony, tym samym zwiększając płynność membrany co czyni ją bardziej podatną na uszkodzenia [7, 8]. Drugie podejście głosi iż digitonina penetrując błonę wiąże się także z cholesterolem, ale nie wyciąga go z błony [9, 10]. Natomiast w membranie tworzone są sferyczne micele lub sztywne tubularne struktury składające się głównie z cholesterolu i digitoniny [9]. Wybrano dwa rodzaje badań do charakterystyki oddziaływań międzycząsteczkowych, metody eksperymentalne i teoretyczne. Eksperymenty zostaną wykonane przy użyciu techniki monowarstw Langmuira, która jest doskonałą metodą służącą do badania oddziaływań międzycząsteczkowych, oraz badania liposomów, które są dwuwarstwowymi modelami błony biologicznej o ściśle określonym składzie. Ponadto eksperymenty zostaną uzupełnione modelowaniem in silico metodami klasycznej dynamiki molekularnej (MD), a także metodami chemii kwantowej pozwalającej na dokładne zbadanie oddziaływania między cząsteczkami zarówno w modelowej monowarstwie, jak i między dimerami cholesterol -digitonina. Celem pracy jest zbadanie oddziaływań fizykochemicznych między cholesterolem, a digito
3 

niną, a następnie porównanie tych interakcji z oddziaływaniem digitoniny z innymi składnikami błony, fosfatydylocholiną oraz sfingomieliną. Na początku zostanie podjęta próba określenia roli łańcucha alifatycznego cholesterolu w interakcji z digitoniną. W tym celu zostaną przeprowadzone badania eksperymentalne i teoretyczne monowarstwy cholesterolu i diosgeniny, cząsteczki różniącej się od cholesterolu tym, że w miejsce łańcucha alifatycznego cholesterolu, diosgenina posiada dwie reszty cukrowe: furanozę i piranozę. Następnie zostanie przeprowadzona analiza oddziaływań fizycznych i chemicznych występujących między oddziałującymi cząsteczkami dimeru cholesterol -digitonina i układu porównawczego diosgenina -digitonina. W tym celu z końcowej klatki symulacji MD monowarstwy cholesterolu bądź diosgeniny zostaną „wycięte” oddziałujące cząsteczki cholesterolu i digitoniny lub odpowiednio diosgeniny i digitoniny, a następnie zostaną one poddane badaniom przy użyciu metod chemii kwantowej. Następnie zostaną przeprowadzone badania eksperymentalne nad wpływem dwóch różnych saponin: digitoniny i ginsenozydu Rh2 na modelowe błony biologiczne. W niniejszych badaniach zostaną wykorzystane duże i olbrzymie jednowarstwowe liposomy, utworzone z równomolowych mieszanin fosfatydylocholiny (ePC) i sfingomieliny (SM) lub ePC, SM i cholesterolu (CHOL). Lipidy zostały tak wybrane gdyż ePC naturalnie tworzy fazę nieuporządkowaną błony (Ld) natomiast SM jest składnikiem bardzo uporządkowanych rejonów membran biologicznych. Ginsenozyd Rh2 został wybrany jako saponina porównawcza gdyż wykazywał on odmienne zachowanie względem komórek nowotworowych niż większość znanych saponin, a konkretnie w badaniach nad komórkami nowotworu piersi jego oddziaływanie z komórkami było słabsze, gdy błony komórkowe były bogate w cholesterol, niż gdy były go pozbawione [11]. Ostatnim elementem badań będzie przeprowadzenie eksperymentów i modelowania in silico monowarstw wieloskładnikowych bardziej przypominających składem natywną błonę komórkową niż monowarstwy zbudowane z samego cholesterolu. Monowarstwy będą składać się z równomolowych mieszanin POPC/SM, jak również POPC/SM/CHOL. Celem pracy będzie zbadanie oddziaływań digitoniny z błoną przypominającą składem błonę komórkową. Ponadto dzięki obliczeniom metodami klasycznej dynamiki molekularnej będzie możliwe zbadanie oddziaływania saponiny z innymi składnikami błony niż cholesterol. Interesujące jest czy digitonina będzie oddziaływała identycznie z cholesterolem wchodzącym w skład modelowej rafty lipidowej, czy to oddziaływanie będzie inne niż dla czystego cholesterolu. 

Część literaturowa 
2.1 Błona komórkowa 
Komórka jest to najmniejsza jednostka strukturalna i funkcjonalna posiadająca zdolność do przeprowadzania wszystkich procesów życiowych. Od środowiska zewnętrznego oddziela ją półprzepuszczalna błona komórkowa zbudowana głównie z lipidów i białek, zachodzą w niej różnorodne procesy, z których najważniejsze to transport materii, wymiana informacji oraz przemiana energii. Biologiczna membrana została opisana w 1972 roku przez amerykańskich cytologów S.J. Singera i G. Nicolsona jako płynna mozaika. Według wspomnianych badaczy najważniejszymi cechami błony są płynność, asymetria, dynamiczność i zdolność do fuzji [12]. Lipidy mają budowę amfifilową, oznacza to, że posiadają część hydrofobową -tak zwany ogon, oraz część hydrofilową -głowę. Taka budowa sprawia, że w środowisku wodnym spontanicznie tworzy się dwuwarstwa lipidowa, gdzie hydrofilowe głowy lipidów zwrócone są na zewnątrz dwuwarstwy, do środowiska wodnego, natomiast hydrofobowe ogony stykają się ze sobą we wnętrzu błony. Ważną cechą błony jest jej półprzepuszczalność dla różnych związków chemicznych. Dwuwarstwa jest przepuszczalna dla tlenu, dwutlenku węgla, azotu, wody, etanolu, glicerolu, mocznika a także amoniaku. Natomiast jony oraz cząsteczki o większej masie cząsteczkowej jak na przykład glukoza, aminokwasy i nukleotydy nie są w stanie spontanicznie dyfundować przez błonę. Dwuwarstwa lipidowa tworząca się spontanicznie w środowisku wodnym tworzy szkielet komórki, do którego przytwierdzone są białka powierzchniowe, natomiast białka integralne penetrują przez błonę i mają kontakt zarówno z cytoplazmą jak i z zewnętrznym otoczeniem komórki, rysunek 2.1. Od wnętrza komórki błona jest podpierana przez cytoszkielet komórkowy, natomiast od zewnątrz jest osłaniana przez tak zwany glikokaliks. Grubość dwuwarstwy lipidowej wynosi około 5nm. W stanie fizjologicznym membrana znajduje się w stanie ciekłokrystalicznym. Płynność błony jest definiowana jako odwrotność lepkości, im większa płynność błony tym szybciej lipidy błonowe mogą się przemieszczać. Lepkość błony zależy od jej składu. Za zwiększanie płynności odpowiadają lipidy nienasycone, natomiast za jej usztywnianie odpowiadają lipidy nasycone, a także cholesterol wypełniający przestrzeń między długimi łańcuchami lipidowymi. Komórka może kontrolować płynność błony zwiększając 
5 

lub zmniejszając udział lipidów nasyconych i nienasyconych oraz cholesterolu [13]. Błona komórkowa jest asymetryczna, znaczy to że wewnętrzna warstwa jest zbudowana z innych lipidów niż warstwa zewnętrzna. Za zróżnicowanie lipidów w błonie plazmatycznej odpowiedzialne są białka zwane flipazami fosfolipidowymi i translokazy aminofosfolipidowe. Pierwsze z nich charakteryzują się niską specyficznością, odpowiadają one za transport cząsteczek fosfatydylocholiny, fosfatydyloseryny i fosfatydyloetanoloaminy. Natomiast translokazy są jednocześnie hydrolazami adenozynotrójfosforanu(ATP). W warunkach fizjologicznych błona plazmatyczna jest asymetryczna, natomiast gdy komórka jest uszkodzona albo znajduje się na szlaku programowanej śmierci komókowej (apoptozy) staje się strukturą o symetrycznym rozmieszczeniu lipidów. W warunkach natywnych glikolipidy, sfingolipidy oraz lipidy, których hydrofilową głowę stanowi fosfatydylocholina znajdują się w większości w zewnętrznej warstwie, natomiast z cytoplazmą kontaktują się lipidy, których głowami hydrofilowymi są fosfatydyloetanoloamina, a także fosfatydyloinozytol. Cholesterol występuje w obu warstwach membrany. Składniki błony mogą się poruszać w obszarze membrany. Najczęstszymi ruchami są ruchy w płaszczyźnie błony, tak zwana dyfuzja lateralna. W błonach biologicznych taka dyfuzja lipidów zachodzi z prędkością 10−14 m/s. Dodatkowo lipidy mogą rotować wokół własnej osi z prędkością 109 obrotów na minutę. Najrzadziej zdarzają się spontaniczne ruchy „flip-flop” czyli przeskakiwanie lipidów między warstwami, takie przemieszczenia lipidów są możliwe dzięki odpowiednim białkom, o których była mowa wcześniej [12]. 

Model płynnej mozaiki zaproponowany przez S.J. Singera i G. Nicolsona zakłada przypadkowe rozmieszczenie lipidów w membranie. Tylko częściowo jest to prawda gdyż błona komórkowa posiada także domeny lipidowe, które są skupiskiem charakterystycznych lipidów i białek. Jedną z najważniejszych funkcji takich domen jest stworzenie optymalnych warunków dla białek pełniących różnorodne funkcje w komórce. Domeny możemy podzielić ze względu 
2.2. LIPIDY 
na rozmiar. Najmniejsze domeny są tworzone przez oddziaływanie cholesterolu z cząsteczkami lipidów: jak na przykład z czterema cząsteczkami sfingomieliny, dwoma cząsteczkami fosfatydylocholiny lub jedną cząsteczką fosfatydyloetanoloaminy. Są to domeny najmniej trwałe. Mikrodomeny o wielkości około 100 nm są wzbogacone w cząsteczki cholesterolu. Do tych domen ściągane są białka z kotwicą zbudowaną z glikofosfatydyloinozytolu (GPI), glikosfingolipidy oraz białka biorące udział w przekazywaniu informacji [13]. Mikrodomeny mogą się ze sobą łączyć w większe skupiska lipidowe. Głównymi składnikami takich domen są: cholesterol, sfingomielina, glikosfingolipidy oraz fosfatydyloinozytolobisfosforan. Domeny o wielkości co najmniej 500 nm są stabilizowane przez cytoszkielet wewnątrzkomórkowy [12, 14]. Niektóre lipidy w dwuwarstwie oprócz klasycznej dwuwarstwy mogą tworzyć także odwrócone micele i odwróconą fazę heksagonalną. Wymienione struktury są tworzone przez komórkę w celu ułatwienia fuzji pęcherzyków pochodzących z innych organelli komórkowych do błony plazmatycznej. Pęcherzyki mogą pochodzić z aparatu Golgiego gdzie są wytwarzane i funkcjonalizowane cząsteczki lipidów [12, 13]. W następnym rozdziale zostaną omówione główne klasy lipidów występujących w komórkach zwierzęcych. 

2.2 Lipidy 
Lipidy tworzą „plastyczny stelaż” komórki. Tworzą one odpowiednie warunki dla białek pełniących rozmaite funkcje w błonie, a także stanowią barierę oddzielającą środowisko zewnętrzne od wewnętrznego (komórkowego). Jednym z wielu stosowanych podziałów lipidów jest podział ze względu na budowę głowy hydrofilowej [13]. 
2.2.1 Fosfolipidy 
Fosfolipidy stanowią najliczniejszą grupę lipidów występującą w błonie komórkowej. Powstają na skutek estryfikacji glicerolu pochodnymi kwasu fosforowego przy atomie węgla C3. Natomiast atomy węgla C1 i C2 połączone są wiązaniami estrowymi z łańcuchem acylowym kwasów tłuszczowych. Hydrofilowa głowa połączona jest wiązaniem estrowym z resztą fosforanową, która z kolei łączy się z jedną z reszt (w nawiasach wypisano nazwy głów hydrofilowych po połączeniu z grupą fosforanową): 
• 
atomem wodoru (kwas fosfatydowy) 

• 
choliną (fosfatydylocholina) 

• 
inozytolem (fosfatydyloinozytol) 

• 
etanoloaminą (fosfatydyloetanoloamina) 

• 
seryną (fosfatydyloseryna) 


• glicerolem (fosfatydyloglicerol). 
W warunkach obojętnego pH grupa fosforanowa jest zjonizowana i posiada ładunek ujemny. Wypadkowy ładunek hydrofilowej głowy zależy zatem od reszty dołączonej do grupy fosforanowej. Lipidy o wypadkowym ładunku ujemnym czyli tak zwane fosfolipidy anionowe to: kwas fosfatydowy, fosfatydyloinozytol, fosfatydyloseryna oraz fosfatydyloglicerol. Fosfolipidy neutralne to fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina. 

Hydorfobowy ogon utworzony jest ze specyficznych kwasów tłuszczowych w pozycjach sn-1 i sn-2 odpowiednio przy pierwszym i drugim atomie węgla glicerolu. Zwykle w pozycji sn-1 jest przyłączony nasycony, natomiast w pozycji sn-2 nienasycony kwas tłuszczowy. Na rysunku 
2.2 została przedstawiona cząsteczka palmitynooleinofosfatydylocholiny (POPC). POPC jest najczęstszym lipidem spotykanym w błonach komórkowych [15, 16]. Dzięki swoim nienasyconym wiązaniom odpowiada za płynność membrany. W modelach błon biologocznych jest wykorzystywany jako reprezentant lipidów błonowych, tworzący fazę lipidów nieuporządkowanych (z ang. liquid disordered Ld)[16]. 

2.2.2 Sfingolipidy 
Podstawowym elementem budulcowym sfingolipidów jest ceramid czyli sfingozyna połączona przez wiązanie amidowe z długołańcuchowym kwasem tłuszczowym. Skład kwasu tłuszczowego tak samo jak ilość wiązań podwójnych jest zróżnicowany. Sfingolipidy możemy podzielić ze względu na typ głowy hydrofilowej. Możemy wyróżnić albo fosfosfingolipidy albo glikosfingolipidy. Jeśli chodzi o pierwszą klasę to podstawniki i podział są takie jak w przypadku fosfolipidów. Drugi typ związków to tak zwane cerebrozydy powstałe w wyniku połączenia ceramidów z jedną lub wieloma resztami cukrowymi. Najpowszechniej występującym sfingolipidem jest sfingomielina(SM) należąca do fosfosfingolipidów. Ceramido-1-fosfocholina to inna nazwa sfingomieliny. Powstaje ona przez podstawienie grupy alkoholowej ceramidu poprzez fosfocholinę [13]. Przykładowa budowa sfingomieliny została przedstawiona na rysunku 2.3. Sfingolipidy najobficiej występują w komórkach nerwowych, budując otoczkę mielinową, a tym samym przyśpieszając przekazywanie impulsu elektrycznego na drodze mózg -organ wykonawczy [12]. W komórkach somatycznych sfingomielina wraz z cholesterolem wchodzą 
2.2. LIPIDY 

w skład domen lipidowych, zapewniając odpowiednie środowisko dla białek integralnych. Sfingomielina może być także wykorzystywana przez komórkę jako źródło ceramidów [17]. SM jest ważnym lipidem używanym w modelach błon biologicznych. Najczęściej jest używany razem z cholesterolem do tworzenia modeli raft lipidowych, ale też czasem jest wykorzystywany do modelowania fazy uporządkowanej lipidów (z ang. liquid ordered Lo) [14, 17]. 

2.2.3 Sterole 
Sterole swoją budową bardzo odbiegają od pozostałych lipidów. Podstawą budowy steroli jest pierścień cyklopentanoperhydrofenantrenowy. Sterole występują w królestwie bakterii, roślin oraz zwierząt. W tym ostatnim najbardziej rozpowszechniony jest cholesterol, który stanowi do 30% a do nawet 50% [18] wszystkich lipidów w błonach biologicznych [13]. Cholesterol jest dwudziestosiedmiowęglowym alkoholem, którego formuła C27H46O została zaproponowana w 1888 roku przez F. Reinitzera, rysunek 2.4. 

Występuje zarówno w błonie komórkowej jak i w membranach innych organelli komórkowych. Cholesterol jest zanurzony praktycznie w całości w błonie komórkowej, jedynie grupa hydroksylowa kontaktaktuje się z powierzchnią błony oddziałując z głowami lipidowymi pozostałych lipidów. Jego obecność w błonie prowadzi do usztywnienia membrany i zmniejszenia jej płynności, a w konsekwencji do uporządkowania łańcuchów acylowych lipidów [15, 16, 14, 19]. Cholesterol jest ważnym składnikiem domen lipidowych występujących w komórce. [14]. 
Cholesterol jest bardzo często używany w układach modelowych takich jak monowarstwy Langmuira czy liposomy, jako jeden ze składników błony [14, 20]. Zazwyczaj razem ze sfingomieliną jest jednym z najważniejszych składników modelowych rafty lipidowych [14, 21]. W przypadku badań nad separacją faz wchodzi w skład fazy Lo [22]. Zwykle jego obecność lub brak bardzo zmienia właściwości modelowej membrany [16]. 

2.2.4 Kwasy tłuszczowe 
Kwasy tłuszczowe wystęujące w komórkach najczęściej stanowią część hydrofobową większości lipidów błonowych. W błonie komórkowej występują niewielkie ilości wolnych form kwasów tłuszczowych. Budowa tych związków jest bardzo zróżnicowana, można je podzielić na cząsteczki o łańcuchach nienasyconch lub nasyconych. Długość łańcuchów acylowych wynosi od dwunastu do dwudziestuczterech atomów węgla. Ilość wiązań podwójnych mieści się w granicach przeważnie od jednego do czterech, czasem sześciu [13]. Kwasy tłuszczowe charakterystyczne dla błon biologicznych zostały zebrane w tabeli 2.1. 
Tablica 2.1: Przykłady kwasów tłuszczowych występujących w komórkach eukariotycznych. 
Symbol  Nazwa systematyczna  Nazwa zwyczajowa  
C12:0  n-dodekanowy  laurynowy  
C14:0  n-tetradekanowy  mirystynowy  
C16:0  n-heksadekanowy  palmitynowy  
C18:0  n-oktadekanowy  stearynowy  
C20:0  n-eikozanowy  arachidowy  
C22:0  n-dokozanowy  behenowy  
cis Δ9 C16:1  cis 9-heksadekenowy  palmitooleinowy  
cis Δ9 C18:1  cis 9-oktadekenowy  oleinowy  
cis Δ9,12 C18:2  cis, cis 9, 12-oktadekadienowy  linolowy  
cis Δ9,12,15 C18:3  cis, cis, cis 9, 12, 15-oktadekatrienowy  alfa-linolenowy  
trans Δ9 C18:1  trans 9-oktadekenowy  elaidowy  
cis Δ5,8,11,14 C20:4  cis, cis, cis, cis 5, 8, 11, 14-eikozatetratrienowy  arachidonowy  
cis Δ4,7,10,13,16,19  cis, cis, cis, cis, cis, cis 4,7,10, 13, 16, 19 -dokozahesaenowy  dokozahesaenowy  

W pierwszej i drugiej kolumnie podano długość łańcucha acylowego, a następnie ilość, konformację oraz miejsce występowania wiązań nienasyconych 

2.3. MODELE BŁONY 


2.3 Modele błony 
2.3.1 Monowarstwy Langmuira 
Rys historyczny 
Od starożytności żeglarze nieświadomie wykorzystywali efekt obniżania napięcia powierzchniowego wody, a tym samym uciszali wzburzone wody poprzez wylewanie oliwy przez burtę statku. Jednakże za początek badań nad monowastwami można przyjąć XVIII wiek, kiedy to w 1757 roku Benjamin Franklin wykonał doświadczenie na niespokojnych wodach jeziora Mo-und Pond znajdującego się w Wielkiej Brytanii na terenie parku Clapham Common. Franklin wylał jedną łyżeczkę oliwy z oliwek na powierzchnię jeziora i zaobserwował uciszenie się fal, co zostało zinterpretowane jako rozprzestrzenienie się cząsteczek oliwy po całej powierzchni jeziora. Grubość warstwy filmu powierzchniowego została określona na około 25 Å . Zjawisko obniżania napięcia powierzchniowego wody przez oliwę z oliwek zostało wyjaśnione dopiero przez Lorda Rayleigha w XIX w., który powtórzył eksperyment Franklina w warunkach laboratoryjnych. Zapostulował on, że na powierzchni wody tworzy się monowastwa cząsteczkowa. Niezależnie od badań Lorda Rayleigha, w Niemczech prowadzone były eksperymenty nad monowarstwami znajdującymi się na granicy faz gaz-ciecz. Agnes Pockels w 1891 roku zmierzyła pierwszą izotermę ciśnienia powierzchniowego w funkcji powierzchni przypadającą na pojedynczą cząsteczkę. Do pomiaru zostały użyte bariery powodujące kompresję nierozpuszczalnego w wodzie filmu. Niemiecka badaczka zauważyła, że ciśnienie powierzchniowe ulega niewielkiej zmianie tylko do momentu kiedy na pojedynczą cząsteczkę przypada więcej niż 20 Å2, natomiast gdy kontynuuje się kompresję monowarstwy i cząsteczki osiągają powierzchnię mniejszą niż 20 Å2 ciśnienie powierzchniowe gwałtownie wzrasta. Punkt, w którym ciśnienie powierzchniowe zaczyna gwałtownie rosnąć został nazwany „punktem Pockels” [23, 24]. Kolejną ważną w historii monowarstw postacią był Irving Langmuir, który zainspirowany wcześniejszymi badaniami, opracował metodę do pomiaru monowarstw. Aparatura składała się z wanny połączonej z ruchomymi barierami, takie urządzenia stosowane są do dnia dzisiejszego, a metoda badawcza na cześć twórcy została nazwana metodą Langmuira. Ponadto Langmuir zauważył, że niezależnie od długości łańucha kwasu tłuszczowego, punkt Pockels zawsze wynosi około 20 Å2 i jedynie grubość monowarstwy się zmienia, co pozwoliło mu określić orientację cząsteczek lipidu na powierzchni wody. Zapostulował, że grupy hydrofilowe lipidu są zanurzone w wodzie, natomiast łańcuchy hydrofobowe lipidu sterczą ponad powierzchnię [24]. Przenoszenie monowarstw z powierzchni wody na stały substrat nauka zawdzięcza Katherine Blodgett, która zademonstrowała metodę osadzania monowastw, a także wielowarstw na stałym podłożu, technikę tę nazywa się od nazwisk twórców: Langmuir-Blodgett. Metoda Langmuira szybko stała się popularna ze względu na swoją prostotę. Langmuir i niezależnie Harkins pracowali nad jej rozwojem. Langmuir zdefiniował właściwości cząsteczek tworzących monowarstwy, a także charakteryzował utworzone monowarstwy. Coraz częściej metoda była używana do charakterystyki cząsteczek chemicznych, i ich właściwiości fizykochemicznych. Między innymi badano zwilżalność materiałów, kontrolę parowania wody z rezerwuarów wodnych pokrytych cienkimi warstwami Langmuira [23]. W niedługim czasie monowarstwy Langmuira znalazły także zastosowanie w badaniach biologicznych. Naukowcy zaczęli tworzyć modele błon biologicznych zbudowanych nie tylko z lipidów ale i białek, a także badać oddziaływania błony ze związkami powierzchniowo-czynnymi, takimi jak leki [25], enzymy [26] czy hormony [27]. 

Fizyczne podstawy metody pomiaru ciśnienia powierzchniowego 
W metodzie Langmuira rozpatruje się cząsteczki zanurzone głowami polarnymi w cieczy i ogonami hydrofobowymi stykającymi się z otaczającym je gazem. W praktyce nie występuje ostra granica między dwoma ośrodkami: cieczą i gazem, a także dwoma cieczami, cieczą i ciałem stałym, a także gazem i ciałem stałym. Między fazami występuje stan przejściowy, gdzie cząsteczki z jednej fazy mieszają się z cząsteczkami drugiej fazy. W naszych rozważaniach ograniczymy się do rozważania układu ciecz-gaz. W układzie doświadczalnym nie ma większego znaczenia jaki gaz zastosujemy, argon, powietrze czy nasyconą parę wodną, wyniki pomiarów będą do siebie bardzo zbliżone [28]. Funkcje termodynamiczne na styku faz gaz-ciecz najwygodniej rozważać gdy układ będzie składał się z cieczy i nasyconej pary tej cieczy. Można wtedy zdefiniować dla niego podstawowe funkcje termodynamiczne. W realnych układach zawsze będzie występowała energia nadmiarowa układu (albo ujemna albo dodatnia), energię tę można opisać wzorem: 
dU = T dS + µidni − P dV + γds 
i 
(2.1) 

gdzie U oznacza energię wewnętrzną, T temperaturę, S entropię, µi potencjał chemiczny itego 
składnika, ni liczbę moli itego składnika, P ciśnienie, V objętość, γ napięcie powierzchniowe, 
s powierzchnię. 
Aby obliczyć energię swobodną Helmholtza F należy równanie 2.1, podstawić do wzoru: F 
≡ U-TS, aby otrzymać: 

dF = −SdT + µidni − P dV + γds 
i 
(2.2) 

skąd możemy uzyskać zależność napięcia powierzchniowego wyrażonego jako różniczkę energi swobodnej Helmholtza po powierzchni, przy stałych wartościach temperatury, objętości i liczby cząstek: 
∂F 

γ = 
∂s 
⏐⏐⏐⏐
(2.3) 

T,V,ni 
Energię swobodną Gibbsa G można zdefiniować jako: G ≡ U -TS + PV . Napięcie powierzch
2.3. MODELE BŁONY 
niowe można wyrazić również jako różniczkę energii swobodnej Gibbsa po powierzchni, przy stałych wartościach temperatury, ciśnienia i liczby cząstek. 
∂G 

γ = 
∂s 
⏐⏐⏐⏐
(2.4) 

T,P,ni 
Jednostką napięcia powierzchniowego jest N . Jednakże częściej stosowanym parametrem niż 
m 
napięcie powierzchniowe jest ciśnienie powierzchniowe, które można zdefiniować jako: 
Π= γ0 − γ (2.5) 
gdzie Π oznacza ciśnienie powierzchniowe, γ0 napięcie powierzchniowe subfazy, a γ to napięcie powierzchniowe subfazy z naniesionym filmem. Wymiar ciśnienia powierzchniowego jest taki jak napięcia powierzchniowego [28]. 


Metoda Wilhelmy’ego 
Najczęściej mierzonym parametrem monowarstw jest ciśnienie powierzchniowe. Metod pomiaru jest wiele. Najprostszą i najczęsciej stosowaną jest metoda Wilhelmy’ego, polega ona na zanurzeniu płytki wykonanej ze szkła, kwarcu, miki lub platyny w subfazie. Ważną własnością płytki jest jej całkowita zwilżalność przez ciecz subfazy, która w trakcie pomiaru tworzy menisk wklęsły na płytce [24], rysunek 2.5. 

W metodzie Wilhelmy’ego mierzona jest siła działająca na zanurzoną w subfazie płytkę. Wypadkowa siła działająca w tej metodzie jest skierowana w dół. Można wyróżnić trzy składowe rozważanej siły: składowa grawitacyjna, składowa związana z efektem napięcia powierzchniowego, a także siła częściowo równoważąca dwie poprzednie, siła wyporu. 
F = ρpgabc +2γ(a + b)cos θ − ρlgabh (2.6) 
gdzie F to wypadkowa siła, ρp i ρl to gęstości odpowiednio płytki i subfazy, g to stała grawitacyjna, a, b, c to wymiary płytki, h to głębokość zanurzenia płytki. W momencie gdy cała płytka jest zwilżona subfazą parametr cos θ przyjmuje wartość 1. Pomiar może następować przy zmiennej sile działającej na płytkę i stałym zanurzeniu, lub przy stałej sile, a zmiennym zanurzeniu [24]. Otrzymane wyniki przelicza się na ciśnienie powierzchniowe. Gdy pomiar jest prowadzony przy zmieniającej się sile, otrzymaną zależność można zapisać jako: 
ΔF
Π= −Δγ = −[ ] (2.7)
2(a + b)
natomiast gdy pomiar prowadzony jest przy stałej sile, a zmiennym zanurzeniu płytki, ciśnienie powierzchniowe można zdefiniować jako: 
ρlgab 
Π= −Δγ = −[ ]Δh (2.8)
2(a + b)gdy płytka jest bardzo cienka, wtedy grubość a jest zaniedbywalna i końcowy wzór na ciśnienie powierzchniowe można zapisać jako: 
Π= −21 ρlgbΔh (2.9) 
Pomiar jest tym dokładniejszy im cieńszą płytkę zastosujemy [24]. 

Charakterystyka filmów monomolekularnych 
W badaniach filmów powierzchniowych umieszczonych na ciekłych subfazach wykonuje się najczęściej pomiar zależności ciśnienia powierzchniowego w funkcji powierzchni cząsteczkowej A wyrażonej w Å2/cząsteczkę. Badania wykonywane są w stałej temperaturze i przy stałym ciśnieniu zewnętrznym, dlatego pomiar nazywany jest izotermą Π -A. Początkowo film powierzchniowy znajduje się w stanie gazowym G. Charakteryzuje się on dużą powierzchnią cząsteczkową i niewielkim zorganiozowaniem. Oddziaływanie cząsteczek znajdujących się na powierzchni subfazy jest zaniedbywalne, wartość ciśnienia powierzchniowego jest bliska zeru. Taki stan monowarstwy można opisać równaniem dwuwymiarowego gazu doskonałego, w którym cząsteczki poruszają się ze średnią energią kinetyczną wynoszącą 1/2kBT dla każdego stopnia swobody. Dwa wymiary na powierzchni subfazy dają średnią energię wynoszącą kBT . W konsekwencji równanie dwuwymiarowego gazu doskonałego przyjmuje postać: 
ΠA = kBT (2.10) 
2.3. MODELE BŁONY 

gdzie kB odpowiada stałej Boltzmana. Jednakże częściej do opisu stanu gazowego monowarstwy stosuje się równanie opisujące dwuwymiarowy gaz rzeczywisty, równanie 2.11. 
Π(A − A0)= kBT (2.11) 
gdzie A0 jest rzeczywistą powierzchnią przypadającą na cząsteczkę w monowarstwie [24]. Ściskanie filmu powierzchniowego prowadzi do większej organizacji cząsteczek w warstwie monomolekularnej, średnia powierzchnia przypadająca na cząsteczkę maleje, natomiast ciśnienie powierzchniowe zaczyna wzrastać. Cząsteczki w monowarstwie zaczynają ze sobą oddziaływać. Monowarstwa przechodzi do stanu ciekłego rozprężonego LE (ang. Liquid Expanded). Taki stan monowarstwy można opisać jako dwuwymiarową ciecz, takie rozwiązanie zostało zaproponowane przez Langmuira w 1933 roku [29]: 
(Π − Π0)(A − A0)= kBT (2.12) 
w którym Π0 odpowiada ciśnieniu związanemu z odpychaniem naładowanych fragmentów cząsteczek. Podczas dalszej kompresji cząsteczki organizują się w monowarstwie w ten sposób, że hydrofilowa część zanurzona jest w subfazie wodnej, natomiast część hydrofobowa znajduje się na granicy faz ciecz -powietrze. Części hydrofobowe są mocno zorganizowane w monowarstwie i oddziałują ze sobą poprzez stabilizujące oddziaływania van der Waalsa. Taki stan fizyczny monowarstwy nazywany jest ciekłym skondensowanym LC (ang. Liquid Condensed), charakteryzuje się znacznym wzrostem ciśnienia powierzchniowego w przebiegu izotermy Π -A. Harkins zaproponował matematyczny opis stanu LC, równanie 2.13. 
Π= b − aA (2.13) 
gdzie a i b są stałymi [24, 30]. Przy dalszym sprężaniu filmu dochodzi do przejścia fazowego z LC do stanu stałego S monowarstwy. Cząsteczki są maksymalnie zorganizowane w monowarstwie, hydrofobowe części cząsteczek są uporządkowane i skierowane prostopadle do powierzchni subfazy. Zarówno części hydrofilowe jak i hydrofobowe cząsteczek mocno oddziałują ze sobą. Monowarstwa charakteryzuje się znacznie mniejszą ściśliwością niż w poprzednich stanach fizycznych. Współczynnik ściśliwości CS −1 wyznaczany dla monowarstw pozwala na dokładniejszą charakterystykę badanych związków amfifilowych, został on zdefiniowany w następujący sposób: 
  
∂Π 
CS −1 = −A(2.14)
∂A
Im wyższa wartość parametru elastyczności tym mniejsza zdolność cząsteczek do kompresji w monowarstwie [38, 39]. Na podstawie Cs−1 można określić w jakim stanie fizycznym znajduje się monowarstwa, charakterystyczne wartości i odpowiadające im fazy uporządkowania, tabela 2.2 [40]. Ponadto wartość różniczki ∂Π określa nachylenie krzywej, natomiast wartość 
∂A 
A określa średnią powierzchnię zajmowaną przez cząsteczki w monowarstwie [39]. Stan fizyczny monowarstwy, a także przebieg izotermy Π -A zależy od właściwości fizycznych i chemicznych badanej substancji amfifilowej. Ponadto zachowanie badanego układu 
silnie zależy od temperatury, pH i składu chemicznego subfazy [31, 32]. Wyżej wymienione czynniki wpływają na wartość ciśnienia powierzchniowego, przy której następuje załamanie monowarstwy. Gdyż kompresja filmu monomolekularnego może odbywać się tylko do pewnego granicznego punktu, powyżej którego cząsteczki są usuwane z monowarstwy. Taki punkt graniczny jest nazywany punktem załamania monowarstwy i występuje przy określonej wartości średniej powierzchni cząsteczkowej Acoll (ang. collapse) i przy określonym ciśnieniu powierzchniowym Πcoll. Klasyczne podejście do załamania monowarstwy głosi iż cząsteczki są wypychane z monowarstwy, po czym następuje kolejne załamanie i tworzone są struktury wielowarstwowe [24]. Najnowsze badania pokazują, że sposób załamania monowarstwy zależy silnie od właściwości fizykochemicznych badanego amfifilu i może przebiegać w różny sposób [33]. 
2.3. MODELE BŁONY 
Tablica 2.2: Wartości parametru elastyczności dla poszczególnych faz monowarstw Langmuira. 

Faza monowarstwy  Wartość współczynnika Cs−1 [mN/m]  Schemat  
Gazowy  0 -12,5  
 
Ciekły rozprężony  12,5 -50  
 
Ciekły skondensowany  100 -250  
 
Stały  ≥ 1000  
 



Elektryczne właściwości filmów powierzchniowych 
Potencjał powierzchniowy ΔV monowarstwy to zmiana potencjału Volty występująca na skutek nałożenia filmu powierzchniowego na granicę ośrodków ciecz-gaz lub ciecz-ciecz [24]. Potencjał powierzchniowy wyliczany jest z powierzchniowego momentu dipolowego µ⊥ wyrażanego wzorem: 
1ΔV 
µ⊥ = (2.15)
4π 
n 
gdzie n wyraża liczbę cząsteczek na cm2 monowarstwy. Fluktuacje wartości potencjału powierzchniowego świadczą o występowaniu niejednorodności w warstwie monomolekularnej. 
Do wykonywania pomiarów izoterm ΔV -A wykorzystywane są dwie główne metody: wibrującej elektrody Kelwina i metoda radioaktywna. 
W pierwszej metodzie wykorzystuje się wibrującą elektrodę Kelwina umieszczoną w niewielkiej odległości od subfazy, natomiast przeciwelektrodę umieszcza się w subfazie, rysunek 2.7. 
Film monomolekularny tworzy na powierzchni kondensator płaski o określonej pojemności 
wyrażonej równaniem Helmholtza, równanie 2.16 [34]. 

ΔV = µ⊥ (2.16)
Ac0cr gdzie c0 jest przenikalnością dielektryczną próżni, natomiast cr wyraża przenikalność dielektryczną monowarstwy. Powierzchniowy moment dipolowy wyrażony jest przez zależność: 
µ⊥ =¯µ cos θ (2.17) 
µ¯jest wewnętrzym momentem dipolowym tworzącym kąt θ z normalną monowarstwy. Równanie Helmholtza traktuje całą cząsteczkę amfifilu jako dipol do wyznaczania wartości µ⊥. Vogel i Moebius [35] w swojej pracy zaproponowali poprawkę do równania Helmholtza uwzględniającą uwodnione części hydrofilowe cząsteczki i hydrofobowe łańcuchy, równanie 

2.18. 
µ⊥ = µα + µω (2.18) 
gdzie µα wyraża moment dipolowy zarówno uwodnionych grup hydrofilowych jak i cząsteczek subfazy ulegających reorganizacji w obecności filmu powierzchniowego. Powyższy model jest czasem nazywany modelem dwuwarstwowego kondensatora. Dalsze prace nad obliczaniem potencjału powierzchniowego prowadzili Davies i Rideal [138], a następnie rozwijali Demchak i Fort [36], którzy zaproponowali model trójwarstwowego kondensatora. Do efektywnego momentu dipolowego są wliczane przyczynki pochodzące od grup hydrofobowych µ1, grup hydrofilowych µ2 oraz cząsteczek wody µ3. Każdy z tych obszarów układu charakteryzuje się różną względną przenikalnością dielektryczną (c1, c2 i c3). Po uwzględnieniu wszystkich parametrów równanie Helmholtza przyjmuje następującą postać: 
1 µ1 µ2 µ3
ΔV = + + (2.19)
Ac0 c1 c2 c3 


2.3.2 Liposomy 
Aby lepiej zrozumieć oddziaływania między cząsteczkami występującymi naturalnie w bło-nach biologicznych stosowane są także inne modele błon. Jednym z wielu są liposomy będące kulistymi pęcherzykami zbudowanymi najczęściej z lipidów, swoją budową przypominają uproszczoną błonę komórkową. Liposomy mają szerokie zastosowanie w naukach biomedycznych. Mogą one imitować uproszczony model błony komórkowej o dokładnie znanym składzie i właściwościach. Pozwalają 
2.3. MODELE BŁONY 
określić rolę poszczególnych lipidów w błonie komórkowej, a także zdefiniować oddziaływanie między lipidami tworzącymi błonę liposomu a różnorodnymi substancjami chemicznymi lub pochodzenia naturalnego. Liposomy mogą być wykorzystywane między innymi do badania oddziaływania między lipidami błonowymi a saponinami. Jednym z przykładów takich badań jest charakterystyka oddziaływań liposomów złożonych z fosfatydylocholiny jajecznej, sfingomieliny jajecznej, fosfatydyloinozytolu oraz cholesterolu z α-hederyną, triterpenową saponiną [42]. Bardzo prężnie rozwijającą się metodą jest zamykanie substancji leczniczej w liposomach, a następnie dostarczanie zamkniętego leku do komórek docelowych w organizmie człowieka. Pęcherzyki tworzone są w taki sposób aby były biologicznie obojętne, słabo immunizujące i nietoksyczne dla organizmu [43]. Często też funkcjonalizuje się powierzchnię liposomów aby charakteryzowały się wysoką specyficznością w stosunku do komórek docelowych [43, 44]. Obecnie stosuje się dwa rodzaje liposomów, albo naturalnie albo sterycznie stabilizowane [45]. Naturalne pęcherzyki mają stosunkowo krótki czas półtrwania w krwioobiegu. Ponadto szybkość rozpadu liposomów wzrasta proporcjonalnie wraz ze wzrostem średnicy, ładunku ujemnego i płynności błony [46]. Sterycznie stabilizowane liposomy są wzbogacone albo gangliozydem GM1, albo fosfatydyloinozytolem. Dodanie tych substancji do błony liposomów znacząco wydłuża ich czas półtrwania w organizmie. Wypadkowy ładunek liposomów dodatni bądź ujemny wpływa na powinowactwo liposomów do różnych typów komórek. Liposomy kationowe lepiej wiążą DNA i są przyswajane częściej przez komórki mózgu, śledziony i szpiku kostnego. Natomiast liposomy z ujemnie naładowaną powierzchnią mają większe powinowactwo do komórek płuc [47]. Liposomy mogą być wykorzystywane w celach diagnostycznych bądź terapeutycznych. W pierwszym przypadku wykorzystuje się na przykład liposomy wypełnione płynnym kontrastem do obrazowania metodą tomografii komputerowej [48]. W echokardiografii mogą być stosowane liposomy wypełnione gazem [49]. Liposomy mogą być także używane w terapii chorób skórnych, dla przykładu hydrokortyzon ośmiokrotnie lepiej przenika przez warstwę rogową naskórka gdy jest zamknięty w otoczce liposomowej niż podawany w tradycyjny sposób [50]. Ponadto liposomy mogą pasywnie transportować substancje bioaktywne do mieszków włosowych przyśpieszając porost lub wypadanie włosów [51]. Pęcherzyki pokryte glikolem polietylenu i wypełnione lekami antynowotworowymi, na przy-kład doksorubicyną, mogą być wykorzystywane w terapii antynowotworowej. Tak zaprojektowana terapia zakończyła się sukcesem w przypadku komórek nowotworów piersi [52] i mięsaka Kaposiego [53]. Liposomy można podzielić ze względu na liczbę warstw na: liposomy wielowarstwowe i jednowarstwowe. Warstwy w liposomach wielowarstwowych przypominają wyglądem cebulę. Stężenie lipidu użytego do budowy takich liposomów jest wyższe niż liposomów jednowarstwowych 
o takiej samej średnicy. 
Do liposomów jednowarstwowych zaliczamy: 
• 
małe liposomy jednowarstwowe (SUV -small unilamellar vesicles), ich średnica nie przekracza 100 nm. Charakteryzują się niskim stosunkiem fazy wodnej zamkniętej w liposomie do ilości lipidu budującego pęcherzyk. Posiadają niskie zdolności do agregacji i charakteryzują się długim czasem życia w krwioobiegu [54]. 

• 
duże liposomy jednowarstwowe (LUV -large unilamellar vesicles), ich średnica to przynajmniej 100 nm. Charakteryzują się wysokim stosunkiem fazy wodnej zamkniętej w liposomie do stężenia lipidu. Najczęściej wykorzystywane są do transportu leków o budowie hydrofilowej. Wykorzystuje się je także do badania spektroskopowego błon biologicznych. [54, 55] 


• olbrzymie liposomy jednowarstwowe (GUV -giant unilamellar vesicles), o średnicy między 10 a 100 µm. Nie posiadają zastosowania w transporcie leków ale są używane do badania zarówno modelu jak i realnej błony komórkowej, jak również procesu tworzenia się domen i raft lipidowych w błonie komórkowej. GUV są doskonałym narzędziem do badań z wykorzystaniem mikroskopii świetlnej [22, 56]. 
Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) 
Zjawisko rozpraszania światła zostało pierwszy raz opisane przez Tyndalla w 1868 roku. Uczony zaobserwował rozpraszanie się światła na cząsteczkach koloidu, których wielkość znacznie przekraczała długość światła użytą w doświadczeniu. Niewiele później Lord Rayleigh opisał rozpraszanie światła na cząsteczkach mniejszych niż długość światła. Wyjaśnił on niebieski kolor nieba jako wynik rozpraszania światła na cząsteczkach atmosfery. Kluczową rolę w tym procesie pełni współczynnik załamania światła ośrodka. Intensywność światła rozproszonego jest zależna od długości fali λ jak λ1 4 . Ważny wkład w rozwój wiedzy o rozproszeniu światła w cieczy miał polski profesor Marian Smoluchowski, który wskazał, że ciecz powinna być rozważana jako ciągłe medium, a ewentualne nieciągłości są spowodowane przez termiczne flukuacje cieczy [57, 58]. W 1908 roku Gustav Mie opublikował swoją teorię opisującą rozpraszanie się światła na cząstkach absorbujących i nieabsorbujących promieniowanie. Wielkość tych cząstek jest znacznie większa od rozmiaru padającej na nie fali elektromagnetycznej. Teoria Mie jest zależna od kształtu cząstek oraz współczynnika załamania światła na cząstce i w otaczającym roztworze [28, 58]. W XIX stuleciu szkocki botanik Robert Brown obserwując pyłek kwiatowy pod mikroskopem zaobserwował, że pyłek porusza się w wodzie, a jego ruchy podobne są do błądzenia, nie są zależne od zewnętrznego pola elektrycznego, magnetycznego czy od grawitacji. Ruchy te zostały nazwane od nazwiska odkrywcy [28]. Powyższe odkrycia stały się podwalinami do rozwoju metody DLS pozwalającej na określenie wielkości cząsteczek, ich wagi i objętości, a także określenie ich stabilności w roztworze. 
2.3. MODELE BŁONY 
Fizyczne podstawy metody DLS 
W metodzie DLS rozpatruje się sferyczne cząsteczki zawieszone w fazie ciekłej. Korzystając z modelu rozpraszania światła zaproponowanego przez Lorda Rayleigh’a światło padające na cząsteczkę o średnicy mniejszej niż długość fali światła, rozprasza się izotropowo. Intensywność odbitego światła została zdefiniowana jako: 
42 − 1 2
1 + cos2 θ 4πn6
I = I0 r (2.20)
2R2 λn2 +2 gdzie I0 i λ odnoszą się do niespolaryzowanego światła padającego na roztwór i oznaczają jego intensywność oraz długość fali. R to odległość do cząstki, θ to kąt załamania światła. Następnie wielkość n określa współczynnik załamania światła przez badaną cząstkę o promieniu r. Fragment 1 + cos2 θ uwzględnia różną polaryzację światła. Światło spolaryzowane prostopadle do płaszczyzny wyznaczonej przez źródło światła, próbkę i obserwatora nie zależy od kąta rozproszenia światła, natomiast światło o polaryzacji równoległej zależy od kąta rozproszenia światła jak cos2 θ [59]. W wyniku rozproszenia światła powstają tak zwane speckle świetlne, czyli plamki ciemne i jasne, które są wynikiem interferencji destruktywnej bądź konstruktywnej fal świetlnych. Jednakże obraz nie jest statyczny, cząsteczki są w ciągłym ruchu, opisanym jako ruchy Browna. Matematycznie ruchy zostały opisane przez Smoluchowskiego i Einsteina jako kwadrat średniego przesunięcia cząstek z następującego w czasie t. 
z 2 =2Dt (2.21) 
gdzie współczynnik dyfuzji D jest odwrotnie proporcjonalny do hydrodynamicznego promienia cząstki a uwzględnionego w równaniu Einsteina-Smoluchowskiego 2.22. 
D = kBT (2.22)
6πηa kB to stała Boltzmana, T to temperatura, natomiast η to lepkość roztworu. Najważniejszą informacją płynącą z równania 2.22 jest zależność szybkości ruchów Browna od wielkości cząstki. Małe cząstki poruszają się w roztworze znacznie szybciej niż duże. Rozmiary cząstek można też powiązać z intensywnością rozpraszania światła zdefiniowaną przez Lorda Reileigha. Z równania 2.20 wynika, że cząstki duże cechują się wiekszą intensywnością światła rozproszonego niż cząstki mniejsze. W równaniu 2.20 intensywność rozproszonego światła jest proporcjonalna do szóstej potęgi promienia cząstki. Oświetlone laserem cząstki rozpraszają promieniowanie, na detektorze tworzy się „obraz” speckli świetlnych. Rozpraszanie światła jest mierzone w niewielkich odstępach czasu. Wzory speckli zmieniają się w czasie. Następnie są porównywane przez urządzenie zwane analizatorem, wyszukuje on korelacji między dwoma obrazami. Tutaj także można powiązać szybkość zaniku korelacji z wielkością cząstek poruszających się ruchami Browna. Im większe cząstki tym korelacja między obrazem odczytanym w chwili t a odczytanym w chwili t + τ wolniej zanika, dla małych cząstek korelacja zanika bardzo szybko, Rys 2.9 [59]. 


Metody wykorzystujące zjawisko fluorescencji 
Spektroskopia fluorescencyjna opiera się na mierzeniu fluorescencji pochodzącej od wzbudzonych promieniowaniem elektromagnetycznym cząstek. Zjawisko fluorescencji zostało schematycznie przedstawione przez polskiego fizyka Aleksandra Jabłońskiego w 1933 w tak zwanym diagramie Jabłońskiego. Cząsteczka lub jej część zwana fluoroforem absorbując falę elektromagnetyczną zostaje wzbudzona, jej energia jest wyższa niż w stanie podstawowym. Następnie część energii zostaje wypromieniowana w postaci innej fali elektromagnetycznej o energii niższej niż fala wzbudzająca, natomiast pozostała energia jest redystrybuowana w procesach wewnętrznych albo zamieniana na energię cieplną [28]. Fluorescencja jest procesem bardzo szybkim i zajmuje zaledwie 10−9 s [60]. Spektroskopia fluorescencyjna jest techniką wykorzystywaną między innymi do badań błon biologicznych, ich składu, ułożenia lipidów, przepuszczalności błony, przejść fazowych. Podczas wytwarzania błony jest ona znakowana specjalnym znacznikiem fluorescencyjnym o odpowiednich właściwościach [22]. W latach pięćdziesiątych ubiegłego stulecia argentyński naukowiec Gregorio Weber po raz pierwszy wykorzystał metody spektroskopowe do badań układów biologicznych [61]. Ważną 
2.3. MODELE BŁONY 

właściwością światła laserowego używanego w pomiarach spektroskopowych jest polaryzacja fali elektromagnetycznej oświetlającej fluorofor. Kolejnym istotnym elementem pomiaru jest detekcja polaryzacji fali emitowanej przez znacznik fluorescencyjny. W układach biologicznych następuje tak zwana fotoselekcja światła, innymi słowy tylko światło o polaryzacji równoległej do osi fluorofora zostanie zaabsorbowane. Proces absorpcji jest szybszy niż rotacja molekuł w błonie. Natomiast proces wypromieniowywania energii jest znacznie wolniejszy niż rotacja cząsteczek zajmująca około 10−12 s. W efekcie uzyskuje się składową światła wypromieniowanego prostopadłą i równoległą do polaryzacji światła wzbudzającego. Intensywność fluorescencji F można zdefinować jako suma intensywności fluorescencji światła spolaryzowanego równolegle I� i dwóch składowych prostopadłych I⊥ i wyrazić wzorem: F = I� +2I⊥ . Na rysunku 2.10 zostało przedstawione schematycznie zjawisko anizotropii fluorescencji. Cząsteczka fluoroforu po zaabsorbowaniu światła może rotować, następnie zachodzi proces fluorescencji, intensywność światła wypromieniowanego jest rozkładana na dwie składowe, prostopadłą i równoległą [62]. Podstawowymi parametrami mierzonymi w spektroskopii fluorescencyjnej są stopień polaryzacji fluorescencyjnej (P) definiowany jako: 
I� − I⊥ I�/I⊥ − 1 
P = = (2.23)
I� + I⊥ I�/I⊥ +1 
oraz anizotropia fluorescencji (rA) opisywana równaniem 2.24 
I� − I⊥ I�/I⊥ − 12P 
rA = = (2.24)
I� +2II�/I⊥ +2 = 3 − P 

Do badań ułożenia lipidów w błonie używane są różne znaczniki fluorescencyjne. Cząsteczka markera fluorescencyjnego posiada zwykle w swojej budowie część aromatyczną, odpowiedzialną za absorpcję i emisję promieniowania [62]. Znaczniki fluorescencyjne oprócz spektroskopii są również używane na przykład w mikroskopii fluorescencyjnej, bądź konfokalnej. Jako przykład można rozważyć dwa związki NBDPE (cząsteczka nitrobenoksadiazolu połączona z dipalmitoiloglicerofosfoetanolaminą) i Rho-DOPE (cząsteczka rodaminy połączona z lipidem dioleoiloglicerofosfoetanolaminą) dodawane do filmu lipidowego używanego do tworzenia gigantycznych liposomów jednowarstwowych. Pierwszy z nich lokalizuje się w fazie lipidów uporządkowanych czyli na przykład raftach lipidowych zbudowanych głównie ze sfingomieliny i cholesterolu, natomiast drugi preferuje fazę lipidów nieuporządkowanych, czyli takich które posiadają nienasycone łańcuchy alifatyczne. Po dodaniu tych fluoroforów do GUV w mikroskopie fluorescencyjnym możliwa jest obserwacja separacji faz, oraz wyznaczenie fazy odpowiedzialnej na przykład za pączkowanie [56, 63]. 
2.3.3 Modelowanie in silico 
Teoria funkcjonału gęstości -DFT (Density Functional Theory) 
Teoria funkcjonału gęstości jest metodą wariacyjną pozwalającą na wyznaczenie struktury elektronowej układów wieloelektronowych z użyciem względnie małej mocy obliczeniowej. DFT opiera się na twierdzeniach Hohenberga-Kohna [64], którzy udowodnili, że znając gęstość elektronową układu można określić wszystkie właściwościwości stanu podstawowego tegoż układu. Ponadto dla znanego funkcjonału gęstości E(ρ) spełniona jest zasada wariacyjna: E(ρ) ≥ E(ρ0). Równość, E(ρ)= E(ρ0), jest spełniona gdy E(ρ) jest funkcjonałem gęstości 
2.3. MODELE BŁONY 
stanu podstawowego. W metodzie wariacyjnej wyznaczona energia stanowi granicę dolną 
możliwych energii układu [65]. 
Energia stanu podstawowego w metodzie DFT jest wyrażona poprzez równanie: 

E = T0 + υ(r)ρ(r)dr + J(ρ)+ Eex(ρ) (2.25) 
w równaniu 2.25 nie uwzględnia się energii kinetycznej oddziałujących elektronów, energia kinetyczna przyjmuje postać: 
1 N
T0 = −  φi|Δφi (2.26)
2 i=1
gdzie φi to spinorbital definiowany jako funkcja współrzędnych kartezjańskich i spinowej 
wybranego elektronu. 
Drugi człon równania 2.25 opisuje oddziaływanie elektronów z jądrami. υ oznacza potencjał 
zewnętrzny, który możemy zapisać za pomocą wzoru: 

υi = − Zα (2.27)
|ri − rα|
α 
grecka litera α odnosi się do jądra atomowego, natomiast Z oznacza liczbę atomową. Mianownik określa odległość rozważanego elektronu od jądra. 
Kolejnym elementem równania 2.25 jest człon odpowiadający za odpychanie coulombowskie 
chmury elektronowej z samą sobą, zdefiniowany jako: 

�� 
1 ρ(r1)ρ(r2)
J(ρ)= dr1dr2 (2.28)
2 |r1 − r2| 
w równaniu 2.28 chmura elektronowa zostaje podzielona na wiele małych sześcianów o ładunku punktowym −ρdr, dzięki czynnikowi 12 oddziaływania tych samych sześcianów są liczone tylko raz [65]. Ostatni człon równania 2.25 to tak zwana energia korelacyjno -wymienna. Aby obliczyć tę energię stosuje się różnorodne przybliżenia. Najbardziej podstawowym jest przybliżenie lokalnej gęstości LDA (Local Density Approximation), które jest przybliżeniem najmniej dokładnym. Dokładniejsze ale bardziej kosztowne jeśli chodzi o czas obliczeń są przybliżenia gradientowe GGA (ang. generalized gradient approximation), natomiast bardziej zaawansowane są tak zwane przybliżenia hybrydowe, a wśród nich funkcjonał B3LYP, dający wyniki bardzo dobrze porównywalne z wynikami eksperymentalnymi [65]. 
Funkcje zlokalizowane w przestrzeni wokół określonego centrum to orbitale atomowe. Zbiór orbitali „atomowych” nazywa się bazą. W obliczeniach kwantowo-chemicznych stosuje się bazy wykładnicze o wzorze ogólnym: 
g(r)= f(x, y, z)exp[−ζrn] (2.29) 
w którym f jest wielomianem, natomiast stopień rozmycia orbitalu wokół centrum zależy od wykładnika ζ, im większa ζ tym zanik funkcji szybszy. Orbitale slaterowskie posiadają w wykładniku n = 1, natomiast w przypadku orbitali gaussowskich n = 2 [65]. Tak jak wspomniano wyżej zbiór orbitali stanowi bazę. Wybór odpowiedniej bazy nie jest rzeczą prostą. W celu uzyskania wiarygodnych wyników najlepiej użyć bazy zawierającej wiele orbitali atomowych, co niestety skutkuje wzrostem zapotrzebowania na moc obliczeniową, gdyż koszt obliczeniowy metody DFT formalnie skaluje się jak O(n4), gdzie n jest wielkością układu [66]. 
Optymalizacja geometrii 
Cząsteczki występujące w przyrodzie dążą do uzyskania konformacji o jak najniższej energii, dlatego chcąc symulować układy rzeczywiste, w obliczeniach także wykorzystuje się struktury posiadajce jak najniższą energię. Aby to osiągnąć początkowe geometrie cząsteczek są optymalizowane, w tym procesie obniża się ich energia. Wyróżnia się dwa rodzaje optymalizacji geometrii, metody gradientowe oraz metody niegradientowe. Do metod gradientowych należą metody najszybszego spadku i sprzężonych gradientów. Natomiast do metod niegradientowych można zaliczyć na przykład algorytmy genetyczne. W optymalizacji można wykorzystać różne rodzaje współrzędnych. Najczęściej stosuje się współrzędne kartezjańskie, współrzędne wewnętrzne (opierające się na macierzy-Z), lub współrzędne mieszane. Optymalizacja geometrii układu polega na znalezieniu punktu stacjonarnego. Proces optymalizacji geometrii dąży do takiego stanu, aby pierwsze pochodne z energii po położeniach zerowały się. Klasyfikacja znalezionych punktów stacjonarnych dokonuje się w oparciu o wartości obliczonych Hessjanów. Gdy wartości Hessjanu były dodatnie układ znajdował się w stanie stacjonarnym. Jeżeli jedna z wartości Hessjanu jest ujemna to układ znajduje się w punkcie siodłowym na powierzchni energii potencjalnej. Po wykonaniu optymalizacji geometrii układ znajduje się najczęściej w minimum lokalnym lub punkcie siodłowym na powierzchni energii potencjalnej [68]. 
Błąd superpozycji bazy 
W ramach metod ab initio obliczanie energii oddziaływania Eoddz międzycząsteczkowego może odbywać się w dwojaki sposób: z wykorzystaniem metody supermolekularnej bądź metody perturbacyjnej. Aby otrzymać wiarygodne wyniki z obliczeń kwantowo-chemicznych trzeba w swoich obliczeniach zachować konsystencję numeryczną i metodologiczną. Konsystencja numeryczna jest zachowana gdy w obliczeniach wykorzystywana jest dokładnie ta sama baza, natomiast konsystencja metodologiczna jest zachowana gdy korzysta się z tej samej metody obliczeniowej. W metodzie supermolekularnej energia oddziaływania definiowana 
2.3. MODELE BŁONY 
jest jako różnica między energią dimeru AB a energią monomerów A i B przyjmujących geometrię taką samą jak w dimerze. Podczas obliczeń monomeru A, monomer B nie jest obecny, a w jego miejsce używane są „orbitale duchy”, tak samo postępuje się w przypadku obliczania energii monomeru B: 
Eoddz = E(AB)ab − E(A)ab − E(B)ab (2.30) 
gdzie ab oznacza bazę dimeru. W ten sposób bazy dla monomerów w układzie są takie same. Struktura geometryczna A i B w minimum lokalnym jest inna niż w dimerze dlatego korekta z tym związana to energia deformacji Edef , wyrażona wzorem: 
Edef = E(A)a − E(A0)a + E(B)b − E(B0), (2.31) 
Edef > 0 
Suma Eoddz i Edef daje energię kompleksacji. Przy takim podejściu błąd superpozycji bazy zostaje wyeliminowany [68]. 
Teoria atomów w cząsteczkach 
Richard Bader jest autorem teorii atomów w cząsteczkach (AIM z ang. atoms in molecules). Teoria ta opisuje atomy jako topologiczne baseny gęstości elektronowej. Gęstość elektronowa przyjmuje najwyższą wartość na jądrach atomowych. Baseny atomowe są rozłącznymi obszarami w przestrzeni fizycznej. Powierzchnia graniczna między basenami zdefiniowana jest warunkiem 2.32: 
\ρ(rr) · rn(rr) = 0 (2.32) 
gdzie rr jest wektorem wodzącym, a rn jest jednostkowym wektorem normalnym do powierzchni \ρ(rr). Z praktycznego punktu widzenia najważniejsze do opisu właściwości cząsteczek są punkty stacjonarne, które w przypadku gęstości elektronowej nazywamy punktami krytycznymi, spełniają one warunek: \ρ(rr)= r0. Aby scharakteryzować punkty krytyczne należy policzyć hesjan czyli macierz drugich pochodnych gęstości elektronowej po położeniu, na-stępnie zdiagonalizować otrzymaną macierz i wyznaczyć jej ślad czyli laplasjan. Diagonalizacja Hessjanu w punktach krytycznych daje informacje niezbędne do klasyfikacji punktów krytycznych. Liczba niezerowych wartości własnych tak zwana ranga i sygnatura, będąca algebraiczną sumą znaków obliczonych wartości własnych, dzieli punkty krytyczne na cztery typy w zależności od wartości rangi i sygnatury: 
• 
(3, -3) punkt krytyczny jądra atomowego (z ang. nuclear critical point) 

• 
(3, -1) punkt krytyczny wiązania (z ang. bond critical point, BCP) 


• 
(3, +1) punkt krytyczny pierścienia (z ang. ring critical point) 

• 
(3, +3) punkt krytyczny wnęki molekularnej (z ang. ring critical point) 


W niniejszej pracy będą rozważane tylko krytyczne punkty wiązania. Znając gęstość elektronową ρ w punkcie krytycznym można określić rodzaj wiązania. Jeżeli ρ jest większe od 0.2 to między atomami występuje wiązanie kowalencyjne, natomiast ρ mniejsze niż 0.1 charakteryzuje oddziaływania słabe [69]. 
Metoda klasycznej dynamiki molekularnej 
Metoda klasycznej dynamiki molekularnej MD (ang. Molecular Dynamics) opiera się na rozwiązywaniu klasycznych równań Newtona dla układów molekularnych. W obliczeniach wyznacza się położenia oraz prędkości atomów badanego układu, co jest określane terminem „trajektoria układu”. Energia potencjalna układu wyznaczana jest za pomocą pola siłowego, FF (ang. force field), opisującego funkcję potencjału. 
Pole siłowe Pole siłowe jest energią cząsteczki w funkcji położenia jej jąder atomowych. Pole siłowe jest wielkością skalarną opisującą hiperpowierzchnię energii potencjalnej V dla ruchu jąder w przestrzeni 3N-6 wymiarowej. Parametry FF wyznaczane są empirycznie najczęściej metodami krystalograficznymi i spektroskopowymi. Pola siłowe stosowane są do badań dużych układów, gdy obliczanie elektronowego równania Schroedingera trwałoby za długo, lub wręcz byłoby niemożliwe. Najczęściej używana jest następująca definicja funkcji potencjału V: 
V = Vb + Va + Vt + VvdW + Vcc (2.33) 
pierwsze trzy człony równania odnoszą się do struktury kowalencyjnej, natomiast kolejne dwa określają przyczynki od oddziaływań niekowalencyjnych. Skróty stosowane w równaniu 2.33 zostaną szczegółowo omówione poniżej: 
1. 
Vb odnosi się do energii potencjalnej zmiany długości wiązania między dwoma atomami charakteryzującej się określoną długością wiązania r0 i harmoniczną stałą siłową k, są to oddziaływania 1-2, rysunek 2.11. W polu siłowym zamiast sztywnego wiązania między atomami stosuje się przybliżenie harmoniczne, które wyraża się wzorem: 12k(r − r0)2, gdzie r to odległość między atomami. 

2. 
Vb oznacza energię potencjalną związaną ze zmianą kąta wyznaczanego przez trzy sąsiednie atomy o ściśle określonych długościach wiązań, oddziaływania 1-3, rysunek 2.11. Tutaj również stosuje się przybliżenie harmoniczne, tak aby sprężyna została umieszczona między pierwszym i trzecim atomem. Podobnie jak w przypadku wiązań, kąty między atomami posiadają pewne charakterystyczne wartości α0 i harmoniczną stałą 


2.3. MODELE BŁONY 
siłową kα. Gdy próbuje się wyprowadzić kąt z położenia równowagi, jego wartość wynosi α. Wyrażenie opisujące kąty jest analogiczne do tego opisującego wiązania, to znaczy: 
1 
2kα(α − α0)2. 
3. 
Vt odnosi się do energii potencjalnej związanej ze zmianą kąta torsyjnego opisującego jak zmieni się energia gdy nastąpi rotacja o kąt ω dookoła wiązania między atomami 2 i 3 w sekwencji wiązań chemicznych 1-2-3-4, rysunek 2.11. Człon torsyjny jest opisywany równaniem G(1− cos(nω)), gdzie n to krotność wystąpienia bariery przy pełnym obrocie, natomiast G to stała. 

4. 
VvdW to energia potencjalna związana ze zmianą oddziaływań van der Waalsa, rysunek 


2.11. Oddziaływania te zapobiegają przed zbliżeniem się atomów na odległość mniejszą niż suma ich promieni van der Waalsa. Gdy takie oddziałujące atomy zbliżają się do siebie energia potencjalna gwałtownie rośnie i atomy zaczynają się odpychać, natomiast oddalenie się atomów powoduje wzrost sił dyspersyjnych proporcjonalne do r−6. Takie oddziaływania zostały opisane jako potencjał Lennarda-Jonesa i wyrażone wzorem: 
12 6
r0 r0
VLJ = c − 2 (2.34) 
rr 
5. Vcc to energia potencjalna związana ze zmianą oddziaływań elektrostatycznych, które zależą od ładunków rozważanych atomów (q1 i q2), można to uwzględnić wprowadzając do pola siłowego przyczynek pochodzący od energii elektrostatycznej opisany wzorem 
q1q2/r. 
Zatem podsumowując, najprostsze pole siłowe może zawierać takie człony: 
� 1 � 1 � V =2k(r − r0)2 +2kα(α − α0)2 + G(1 − cos(nω)) 
A−BA−B−CA−B−C−D 
12 6
r0 r0 qAqB
+ c − 2+ 
rr r
A,B A,B 
oznaczenia są analogiczne jak w opisie pola siłowego. Wadą opisanych pól siłowych jest to, że nie da się przeprowadzić reakcji z użyciem pól siłowych, wiązania chemiczne nie mogą zostać rozerwane, natomiast układ dąży do optymalizacji ich parametrów [65]. W przypadku kiedy jest potrzeba przeprowadzania reakcji chemicznych używa się model oscylatorów anharmonicznych zaproponowany przez Philipa Morse’a. Model ten jest znacznie bardziej skomplikowany i kosztowny jeśli chodzi o moc obliczeniową [65]. 

Mechanika molekularna 
Mechanika molekularna jest analizą topologiczną pozwalającą na znalezienie punktów stacjonarnych na hiperpowierzchni energii potencjalnej. Dąży się do tego minimalizując energię potencjalną badanego układu. Energia jest minimalizowana do momentu kiedy obliczony z niej gradient wynosi „zero”. Problemem tej metody jest to, że nie zawsze, a właściwie dosyć rzadko osiąga się minimum globalne, szczególnie jeżeli minimalizuje się energię dużych cząstek. Zwykle znajdowane są punkty stacjonarne zerowego i pierwszego rzędu. 
Dynamika molekularna (MD) 
Procesy dynamiczne zachodzą w czasie i temperaturze. W dynamice molekularnej wykorzystuje się związek między energią kinetyczną układu, a jego temperaturą. Aby zdefiniować warunki początkowe symulacji należy podać początkowe położenia, prędkości, które w bardzo krótkim odcinku czasu Δt mogą być wartością stałą. Następnie w kolejnym kroku czasowym ustala się nową prędkość i nowe położenie. W ten sposób można uzyskać trajektorię czyli zmianę położenia w czasie. 
2.3. MODELE BŁONY 
Przedmiotem rozważań MD są atomy, a procedura obliczeniowa opiera się na numerycznym scałkowaniu równań ruchu Newtona: 
dV d2ri
Fi(t)= − = mi i =1, 2, ..., M (2.35)
dri dt2 , gdzie Fi to siła działająca na atom i, V to potencjał, ri to wektor położenia atomu zapisany we współrzędnych kartezjańskich, mi to masa, natomiast t to czas. Położenie atomów w kolejnym kroku czasowym można uzyskać stosując rozwinięcie w szereg Taylora funkcji położenia w czasie: 
∂r 1 ∂2r 1 ∂3r 
ri+1 = ri + (Δt)+ (Δt)2 + (Δt)3 + ... (2.36)
∂t 2 ∂t2 6 ∂t3 We wzorze 2.36 pierwsza pochodna położenia po czasie to prędkość, natomiast druga pochodna to przyspieszenie. Następnie zostanie wyznaczone położenie układu w czasie t − Δt. 
∂r 1 ∂2r 1 ∂3r 
ri−1 = ri − (Δt)+ (Δt)2 − (Δt)3 + ... (2.37)
∂t 2 ∂t2 6 ∂t3 
po czym od równania 2.36 zostanie odjęte równanie 2.37 przez co wartości położenia i pędu przyjmują wartości dyskretne. 
ri+1 = (2ri − ri−1)+ ∂2r(Δt)2 + ... (2.38)
∂t2 przyśpieszenie można obliczyć ze wzoru 2.35. Powyższy sposób numerycznego rozwiązywania równań Newtona został nazwany algorytmem Verleta. W każdym kroku iteracji przyśpieszenie cząstek w układzie powinno zostać obliczone na nowo. Dodatkowo im mniejszy krok czasowy zostanie przyjęty tym położenia atomów zostaną dokładniej obliczone [68]. Metoda MD dostarcza informacji na poziomie mikroskopowym aby wymodelować warunki makroskopowe stosuje się różne metody mechaniki statystycznej. Do kontroli temperatury i ciśnienia wykorzystywane są odpowiednio termostat i barostat. Obliczenia można prowadzić w różnych zespołach statystycznych, najbardziej rozpowszechnione są zespół kanoniczny (NVT) i izobaryczno-izoterminczym (NPT). Pierwszy zespół statystyczny przyjmuje stałą liczbę atomów (N), obliczenia prowadzone są w stałej objętości (V) i temperaturze (T). Gdy wyniki symulacji mają być porównywane z eksperymentami prowadzonymi w warunkach stałego ciśnienia i temperatury wykorzystywane są zespoły statystyczne izotermicznoizobaryczne o stałej liczbie atomów, stałej temperaturze i przy stałym ciśnieniu (P). Periodyczne warunki brzegowe (PBC) Zakładamy, że do obliczeń wykorzystano realistyczny model układu otoczonego przez cząsteczki rozpuszczalnika. Przy tworzeniu modelu podaje się trzy wektory określające kształt komórki symulacyjnej, najprostszym jest kształt prostopadłościanu, rysunek 2.12. W tak utworzonej replice warunki panujące na brzegach sześcianu są niefizyczne. Aby pozbyć się niefizyczności stosuje się periodyczne warunki brzegowe, w których badany prostopadłościan otoczony jest z każdej strony przez swoje repliki, takich replik potrzebnych do otoczenia sześcianu jest 26, por. rysunek 2.12. Następnie aby otoczyć układ drugą warstwą replik należy zużyć 96 takich samych sześcianów i tak dalej. 

W obliczeniach dynamiki molekularnej stosuje się zwykle model quasi -periodyczne. Oznacza to, że jeżeli środek masy cząsteczki z modelu wyjdzie poza wytyczoną komórkę symulacyjną cząsteczka jest dodawana z przeciwnej strony układu, tak aby zachować stałą liczbę atomów w prowadzonej symulacji. Takie zachowanie pociąga za sobą oddziaływania dalekiego za-sięgu. Aby ograniczyć te oddziaływania stosuje się parametr odcięcia (cutoff), który zwykle jest ustalany na 10-12 Å. Jeżeli dwa atomy znajdują się w odległości większej niż cutoff to oddziaływanie van der Waalsa między nimi nie jest liczone. Narzędziem przyśpieszającym obliczenia oddziaływań elektrostatycznych jest metoda sieciowych komórek Ewalda (z ang. Particle Mesh Ewald). Metoda polega na podzieleniu oddziaływań na krótko-i dalekozasięgowe. Ładunki znajdujące się w układzie traktowane są jak funkcje gausowskie. W przypadku gdy dwa ładunki znajdują się blisko siebie ich funkcje gausowskie są zliczane bezpośrednio. Natomiast do zliczeń oddziaływań dalekiego zasięgu jest używana tranformata Fouriera lub przestrzeń odwrotna. W wyniku tego zabiegu obliczenia zamiast skalować się jak N2, skalują się jak NlnN [68]. 
Modele wody 
Woda jest najczęstszym rozpuszczalnikiem używanym w badaniach biologicznych, posiada unikalne właściwości wynikające z możliwości tworzenia wiązań wodorowych między poszczególnymi cząsteczkami wody [70]. Istnieje wiele modeli opisujących wodę, jednakże bardzo trudno jest wymodelować wszystkie właściwości wody. Dlatego w zależności od potrzeb używa się modeli, które dobrze symulują konkretne własności wody. W niniejszej pracy został użyty model wody TIP3P (transferable intermolecular potential 3P), który jest zaimplementowany do pola siłowego CHARMM i dzięki swojej prostocie jest bardzo często używany w 
2.3. MODELE BŁONY 
symulacjach układów biologicznych [71]. Porównanie właściwości wody opisanej przez model TIP3P i eksperyment zostały zebrane w tabeli 2.3. 
Tablica 2.3: Porównanie właściwości wody; zestawienie wyników uzyskanych eksperymentalnie i z modelu TIP3P [68]. 
TIP3P  Eksperyment  
temperatura topnienia [K]  146  273  
gęstość ∗ [g/ml]  0.98  0.997  
ciepło parowania [kJ/mol]  42  44  
pojemność cieplna  79  75  
stała dielektryczna  94  78  

∗ 
gęstość w temperaturze 298 K. 
Jak wynika z tabeli 2.3, model poprawnie odtwarza gęstość, ciepło parowania i pojemność cieplną wody, natomiast nie radzi sobie z temperaturą topnienia i stałą dielektryczną. Ponadto dużą wadą modelu jest to, że nie odtwarza poprawnie radialnej funkcji rozkładu par, także napięcie powierzchniowe wody nie jest dobrze odtworzone. 
Uzyskiwanie informacji z symulacji 
Poprawnie przeprowadzone obliczenia metodą dynamiki molekularnej powinny zawierać na-stępujące po sobie kroki. Pierwszy to minimalizacja energii, po nim następuje równowago-wanie w zespole kanonicznym, następnie równowagowanie w docelowym zespole statystycznym, po którym następuje faza „produkcyjna” (ang. production run). Bardzo ważny jest odpowiedni dobór kroku czasowego w prowadzonej symulacji. Poprawnie dobrana wartość powinna być o rząd wielkości mniejsza niż najszybsze drgania w układzie [72], a konkretnie drgania oscylacyjne w cząsteczkach, występujące w czasie 10−14 do 10−13 s. Dlatego w symulacjach stosuje się najczęściej krok czasowy wynoszący 1 fs. Zamrożenie najszybszych drgań w badanym układzie pozwala na wydłużenie kroku czasowego do 2 fs. Poprawność danych uzyskanych z symulacji należy zweryfikować, wykorzystując do tego metody statystyczne, jak na przykład metodę zaproponowaną przez Flyvberga i Petersena [68]. Uzyskane dane mogą służyć do porównania z wartościami eksperymentalnymi [65]. Jeżeli obie metody, eksperymentalna i obliczeniowa zgadzają się ze sobą można wykorzystać dane uzyskane z obliczeń do wyjaśnienia zjawisk w skali nano. Przykładem informacji uzyskanej z symulacji jest radialna funkcja gęstości g(r), mierząca prawdopodobieństwo napotkania zadanej cząstki w funkcji odległości. Zlicza ona liczbę zadanych molekuł w pierścieniach o przekroju Δr, w rezultacie dając informację ile razy bardziej prawdopodobne jest napotkanie danej molekuły w konkretnej odległości niż napotkanie tej molekuły w systemie, który ma jednorodny rozkład cząstek. Granica gazu doskonałego powinna dawać wartość 1 [68]. Parametr uporządkowania (Smol) jest kolejną informacją, którą można uzyskać z analizy wyników symulacji MD. Można go wyliczyć ze wzoru: Smol = −(3 < cos2θ> −1) (2.39) 
gdzie θ jest kątem między wiązaniem C-H, a normalną monowarstwy, <> oznacza średnią po czasie. Parametr jest obliczany dla wszystkich cząsteczek w układzie, a także dla każdego wiązania C-H w łańcuchu alifatycznym. Wartości parametru porządku wynoszą od zero do jeden, zero odpowiada stanowi nieuporządkowanemu, a wraz ze wzrostem wartości parametru badany układ staje się bardziej uporządkowany [73, 74, 75]. 
2.4 Saponiny 
Saponiny są glikozydami naturalnie występującymi w roślinach, organizmach morskich i w niektórych bakteriach, pełnią funkcję antyzapalną, antybakteryjną i antywirusową [1]. Dzięki swojej amfifilowej budowie są cząsteczkami powierzchniowo czynnymi i podobnie jak mydło powodują pienienie się wody, czemu zawdzięczają swoją nazwę, gdyż słowo „sapo” po grecku znaczy mydło [76]. Ze względu na budowę części hydrofobowej -aglikonu, saponiny dzielimy na steroidowe i triterpenowe. Te pierwsze występują między innymi w owsie, papryce, bakłażanie, czosnku, nasionach pomidora oraz w żeń-szeniu. Natomiast drugie występują w roślinach strączkowych, czosnku, herbacie, szpinaku, buraku cukrowym i w słoneczniku [1]. Saponiny steroidowe posiadają silniejsze działanie hemolityczne niż saponiny triterpenowe [77, 78]. Saponiny można także podzielić ze względu na liczbę miejsc połączeń reszt cukrowych z aglikonem. Najczęściej spotykanymi saponinami są monodesmosydyczne i bidesmosydyczne. Te pierwsze posiadają jedno połączenie reszty cukrowej z aglikonem zwykle przy atomie węgla C3, natomiast drugie charakteryzują się występowaniem dwóch takich miejsc, cukry przyłączone są także do atomu węgla C26 lub C28 [4, 6]. Saponiny monodesmosydyczne wykazują trzydziestokrotnie większe działanie hemolityczne niż saponiny bidesmosydyczne [78, 79]. W części glikonowej występują następujące ugrupowania glikonowe: D-glukoza, D-galaktoza, kwas D-glukuronowy, D-fukoza, D-ksyloza, L-ramnoza, L-arabinoza [6, 4]. Saponiny znajdują zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu jak i w medycynie. Steroidowe saponiny wyizolowane z rodzaju Yucca są używane w przemyśle spożywczym do podniesienia jakości produktów, między innymi zapewniają utrzymanie odpowiedniej porowatości, gęstości, a także twardości wyrobów [80]. Korzenie rośliny z rodzaju Glycyrrhiza są używane jako substancje słodzące i wzbogacające smak potraw [81]. Saponiny wyizolowane z rośliny z rodzaju Quillaja są stosowane w przemyśle chemicznym jako środek pieniący i są dodawane do szamponów, past do zębów i ciekłych detergentów [82]. W przemyśle farmaceutycznym diosgenina wyizolowana z bulw rośliny Dioscorea villosa jest używana jako prekursor kortyzonu, progesteronu, a także pregnenolonu [83, 84]. Saponiny najczęściej kojarzone są z efektem hemolitycznym jaki wywierają na komórki ery
2.4. SAPONINY 
trocytów. Ich toksyczność w stosunku do czerwonych krwinek jest czynnikiem limitującym ich zastosowanie w medycynie. Jednakże saponiny posiadają także wiele dobroczynnych właściwości. Saponiny wyizolowane z korzenia rośliny Panax Ginseng przyśpieszają gojenie się ran poprzez zwiększenie migracji keratynocytów do chorobowo zmienionego obszaru [6, 85]. Saponiny triterpenowe wyizolowane z roślin Sargentodoxa cuneata i Thinouia coriacea hamują syntezę DNA i kapsydu wirusa HSV1 [2, 6]. Ponadto niektóre saponiny wykazują działanie antyzapalne, na przykład saponiny wyizolowane z Caulophyllum thalictroides hamują wydzielanie cytokin prozapalnych, indukowanej syntazy tlenku azotu, a także cytooksygenazy drugiej w nadnerczach mysich [3, 6]. Saponiny są intensywnie badane na działanie antynowotworowe przeciwko różnym typom komórek nowotworowych. Saponiny wyizolowane z roślin z rodzaju Astragalus posiadają właściwości antynowotworowe przeciwko komórkom raka jelita grubego i wątrobiaka (HCC). Obniżają one poziom α-fetoproteiny występującej naturalnie w orgaznizmie w okresie ciąży oraz w przypadku nowotworu wątroby. Hamują wzrost komórek nowotworu poprzez supresję czynnika wzrostu. Następnie prowadzą komórkę na szlak metaboliczny niezależny od ERK (kinaza regulowana czynnikami zewnętrznymi) co powoduje zwiększenie wydzielania czynnika NF-κB (czynnik transkrypcyjny kappa B) i w konsekwencji prowadzi do programowanej śmierci komórki, czyli apoptozy [86, 87]. Awicyna D, saponina z grupy saponin triterpenowych wykazuje właściwości cytotoksyczne skierowane przeciwko komórkom kostniakomięsaka, nowotworu kości. Awicyna penetrując wnętrze komórki zaburza gospodarkę energetyczną komórki, poprzez zwiększenie przepuszczalności zewnętrznej błony mitochondrialnej i upośledzenie oddychania komórkowego. Ponadto w obecności awicyny wpływa na supresję genów kinazy aktywowanej 5’AMP (adenozynomonofosforan), odpowiedzialnej za homeostazę energetyczną komórki, oraz zwiększa ekspresję tuberyny, która jest białkiem odpowiedzialnym między innymi za autofagię komórki [87, 88, 89, 90]. W niniejszej pracy zostanie zbadane oddziaływanie modelowych błon komórkowych z dwoma saponinami: digitoniną i ginsenozydem Rh2. Ponadto diosgenina, steroidowa saponina, o budowie bardzo zbliżonej do cholesterolu zostanie wykorzystana do badań nad rolą łańcucha alifatycznego w cząsteczce cholesterolu. 
2.4.1 Digitonina 
Digitonina jest steroidową saponiną naturalnie występującą w naparstnicy purpurowej (Digitalis purpurea), w roślinie pełni funkcję ochronną -antybakteryjną, przeciwgrzybiczną i antywirusową [1]. Digitonina dzięki swojej amfifilowej budowie jest związkiem powierzchniowo czynnym, składa się ze spirostanowej części hydrofobowej, oraz pięciu reszt cukrowych: dwóch glukoz, dwóch galaktoz oraz ksylozy, Rys 2.13. W roku 1909 Adolf Windaus zaproponował metodę wyznaczania ilości cholesterolu bazującą na tworzeniu osadu tworzonego przez oddziałujące ze sobą cząsteczki cholesterolu i digitoniny [7]. Następnie metoda ta przez wiele lat służyła do szacowania ilości wolnego cholesterolu we krwi. Co więcej digitonia oddziałuje także z 3β-oksysterolem, a także alkoholami [7, 91, 92]. W naukach biomedycznych jest także wykorzystywana w terapii antynowotworowej, ze względu na jej właściwości cytotoksyczne i cytostatyczne w stosunku do chorobowo zmienionych komórek [79]. Digitonina znajduje także zastosowanie w przypadku nowotworów cechujących się wielolekoopornością. Taka terapia prowadzona jest z użyciem więcej niż jednej substancji, z których każda oddziałuje na komórkę w inny sposób. Digitonina blokuje białko posiadające kasetę wiążącą ATP (ABC transporter) w błonie komórkowej, przez co ułatwia wnikanie do komórki leków oddziałujących na jądro komórkowe i w konsekwencji powodujących apoptozę komórki nowotworowej [93]. Bardzo ważną właściwością digitoniny jest oddziaływanie z cholesterolem. Pierwszy artykuł poświęcony temu oddziaływaniu został napisany przez naukowców Rideal i Schulman, którzy pokazali nagły wzrost ciśnienia powierzchniowego monowarstwy cholesterolu po dodaniu digitoniny do subfazy. Ciśnienie początkowe wynosiło 10 mN/m, a po dodaniu digitoniny wzrosło do około 60 mN/m [9]. Niedługo po tym odkryciu Langmuir oszacował stosunek stechiometryczny cholesterolu i digitoniny na 1:0.72 [5]. W literaturze pojawiają się także doniesienia, iż stosunek stechiometryczny cholesterol-digitonina wynosi 1:1 [94, 95, 96]. Kolejnym przedmiotem badań było określenie wpływu stężenia cholesterolu oraz digitoniny na ich wzajemne oddziaływanie w błonach biologicznych. Digitonina słabiej oddziałuje z lipidami błonowymi innymi niż cholestesterol i jego pochodne. Jednakże w literaturze można znaleźć informację, że w przypadku braku cholesterolu w membranie digitonina nie zmie

2.4. SAPONINY 
nia rozmiaru liposomów, jednakże może wbudowywać się w błony liposomowe gdy stężenie saponiny będzie znacznie przekraczać CMC, a ponadto roztwór liposomowy będzie bardzo stężony. W takiej sytuacji podczas kolizji miceli digitoniny z liposomem może następować wymiana, lipid zostaje wbudowany w micelę, natomiast digitonina zostaje wbudowana w zewnętrzną błonę liposomu. Digitonina pozostaje w zewnętrznej błonie i nie wykonuje ruchów flip-flop [97]. Następnie gdy stężenie cholesterolu w błonie jest niższe niż 10 % mol digitonina wbudowując się w błonę biologiczną zwiększa jej płynność ale błona nie ulega uszkodzeniu. Powyżej stężenia 10 % mol cholesterolu w błonie tworzą się agregaty digitonina -cholesterol, które powodują powstanie asymetrii w błonie, przez co tworzone są pęknięcia, a także błona ulega poważnym uszkodzeniom, a w konsekwencji rozpuszczeniu [97]. Naukowiec Irene Schulz zbadała wpływ stężenia digitoniny na jej oddziaływanie z błoną komórkową. W niniejszej pracy zostało pokazane, że digitonina o stężeniu 10 µg/ml tworzy pory w błonie komórkowej o średnicy 8-10 nm, przez które swobodnie migrują białka o masie do 200 kDa. Organelle wewnętrzne komórki nie zostają uszkodzone przy takim stężeniu saponiny. Digitonina wraz z błonowym cholesterolem tworzą w błonie sferyczne micele gdzie części hydrofobowe obu cząsteczek skierowane są do wnętrza miceli, natomiast cukry na zewnątrz. Ponadto oddziałujące cząsteczki tworzą sztywne tubularne struktury. Wszystkie oddziaływania sterolu z saponiną występują we wnętrzu błony komórkowej i zostały zaobserwowane z użyciem mikroskopii elektronowej [98]. Stężenie digitoniny między 200 a 900 µg/ml jest przyczyną uwalniania około 50 % białek cytozolowych z komórki. Stężenie powyżej 1000 µg/ml powoduje usunięcie pozostałych białek cytozolowych oraz rozpuszczenie lipidów i białek błonowych. Zwiększenie stężenia do 3000 µg/ml powoduje zniszczenie organelli komórkowych takich jak lizosomy i mitochondria i w konsekwencji lizę komórek [98]. W literaturze można znaleźć wiele prób wyjaśnienia mechanizmu działania saponiny z cholesterolem błonowym [7, 8, 20, 99, 100]. Ze względu na bardzo skomplikowaną budowę błony komórkowej badania prowadzone są na uproszczonych błonach takich jak liposomy, czy monowarstwy Langmuira. Do tej pory w nauce pojawiło się wiele propozycji wyjaśnienia tego oddziaływania. Takagi i współpracownicy badali oddziaływania digitoniny oraz jej pochodnych posiadających mniejszą część glikonową z cholesterolem oraz jego pochodnymi o różnej długości łańcucha acylowego. Naukowcy wnioskowali, że im dłuższy łańcuch alifatyczny tym oddziaływanie między digitoniną (lub jej pochodnymi) a cholesterolem (lub jego pochodnymi) mocniejsze. Ponadto łańcuch acylowy cholesterolu może poprawiać dopasowanie między częściami sterolowymi digitoniny i cholesterolu, w wyniku czego powstaje silniejsze oddziaływanie między tymi dwoma cząsteczkami. Takagi i współpracownicy zaproponowali model tworzenia klatratu: digitonina -cholesterol, w którym saponina pełni rolę gospodarza, a cholesterol rolę gościa. Siła oddziaływania międzycząsteczkowego w tym klatracie jest zależna od wzajemnego dopasowania cząsteczek [100]. 
Podobne wyjaśnienie oddziaływania digitoniny z cholesterolem podali Wojciechowski i współpracownicy. Badali oni monowarstwy Langmuira zbudowane z DPPC:cholesterol (10:9) i skompresowane do ciśnienia powierzchniowego 32,5 mN/m oddziałujące z digitoniną rozpuszczoną w subfazie wodnej. Naukowcy rozważali względne ułożenie cząsteczek cholesterolu i digitoniny w monowarstwie. Zaproponowali, że digitonina penetruje monowarstę prostopadle do jej powierzchni, ponadto saponina jest hydratowana przez około 70 cząsteczek wody i zajmuje objętość 2040 Å3. Cholesterol może zostać wyciągnięty z monowarstwy i tworzyć wraz z saponiną drugą warstwę pod powierzchnią pierwszej. Monowarstwa pozbawiona cholesterolu jest bardziej przepuszczalna i podatna na uszkodzenia. Digitonina tworzy kompleks z cholesterolem, co wynika z mniejszej powierzchni kompleksu niż cząsteczek go budujących. Kompleks ten przypomina kryształ, w którym analogicznie do pracy Takagi’ego i współpracowników digitonina pełni rolę gospodarza, a cholesterol gościa. Oddziaływania Londona stabilizujące kompleks występują między sterolami obu badanych molekuł [7]. W pracy Ikhwana R. Sudji i współpracowników zostało zbadane oddziaływanie digitoniny z cholesterolem w liposomach zbudowanych z POPC/SM/cholesterol (2:2:1), POPC/cholesterol (4:1), SOPC/cholesterol (4:1). Wykonano także liposomy referencyjne nie zawierające cholesterolu zbudowane z POPC i SOPC. Naukowcy zaproponowali, że digitonina oddziałując z cholesterolem zwiększa przepuszczalność błony, tworzą się pory o średnicy większej niż 2 nm. Ponadto digitonina dodana do roztworu liposomów zawierających cholesterol początkowo powoduje zwięszenie średnicy liposomów, natomiast po pewnym czasie następuje stabilizacja lipidów w błonie i powstaje frakcja liposomów o mniejszej średnicy niż liposomy macierzyste. Jednocześnie digitonina nie oddziaływała z liposomami nie zawierającymi cholesterolu. Badacze wnioskują także, iż digitonina nie oddziałuje z fosfatydylocholiną, sfingomieliną, a także mitochondrialną kardiolipiną [78]. Badacze z Heidelberga rozpatrywali oddziaływanie digitoniny z cholesterolem w kontekście natywnej błony komórkowej. Według autorów digitonina zwiększa lepkość membrany i jest to efekt nieodwracalny, co sugeruje, że cząsteczki cholesterolu są usuwane z błony. Na skutek dodania saponiny zmienia się także mechanika błony. Nataliya Frenkel i współpracownicy odrzucają hipotezę Schulz, a tym samym wykluczają istnienie miceli powierzchniowych oraz układów tubularnych na powierzchni błony. Badania liposomowe pokazały, że w liposomach zbudowanych z SOPC i 5% lub 20% cholesterolu, cząsteczki sterolu są usuwane z liposomu przez cząsteczki saponiny. Reasumując digitonina penetruje błonę komórkową w miejscu występowania cholesterolu, następnie tworzy się kompleks digitonina -cholesterol, który jest usuwany z błony nie powodując wprost zerwania jej ciągłości ale zwiększając jej płynność i podatność na uszkodzenia [8]. Wraz z kolejnymi badaniami wiedza na temat oddziaływania digitoniny z cholesterolem staje się pełniejsza. Jednakże wyjaśnienie mechanizmu oddziaływania digitoniny i cholesterolu na poziomie molekularnym nie jest rzeczą prostą. W niniejszej pracy zostanie podjęta próba pełniejszego wyjaśnienia oddziaływania między tymi związkami. 
2.4. SAPONINY 
2.4.2 Diosgenina 
Diosgenina naturalnie występuje w roślinach strączkowych (Trigonella sp.) oraz w pochrzynach (Discorea sp.). Saponina ta jest używana jako substrat w przemyśle farmaceutycznym do syntezy produktów steroidowych, jak na przykład kortyzonu lub progesteronu [101, 102]. Diosgenina jest steroidową saponiną, jej część hydrofobowa składa się z spirostanolu [(25R)spirost-5-en-3b-ol], natomiast część hydrofilową stanowi grupa hydroksylowa. Saponina ta jest strukturalnie podobna do cholesterolu. Wysoka aktywność biologiczna saponiny wynika z obecności wiązania podwójnego między piątym a szóstym atomem węgla w pierścieniu B, a także z obecności dwóch reszt cukrowych, furanozy i piranozy, dołączonych kolejno do steroidowej części saponiny [103]. Wzór strukturalny z zaznaczonymi niektórymi atomami został przedstawiony na rysunku 2.14. 

Diosgenina była intensywnie badana pod kątem oddziaływania z komórkowami nowotworowymi. Działanie antynowotworowe diosgeniny wykazano w stosunku do komórek nowotworów: jelita grubego [104], piersi [105, 106], wątroby [107], kości [103], gardła oraz skóry [108]. W stosunku do komórek nowotworowych diosgenina najczęściej przyczynia się do wprowadzenia komórek na drogę apoptozy, a także blokuje cykl komórkowy między G0/G1, gdzie G0 oznacza fazę spoczynku, natomiast G1 to faza wzrostu komórki [103, 105, 107, 108, 109, 110]. Ważną aktywnością biologiczną saponiny jest ograniczenie wzrostu i proliferacji komórek nowotworowych [104, 106]. Udowodniono także, że diosgenina podnosi poziom limfocytów T regulatorych powodujących imunosupresję, a w rezultacie zmniejszenie stanu zapalnego w jelitach myszy z alergią pokarmową [102]. W Japonii został przeprowadzony eksperyment z wykorzystaniem grupy zdrowych Japończyków. Osobom z grupy badawczej podawano wyciąg z pochrzynu chińskiego (Discorea batatas) lub placebo. Eksperyment został zaplanowany jako podwójnie ślepy (double blind), badania były prowadzone naprzemiennie oraz kontrolowane poprzez użycie placebo. W wyniku przyjmowania ekstraktu z pochrzynu chińskiego bogatego w diosgeninę istotnie zwiększyły się zdolności poznawcze grupy dorosłych Japończyków [111]. 
Diosgenina została wybrana do badań powierzchniowych ponieważ tak samo jak cholesterol jest sterolem, ponadto tak samo jak cholesterol jest praktycznie nierozpuszczalna w wodzie. Jednocześnie tworzy stabilną monowarstwę na subfazie wodnej. Wyniki pomiarów izoterm diosgeniny pokazują, że cząsteczki w monowarstwie są sztywne i mają małą zdolność kompresji. Punkt załamania monowarstwy występuje przy ciśnieniu 41 mN/m [101]. 
2.4.3 Ginsenozyd Rh2 
Żeń-szeń (Panax ginseng) został odkryty około pięć tysięcy lat temu i przez wieki był stosowany w tradycyjnej medycynie chińskiej do leczenia chorób serca. W XIX wieku został sprowadzony do Europy i był wykorzystywany do leczenia między innymi reumatyzmu, anemii i bezsenności. W 1981 roku pierwszy raz przeprowadzono badania nad działaniem żeń-szenia na komórki nowowtworowe. Ważną częścią rośliny są saponiny występujące w korzeniach, liściach oraz organach generatywnych. Struktura glikozydów została określona przez grupę profesora Shibaty i nazwana Rx, gdzie indeks x zmieniał się od „a” do „h” wraz ze wzrostem hydrofobowości saponiny [112]. Ginsenozyd Rh2 jest steroidową saponiną, której aglikon jest zbudowany z dammaranu, posiadającego siedmiowęglowy łańcuch acylowy, w miejsce dwóch reszt cukrowych występujących w części acylowej digitoniny i diosgeniny. Rh2 jest monodesmosydyczną saponiną, z glikonem zbudowanym z β-D-glukopiranozydu, Rys 2.15. Ginsenozyd Rh2 charakteryzuje się 

wysoką aktywnością biologiczną, jest używany w terapii nowotworów in vitro. Badania wykazały, że saponina zatrzymuje cykl komórkowy w fazie wzrostu komórki (tak zwana faza G1), przez co ogranicza wzrost i rozwój komórek nowotworowych [113]. W przypadku nowotworu skóry, saponina hamuje wzrost komórek oraz przyśpiesza ich różnicowanie, a także powoduje zwiększenie wydzielania melaniny [112]. Doniesienia naukowe o ginsenozydzie Rh2 w terapii antynowotworowej najczęściej dotyczą kierowania komórek nowotworowych na drogę apoptozy. Przykładami nowotworów wrażliwych na działanie saponiny są komórki nowotworu płuc [113], raka wątrobowokomórkowego [114], a także nowotworu piersi [115]. 
2.4. SAPONINY 
Ginsenozyd Rh2 ma działanie przeciwstawne do większości saponin. Saponina wbudowuje się w błonę komórki zwiększając upakowanie zarówno łańcuchów hydrofobowych jak i głów polarnych. Badania wykazały, że ginsenozyd Rh2 jest mniej cytotoksyczny względem komórek 
o mniejszej zawartości cholestrolu [11]. 
Materiał badawczy i metody 
3.1 Materiały 
W niniejszej pracy do badań laboratoryjnych zostały wykorzystane następujące lipidy bło-nowe: 
• 
cholesterol (chol) o czystości > 99%, Sigma-Aldrich; 

• 
1-palmityno-2-oleinofosfatydylocholina (POPC) o czystości > 99%, Avanti Polar Lipids; 

• 
fosfatydylocholina jaja kurzego (ePC) o czystości 95%, Avanti Polar Lipids; 


• 
sfingomielina jaja kurzego (SM) o czystości > 99%, Avanti Polar Lipids; Saponiny: 

• 
digitonina (dig) o czystości 66%, Sigma-Aldrich; 

• 
diosgenina (dios) o czystości 93%, Avanti Polar Lipids; 



• 
Ginsenozyd Rh2 (Rh2) o czystości >97%, Sigma-Aldrich; Barwniki fluorescencyjne: 

• 
1,6-difenylo-1,3,5-heksatrien (DPH) o czystości 98%, Sigma-Aldrich; 

• 
6-Dodekanoilo-N,N-dimetylo-2-aminonaftalen (Laurdan) o czystości > 97%, Invitrogen; 

• 
kalceina o czystości ≥ 96%, Sigma-Aldrich; 

• 
1,2-dipalmitynofosfatydyloetanolamino-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-yl) (NBD-PE) 

o czystości > 99%, Avanti Polar Lipids; 

• 
rodamina-1,2-dioleoinofosfatydyloetanolamina (Rho-DOPE) o czystości > 99%, Avanti Polar Lipids; 




Rozpuszczalniki organiczne: 
• chloroform spektralnie czysty, o czystości >99,8%, Avanti Polar Lipids; 
42 

3.2. METODY 
• 
metanol spektralnie czysty, o czystości >99,9%, Sigma-Aldrich; 

• 
chloroform cz.d.a o czystości ≥ 98,5%, Chempur; 

• 
metanol cz.d.a o czystości ≥ 99,8%, POCh; 

• 
etanol cz.d.a o czystości 96%, POCh; 

• 
dimetylosulfotlenek (DMSO), Sigma-Aldrich; 


Rozpuszczalniki nieorganiczne: 
• woda o czystości MiliQ; 
Pozostałe: 
• 
Tris HCl, Sigma-Aldrich; 

• 
NaCl, Sigma-Aldrich; 

• 
Sephadex-G50, Sigma-Aldrich; 


W preparatyce roztworów zostały użyte rozpuszczalniki organiczne o czystości spektralnej (chloroform, metanol). W roztworach wodnych wykorzystywano ultra czystą wodę (MiliQ). Natomiast w preparatyce liposomów został użyty bufor sporządzony z 10 mM roztworu wodnego Tris HCl o pH 7,4. Zadane pH otrzymano dodając do buforu roztwór NaOH. SephadexG50 został użyty do utworzenia kolumny chromatograficznej służącej do usunięcia kalceiny znajdującej się na zewnątrz liposomów. Odczynniki o czystości cz.d.a zostały użyte do czyszczenia wagi Langmuira. 
3.2 Metody 
3.2.1 Monowarstwy Langmuira 
Szczegóły eksperymentalne 
Do wykonania pomiarów monowarstw Langmuira została użyta waga Langmuira KSV model 2000 (KSV Instruments, Helsinki). Ciśnienie powierzchniowe zostało zmierzone z wykorzystaniem metody Wilhelmiego i płytki platynowej. Potencjał powierzchniowy zmierzono z wykorzystaniem techniki wibrującej elektrody wyprodukowanej przez KSV Spot 1( KSV Instruments, Helsinki). Wanienka używana do pomiarów była wykonana z teflonu, natomiast hydrifilowe barierki zostały wykonane z derlinu. Kompresja była prowadzona symetrycznie z dwóch stron. Przed każdym pomiarem korytko było czyszczone z wykorzystaniem chloroformu i metanolu. 
Platynowa płytka była czyszczona etanolem i następnie wyprażana w płomieniu palnika. Po wypełnieniu wanny subfazą jej powierzchnia była czyszczona aż do uzyskania ciśnienia powierzchniowego mniejszego niż 0,2 mN/m. Pomiary były prowadzone w stałej temperaturze 20◦C (termostat firmy Lauda, model Re 104) i pod ciśnieniem atmosferycznym. Po wyczyszczeniu powierzchni sygnał potencjału był stabilizowany i następnie zerowany. Zadana ilość substancji była odmierzana z wykorzystaniem strzykawki Hamiltona. Na wyczyszczoną powierzchnię nakładano związek rozpuszczony w chloroformie. Pomiar rozpoczynał się po 10 min od nałożenia roztworu. Barierki były ściskane z prędkością 2,5 mm/min lub 5 mm/min. Subfazę stanowiła ultra czysta woda (miliQ), lub wodny roztwór digitoniny o stężeniu 80 µg/ml. Pomiar ciśnienia powierzchniowego odbywał się z dokładnością ± 0,2 mN/m, potencjału powierzchniowego ± 0,01 V, zaś powierzchni przypadającej na cząsteczkę w filmie monomolekularnym z dokładnością ± 0,5 Å2. Temperaturę subfazy była wyznaczana z dokładnością 0,1◦C 
Izotermy adsorpcji 
Pomiary izoterm adsorpcji były prowadzone w teflonowej zlewce, do której odmierzano 20 ml wody o czystości MiliQ. Na początku na powierzchnię subfazy nakładany był roztwór lipidu, następnie po odparowaniu rozpuszczalnika, spod filmu odciągany był 1 ml wody, i nastrzykiwany 1 ml roztworu digitoniny o stężeniu 1.6 mg/ml, w celu otrzymania stężenia końcowego 65µM (80 µg/ml). Izotermę rejestrowano przez 5000 s. 
3.2.2 Liposomy 
Preparatyka dużych liposomów jednowarstwowych (LUV) 
Do przygotowania LUV wykorzystano metodę ekstruzji liposomów wielowarstwowych (Multilamellar Vesicles, MLV) [118]. Odpowiednią ilość lipidów odmierzano z wykorzystaniem strzykawki Hamiltona i umieszczano w kolbie okrągłodennej. Następnie dodawano 60 µl mieszaniny chloroform-metanol (1:1). Rozpuszczalnik był odparowywany w wyparce obrotowej(model R Buchi Re-111, Buchi, Flawil, Szwajcaria) przez 10 min, a następnie kolbę umieszczano w eksykatorze i inkubowano przez noc. Do suchego filmu lipidowego dodawano 10 mM buforu Tris HCl zawierającego 150 mM NaCl, pH buforu wynosiło 7,4. Następnie prowadzono 5 cykli zamrażania roztworu w suchym lodzie, i następującego po nim ogrzewania do temperatury 37◦C i wytrząsania. W rezultacie otrzymywano roztwór z liposomami wielowarstwowymi, który następnie przeciskano przez ekstruder (Avanti Mini Extruder) wyposażony w filtry o średnicy porów 100 nm (Nucleopore Track-Etch Membrane). Następnie aby zweryfikować średnicę wytworzonych liposomów wykonywano pomiar metodą DLS. Kontrolowano także stężęnie fosfolipidów w roztworze z liposomami poprzez analizę ilości fosforu w próbce [119]. 
Preparatyka ogromnych liposomów jednowarstwowych (GUV) 
GUV zostały wytworzone metodą elektroformacji [120, 121]. W elektroformacji wykorzy
3.2. METODY 
stuje się komorę składającą się z dwóch szkiełek pokrytych z jednej strony tlenkiem cyny indu (ITO), pomiędzy szkiełka jest wsadzona silikonowa uszczelka. Na wewnętrzną stronę szkiełka (pokrytą ITO) nakłada się film lipidowy zawierający sondy fluorescencyjne. W procesie tworzenia GUV wykorzystywano dwie sondy fluorescencyjne. Pierwsza, Rho-DOPE była dodawana w stosunku molowym 1:1000 (znacznik fluorescencyjny: próbka). Długość fali wzbudzenia Rho-DOPE wynosiła 560 nm, natomiast długość emitowanej fali wynosiła 589 nm. Drugim znacznikiem fluorescencyjnym był NBD-PE, dodawany w stosunku molowym 
1:200 (znacznik fluorescencyjny : próbka). Długość fali wzbudzenia NBD-PE wynosiła 463 nm, natomiast emisja zachodziła przy długości fali równej 536 nm. Następnie po odparowaniu rozpuszczalnika komora wypełniana była 0,2 M roztworem sacharozy. Tak przygotowana szczelnie zamknięta komora umieszczana jest w temperaturze 60◦ i podpinana jest do prądu sinusoidalnie zmiennego o napięciu 1 V na dwie godziny. 
Inkubacja z saponinami 
Wpływ działania saponin na modelowe błony biologiczne został określony poprzez wykonanie 
różnorodnych eksperymentów na liposmach. Każdy z tych eksperymentów został poprzedzony 
inkubacją roztworu liposomów z wybraną saponiną o odpowiednim stężeniu. 
W przypadku Rh2 dodawano dwa różne stężenia, aby końcowe stężenie ginsenozydu wynosiło: 
5 µM lub 10 µM. Natomiast w przypadku digitoniny próbkę inkubowano w stężeniach 32.5 
µM (40 µg/ml) i 65 µM (80 µg/ml). 

DLS i spektroskopia 
Pomiar dynamicznego rozpraszania światła (DLS) na liposomach wykonywano na urządzeniu Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Ltd, Worecestershire, Wielka Brytania) wyposażonego w laser helowo-neonowy. Detektor był umieszczony pod kątem 173◦ w stosunku do światła padającego. Dane były zbierane z wykorzystaniem modułu analizy rozkładu rozmiaru. Do pomiaru upakowania lipidów w błonie wykorzystywano spektrofotometr luminescencyjny Perkin-Elmer LS55, który był połączony z termostatem. W pomiarach były używane próbki liposomów, w których stężenie lipidów wynosiło 5 µM. Jako pozytywna kontrola został wykorzystany 2% Triton X-100, natomiast negatywną kontrolę stanowiło DMSO. 
Znaczniki fluorescencyjne: Laurdan, DPH 
W zależności od potrzeb używane były znaczniki fluorescencyjne zestawione w tabeli 3.1. 
3.2.3 Mikroskopia fluorescencyjna 
Do badań fluorescencji GUV został użyty mikroskop konfokalny Axioskop 40 (Carl Zeiss, Jena, Niemcy), z obiektywem o powiększeniu 40x/0.75 (Zeiss EC Plan-Neofluar). Obraz był rejestrowany z wykorzystaniem kamery Nikon digital sight DS-5 M (Nikon, Tokio, Japonia). 




Tablica 3.1: Znaczniki fluorescencyjne 
DPH, difenyloheksatrien, jest to związek liniowy, lokujący się w części hydrofobowej błony biologicznej, a dokładnie między ogonami lipidowymi. Pozwala na określenie uporządkowania łańcuchów kwasów tłuszczowych w cząsteczkach lipidu. Jest używany także do wyznaczania krytycznego stężenia micelizacji, gdyż w roztworze wodnym posiada znacznie mniejszą fluorescencję niż w środowisku apolarnym. Jest bardzo dobrym narzędziem do wyznaczania temperatury przejść fazowych lipidów [62, 122]. Laurdan, dodecanodimetylaminonaftalen, to fluorofor czuły na polarność otaczającego środowiska. Jeżeli fluorofor ma kontakt z roztworem wodnym to jego fluorescencja wykazuje przesunięcie w kierunku podczerwieni w stosunku do roztworu niepolarnego. Dzięki takim właściwościom wykorzystywany jest do badania stopnia upakowania lipidów w błonie. [122]. NBD-PE cząsteczka nitrobenzoksadiazolu połączona z dipalmitynoglicerofosfoetanolaminą (DPPE), preferencyjnie lokuje się w domenach charakteryzujących się płynną fazą lipidów uporządkowanych, dodatkowo wykorzystywany jest w doświadczeniach odzyskiwania fluorescencji wygaszonej błyskiem światła (FRAP), a także jako donor w eksperymencie rezonansowego transferu energii fluorescencji (FRET) [123]. 
Rho-DOPE cząsteczka rodaminy połączona z lipidem dioleinoglicerofosfoetanolaminą, umiejscawia się w fazie lipdiów nieuporządkowanych, a także jest używana jako akceptor w eksperymencie FRET [123]. 
3.2. METODY 
Do roztworu GUV dodawano roztwór 0.2 M glukozy Tris HCl, a także saponiny, następnie inkubowano 5 min. 
3.2.4 Statyczne obliczenia kwantowo-chemiczne 
Obliczenia kwantowo-chemiczne były prowadzone w Akademickim Centrum Komputerowym CYFRONET AGH -na komputerach Zeus oraz Prometheus. Do obliczeń z użyciem formalizmu DFT wykorzystywano program Gaussian 09.D01 [67]. Badania in silico prowadzono z użyciem metod Hartree-Focka [124] i teorii funkcjonału gęstości. Obliczenia DFT wykonywano przy użyciu funkcjonału korelacyjno-wymiennego B3LYP [125], z uwzględnieniem poprawki dyspersyjnej D3 [126]. Obliczenia były prowadzone w bazach 6-31G(d) [127] oraz 6-311G(d,p) [128]. Błąd superpozycji bazy (BSSE) został wyeliminowany przez użycie poprawki „Counterpoise” zaproponowanej przez Boys’a i Bernardiego [129]. Funkcja falowa otrzymana z obliczeń DFT/B3LYP/6-311G(d,p) w programie Gaussian została użyta to wyzanczenia międzycząsteczkowych punktów krytycznych. Do określenia BCP wykorzystano program AIMALL wersja 17.01.25 [130]. 
3.2.5 Klasyczna dynamika molekularna 
Przygotowanie układu 
Układy do obliczeń MD zostały przygotowane według następującego schematu. Na początku optymalizowano geometrię cząsteczek (HF/6-31G(d)). Brakujące parametry pola siłowego obliczono za pomocą narzędzia „force field toolkit” (ffTK) [131] zaimplementowanego w programie VMD [132]. Następnie optymalne struktury zostały użyte do budowy układu składającego się z dwóch monowarstw oddzielonych od siebie taflą wody o wysokości przynajmniej 100 Å, por. rysunek 3.1. Saponiny zostały umieszczone około 3 Å pod powierzchnią monowarstwy. W symulacjach MD pod monowarstwą zostało umieszczone 8 cząsteczek digitoniny, rysunek 3.1 B. Monowarstwy cholesterolu zostały zbudowane ze 100 cząsteczek lipidu każda, warstwa wodna zawierała około 45 tysięcy cząsteczek wody. Natomiast monowarstwy wieloskładnikowe (POPC/SM i POPC/SM/CHOL) zostały zbudowane ze 106 cząsteczek i oddzielone ponad 32 tysiącami cząsteczek wody. 
Szczegóły obliczeniowe 
Obliczenia były prowadzone w Akademickim Centrum Komputerowym CYFRONET AGH na komputerze Prometheus. Do obliczeń używano pakietu NAMD2 [133] wykorzystującego pole siłowe CHARMM36 [134]. Do symulacji cząsteczek wody wykorzystano model TIP3P [135]. W obliczeniach zostały użyte trójwymiarowe periodyczne warunki brzegowe. Aby uniknąć oddziaływania między sąsiednimi replikami na osi z, repliki oddzielono 170 Å próżni, rysunek 3.1 A. Na początku przeprowadzono wstępną minimalizację energii układu, następnie przeprowadzono wstępne równowagowanie układu w zespole kanonicznym, po czym równowagowanie w docelowym zespole statystycznym i na końcu następował cykl produkcyjny obliczeń wynoszący 60 ns, prowadzony w dwóch różnych zespołach statystycznych: 

• 
stała liczba cząstek (N), stała temperatura (T ), stałe ciśnienie normalne (pN ) oraz stałe napięcie powierzchniowe (γ): NTpnγ 

• 
stała liczba cząstek (N), stała temperatura (T ), stałe ciśnienie normalne (pn) oraz stała powierzchnia (A): NTpnA 


Oddziaływania elektrostatyczne były uwzględnione stosując technikę Ewalda. Promień odcięcia oddziaływań van der Waalsa wynosił 12 Å. Zastosowano także funkcję wygładzania od odległości 10 Å. Temperatura była stała i wynosiła 293 K, ciśnienie wynosiło 1.01325 bar (1 atmosfera). W przypadku układów statystycznych NTpnγ, γ wynosiło 35, 45 lub 55 mN/m. Natomiast układy modelowane w zależności od powierzchni przyjmowały wartości A równe 45 Å2/cząsteczkę. Dynamika Langevina została zastosowana do kontroli temperatury w układzie, z parametrem tłumienia ustawionym na 5 ps. Zastosowano także zmodyfikowany tłok Nose-Hoovera Langevina [136] Wyniki były wizualizowane i analizowane w programie VMD [132]. 
Wyniki pomiarów 
Saponiny silnie oddziałują ze sterolami [7, 20, 78]. W celu dokładnego poznania mechanizmu oddziaływania digitoniny, a także ginsenozydu Rh2 ze sterolami wykonano obliczenia in si-lico, a także badania eksperymentalne. Wyniki zostaną podzielone na trzy części. W pierwszej zostaną zaprezentowane wyniki dotyczące oddziaływania cholesterolu z digitoniną. W drugiej części zostaną zaprezentowane wyniki dotyczące oddziaływania digitoniny oraz ginsenozydu Rh2 z liposomami utworzonymi z równomolowych mieszanin lipidowych, a konkretnie: 
• 
ePC / SM 

• 
ePC / SM / cholesterol 


Na końcu zostanie omówione oddziaływanie digitoniny z monowarstwami zbudowanymi z POPC/SM oraz POPC/SM/chol. 
4.1 Przygotowanie dynamiki 
Oddziaływanie cząsteczek saponiny w szczególności digitoniny z cholesterolem jest przedmiotem badań wielu laboratoriów na świecie. Powstał cały szereg teorii dotyczących tego oddziaływania [7, 8, 99, 100], jednakże mechanizm oddziaływania tych dwóch cząsteczek nie został dobrze poznany. W niniejszej pracy oprócz badań nad oddziaływaniem digitoniny z modelowymi błonami biologicznymi wykonano także badania z wykorzystaniem drugiej saponiny: ginsenozydu Rh2. Pracę nad obliczeniami z wykorzystaniem metod klasycznej dynamiki molekularnej rozpoczęto od zoptymalizowania geometrii saponin: digitoniny i ginsenozydu Rh2 używanych w badaniach ich oddziaływań z modelową błoną biologiczną. Obie saponiny zaliczane są do steroidowych saponin, jednakże mają różną zarówno część aglikonową, jak i glikonową. Część hydrofobową digitoniny stanowi spirostan, natomiast ginsenozydu Rh2 furostan. Digitonina w swojej części cukrowej posiada pięć reszt cukrowych, natomiast druga saponina tylko jedną resztę. Optymalizację przeprowadzono z użyciem programu Gaussian 09. Wykorzystano metodę Hatree-Focka w bazie 6-31G(d). Otrzymane wyniki zostały zaprezentowane na rysunku 
4.1. 
49 


Na optymalnych geometriach zostały wyznaczone objętości cząsteczkowe zdefiniowane jako objętość zawarta w izopowierzchni o wartości 0.001 elektrona/Bohr3. Dla digitoniny wartość ta wynosiła 4435 Å3 [20], natomiast dla ginsenosydu Rh2 zaledwie 2695 Å3. Wyniki są zgodne z oczekiwaniami gdyż digitonina jest cząsteczką znacznie większą od ginsenozydu Rh2. Tak zoptymalizowane cząsteczki zostały użyte do badania ich oddziaływania z monowarstwami stanowiącymi modele błon komórkowych. 
4.2 	Oddziaływanie monowarstw cholesterolu i diosgeniny z digitoniną 
W niniejszej części zostaną przedstawione wyniki badań nad oddziaływaniem digitoniny z monowarstwami cholesterolu i diosgeniny. Diosgenina jest strukturalnie bardzo podobna do cholesterolu, różni się jedynie występowaniem dwóch reszt cukrowych w miejsce łańcucha acylowego cholesterolu. Dzięki porównaniu wpływu digitoniny na monowarstwy składające się z tych dwóch związków będzie możliwe określenie roli łańcucha alifatycznego cholesterolu w oddziaływaniach z digitoniną. Zostaną zaprezentowane zarówno pomiary eksperymentalne -techniką nierozpuszczalnych monowarstw Langmuira, jak i modelowanie in silico metodą klasycznej dynamiki molekularnej. Ponadto zostaną scharakteryzowane oddziaływania między cząsteczkami digitoniny i cholesterolu, a także digitoniny i diosgeniny za pomocą metod chemii kwantowej. 
4.2. ODDZIAŁYWANIE MONOWARSTW Z DIGITONINĄ 
4.2.1 Izotermy ciśnienia powierzchniowego Π − A 
Zarówno cholesterol jak i diosgenina są związkami amfifilowymi, praktycznie nie rozpuszczalnymi w wodzie, dzięki temu cząsteczki na powierzchni wody tworzą nierozpuszczalne monowarstwy. W niniejszej pracy zostały zarejestrowane izotermy ciśnienia powierzchniowego monowarstw cholesterolu i diosgeniny na subfazie wodnej oraz wodnym roztworze digitoniny. Badania nad oddziaływaniem digitoniny z cholesterolem rozpoczęto od eksperymentalnego zbadania monowarstw cholesterolu na wodnym roztworze digitoniny o stężeniu: 65 µM, 6,5 µM, 0,65 µM. Analogicznie badania wykonano dla diosgeniny. Na rysunku 4.2 zostały zaprezentowane izotermy Π − A zarejestrowane dla cholesterolu i diosgeniny na wodzie i na wodnym roztworze digitoniny, w 20◦ C i pod ciśnieniem atmosferycznym. 

Zarejestrowana izoterma Π-A monowarstwy cholesterolu na subfazie wodnej ukazuje, że cząsteczki cholesterolu tworzą na subfazie wodnej stabilną monowarstwę. Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczono charakterystyczne parametry w punkcie załamania monowarstwy: punkt załamania monowarstwy występował przy ciśnieniu powierzchniowym równym 45,5 mN/m oraz powierzchni 37,4 Å2/cząsteczkę (por. tabela 4.1). Wyznaczono współczynnik ściśliwości monowarstwy wynoszący 953 mN/m, wartość ta sugeruje, że cząsteczki w mono-warstwie znajdowały się między stanem ciekłym skondensowanym, a stanem stałym. Izoterma cholesterolu zarejestrowana na subfazie zawierającej niskie stężenie digitoniny (0,65 µM) przesuwa się w kierunku wyższych powierzchni cząsteczkowych, co świadczy o oddziaływaniu cząsteczek digitoniny z subfazy z cząsteczkami cholesterolu tworzącymi film na powierzchni. Otrzymana w tym pomiarze monowarstwa charakteryzuje się występowaniem punktu załamania przy Π = 44,0 mN/m oraz powierzchni cząsteczkowej 48,2 Å2; parametry zostały zebrane w tabeli 4.1. Monowarstwa cholesterolu na subfazie zawierającej bardzo niskie stężenie digitoniny ma także charakter pośredni między stanem ciekłym skondensowanym a stanem stałym. Gdy stężenie digitoniny w subfazie zostało zwiększone do 6,5 µM następowała gwałtowna adsorpcja digitoniny do monowarstwy cholesterolu, o czym świadczy wysokie ciśnienie powierzchniowe zarejestrowane na początku pomiaru. W przypadku gdy stężenie digitoniny w układzie wynosiło 6,5 µM obserwowano ciągły wzrost ciśnienia powierzchniowego podczas ściskania monowarstwy. Jednocześnie brak punktu załamania monowarstwy jak również bardzo niska średnia powierzchnia przypadająca na cząsteczkę może sugerować, że digitonina adsorbując i penetrując monowarstwę bardzo zaburza uporządkowanie cząsteczek w monowarstwie. Wyznaczony maksymalny współczynnik ściśliwości wynoszący 167,8 mN/m świadczy o tym, że monowarstwa miała charakter stanu ciekłego skondensowanego. Ponadto gdy ciśnienie powierzchniowe było wyższe niż 44 mN/m wartość współczynnika ściśliwości wynosiła zaledwie 25,8 mN/m co charakteryzuje monowarstwę znajdującą się w stanie ciekłym rozprężonym. Spadek współczynnika ściśliwości od wartości 167,8 mN/m do 25,8 mN/m oznacza, że podczas ściskania zmienił się stan fizyczny monowarstwy cząsteczki na początku pomiaru były mocno upakowane i monowarstwa znajdowała się w stanie ciekłym skondensowanym. Natomiast podczas ściskania cząsteczki w filmie były mocno destabilizowane przez obecną w subfazie digitoninę co w konsekwencji doprowadziło do rozluźnienia oddziaływań międzycząsteczkowych w monowarstwie i zmianę charakteru warstwy monomolekularnej do stanu ciekłego rozprężonego. 
Tablica 4.1: Parametry charakterystyczne monowarstw. 
Cholesterol 
Diosgenina 
[DIG] 
0 µM 
0,65 µM 
6,5 µM 
65 µM 
0 µM 
0,65 µM 
6,5 µM 
65 µM 
C−1 
Smax [mN/m] 
953,0 
762,3 
167,8 
57,4 
675,2 
389,6 
116,3 
35,9 
Πcoll [mN/m] 
45,5 
44,0 
-
-
40,2 
40,6 
-
-
37,4 
48,2 
-
-
40,1 
45,3 
-
-
Acoll [Å2/cz] 

Izoterma Π-A uzyskana dla monowarstwy na subfazie zawierającej digitoninę o stężeniu 65 
µM została zarejestrowana w inny sposób niż pozostałe. Na początku wykonano dwa cykle 
histerezy do ciśnienia 30 mN/m, a następnie zarejestrowano zamieszczoną na rysunku 4.2 

4.2. ODDZIAŁYWANIE MONOWARSTW Z DIGITONINĄ 
izotermę. Postąpiono tak dlatego, że izotermy rejestrowane zaraz po nałożeniu próbki charakteryzowały się brakiem powtarzalności, a także adsorpcja digitoniny do monowarstwy była bardzo nagła i chaotyczna. Natomiast gdy cząsteczki zostały wstępnie uporządkowane otrzymywane izotermy stawały się bardziej powtarzalne. We wszystkich zbadanych filmach lipidowych znajdujących się na powierzchni subfazy roztworu digitoniny nie występował punktu załamania monowarstwy, także ciśnienie powierzchniowe monowarstwy wzrastało do wartości nieznacznie przekraczającej 30 mN/m przy bardzo niskich powierzchniach cząsteczkowych. Takie zachowanie układu świadczy o destabilizującym działaniu digitoniny na cząsteczki cholesterolu. Również bardzo niski współczynnik ściśliwości wynoszący zaledwie 57,4 mN/m pokazuje, że badana monowarstwa znajdowała się w stanie między ciekłym rozprężonym, a ciekłym skondensowanym. Izotermy zarejestrowane dla monowarstwy diosgeniny na subfazie wodnej oraz wodnym roztworze digitoniny są bardzo podobne do izoterm uzyskanych dla cholesterolu. Diosgenina jest związkiem bardzo słabo rozpuszczalnym w wodzie. Podobnie jak cholesterol tworzy na powierzchni wody stabilną monowarstwę, dla której zostały wyznaczone parametry charakterystyczne: punkt załamania monowarstwy występował przy ciśnieniu powierzchniowym równym 40,2 mN/m co odpowiadało powierzchni 40,1 Å2/cząsteczkę. Wyznaczony współczynnik ściśliwości wynosił 675,2 mN/m, co wskazywało, że monowarstwa ta podobnie jak cholesterol miała charakter pośredni między stanem ciekłym skondensowanym, a stanem stałym. Otrzymane wyniki uzyskane na subfazie wodnej są analogiczne do wyników Hao i współpracowników [101]. Diosgenina tworzy także stabilną monowarstwę na subfazie o bardzo niskim stężeniu digitoniny (0,65 µM). Izoterma Π-A jest przesunięta względem izotermy diosgeniny na subfazie wodnej w stronę wyższych powierzchni cząsteczkowych. Monowarstwa charakteryzuje się występowaniem punktu załamania przy ciśnieniu powierzchniowemu 40,6 mN/m oraz odpowiadającej mu powierzchni 45,3 Å2/cząsteczkę. Wyznaczony maksymalny współczynnik ściśliwości dla monowarstwy wynosił 389,6 mN/m co odpowiadało stanowi pośredniemu między ciekłym skondensowanym, a stanem stałym. Izoterma diosgeniny na wodnym roztworze digitoniny o stężeniu równym 0,65 µM charakteryzuje się mniejszym przesunięciem w stronę większych powierzchni cząsteczkowych i jednocześnie przebieg izotermy diosgeniny jest inny niż analogicznej izotermy cholesterolu. Podobnie jak cholesterol, diosgenina nie tworzy stabilnych monowarstw na subfazach zawierających wyższe stężenia digitoniny. W przypadku stężenia 6,5 µM obserwuje się natychmiastowy wzrost ciśnienia powierzchniowego, nie występuje punkt załamania monowarstwy oraz ciśnienie wzrasta podczas całego pomiaru. Takie zachowanie monowarstwy może świadczyć o dużym powinowactwie cząsteczek digitoniny do cząsteczek budujących monowarstwę. Prawdopodobnie cząsteczki digitoniny adsorbują i penetrują do memebrany. Ciekawe jest zachowanie monowarstwy podczas ściskania, gdyż na początku pomiaru (obszary dużych powierzchni cząsteczkowych) jak wynika z wyliczonego współczynnika ściśliwości monowarstwa ma charakter stanu ciekłego skondensowanego (CSmax=116,3 mN/m), następnie podczas dalszej kompresji monowarstwy współczynnik ściśliwości maleje do wartości zaledwie 55,0 mN/m, który odpowiada stanowi pośredniemu między stanem ciekłym rozprężonym, a ciekłym skondensowanym. Takie zachowanie monowarstwy świadczy o niezwykle silnym oddziaływaniu digitoniny z cząsteczkami diosgeniny w monowarstwie, oraz o zmniejszeniu uporządkowania cząsteczek podczas ściskania monowarstwy. Jest to zachowanie analogiczne do tego obserwowanego w przypadku monowarstwy cholesterolu. Podobnie jak w przypadku monowarstwy cholesterolu, monowarstwa diosgeniny na subfazie wodnego roztworu digitoniny o stężeniu 65 µM również została poddana na początku dwóm cyklom histerezy wymuszającej wstępne uporządkowanie cząsteczek w monowarstwie, a następnie została zarejestrowana izoterma przedstawiona na rysunku 4.2. Takie postępowanie sprawiło, że izotermy Π-A zarejestrowane na subfazie o stężeniu digitoniny 65 µM były bardziej powtarzalne. W przypadku monowarstwy diosgeniny ciśnienie powierzchniowe nie wzrasta bezpośrednio na początku pomiaru, ale dopiero przy powierzchni cząsteczkowej wynoszącej około 96 Å2. Wzrost Π jest powolny i monowarstwa osiąga ciśnienie powierzchniowe równe 32 mN/m. Monowarstwa jest mocno destabilizowana przez obecne w subfazie cząsteczki digitoniny o czym świadczy brak punktu załamania monowarstwy oraz bardzo niski współczynnik ściśliwości wynoszący jedynie 35,9 mN/m, co jest charakterystyczne dla monowarstwy znajdującej się w stanie ciekłym rozprężonym. Mimo podobnej budowy cząsteczek cholesterolu i diosgeniny, monowarstwa cholesterolu na subfazie wodnej oraz na wodnym roztworze digitoniny charakteryzuje się wyższymi parametrami współczynnika ściśliwości oraz wartości ciśnienia powierzchniowego przy którym następuje załamanie monowarstwy. Jednocześnie załamanie monowarstwy cholesterolu występuje przy niższych powierzchniach cząsteczkowych niż analogicznych monowarstw diosgeniny. Takie zachowanie świadczy o większej zdolności upakowania cząsteczek cholesterolu niż diosgeniny w monowarstwie. Ponadto cholesterol mocniej oddziałuje z digitoniną występującą w niskim stężeniu niż diosgeniną, o czym świadczy większe względne przesunięcie izotermy w stronę wyższych wartości powierzchni cząsteczkowej w stosunku do izoterm rejestrowanych na subfazie wodnej. W przypadku gdy subfazę stanowił roztwór o wyższym stężeniu digitoniny obie monowarstwy, cholesterolu i diosgeniny, były bardzo mocno destabilizowane przez obecną w subfazie digitoninę. 
4.2.2 Modelowanie MD 
Następnie wykonano modelowanie in silico metodami klasycznej dynamiki molekularnej. Sporządzono układ składający się z dwóch monowarstw umieszczonych po przeciwnych stronach pudełka z wodą. Pod każdą z monowarstw umieszczono cząsteczki digitoniny (prostopadle do normlanej monowarstwy), w odległości około 3 Å. Każda monowarstwa składała się ze 100 cząsteczek cholesterolu lub diosgeniny, natomiast pod monowarstwą znajdowało się 8 
4.2. ODDZIAŁYWANIE MONOWARSTW Z DIGITONINĄ 
cząsteczek digitoniny. Sporządzono także układ referencyjny nie zawierający digitoniny. Celem modelowania było jak najlepsze odtworzenie warunków eksperymentalnych dlatego na początku symulacja była prowadzona przy dużej powierzchni cząsteczkowej -55 Å2 przez około 35 ns. Taka powierzchnia została wybrana gdyż izotermy eksperymentalne cholesterolu i diosgeniny zarówno na subfazie wodnej, jak i na wodnym roztworze digitoniny o stężeniu 65 µM mają w tym miejscu podobne wartości ciśnienia powierzchniowego. Ponadto jest to także powierzchnia cząsteczkowa znacznie większa niż punkt załamania monowarstwy dla poszczególnych izoterm rejestrowanych na subfazie wodnej. Następnie układ był kompresowany do zadanego ciśnienia powierzchniowego: 15 mN/m, 25mN/m i 35 mN/m i dla tak dobranego ciśnienia były prowadzone obliczenia klasyczną dynamiką molekularną przez kolejne 60 ns, ostatnie 10 ns symulacji zostało użyte do analizy. 
Oddziaływanie monowarstwy cholesterolu z digitoniną 
Na rysunku 4.3 został przedstawiony układ zawierający monowarstwę cholesterolu z digitoniną ściśnięte do ciśnienia 25 mN/m (A i B) oraz 35 mN/m (C i D). Wyniki z analizy mono-warstwy cholesterolu przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m nie zostały przedstawione, gdyż w monowarstwie stworzył się olbrzymi stabilny por, zajmujący około jednej trzeciej powierzchni. Przyczyną powstawania porów w monowarstwie mógł być zastosowany w obliczeniach model wody powodujący zaniżenie napięcia powierzchniowego względem układu rzeczywistego. Ponadto duże zagęszczenie cząsteczek w monowarstwie sugeruje, że oddziaływania międzycząsteczkowe części hydrofobowych cholesterolu i dążenie do unikania kontaktu z wodą jest bardzo silne. Monowarstwy skompresowane do wyższych ciśnień powierzchniowych zostały przedstawione na rysunku 4.3. Rzuty monowarstw z góry i z boku przedstawiają ułożenie cząsteczek w monowarstwie. Monowarstwy skompresowane do obu badanych ciśnień powierzchniowych wyglądają bardzo podobnie. Widać wyraźnie, że cząsteczki cholesterolu są mocno zorganizowane i zajmują całą dostępną powierzchnię. Natomiast cząsteczki digitoniny penetrują monowarstwę swoimi częściami aglikonowymi lub są zaadsorbowane pod powierzchnią monowarswy. Część glikonowa digitoniny zawsze znajduje się w subfazie wodnej. Wszystkie cząsteczki digitoniny znajdują się w pobliżu monowarstwy i z nią oddziałują, co świadczy o dużym powinowactwie cząsteczek digitoniny do monowarstwy cholesterolu. W celu dokładniejszego poznania lokalizacji cząsteczek w monowarstwie zostały sporządzone profile gęstości charakterystycznych punktów w cząsteczkach. Profil gęstości jest to histogram położeń na osi z zdefiniowanych grup funkcyjnych obliczony po wszystkich cząsteczkach w układzie oraz po zadanej ilości klatek trajektorii. Na rysunku 4.4 przedstawiono profile gęstości grup funkcyjnych oraz środka masy części aglikonowej digitoniny. W przypadku monowarstwy skompresowanej do ciśnienia powierzchniowego 25 mN/m widoczna jest różnica między sygnałami pochodzącymi od badanej monowarstwy cholesterolu z digitoniną (sygnał od grupy izopropylowej i hydroksylowej cholesterolu) i jej referencji (monowarstwy na subfazie wodnej). Cząsteczki w układzie referencyjnym są 

4.2. ODDZIAŁYWANIE MONOWARSTW Z DIGITONINĄ 

bardziej uporządkowane, niż te w układzie z digitoniną o czym świadczy większa gęstość grup funkcyjnych pochodzących od cholesterolu odpowiadająca danemu położeniu na osi x. Sygnały pochodządze z układu referencyjnego mają mniejszą szerokość połówkową a także są wyższe niż w układzie zawierającym cząsteczki digitoniny. Część hydrofobowa digitoniny albo penetruje wnętrze błony, albo znajduje się tuż pod jej powierzchnią. Interesujące jest to, że nie obserwuje się etapu częściowej penetracji -środek masy części hydrofobowej digitoniny znajduje się albo w okolicach środka monowarstwy cholesterolu albo w okolicy grup hydroksylowych cholesterolu. Grupy hydroksylowe pochodzące od cukrów są zanurzone w wodzie i albo oddziałują z grupami hydroksylowymi cholesterolu albo z otaczającymi cząsteczkami wody. Między monowarstwami cholesterolu przy ciśnieniu powierzchniowym wynoszącym 35 mN/m nie występuje różnica w wysokościach i szerokościach sygnałów od grup funkcyjnych cholesterolu, co może sugerować, że przy tak wysokim ciśnieniu digitonina nie ma wpływu na uporządkowanie cząsteczek cholesterolu w monowarstwie. Środki masy części hydrofobowej digitoniny znajdują się we wnętrzu monowarstwy, co wskazuje na penetrację części hydrofobowej digitoniny w monowarstwę cholesterolu, a także w okolicach grup hydroksylowych cholesterolu co pokazuje, że niektóre cząsteczki digitoniny adsorbują się do monowarstwy od strony subfazy wodnej. Część glikonowa tak samo jak w przypadku niższego ciśnienia znajduje się pod powierzchnią wody. W następnym kroku rozważano uporządkowanie cholesterolu w monowarstwie. Do tego celu został wyznaczony wektor cząsteczki cholesterolu między atomem węgla C3 a C17 (rys 2.4). Następnie zbadano rozkład nachylenia wyżej wspomnianego wektora do normalnej monowarstwy. Wyniki zostały przedstawione na rysunku 4.5. 

A: Π = 25 mN/m, rysunek B: Π = 35 mN/m. Pomiar prowadzony był tylko dla górnej monowarstwy, wyniki dla dolnej są analogiczne. Linią ciągłą oznaczono układ zawierający digitoninę, linią przerywaną układ referencyjny. 
Rozkład kąta nachylenia cholesterolu do normalnej monowarstwy jest inny w układzie zawierającym cząsteczki digitoniny niż w przypadku monowarstwy referencyjnej. Przy ciśnieniu powierzchniowym 25 mN/m sygnał pochodzący od cząsteczek cholesterolu w układzie referencyjnym jest wyższy i węższy, niż analogiczny sygnał z układu zawierającego digitoninę. Ponadto w obecności digitoniny w monowarstwie można zaobserwować cząsteczki cholesterolu nachylone pod kątami około 48◦, ustawienie cząsteczek w układzie referencyjnym jest znacznie bardziej homogeniczne. Monowarstwy ściśnięte do ciśnienia powierzchniowego 35 mN/m charakteryzowały się podobnym ustawieniem cząsteczek w monowarstwie. Sygnał pochodzący od układu referencyjnego posiadał maksimum nieznacznie przesunięte w stronę niższych kątów względem układu z digitoniną. Cząsteczki cholesterolu były nachylone średnio około 9◦ do normalnej monowarstwy w układzie odniesienia, natomiast w układzie z digitoniną o 12◦ do normalnej. Gdy w układzie występowała digitonina rozkład kąta nachylenia cholesterolu nie był symetryczny, więcej cząsteczek było nachylonych pod większymi kątami do normalnej monowarstwy niż w analogicznym układzie odniesienia. W następnym kroku analizy oddziaływań między monowarstwą cholesterolu i cząsteczkami digitoniny zbadano wpływ digitoniny na uwodnienie grup hydroksylowych sterolu. Wyniki zostały zestawione na rysunku 4.6. 
W obu badanych ciśnieniach wpływ digitoniny na monowarstwę cholesterolu jest praktycznie identyczny, dlatego oba rysunki zostaną omówione łącznie. Z rysunku 4.6 widać że, obecność digitoniny bardzo nieznacznie obniżała liczbę cząsteczek wody występujących w pierwszej sferze hydratacyjnej w stosunku do układu odniesienia. Więcej cząsteczek wody znajdowało się w kolejnych sferach hydratacyjnych grupy hydroksylowej cholesterolu gdy w układzie nie 
4.2. ODDZIAŁYWANIE MONOWARSTW Z DIGITONINĄ 

było digitoniny, niż gdy saponina była obecna. 
Kolejnym etapem badań będzie stworzenie układu porównawczego, gdzie monowarstwę będą 
tworzyły cząsteczki diosgeniny. Taki model pozwoli na określenie znaczenia łańcucha alifatycznego cholesterolu na oddziaływanie sterolu z digitoniną. 

Oddziaływanie monowarstwy diosgeniny z digitoniną 
Po znalizowaniu układu zawierającego cholesterol przystąpiono do modelowania układu porównawczego. W układzie tym monowarstwa była zbudowana z cząsteczek diosgeniny, natomiast cząsteczki digitoniny były umieszczone w subfazie wodnej. Symulacja była prowadzona analogicznie do poprzedniego układu. Na rysunku 4.7 zostały przedstawione projekcje monowarstw z góry i z boku. Monowarstwa diosgeniny charakteryzuje się większym nieuporządkowaniem niż monowarstwa cholesterolu. Na projekcji z góry na monowarstwy jest widoczne, że cząsteczki diosgeniny bardzo często są odchylone w stosunku do normalnej. W przeciwieństwie do monowarstwy cholesterolu cząsteczki diosgeniny zajmują całą dostępną powierzchnię w każdym ze zbadanych ciśnień powierzchniowych. Ponadto między cząsteczkami tworzącymi membranę zaobserwowano nieliczne molekuły wody (Rysunek 4.7 C). Wynika to z obecności atomów tlenu w pierścieniach cząsteczki diosgeniny. Cząsteczki digitoniny adsorbują i penetrują do monowarstwy skompresowanej do trzech badanych ciśnień powierzchniowych. W przypadku najniższego Π cząsteczki digitoniny zaczynają penetrować membranę swoimi częściami hydrofobowymi, jednakże z rzutu bocznego widać, że część aglikonowa digitoniny nie penetruje monowarstwy w pełni, ale niektóre cząsteczki wchodzą do monowarstwy jedynie do połowy długości części hydrofobowej. Część hydrofilowa cząsteczek digitoniny jest zanurzona w wodzie, a także oddziałuje z grupami hydroksylowmi 

Rysunek 4.7: Model monowarstwy diosgeniny z digitoniną. A,B -monowarstwa przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m; C,D: Π = 25mN/m; E,F: Π = 35mN/m. Cząsteczki wody penetrujące monowarstwę przy ciśnieniu powierzchniowym 25 mN/m zostały przedstawione na powiększeniu rysunku C. Dla większej przejrzystości rysunku z diosgeniny zostały usunięte atomy wodoru. Kolory użyte na rysunku: diosgenina -szary, grupa hydroksylowa diosgeniny-czerwony, część hydrofobowa digitoniny -żółty, reszty cukrowe digitoniny -różowy, woda -cyjan. 
4.2. ODDZIAŁYWANIE MONOWARSTW Z DIGITONINĄ 
diosgeniny. W przypadku gdy monowarstwa była ściśnięta do ciśnienia powierzchniowego 25 mN/m cząsteczki digitoniny penetrują monowarstwę swoimi częściami aglikonowymi, części cukrowe są zanurzone w subfazie wodnej. Jednakże, wydaje się, że dzięki słabemu uporządkowaniu w monowarstwie niektóre reszty cukrowe mogą przesuwać się w kierunku monowarstwy i penetrować ją w niewielkim stopniu. Zachowanie monowarstwy przy ciśnieniu powierzchniowym 35 mN/m jest analogiczne do monowarstwy ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego 25 mN/m. Cząsteczki digitoniny penetrują monowarstwę diosgeniny swoimi częściami hydrofobowymi, ugrupowania glikonowe są zanurzone w subfazie wodnej. Cząsteczki w monowarstwie wydają się bardziej upakowane niż w przypadku Π równego 15 mN/m. 
W celu głębszego zrozumienia organizacji cząsteczek w monowarstwie, w następnym kroku analizy zostaną przedstawione profile gęstości wybranych grup funkcyjnych cząsteczek diosgeniny i digitoniny oraz cząsteczek wody, obliczenia wykonano dla układu zawierającego digitoninę oraz w układzie referencyjnym dla wszystkich trzech badanych ciśnień: 15 mN/m, 25 mN/m, 35 mN/m, rysunek 4.8. Jak już wspomniano wcześniej cząsteczki wody penetrowały monowarstwę diosgeniny. Jest to pierwsza z różnic w zachowaniu układu zbudowanego z diosgeniny względem układu cholesterolowego. Monowarstwa diosgeniny jest także bardziej zanurzona w subfazie wodnej w stosunku do membrany cholesterolowej, o czym świadczy występowanie profilu gęstości grupy hydroksylowej diosgeniny kilka angstremów poniżej granicy międzyfazowej układu. W monowarstwie ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m penetracja cząsteczek wody w monowarstwę jest największa. W przypadku monowarstwy referencyjnej woda penetruje praktycznie w całej grubości monowarstwy. Natomiast w układzie zawierającym cząsteczki digitoniny więcej cząsteczek wody znajduje się w okolicach reszt cukrowych diosgeniny niż w najbardziej hyrofobowej części cząsteczki (między atomem węgla C3 a C17). Profile gęstości wyznaczają granice monowarstwy: profil gęstości od grupy hydroksylowej (kolor czarny) i terminalnej grupy metylowej (kolor czerwony) cząsteczki diosgeniny. Część aglikonowa (różowy) i grupy hydroksylowe z ugrupowań glikonowych (niebieski) zanajdują się w pobliżu monowarstwy. Na otrzymanym profilu gęstości widać, że różowy sygnał znajduje się zarówno we wnętrzu monowarstwy, jak i tuż pod jej powierzchnią na granicy międzyfazowej układu. Sugeruje to, że część aglikonowa digitoniny penetruje w monowarstwę diosgeniny, występują także cząsteczki digitoniny całkowicie zanurzone w subfazie wodnej ale znajdujące się bardzo blisko monowarstwy. Reszty cukrowe znajdują się w subfazie wodnej. Profile gęstości otrzymane dla monowarstwy ściśniętej do ciśnienia 25 mN/m (rysunek 4.8 B) pokazały, że cząsteczki diosgeniny w monowarstwie są bardziej uporządkowane -sygnały pochodzące zarówno od grupy hydroksylowej jak i terminalnej grupy metylowej diosgeniny są węższe i wyższe, w stosunku do sygnałów pochodzących z monowarstwy przy ciśnieniu powierzchniowym równym 15 mN/m. Ponadto większość cząsteczek, a konkretnie ich części aglikonowych penetruje do monowarstwy, tylko nieznaczna frakcja pozostaje w całości zanurzona w subfazie wodnej. Tak samo jak w poprzedniej omówionej symulacji reszty cukrowe znajdują się w subfazie wodnej. Cząsteczki monowarstwy ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego równego 35 mN/m (rysunek 4.8 C) są mniej uporządkowane niż w przypadku niższego ciśnienia i swojego układu 

4.2. ODDZIAŁYWANIE MONOWARSTW Z DIGITONINĄ 
referencyjnego. Profile gęstości środka masy części hydrofobowej digitoniny rozdziela się na kilka niezależnych maksimów, maksimum o największej powierzchni znajduje się w środku monowarstwy sugerując, że część cząsteczek digitoniny, a konkretnie jej części aglikonowej penetruje monowarstwę. Występują także dwa mniejsze sygnały znajdujące się w pobliżu grup hydroksylowych diosgeniny oraz pod powierzchnią monowarstwy co świadczy, że niektóre cząsteczki są w całości zanurzone w subfazie. Wyniki otrzymane dla trzech rejestrowanych ciśnień powierzchniowych sugerują, że części aglikonowe cząsteczek digitoniny na początku są wciągane do monowarstwy: powierzchnie sygnałów dla części aglikonowej digitoniny są podobne we wnętrzu monowarstwy jak i pod jej powierzchnią przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m, następnie przy ciśnieniu 25 mN/m większość cząsteczek digitoniny, a konkretnie jej części aglikonowej jest wciągane do wnętrza monowarstwy. Na granicy międzyfazowej układu występuje tylko nieliczna frakcja cząsteczek digitoniny. Natomiast przy ciśnieniu 35 mN/m następuje wypychanie niektórych cząsteczek digitoniny z monowarstwy: obserwuje się podział, połowa cząsteczek digitoniny penetruje monowarstwę częściami aglikonowymi, natomiast druga połowa znajduje się pod powierzchnią monowarstwy. Taki wynik jest zgodny z wynikami eksperymentalnymi wykazującymi, że cząsteczki są wypychane z monowarstwy do subfazy wodnej. W celu lepszego zrozumienia uporządkowania cząsteczek w monowarstwie zbadano rozkład kątów nachylenia wektorów diosgeniny wyznaczonych między atomem węgla C3 a C17, do normalnej monowarstwy. Wyniki zaprezentowano na rysunku 4.9. 

A: Π = 15 mN/m, B:Π =25 mN/m C: Π = 35 mN/m. Pomiar prowadzony był tylko dla górnej monowarstwy, wyniki dla dolnej są analogiczne. Linią ciągłą oznaczono układ zawierający digitoninę, linią przerywaną układ referencyjny. 
Pomiary rozkładu kąta nachylenia cząsteczek w monowarstwie przy ciśnieniu 15 mN/m wykazały niewielką różnicę w nachyleniu cząsteczek diosgeniny w układzie zawierającego digitoninę względem układu referencyjnego. Cząsteczki diosgeniny w układzie zawierającym drugą saponinę najczęściej były nachylone do normalnej monowarstwy pod kątami 22◦ i 40◦. Natomiast w układzie referencyjnym cząsteczki były nachylone głównie pod kątem 25◦. Co ciekawe w obu układach obserwuje się niewielką populację cząsteczek nachylonych między 60◦ a 90◦, w układzie referencyjnym jest ona liczniejsza niż w układzie z digitoniną. 
W przypadku monowarstw ściśniętych do ciśnienia powierzchniowego 25 mN/m zaobserwowano, że obecność digitoniny wpływa stabilizująco na układ. Cząsteczki w monowarstwie były nachylone pod kątem 24◦ do normalnej. Występowała także niewielka populacja cząsteczek nachylona pod kątem między 50◦ a 60◦. W przypadku monowarstwy referencyjnej większość cząsteczek jest nachylona pod kątem około 22◦. Tak samo jak w przypadku niższego ciśnienia występują w układzie cząsteczki nachylone między 50◦ a 90◦. Cząsteczki w monowarstwie skompresowanej do 35 mN/m były najbardziej upakowane i uporządkowane w monowarstwie, ich kąty nachylenia względem normalnej monowarstwy wynosiły 18◦ dla układu referencyjnego, oraz 24◦ dla układu z digitoniną. W obu układach widoczne było występowanie populacji cząsteczek nachylonych między 50◦ a 90◦ do normalnej. Jednakże liczba takich cząsteczek była mniejsza niż w układach o niższym ciśnieniu powierzchniowym. 

Następnie wyliczono całkę po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par między atomami tlenu z grupy hydroksylowej diosgeniny i cząsteczkami wody, rysunek 4.10. W każdym z rozważanych ciśnień powierzchniowych uwodnienie grupy -OH diosgeniny jest takie samo dla układów zawierających digitoninę, układy referencyjne w trzech różnych ciśnieniach powierzchniowych również zachowują się bardzo podobnie. We wszystkich układach uwodnienie grup hydroksylowych diosgeniny jest większe w przypadku układów referencyjnych niż w układach zawierających digitoninę. Ilość tworzonych wiązań wodorowych między grupami -OH a wodą jest nieznacznie mniejsza w układach zawierających digitoninę niż w układach referencyjnych. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że digitonina adsorbując się do powierzchni monowarstwy oddziałuje z grupami -OH cholesterolu, przez co zmniejsza ich dostępność dla cząsteczek wody. 
4.2. ODDZIAŁYWANIE MONOWARSTW Z DIGITONINĄ 
4.2.3 	Porównanie oddziaływania digitoniny z monowarstwami cholesterolu i monowarstwami diosgeniny 
W badaniach eksperymentalnych zostały zbadane monowarstwy cholesterolu i diosgeniny na subfazie wodnej i wodnym roztworze digitoniny o stężeniach: 0,65 µM, 6,5 µM oraz 65 µM. Oba układy zachowują się bardzo podobnie. Stabilne monowarstwy są tworzone jedynie na subfazie wodnej i wodnym roztworze digitoniny o stężeniu 0,65 µM. Monowarstwa cholesterolu jest bardziej przesunięta w stronę wyższych powierzchni cząsteczkowych względem analogicznej monowarstwy zbudowanej z diosgeniny. Jednocześnie jest bardziej skondensowana, 
o czym świadczy prawie dwukrotnie wyższy współczynnik ściśliwości. Obie monowarstwy nie tworzą stabilnych izoterm na wyższych stężeniach digitoniny. Przy stężeniu 6,5 µMw obu układach widać gwałtowną adsorpcję i penetrację digitoniny do badanej monowarstwy, tak, że ciśnienie powierzchniowe wzrasta do prawie 70 mN/m. W przypadku najwyższego badanego stężenia saponiny, cząsteczki monowarstwy musiały być wstępnie porządkowane przez dwa cykle histerezy zanim otrzymano powtarzalne wyniki. Jednocześnie monowarstwy nie tworzyły stabilnych izoterm Π-A, co wskazywało na destrukcyjne działanie digitoniny na film powierzchniowy. Badania eksperymentalne zostały uzupełnione o modelowanie in silico. Uzyskano następujące wyniki. Digitonina penetruje monowarstwy swoją częścią hydrofobową, może to być penetracja całą częścią aglikonową do wnętrza monowarstwy, jak również penetracja gdy tylko część aglikonu znajdowała się w membranie. Poza cząsteczkami digitoniny penetrującymi błonę, występowały także cząsteczki adsorbujące pod powierzchnią membrany. N.Frenkel i współpracownicy [8] wykazali że cząsteczki digitoniny adsorbują do błony liposomów z SOPC (stearynooleinofosfatydylocholina) i cholesterolu. Cząsteczki digitoniny tworzyły pod powierzchnią błony dodatkową warstwę oddziałującą z błoną. Taki wynik dobrze koreluje z wykonanymi przeze mnie symulacjami, w którym można zaobserwować, że zarówno całe cząsteczki, jak również jedynie ugrupowania glikonowe lokują się pod powierzchnią błony oddziałując z nią. 
Monowarstwa cholesterolu jest bardziej uporządkowana niż monowarstwa diosgeniny. Cząsteczki cholesterolu ściśnięte nawet do niskiego ciśnienia powierzchniowe są mocno upakowane w monowarstwie, ograniczając jak najbardziej swój kontakt z wodą, jedynie grupa hydroksylowa cholesterolu jest zanurzona w subfazie wodnej. Natomiast cząsteczki w monowarstwie diosgeniny są znacznie mniej uporządkowane, zawsze zajmują całą dostępną powierzchnię, również dwie reszty cukrowe występujące w miejscu, gdzie cholesterol posiada łańcuch acylowy, mają kontakt z cząsteczkami wody. Nachylenie cząsteczek budujących monowarstwy zostało zaprezentowane na rysunku 4.11, natomiast wartości rozkładu kąta nachylenia cząsteczek do normalnej zostały zebrane w tabeli 4.2. Digitonina ma wpływ na uporządkowanie i kąt nachylenia cząsteczek w monowarstwie, destabilizuje cząsteczki w monowarstwie zwiększając ich kąt nachylenia względem normalnej, co jest zgodne z wynikami eksperymentalnymi. 

W literaturze zostało pokazane, że modelowe błony biologiczne zawierające w swoim składzie cząsteczki cholesterolu są destabilzowane w obecności saponin [8, 7]. 
Tablica 4.2: Porównanie kątów nachylenia cząsteczek w monowarstwie. 
Cholesterol  Diosgenina  
referencja  z digitoniną  referencja  z digitoniną  
Π = 25 mN/m  9◦  11◦  23◦  25◦  
Π = 35 mN/m  8◦  11,5◦  15◦  25  

Następnie w celu analizy uwodnienia grup hydroksylowych cząsteczek budujących monowarstwy wykonano całki po trzech wymiarach z radialnej funkcji dystrybucji par, rysunek 4.12. Wyniki pokazały, że liczba cząsteczek wody w pierszej sferze hydratacyjnej grup -OH cholesterolu i diosgeniny nie zmienia się w obecności digitoniny. Natomiast zmienia się liczba cząsteczek wody znajdujących się w kolejnych sferach hydratacyjnych badanej grupy funkcyjnej. W przypadku gdy digitonina jest obecna, mniej cząsteczek wody znajduje się w okolicy badanej grupy hydroksylowej. Świadczy to o adsorpcji digitoniny do powierzchni monowarstwy i prawdopodobnym oddziaływaniu grup hydroksylowych reszt cukrowych digitoniny z grupą hydroksylową cząsteczek budujących monowarstwę. Uwodnienie cząsteczek w monowarstwach cholesterolu i diosgeniny przy obecności digitoniny w układzie jest prawie identyczne. Taki sam wynik otrzymano dla obu monowarstw referencyjnych. Jednakże widać wyraźnie, że występuje różnica w uwodnieniu między układem nie zawierającym digitoniny, a tym gdzie saponina jest obecna. Z wykonanych badań można wyciągnąć następujące wnioski. Wyniki otrzymane z eksperymentu jak i z symulacji teoretycznych są ze sobą zgodne i pokazują, że digitonina adsorbuje do monowarstwy i penetruje zarówno monowarstwę cholesterolu jak i diosgeniny. Świadczy 
4.3. POMIARY PRZY STAŁEJ POWIERZCHNI 

to o dużym wpływie pierścieni steroidowych połączonych z grupą hydroksylową przy atomie węgla w pozycji C3 na oddziaływanie z digitoniną. Wniosek ten jest w zgodzie z pracą profesora Takagi i współpracowników, w której zostało pokazane, że pierścienie steroidowe występujące w cholesterolu oraz ich oddziaływanie z digitoniną jest przyczyną powstawania kompleksu między tymi dwoma cząsteczkami. [100]. Ponadto obecność łańcucha alifatycznego cholesterolu stabilizuje cząsteczki digitoniny zakotwiczone w błonie, co jest efektem przeciwnym do badanej monowarstwy diosgeniny gdzie cząsteczki digitoniny są wypychane z monowarstwy wraz ze wzrastającym ciśnieniem powierzchniowym. 
4.3 Pomiary przy stałej powierzchni 
W kolejnym kroku badań nad oddziaływaniem digitoniy z cholesterolem wykonano izotermy adsorpcji digitoniny do monowarstw cholesterolu oraz diosgeniny. W analogii do badań eksperymentalnych wykonano symulacje metodami in silico. Obliczenia dla monowarstw cholesterolu i diosgeniny prowadzono w warunkach stałej powierzchni wynoszącej 45 Å2/cząsteczkę. Powierzchnia ta została wybrana ponieważ monowarstwy cholesterolu jak i diosgeniny znajdują się w fazie ciekłej skondensowanej. Cząsteczki w monowarstwie oddziałują ze sobą, a także są już dobrze uporządkowane. Tak samo jak w poprzednim modelu wykonano symulacje dla układów zawierających cząsteczki digitoniny oraz układów referencyjnych. Symulacje prowadzono przez 60 ns, ostatnie 10 ns zostało wzięte do analizy. 
4.3.1 Izotermy adsorpcji 
Modelowe błony biologiczne mogą zostać poprawnie odtworzone w badaniach z wykorzystaniem izoterm adsorpcji. Są to badania nad monowarstwami ściśniętymi do zadanego ciśnienia powierzchniowego, w badaniach biologicznych jest to zwykle ciśnienie powierzchniowe odpowiadające temu występującemu w natywnych błonach komórkowych, czyli między 27 a 35 mN/m [11]. Pod tak uformowaną błonę wstrzykiwana jest substancja oddziałująca membraną. Rysunki 4.13 A i C przedstawiają izotermy adsorpcji digitoniny do monowarstw cholesterolu (A) i diosgeniny (C), ciśnienia początkowe monowarstw zostały znormalizowane do 0, na wykresie przedstawiono jedynie efekt działania digitoniny na badane monowarstwy. Natomiast rysunki 4.13 B i D przedstawiają wyznaczone ciśnienia wysycenia monowarstwy czyli ΔΠ przy której nie następuje dalsze oddziaływanie badanej substancji z monowarstwą, bądź nie występuje dalsza penetracja badanej substancji do monowarstwy. Ciśnienie wysycenia jest wyznaczane poprzez ekstrapolację dopasowanej prostej do zależności zmiany ciśnienia powierzchniowego (ΔΠ) w funkcji ciśnienia początkowego (Π0) [139]. 

4.3. POMIARY PRZY STAŁEJ POWIERZCHNI 
W obu układach, cholesterolu i diosgeniny zbadano oddziaływanie digitoniny z monowarstwami dla siedmiu różnych ciśnieniach początkowych. W przypadku cholesterolu zakres Π0 wynosił od 7 mN/m do 32 mN/m, natomiast w przypadku diosgeniny od 12 mN/m do 24 mN/m. Pomiary w różnych warunkach ciśnienia powierzchniowego służyły do wyznaczenia ciśnienia wysycenia monowarstwy, rysunek 4.13 B i D. Po ustabilizowaniu ciśnienia początkowego monowarstwy do subfazy została wprowadzona digitonina. W tym momencie ciśnienie powierzchniowe znacząco wzrosło i po kilkudziesięciu sekundach osiągnęło maksymalną wartość, która była stała dla monowarstw cholesterolu, lub zaczynała powoli spadać w przypadku monowarstw utworzonych z diosgeniny. Monowarstwy cholesterolu charakteryzują się większym wzrostem ciśnienia powierzchniowego w obecności digitoniny, niż odpowiadające im monowarstwy diosgeniny. Ponadto digitonina oddziałuje gwałtownie z cząsteczakmi cholesterolu, następnie ustala się stan równowagi zobrazowany jako plateau na wykresie izoterm adsorpcji. Jedynie w przypadku początkowego ciśnienia powierzchniowego wynoszącego 19 mN/m obserwowany jest wolniejszy proces adsorpcji digitoniny do membrany cholesterolowej. Ciśnienie wysycenia monowarstwy zostało wyznaczone poprzez ekstrapolację prostej regresji do osi odciętych i wynosiło 68,4 mN/m. Digitonina oddziałuje z monowarstwami diosgeniny o różnych początkowych ciśnieniach powierzchniowych, oddziaływanie to jest bardzo szybkie ale wolniejsze niż oddziaływanie digitoniny z monowarstwą cholesterolu. Następnie monowarstwy diosgeniny osiągają stan wysycenia. Jednakże w przypadku monowarstw diosgeniny po wysyceniu monowarstwy nie jest obserwowany stan równowagi jak w przypadku monowarstw cholesterolu ale następuje powolna desorpcja cząsteczek z monowarstwy do fazy objętościowej czego dowodem jest spadek wartości ciśnienia powierzchniowego w czasie. Również ciśnienie wysycenia monowarstwy jest niższe niż w przypadku cholesterolu i wynosi jedynie 49,0 mN/m, co sugeruje, że mniej cząsteczek digitoniny może penetrować monowarstwę diosgeniny niż cholesterolu. Wynika to prawdopodobnie z różnic w budowie cząsteczek cholesterolu i diosgeniny. 
4.3.2 Modelowanie MD -układ cholesterol -digitonina 
W celu lepszego zrozumienia interakcji digitoniny i cholesterolu wykonano modele teoretyczne monowarstw. W niniejszej symulacji monowarstwa na początku została skompresowana do powierzchni cząsteczkowej 45 Å2, następnie pod monowawarstwą zostały umieszczone cząsteczki digitoniny. Obliczenia z wykorzystaniem klasycznej dynamiki molekularnej były prowadzone przy stałej powierzchni przez 60 ns, ostatnie 10 ns zostało wzięte do analizy. Na rysunku 4.14 została przedstawiona monowarstwa cholesterolu, projekcja z góry (4.14 A) i z boku (4.14 B). Na rysunkach 4.14 A i B widać, że cząsteczki są ściśle upakowane w monowarstwie. Tak samo jak w poprzednim modelu cząsteczki cholesterolu orientują się na powierzchni wody, unikając z nią kontaktu. Jedynie grupa hydroksylowa jest zanurzona w subfazie wodnej. Digitonina tak jak w poprzednim modelu posiada duże powinowactwo do cząsteczek cholesterolu w monowarstwie i znajduje się albo bezpośrednio pod powierzchnią membrany albo penetruje ją częścią aglikonową, część glikonowa zanurzona jest w subfazie wodnej. 


Rysunek 4.15: A:Profile gęstości monowarstwy cholesterolu skompresowanej do powierzchni cząsteczkowej 45Å. Na rysunku został przedstawiony tylko pomiar dla górnej monowarstwy, wyniki dla dolnej są analogiczne. Linią ciągłą oznaczono układ zawierający digitoninę, linią przerywaną układ referencyjny. Kolory: czerwony -grupa izopropylowa cholesterolu, czarny -OH cholesterolu, magenta -środek masy części hydrofobowej digitoniny, niebieski -OH z reszt cukrowych digitoniny, jasnoniebieski -woda. B: Całka po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par między grupą -OH cholesterolu a grupami -OH z reszt cukrowych digitoniny. 
4.3. POMIARY PRZY STAŁEJ POWIERZCHNI 
Następnie w celu dokładniejszego poznania lokalizacji cząsteczek w monowarstwie wyznaczono profile gęstości charakterystycznych grup funkcyjnych w cząsteczkach układu. Wyniki zostały przedstawione na rysunku 4.15. Profile gęstości grup funkcyjnych w cząsteczkach układu wykazały, że sygnały pochodzące od cząsteczek cholesterolu w układzie zawierającym digitoninę są przesunięte w stronę subfazy wodnej względem analogicznych sygnałów pochodzących od układu referencyjnego. Takie wyniki oznaczają, że cząsteczki cholesterolu są nieznacznie bardziej zanurzone w subfazie wodnej w przypadku monowarstwy referencyjnej niż w układzie zawierającym digitoninę. Sygnały otrzymane dla terminalnego izopropylu oraz grupy hydroksylowej cholesterolu dla układu zawierającego saponinę są odrobinę wyższe i węższe w stosunku do odpowiadających im sygnałów z monowarstwy referencyjnej. Środki masy części hydrofobowej digitoniny zarówno penetrują monowarstwę, jak i adsorbują pod jej powierzchnią. Sygnały pochodzące od grup hydroksylowych reszt cukrowych digitoniny występują jedynie w subfazie wodnej. Sugeruje to, że część glikonowa saponiny zanurzona jest w wodzie i oddziałuje zarówno z cząsteczkami subfazy jak i z grupami hydroksylowymi cholesterolu. Następnie w celu jednoznaczego potwierdzenia oddziaływania między grupami hydroksylowymi cholesterolu i grupami hydroksylowymi reszt cukrowych digitoniny wyliczono całkę po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par. Wyniki zaprezentowane na rysunku 4.15 B, dowodzą, że wspomniane wyżej grupy funkcyjne sterolu i saponiny znajdują się w odległości około 3 Å, co potwierdza możliwość tworzenia wiązań wodorowych między badanymi grupami funkcyjnymi. 

Następnie zbadano uporządkowanie cząsteczek cholesterolu w monowastwie, w tym celu wykonano pomiar rozkładu kąta nachylenia molekuł budujących membranę, a także obliczono całkę po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par między grupami hydroksylowymi cholesterolu a cząsteczkami wody. Wyniki zostały przedstawione na rysunku 4.16. Rozkład kąta nachylenia wektora cholesterolu zdefiniowanego pomiędzy atomami węgla C3 i C17 wykazał, iż cząsteczki cholesterolu w monowarstwie referencyjnej są nachylone pod mniejszym kątem w stosunku do normalnej monowarstwy. W przypadku układu zawierającego digitoninę cząsteczki sterolu są nachylone pod kątem 22◦ do normalnej monowarstwy. Natomiast w układzie referencyjnym cząsteczki budujące monowarstwę są odchylone o 17◦ od normalnej. Dla układu zawierającego digitoninę otrzymano szerszy rozkład kąta nachylenia cholesterolu do normalnej, co wskazuje na słabszą organizację cząsteczek w monowarstwie. Natomiast cząsteczki w monowarstwie referencyjnej są bardziej zorganizowane i mniej odchylone od normalnej. Całka po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par między grupami hydroksylowymi cholesterolu, a cząsteczami wody opisuje stopień uwodnienia grup -OH cholesterolu. Z zamieszczonego wykresu (rysunek 4.16 B) wynika, że cząsteczki cholesterolu w badanej monowarstwie były mniej uwodnione w stosunku do monowarstwy referencyjnej. Jednakże ilość cząsteczek wody występujących w pierwszej sferze hydratacyjnej dla obu układów jest podobna, o czym świadczą takie same wartości wyliczonej całki w odległości między cząsteczkami około 3 Å. W dalszych sferach hydratacyjnych znajduje się mniej cząsteczek wody w układzie zawierającym digitoninę niż w układzie odniesienia. Mniejsze uwodnienie badanego układu potwierdza powinowactwo digitoniny do monowarstwy i jej występowanie w pobliżu cząsteczek cholesterolu, a także może świadczyć o oddziaływaniach reszt cukrowych digitoniny z grupą hydroksylową cholesterolu. 
Obliczenia kwantowo-chemiczne dimeru cholesterol -digitonina 
W kolejnym etapie badań wykonano obliczenia kwatnowo -chemiczne dimerów: cholesterolu i digitoniny. Obliczenia miały na celu zbadnie oddziaływań między hydrofobowymi częściami cząsteczek sterolu i saponiny. Geometrie dimerów zostały wycięte z trajektorii, a konkretnie została wycięta co dziesiąta klatka z ostatniej nanosekundy symulacji, jedna z klatek została zaprezentowana na rysunku 4.17 A. Następnie obliczono energię oddziaływania cząsteczek (bez ich optymalizowania), która wynosiła -11,9 (± 2,1) kcal/mol. Dla jednej losowej klatki została wygenerowana funkcja falowa, a następnie z wykorzystaniem metod QTAIM zostały wyznaczone punkty krytyczne wiązań między cząsteczkami w dimerze, rysunek 4.17 B. 
Przeprowadzone obliczenia QTAIM wykazały istnienie 9 punktów krytycznych wiązania między hydrofobowymi częściami cząsteczkek cholesterolu i digitoniny. Większość z nich stanowiły oddziaływania wodór -wodór (7), pozostałe BCP występowały między atomem węgla i wodoru (1) a także atomem węgla i tlenu (1). Gęstości elektronowe w powyższych punktach krytycznych wynosiły od 0,00259 a.u. (oddziaływania H ··· H) do 0,00911 a.u. (oddziaływania H ··· O). Powyższe wartości gęstości elektronowych między badanymi cząsteczkami wskazują na istnienie oddziaływań van der Waalsa [69]. 
4.3. POMIARY PRZY STAŁEJ POWIERZCHNI 

Oddziaływanie digitoniny z monowarstwą diosgeniny 
Na rysunku 4.18 zostały zaprezentowane końcowe klatki trajektorii, projekcja z góry (A) i z boku (B). Cząsteczki w monowarstwie zajmują całą dostępną powierzchnię. Cząsteczki digitoniny adsorbują się do powierzchni monowarstwy. W przypadku skompresowanego układu diosgeniny tylko nieliczne cząsteczki digitoniny penetrują monowarstwę swoimi częściami aglikonowymi, większość z nich jest ułożona prostopadle do normalnej monowarstwy pod jej powierzchnią. W celu lepszego poznania umiejscowienia cząsteczek w monowarstwie zostały wyznaczone profile gęstości charakterystycznych grup funkcyjnych cząsteczek układu, rysunek 4.19 A. Profile gęstości zostały umieszczone na dwóch wykresach, górny przedstawia układ zawierający cząsteczki digitoniny, natomiast dolny odpowiada układowi referencyjnemu. Taki podział był konieczny ze względu na penetrację cząsteczek wody do monowarstwy. Widać, że w przypadku obu układów, z digitoniną i referencyjnego cząsteczki wody penetrują w głąb monowarstwy lokalizując się na wysokości reszt cukrowych diosgeniny -gęstość wody to około 0,05 g cm−3. Natomiast część steroidowa diosgeniny jest znacznie mniej uwodniona -gęstość wody w tym rejonie cząsteczki to jedynie 0,015 g cm−3. Ponadto cząsteczki wody penetrują głębiej do monowarstwy gdy w układzie obecna jest digitonina. Cząsteczki diosgeniny w obecności digitoniny są głębiej zanurzone do subfazy wodnej w stosunku do monowarstwy referencyjnej, co może świadczyć o przesunięciu cząsteczek diosgeniny w stronę subfazy wodnej. Digitonina częściej umiejscawia się tuż pod powierzchnią monowarstwy niż w samej membranie. Ponadto tak samo jak w przypadku monowarstw ściśniętych do zadanego ciśnienia powierzchniowego tylko część aglikonowa penetruje do monowarswy, części cukrowe zlokalizowane są pod powierzchnią monowarstwy i mogą oddziaływać z otaczającymi cząsteczkami wody, a także grupami hydroksylowymi diosgeniny. Oddziaływanie grupy hydroksylowej diosgeniny z grupami hydroksylowymi części glikonowej digitoniny, zostało zaprezentowane na rysunku 4.19 B. Obliczona całka po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par w odległości 3 Å potwierdziła, że grupy -OH diosgeniny i grup -OH ugrupowań glikonowych digitoniny znajdują się wystarczająco blisko siebie żeby możliwe było wytworzenie wiązań wodorowych między tymi atomami. Na rysunku 4.20 A został zaprezentowany rozkład kąta nachylenia wektora diosgeniny zdefiniowanego między atomami węgla C3 i C17. W przypadku monowarstwy referencyjnej cząsteczki są nachylone najczęściej o 23◦ w stosunku do normalnej podczas gdy cząsteczki diosgeniny w układzie z digitoniną charakteryzują się dwoma preferowanymi nachyleniami pod kątem 17◦ oraz 33◦. W układzie z digitoniną występuje także sygnał od cząsteczek nachylonych pod kątem 60◦ i niewielki sygnał od cząsteczek nachylonych pod kątem 80◦. Nachylenie cząsteczek pod dużymi kątami może świadczyć o dużym nieuporządkowaniu cząsteczek w błonie, a także pośrednio o możliwości przesunięcia cząsteczek diosgeniny w stronę subfazy wodnej co jest zgodne z izotermami adsorpcji zmierzonymi eksperymentalnie. W kolejnym kroku analizy obliczono całkę po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par między grupą hydroksylową diosgeniny, a cząsteczkami wody. Wyniki potwierdzają duże powinowactwo digitoniny do monowarstwy diosgeniny. Uwodnienie monowarstwy diosgeniny jest mniejsze gdy w układzie obecna jest digitonina. Również liczba cząsteczek wody w pierwszej sferze hydratacyjnej grupy hydroksylowej diosgeniny może się nieznacznie zmniejszać w układzie badanym względem układu referencyjnego. 

4.3. POMIARY PRZY STAŁEJ POWIERZCHNI 

Rysunek 4.19: A:Profile gęstości monowarstwy diosgeniny skompresowanej do powierzchni cząsteczkowej 45Å. Na rysunku został przedstawiony tylko pomiar dla górnej monowarstwy, wyniki dla dolnej są analogiczne. Linią ciągłą oznaczono układ zawierający digitoninę, linią przerywaną układ referencyjny. Kolory: czerwony -terminalna grupa metylowa diosgeniny, czarny -OH diosgeniny, magenta -środek masy części hydrofobowej digitoniny, niebieski -OH z reszt cukrowych digitoniny, jasnoniebieski -woda. B: Całka po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par między grupą -OH diosgeniny a grupami -OH z reszt cukrowych digitoniny. 

Obliczenia kwantowo -chemiczne dimeru diosgenina -digitonina 
W kolejnym etapie badań wykonano obliczenia kwantowo -chemiczne dla dimeru diosgenina -digitonina. Celem obliczeń była dokładna analiza oddziaływań między diosgeniną a digitoniną. W tym celu z symulacji MD została wybrana cząsteczka diosgeniny i oddziałująca z nią cząsteczka digitoniny. Ich geometrie zostały wycięte z co dziesiątej klatki ostatniej nanosekundy symulacji. Dla otrzymanych geometrii została obliczona energia oddziaływania międzycząsteczkowego, która wynosiła -8,6 (±-1,1) kcal/mol, co wskazuje na oddziaływania stabilizujące między cząsteczkami w dimerze. Z losowej klatki trajektorii została wygenerowana funkcja falowa, z której wyznaczono punkty krytyczne wiązania metodami QTAIM dla części aglikonowych obu badanych cząsteczek. 

Na rysunku 4.21 A została przedstawiona przykładowa geometria wycięta z trajektorii, cząsteczki oddalone są od siebie o około 3 Å, części hydrofobowe obu cząsteczek są ustawione równolegle do siebie, jednakże cząsteczka digitoniny jest przesunięta w stosunku do cząsteczki diosgeniny. Jest to spowodowane niecałkowitą penetracją digitoniny do błony (por. rysunki: 
4.18 i 4.19). Następnie na rysunku 4.21 B zostały przedstawione wyznaczone punkty krytyczne wiązania między częściami hydrofobowymi cząsteczek diosgeniny i digitoniny. Analiza Badera wykazała istnienie dziewięciu punktów krytycznych wiązania między cząsteczkami w dimerze, wszystkie to BCP wodór -wodór. Gęstości elektronowe w wyznaczonych punktach krytycznych wynosiły od 0,00161 a.u do 0,00689 a.u. Otrzymane gęstości odpowiadają oddziaływaniom van der Waalsa między badanymi cząsteczkami [69]. 
4.3. POMIARY PRZY STAŁEJ POWIERZCHNI 
4.3.3 	Porównanie parametrów monowarstw cholesterolu i dosgeniny, dyskusja 
Porównanie parametrów monowarstw cholesterolu i diosgeniny zostało przedstawione na rysunku 4.22. 

Rysunek 4.22: Porównanie parametrów monowarstw cholesterolu i diosgeniny. Rysunek A: rozkład kąta nachylenia; B: całka po trzech wymiarach z radialnej funkcji rozkładu par między grupami -OH cholesterolu (czarny) lub -OH diosgeniny (czerwony) a cząsteczkami wody; C: całka po trzech wymiarach z radialnej funkcji rozkładu par między grupami -OH cholesterolu (czarny) lub -OH diosgeniny (czerwony) a grupami -OH reszt cukrowych digitoniny. Linią ciągłą oznaczono układ zawierający digitoninę, linią przerywaną układ referencyjny. 
Skompresowana monowarstwa cholesterolu jest bardziej zorganizowana niż monowarstwa diosgeniny w tych samych warunkach (rysunek 4.22 A). W monowarstwie diosgeniny w obecności cząsteczek digitoniny tworzą się dwa preferowane nachylenia cząsteczek: 17◦ i 33◦, podczas gdy w monowarstwie cholesterolu cząsteczki najczęściej ustawiają się pod kątem 22◦. Cząsteczki diosgeniny są przesuwane z monowarstwy w kierunku subfazy o czym świadczy występowanie sygnałów przy kątach większych niż 60◦ i 80◦. W przypadku uwodnienia grup hydroksylowych cząsteczek budujących monowarstwę nie ma różnicy w uwodnieniu cholesterolu i diosgeniny. W obu przypadkach digitonina umiejscawia się blisko monowarstwy separując grupy -OH od cząsteczek wody. W obu przypadkach możliwa liczba cząsteczek wody znajdujących się w pierwszej strefie hydratacyjnej grup hydroksylowych nieznacznie spada gdy w układzie obecna jest digitonina. Grupy hydroksylowe cząsteczek budujących monowarstwę znajdują się wystarczająco blisko ugrupowań glikonowych digitoniny by mogły się między nimi tworzyć wiązania wodorowe. Grupy hydroksylowe cholesterolu oddziałują nieco częściej z digitoniną niż analogiczne grupy -OH diosgeniny. Digitonina adsorbuje do monowarstwy i penetruje zarówno monowarstwę cholesterolu jak i diosgeniny. W eksperymencie wyznaczono tak zwane ciśnienie wysycenia monowarstwy, które dla monowarstwy cholesterolu wynosiło 68,4 mN/m [137], taki wynik jest zbliżony do wyniku uzyskanego przez Schulmana i Rideala [9]. Natomiast dla monowarstwy diosgeniny ciśnienie wysycenia było równe 49,0 mN/m. Różnica w otrzymanych wartościach sugeruje, że więcej cząsteczek digitoniny może penetrować do monowarstwy cholesterolu niż do membrany zbudowanej z diosgeniny. Wyniki te są zgodne z wynikami otrzymanymi za pomocą klasycznej dynamiki molekularnej. Doświadczenia in silico wykazały, że więcej cząsteczek digitoniny penetruje monowarstwę cholesterolu, oraz że cząsteczki zaadsorbowane pozostają w monowarstwie. Wniosek ten jest tożsamy z wnioskami wynikającymi z sekcji 4.2, gdzie niezależnie od ciśnienia powierzchniowego membrany, digitonina penetrowała monowarstwę w podobnym stopniu, co zostało także pokazane w pracy Korchowiec i współpracowników [20]. Podobne wyniki uzyskali Wojciechowski i współpracownicy badający monowarstwy zbudowane z mieszanin lipidowych zawierających w swoim składzie cholesterol [7] oraz Frenkel i współpracownicy badający liposomy zbudowane z SOPC i cholesterolu [8]. Natomiast w przypadku monowarstwy zbudowanej z diosgeniny digitonina w większości adsorbuje się do monowarstwy ale tylko nieliczne cząsteczki penetrują monowarstwę swoimi częściami hydrofobowymi. Izotermy adsorpcji digitoniny do monowarstw diosgniny pokazały, że po początkowej adsorpcji digitoniny do monowarstwy następuje powolna desorpcja cząsteczek monowarstwy do subfazy wodnej, taki wynik został także otrzymany w symulacji w sekcji 4.2, gdzie digitonina penetrowała układ tylko do ciśnienia powierzchniowego wynoszącego 25 mN/m, następnie przy Π = 35 mN/m następowało wypychanie cząsteczek digitoniny z monowarstwy. W niniejszej pracy po raz pierwszy zaprezentowano analizę oddziaływań międzycząsteczkowych w dimerach cholesterol-digitonina i diosgenina-digitonina. Obliczono energię oddziaływania między dimerami wynoszącą odpowiednio: -11,9 (± 2,1) kcal/mol i -8,6 (±-1,1) kcal/mol. Obie energie wskazują na występowanie oddziaływania stabilizującego między cząsteczkami w dimerach, różnice między nimi nie są istone statystycznie. Między cząsteczkami w dimerach zostały wyznaczone punkty krytyczne wiązania, zarówno w dimerze cholesteroldigitonina jak również diosgenina-digitonina występowało dziewięć BCP. W przypadku obu dimerów większość punktów krytycznych wiązania stanowiły oddziaływania wodór-wodór, występowały również BCP węgiel-wodór, oraz tlen-wodór. 
4.4 Liposomy LUV 
W niniejszej pracy wykonano także pomiary dla dużych liposomów jednowarstwowych (LUV) stanowiących modelowe błony biologiczne. Błony zostały zbudowane w taki sposób aby jak najlepiej odtwarzać rzeczywiste błony komórkowe. Lipid ePC stanowi fazę nieuporządkowaną (Ld), natomiast SM oraz cholesterol stanowią fazę uporządkowaną (Lo) błon komórkowych i są ważnymi składnikami raft lipidowych [12]. W środowisku naukowym panuje przekonanie, że saponiny oddziałując z błoną komórkową wiążą się z występującym w niej cholesterolem. Aby zweryfikować tę tezę wykonano liposomy składające się z ePC:SM w stosunku równomolowym, a także ePC:SM:chol także w stosunku 1:1:1. Liposomy zostały wykonane poprzez 
4.4. LIPOSOMY LUV 
ekstruzję liposomów wielowarstwowych. Średnica liposomów wynosiła około 150 nm. Celem eksperymentu było zbadanie wpływu dwóch saponin digitoniny, a także ginsenozydu Rh2 na modele membran biologicznych, a także określenie roli cholesterolu w tym oddziaływaniu. Na początku zbadano wpływ saponin na wielkość liposomu. W tym celu do przygotowanych roztworów liposomów zostały dodane albo digitonina albo ginsenozyd Rh2 i całość inkubowano przez 5 min w 25◦C. Eksperyment został powtórzony trzy razy po trzy próbki w każdym powtórzeniu. Wyniki zostały poddane analizie za pomocą testu statystycznego jednokierunkowej analizie wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Dunnetta. Wyniki przedstawiono na rysunku 4.23. 

Na rysunku 4.23 A zostały przedstawione liposomy inkubowane z digitoniną. Stężenie digitoniny zostało tak dobrane aby odpowiadało stężeniu digitoniny stosowanej w badaniach monowarstw Langmuira, drugie niższe stężenie to połowa stężenia stosowanego w badaniach powierzchniowych. Liposomy referencyjne, zaznaczone przerywaną linią, posiadają homogeniczny rozkład wielkośi wynoszący około 150 nm. Digitonina wywiera ogromny wpływ na liposomy zawierające cholesterol ich średnica zwiększa się prawie dziesięciokrotnie, jest to różnica istotna statystycznie na poziomie p = 0,001. Natomiast w przypadku liposomów dwuskładnikowych (ePC: SM, 1:1) digitonina nie powoduje zmiany wielkości pęcherzyków. Wpływ digitoniny na liposomy jest porównywalny w obu stężeniach. Rysunek 4.23 B przedstawia wpływ ginsenozydu Rh2 na liposomy dwu i trój składnikowe (ePC:SM:eChol, 1:1:0 lub 1:1:1). W badaniach zastosowano trzy stężenia saponiny 2µM, 5 µM i 10 µM. Stężenia te zostały wybrane gdyż były to minimalne stężenia dla których widoczny był wpływ zarówno na błonę cytoplazmatyczną komórek nowotworowych nowotworu piersi [11] jaki i błony modelowe. Tak jak w poprzednim wypadku widać, że wielkości liposomów referencyjnych są homogeniczne i wynoszą około 150 nm. Ginsenozyd Rh2 wywiera efekt na oba rodzaje pęcherzyków. Inkubacja z saponiną jest przyczyną powiększenia się średnicy liposomów. Średnica liposomów dwuskładnikowych zostaje powiększona zarówno gdy pęcherzyki były inkubowane z ginsenozydem Rh2 o stężeniu 5µM i 10 µM, są to różnice 
o poziomie istotności na poziomie p = 0,01. Natomiast średnica liposomów zawierających cholesterol zostaje powiększona tylko w przypadku zastosowania wyższego stężenia saponiny, jest to także różnica istotna statystycznie na poziomie p = 0,01. 
Uporządkowanie lipidów w błonie liposomu 
Następnie zbadano uporządkowanie lipidów w błonie liposomów. W tym celu zastosowano dwa znaczniki fluorescencyjne umiejscawiające się w różnych częściach błony, pierwszym z nich był Laurdan, który posiada niewielką część hydrofilową dzięki, której preferencyjnie umiejscawia się na poziomie glicerolu w błonie [140]. W doświadczeniu badano uogólnioną polaryzację (GP) sondy Laurdan wyrażonej wzorem: 
I440 − I490
GP = (4.1)
I440 + I490 gdzie I oznacza intensywność fluorescencji sondy Laurdan przy długościach fali 440 nm lub 490 nm. GP określa stopień uporządkowania dwuwarstwy lipidowej, a konkretnie gdy cząsteczka Laurdanu znajduje się w błonie w stanie stałym (żel krystaliczny), wtedy emituje promieniowanie o długości fali 440 nm. Natomiast gdy chromofor znajduje się w błonie w fazie ciekłego kryształu, sonda Laurdan emituje promieniowanie o długości fali 490 nm. Im wyższa wartość parametru GP sondy Laurdan tym błona jest bardziej uporządkowana [22, 141] . Tak jak poprzednio badano cztery układy, liposomy dwuskładnikowe równomolowe składające się z ePC oraz SM, oraz trójskładnikowe składające się z równomolowej mieszaniny ePC, SM oraz cholesterolu. Liposomy były inkubowane z dwoma różnymi saponinami albo digitoniną albo ginsenozydem Rh2. Wyniki zostały przedstawione na rysunku 4.24. 

W przypadku liposomów dwuskładnikowych (ePC:SM, 1:1) digitonina nie wywierała żadnego efektu na błonę liposomową, o czym świadczy podobna wartość parametru GP otrzymana 
4.4. LIPOSOMY LUV 
dla liposomów kontrolnych i inkubowanych z digitoniną, rysunek 4.24 A. Obliczony parametr GP dla liposomów dwuskładnikowych wynosił od 0,17 do 0,19 która charakteryzowała się wysokim nieuporządkowaniem w rejonie głów lipidowych. Obecność digitoniny w roztworze liposomów trójskładnikowych powodowała zmniejszenie wartości parametru GP sondy Laurdan, co oznaczało że digitonina zmniejszała organizację w błonie liposomów składających się z ePC:SM:chol (1:1:1). Otrzymany wynik jest istotny statystycznie na poziomie p = 0,001 dla obu badanych stężeń. Ponadto dobrze koreluje z wynikami uzyskanymi w badaniach eksperymentalnych i teoretycznych monowarstw, gdzie zostało pokazane, że obecność digitoniny destabilizuje badane monowarstwy POPC/SM/CHOL. W przypadku oddziaływania ginsenozydu Rh2 z liposomami, otrzymano wyniki przeciwne do tych otrzymanych dla liposomów inkubowanych z digitoniną. Ginsenozyd Rh2 usztywnia błonę zarówno liposomów dwu-i trójskładnikowych i jest to wynik istotny statystycznie na poziomie p = 0,01 w przypadku zastosowania roztworu Rh2 o stężeniu 5 µM i 10 µM. Wartość współczynnika uogólnionej polaryzacji sondy Laurdan wzrastała dla wszystkich badanych stężeń ginsenozydu Rh2, jest to wynik istotny statystycznie na poziomie p = 0,01. Taki wynik sugeruje, że części hydrofilowe lipidów ePC i SM oddziałują z ginsenozydem znacznie lepiej nawet przy niskich stężeniach saponiny, niż gdy w błonie liposomowej obecny jest cholesterol. Otrzymane wyniki pokazują przeciwstawne działanie dwóch badanych saponin. Digitonina destabilizuje błonę liposomu zawierającego cholesterol. Natomiast ginsenozyd Rh2 wykazuje efekt analogiczny do cholesterolu poprzez usztywnianie i stabilizowanie błony liposomu. 
Drugim znacznikiem fluorescencyjnym było DPH, które jest cząsteczką niepolarną lokalizującą sie w pobliżu łańcuchów lipidowych w błonie. Metoda pomiaru anizotropii fluorescencji DPH (r), opisana w sekcji 2.3.2, pozwala na badanie uporządkowania hydrofobowych części błon biologicznych, im wyższa anizotropia fluorescencji DPH tym rejon hydrofobowy błony jest bardziej zorganizowany. W kolejnym eksperymencie zbadano uporządkowanie łańcuchów lipidowych w błonie liposomów wykorzystując sondę DPH, wyniki zostały zestawione na rysunku 4.25. 
Obecność digitoniny w roztworze zawierającym liposomy dwuskładnikowe powoduje wzrost anizotropii fluorescencji DPH w stosunku do liposomów kontrolnych. Świadczy to o działaniu stabilizującym digitoniny na liposomy nie zawierające cholesterolu i zmniejszeniu płynności błony, jest to efekt istotny statystycznie na poziomie p = 0,05. Natomiast nie zmienia się płynność części hydrofobowej liposomów trójskładnikowych, gdyż wartości r nie zmieniają się istotnie statystycznie w obecności digitoniny względem próbki kontrolnej. Wyniki otrzymane dla liposomów inkubowanych z digitoniną porównano z wynikami otrzymanymi z analogicznego eksperymentu z ginsenozydem Rh2. Zarówno liposomy inkubowane z ginsenozydem Rh2 o stężeniu 5 µM jak i 10 µM zwiększają wartość parametru r, co oznacza wzrost sztywności błony liposomów zbudowanych z ePC:SM (1:1). Jest to wynik istotny statystycznie na poziomie p =0.01. W liposomach zbudowanych z trójskładnikowej mieszaniny lipidów również obserwowalny jest wzrost sztywności błony, jednakże efekt jest znacznie mniejszy niż w przypadku liposomów dwuskładnikowych. Przedstawione wyniki sugerują, że obie saponiny oddziałują z liposomami, digitonina oddziałuje silniej z liposomami, w których skład wchodzi cholesterol, natomiast ginsenozyd Rh2 oddziałuje preferencyjnie z liposomami dwuskładnikowymi. Najprawdopodobniej wynika to z różnicy w budowie cząsteczek saponin. Ponadto w publikacji grupy profesor Mingeot-Leclercq [143] zostało wykazane, iż ginsenozyd Rh2 charakteryzuje się podobnym działaniem jak cholesterol w błonie, to znaczy preferencyjne oddziałuje ze sfingomieliną, a także stabilizuje i usztywnia błonę. 

4.5 	Badania mikroskopowe -olbrzymie liposomy jednowarstwowe (GUV) 
W ostatnim etapie badań nad dwuwarstwami zbadano oddziaływanie saponin, digitoniny i ginsenozydu Rh2 z błoną GUV. W tym celu utworzono olbrzymie liposomy zawierające barwniki fluorescencyjne. Wykorzystano Rho-DOPE, które preferencyjne umiejscawia się w fazie ciekłej nieuporządkowanej(ld)-wykazuje ono emisję przy długości fali odpowiadającej światłu czerwonemu, a także NBD-DHPE, który ma powinowactwo do lipidów występujących w stanie ciekłym uporządkowanym (lo)-emisja światła o długości fali odpowiadającej barwie zielonej. Tak jak w poprzednim eksperymencie liposomy składały się albo ePC:SM (1:1) albo ePC:SM:chol (1:1:1). Następnie GUVy były inkubowane z saponiną: digitoniną lub ginsenozydem Rh2 przez 5 min i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Następnie próbka była kontrolowana co 10 min przez 2 h. Faza lipidów ld była widoczna po oświetleniu próbki lampą emitującą 
4.5. BADANIA MIKROSKOPOWE -GUV 

promieniowanie 560 nm, natomiast do wizualizacji fazy lo użyto lampy z długością fali równą 463 nm. Wyniki obserwacji liposomów dwuskładnikowych zostały przedstawione na rysunku 4.26. W próbce kontrolnej inkubowanej przez 5 min z DMSO zostało zaobserwowane wiele liposomów 
o różnych wielkościach, w liposomach nie obserwowano separacji faz co oznaczało, że lipidy w dwuwarstwie były wymieszane i nie tworzyły większych skupisk jednolipidowych. Interesu-jące jest to, że w próbce kontrolnej obserwowano odpączkowywanie i tworzenie się wtórnych liposomów we wnętrzu liposomów pierwotnych, co mogło świadczyć o niestabilności liposomów [143]. Inkubacja liposomów z digitoniną w obu badanych stężeniach prowadziła do zmniejszenia liczby pęcherzyków występujących w próbce, jednakże liposomy wciąż były widoczne, na ich powierzchni nie obserwowano separacji faz. Ponadto z pęcherzyków nie wypączkowywały 
liposomy wtórne, a wnętrza liposomów nie zawierały rozerwanych fragmentów błon. 


Po pięciominutowej inkubacji z ginsenozydem Rh2 w badanej próbce wciąż były widoczne liposomy. Ich liczba była większa niż w przypadku próbki kontrolnej, natomiast ich średnica była mniejsza, co mogło świadczyć o intensywnym podziale. Dodatkowo we wnętrzach liposomów były widoczne fragmenty błon, powierzchnia liposomów była jednorodna i nie występowała separacja faz. Następnie zostały zbadane liposomy trójskładnikowe składające się z ePC:SM:CHOL (1:1:1). Liposomy inkubowano 5 min z saponiną, jako kontrola został użyty DMSO. W próbce kontrolnej zaobserwowano wiele liposomów, o różnych rozmiarach. We wszystkich liposomach nie zaobserwowano separacji faz, innymi słowy faza ld i lo znajdowała się w obrębie całej powierzchni liposomu. W liposomach inkubowanych przez 5 min z digitoniną o stężeniu 32,5 µM zaobserwowano liposomy z niewielkimi skupiskami lipidów w fazie ld, natomiast lipidy fazy lo charakteryzowały się jednorodnym rozkładem na powierzchni liposomu, dłuższa inkubacja 
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 
prowadziła do zaniku liposomów i przekształceniu ich w „grudki” lipidowe. Kolejnym eksperymentem była inkubacja liposomów z digitoniną o stężeniu 65 µM po 5 minutach inkubacji nie zaobserwowano żadnych liposomów, jedynie skupiska lipidów, które były pozostałością po liposomach, rysunek 4.27 (C). Drugą badaną saponiną był ginsenozyd Rh2, w liposomach inkubowanych z tą saponiną występowała separacja faz, która była niewielka po 5 minutach inkubacji, natomiast po 120 minutach lipidy w liposomie rozdzielały się na dwie fazy: lo i ld. W miejscu gdzie występowały lipidy znajdujące się w fazie ld tworzył się pęcherzyk i następowało powolne wypączkowywanie wtórnego liposomu z liposomu macierzystego. Badania mikroskopowe morfologii ogromnych liposomów jednowarstwowych pozwoliły na określenie wpływu badanych saponin na modelowe błony biologiczne. Cholesterol pełni kluczową rolę w oddziaływaniu digitoniny z błoną biologiczną co jest zgodne z badaniami opisanymi w literaturze [78]. Co ciekawe także w przypadku liposomów dwuskładnikowych (ePC:SM, 1:1) obecność digitoniny wpływa na zmniejszenie liczby liposomów występujących w próbce, co może świadczyć o oddziaływaniu digitoniny z lipidami ePC i SM. Oddziaływanie digitoniny z innymi lipidami niż cholesterol zostało pokazane także w pracach Korchowiec i współpracowników [20], oraz pracy Orczyk i współpracowników [142]. Ginsenozyd Rh2 wywołuje separację faz w liposomach trójskładnikowych, której konsekwencją jest wypączkowywanie liposomów wtórnych z liposomów macierzystych. Natomiast w liposomach dwuskładnikowych powoduje niszczenie liposomów co jest widoczne w mikroskopie jako fragmenty błon, oraz podział liposomów przez co w polu widzenia znajduje się więcej liposomów o mniejszych średnicach niż przed inkubacją z saponiną. W publikacji grupy profesor Mingeot-Leclercq zostało pokazane, że ginsenozyd Rh2 powoduje wypączkowywanie nowych liposomów tylko wtedy gdy w błonie modelowej obecna jest sfingomielina. Natomiast gdy liposomy składają się tylko z ePC oraz cholesterolu obserwuje się pączkowanie nowych liposomów do środka liposomu macierzystego [143]. 
4.6 Oddziaływanie digitoniny z lipidami 
W publikacji grupy profesor Mingeot-Leclercq zostało pokazane, że ginsenozyd Rh2, steroidowa saponina, oddziałuje mocniej z komórkami z mniejszą ilością cholesterolu w komórkach nowotworu piersi niż z komórkami z prawidłową ilością sterolu [11]. Ponadto badania fizykochemiczne układu modelowego -liposomów, wykazały że ginsenozyd Rh2 oddziałuje najsilniej ze sfingomieliną obecną w błonie badanych pęcherzyków [143]. Digitonina jest saponiną znaną z jej oddziaływania z cholesterolem błonowym, jednakże nie ma badań poświęconych ewentualnemu oddziaływaniu saponiny ze sfingomieliną. Ponadto digitonina jest saponiną wykorzystywaną w badaniach neurobiologicznych. Zgodnie z literaturą błony komórek nerwowych są bogate w sfingomielinę oraz rafty lipidowe zbudowane głównie ze sfingomieliny i cholesterolu [144, 145, 146]. Digitonina zwiększa przepuszczalność 
błon komórkowych komórek nerwowych. 
W celu zbadania oddziaływań digitoniny ze sfingomieliną, a także z raftami lipidowymi 
wykonano szereg pomiarów monowarstw Langmuira zbudowanych z następujących lipidów: 
POPC/SM (1:1), POPC/SM/CHOL (1:1:1). Badania obejmowały pomiary izoterm Π-A, 
potencjału, izoterm adsorpcji, a także modelowanie z wykorzystaniem metod klasycznej dynamiki molekularnej. 

4.6.1 Oddziaływanie digitoniny z monowarstwą POPC/SM 
Wykonano model błony komórkowej nie zawierający w swoim składzie cholesterolu. Model zawierał lipidy z fazy ld -POPC oraz lo -SM w mieszaninie równomolowej. Dla powyższej mieszaniny wykonano pomiary izoterm Π − A oraz ΔV − A na subfazie wodnej oraz wodnym roztworze digitoniny, rysunek 4.28. W przypadku monowarstwy POPC/SM nałożonej na subfazę wodną zarejestrowano izotermę, która charakteryzowała monowarstwę jednorodną, bez widocznych przejść fazowych, rysunek 4.28 A. Potencjał powierzchniowy wzrasta na po-czątku gwałtownie o 0,2 V sugerując następowanie reorganizacji cząsteczek w monowarstwie, bezpośrednio po nagłym wzroście potencjału, zaczyna także wzrastać ciśnienie powierzchniowe. Następnie po niewielkim plateau potencjał powierzchniowy powoli wzrasta aby osiągnąć swoje maksimum (0,37 V) w punkcie załamania monowarstwy. Natomiast z izotermy Π − A można odczytać, że monowarstwa załamywała się przy ciśnieniu powierzchniowym 
42.5 mN/m oraz powierzchni cząsteczkowej równej 51 mN/m. Dla zmierzonej monowarstwy został obliczony współczynnik ściśliwości równy 101,9 mN/m co według klasyfikacji Rideala & Daviesa odpowiada stanowi ciekłemu skondensowanemu. 

Następnie nałożono film lipidowy na powierzchnię subfazy wodnego roztworu digitoniny, również w przypadku tego układu zaobserwowano nagły wzrost ciśnienia powierzchniowego wskazującego na adsorpcję i penetrację digitoniny do filmu, rysunek 4.28 A. Pomiar potencjału 
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 
powierzchniowego wskazuje na niewielkie zmiany w organizacji cząsteczek w monowarstwie podczas kompresji filmu. Punkt załamania monowarstwy występował przy Acoll równym 53 Å2/cząsteczkę, oraz ciśnieniu powierzchniowym wynoszącym 17,8 mN/m. Nachylenie monowarstwy jest niewielkie co oznacza, że cząsteczki digitoniny mocno destabilizują układ. Współczynnik ściśliwości monowarstwy obliczony dla tego układu odpowiada fazie ciekłej rozprężonej i wynosi zaledwie 23 mN/m. Następnie wykonano pomiary izoterm adsorpcji dla trzech wybranych ciśnień powierzchniowych, rysunek 4.29. Digitonina adsorbowała i penetrowała do monowarstwy gwałtownie podwyższając ciśnienie powierzchniowe. Największą zmianę ciśnienia powierzchniowego zaobserwowano dla monowarstwy ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m, gdzie ΔΠ była równa 20,7 mN/m, następnie przy wyższym Π początkowym (25 mN/m) ΔΠ wynosiła 16 mN/m, a w przypadku monowarstwy ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego 35 mN/m wynosiła jedynie 11 mN/m. Z otrzymanych wyników obliczono ciśnienie wysycenia monowarstwy wynoszące 59,6(±0,3) mN/m. 

Równolegle z badaniami eksperymentalnymi zostały przeprowadzone symulacje monowarstw metodami klasycznej dynamiki molekularnej. Została sporządzona monowarstwa składająca się z cząsteczek POPC i SM rozrzuconych losowo w membranie, liczba cząsteczek obu lipidów była równa. Monowarstwa została zanurzona w wodzie (model TIP3P) -układ referencyjny. Ponadto pod monowarstwą umieszczono 8 cząsteczek digitoniny. Symulacje prowadzono 60 ns, z których ostatnie 10 ns zostało użyte do analizy. Na rysunku 4.30 zostały zestawione projekcje z góry i z boku na monowarstwy ściśnięte do trzech różnych ciśnień: 15 mN/m, 25 mN/m i 35 mN/m. Lipidy w monowarstwie zajmują całą dostępną powierzchnię, nie tworzą sie stabilne pory. Digitonina adsorbuje pod powierzchnią monowarstw, lub znajduje się po-niżej w fazie objętościowej. Widać wyraźną różnicę w adsorpcji digitoniny do monowarstwy składającej się z mieszaniny lipidów POPC/SM, a czystą monowarstwą cholesterolu. W przy
padku mieszaniny część cząsteczek adsorbuje do monowarstwy, ale też cząsteczki znajdują 
się w fazie objętościowej w pewnym oddaleniu od błony. 
W celu dokładniejszego poznania umiejscowienia digitoniny w układzie, wyznaczono profile 
gęstości charakterystycznych grup funkcyjnych cząsteczek występujących w układzie. 


Na rysunku 4.31 zostały zestawione profile gęstości otrzymane przy trzech ciśnieniach powierzchniowych: 15 mN/m, 25 mN/m i 35 mN/m. Układ ściśnięty do ciśnienia powierzch
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 
niowego 15 mN/m charakteryzuje się najszerszymi profilami gęstości głów hydrofilowych, co oznacza najmniejsze uporządkowanie części hydrofilowych lipidów. Obecność digitoniny powoduje nieznaczne poszerzenie profili gęstości grupy cholinowej POPC i przesunięcie jej w stronę subfazy wodnej. Jednocześnie profil gęstości zarejestrowany dla głów SM nie ulega zmianie w obecności cząsteczek saponiny względem układu referencyjnego. Zarówno część hydrofobowa, jak i glikonowa digitoniny znajduje się pod powierzchnią monowarstwy przy ciśnieniu powierzchniowym równym 15 mN/m. Sygnał otrzymany od ugrupowań glikonowych digitoniny nakłada się z sygnałem od głów hydrofilowych, co oznacza, że część glikonowa może oddziaływać z głowami lipidowymi. Nie obserwuje się penetracji monowarstwy przez część aglikonową digitoniny, co może świadczyć o mniejszym powinowactwie saponiny do cząsteczek lipidów w błonie. Terminalne grupy metylowe obu lipidów nie zmieniają znacząco swojego położenia w obecności digitoniny w stosunku do układu referencyjnego. Co ciekawe digitonina obecna w układzie gdzie monowarstwa została ściśnięta do ciśnienia powierzchniowego 25 mN/m zwiększa orientację głów hydrofilowych obu lipidów monowarstwy. W przypadku układu referencyjnego sygnał otrzymany od choliny jest znacznie szerszy, a średnia gęstostość tej grupy funkcyjnej wynosi około 0,29 g cm−3 (POPC) i 0,31 g cm−3(SPH). Natomiast w układzie z digitoniną gęstość ta wynosi około 0,53 g cm−3 dla każdego z lipidów. Tak jak w przypadku ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m, digitonina umiejscawia się pod powierzchnią monowarstwy. Część aglikonowa nie penetruje wnętrza membrany, natomiast reszty cukrowe oddziałują z głowami hydrofilowymi lipidów. Profile gęstości części hydrofilowej i hydrofobowej lipidów są przesunięte w stronę subfazy wodnej w układzie odniesienia względem układu z digitoniną. Taki wynik sugeruje, iż digitonina nieznacznie wypycha lipidy z subfazy wodnej, oraz zwiększa organizację ogonów lipidowych. 
Ostatni badany układ przy ciśnieniu powierzchniowym 35 mN/m zgodnie z oczekiwaniami jest najbardziej uporządkowany, o czym świadczą wysokie wartości gęstości. Digitonina obecna w układzie nieznacznie destabilizuje głowę hydrofilową sfingomieliny -otrzymany sygnał ma mniejszą intensywność oraz jest szerszy. Tak samo jak w poprzednich układach digitonina nie penetruje monowarstwy, znajduje się pod jej powierzchnią. Ugrupowania glikonowe digitoniny oddziałują z głowami hydrofilowymi lipidów. Położenie terminalnych grup metylowych ogonów lipidowych nie zmienia się w obecności digitoniny, sugerując, że przy tak wysokim ciśnieniu monowarstwy digitonina nie ma wpływu na ułożenie łańcuchów acylowych w monowarstwie. W następnym kroku analizy obliczono rozkład kąta nachylenia głów lipidowych względem normalnej monowarstwy. Wyniki zostały zebrane na rysunku 4.32, rysunki A-C odpowiadają pomiarom kątów nachylenia głów POPC względem normalnej monowarstwy w trzech badanych wartościach Π, natomiast rysunki od D-F obrazują kąty nachylenia głów sfingomieliny. We wszystkich układach kąty nachylenia głów lipidowych nie układają się w idealny rozkład normalny. Zaburzenia mogą świadczyć o występowaniu oddziaływań między głowami lipidowymi, a także między głowami lipidowymi a cząsteczkami digitoniny. 

Rysunek 4.31: Profile gęstości grup funkcyjnych monowarstwy równomolowej mieszaniny POPC/SM z digitoniną. Rysunki przedstawiają monowarstwy przy trzech badanych ciśnieniach powierzchniowych: 15 mN/m (A), 25mN/m (B) i 35 mN/m (C). Pomiar prowadzony był tylko dla górnej monowarstwy, wyniki dla dolnej są analogiczne. Legenda zawiera tylko opisy tylko do układu zawierającego digitoninę, kolory dla układu bez digitoniny są analogiczne, zaznaczono je przerywaną linią. Oznaczenie „CM cz. aglikonowej DIG” odnosi się do środka masy części aglikonowej digitoniny. 
W przypadku głów hydrofilowych POPC w monowarstwie ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m (rysunek 4.32 A) widoczne jest niewielkie przesunięcie średniego kąta odchylenia od normalnej w stronę wyższych wartości, jednakże maksimum dla układu referencyjnego i badanego występuje w tym samym miejscu i średni kąt nachylenia wynosi 53◦. Następnie przy ciśnieniu 25 mN/m (rysunek 4.32 B), sygnał otrzymany od głów hydrofilowych układu zawierającego digitoninę znacznie się poszerzył względem układu referencyjnego. Można wyodrębnić kilka równocennych maksimów, natomiast dla układu referencyjnego występuje jeden dominujący sygnał występujący przy 77◦. Głowy hydrofilowe w monowarstwie przy ciśnieniu powierzchniowym 35 mN/m charakteryzują się podobnym histogramem bez względu na obecność digitoniny, rysunek 4.32 C. W obecności saponiny maksimum sygnału występuje dla odchylenia o 78◦ od normalnej monowarstwy, natomiast 
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 

dla układu referencyjnego cząsteczki są średnio odchylone o 76◦ do normalnej. Monowarstwa przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m nie wykazuje różnic w nachyleniu głów hydrofilowych SM w obecności i przy braku digitoniny, rysunek 4.32 D. W układzie referencyjnym badane grupy funkcyjne są nachylone pod kątem 73◦, natomiast gdy digitonina znajdowała się w układzie powstają dwa maksima przy 70◦ i 79◦. Ściśnięcie monowarstwy do ciśnienia powierzchniowego 25 mN/m powoduje zwiększenie nieuporządkowania w rejonie głów lipidowych sfingomieliny, rysunek 4.32 E . W układzie referencyjnym otrzymany histogram jest bardzo szeroki i posiada liczne maksima. Natomiast obecność digitoniny w układzie zdaje się stabilizować układ, występuje tu jedno maksimum głowne (73◦) i dwa mniejsze (47◦ i 127◦). Monowarstwa skompresowana do ciśnienia powierzchniowego 35 mN/m charakteryzuje się podobnym rozkładem kąta nachylenia głów lipidowych w obecności jak i przy braku digitoniny, rysunek 4.32 F. W układzie z digitoniną cząsteczki są nachylone pod kątem 76◦ do normalnej monowarstwy, natomiast w układzie referencyjnym o 80◦. W celu dokładniejszego poznania oddziaływania digitoniny z membraną obliczono całkę po trzech wymiarach z radialnej funkcji gęstości par między atomami azotu i fosforu pochodzących z cholin, a grupami hydroksylowymi ugrupowań glikonowych digitoniny. Wyniki zostały przedstawione na rysunku 4.33. 

Otrzymane wyniki pozkazują, że oddziaływanie digitoniny z monowarstwą dwuskładnikową niezawierającą cholesterolu zależy bardzo mocno od stopnia uporządkowania monowarstwy. Digitonina oddziałuje silniej ze sfingomieliną niż z POPC gdy monowarstwa jest luźno upakowana (Π=15 mN/m), natomiast w przypadku ciśnienia powierzchniowego równego 25 mN/m liczba cząsteczek znajdujących się w pobliżu SM spada na rzecz głowy hydrofilowej POPC. Liczba grup hydroksylowych digitoniny otaczająca grupę aminową choliny jest prawie identyczna dla obu lipidów, natomiast grupa fosforanowa sfingomieliny oddziałuje częściej z digitoniną, niż analogiczna grupa funkcyjna POPC. Cząsteczki znajdujące sie w monowarstwie przy ciśnieniu powierzchniowym 35 mN/m są bardzo mocno zorganizowane i prawdopodobieństwo wystąpienia digitoniny szczególnie w okolicach grupy fosforanowej znacznie spada. Ponadto, nie ma różnicy w liczbie cząsteczek digitoniny znajdującej się w pobliżu obu bada
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 
nych lipidów. Obliczono także hydratację głów lipidowych w pobliżu atomów fosforu i azotu. Liczba cząsteczek wody otaczających cholinę jest praktycznie stała i nie zależy ani od ciśnienia powierzchniowego monowarstwy, ani od obecności digitoniny w układzie. Głowa hydrofilowa sfingomieliny jest otoczona średnio przez 24-25 cząsteczek wody, natomiast głowa POPC przez 23-24 cząsteczki. W kolejnym etapie badań zanalizowano zachowanie łańcuchów hydrofobowych w błonie, w tym celu wyliczono parametr porządku w obu łańcuchach POPC, sn − 1i sn − 2, oraz w obu łańcuchach sfingomieliny, sfingozyny i kwasu tłuszczowego. Dane zostały pokazane na rysunku 4.34. Wartość parametru porządku bliska zero wskazuje na występowanie wielu konformacji typu gauche, natomiast wartość zbliżająca się do jedności świadczy o obecności konformacji all-trans, a tym samym wysokim uporządkowaniu w łańcuchach. Sfingomielina stanowiąca fazę uporząkowaną w błonie charakteryzuje się wyższym parametrem porządku(Smol) wahającym się między 0,4 a 0,6, niż POPC, które stanowi fazę nieuporządkowaną w membranie, dla którego wartość Smol wynosi jedynie 0,2-0,4. 

Parametry porządku obliczone dla POPC wskazują na wzrost uporządkowania łańcuchów acylowych wraz ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego monowarstwy, rysunek 4.34. Digitonina ma wpływ na uporządkowanie w łańcuchach sn − 1. W układach ściśniętych do 25 mN/m i 35 mN/m obecność digitoniny zwiększa wartość parametru porządku w łańcuchu. Odwrotny efekt obserwowany jest dla monowarstwy skompresowanej ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m. Na kolejnym wykresie został przedstawiony parametr porządku dla łańcucha sn−2. Obserwowalny jest nagły spadek wartości przy dziewiątym atomie węgla wynikający z obecności wiązania podwójnego. Digitonina ma niewielki wpływ na uporządkowanie łańcucha sn−2 POPC. Obserwowany jest niewielki wzrost parametru uporządkowania w monowarstwie ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego 35 mN/m, a konkretnie między atomami węgla od piątego do ósmego, oraz w monowarstwie skompresowanej do Π równego 15 mN/m, między atomami węgla od dziesiątego do siedemnastego. Natomiast niewielki spadek uporządkowania łańcucha sn − 2 w układzie zawierającym digitoninę obserwowany był przy ciśnieniu powierzchniowym równym 35 mN/m. Parametry porządku obliczone dla obu łańcuchów sfingomieliny wykazały, że najbardziej uporządkowane są łańuchy lipidowe w monowarstwie skompresowanej do ciśnienia powierzchniowego równego 35 mN/m, natomiast nie widać znaczącej różnicy między łańcuchami lipidowymi znajdującymi się w monowarstwach przy niższych wartościach ciśnienia powierzchniowego. Digitonina destabilizuje łańcuchy sfingozyny we wszystkich badanych układach, jedynie w monowarstwie ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m następuje wzrost organizacji łańcuchów między dwunastym a piętnastym atomem węgla. Natomiast w przypadku łańcucha kwasu tłuszczowego digitonina wywiera największy destabilizujący efekt w monowarstwie skompresowanej do Π równego 25 mN/m. Digitonina zmniejsza również uporządkowanie w łańcuchach występujących w układzie skompresowanym do 15 mN/m, a także w niewielkim stopniu w układzie przy ciśnieniu 35 mN/m. Tak samo jak wprzypadku łańcucha sfingozyny digitonina stabilizuje łańcuch kwasu tłuszczowego między atomami węgla dwanaście a piętnaście. 
4.6.2 Oddziaływanie digitoniny z monowarstwą POPC/SM/CHOL 
Sporządzono także monowarstwę zbudowaną z trzech składników: POPC, SM i cholesterolu w proporcji równomolowej. Następnie wykonano pomiary izoterm Π − A oraz ΔV − A. Pomiary tak samo jak w poprzednim modelu wykonano na dwóch subfazach: wodnej i wodnym roztworze digitoniny. Monowarstwa mieszaniny POPC/SM/CHOL na subfazie wodnej charakteryzuje się brakiem widocznych przejśc fazowych, jest jednorodna i homogeniczna, rysunek 4.35 A. Potencjał powierzchniowy zaczyna wzrastać przy powierzchni cząsteczkowej równej 92 Å2 i jego wartość zmienia się o 0,25 V. Następnie podczas dalszej kompresji filmu następuje niewielkie plateau po którym następuje nieznaczny wzrost potencjału powierzchniowego. W punkcie załama
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 

nia monowarstwy potencjał osiąga wartość 0,38 V. Z pomiaru izotermy można odczytać, że monowarstwa załamuje się przy Π równym 43 mN/m i powierzchni cząsteczkowej 46 Å2. Dla otrzymanej izotermy wyznaczono współczynnik ściśliwości wynoszący 167 mN/m, taka wartość charakteryzuje monowarstwę w fazie ciekłej skondensowanej, rysunek 4.35 B. Mieszanina trójskładnikowa nałożona na powierzchnię subfazy, wodnego roztworu digitoniny, charakteryzowała się natychmiastowym wzrostem ciśnienia powierzchniowego do wartości 5 mN/m. Następnie podczas ściskania monowarstwa załamywała się przy ciśnieniu powierzchniowym 20 mN/m oraz przy powierzchni cząsteczkowej równej 51 Å2. Wyznaczony współczynnik ściśliwości dla badanej monowarstwy wynosił zaledwie 22 mN/m, co wskazywało, że cząsteczki w monowarstwie znajdują się w fazie ciekłej rozprężonej. Obecność digitoniny w subfazie działała na monowarstwę destabilizująco, przesuwając jej punkt załamania w stronę wyższych powierzchni cząsteczkowych i niższego Π. Potencjał powierzchniowy pozostawał praktycznie stały podczas całego pomiaru co oznacza, że nie następowała reorganizacja cząsteczek w monowarstwie. 
Aby lepiej poznać mechanizm oddziaływania digitoniny z monowarstwą składającą się z mieszaniny trójskładnikowej wykonano pomiary izoterm adsorpcji dla trzech wybranych ciśnień powierzchniowych, rysunek 4.36 A. Digitonina adsorbowała do monowarstwy i penetrowała ją w każdym badanym ciśnieniu powierzchniowym. Ponadto w przypadku dwóch niższych ciśnień powierzchniowych, 15 mN/m i 25 mN/m, obserwowalny był ciągły wzrost wartości ciśnienia powierzchniowego. Oddziaływanie digitoniny z monowarstwą było najsilniejsze przy najniższym Π początkowym, w pomiarach tych zanotowano wzrost ciśnienia powierzchniowego o 43,5 mN/m. Monowarstwa skompresowana do Π równego 25 mN/m charakteryzowała się mniejszym wzrostem ciśnienia powierzchniowego po dodaniu saponiny jego wartość wzrosła o 36 mN/m. Najniższy wzrost Π, a konkretnie o 27,3 mN/m, zaobserwowano dla monowarstwy o początkowym ciśnieniu powierzchniowym 35 mN/m. Z otrzymanych wyników wyznaczono ciśnienie wysycenia monowarstwy wynoszące w tym przypadku 66,4 (± 2,2) mN/m, rysunek 4.36 B. Oprócz badań eksperymentalnych zostały przeprowadzone badania in silico metodami klasycznej dynamiki molekularnej. Sporządzono monowarstwę trójskładnikową, składającą się z POPC, sfingomieliny i cholesterolu w proporcjach równomolowych. Tak jak w poprzednich badaniach wykonano dwa układy jeden zawierający cząsteczki digitoniny usytuowane pod monowarstwą w subfazie wodnej oraz drugi bez digitoniny (układ referencyjny). Rysunek 4.37 przedstawia projekcję układu z góry i z boku w ostatniej klatce symulacji. Na rysunkach przedstawiających projekcję z góry widać, że cząsteczki filmu powierzchniowego zajmują całą dostępną przestrzeń, na powierzchni nie tworzą się pory. Ponadto cząsteczki lipidów nie tworzą domen ale są rozłożone losowo w monowarstwie. Cząsteczki cholesterolu są zakotwiczone w monowarstwie, nie obserwuje się cząsteczek cholesterolu w subfazie wodnej. Natomiast widok z boku przedstawia oddziałującą z błoną digitoninę, widać, że przy dwóch niższych ciśnieniach powierzchniowych digitonina penetruje monowarstę, a także adsorbuje się pod jej powierzchnią. Grupy cukrowe digitoniny prawdopodobnie oddziałują z głowami hydrofilowymi lipidów. W celu głębszego zrozumienia ułożenia cząsteczek w układzie, jak również ich wzajemnego oddziaływania obliczono profile gęstości dla charakterystycznych grup funkcyjnych cząsteczek w monowarstwach skompresowanych do trzech różnych ciśnień powierzchniowych, wyniki zostały zestawione na rysunku 4.38. Z otrzymanych profili gęstości widać, że obecność digitoniny nie wpływa na ułożenie cząsteczek w monowarstwie na osi wzdłuż normalnej monowarstwy. Jedynie w układzie ściśniętym do ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m, cholesterol jest bardzo nieznacznie przesunięty w stronę subfazy wodnej gdy w układzie występuje digitonina. Pozostałe sygnały od grup 

4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 

funkcyjnych nie ulegają przesunięciu na osi z w obecności saponiny. Digitonina oddziałuje z monowarstwą układając się pod jej powierzchnią lub penetrując monowarstwę swoją częścią hydrofobową. Taka penetracja ma miejsce tylko przy dwóch niższych ciśnieniach powierzchniowych. Przy Π = 35 mN/m, część hydrofobowa digitoniny oddziałuje z głowami polarnymi lipidów. Reszty cukrowe digitony lokują się pod powierzchnią monowarstwy lub w rejonie 

Rysunek 4.38: Profile gęstości monowarstwy równomolowej mieszaniny POPC/SM/CHOL z digitoniną . Rysunki przedstawiają monowarstwy przy trzech badanych ciśnieniach powierzchniowych: 15 mN/m (A), 25mN/m (B) i 35 mN/m (C). Pomiar prowadzony był tylko dla górnej monowarstwy, wyniki dla dolnej są analogiczne. Legenda zawiera tylko opisy tylko do układu zawierającego digitoninę, kolory dla układu bez digitoniny są analogiczne, zaznaczono je przerywaną linią. Oznaczenie ĆM cz. aglikonowej DIGódnosi się do środka masy części aglikonowej digitoniny. 
głów hydrofilowych lipidów, co może sugerować iż występuje oddziaływanie między tymi 
grupami. W kolejnym kroku analizy obliczono rozkład kąta nachylenia głów hydrofilowych lipidów. Wyniki zostały zestawione na rysunku 4.39. Tak jak w przypadku mieszaniny dwuskładnikowej otrzymane histogramy rozkładu kąta nachylenia nie mają rozkładu normalnego. W monowarstwie skompresowanej do ciśnienia powierzchniowego równego 15 mN/m (rysunek 
4.39 A i D) głowy hydrofilowe w układzie referencyjnym są najczęściej odchylone o 80◦ względem normalnej monowarstwy. Natomiast gdy w układzie pojawia się digitonina, maksimum jest przesunięte w stronę mniejszych kątów i wynosi 74◦. W przypadku monowarstwy skompresowanej do środkowego badanego ciśnienia powierzchniowego (rysunek 4.39 B i E) w układzie referencyjnym głowy cholinowe są ustawione pod kątem 68◦, a także między kątami 120◦-140◦ tworzy się charakterystyczne plateau oznaczające, że w układzie występują także cząsteczki o dużym nachyleniu w stosunku do normalnej monowarstwy. Natomiast w układzie 
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 

zawierającym cząsteczki digitoniny pojawiają się dwa maksima przy 68◦ i 90◦. W układzie ściśniętym do ciśnienia powierzchniowego 35 mN/m (rysunek 4.39 C i F), układ referencyjny charakteryzuje się wygięciem głów cholinowych POPC względem normalnej o 72◦, natomiast gdy w układzie obecna jest digitonina maksimum sygnału przesuwa się nieznacznie w stronę niższych kątów i wynosi 63◦. Reszty cholinowe występujące w cząsteczkach sfingomieliny także wykazują bardzo niewielką zmianę gdy w układzie występuje digitonina. Saponina największy wpływ wywiera na monowarstwy przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m i 35 mN/m, rysunek 4.39 D i F. W przypadku niższego ciśnienia w układzie z digitoniną pojawia się dodatkowe maksimum występujące przy kącie 95◦. Natomiast przy wysokim ciśnieniu powierzchniowym główne maksimum kąta nachylenia przesuwa się nieznacznie w stronę wyższych wartości kątów i wynosi 79◦ podczas gdy układ referencyjny charakteryzuje się występowaniem największej liczby cząsteczek nachylonych pod kątami 70◦ i 75◦. Tak samo jak w przypadku układu dwuskładnikowego obliczono całki po trzech wymiarach z radialnej funkcji rozkładu par między atomami azotu i fosforu pochodzącymi z lipidów, a grupami hydroksylowymi pochodzącymi z części glikonowej digitoniny, oraz między atomami tlenu z cząsteczki cholesterolu, a grupami -OH z części hydrofilowej digitoniny (rysunek 4.40). 

Otrzymane wyniki są bardzo interesujące, wynika z nich, że gdy monowarstwa jest skompresowana do ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m i 25 mN/m, cholesterol i reszty cukrowe digitoniny znajdują się w odległości wystarczająco małej aby mogły tworzyć się między nimi wiązania wodorowe. Natomiast gdy monowarstwa jest mocno skompresowana i jej ciśnienie powierzchniowe odpowiada temu występującemu w natywnej komórce to cholesterol praktycznie nie oddziałuje z grupami -OH glikonowej części digitoniny. W przypadku monowarstwy skompresowanej do najniższego badanego ciśnienia powierzchniowego grupy hydroksylowe glikonu digitoniny znajdują się z większym prawdopodobieństwem bliżej reszt cholinowych POPC niż analogicznych grup sfingomieliny. Natomiast odwrotne zachowanie obserwuje się u monowarstw ściśniętych do 25 mN/m i 35 mN/m. Zbadano także uwodnienie głow hydrofilowych lipidów i grupy hydroksylowej cholesterolu, tak samo jak w przypadku układu dwuskładnikowego także i w tym układzie hydratacja badanych residuów nie zależała od ciśnienia powierzchniowego monowarstwy, a także obecności digitoniny w układzie. Atomy N i P pochodzące z choliny POPC były otoczone przez 24-25 
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 
cząsteczek wody, natomiast analogiczne atomy ze sfingomieliny były hydratowane przez 25 cząsteczek wody. 

Następnie zanalizowano wpływ digitoniny na część hydrofobową błony, w tym celu wyliczono parametry porządku dla każdego łańcucha acylowego lipidów błonowych, wyniki zostały zaprezentowane na rysunku 4.41. W obecności cholesterolu lipidy w monowarstwach są bardziej uporządkowane. Paramtery porządku obliczone dla łańcuchów są wyższe średnio o 0,2 w stosunku do monowarstwy POPC/SM. Ponadto uporządkowanie atomów węgla występujących bliżej głowy hydrofilowej jest znacznie wyższe niż uporządkowanie końcowych grup alkilowych. Obecność digitoniny w układzie destabilizuje układ i obniża uporządkowanie łańcuchów lipidowych o czym świadczy spadek wartości parametru porządku. Największy wpływ na łańcuchy lipidowe digitonina wywiera w najniższym badanym ciśnieniu powierzchniowym. Wraz ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego łańcuchy POPC sn − 1 w układzie referencyjnym charakteryzują się nieznacznym wzrostem parametru porządku. Natomiast w obecności digitoniny wartość parametru spada, największy spadek jest obserwowany w monowarstwie przy ciśnieniu powierzchniowym równym 15 mN/m, następnie przy 25 mN/m a najmniejszy efekt przy 35 mN/m. W przypadku nienasyconego łańcucha POPC sn − 2, obserwowany jest spadek parametru uporządkowania w miejscu występowania wiązania podwójnego. Tak samo jak w przypadku łańcucha nasyconego, największy efekt digitonina wywiera na łańcuchy w monowarstwie ściśniętej do ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m, natomiast uporządkowanie łańcuchów przy wyższych ciśnieniach powierzchniowych było podobne. W przypadku łańcuchów sfingomieliny średnie wartości parametru są wyższe niż dla łańcuchów POPC. Ponadto, digitonina obniża uporządkowanie w łańuchach alifatycznych SM, a także powoduje występowanie fluktuacji w wartościach parametru porządku otrzymanych dla poszczególnych atomów węgla w łańcuchach, prawdopodobnie jest to związane z penetracją aglikonowej części digitoniny do monowarstwy. Efekt jest tym większy im mniejsze ciśnienie powierzchniowe panujące w monowarstwie. W łańcuchu sfingozyny występuje wiązanie podwójne między pierwszym a drugim atomem węgla w cząsteczce, co tłumaczy spadek wartości parametru uporządkowania o około 0,1. Natomiast w łańcuchu kwasu tłuszczowego nie obserwowane są znaczne spadki uporządkowania między atomami węgla. Następnie analogicznie do badań z wykorzystaniem monowarstwy zbudowanej z cząsteczek cholesterolu wyznaczono wektor cząsteczki cholesterolu między atomami węgla C3 i C17, wyznaczony wektor został użyty do wyliczenia kąta nachylenia sterolu w monowarstwie mieszanej. Wyniki zostały przedstawione na rysunku 4.42. 

Cząsteczki cholesterolu były ustawione niemalże pionowo w monowarstwach mieszanych. Jedynie gdy monowarstwa była ściśnięta do ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m otrzymany rozkład kątów jest szerszy niż dla pozostałych Π, a także występują cząsteczki cholesterolu nachylone między 40◦ a 60◦ do normalnej monowarstwy. W każdej badanej monowarstwie cząsteczki cholesterolu w większości nachylone są między 14◦ a 21◦ do normalnej. Wpływ digitoniny na nachylenie cząsteczek sterolu jest nieznaczny, największą różnicę można zaobserwować w monowarstwie skompresowanej do Π równego 25 mN/m, gdzie cholesterol w monowarstwie referencyjnej nachylony jest pod kątem 14◦, natomiast gdy w układzie obecna jest digitonina to średni kąt nachylenia wynosi 19◦, co sugeruje, że cząsteczki cholesterolu są 
4.6. ODDZIAŁYWANIE DIGITONINY Z LIPIDAMI 
nieznacznie destabilizowane przez saponinę. 
4.6.3 Porównanie parametrów monowarstw mieszanych i dyskusja 
W ostatniej części badań wykonano pomiary eksperymentalne oraz modelowanie in silico dwóch układów reprezentujących modelową błonę biologiczną. Pierwszy, dwuskładnikowy, składał się z POPC (faza ld) oraz SM (faza lo) w stosunku molowym 1:1; oraz drugi, trój-składnikowy zbudowany z POPC, SM oraz cholesterolu w stosunku molowym 1:1:1. Celem badań było opisanie oddziaływania cholesterolu z błoną przypominającą naturalną błonę komórkową, a także zbadanie interakcji saponiny z innymi składnikami błony biologicznej. W badaniach eksperymentalnych na początku wykonano pomiary izoterm Π-A oraz V-A. Oba układy tworzą stabilne monowarstwy na subfazie wodnej i przy maksymalnym skompresowaniu znajdują się w fazie ciekłej skondensowanej. Ponadto gdy w roztworze obecna jest digitonina obie mieszaniny zachowują się bardzo podobnie. Tworzone monowarstwy nie są stabilne, digitonina gwałtownie adsorbuje do monowarstw w momencie nałożenia filmu na powierzchnię. W czasie maksymalnego skondensowania monowarstwy znajdują się w stanie ciekłym rozprężonym. W kolejnym kroku wykonano pomiary izoterm adsorpcji digitoniny do monowarstwy POPC/SM lub POPC/SM/CHOL. Badano oddziaływanie digitoniny z monowarstwami przy trzech ciśnieniach powierzchniowych 15 mN/m, 25 mN/m oraz 35 mN/m. W obu układach następowało gwałtowne podniesienie ciśnienia powierzchniowego po dodaniu digitoniny. W mieszaninie dwuskładnikowej ΔΠ wynosiła między 10 mN/m a 20 mN/m w zależności od ciśnienia początkowego, im wyższe ciśnienie początkowe tym mniejsza zmiana Π po dodaniu digitoniny. Ciśnienie wysycenia monowarstwy wynosiło 59,6 (± 0,3) mN/m. Natomiast w układzie trójskładnikowym zawierającym cholesterol ΔΠ wahała się między 25 mN/m a 45 mN/m, a ciśnienie wysycenia było równe 66,4 (± 2,2) mN/m. Wyższe wartości ΔΠ otrzymane dla układu POPC/SM/CHOL świadczą o dużej roli cholesterolu w oddziaływaniu błony z digitoniną, co jest także zgodne z literaturą [22, 1, 6]. W celu lepszego zrozumienia oddziaływania digitoniny z monowarstwami mieszanymi zostały wykonane komputerowe modele błon. Otrzymane wyniki pokazały, że digitonina adsorbuje do obu badanych mieszanin, natomiast tylko w obecności cholesterolu penetruje do monowarstwy swoją częścią aglikonową. Otrzymane wyniki dobrze korelują z badaniami liposomowymi wykonanymi przez Sudji i współpracowników [78]. Głowy hydrofilowe lipidów w obu układach są nachylone pod kątem 63◦ do 95◦. Niższe wartości występują zwykle gdy w układzie nie było digitoniny, natomiast w układzie z digitoniną obserwuje się niewielkie przesunięcie maksimów otrzymanych rozkładów w stronę wyższych kątów w stosunku do normalnej monowarstwy. Grupy hydroksylowe glikonowej części digitoniny mają wyższe powinowactwo do sfingomieliny w układzie dwuskładnikowym przy niższych ciśnieniach powierzchniowych, natomiast gdy układ był ściśnięty do ciśnienia powierzchniowego 35 mN/m nie było różnicy w otrzymanych wartościach RDF dla obu lipidów. W układzie POPC/SM/CHOL, jedynie grupa hydroksylowa cholesterolu znajdowała się w odpowiedniej odległości do wytworzenia wiązania wodorowego z grupami -OH części glikonowej digitoniny. Natomiast w przypadku niższego ciśnienia saponina miała wyższe powinowactwo do reszty cholinowej POPC niż do sfingomieliny. Gdy ciśnienie powierzchniowe było wyższe to wyniki były odwrotne -digitonina miała większe powinowactwo do reszty cholinowej SM niż do POPC. Ponadto przy ciśnieniu powierzchniowym 35 mN/m cholesterol nie oddziaływał z grupami hydroksylowymi glikonowej części digitoniny. Taki wynik sugeruje, że cząsteczki cholesterolu zakotwiczają się głęboko w błonie, digitonina penetrując membranę swoją częścią hydrofobową może oddziaływać z cholesterolem. Jednakże z wyników otrzymanych metodami klasycznej dynamiki molekularnej nie można wnioskować, że digitonina wyciąga cholesterol z monowarstwy. Biologowie pracujący z tkanką nerwową pokazali, że digitonina wnikając do błony komórkowej zwiększa jej przepuszczalność, skład błony powiększa się o penetrujące cząsteczki digitoniny, jednakże pozostałe składniki błony, jak na przykład cholesterol nie są usuwane z błony [10, 144, 147]. Natomiast naukowcy badający modelowe błony biologiczne, posiadające w swoim składzie cholesterol, a także najczęściej fosfolipidy pokazali, że digitonina po zaadsorbowaniu się do błony wyciągna z niej cholesterol do środowiska zewnętrznego [7, 8, 78]. Możliwe, że takie rozbieżności są związane ze składem błony i jej otoczeniem. Komórki nerwowe są bogate w sfingolipidy, których powinowactwo do cholesterolu jest bardzo wysokie i opisywane w literaturze jako podstawa raft lipidowych. Natomiast gdy takich raft nie ma w układzie badanym, cholesterol jest za słabo związany ze składnikami błony i może być z niej usuwany jak wskazuje Wojciechowski i wsp [7]. Łańcuchy lipidowe były mniej uporządkowane w układzie dwuskładnikowym, niż w układzie trójskładnikowym, co jest zgodne z danymi literaturowymi dotyczącymi usztywniania błony przez występujący w niej cholesterol [12]. Ponadto digitonina obniża uporządkowanie łańcuchów lipidowych w monowarstwie, z wyjątkiem łańcuchów POPC w układzie POPC/SM, tam działanie saponiny jest przeciwne. 
Wnioski 
Wykonane badania eksperymentalne i teoretyczne umożliwiły wypełnienie założonych celów pracy doktorskiej oraz pozwoliły na sformuowanie następujących wniosków: 
• 
Obecność digitoniny wpływa destabilizująco na monowarstwę zarówno cholesterolu jak i diosgeniny. 

• 
Digitonina adsorbuje i penetruje do monowarstw cholesterolu i diosgeniny. Do monowarstwy penetruje tylko część hydrofobowa (aglikon) digitoniny, natomiast część cukrowa (glikon) pozostaje w subfazie wodnej i oddziałuje z cząsteczkami wody jak również z grupami hydroksylowymi cholesterolu i diosgeniny. 

• 
Łańcuch alifatyczny cholesterolu oddziałuje silnie z digitoniną, oraz utrzymuje ją w badanej monowarstwie. Natomiast digitonina znacznie słabiej penetruje monowarstwę diosgeniny swoją częścią aglikonową, może to być spowodowane obecnością cząsteczek wody we wnętrzu monowarstwy. 

• 
Oddziaływanie między cząsteczkami w dimerach cholesterol-digitonina i diosgeninadigitonina jest stabilizujące. Wykazano istnienie punktów krytycznych wiązania między oddziałującymi częściami hydrofobowymi cząsteczek, o gęstości odpowiadającej oddziaływaniom van der Waalsowskim. Natomiast wyznaczone radialne funkcje gęstości par (RDF) między grupami hydroksylowymi cukrów digitoniny i grupy -OH cholesterolu wskazywały, że badane grupy znajdują się wystarczająco blisko siebie aby mogły tworzyć wiązania wodorowe. Oddziaływania między cząsteczkami cholesterolu i digitoniny nigdy wcześniej nie zostały zbadane za pomocą metod chemii kwantowej, a także klasycznej dynamiki molekularnej. 

• 
Digitonina i ginsenozyd Rh2 oddziałują z liposomami. Digitonina oddziałuje silniej z liposomami, w których skład wchodzi cholesterol. Natomiast ginsenozyd Rh2 oddziałuje preferencyjnie z liposomami, w których skład wchodzi ePC i SM, wykazuje podobny wpływ na błonę jak cząsteczki cholesterolu [143]. 

• 
Inkubacja olbrzymich liposomów z digitoniną prowadzi do zmniejszenia liczby liposomów. Podczas inkubacji z digitoniną liposomy posiadające w błonie cholesterol kurczą 


105 

się tworząc agregaty lipidowe, wynik jest analogiczny do tego otrzymanego przez Sudji i wsp [78]. 
• 
Inkubacja dwuskładnikowych GUV z ginsenozydem Rh2 prowadzi do powstania separacji faz w liposomie, w miejscu gdzie występuje faza nieuporządkowana lipidów czyli ePC powstaje pęcherzyk, który następnie odpączkowuje od liposomu macierzystego co zostało opublikowane w naszej pracy [143]. 

• 
Ginsenozyd Rh2 działa podobnie jak cholesterol na błony liposomów dwuskładnikowych, po inkubacji próbki z saponiną dochodzi do usztywnienia błony komórkowej [11, 143]. 

• 
Digitonina adsorbuje się zarówno do monowarstwy POPC/SM jak i POPC/SM/CHOL oddziałując z nią. Jednakże penetracja części aglikonowej saponiny następuje tylko w obecności cholesterolu. 

• 
W niższych ciśnieniach powierzchniowych grupy -OH cząsteczek cholesterolu znajdują się na tyle blisko grup hydroksylowych glikonowej części digitoniny aby móc tworzyć z nimi wiązania wodorowe, natomiast przy wyższych ciśnieniach powierzchniowych nie obserwowano takiego efektu. Takie zachowanie może być spowodowane obecnością sfingomieliny w badanej membranie, z którą cholesterol współtworzy tak zwane rafty lipidowe [12, 19]. 

• 
Cząsteczki cholesterolu w monowarstwie zbudowanej z POPC/SM/CHOL nie są przesuwane do subfazy wodnej w obecności digitoniny. 

• 
W liposomach dwuskładnikowych reszta cholinowa sfingomieliny oddziałuje silniej z resztami cukrowymi digitoniny. Natomiast gdy w układzie obecny jest cholesterol digitonina ma większe powinowactwo do POPC niż do sfingomieliny. 


Wyniki otrzymane podczas studiów doktoranckich rozszerzają wiedzę na temat oddziaływania digitoniny z cholesterolem. Uzyskane wyniki mają charakter poznawczy i mogą posłużyć naukowcom zajmującym się badaniami biologicznymi wykorzystującymi saponiny, w głębszym zrozumieniu oddziaływania błony komórkowej z glikozydami roślinnymi. Zastosowane metody mają ogromny potencjał do wyjaśniania niezrozumiałych oddziaływań międzycząsteczkowych występujących w błonach biologicznych. 
Bibliografia 

[1] Francis G., Kerem Z., Makkar H.P., Becker K., 2002. The biological action of saponins in animal systems: a review. Br. J. Nutr. 88, 587-605. 
[2] Simoes C.M., Amoros M., Gierre R.L, 1999. Mechanism of antiviral activity of triterpenoid saponins. Phytother. Res. 13, 323-328. 
[3] Lee Y., Jung J.C., Ali Z., Khan I.A., Oh S., 2012. Anti-inflamatory effect of triterpene saponins isolated from Blue Cohosh Caulophyllum thalictroides. Evid. Based Bmplement Alternat. Med. 2012, 798192. 
[4] Podolak, I., Galanty, A., Sobolewska, D., 2010. Saponins as cytotoxic agents: a review. Phytochem. Rev. 9(3), 425 – 474. 
[5] Langmuir I., Schaefer V.J., Sobotka H, 1937. Multilayers of sterols and the adsorption of digitonin by deposited monolayers. J. Am. Chem. Soc. 59, 1751-1759. 
[6] de Groot C., Muller-Goymann C.C., 2016. Saponin interactions with model membrane systems -Langmuir monolayer studies, hemolysis and formation of ISCOMs. Planta Med. 82, 1496-1512. 
[7] Wojciechowski K., Orczyk M., Gutberlet T., Brezesinski G., Geue T., Fontaine P., 2016. On the interaction between digitonin and cholesterol in Langmuir monolayers. Langmuir 32, 9064-9073. 
[8] Frenkel N., Makky A., Sudji I.R., Wink M., Tanaka M., 2014. Mechanistic investigation of interactions between steroidal saponin digitonin and cell memebrane models. J. Phys. Chem. B 118, 14632-14639. 
[9] Schulman J.H., Rideal E.K., 1936. Molecular Interaction in Monolayers: I -Complexes between large Molecules. Proc. Roy. Soc. B 122, 29-45. 
[10] Paila Y.D., Pucadyil T.J., Chattopadhyay A., 2005. The cholesterol-complexing agent digitonin modulates ligand binding of the bovine hippocampal serotonin1A receptor. Mol. Membr. Biol. 22(3), 241-249. 
[11] Verstraeten S.L., Albert M., Paquot A., Muccioli G.G., Tyteca D., Mingeot-Leclercq M.P., 2018. Membrane cholesterol delays cellular apoptosis induced by ginsenoside Rh2, a steroid saponin. Toxicol. Appl. Pharmacol. 352, 59-67. 
[12] Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Podstawy biologii komórki. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 2007. 
107 

[13] Dołowy K., Szewczyk A., Pikuła S. Błony biologiczne. Wydawnictwo Śląsk, Katowice, 2003. 
[14] Pike L.J, 2003. Lipid rafts: bringing order to chaos. J. Lipid Res. 44, 655–667. 
[15] Schumann-Gillett A., O’Mara M.L., 2019. The effects of oxidised phospholipids and cholesterol on the biophysical properties of POPC bilayers. Biochim. Biophys. Acta 1, 210-219. 
[16] Gironi B., Paolantoni M., Morresi A., Foggi P., Sassi P., 2018. The Influence of Dimethyl Sulfoxide on the Low -Temperature Behavior of Cholesterol-Loaded Palmitoyl-oleylphosphatidylcholine Membranes. J. Phys. Chem. B 122(24), 6396-6402. 
[17] Milhas D., Clarke C.J., Hannun Y.A., 2010, Sphingomyelin Metabolism at the Plasma Membrane: Implications for Bioactive Sphingolipids. FEBS lett. 584(9), 1887-1894. 
[18] G. van Meer, D.R. Voelker, G.W. Feigenson, 2008. Membrane lipids: where they are and how they behave., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 112–124. 
[19] Lokar, M., Kabaso, D., Resnik, N., Sepčić, K., Kralj-Iglič, V., Veranič, P., Zorec R., Iglič, A., 2012. The role of cholesterol-sphingomyelin membrane nanodomains in the stability of intercellular membrane nanotubes. Int. J. Nanomed. 7, 1891–1902. 
[20] Korchowiec, B., Gorczyca, M., Wojszko, K., Janikowska, M., Henry, M., Rogalska, E., 2015. Impact of two different saponins on the organization of model lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta -Biomembranes 1848(10), 1963–1973. 
[21] Krause M.R., Regen S.L., 2014. The structural role of cholesterol in cell membranes: from condensed bilayers to lipid rafts. Acc. Chem. Res. 47, 3512-3521. 
[22] Lorent J., Le Duff C.S., Quetin-Leclercq J., Mingeot-Leclercq M.P., 2013. Induction of highly curved structures in relation to membrane permeabilization and budding by the triterpenoid saponins α-and δ-hederin. J. Biol. Chem. 288(20), 1400-1417. 
[23] Oliveira O.N., 1992. Langmuir-Blodgett films -properties and possible applications. Braz. J. Phys. 22, 60-69. 
[24] Gaines G.L. Insoluble monolayers at liqiud-gas interfaces. A division of John Wiley Sons, INC, Nowy Jork, 1966. 
[25] Czapla, K., Korchowiec, B., Rogalska, E., 2010. Differentiating oxicam nonsteroidal antiinflammatory drugs in phosphoglyceride monolayers. Langmuir 26(5), 3485-3492. 
[26] Czapla, K., Korchowiec, B., Orlof, M., Magnieto, J.R., Rogalska, E., 2011. Enzymatic probing of model lipid membranes: Phospholipase A2 activity toward monolayers modified by oxicam nsaids. J. Phys. Chem. B 115(29), 9290-9298. 
[27] Maget -Dana R., 1999. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane -lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta 1462, 109 -140. 
BIBLIOGRAFIA 
[28] Pigoń K., Ruziewicz Z. Chemia fizyczna 1. Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa, 2009. 
[29] Langmuir I., 1933. Oil Lenses on Water and the Nature of Monomolecular Expanded Films, J.Chem. Phys. 1, 756 -776. 
[30] Harkins W.D. The physical chemistry of surface films, Reinhold Publishing Co., Nowy Jork, 1954. 
[31] Ni S., Lee W., Li B., Esker A.R., 2006. Thermodynamics of the liquid expanded to condensed phase transition of Poly(L-lactic acid) in Langmuir monolayers. Langmuir 22, 3672-3677. 
[32] Chou T.H., Chang C.H., 2000. Thermodynamic characteristics of mixed DPPC/DHDP monolayers on water and phosphate buffer subphases. Langmuir 16, 3385-3390 
[33] Gopal A., Lee K.Y.C., 2001., Morphology and collapse transitionsin binary phospholipid monolayers. J. Phys. Chem. B 105, 10348–10354. 
[34] Taylor D.M., 2000. Developments in the theoretical modelling and experimental measurement of the surface potential of condensed monolayers. Adv. Colloid Interface Sci. 87, 183-203. 
[35] Vogel V., Mobius D., 1988. Local surface potentials and electric dipole moments of lipid monolayers: Contributions of the water/lipid and the lipid/air interfaces. J. Colloid Interface Sci. 126, 408 -420. 
[36] Demchak R.J., Fort T.J., 1974. Surface dipole moments of close-packed nonionized monolayers at he air-water interface. J. Colloid Interface Sci. 46, 191-202. 
[37] Gorczyca M., Korchowiec B., Korchowiec J., Trojan S., Rubio-Magnieto J., Luis S.V., Rogalska E., 2015. A study of the interaction between a family of gemini amphiphilic pseudopeptides and model monomolecular film membranes formed with a cardiolipin. 
J. Phys. Chem. 119, 6668 -6679. 
[38] Feng, S. S.; Gong, K.; Chew, 2002. Molecular Interactions between a Lipid and an Antineoplastic Drug Paclitaxel (Taxol) within the Lipid Monolayer at the Air/Water Interface. Langmuir 18, 4061 -4070. 
[39] Nunes C., Brezesinski G., Pereira-Leite C., Lima J.L., Reis S., Lucio M., 2011. NSAIDs Interactions with Membranes: A Biophysical Approach. Langmuir 27, 10847 – 10858. 
[40] Dervichian D. G., 1939. Changes of Phase and Transformations of Higher Order in Monolayers, J. Chem. Phys. 7, 931 -948. 
[41] Wang Z., Yang S., 2009. Effects of Fullerenes on Phospholipid Membranes: A Langmuir Monolayer Study. Chem. Phys. Chem. 10, 2284 – 2289. 
[42] Lorent J., Lins L., Domenech O., Quetin-Leclercq J., Brasseur R., Mingeot-Leclercq M.P., 2013. Domain formation and permeabilization induced by the saponin α-hederin and its aglycone hederagenin in a cholesterol-containing bilayer. Langmuir 30, 45564569. 
[43] Balazs D.A., Godbey W.T., 2010. Liposomes for use in gene delivery. J. Drug Del. 2011, Article ID 326497. 
[44] Riaz M.K., Riaz M.A., Zhang X., Lin C., Wong K.H., Chen X., Zhang G., Lu A., Yang Z., 2018. Surface functionalization and targeting strategies of liposomes in solid tumor therapy: a review. Int. J. Mol. Sci. 19, 195-222. 
[45] Bangham A.D., 1993. Liposomes: the Babraham Connection. Chem Phys Lipids 64, 275–285. 
[46] Bangham A.D., 1972. Model Membranes. Chem Phys Lipids 8, 386–392. 
[47] Kimelberg 	H.K., 1976. Differential Distribution of Liposome-Entrapped [3 H]methotrexate and Labelled Lipids After Intravenous Injection in a Primate. Biochim Biophys Acta 448, 531–550. 
[48] Seltzer S.E. 1988. Contrast-Carrying Liposomes. Current Status. Invest. Radiol. 23, S122–S125. 
[49] Adzamli I.K., Seltzer S.E., Slifkin M., Blau M., Adams D.F., 1990. Production and Characterization of Improved Liposomes Containing Radiographic Contrast Media, Invest. Radiol. 25, 1217–1223. 
[50] Lasch J., Wohlrab W., 1986. Liposome-Bound Cortisol: A New Approach to Cutaneous Therapy. Biomed Biochim Acta 45, 1295–1299. 
[51] Li L., Hoffman R.M., 1995. Model of Selective Gene Therapy of Hair Growth: Liposome Targeting of the Active Lac-Z Gene to Hair Follicles of Histocultured Skin. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 31, 11–13. 
[52] Ranson M.R., Carmichael J., O’Byrne K., Stewart S., Smith D., Howell A., 1997. Treatment of Advanced Breast Cancer with Sterically Stabilized Liposomal Doxorubicin: Results of a Multicenter Phase II Trial, J. Clin. Oncol. 15, 3185–3191. 
[53] Northfelt D.W., Dezube B.J., Thommes J.A., Levine R., Von Roenn J.H., Dosik G.M., Rios A., Krown S.E., DuMond C., Mamelok R.D., 1997. Efficacy of Pegylated-Liposomal Doxorubicin in the Treatment of AIDS-Related Kaposi’s Sarcoma After Failure of Standard Chemotherapy. J Clin Oncol 15, 653–659. 
[54] Sandeep K., Sunikumar K.T., Sudheer B., Mohanvarma M., 2013. Liposomal drug delivery system -a comprehensive review. Int. J. Drug Dev. Res. 5(4), 62-75. 
[55] Akbarzadeh A., Rezaei-Sadabady R., Davaran S., Joo S.W., Zarghami N., Hanifehpour Y., Samiei M., Kouhi M., Nejati-Koshki K., 2013. Liposome: classification, preparation, and applications. Nano. Res. Lett. 8, 102-111. 
[56] Wesołowska O., Michalak K., Maniewska J., Hendrich A.B., 2009. Giant unilamellar vesicles -a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochim. Pol. 1, 33-39. 
BIBLIOGRAFIA 
[57] Smoluchowski M., 1908. Molekular-kinetische Theorie der Opaleszenz von Gasen im kritischen Zustande, sowie einiger verwandter Erscheinungen. Annalen der Physik 330, 205–226. 
[58] Stefeld J., McKenna S.A., Patel T.R., 2016. Dynamic light scattering: a practical quide and applications in biomedical sciences. Biophys. Rev. 8, 409-427. 
[59] Barron A.R. Physical Methods in Chemistry and Nano Science. 	Rice University, Houston, 2012. 
[60] National Research Council. Controlling the Quantum World: The Science of Atoms, Molecules, and Photons. The National Academies Press, Washington, 2007. 
[61] Weber G., 1950. Fluorescence of riboflavin and flavin-adenine dinucleotide. Biochem. J. 47(1), 114-121. 
[62] Shinitzky M., Barenholz Y., 1978. Fluidity parameters of lipid regions determined by fluorescence polarization. Biochim. Biophys. Acta 515, 367-394. 
[63] Morales-Penningston N.F., Wu J., Farkas E.R., Goh S.L., Konyakhina T.M., Zheng J.Y., Webb W.W. Feigenson G.W., 2010. Biochim. Biophys. Acta 1798(7), 1324-1332. 
[64] Hohenberg P., Kohn W., 1964. Inhomogeneous Electron Gas. Phys. Rev. 136, B864B871. 
[65] Piela L. Idee chemii kwantowej. Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa, 2006. 
[66] Davidson E.R., Feller D., 1986. Basis set selection for molecular calculations. Chem. Rev. 86, 661-696. 
[67] Gaussian 09, Revision A.02, Frisch M.J., Trucks G.W., Schlegel H.B., Scuseria G.E., Robb M.A., Cheeseman J.R., Scalmani G., Barone V., Petersson G.A., Nakatsuji H., Li X., Caricato M., Marenich A., Bloino J., Janesko B.G., Gomperts R., Mennucci B., Hratchian H.P., Ortiz J.V., Izmaylov A.F., Sonnenberg J.L., Williams-Young D., Ding F., Lipparini F., Egidi F., Goings J., Peng B., Petrone A., Henderson T., Ranasinghe D., Zakrzewski V.G., Gao J., Rega N., Zheng G., Liang W., Hada M., Ehara M., Toyota K., Fukuda R., Hasegawa J., Ishida M., Nakajima T., Honda Y., Kitao O., Nakai H., Vreven T., Throssell K., Montgomery J.A., Peralta J. E., Ogliaro F., Bearpark M., Heyd J.J., Brothers E., Kudin K.N., Staroverov V.N., Keith T., Kobayashi R., Normand J., Raghavachari K., Rendell A., Burant J.C., Iyengar S.S., Tomasi J., Cossi M., Millam J.M., Klene M., Adamo C., Cammi R., Ochterski J.W., Martin R.L., Morokuma K., Farkas O., Foresman J.B., Fox D.J., Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2016. 
[68] Jensen F. Introduction to computational chemistry. Wiley, Wielka Brytania, 2017. 
[69] Matta C.F., Boyd R.J., 2007. rozdział: An introduction to the quantum theory of atoms in molecule, tytuł książki: The quantum theory of atoms in molecules. Redaktorzy: Matta C.F., Boyd R.J., Wiley, Wielka Brytania, 2007. 
[70] Mark P., Nilsson L., 2001. Structure and Dynamics of the TIP3P, SPC, and SPC/E Water Models at 298 K. J. Phys. Chem. A 105 (43), 9954–9960. 
[71] Harrach M.F., Drossel B., 2014. Structure and dynamics of TIP3P, TIP4P, and TIP5P water near smooth and atomistic walls of different hydroaffinity. J. Chem. Phys. 140, 174501. 
[72] Leach A.R. Molecular modelling: principles and applications. Prentice Hall, Edynburg, 2001. 
[73] Stachowicz-Kuśnierz A., Trojan S., Ćwiklik Ł., Korchowiec B., Korchowiec J., 2017. Modeling lung surfactant interactions with benzo[a]pyrene. Chem. Eur. J. 23, 53075316. 
[74] Huynh L., Perrot N., Beswick V., Rosilio V., Curmi P.A., Sanson A., ge Jamin N., 2013. Structural properties of POPC monolayers under lateral compression: computer simulations analysis. Langmuir 30(2), 564–573. 
[75] Baoukina S., Mendez-Villuendas E., Tieleman D.P., Molecular View of Phase Coexistence in Lipid Monolayers. J. Am. Chem. Soc. 134, 17543-17553. 
[76] Orczyk M., Wojciechowski K., 2015. Comparision of the effect of two Quillaja bark saponin extracts on DPPC and DPPC/cholesterol Langmuir monolayers. Coll. Surf. B 136, 291-299. 
[77] Nakamura T., Inoue K., Nojima S., Sankawa U., Shoji J., Kawasaki T., Shibata S., 1979. Interaction of saponins with red blood cells as well as with the phosphatidylcholine liposomal membranes. J Pharmacobio-Dynam. 2, 374-382. 
[78] Sudji I.R., Subburaj Y., Frenkel N., Garacia-Saez A.J., Wink M., 2015. Membrane disintergration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules 20, 20146-20160. 
[79] Eid S.Y., El-Readi M.Z., Wink M., 2012. Digitonin synergistically enhances the cytotoxicity of plant secondary metabolites in cancer cells. Phytomedicine 19, 1307-1314. 
[80] Sucharzewska D., Stochmal A., Oleszek W., 2003. The effect of Yucca schidigera extract on the physical structure and on the oxidative stability of sugar-candy foam products. Lebensm. Wiss. Technol 36, 347-351. 
[81] Tao W., Duan J., Zhao R., Li X., Yan H., Li J., Guo S., Yang N., Tang Y., 2013. Comparison of three officinal Chinese pharmacopoeia species of Glycyrrhiza based on separation and quantification of triterpene saponins and chemometrics analysis. Food Chem. 141(3), 1681-1689. 
[82] Patent WO 2003/055514 A1 Compositions comprising immunoreactive reagents and saponins, and methods of use thereof. WIPO, https://lens.org/187-909-864-733-970. 
[83] Moses T., Papadopoulou K.K., Osbourn A., 2014. Metabolic and functional diversity of saponins, biosynthetic intermediates and semi-synthetic derivatives. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 49(6), 439-462. 
BIBLIOGRAFIA 
[84] Kregiel D., Berlowska J., Witonska I., Antolak H., Proestos C., Babic M., Babic L., Zhang B. rozdział: Saponin-Based, Biological-Active Surfactants from Plants. tytuł książki: Application and Characterization of Surfactants. redaktor: Reza Najjar, IntechOpen, Rijeka, 2017. 
[85] Kim Y.S., Cho I.H., Jeong M.J.,Jeong S.J., Nah S.Y., Cho Y.S., Kim S.H., Go A., Kim S.E., Kang S.S., Moon C.J., Kim J.C, Kim S.H, Bae C.S., 2011. Therapeutic effect of total ginseng saponin on skin wound healing. J. Ginseng Res. 35, 360-367. 
[86] Auyeung K.K., Law P.C., Ko J.K., Astargalus saponins induce apoptosis via an ERK-independent NF-kappaB signaling pathway in the human hepatocellular HepG2 cell line. Int. J. Mol. Med. 23(2), 189-196. 
[87] Man S., Gao W., Zhang Y., Huang L., Liu C., 2010. Chemical study and medical application of saponins as anti cancer agents. Fitoterapia 81, 703-714. 
[88] Haridas V., Higuchi M., Jayatilake G.S., Bailey D., Mujoo K., Blake M.E., Arntzen C.J., Gutterman J.U., 2001. Avicins: triterpenoid saponins from Acacia victoriae (Bentham) induce apoptosis by mitochondrial perturbation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(10), 5821-5826. 
[89] Xu Z.X., Liang J., Haridas V., Gaikwad A., Connolly F.P., Mills1and G.B., Gutterman J.U., 2007. A plant triterpenoid, avicin D, induces autophagy byactivation of AMPactivated protein kinase. Cell Death Differ. 14, 1948–1957. 
[90] Lemeshko V.V., Haridas V., Quijano Perez J.C., Gutterman J.U., 2006. Avicins natural anticancer saponins, permeabilize mitochondrial membranes. Arch. Biochem. Biophys. 454, 114-122. 
[91] Edwards C.H., Edwards G.A., Gadsden E.L., 1964. Tomatine and digitonin as precipitating agents in the estimation of cholesterol. Anal. Chem. 36, 420-421. 
[92] Goodman J.R., Jarnagin L.P., Meier R.M., Shonley I.A., Determination of free and esterified cholesterol by a modified digitonin-anthrone method. Anal. Chem. 35,760-763. 
[93] Eid S.Y., El-Readi M.Z., Eldin E.E., Fatani S., Wink M., 2013. Influence of combinations of digitonin with selected phenolics terpenoids, and alkaloids on the expression and activity of P-glycoprotein in leukemia and colon cancer cells. Phytomedicine 21, 47-61. 
[94] Akiyama T., Takagi S., Sankawa U., Inari S., Saito H., 1980. Saponin-cholesterol interaction in the multibilayers of egg yolk lecithin as studied by deuterium nuclear magnetic resonance: digitonin and its analogs. Biochemistry 19, 1904-1911. 
[95] Yu B.S., Choi H.O., 1986. The effects of digitonin and glycyrrhizin on liposomes. Arch. Pharma. Res. 9, 119-125. 
[96] Mitra S., Dungan S.R., 2001. Cholesterol solubilization in aqueous micellar solutions of quillaja saponin, bile salts, or nonionic surfactants. J. Agric. Food Chem. 49, 384-394. 
[97] Fan H.Y., Heerklotz H., 2017. Digitonin does not flip across cholesterol-poor membranes. 
J. Colloid Interface Sci. 504, 283-293. 
[98] Schulz I., 1990. Permeabilizing cells: some methods and applications for the study of intracelluar processes. Methods Enzymol. 192,280-300. 
[99] Golemanov K., Tcholakova S., Denkov N., Pelan, E., Stoyanov S.D, Remarkably high surface visco-elasticity of adsorption layers of triterpenoid Saponins. Soft Matter 9, 5738-5752. 
[100] Takagi S., Otsuka H., Akiyama T., Sankawa U., 1982. Digitonin-cholesterol complex formation: Effect of varying the length of the side-chain. Chem. Pharm. Bull. 30(10), 3485-3492. 
[101] Hao C., Zhang L., Sun R., Yang J., He G., 2014. Interaction Between Ganglioside GM1 and Diosgenin in Langmuir Monolayers at the Air/Water Interface. SCANNING 36, 218-223. 
[102] Huang C.H., Liu D.Z., Jan T.R., 2010. Diosgenin, a Plant-Derived Sapogenin, Enhances Regulatory T-Cell Immunity in the Intestine of Mice with Food Allergy. J. Nat. Prod. 73, 1033-1037. 
[103] Trouillas P., Corbiere C., Liagre B., Duroux J.C., Beneytout J.C, 2004. Structurefunction relationship for saponin effects on cell cycle arrest and apoptosis in the human 1547 osteosarcoma cells: a molecular modelling approach of natural molecules structurally close to diosgenin. Bioorg. Med. Chem. 13, 1141-1149. 
[104] Lepage C., Liagre B, Cook-Moreau J., Pinon A., Beneytout J.L. 2010. Cyclooxygenase2 and 5-lipoxygenase pathways in diosgenin-induced apoptosis in HT-29 and HCT-116 colon cancer cells. Int J Oncol. 36(5), 1183-1191. 
[105] Chiang C.T., Way T.D., Tsai S.J., Lin J.K., 2007. Diosgenin, a naturally occurring steroid, suppresses fatty acid synthase expression in HER2-overexpressing breast cancer cells, through modulating Akt, mTOR and JNK phosphorylation. FEBS Lett. 581, 5735-5742. 
[106] Srinivasan S., Koduru S., Kumar R., Venguswamy G., Kyprianou N., Damodaran C., 2009. Diosgenin targets Akt-mediated prosurvival signaling in human breast caner cells. Int. J. Cancer. 125(4), 961-967. 
[107] Li F., Fernandez P.P., Rajendran P., Hui K.M., Stthi G., 2010. Diosgenin, a steroidal saponin, inhibits STAT3 signaling pathway leading to suppression of proliferation and chemosensitization of human hepatocellular carcinoma cells. Cancer Lett. 292, 197-207. 
[108] Corbiere C., Liagre B., Terro F., Beneytout J.L., 2004. Induction of antiproliferative effect by diosgenin through activation of p53, release of apoptosis-inducing factor (AIF) and modulation of caspase-3 activity in different human cancer cells. Cell Research 14(3), 188-196. 
[109] Raju J. Rao C.V. chapter: Diosgenin, a Steroid Saponin Constituent of Yams and Fenugreek: Emerging Evidence for Applications in Medicine; tytuł książki: Bioactive compounds in Phytomedicine; edytor Iraj Rasooli, IntechOpen, 2012. 
BIBLIOGRAFIA 
[110] Moalic S., Liagre B., Corviere C., Bianchi A., Dauca M., Bordji K., Beneytout J.L., 2001. A plant steroid, diosgenin, induces apoptosi, cell cycle arrest and COX activity in osteosarcoma cells. FEBS Letters 506, 225-230. 
[111] Tohda C., Yang X., Matsui M., Inada Y., Kadomoto E., Nakada S., Watari H., Shibahara N., 2017. Diosgenin-Rich Yam Extract Enhances Cognitive Function: A Placebo-Controlled, Randomized, Double-Blind, Crossover Study of Healthy Adults. Nutrients 9, 1160-1173. 
[112] Nag S.A., Qin J.J., Wang W., Wang M.H., Wang H., Zhang R., 2012. Ginsenosides as anticancer agents: invitro and invivo activities, structure -activity relationships, and molecular mechanisms of action. Front. Pharmacol. 3, 25. 
[113] Cheng C.C., Yang S.M., Huang C.Y., Chang W.M., Hsu S.L., 2005. Molecular mechanisms of ginsenoside Rh2 -mediated G1 growth arrest and apoptosis in human lung adenocarcinoma A549 cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 55, 531-540. 
[114] Park J.A., Kwang Y.L., Oh Y.J., Kim K.W., Lee S.K., Activation of caspase-3 protease via a Bcl-2-insensitive pathway during the process of ginsenoside Rh2-induced apoptosis. Cancer Lett. 121, 73-81. 
[115] Kim A.D., Kang K.A., Zhang R., Lim C.M., Kim H.S., Kim D.H., Jeon Y.J., Lee C.H., Park J., Chang W.Y., Hyun J.W., 2010. Ginseng saponin metabolite induces apoptosis in MCF-7 breast cancer cells through the modulation of AMP -activated protein kinase. Environ. Taxicol. Pharmacol. 30, 134-140. 
[116] Seoane R., Dynarowicz -Łątka P., Minones Jr. J., Rey -Gomez -Serranillos I., 2001. Mixed Langmuir monolayers of cholesterol and essential fatty acids. Colloid. Polym. Sci. 279, 562 -570. 
[117] Deleu M., Lorent J., Lins L., Brasseur R., Braun R., Braun N., Kirat K. E., Nylander T., Dufrene Y. F., Mingeot-Leclercq M.P., 2013. Effects of surfactin on membrane models displaying lipid phase separation. Biochim. Biophys. Acta 1828, 801-815. 
[118] Montenez J.P., Van Bambeke F., Pieret J., Brasseur R., Tulkens P.M., Mingeot-Leclercq M.P., 1999. Interactions of macrolide antibiotics (Erythromycin A, roxithromycin, erythromycylamine [Dirithromycin], and azithromycin) with phospholipids: computer-aided conformational analysis and studies on acellular and cell culture models. Toxicol. Appl. Pharmacol. 156, 129-140. 
[119] Barlett G.R., 1959. Colorimetric assay methods for free and phosphorylated glyceric acids. J. Biol. Chem. 234, 469-471. 
[120] Angelova M.I. rozdział: Liposome Electroformation; tytuł książki: Perspectives in Supramolecular Chemistry. Edytor P. L. Luisi and P. Walde. Wiley, 1999. 
[121] Angelowa M.I., Soleau S., Meleard P., Faucon J.F., Bothorel P., 1992. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Prog. Colloid Polymer Sci. 89, 127-131. 
[122] Parasassi T., De Stasio G., d’Ubaldo A., Gratton E., 1990. Phase fluctation in phospholipid membranes revealed by Laurdan fluorescence. Biophys. J. 57, 1179-1186. 
[123] Ayuyan A.G., Cohen F.S., 2006. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys. J. 91, 2172-2183. 
[124] Roothaan C.C., 1951. New Developments in Molecular Orbital Theory. Rev. Mod. Phys. 23, 69-89. 
[125] [5] Becke A.D., 1993. Density-functional thermochemistry. 	III. The role of exact exchange. J. Chem. Phys., 98, 5648-5652. 
[126] Grimme S., Antony J., Ehrlich S., Krieg H., 2010. A consistent and accurate ab initio parametrization of density functional dispersion correction (DFT-D) for the 94 elements H-Pu. J. Chem. Phys. 132 (15), 154104. 
[127] Ditchfield R., Hehre W.J., Pople J.A.,1971. Self-Consistent Molecular Orbital Methods. 
9. Extended Gaussian-type basis for molecular-orbital studies of organic molecules, J. Chem. Phys. 54 724-728. 
[128] McLean A.D., Chandler G.S., 1980. Contracted Gaussian-basis sets for molecular calculations. 1. 2nd row atoms, Z=11-18. J. Chem. Phys. 72, 5639-5648. 
[129] Boys S.F. Bernardi F., 1970. Calculation of Small Molecular Interactions by Differences of Separate Total Energies – Some Procedures with Reduced Errors. Mol. Phys. 19, 553
566. 
[130] AIMAll (Version 13.11.04), Todd A. Keith, TK Gristmill Software, Overland Park KS, USA, 2013 (aim.tkgristmill.com) Mol. Phys., 19, 553-566. 
[131] Mayne, C. G., Saam, J., Schulten, K., Tajkhorshid, E., Gumbart, J. C., 2013. Rapid parameterization of small molecules using the Force Field Toolkit. J. Comp. Chem. 34(32), 2757-2770. 
[132] Humphrey W., Dalke A., Schulten K., 1996. VMD: Visual molecular dynamics. J. Mol. Graph. 14, 33–38. 
[133] Kale L., Skeel R., Bhandarkar M., Brunner R., Gursoy A., Krawetz N., Phillips J., Shinozaki A., Varadarajan K., Schulten K., 1999. NAMD2: Greater scalability for parallel molecular dynamics. J. Comput. Phys. 151, 283-312. 
[134] Brooks B.R., Bruccoleri R. E., Olafson B. D., States D. J. , Swaminathan S., Kar-plus M., 1983. CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations. J. Comput Chem. 4(2), 187-217. 
[135] Jorgensen W. L., Chandrasekhar J., Madura J. D., Impey R. W., Klein M. L., 1983. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water. J. Chem. Phys. 79, 926-935. 
[136] Feller S.E., Zhang Y.H., Pastor R.W., Brooks B.R., 1995. Constant pressure molecular dynamics simulation: The Langevin piston method. J. Chem. Phys. 103, 4613-4621. 
BIBLIOGRAFIA 
[137] Kwiecinska K. Powinowactwo wybranych monodesmosydycznych saponin do mono-warstw cholesterolu. Praca magisterska. Wydział Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego, 2015. 
[138] Davies J.T., Rideal E.K., Interfacial phenomena. Academic Press. Nowy Jork, 1963. 
[139] Bhakoo M., Brickbeck T.H., Freer J.H., 1982. Interaction of Staphylococcus Aureus δ-lysin with phospholipid monolayers. Biochemistry 21, 6879-6883. 
[140] Bojarska-Kujawa D., Cyboran D., Oszmiański J., Kleszczyńska H., 2015. Aktywność przeciwutleniająca ekstraktów polifenolowych z owoców czerwonej porzeczki i żurawiny w odniesieniu do błony erytrocytów. ŻNTJ 3(100), 148-149. 
[141] Chong P.L., Wong P.T., 1993. Interaction of Laurdan with phosphatidylcholine liposomes: a high pressure FTIR study. Biochim. Biophys. Acta 1149, 260-266. 
[142] Orczyk M., Wojciechowski K., Brezesinski G., 2017. Disordering effects of digitonin on phospholipid monolayers. Langmuir 33, 3871-3881. 
[143] Verstraeten S., Deleu M., Janikowska-Sagan M., Claereboudt E., Lins L., Tyteca D., Mingeot-Leclercq M.P., 2019. The activity of the saponin ginsenoside Rh2 is enhanced by the interaction with membrane sphingomyelin but depressed by cholesterol. Sci. Rep. 9, numer artykułu: 7285. 
[144] Matsubayashi Y., Iwai L., Toda T., Lu Q.R., Kawasaki H., 2009. Immunostaining for oligodendrocyte-specific galactosphingolipids in fixed brain sections using the cholesterol-selective detergent digitonin. J. Neurosci. Methods 178, 87-98. 
[145] Simons K., Ikonen E., 1997. Functional rafts in cell memebranes. Nature 387, 569-572. 
[146] Lingwood D., Kaiser H.J., Levental I., Simons K., 2009. Lipid rafts as functional heterogeneity in cell membranes. Biochem. Soc. Trans. 37, 955-960. 
[147] Elias P.M., Goerke J., Friend D.S., Brown B.E., 1978. Freeze-fracture indentification of sterol-digitonin complexes in cell and liposome membranes. J. Cell Biol 78, 577-596. 
[148] Nishikawa M., Nojima S., Akiyama T., Sankawa U., Inoue K., 1984. Interaction of digitonin and its analogs with membrane cholesterol. J . Biochem. 96, 1231-1239. 
Streszczenie rozprawy doktorskiej 
Celem niniejszej rozprawy doktorskiej było scharakteryzowanie oddziaływań fizykochemicznych między cząsteczkami digitoniny i cholesterolu błonowego. W prowadzonych badaniach tworzono modelowe membrany biologiczne, które następnie poddawano działaniu saponiny, digitoniny lub ginsenozydu Rh2. Do badań wykorzystywano metody eksperymentalne i teoretyczne. Eksperymenty wykonywano przy użyciu metody monowarstw Langmuira oraz metod spektroskopowych i fluorescencyjnych z wykorzystaniem dużych i ogromnych jednowarstwowych liposomów, symulację komputerowe prowadzono z wykorzystaniem metod klasycznej dynamiki molekularnej i metod chemii kwantowej. Praca doktorska została podzielona na trzy zasadnicze części. Pierwszą z nich stanowił przegląd literatury naukowej dotyczącej badanego zagadnienia. Na początku została opisana budowa, funkcje i skład błony komórkowej. Szczególną uwagę poświęcono wykorzystywanym w nauce modelom błon biologicznych. Przegląd literaturowy został zakończony podrozdziałem poświęconym saponinom, ich występowaniu, znaczeniu biologicznym oraz wykorzystywaniu w naukach biomedycznych. W drugiej części pracy opisano materiał badawczy oraz szczegóły eksperymentalne metod wykorzystanych w badaniach. Materiał badawczy stanowiły: cholesterol (CHOL) i diosgenina będące sterolami; POPC stanowiący fazę nieuporządkowaną modelowej błony; oraz sfingomielina (SM), która wraz z cholesterolem wchodzi w skład raft lipidowych. W badaniach zostały zastosowane filmy powierzchniowe o czterech różnych kompozycjach: cholesterol, diosgenina, mieszaniny: POPC/SM oraz POPC/SM/CHOL. Tak utworzone filmy powierzchniowe były poddawane działaniu digitoniny. W badaniach zastosowano dwa rodzaje subfaz: wodną oraz wodny roztwór digitoniny. W badaniach liposomowych wykorzystywano duże i olbrzymie jednowarstwowe liposomy składające się następujących mieszanin równomolowych: ePC/SM oraz ePC/SM/CHOL. Liposomy były inkubowane z saponinami: digitoniną i ginsenozydem Rh2. W ostatniej zasadniczej części pracy przedstawiono uzyskane wyniki pomiarów oraz ich dyskusję. Otrzymane wyniki zostały podzielone na trzy części, z których pierwsza dotyczyła czystych monowarstw cholesterolu bądź diosgeniny. Uzyskane wyniki pokazały, że digitonina destabilizowała zarówno monowarstwę cholesterolu jak i diosgeniny. Symulacja in silico pokazała, że w przypadku gdy błona została ściśnięta do ciśnienia powierzchniowego przypominającego to panujące w natywnych membranach biologicznych digitonina oddziaływała znacznie silniej z cholesterolem, niż z diosgeniną, co świadczyło o dużej roli łańcucha alifatycznego sterolu w oddziaływaniu z badaną saponiną. Ponadto obliczenia kwantowo-chemiczne wykazały, że oddziaływania między cząsteczkami cholesterol -digitonina, a także diosgenina -digitonia były stabilizujące, a między oddziałującymi cząsteczkami występowały punkty krytyczne wiązania odpowiadające oddziaływaniom Van der Waalsowskim. W drugiej części zostały zaprezentowane wyniki otrzymane z badań nad liposomami zbudowanymi z mieszanin ePC/SM (1:1) oraz ePC/SM/cholesterol (1:1:1). Zarówno digitonina jak i ginsenozyd Rh2 oddziaływały z liposomami. Digitonina oddziaływała silniej z liposomami, w których skład wchodził cholesterol. Natomiast ginsenozyd Rh2 miał większy wpływ na liposomy dwuskładnikowe. Ponadto jego funkcja w błonie była podobna do roli cholesterolu, to znaczy następowało usztywnienie błony w czasie gdy liposomy były inkubowane z ginsenozydem Rh2. Trzecią część wyników stanowiły badania nad oddziaływaniem digitoniny z monowarstwami utworzonymi z POPC/SM (1:1), a także POPC/SM/CHOL (1:1:1). Wykazano, że saponina oddziaływała z obiema monowarstwami. Jednakże penetracja części aglikonowej digitoniny do wnętrza membrany następowała tylko w przypadku gdy monowarstwa zawierała cholesterol. Praca została zakończona zestawieniem najważniejszych wniosków płynących z wykonanych badań. Następnie została podana bibliografia, z której korzystano podczas tworzenia części literaturowej pracy oraz dyskusji wyników. 
Spis publikacji i wystąpień konferencyjnych 
Wyniki badań przedstawione w niniejszej rozprawie doktorskiej zostały zamieszczone w następujących artykułach: 
1. 
Korchowiec B., Gorczyca M., Wojszko K., Janikowska M., Henry M., Rogalska E., 
2015. Impact of two different saponins on the organization of model lipid membranes. 
Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1848(10), 1963–1973. 


2. 
Verstraeten S., Deleu M., Janikowska-Sagan M., Claereboudt E., Lins L., Tyteca D., 
Mingeot-Leclercq M.P., 2019. The activity of the saponin ginsenoside Rh2 is enhanced 
by the interaction with membrane sphingomyelin but depressed by cholesterol. Sci. 
Rep. 9, 7285. 



Pozostały dorobek naukowy: 
1. 
Wnętrzak, A., Chachaj-Brekiesz, A., Janikowska-Sagan M., Rodriguez J.L., Conde 
J.M., Dynarowicz-Łątka P., 2019. Crucial role of the hydroxyl group orientation in 
Langmuir monolayers organization–The case of 7-hydroxycholesterol epimers. Colloids 
Surf., B 563, 330-339. 


2. 
Wnętrzak, A., Chachaj-Brekiesz, A., Janikowska-Sagan M., Dynarowicz-Łątka P., 2019. Influence of 7-hydroxycholesterol on sphingomyelin and sphingomyelin/phosphatidylcholine films -The Langmuir monolayer study complemented with theoretical calculations. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 4, 861-870. 


Prezentacje na konferencjach naukowych: 
1. 
15th European Student Colloid, 8 -11 lipca 2015, Kraków: 
Janikowska M., Korchowiec B., Gorczyca M., Wojszko K., Trojan S., Max H., Korchowiec J. Poster: „Action of selected saponins on biological model membranes” 


2. 
15th European Student Colloid, 8 -11 lipca 2015, Kraków: 
Trojan S., Eustarbowska M., Korchowiec B., Janikowska M., Jean-Pierre J., Korchowiec J. Poster: „The role of chain unsaturation in the formation of organized molecular 
films of crown ether -modified phospholipid monolayers”. 



120 
3. 
16th International Conference on Organized Molecular Films, 25 -29 lipca 2016, Helsinki, Finlandia: Janikowska M., Kwiecińska K., Trojan S., Korchowiec B., Korchowiec J. Poster: „The affinity of selected monodesmosidic saponins to the monolayer of cholesterol”. 

4. 
16th International Conference on Organized Molecular Films, 25 -29 lipca 2016, Helsinki, Finlandia: Trojan S., Stachowicz-Kuśnierz A., Janikowska M., Korchowiec B., Korchowiec J. Poster: ”The influence of benzo[a]pyrene on model pulmonary surfactant monolayers composed of phosphathidylcholine and phosphatidylglycerol”. 

5. 
Current Trends in Theoretical Chemistry VII 4 -8 września 2016, Kraków: Janikowska M., Kwiecińska K., Korchowiec B., Korchowiec J. Poster: „Modeling the adsorption of digitonin to cholesterol and diosgenin monolayers”. 

6. 
PhD day at the LDRI, 23 maja 2017, Bruksela, Belgia: Verstraeten S., Janikowska M., Albert M., Leonard C., Tyteca D., Mingeot Leclercq 


M.P. Poster: „Role of membrane cholesterol in the apoptosis induced by ginsenoside Rh2, a steroid saponin”.