Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Agnieszka Szkaradek Optymalizacja procedur wytwarzania preparatów mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej dla potrzeb regeneracji kostno-chrzęstnych ubytków stawów Rozprawa doktorska Praca doktorska wykonana po kierunkiem: promotora prof. dr hab. Ewy Zuby-Surmy, promotora pomocniczego dr Anny Łabędź-Masłowskiej w Zakładzie Biologii Komórki Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie we współpracy z: Jagiellońskim Centrum Innowacji Sp. z o.o. w Krakowie. Kraków 2021 Praca została zrealizowana w ramach projektu pt.: „Opracowanie zoptymalizowanych metod leczenia uszkodzeń tkankowych w oparciu o innowacyjne kompozyty oraz mezenchymalne komórki macierzyste i ich pochodne u pacjentów z chorobami cywilizacyjnym” (BioMiStem) kierowanego przez prof. dr. hab. Ewę Zubę-Surmę, finansowanego ze środków programu strategicznego STRATEGMEDIII przez Narodowego Centrum Nauki i Rozwoju (NCBR) (STRATEGMED3/303570/7/NCBR/2017). oraz I edycji programu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego pt. „doktorat wdrożeniowy”, którego celem jest wdrażanie wyników prowadzonej działalności naukowej doktoranta do przedsiębiorstwa. Przedsiębiorca biorący udział w programie: Jagiellońskie Centrum Innowacji Sp. z o.o. Opiekun ze strony firmy: dr Łukasz Kutrzeba Składam serdeczne podziękowania: Pani prof. dr hab. Ewie Zubie-Surmie promotorowi mojej pracy, za stworzenie warunków rozwoju naukowego, ofiarowany mi czas i cenne rady w realizowaniu projektu badawczego niniejszej pracy doktorskiej; dr Annie łabędź-Masłowskiej promotorowi pomocniczemu, za opiekę, pomoc w czasie studiów doktoranckich oraz pomoc merytoryczną w przygotowaniu niniejszej rozprawy doktorskiej; dr n.med. Małgorzacie Sekule –Stryjewskiej dr Elżbiecie Karnas dr Marcie Pabiś oraz mgr Sylwii Nodze za merytoryczne wsparcie, przyjazną atmosferę oraz owocną współpracę; Koleżankom i Kolegom z Zakładu Biologii Komórki WBBiB UJ za stworzenie miłej atmosfery pracy; Prezesowi Pawłowi Błachno oraz opiekunowi Dr Łukaszowi Kutrzebie z Jagiellońskiego Centrum Innowacji za umożliwienie mi rozwoju zawodowego, a także życzliwość i wsparcie. Szczególne podziękowania składam mojemu kochanemu mężowi za cierpliwość, wyrozumiałość i wiarę we mnie każdego dnia. Spis treści WYKAZ SKRÓTÓW ................................................................................................................ 6 STRESZCZENIE ..................................................................................................................... 10 SUMMARY ............................................................................................................................. 14 1.1. Definicja oraz klasyfikacja komórek macierzystych................................................ 17 1.2. Właściwości MSCs jako źródła komórek dla zastosowań w medycynie regeneracyjnej ...................................................................................................................... 19 1.3. Biomateriały stosowane w inżynierii tkankowej do regeneracji układu chrzęstno – kostnego ............................................................................................................................... 25 1.4. Zastosowanie terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej – ze szczególnych uwzględnieniem ubytków chrzęstno-kostnych .................................................................... 30 1.5. Znaczenie Dobrej Praktyki Wytwarzania w projektowaniu i wytwarzaniu produktu leczniczego terapii zaawansowanej ...................................................................................... 39 2. CELE PRACY ...................................................................................................................... 51 3. MATERIAŁY I METODY .................................................................................................. 53 3.1. MATERIAŁY ............................................................................................................... 53 3.1.1. Aspirat ludzkiej tkanki tłuszczowej ....................................................................... 53 3.1.2. Aspirat ludzkiego płynu stawowego ...................................................................... 54 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu ............................................. 56 3.1.4. Szczury ................................................................................................................... 57 3.1.5. Materiały i odczynniki certyfikowane do zastosowań klinicznych........................ 57 3.2. METODY ...................................................................................................................... 61 3.2.1. Optymalizacja protokołu wytwarzania preparatów komórkowych w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania .......................................................................................... 61 3.2.1.1. Optymalizacja procedury izolacji frakcji SVF ................................................ 61 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro ................................. 65 3.2.1.3. Optymalizacja fazy implementacyjnej produktu leczniczego ......................... 67 3.2.2. Ocena fenotypu oraz właściwości biologicznych hAT-MSCs hodowanych w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania ....................................................................... 72 3.2.2.1. Ocena morfologii oraz fenotypu antygenowego hAT-MSCs.......................... 72 3.2.2.2. Ocena zdolności różnicowania MSCs w kierunku komórek mezodermy ....... 74 3.2.2.3. Analiza profilu wydzielniczego hAT-MSCs ................................................... 77 3.2.2.4. Test chemotaksji hAT-MSCs w gradiencie ludzkiego płynu stawowego (hSF) ...................................................................................................................................... 81 3.2.3. Analiza składu wybranych czynników w płynie stawowym ................................. 84 3.2.4. Ocena wpływu wybranych podłoży grafenowych na właściwości biologiczne hAT-MSCs w warunkach in vitro oraz in vivo ................................................................ 84 3.2.4.1.Ocena morfologii i fenotypu komórek hAT-MSCs hodowanych na natywnych oraz modyfikowanych podłożach GO .......................................................................... 85 3.2.4.2.Wpływ podłoży grafenowych na proliferację i żywotność hAT-MSCs in vitro ...................................................................................................................................... 86 3.2.4.3. Ocena zdolności różnicowania hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych w kierunku komórek tkanki chrzęstnej i kostnej in vitro ....................... 87 3.2.4.3.1. Analiza profilu ekspresji genów w procesie różnicowania się hAT-MSCs w kierunku chondrocytów in vitro ........................................................................... 88 3.2.4.5. Analiza potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs natywnych oraz różnicowanych na podłożach grafenowych – badania in vivo ..................................... 93 3.2.5. Analiza statystyczna danych .................................................................................. 96 4. WYNIKI ............................................................................................................................... 98 4.1. Opracowanie protokołu izolacji i hodowli hAT-MSCs w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania ......................................................................................................................... 98 4.2. Ocena właściwości biologicznych hAT-MSCs hodowanych in vitro w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania ............................................................................................ 113 4.2.1. Analiza morfologii oraz fenotypu hAT-MSCs ..................................................... 113 4.2.2. Ocena potencjału różnicowania hAT-MSCs in vitro ........................................... 116 4.2.3. Analiza profilu sekrecji hAT-MSCs..................................................................... 121 4.2.4. Ocena aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs w obecności hSF in vitro ........ 125 4.3. Ocena składu molekularnego hSF .......................................................................... 128 4.4. Analiza możliwości wykorzystania hAT-MSCs hodowanych w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania w inżynierii tkankowej .................................................................. 131 4.4.1. Analiza morfologii oraz fenotypu hAT-MSCs hodowanych na natywnych oraz modyfikowanych podłożach grafenowych in vitro ........................................................ 131 4.4.2. Ocena wpływu natywnych i modyfikowanych podłoży grafenowych na proliferację i żywotność hAT-MSCs in vitro ................................................................. 138 4.4.3. Ocena wpływu natywnych i modyfikowanych podłoży grafenowych na indukcję procesów chondrogenezy oraz osteogenezy hAT-MSCs in vitro .................................. 142 4.4.4. Ocena zmian ekspresji genów na poziomie RNA związanych z chondrogenezą w hAT-MSCs hodowanych na natywnych oraz modyfikowanych podłożach grafenowych ................................................................................................................... 150 4.4.5. Ocena potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs in vivo w szczurzym modelu osteoartrozy .................................................................................................................... 160 4.5. Przygotowanie do wdrożenia produktu leczniczego terapii zaawansowanej – wyjątek szpitalny (ATMP-HE) ........................................................................................................ 164 5. DYSKUSJA ....................................................................................................................... 172 6. PODSUMOWANIE WYNIKÓW I WNIOSKI KOŃCOWE............................................ 201 7. SPIS PIŚMIENNICTWA ................................................................................................... 203 8. ZAŁĄCZNIKI .................................................................................................................... 232 WYKAZ SKRÓTÓW Skrót: Nazwa w j. angielskim / łacińskim: Nazwa w j. polskim: ACI autologous chondrocyte implantaion implantacja autologicznych chondrocytów ACI autologous chondrocyte implantaion aplikacja autologicznych chondrocytów ADAMTS A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin metaloproteinaza zawierająca w swej budowie motyw trombospondyny ATIMP Advanced Therapy Investigational Medicinal Product badany produkt leczniczy terapii zaawansowanej - w badaniu klinicznym ATMP Advanced Therapy Medicinal Products produkt leczniczy terapii zaawansowanej ATMP-HE Advanced Therapy Medicinal Product – hospital exemption produkt leczniczy terapii zaawansowanej – podawany w: wyjątku szpitalnym AT-MSCs adipose-derived mesenchymal/stromal stem cells mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące z tkanki tłuszczowej BMAC bone marrow autologous concentrate autologiczny koncentrat szpiku kostnego BMI body mass index wskaźniku masy ciała BM-MSCs bone marrow mesenchymal/stromal cells mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące ze szpiku kostnego BMP bone morphogenetic protein białko morfogenetyczne kości BTiK Cell and Tissue Bank Bank Tkanek i Komórek CAT Committee for Advanced Therapies Komitet ds. Terapii Zaawansowanych cATMP Combined ATMP produkt leczniczy skojarzonej terapii zaawansowanej COMP cartilage oligomeric matrix protein oligomeryczne białko macierzy chrząstki CT clinical trial badanie kliniczne DP-SCs dental pulp stem cells komórki macierzyste miazgi zęba ECM extracelullar matrix macierz zewnątrzkomórkowa EGF epidermal growth factor czynnik wzrostu naskórka EMA European Medicines Agency Europejska Agencja Leków ESCs embryonic stem cells zarodkowe komórki macierzyste EU European Union Unia Europejska EVs extracellular vesicles pechęrzyki zewnątrzkomórkowe FBS fetal bovine serum bydlęca surowica płodowa FGF fibroblast growth factor czynnik wzrostu fibroblastów FSCs fetal stem cells komórki macierzyste występujące w tkankach płodowych GADPH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego GCSF granulocyte colony-stimulating factor czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów GIF - Główny Inspektorat Farmaceutyczny GMP Good Manufacturing Practice Dobra Praktyka Wytwarzania GO graphene oxide tlenek grafenu GTMP Gene Therapy Medicinal Product produkt leczniczy terapii genowej GTR guided tissue regeneration sterowana regeneracja tkanek hAT-MSCs human adipose-derived mesenchymal/stromal stem cells ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące z tkanki tłuszczowej hBM-MSCs human bone marrow mesenchymal/stromal cells ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące ze szpiku kostnego hPL human platelet lysate ludzki lizat płytkowy hSF human synovial fluid ludzki płyn stawowy IGF insulin-like growth factor insulinopodobny czynnik wzrostu iPSCs induced pluripotent stem cells indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste ISCT International Society for Cellular Therapy Międzynarodowe Towarzystwo ds. Terapii Komórkowej IZN - Istotne Zdarzenia Niepożądane KCBTiK - Krajowe Centrum Bankowania Tkanek i Komórek KM stem cells komórki macierzyste MCP-1 membrane cofactor protein 1 monocytarny chemotaktyczny czynnik białkowy 1 MHC major histocompatibility complex antygen zgodności tkankowej MIA sodium monoiodoacetate monojodooctan sodu MMP matrix metalloproteinases metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej MRI magnetic resonance imiging obrazowanie z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego MSCs mesenchymal stem/stromal cells mezenchymalne komórki macierzyste/ stromalne NF-κB nuclear factor kappa B jądrowy czynnik kappa B OA osteoarthritis choroba zwyrodnieniowa stawów / osteoartroza OARSI Osteoarthritis Research Society International Międzynarodowe Towarzystwo Badań Choroby Zwyrodnieniowej Stawów OI łac.osteogenesis imperfecta wrodzona łamliwość kości OP osteoporosis osteoporoza OPG osteoprotegerin osteoprotegeryna PBS phosphate buffered saline buforowany roztwór soli fizjologicznej PDGF-AA platelet-derived growth factor AA płytkopochodny czynnik wzrostu AA PFA paraformaldehyde paraformaldehyd PGE2 prostaglandin E2 prostaglandyna E2 PRP platelet rich plasma osocze bogatopłytkowe PTH parathormon parathormon RANTES regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted chemokina syntetyzowana i wydzielana przez limfocyty T RBC red blood cells krwinki czerwone / erytrocyty SCID severe combined immunodeficiency cieżki niedobór odporności SCTMP Somatic Cell Therapy Medicinal Product produkt leczniczy somatycznej terapii komórkowej SOP standard operating procedure standardowa procedura operacyjna SPF specific patogen free wolny od patogenów SVF stromal vascular-fraction frakcja stromalno-naczyniowa SZJ - System Zapewnienia Jakości TCPS tissue culture polystyrene polisterynowa powierzchnia naczyń hodowlanych TEP Tissue Engineered Product produkt inżynierii tkankowej TGF-β3 transforming growth factor β3 transformujący czynnik wzrostu β3 TNF tumor necrosis factor czynnik martwicy nowotworów TNTs tuneling nanotubes nanorurki tunelujące UC-MSCs umbilical cord mesenchymal stem/stromal cells mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące z krwi pępowinowej VEGF vascular endothelial growth factor czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego WJ-MSCs Wharton's Jelly Mesenchymal Stem/Stromal Cells mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące z galarety Whartona STRESZCZENIE Osteoartroza stawów stanowi współcześnie najczęstszą chorobę stawów prowadzącą do postępującej degradacji chrząstki stawowej oraz uszkodzenia aparatu ruchu u pacjentów. Opracowanie efektywnych strategii leczenia uszkodzeń chrzęstno-kostnych stawów stanowi w tym kontekście jedno z wyzwań współczesnej medycyny regeneracyjnej, dające pacjentom potencjalną możliwość na naprawę uszkodzonych tkanek, a tym samym powrót do normalnej aktywności fizycznej. Mezenchymalne komórki macierzyste/ stromalne (ang. mesenchymal stem/ stromal cells; MSCs), stanowiące od lat przedmiot szeregu badań podstawowych, przedklinicznych oraz klinicznych, wykazują szereg właściwości pożądanych dla ich wykorzystania w naprawie uszkodzonych tkanek, w tym zdolność do różnicowania się w kierunku komórek linii mezodermalnej, tj. m.in. do komórek prekursorowych chondrocytów, mogących zastępować uszkodzone komórki tkanki chrzęstnej. Z kolei immunosupresyjny mechanizm działania MSCs, ich szeroka aktywność wydzielnicza oraz możliwość transferu bioaktywnych cząsteczek do innych komórek, w tym za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, może przyczyniać się m.in. do ograniczenia reakcji zapalnej oraz stymulacji endogennych mechanizmów naprawczych po podaniu komórek MSCs w miejsce uszkodzenia, a zatem również wywierać efekt protekcyjny oraz proregeneracyjny w przebiegu choroby zwyrodnieniowej stawów. Co więcej, liczne badania potwierdzają bezpieczeństwo stosowania MSCs, w tym brak formowania guzów nowotworowych tzw. potworniaków. Właściwości proregeneracyjne MSCs mogą być dodatkowo wzmocnione dzięki zastosowaniu triady inżynierii tkankowej, czyli podejścia łączącego biozgodne rusztowania biomateriałowe, czynniki wzrostowe ukierunkowujące różnicowanie oraz komórki macierzyste (KM), co zwiększa ich integrację z uszkodzoną tkanką in vivo. Jednakże w celu zastosowania preparatów opartych o MSCs w leczeniu pacjentów, koniecznym jest opracowanie procedur pozyskiwania oraz namnażania tych komórek zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Wytwarzania (ang. Good Manufacturing Practice; GMP). W związku z powyższym, głównym celem niniejszej rozprawy doktorskiej - realizowanej w ramach programu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego pt. „Doktorat Wdrożeniowy” - było zoptymalizowanie procedur izolacji oraz ekspansji komórek MSCs pochodzących z ludzkiej tkanki tłuszczowej (ang. human Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells; hAT-MSCs) z uwzględnieniem zasad GMP, w celu dalszego przygotowania klinicznych preparatów komórkowych dla celów regeneracji kostno-chrzęstnych ubytków stawów u pacjentów, które to preparaty stanowią produkty lecznicze w rozumieniu ustawodawstwa EU oraz polskiego. Kolejnym celem realizowanych badań było zbadanie wpływu natywnych i modyfikowanych podłoży opartych o związki grafeun, jako rusztowań do chrzęstnotwórczego i kościotwórczego różnicowania hAT-MSCs w badaniach in vitro i in vivo, a tym samym zweryfikowanie hipotezy, że hAT-MSCs w połączeniu z wybranymi podłożami grafenowymi wykazują zwiększony potencjał chondrogenny i tym samym promują procesy regeneracji uszkodzeń chrzęstno-kostnych, co można wykorzystać w przyszłych zastosowaniach w naprawie tkankowej. W ramach przeprowadzonych badań, w pierwszej kolejności opracowano procedury izolacji frakcji stromalno-naczyniowej (ang. stromal vascular-fraction; SVF) z ludzkiej tkanki tłuszczowej oraz hodowli hAT-MSCs zgodnie ze standardami GMP. Etap prac optymalizacyjnych obejmował takie kroki jak: trawienie enzymatyczne tkanki tłuszczowej oraz związany z tym wybór optymalnego stężenia kolagenazy, wybór pożywki hodowlanej zgodnej z wymogami GMP (w tym pozbawionej produktów odzwierzęcych) oraz naczyń hodowlanych. Komórki hAT-MSCs wyizolowane oraz rozpropagowane przy użyciu zoptymalizowanych, zgodnych z GMP procedur opracowanych w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej, zostały wykorzystane w kolejnym kroku, związanym z realizacją prac implementacyjnych tj. w walidacji procesu wytwarzania produktu leczniczego terapii zaawansowanej – podawanego w wyjątku szpitalnym (ang. Advanced Therapy Medicinal Product – hospital exemption; ATMP-HE) w laboratorium typu cleanroom, tj. spełniającym standard produkcji produktów leczniczych terapii zaawansowanej (ang. Advanced Therapy Medicinal Products; ATMP) w standardzie GMP. Etap ten obejmował: kwalifikację materiału wyjściowego (tj. ludzkiej tkanki tłuszczowej) do procesu wytwarzania, przetwarzanie tkanki tłuszczowej w celu izolacji frakcji SVF, ekspansję hAT-MSCs, zakończenie hodowli oraz przygotowanie końcowej formulacji produktu końcowego (produkt ATMP-HE). Ponadto, biorąc pod uwagę wdrożeniowy charakter prowadzonej rozprawy doktorskiej, po opracowaniu protokołu wytwarzania w/w preparatu komórkowego oraz towarzyszącej mu tzw. dokumentacji miejsca wytwarzania, złożono wniosek dla produktu ATMP-HE do organów nadzorujących, uzyskując pozwolenie Ministra Zdrowia (MZ) na gromadzenie, przechowywanie oraz dopuszczenie do obiegu tkanki tłuszczowej, a także zgodę Głównego Inspektoratu Farmaceutycznego (GIF) na wytwarzanie produktu ATMP-HE - dla Jagiellońskiego Centrum Innowacji Sp. z o.o. w Krakowie (w skrócie: JCI), będącego firmą zaangażowaną w realizację niniejszego doktoratu wdrożeniowego. Tożsamość wyizolowanych hAT-MSCs została potwierdzona zgodnie z kryteriami zalecanymi przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ang. International Society for Cellular Therapy; ISCT). Wykazano m.in. właściwy profil antygenowy hAT-MSCs, jak również potencjał do różnicowania się w kierunku komórek linii mezodermalnej in vitro, tj. w adipoblasty, chondroblasty oraz osteoblasty. Dodatkowo potwierdzono zdolność hAT-MSCs do różnicowania w komórki tkanki chrzęstnej w warunkach in vitro odzwierciedlających mikrośrodowisko panujące w ludzkim stawie kolanowym tj. hipoksji oraz poddanych działaniu podwyższonego ciśnienia. Ponadto zbadano profil czynników wydzielanych przez hAT-MSCs, wykazując m.in. obecność interleukiny (ang. interleukin) 6, IL-8, białka chemotaktycznego monocytów 1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1; MCP-1), czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (ang. Granulocyte Colony-Stimulating Factor; GCSF), mających m.in. wpływ na regulację procesów chondrogenezy. Co istotne, w badaniach dotyczących aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs w gradiencie stężeń czynników obecnych w płynie stawowym (ang. human Synovial Fluid; hSF), pochodzącym od dawców z i bez osteoartrozy (ang. Osteoarthritis; OA), wykazano zwiększoną chemotaksję hAT-MSCs w kierunku czynników hSF w szczególności pochodzących od dawców z OA w porównaniu z kontrolą, co sugeruje tropizm hAT-MSCs do środowiska zapalnego. W celu wyjaśnienia tego zjawiska zbadano profil cytokin, chemokin i czynników wzrostowych w hSF od dawców zdrowych (bez OA) oraz chorych (z OA). Wykazano, że profile te różniły się pomiędzy tymi grupami, co może być związane ze zmiennością osobniczą oraz uzależnione od patofizjologii tkanki chrzęstnej. Następnie zbadano możliwość wykorzystania hAT-MSCs w inżynierii tkankowej poprzez zastosowanie podłoży opartych o związki grafenu, jako potencjalnych rusztowań stymulujących różnicowanie chondrogenne tych komórek. Analiza morfologiczna hAT-MSCs hodowanych na podłożach opartych o tlenek grafenu (GO) wykazała zwiększoną ich adhezję do badanych podłoży, jak również formowanie się samoorganizujących się skupisk komórkowych, co może świadczyć o promowaniu procesów chondrogenezy in vitro. Ponadto, obniżona proliferacja hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych przy zachowaniu wysokiej żywotności komórek może wskazywać na postępujące różnicowanie komórek na rusztowaniach, na co wskazały również zmiany w ekspresji wybranych markerów. Dodatkowo, analiza ekspresji genów na poziomie mRNA potwierdziła, że podłoża grafenowe mogą promować potencjał chondrogenny hAT-MSCs w hodowli in vitro. Wybrane podłoża oparte o GO zastosowano w dalszych badaniach in vivo w szczurzym modelu indukowanej chemicznie osteoartrozy, w których badano potencjał proregeneracyjny hAT-MSCs hodowanych na wymienionych podłożach. Wstępna analiza histologiczna potwierdziła formowanie się tkanki odpowiadającej w obrazie mikroskopowym chrząstce szklistej powierzchni stawowej szczurów, po podaniu hAT-MSCs różnicowanych w kierunku chondroblastów na podłożu kontrolnym tj. polisterynowych powierzchniach naczyń hodowlanych (ang. tissue culture polystyrene; TCPS) oraz na natywnych i modyfikowanych podłożach grafenowych. Podsumowując, podczas realizacji badań objętych niniejszą rozprawą doktorską opracowano zoptymalizowane protokoły izolacji i hodowli hAT-MSCs in vitro - zgodnie z wymogami GMP. Opracowane protokoły stanowiły podstawę do opracowania procedur wytwarzania produktów leczniczych ATMP-HE, które z kolei mogą zostać zaimplementowane w przyszłych badaniach klinicznych. Ponadto, wykazano, że biozgodne podłoża grafenowe - natywne i modyfikowane cząsteczkami złota, mogą wzmacniać chondrogenne różnicowanie hAT-MSCs oraz ich integrację z tkanką chrzęstną, wspierając tym samym odbudowę uszkodzonej chrząstki stawowej, co świadczy o proregeneracyjnych właściwościach tych komórek. W oparciu o uzyskane wyniki opracowano także procedury operacyjne dla wytwarzania produktów ATMP-HE, które zostały wdrożone w firmie (JCI w Krakowie), uczestniczącej w przygotowaniu niniejszego doktoratu wdrożeniowego. SUMMARY Osteoarthritis (OA) represents one of the most common diseases of joints in human patients, leading to the progressive degradation of the articular cartilage and damage to the patient’s locomor system. In this context, one of the challenges of modern regenerative medicine is to develop effective strategies for treatment of cartilage and bone damage, increasing chances of patients to return to ordinary physical activity. Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), which have been for many years the subject of several basic, preclinical and clinical studies, exhibit a number of properties desirable for their use in tissue repair such as the ability of MSCs to differentiate towards the mesodermal cell lineages, including chondrocyte precursor cells that may replace damaged cartilage. On the other hand, the immunosuppressive mechanism of action of MSCs, their broad secretory activity and the possibility of transferring bioactive molecules to other cells via extracellular vesicles, may contribute to the surpression of the inflammatory response and stimulation of endogenous repair mechanisms following administration of MSCs into the site of damage and therefore exert protective and pro-regenerative effects in the osteoarthritis. Moreover, numerous studies confirm the safety of usage of MSCs including the lack of formation of neoplastic tumours, the so-called teratomas. Pro-regenerative properties of MSCs can be additionally enhanced by the use of the tissue engineering triad, i.e. an approach combining biocompatible biomaterial scaffolds, growth factors directingdifferentiation and stem cells (SCs), which increases their integration with damaged tissue. However, in order to use such MSC- based products in the treatment of patients, it would be necessary to develop procedures for harvesting and propagating these cells in accordance with the principles of Good Manufacturing Practice (GMP). Thus, the main objective of this doctoral project - carried out as part of the programme of the Polish Ministry of Science and Higher Education entitled "Implementation Doctorate Programme" - was to optimize the procedures of isolation and expansion of MSCs derived from human adipose tissue (human Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells; hAT-MSCs), taking into account the GMP principles, which cell could be further use for preparation of clinical cellular formulas for regeneration of osteochondral joint defects. Such GMP- based cellular formulas are medicinal products within the meaning of EU and Polish legislation. Another objective of this study was to investigate the effect of native and modified graphene-based scaffolds on hAT-MSCs chondrogenic and osteogenic differentiation potential in vitro and in vivo. Thus, the goal was to verify the hypothesis that hAT-MSCs in combination with selected graphene substrates show increased chondrogenic potential and promote the repair of cartilage and bone damage, which can be used in future applications in tissue repair. In the first part of the study, we developed procedures for isolating the stromal vascular-fraction (SVF) from human adipose tissue and culturing the hAT-MSCs in vitro- in accordance with GMP standards. The optimization stage included following steps: enzymatic digestion of adipose tissue and the related selection of the optimal concentration of collagenase, selection of a GMP-compliant culture medium (including animal-free products) and culture vessels. The isolated hAT-MSCs were propagated using optimized GMP-compliant procedures developed as part of this doctoral project, and were further used in the implementation steps of the project such as validation of the ATMP-HE product manufacturing process in a cleanroom laboratory, i.e. meeting the ATMP manufacturing standard in GMP. This stage included: qualification of the starting material (human adipose tissue) for the production process, processing of the adipose tissue in order to isolate the SVF fraction, expansion of hAT-MSCs, termination of the culture and preparation of the final formulation of the final product (ATMP-HE product). In addition, taking into account the implementation nature of this doctoral project, having the developed protocols for production of the hAT-MSC product, we have prepared the accompanying documentation of the production site, and submitted application the Polish supervisory authorities - to obtain a permit from the Ministry of Health for the accumulation, storage, and release of adipose tissue as well the consent of the Main Pharmaceutical Inspectorate (GIF) to manufacture the ATMP-HE product - for the Jagiellonian Center of Innovation Ltd. (JCI) in Krakow, the company involved in the implementation side of this doctorate. Identity of the isolated hAT-MSCs was confirmed accordingly to the criteria recommended by the International Society for Cellular Therapy (ISCT) for MSC identification including the correct antigenic profile as well as the potential to differentiate into cells of the mesodermal lineage in vitro, including adipocytes, chondroblasts and osteoblasts. Additionally, the ability of hAT-MSCs to differentiate into cartilage cells was confirmed in vitro under conditions reflecting microenvironment of the human knee joint, i.e. hypoxia and those subjected to high pressure. Moreover, the profile of factors secreted by hAT-MSCs was examined, showing the presence of interleukin (IL) 6, IL-8, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), granulocyte colony-stimulating factor (GCSF), which may influence on chondrogenesis. Importantly, the studies on the chemotactic activity of hAT-MSCs in the presence of human synovial fluid (hSF) from donors with or without osteoarthritis (OA), showed increased chemotaxis of hAT-MSCs towards hSF from donors with OA when compared to controls, suggesting that hAT-MSCs tropism to inflammation sites. In order to explain this phenomenon, the cytokine, chemokine and growth factor profile of hSF from healthy donors (without OA) and those sufferring from OA was investigated. It was shown that the profile of hSF from both types of donors was different between these groups, which may be related to individual variability and may depend on the pathophysiology of cartilage. Next, the possibility of employing hAT-MSCs in tissue engineering was investigated by using graphene oxide (GO)-based substrates as potential scaffolds to stimulate chondrogenic differentiation of these cells. Morphological analysis of hAT-MSCs grown on graphene substrates showed their increased adhesion to the tested substrates as well as formation of self-organizing cell clusters, which may indicate promotion of chondrogenesis processes in vitro. Moreover, decreased proliferation of hAT-MSCs on graphene substrates along with sustained high cell viability, may suggest cell differentiation ongoing on the scaffold, which was also indicated by changes in the expression of selected surface markers. Moreover, gene expression analysis at the mRNA level, confirmed that graphene substrates may promote the chondrogenic potential of hAT-MSCs in in vitro culture. The selected GO substrates were used to investigate pro-regenerative potential of hAT-MSCs grown on these substrates in further in vivo studies employing a rat model of chemically induced osteoarthritis. Preliminary histological analysis confirmed the formation of the tissue corresponding to the hyaline cartilage in the rats after administration of hAT-MSCs differentiated into chondroblasts on the control substrate (i.e. tissue culture polystyrene (TCPS) and on native and modified graphene substrates. To summarize, during this doctoral project, we have been developed optimized protocols for isolation and expansion of hAT-MSCs in vitro, in accordance with GMP requirements. The developed protocols provided the basis to develop ATMP-HE medicinal product manufacturing procedures, which may be implemented in future clinical studies. In addition, it has been shown that biocompatible native and gold-modified graphene substrates may enhance chondrogenic differentiation of hAT-MSCs and their integration with cartilage and as such potentially support the damaged articular cartilage repair. Based on the doctoral project results’, appropriate operational procedures for the production of ATMP-HE products were also developed, which were implemented in the company (JCI in Cracow) participating in the implementation side of this doctorate. 1. WSTĘP 1.1. Definicja oraz klasyfikacja komórek macierzystych Komórki macierzyste (KM) stanowiące przedmiot zainteresowania wielu naukowców, stanowią pulę pierwotnych niewyspecjalizowane komórek o nieograniczonym potencjale proliferacyjnym, pozwalającym na samoodnowę puli komórkowej oraz zdolnością do różnicowania w komórki potomne o coraz wyższym stopniu specjalizacji [1]. KM mogą być klasyfikowane pod względem ich potencjału do różnicowania, jak również pochodzenia (Rycina 1) [2,3]. Rycina 1. Hierarchia komórek macierzystych ze względu na potencjał różnicowania. Zygota o cechach totipotencji posiada najwyższy potencjał do różnicowania przy jednocześnie najmniejszym stopniu zróżnicowania tkankowego, dając początek wszystkim komórkom embrionu, jak i trofoblastu. KM pluripotencjalne węzła zarodkowego blastocysty powstałej z moruli, różnicują we wszystkie komórki oprócz trofoblastu, z kolei KM multipotencjalne izolowane z tkanek/organów dają początek komórkom pochodzącym z jednego z trzech listków zarodkowych. KM unipotentne (progenitorowe) różnicują typowo w jeden rodzaj komórek danej tkanki. Przygotowano na podstawie [4], schemat zmodyfikowano. Najwyższy potencjał do różnicowania, tj. w kierunku komórek wszystkich trzech listków zarodkowych, a więc wszystkich tkanek organizmu, jak również tkanek pozazarodkowych trofoblastu (łożyska), posiadają KM totipotencjalne [5]. Zygota będąca komórką totipotencjalną we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego daje początek stadiom moruli, a następnie blastocysty, w których skład wchodzą KM pluripotencjalne, mogące różnicować do wszystkich tkanek dorosłego organizmu z wyjątkiem komórek trofoblastu [4]. Wraz z rozwojem zarodkowym i postępującym ukierunkowaniem tkankowym wyróżnia się KM multipotencjalne wykazujące potencjał do różnicowania w obrębie jednego z trzech listków zarodkowych tj. ektodermy, endodermy lub mezodermy. Przykładem KM multipotencjalnych są mezenchymalne komórki macierzyste/ stromalne (MSCs) [6], KM neuralne [7] czy też KM hematopoetyczne [8]. Z kolei najbardziej ukierunkowaną tkankowo grupę KM stanowią unipotencjalne KM, czyli komórki progenitorowe, różnicujące się zasadniczo w jeden typ tkankowy [9]. Przykładem są komórki satelitarne obecne w mięśniach szkiletowych [10] oraz komórki progenitorowe śródbłonka [11], które pełnią ważną rolę w endogennej regeneracji mikrouszkodzeń tkankowych oraz w naturalnym „obrocie” komórek w tkankach (z ang. cell turnover) [10–12]. Obok w/w podziału komórek macierzystych w zależności o potencjału różnicowania, przyjmuje się również inne kryteria klasyfikacji KM oparte min. na ich źródle pochodzenia KM i na tej podstawie można wyróżnić: (i) embrionalne komórki macierzyste (ang. embryonic stem cells; ESCs), aktualnie stosowane w badaniach w postaci przede ustalonych linii komórek embrionalnych [13], (ii) KM występujące w postnatalnych tkankach popłodowych (ang. fetal stem cells; FSCs), takich jak np. kosmówka, krew pępowinowa, sznur pępowinowy, płyn owodniowy [14], (iii) KM pozyskiwane z tkanek terminalnie zróżnicowanych, czyli dojrzałych - (ang. adult stem cells; adult SCs) [15] oraz (iv) reprogramowane KM, do których należą przede wszystkim indukowane pluripotencjalne KM (ang. induced pluripotent stem cells; iPSCs), które stanowią dziś realną alternatywę dla komórek pluripotencjalnych izolowanych z moruli lub blastocysty (tj. ESCs) [16]. Biorąc pod uwagę rosnącą wiedzę na temat właściwości komórek macierzystych w procesach kształtowania tkanek organizmu, poczynając od formowania zarodka, płodu, następnie w postępującym wzroście i ontogenezie organizmu oraz regeneracji tkanek [17], stały się one obecnie przedmiotem wielu badań mających na celu m.in. opracowanie ich zastosowań u pacjentów w medycynie regeneracyjnej. 1.2. Właściwości MSCs jako źródła komórek dla zastosowań w medycynie regeneracyjnej Wykorzystanie ESCs pozyskiwanych z zarodków do badań naukowych oraz potencjalnych aplikacji klinicznych od lat budzi wiele zastrzeżeń natury nie tylko etycznej, ale również naukowej [18]. Aplikacja kliniczna komórek pochodzących z zarodków, które nie wykazują zgodności w obrębie antygenów HLA z komórkami biorcy, co wiąże się z ich ewentualnym podaniem zawsze w układzie allogenicznym, mogłaby skutkować odrzuceniem takiego przeszczepu i niepowodzeniem procedury transplantacyjnej. Z drugiej strony, u myszy z ciężkim niedoborem odporności (ang. severe combined immunodeficiency; SCID), którym podawano ludzkie ESCs, obserwowano powstawanie guzów nowotworowych tzw. potworniaków, obejmujących histologicznie komórki pochodzące z wszystkich trzech listków zarodkowych [18]. Powyższe aspekty przyczyniły się z jednej strony do ograniczenia możliwości zastosowania terapii opartych o ESCs w praktyce klinicznej, z drugiej zapoczątkowały rozwój alternatywnych metod pozyskiwania komórek macierzystych o cechach pluripotencji. Taką alternatywę stanowią obecnie iPSCs (ang. induced pluripotent stem cells), których wykorzystanie nie budzi kontrowersji etycznych związanych z pochodzeniem tych komórek, tworzonych de novo na drodze tzw. reprogramowania genetycznego [19]. Podobnie jak ESCs, komórki te mogą potencjalnie różnicować w dowolną komórkę tkanek ciała organizmu, poza komórkami łożyska [20]. Reprogramowanie komórek somatycznych w celu otrzymania iPSCs następuje w wyniku transformacji dojrzałych komórek poprzez wywołanie nadekspresji tzw. czynników pluripotencji, w tym np. Oct-3/4, Sox-2, Klf-4, c-Myc [19]. Pomimo obiecującego potencjału terapeutycznego, iPSCs wykazują wysoki potencjał formowania potworniaków po przeszczepieniu in vivo [18], podobnie do ESCs. Jednakże według niektórych badań i przesłanek literaturowych możliwa jest bezpieczna aplikacja odpowiednio przygotowanych iPSCs w modelach in vivo [21], co jest obecnie przedmiotem intensywnych badań wielu naukowców. Tym samym, rozbieżności jakie pojawiają się w doniesieniach naukowych dotyczące głównie oceny ryzyka formowania guzów nowotworowych po podaniach iPSCs muszą być gruntownie wyjaśnione przed możliwością stosowania tych komórek jako produktu leczniczego [22,23]. W związku z powyższym, duże nadzieje pokłada się w możliwościach praktycznego wykorzystania KM o niższym potencjale różnicowania, ale nieposiadających potencjału teratogennego, w tym KM multipotencjalnych, do których należą MSCs. Przydatność kliniczną tych KM intensywnie bada się w tej chwili w wielu przedklinicznych zwierzęcych modelach in vivo, jak również licznych badaniach klinicznych. Rosnące zainteresowanie dotyczące wykorzystania MSCs pozyskiwanych z różnych źródeł dla celów terapii komórkowej oraz konieczność porównania wyników z przeprowadzonych badań pomiędzy poszczególnymi grupami badawczymi (ze względu np. na różne metody izolacji, ekspansji oraz charakterystyki tych komórek), przyczyniły się do opracowania przez środowisko naukowe minimalnych kryteriów definiowania MSCs. Ustalone kryteria, o których mowa zostały opublikowane w 2006 r. przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ang. International Society for Cellular Therapy; ISCT) i obejmują one następujące cechy charakterystyczne dla MSCs: i) zdolność przylegania do plastikowych powierzchni naczyń hodowlanych w standardowych warunkach hodowli in vitro; ii) obecność następujących antygenów powierzchniowych: CD73, CD90 i CD105 (≥95% komórek dodatnich) oraz równolegle brak markerów charakterystycznych dla komórek hematopoetycznych obejmujących antygeny: CD45, CD34, CD14 lub CD11b, CD79α lub CD19, HLA-DR klasy II (≤2 % komórek dodatnich); iii) zdolność do różnicowania do komórek linii mezodermalnej, w tym osteoblastów, chondroblastów i adipocytów w warunkach in vitro [24]. Komórki o właściwościach MSCs izolowane są powszechnie z różnych źródeł m.in.: szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej, krwi pępowinowej, galarety Whartona sznura pępowinowego czy też miazgi zębowej [25,26]. Jednymi z najczęściej badanych populacji MSCs są komórki pochodzące ze szpiku kostnego, jak również z tkanki tłuszczowej, ze względu na dużą dostępność tego materiału, często stanowiącego odpad medyczny po zbiegach chirurgii plastycznej lub innych zabiegach medycznych [27,28]. W toku badań wykazano, że wydajniejszą izolację MSCs można przeprowadzić z tkanki tłuszczowej w porównaniu do szpiku kostnego. Frakcja komórek wyizolowana poprzez trawienie tkanki tłuszczowej, tzw. frakcja stromalno-naczyniowa (SVF) zawiera 5-25,9% MSCs [29], podczas gdy frakcja komórek jednojądrzastych ze szpiku kostnego zawiera jedynie 0,001- 0,01% MSCs [30]. Należy jednak zwrócić uwagę, że chociaż szpik kostny stanowi najpopularniejszy rezerwuar MSCs, tzw. złoty standard, efektywność izolacji MSCs, szczególnie widoczna u starszych dawców szpiku kostnego może ograniczać ich zastosowanie w praktyce klinicznej [31]. Co więcej, wykazano zależność pomiędzy potencjałem biologicznym MSCs, a wiekiem pacjenta, z którego izolowano te komórki. Starzejące się MSCs traciły swój potencjał do samoodnowy oraz różnicowania, a ich potencjał immunomodulacyjny ulegał znacznemu zaburzeniu, czego efektem było zahamowanie właściwości immunosupresyjnych oraz promowanie właściwości prozapalnych tych komórek [31,32]. Biorąc pod uwagę zdolność MSCs do różnicowania w kierunku linii mezodermalnej, w tym do komórek prekursorowych chondrocytów, badania nad tymi komórkami często dotyczą właśnie efektywności procesów chondrogenezy. W badaniach przeprowadzonych przez Barry i wsp. wykazano, że MSCs pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego (ang. human bone marrow mesenchymal/stromal cells; hBM-MSCs) hodowane in vitro w obecności transformującego czynnika wzrostu (ang. transforming growth factor; TGF) β3 lub β2, charakteryzowały się wczesną ekspresją fibromoduliny i oligomerycznego białka macierzy chrząstki (ang. Cartilage Oligomeric Matrix Protein; COMP), które to białka stanowią budulec macierzy zewnątrzkomórkowej niezbędnej do wytworzenia w pełni funkcjonalnej tkanki chrzęstnej [33]. Podobny efekt obserwowano dla BM-MSCs oraz AT-MSCs poprzez dodanie do pożywki hodowlanej deksametazonu, kwasu askorbinowego i β-glicerofosforanu [34,35]. Przytoczone przykłady, reprezentujące liczną grupę badań prowadzonych przez wiele grup badawczych na całym świecie, potwierdzają potencjał chondrogenny MSCs i tym samym ich możliwość ich potencjalnego zastosowania w naprawie tkanek układu chęstno-kostnego. Zdolność MSCs do różnicowania w komórki linii mezodermalnej jest wykorzystywana jako jeden z głównych mechanizmów regeneracji niezbędny w procesie odbudowy uszkodzonej tkanki chrzęstnej oraz kostnej. Kolejny mechanizm działania MSCs, który może mieć znaczenie w naprawie tkankowej, opiera się na ich szeroko opisanych właściwościach immunomodulujących [36]. Przykładem czynników sygnałowych modulujących odpowiedź układu odpornościowego, które mogą być wydzielane przez MSCs, są m.in. antagonista receptora interleukiny 1 (ang. interleukin-1 receptor antagonist; IL-1RA), IL-6 i IL-10, oraz czynnik wzrostu TGF-β [37–40]. Czynniki te mogą m.in. ograniczać nagłe uwolnienie reaktywnych form tlenu (anionu ponadtlenkowego i nadtlenku wodoru) poprzez zahamowanie wybuchu tlenowego neutrofili [41] oraz hamować aktywność komórek immunokompetentnych, takich jak monocyty, makrofagi, granulocyty, limfocyty B i T (CD8) [42–44]. Tym samym immunosupresyjny mechanizm działania MSCs na komórki układu immunologicznego może przyczyniać się do ograniczenia i zmniejszenia reakcji zapalnej związanej z uszkodzeniem tkankowym, po podaniu komórek MSCs w miejsce uszkodzenia [45,46]. Ponadto, wydzielane przez MSCs bioaktywne czynniki, tj. cytokiny, chemokiny, czynniki wzrostu, jak również pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (ang. Extracellular Vesicles, EVs), mogą wywierać efekt protekcyjny oraz proregeneracyjny, poprzez swoje plejotropowe działanie w uszkodzonych tkankach [39,47,48]. Podczas postępującej osteoartrozy dochodzi do szeregu zmian strukturalnych oraz molekularnych w obrębie mikrośrodowiska chrząstki stawowej [49]. Chondrocyty zdegradowanej chrząstki stawowej mogą regulować i stymulować osteoklastogenezę poprzez wzrost ekspresji czynników tj. m.in. chemokiny syntetyzowanej i wydzielanej przez limfocyty T (ang. regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted; RANKL), czy też osteoprotegryny (ang. osteoprotegerin, OPG), co ostatecznie prowadzi do resorbcji blaszki kości podchrzęstnej [50]. Ponadto, kataboliczny wpływ na budowę chrząstki mają również wydzielane przez te komórki m.in. IL-1β, która przyczynia się do zmniejszenia syntezy kolagenu typu II oraz wapnienia macierzy chrząstki, czynnik martwicy nowotworów α (ang. Tumor Necrosis Factor; TNF-α), który m.in. wpływa na zmniejszenie ekspresji genów macierzy zewnątrzkomórkowej (ang. extracelullar matrix; ECM) i agrekanu [49], jak również metaloproteinaza 13 (MMP-13), której nadekspresja przyczynia się do degradacji białek ECM, w tym m.in. kolagenu [51,52]. Z kolei zwiększony poziomy reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species; ROS) sprzyja rozwojowi mikrośrodowiska tkankowego o fenotypie prozapalnym [53], przy czym rola ROS w progresji choroby zwyrodnieniowej stawów pozostaje niejasna [54]. Na Rycinie 2 przedstawiono przykładowe bioaktywne cząsteczki istotne w patogenezie choroby zwyrodnieniowej stawów. Odwrócenie lub spowolnienie tych procesów poprzez bioaktywne cząsteczki wydzielane przez MSCs mogłoby mieć istotne znaczenie opóźniające rozwój tej choroby, jak również stymulujący endogenną naprawę tkanki chrzęstno-kostnej. Rycina 2. Podsumowanie głównych zmian strukturalnych i molekularnych w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Tlenek azotu (ang. nitrogen oxide; NO); reaktywne form tlenu (ang. reactive oxygen species; ROS), prostaglandyna E2 (ang. prostaglandin E2; PGE2), metaloproteinazy (ang. metalloproteinase; MMP), metaloproteinaza zawierająca w swej budowie motyw trombospondyny (ang. A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin; ADAMTS). Zmodyfikowano na podstawie [55]. Działanie parakrynne MSCs nie ogranicza się tylko do wydzielania bezpośrednio do środowiska rozpuszczalnych bioaktywnych cząsteczek, ale również ich transferu w postaci pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wydzielanych przez te komórki [56]. EVs biorą udział w komunikacji międzykomórkowej [57] oraz uczestniczą w przekazywaniu bioaktywnej zawartości (np. mRNA, miRNA, białek i lipidów, cytokin, chemokin oraz czynników wzrostu) z komórek donorowych do komórek akceptorowych [58,59]. Co istotne w etiologii choroby zwyrodnieniowej stawów, EVs pochodzące z hAT-MSCs mogą wywierać swój efekt proregeneracyjny poprzez wyciszanie stanu zapalnego, co wykazano m.in. w modelu in vitro badając wpływ EVs na aktywność wydzielniczą ludzkich chondrocytów z OA, w tym cytokin TNF-α, IL-6, IL-10 [60]. Co więcej wykazano, że transfer przez MSCs licznych bioaktywnych cząsteczek oraz nawet całych organelli komórkowych (głównie mitochondriów) do innych komórek, może odbywać się również za pośrednictwem tzw. nanorurek tunelujących (ang. tuneling nanotubes; TNTs), czyli struktur błonowych przyjmujących postać cienkich rureczek biorących udział w bezpośredniej komunikacji komórka-komórka [61–63]. Wykazano, że hAT-MSCs, w szczególności hAT-MSCs traktowane uprzednio antyoksydantami (tj. N- acetylocysteiną oraz 2-fosforanem kwasu askorbinowego), hodowane w kokulturze z hAT-MSCs traktowanymi uprzednio H2O2 (w celu indukcji śmierci komórkowej wywołanej stresem oksydacyjnym) uczestniczą w aktywnym transferze mitochondriów do uszkodzonych komórek poprzez formowanie TNTs i tym samym wywierają działanie protekcyjne na te komórki poprzez redukcję ROS [64]. Ponadto, poprzez możliwość przekazywania organelli komórkowych oraz bioaktywnych cząsteczek, postuluje się, że formowanie TNTs pośrednio wpływa immunomodulująco, protekcyjnie oraz proregenerująco na uszkodzoną tkankę poprzez wpływ na interakcje komórkowe, w tym bezpośrednią sygnalizację komórka-komórka jak również sygnalizację parakrynną [63,65,66]. Biorąc pod uwagę w/w właściwości MSCs, plejotropowy parakrynny mechanizm ich działania, właściwości immunomodulujące oraz niską immunogenność, komórki te mogą odgrywać kluczową rolę w regeneracji uszkodzonych tkanek [67,68], w tym w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Na Rycinie 3 przedstawiono wybrane, podstawowe efekty działania MSCs, na przykładzie ich podania dostawowo. Rycina 3. Główne efekty działania MSCs po podaniu do przestrzeni stawowej. Uważa się, że główny mechanizm działania MSCs opiera się na ich aktywności parakrynnej, tj. na wydzielaniu bioaktywnych cząsteczek, które są w stanie wywoływać efekty terapeutyczny, w tym chondroprotekcyjny i immunomodulujący [69]. W odpowiedzi na m.in. cytokiny prozapalne obecne w miejscu przeszczepienia (np. w płynie stawowym pacjentów z OA), może następować „aktywacja” komórek MSCs, wskutek czego wydzielają one bioaktywne cząsteczki oraz cząstki (chemokiny, cytokiny, EVs), które mogą stymulować regenerację uszkodzonej tkanki. Jednocześnie aktywowane MSCs są zdolne do lokalnego modulowania odpowiedzi immunologicznej poprzez selektywne hamowanie nacieku i proliferacji komórek odpornościowych [47]. Endogenne komórki progenitorowe tkanek pobudzane są do proliferacji i różnicowania, podczas gdy chemoatraktanty mogą dodatkowo rekrutować endogenne progenitory do miejsca urazu. Zmodyfikowano na podstawie [47]. 1.3. Biomateriały stosowane w inżynierii tkankowej do regeneracji układu chrzęstno – kostnego Regeneracja tkanki chrzęstnej stanowi istotne wyzwanie dla inżynierii tkankowej nie tylko ze względu na wysoką częstotliwość występowania urazów tej tkanki oraz rozwój chorób zwyrodnieniowych, w tym OA, dotykający coraz większą grupę ludzi na całym świecie, ale przede wszystkim na ograniczone możliwości jej regeneracji i odbudowy w miejscu ubytku, co związane jest m.in. z brakiem unaczynienia tej tkanki [70]. Budowa warstwowa chrząstki zapewnia jej doskonałą amortyzację poprzez możliwość rozpraszania sił działających na staw (tj. ściskanie, rozciąganie) i tym samym chroni aparat ruchu przed nadmiernym przeciążeniem i potencjalnym uszkodzeniem. Główną mechaniczną funkcję tej tkanki zapewnia substancja międzykomórkowa chrząstki zbudowana z istotny podstawowej (głównie agregatów proteoglikanów) oraz sieci włókien kolagenowych zlokalizowanych w chrząstce szklistej [71]. Pod wpływem działania sił ściskających, cząsteczki wody silnie uwodnionych proteoglikanów wypychane są na zewnątrz, a jednoimienne ładunki w łańcuchach proteoglikanów odpychają się i tym samym kompensują działanie sił ściskających [72]. W związku z tym, projektując rusztowania z materiałów zastępczych ważne jest uwzględnienie parametrów wspomnianej tkanki docelowej, w tym właściwości mechanicznych poszczególnych jej warstw morfologicznych, tak by odwzorowywały one naturalne właściwości oraz strukturę chrząstki, zapewniając tym samym fizyczne podłoże do optymalnego wzrostu, proliferacji oraz różnicowania komórek [73,74]. Na Rycinie 4 przedstawiono budowę stawu kolanowego oraz chrząstki stawowej, z zaznaczeniem funkcji poszczególnych warstw morfologicznych tej tkanki, które zapewniają odpowiednie parametry mechaniczne tkanki istotne pod kątem projektowania implantowanych w miejsce uszkodzenia biomateriałów. Rycina 4. Schematyczna budowa zdrowego stawu kolanowego oraz chrząstki stawowej. W stawie kolanowym wyróżniamy dwie naprzeciwległe względem siebie powierzchnie: panewkę stawową i głowę kości pokryte chrząstką stawową. Poprzez przemieszczanie się płynu stawowego w jamie stawowej dochodzi do dyfuzji składników odżywczych do chrząstki stawowej. Ponadto, sam płyn stawowy odgrywa rolę lubrykantu / mazi nadającej odpowiedni poślizg powierzchnią stawowym. Więzadła wzmacniają i podtrzymują ruchome połączenia między kośćmi. Warstwowy układ chrząstki stawowej pełni rolę amortyzującą. Zmodyfikowano na podstawie [71,75]. W zależności od rozległości powstałego defektu, regenerację tkanki można pobudzić poprzez zastosowanie w miejscu uszkodzenia samych komórek, ich czynników wzrostowych i sygnalizacyjnych (tj. cytokin, chemokin, czynników wzrostu, EVs), bądź też biomimetycznych rusztowań pokrytych komórkami, sprzyjających odbudowie uszkodzonej tkanki [76]. Rusztowania takie poprzez swoją strukturę, w tym topografię powierzchni oraz parametry mechaniczne tj. rozciągliwość, sztywność, mają na celu jak najbliższe naśladowanie macierzy zewnątrzkomórkowej docelowej tkanki a także jej fizjologicznego środowiska oraz sprzyjać interakcji odziaływania biomateriału z tkanką jak również regulować jej funkcje (Rycina 5) [73]. Rycina 5. Wpływ biomateriałów na właściwości biologiczne komórek. W odpowiedzi na interakcje z biomateriałem o określonych parametrach fizyko-chemicznych (m.in. nanotopografia biomateriału) oraz mechanicznych (m.in. rozciąganie, naprężenia, sztywność) dochodzi do modulacji właściwości biologicznych komórek, które zostały uprzednio wysiane na biomateriał, jak również komórek tkanek własnych wchodzących w bezpośrednią interakcję z biomateriałem, związanych m.in. z ich potencjałem do proliferacji, migracji oraz różnicowania, w celu zwiększenia ich potencjału do naprawy uszkodzonej struktury tkanki. ECM: macierz zewnątrzkomórkowa (ang. extracelullar matrix). Przygotowano na podstawie [74], rycina własna. Przykładem takich podłoży, będących membranami barierowymi, są biomateriały przeznaczone do sterowanej regeneracji tkanek (ang. Guided Tissue Regeneration; GTR) [77]. Zastosowanie membran, które stanowią matrycę dla odbudowy tkanki, pozwala na izolację komórek pochodzących z sąsiadujących tkanek, zapewnienie przepływu substancji odżywczych oraz promowanie adhezji, proliferacji oraz kierunkowego różnicowania komórek, tym samym indukując procesy regeneracji w miejscu powstałego ubytku [77]. Do rusztowań tego typu można zaliczyć np. membranę BioSeed®-C, stanowiącą komercyjnie dostępną membranę o unikatowej opatentowanej porowatej strukturze stosowaną do regeneracji tkanki chrzęstnej [78,79] oraz gradientowy implant TRUFIT CB™ stosowany do wypełnienia ubytków kostno-chrzęstnych [80]. Rusztowania oparte o BioSeed®-C stosowano z powodzeniem w podejściu terapeutycznym ukierunkowanym na osiągnięcie regeneracji chrząstki stawowej u pacjentów ze zmianami zwyrodnieniowymi tkanki chrzęstnej i wykazano umiarkowane bądź całkowite wypełnienie ubytku tkanki chrzęstnej po zastosowaniu takiej membrany, za pomocą badania rezonansem magnetycznym (ang. magnetic resonance imiging; MRI) [78]. W przypadku implantu TRUFIT CB™, stosowanego u pacjentów ze zmianami pourazowymi, w obrazowaniu MRI wykazano formowanie się blaszki podchrzęstnej. Dodatkowo zastosowano tzw. obrazowanie T2-zależne, które charakteryzuje się wysoką rozdzielczością i kontrastem tkankowym, co pozwoliło wysunąć stwierdzenie o obecności tkanki podobnej do prawidłowej chrząstki stawowej w miejscu podania implantu [80]. Innym przykładem są membrany kolagenowe Chondro-Gide® wspomagające regenerację ubytków chrząstki stawowej (ubytków o powierzchni 2-8 cm2) [81], które wykorzystywane są w połączeniu z: (i) techniką mikrozłamań (technika naprawy chrząstki polegająca na perforacji kości do blaszki podchrzęstnej) w celu stymulacji rekrutacji komórek KM i progenitorowych, w tym MSCs, do miejsc ubytku) [82], stanowiącą podstawę leczenia uszkodzeń chrząstki lub (ii) aplikacją autologicznych chondrocytów (ang. autologous chondrocyte implantaion; ACI) [83]. W eksperymencie medycznym przeprowadzonym przez Sciarretta i wsp., który obejmował pacjentów z ubytkami chrząstki w obrębie stawu kolanowego [84], zastosowano membranę Chondro-Gide® z uprzednio naniesionymi hAT-MSCs oraz technikę mikrozłamań. Po 6 miesiącach od zabiegu implantacji membrany, badanie MRI wykazało postępujące wypełnienie ubytku tkanką chrzęstną, jednak jak sam autor zaznacza, badanie to wymaga dalszej długoterminowej obserwacji w celu oceny skuteczności stosowanej strategii terapeutycznej [84]. Obecnie, duże nadzieje dla regeneracji miejsc ubytku chrząstki stawowej pokłada się w tzw. triadzie inżynierii tkankowej stanowiącej połączenie trzech komponentów tj. komórek, czynników sygnalizacyjnych oraz biokompatybilnych rusztowań [85]. Jej uproszczona idea zakłada połączenie rusztowania odwzorowującego strukturę macierzy zewnątrzkomórkowej uszkodzonej tkanki, na które nanoszone są komórki (np. wybrana frakcja KM) oraz zastosowanie czynników sygnalizacyjnych w celu wzmocnienia kierunkowego różnicowania komórek oraz stymulacji procesów regeneracji. Odpowiednie dobranie w/w trzech komponentów, w taki sposób aby sprzyjały one odtworzeniu uszkodzonej tkanki danego rodzaju w wyniku przywrócenia lub podtrzymania jej funkcji lub też zastąpienia powstałego w niej ubytku [76], może stanowić obiecującą strategię terapeutyczną defektów również kostno-chrzęstnych [85]. Przykładem takiego podejścia są badania przeprowadzone przez grupę Yu i wsp., które wykazały, że zastosowanie mikrosfer zbudowanych z polimeru PLGA (Poli(L,L-laktyd-co-glikolid) pokrytych kolagenem typu I, w połączeniu ze szczurzymi BM-MSCs, promowało proces beleczkowania kostnego i tym samym proces rekonstrukcji kości w szczurzym modelu indukowanej osteoporozy [86]. Podobne wyniki dotyczące przebudowy beleczkowania w ubytkach kostnych obserwowano w próbie klinicznej z wykorzystaniem porowatego rusztowania Vitoss®, wykonanego z bioresorbowalnego β-fosforanu trójwapniowego (ang. β-tricalcium phosphate; β-TCP), będącego nośnikiem autologicznych ludzkich BM-MSCs uprzednio poddanych ekspansji in vitro [87]. Z kolei badania przeprowadzone przez Zhou i wsp. wykazały, że kierunkowe różnicowanie hBM-MSCs wyizolowanych od pacjentów z OA, w pożywce hodowlanej zawierającej TGF-β3, może zostać wzmocnione poprzez zastosowanie płatków tlenku grafenu (ang. graphene oxide; GO) [88]. Wspomniane podłoże grafenowe, do którego zaadsorbował czynnik TGF-β3, po połączeniu z hydrożelem kolagenowym, w którym zawieszono hBM-MSCs, promowało wyższą ekspresję genów związanych z procesem chondrogenezy w tych komórkach, jak również odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej specyficznej dla chrząstki, w porównaniu z hBM-MSCs hodowanych w standardowych warunkach (bez rusztowania) [88]. W ostatnich latach, w szczególności po przyznaniu w 2010 r. nagrody Nobla z fizyki dla Andre Geim’a i Konstantina Novoselov’a, za odkrycie grafenu [89], coraz większą rolę w inżynierii biomateriałów zaczęły odgrywać kompozyty węglowe oparte właśnie o grafen i jego pochodne, w tym w potencjalnych zastosowaniach biomedycznych [90,91]. Tlenek grafenu, wytworzony w wyniku utleniania grafitu, wzbogacony jest w grupy funkcyjne: -COOH i -OH, które zapewniają doskonałe właściwości adsorbcyjne oraz możliwość biofunkcjonalizacji jego powierzchni, dając tym samym szerokie spektrum modulacji właściwości tego materiału [92]. Obecność tlenowych grup funkcyjnych, które zawierają wolną parę elektronów, zapewnia możliwość adsorbcji związków nieorganicznych oraz organicznych, co pozwala modyfikować powierzchnie GO dla potrzeb prowadzonych badań naukowych. Co więcej, dwuwymiarowa topografia GO oraz możliwość licznych modyfikacji funkcjonalnych jego powierzchni czyni ten materiał atrakcyjnym podłożem hodowlanym dla komórek, w szczególności dla MSCs ze względu na możliwość potencjalnego kierunkowego różnicowania tych komórek do linii mezodermalnej [93–95]. Przykładem modyfikacji powierzchni GO jest wiązanie jonów metali np. jonów złota (Au). Przeprowadzone przez grupę Li i wsp. badania in vitro wykazały, że same nanocząstki złota mogą indukować wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej (glikozaminoglikanów; GAG) przez hBM-MSCs oraz promować ekspresję genów charakterystycznych dla tkanki chrzęstnej (np. Agrekanu i Sox9) [96]. Ponadto, nanocząstki złota mogą stymulować różnicowanie osteogenne mysich BM-MSCs w wyniku aktywacji szlaku p38 MAPK [97], którego dokładny mechanizm działania jak do tej pory nie został wyjaśniony [98]. Biorąc pod uwagę powyższe, rodzi się intersujące badawczo pytanie, czy biofunkcjonalizacja powierzchni GO nanocząstkami złota mogłaby potencjalnie zwiększyć efektywność kierunkowego różnicowania MSCs, w tym różnicowania w kierunku komórek tkanki chrzęstnej i tym samym stanowić atrakcyjne narzędzie w terapii komórkowej pacjentów cierpiących na osteoartozę. Zatem wydaje się, że aplikacja ukierunkowanych tkankowo ludzkich MSCs, uprzednio hodowanych na podłożach opartych o GO, w miejsce defektu kostno-chrzęstnego, może wpływać na promowanie procesów chondrogenezy oraz potencjalnie zwiększać integrację MSCs z tkanką docelową. Istnieje zatem potrzeba opracowania nowych metod leczenia z wykorzystaniem tych materiałów, będących w stanie odbudować uszkodzoną strukturę tkanki chrzęstnej i kostnej oraz przywrócić jej funkcję, których sposób podania będzie jak najmniej obciążający dla pacjenta (np. w postaci iniekcji dostawowych). Należy jednak zwrócić uwagę, że skuteczność takich metod leczenia uzależniona jest od wielu czynników, w tym zaleceń lekarskich związanych z kontrolowanym obciążeniem i rehabilitacją aparatu ruchu. Kluczowym aspektem jest również odpowiedni dobór biomateriału, który będzie wspierał integrację komórek z ECM, jak również dobór parametrów preparatu przeszczepowego (tj. optymalna liczba nanoszonych na biomateriał komórek, nośnik komórek, technika wysiewania komórek na biomateriał itd.). Zatem, efekty leczenia powinny stanowić efekt synergii pomiędzy zastosowanym rusztowaniem hybrydowym, a stymulacją ruchową układu kostnego, co stanowi obecnie wyzwanie w opracowaniu skutecznej strategii terapeutycznej. 1.4.Zastosowanie terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej – ze szczególnych uwzględnieniem ubytków chrzęstno-kostnych Nowatorskie rozwiązania związane z technologią postaci leku tzw. leków celowanych, w tym produktów ATMP-HE oraz postęp w farmacji stosowanej, przyczynił się do rozwoju medycyny regeneracyjnej, której celem jest zastępowanie, regeneracja lub ponowne przywrócenie optymalnej funkcji uszkodzonej tkanki [99]. Proces ten może być realizowany poprzez wykorzystanie m.in. terapii komórkowych z udziałem lub bez udziału biomateriałów, które to dodatkowo może stymulować kierunkowe różnicowanie komórek, o czym wspomniano wyżej. Zaawansowane terapie komórkowe stanowią przykład spersonalizowanych strategii terapeutycznych uwzględniających specjalne potrzeby pacjenta, których szacowana wartość na globalnym rynku wynosiła ponad 6 mln USD w roku 2019, a do roku 2025 średni roczny wzrost tego rynku szacuje się na poziomie 6,95%, osiągając tym samym wartość ponad 9 mln USD [100]. Kluczowymi czynnikami napędzającymi ten rynek jest stale wzrastająca liczba osób cierpiących na choroby przewlekłe, w szczególności na otyłość [101], która to koreluje ze wzrostem ryzyka występowania innych schorzeń, w tym choroby zwyrodnieniowej stawów, zwłaszcza stawów kolanowych [102]. Według Międzynarodowego Towarzystwa Badań Choroby Zwyrodnieniowej (ang. Osteoarthritis Research Society International; OARSI) globalnie choroba ta dotyka ponad 240 mln ludzi na świecie, z czego dwa razy częściej kobiet niż mężczyzn [103]. Rozwojowi OA sprzyja starzejące się społeczeństwo, chociaż nie jest to fizjologiczny objaw starzenia, a raczej uzależniony jest on od trybu życia, w tym takich czynników jak aktywność fizyczna czy czynniki zawodowe (np. rodzaj wykonywanej pracy). Ponadto predyspozycje genetyczne czy też wrodzone choroby tkanki chrzęstnej i kostnej oraz nieprawidłowa anatomia stawu sprzyjają szybszej progresji choroby [104]. Tradycyjne strategie leczenia tej choroby obejmują stosowanie środków farmakologicznych tj. leków przeciwzapalnych oraz przeciwbólowych (głównie niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) oraz opioidów), jak również postępowanie niefarmakologiczne oparte o dobór odpowiednich ćwiczeń fizycznych, utrzymanie prawidłowej masy ciała, jak również stosowanie (w uzasadnionych przypadkach) urządzeń ortopedycznych odciążających staw [105,106]. Jednakże, w przypadku początkowego stadium rozwoju OA, często koniecznym jest wykonanie artroskopii stawu w celu usunięcia m.in. osteofitów (wyrośli kostnych), nadmiaru błony maziowej, wolnych fragmentów chrząstki albo drenaż (płukanie) stawu [107]. Poprawa po zabiegu może być krótko lub długoterminowa, jednak należy podkreślić, że często nie przyczynia się ona znacząco do naprawy histologicznej uszkodzonej chrząstki stawowej, a jedynie powoduje eliminację dolegliwości bólowych oraz sztywności stawu poprzez poprawę głównie ruchomości stawu [108]. W przypadku znacznego nasilenia objawów choroby często wykonywanym zabiegiem jest punkcja stawu w celu podania m.in. glikokortykosteroidów (o działaniu przeciwzapalnym) czy też kwasu hialuronowego, który stanowi naturalny komponent płynu stawowego i nadaje mu dużą lepkość jak również wspiera funkcję mechaniczną stawu (nadaje poślizg, ochrania przed tarciem i nadmiernym obciążeniem stawu) [108]. Z kolei ostateczne leczenie chirurgiczne, stosowane w przypadku, kiedy pacjent nie odpowiada na leczenie farmakologiczne, wiąże się m.in. z zastąpieniem określonego stawu (przeważnie stawu kolanowego) sztuczną protezą (tzw. aloplastyka stawu) [109]. Ponadto, zastosowanie protezy często wiąże się z koniecznością wykonania ponownej rewizji stawu, która nie wynika tylko i wyłącznie z ewentualnych komplikacji po wykonanym zabiegu ale może być konsekwencją postępującego obluzowywania się protezy, jej degradacją lub też nadmiernym zużyciem, a przez to koniecznością wymiany na nową protezę. Tym samym, ze względu na ograniczenie stosowanych metod konwencjonalnych, które nie są w stanie odtworzyć uszkodzonej chrząstki stawowej ani też kości podchrzęstnej w postępującym przebiegu OA, narodziła się potrzeba opracowania skutecznych i bezpiecznych metod regeneracji tkanki chrzęstnej, które mogą stanowić nową alternatywną metodę terapeutyczną lub też strategię wspierającą konwencjonalne techniki leczenia. Do metod tych należą m.in. intensywnie rozwijające się terapie komórkowe wykorzystujące potencjał biologiczny komórek, w tym KM, w regeneracji ubytków chrzęstno-kostnych. Jednym z typów komórek, które mogą być zastosowane w celu możliwości przywrócenia optymalnej funkcji uszkodzonej tkanki chrzęstnej są chondrocyty. Jednak możliwość ich wykorzystania jest związana z koniecznością pobrania tkanki chrzęstnej (która stanowi materiał źródłowy do ich izolacji) z już obciążonego ubytkiem stawu i jest obarczona ryzykiem mało wydajnej ekspansji tych komórek ex vivo oraz utratą ich pierwotnego fenotypu [110]. Stąd też, powstała potrzeba poszukiwania alternatywnych źródeł komórek. Obecnie trwają badania nad możliwością regeneracji chrząstki stawowej przy wykorzystaniu właściwości biologicznych MSCs pozyskiwanych z różnych źródeł. Według raportu Global Stem Cell Market [100] najbardziej perspektywicznym obszarem związanym z zastosowaniem „dorosłych” komórek macierzystych, w tym MSCs, jest właśnie ortopedia. Szacuje się, że roczne tempo wzrostu inwestycji w obszarze terapii komórkowych z użyciem MSCs do roku 2028 wyniesie 12,6% [111]. W udostępnionym przez Narodową Bibliotekę Medyczną Stanów Zjednoczonych rejestrze badań klinicznych (ang. clinical trials; CT), prowadzonym na stronie ClinicalTrials.gov, liczba zarejestrowanych otwartych badań klinicznych, w ramach których prowadzona jest już rekrutacja pacjentów lub będących jeszcze przed rekrutacją pacjentów, a które wykorzystują MSCs - wynosi 377 (dane na dzień: 15.09.2021, wyszukiwania dla: mesenchymal stem cells, z zastosowaniem filtrów: recruiting oraz not yet recruiting) (Rycina 6). Rycina 6. Mapa świata obrazująca liczbę aktywnych badań klinicznych z wykorzystaniem MSCs. Źródło danych oraz grafiki: www.ClinicalTrials.gov Spośród wyszukiwanej liczby badań klinicznych, największą liczbę badań stanowią terapie z wykorzystaniem MSCs pochodzących z ludzkiej tkanki tłuszczowej, szpiku kostnego, oraz MSCs z krwi pępowinowej (ang. human umbilical cord mesenchymal/stromal stem cells; hUC-MSCs). Zawężając wyszukiwania do najczęściej spotykanych defektów kostno-chrzęstnych, jakim jest m.in. choroba zwyrodnieniowa stawów (dane na dzień: 15.09.2021, wyszukiwania dla: mesenchymal stem cells z zastosowaniem filtrów: recruiting oraz not yet recruiting oraz w schorzeniach: osteoarthritis), obecnie 37 badań jest w fazie aktywnej, bądź na etapie rekrutacji pacjentów, z których największa liczba badań prowadzona jest na terenie Chin i Stanów Zjednoczonych (Tabela 1). Tabela 1. Wykaz wybranych badań klinicznych dotyczących leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez zastosowanie podań MSCs izolowanych z różnych tkanek. hDP-SCs: ludzkie komórki macierzyste miazgi zęba (ang. human Dental Pulp Stem Cells); hBM-MSCs: ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące ze szpiku kostnego (ang. human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells); ND: nie zdefiniowano; PRP: osocze bogatopłytkowe (ang. platelet rich plasma); hWJ-MSCs: ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne z galarety Whartona (ang. Wharton's Jelly Mesenchymal Stem/Stromal Cells); hAT-MSCs: ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące z tkanki tłuszczowej (ang. human Adipose- derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells); hUC-MSCs: ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne z krwi pępowinowej (ang. human Umbilical Cord Mesenchymal Stem/Stromal Cells); BMAC: autologiczny koncentrat komórek macierzystych/stromalnych aspiratu szpiku kostnego (ang. Bone Marrow Autologous Concentrate); SVF: frakcja stromalno-naczyniowa (ang. stromal vascular fraction) izolowana z tkanki tłuszczowej; PBKM: Polski Bank Komórek Macierzystych. Przygotowano na podstawie strony www.clinicaltrials.gov Identyfikator Faza badania Nazwa badania Dawkowanie 03383081 2 Ocena bezpieczeństwa i skuteczności terapii z zastosowaniem hUC-MSCs (19#iSCLife®-OA) Dostawowa iniekcja hUC-MSCs (SCLnow 19#) z różnymi grupami dawek • Niska dawka / grupa A: 1x107 UC-MSCs (5ml); • Wysoka dawka / grupa B: 2x 107 hUC-MSCs (5ml) 03869229 1 oraz 2 Dostawowe iniekcje autologicznych hAT-MSCs Dostawowa iniekcja hAT-MSCs pod kontrolą USG. Schemat dawkowania: • ≥1x106 hAT-MSCs, co 3 miesiące przez 12 miesięcy (max.4 dawki) 03956719 ND Dostawowe iniekcje autologicznych hAT-MSCs Dostawowa iniekcja hAT-MSCs izolowanych z 50ml pozyskanego lipoaspiratu 04130100 1 Ocena bezpieczeństwa i skuteczności terapii z zastosowaniem hDP-SCs Podanie niskiej oraz wysokiej dawki hDP-SCs* 03477942 1 Ocena bezpieczeństwa i skuteczności dostawowych iniekcji autologicznych hBM-MSCs Dostawowa iniekcja hBM-MSCs w dawce 50x106 hBM-MSCs 02963727 1 Ocena bezpieczeństwa i skuteczności dostawowych iniekcji hUC-MSCs Dostawowa iniekcja 2 dawek hUC-MSCs, każda po 50x106 komórek 03969680 ND Ocena bezpieczeństwa i skuteczności dostawowych iniekcji autologicznych hBM-MSCs Dostawowa iniekcja 3 dawek hBM-MSCs zawieszonych w 3ml autologicznego PRP, co 3 miesiące 04208646 2 Ocena bezpieczeństwa i skuteczności terapii z zastosowaniem hAT-MSCs (AlloJoin®) Dostawowa iniekcja allogenicznych hAT-MSCs (AlloJoin®) z różnymi grupami dawek (wysoka i niska dawka)* 02966951 1 Ocena bezpieczeństwa i skuteczności dostawowych iniekcji autologicznych hAT-MSCs Dostawowa iniekcja 2 dawek hAT-MSCs, każda po 50x106 04212728 2 Ocena bezpieczeństwa i skuteczności dostawowych iniekcji autologicznych hAT-MSCs zawieszonych w PRP Dostawowa iniekcja hAT-MSCs wyekstrahowanych z 150ml podskórnej tkanki tłuszczowej, zawieszonych w 3ml autologicznego PRP. Schemat dawkowania: • 3 dawki, co 3 miesiące 03866330 1 oraz 2 Dostawowe iniekcje allogenicznych hWJ-MSCs Dostawowa iniekcja hWJ-MSCs pod kontrolą USG, dostarczonych przez PBKM. Schemat dawkowania: ≥1x106 hWJ-MSCs, co 3 miesiące przez 24 miesięcy 03818737 3 1) Dostawowa iniekcja autologicznego koncentratu komórek macierzystych/stromalnych aspiratu szpiku kostnego (BMAC), pod kontrolą USG 2) MSCs pochodzące z tkanki tłuszczowej frakcji stromalno-naczyniowej (SVF) 3) Allogeniczne hUC-MSCs Dostawowa iniekcja MSCs w trzech badanych grupach: 1) Dostawowa iniekcja BMAC pod kontrolą USG 2) Dostawowa iniekcja SVF 3) Dostawowa iniekcja 20x106 hUC-MSCs zawieszonych w 4ml roztworu osocza i 5% albuminy 04314661 1 oraz 2 1) Allogenicznych terapia hUC-MSCs zakończona artroskopią leczonego stawu 2) Dostawowe iniekcje allogenicznych hUC-MSCs, bez artroskopii 3) Dostawowe iniekcje pożywki kondycjonowanej Dostawowa iniekcja MSCs w trzech badanych grupach: 1) Dostawowa iniekcja 5x106 hUC-MSCs. W odstępach 2 tyg. dwie iniekcje pożywek kondycjonowanych znad hodowli. Leczenie zakończone artroskopią stawu. 2) Dostawowa iniekcja 5x106 hUC-MSCs. W odstępach 2 tyg. Dwie iniekcje pożywek kondycjonowanych: pierwsza iniekcja po 2tyg. od iniekcji MSCs, druga dawka po 4tyg od iniekcji pożywki kondycjonowanej. Leczenie zakończone artroskopią stawu. 3) Dostawowa iniekcja pożywki kondycjonowanej hUC-MSCs. Dwie iniekcje w odstępach 2 tyg. Leczenie bez artroskopii stawu. 04368806 2 oraz 3 Ocena skuteczności i bezpieczeństwa terapii hAT-MSCs (JointStem) Dostawowa iniekcja ludzkich autologicznych hAT-MSCs* 04240873 1 oraz 2 Ocena bezpieczeństwa i skuteczności dostawowych iniekcji hBM-MSCs Dostawowa iniekcja hBM-MSCs w dawce 1x108 hBM-MSCs 03943576 1 oraz 2 Ocena skuteczności i bezpieczeństwa terapii allogenicznymi hAT-MSCs (GXCPC1) Dostawowa pojedyncza iniekcja allogenicznych hAT-MSCs w dawce 6,7x106 lub 4,7x107 04230902 3 Dostawowa iniekcja mikrofragmentowanej metodą mechaniczną tkanki tłuszczowej Iniekcja autologicznej mikrofragmentowanej tkanki tłuszczowej uzyskanej przy użyciu zestawu Lipogems® Kit 02838069 2 Ocena skuteczności i bezpieczeństwa autologicznych hAT-MSCs Dostawowa jednorazowa iniekcja MSCs w dwóch badanych grupach: 1) Dostawowa iniekcja 2x106 hAT-MSCs/5ml 2) Dostawowa iniekcja 10x106 hAT-MSCs/5ml *Sponsor badania nie podaje szczegółowych danych dot. stosowanej dawki produktu, tj. liczby aplikowanych komórek. Powyższy wykaz wskazuje na intensywne próby oceny potencjału aplikacyjnego terapii komórkowych opartych głównie o hBM-MSCs oraz hAT-MSCs, ale także inne komórki o charakterze MSCs, prowadzonych na drodze zarejestrowanych badań klinicznych, w chorobie zwyrodnieniowej stawów. Z kolei produkty lecznicze stosowane we wskazaniach ortopedycznych, które przeszły już ścieżkę i pozytywnie zakończyły fazę badań klinicznych i tym samym zostały dopuszczone do obrotu, jako zarejestrowane produkty lecznicze (tzw. komórkowe produkty lecznicze), wymieniono w Tabeli 2. Tabela 2. Wykaz wybranych produktów ATMP stosowanych we wskazaniach ortopedycznych, dopuszczonych do obrotu na terenie Europy oraz USA. PL, produkt leczniczy; TEP (ang. Tissue Engineered Product; produkt inżynierii tkankowej); cATMP (ang. combined ATMP; produkt leczniczy skojarzonej terapii zaawansowanej). Opracowano na podstawie kart charakterystyki produktu leczniczego (Spherox, MACI oraz Chondrocelect) dostępnych na stronie www.ema.europa.eu, opisu produktu zamieszczonego na stronie www.rxlist.com (Carticel) oraz opisu zamieszczonego w publikacji (dla produktu Jacc). [112,113]. Nazwa Opis produktu Skład PL Wielkość ubytku Aplikacja Spherox / TEP / (CO.DON) Zawiesina ludzkich autologicznych chondrocytów zawieszonych w izotonicznym roztworze NaCl Określona liczba agregatów komórkowych zależna od wielkości ubytku ≥10cm2 Zalecana dawka 10-70 agregatów komórkowych / cm2 ubytku Po opracowaniu podłoża ubytku dostawowa implantacja PL. Zamknięcie ubytku płatem okostnowym bez stosowania kleju fibrynowego MACI * / cAMP / (Vericel) Matryca (błona z wieprzowego kolagenu typu I/III pochodząca od świń) z naniesionymi oznakowanymi autologicznymi chondrocytami do implantacji Matryca o powierzchni 14,5cm2 zawierająca 0,5 – 1x106 komórek/cm2, przeznaczona do przycięcia w zależności od rozmiaru i kształtu ubytku 3-20cm2 Podłoże ubytku opracowane do płytki podchrzęstnej. Wymaga naniesienia fibrynowego środka uszczelniającego aplikowanego na podstawę i brzeg ubytku Chondrocelect * /TEP / (TiGenix) Autologiczne komórki chrząstki namnożone ex vivo 0,001x106 komórek/µl 4x106 komórek/0,4 ml DMEM ≤5cm2 zalecana dawka PL to 0,8–1 x106 /cm², co odpowiada 80– 100 µl produktu/cm² uszkodzenia Po opracowaniu chirurgicznym rany aplikacja PL, jednocześnie z fizycznym uszczelnieniem zmiany Carticel / Terapia komórkowa / Vericel Corporation Zawiesina ludzkich autologicznych chondrocytów 12x106 komórek/0,4 ml DMEM ≤ 7 cm² / 1szt. PL 7-14cm2 / 2szt. PL >14cm2 / 3szt. PL zalecana dawka PL to 1,6 x106 /cm² Po opracowaniu podłoża ubytku, implantacja PL. Zamknięcie rany płatem okostnowym Jacc / TEP / Japan Tissue Engineering Zawiesina ludzkich autologicznych chondrocytów zawieszonych w żelu acetokolagenowym 2×106 komórek/ml 1,33% kolagenu ≤ 4 cm2 Ilość mieszaniny potrzebną do implantacji określa wielkość ubytku chrząstki Po opracowaniu podłoża ubytku, implantacja PL. Zamknięcie rany płatem okostnowym według następującego wzoru: powierzchnia ubytku x 0,3 ml *na wniosek producenta produkt wycofany z obrotu. W uzasadnieniu za oficjalny powód wycofania produktu leczniczego podaje się aspekt finansowy (tzw. „commercial reasons”). W Polsce, na podstawie rejestru wytwórców produktu leczniczego prowadzonego przez Główny Inspektorat Farmaceutyczny (GIF) (Tabela 3), dziewięciu (9) wytwórców posiada obecnie uprawnienia do wytwarzania różnych produktów ATMP-HE dla zastosowań w różnych wskazaniach klinicznych, przy czym kolejnych sześć (6) podmiotów prowadzi badania kliniczne produktu ATIMP (baza danych: www.clinicaltrials.gov; dane na dzień: 19.10.2021, wyszukiwania dla: mesenchymal stem cells, z zastosowaniem filtrów: recruiting oraz not yet recruiting), co może wskazywać na wieloaspektowość procesu, którego szczegóły opisano w dalszym podrozdziale 1.5 Znaczenie procedur Dobrej Praktyki Wytwarzania w projektowaniu i wytwarzaniu produktu leczniczego terapii zaawansowanej (wyłączenia szpitalnego) jako preparatu przeszczepowego. Tabela 3. Wykaz polskich wytwórców produktów ATMP-HE. Zmodyfikowano na podstawie [114]. hWJ-MSCs: ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące z galarety Whartona; ang. human Wharton's Jelly Mesenchymal Stem/Stromal Cells; hAT-MSCs: ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące z tkanki tłuszczowej (ang. human Adipose-derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells); hBM-MSCs: ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste/stromalne pochodzące ze szpiku kostnego (ang. human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells). Lp. Wytwórca Produkt leczniczy 1 Regionalne Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa, Katowice aplikacja autologiczny chondrocytów hodowanych in vitro 2 Centrum Leczenia Oparzeń im dr. Stanisława Sakiela, Siemianowice Śląskie aplikacja autologicznych keratynocytów hodowanych in vitro 3 Polski Bank Komórek Macierzystych S.A., Warszawa aplikacja hWJ-MSCs 4 Uniwersyteckie Centrum Kliniczne, Gdańsk aplikacja autologicznych namnożonych ex vivo limfocytów T-regulatorowych 5 Uniwersytet Jagielloński, Kraków (Bank Komórek i Wytwórnia Produktów Leczniczych Terapii Zaawansowanej, WBBiB UJ; aplikacja autologicznych hAT-MSCs, hBM-MSCs, komórek naskórka (keratynocyty) 6 Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie aplikacja hWJ-MSCs, hBM-MSCs oraz hAT-MSCs 7 Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa aplikacja hAT-MSCs 8 Fundacja Na Rzecz Regeneracji Komórek Nerwowych „Regenerv”, Olsztyn aplikacja hWJ-MSCs 9 Jagiellońskie Centrum Innowacji (JCI), Kraków * aplikacja autologiczny hAT-MSCs *wpisanie JCI w Krakowie (Pracodawca doktorantki) do rejestru Wytwórców produktów ATMP-HE jest częściowo wynikiem realizacji niniejszej rozprawy doktorskiej. Tym samym, powyżej wymienione proponowane strategie terapii komórkowej, w tym te prowadzone i sprawdzane w badaniach klinicznych, których celem jest w pierwszej kolejności ocena bezpieczeństwa i skuteczności produktu leczniczego, jak również dobór efektywnego schematu leczenia (np. dawkowanie produktu leczniczego), wskazują na wysokie zainteresowanie wykorzystaniem potencjału biologicznego ludzkich MSCs pochodzących z różnych źródeł, w naprawie tkankowej , w tym w leczeniu jednej z najczęściej spotykanych chorób przewlekłych, jaką jest choroba zwyrodnieniowa stawów. 1.5.Znaczenie Dobrej Praktyki Wytwarzania w projektowaniu i wytwarzaniu produktu leczniczego terapii zaawansowanej Produktami leczniczymi terapii zaawansowanej (ang. Advanced Therapy Medicinal Products; ATMP) nazywamy grupę innowacyjnych produktów biologicznych stosowanych u ludzi w celach leczniczych [115], których główną komponentę stanowią komórki natywne, modyfikowane genetycznie lub tkanki [116,117]. W zależności od przeznaczenia klinicznego, do produktów tych zaliczane są: (i) produkty lecznicze terapii zaawansowanej przeznaczone dla zastosowań klinicznych w ramach tzw. „wyjątku szpitalnego” (ang. Advanced Therapy Medicinal Products, Hospital Exemption; ATMP-HE) – to produkty nie dopuszczone do obrotu w państwach członkowskich EU, które są wytwarzane na indywidualne zlecenie lekarza, do zastosowania u konkretnego pacjenta, (ii) badane produkty lecznicze terapii zaawansowanej (ang. Advanced Therapy Investigational Medicinal Products; ATIMP) – to produkty badane pod względem bezpieczeństwa i efektywności na drodze badań klinicznych, które mogą być dopuszczone do obrotu [118]. W zależności od właściwości materiału biologicznego zawartego w tego typu lekach, w ramach produktów ATMP wyróżnia się następujące kategorie [119] (Rycina 7): • produkty lecznicze terapii genowej (ang. Gene Therapy Medicinal Products; GTMP) – stanowiące produkty lecznicze zawierające ludzkie komórki modyfikowane genetycznie, w których zmienione geny wprowadzane są itp. z wykorzystaniem wektora wirusowego w celu wywołania pożądanego efektu terapeutycznego; • produkty lecznicze somatycznej terapii komórkowej (ang. Somatic Cell Therapy Medicinal Products; SCTMP) – to leki składające się z komórek / tkanek natywnych (niemodyfikowanych genetycznie), które nie są przeznaczone do zastosowań w tych samych tkankach, z których pochodzą. Oznacza to, że właściwości biologiczne i podstawowa funkcja tych komórek, które podawane są w inne niehomologiczne miejsce (względem ich pochodzenia), może ulegać zmianie po podaniu. Ponadto, w świetle prawa komórki te poddawane są w czasie ich przygotowania znaczącej manipulacji, do których należą itp. takie czynności jak: cięcie, rozdrabnianie tkanki źródłowej, wirowanie, filtrowanie, zamrażanie, namnażanie z roztworach zawierających antybiotyki, itp. [115]; • produkty inżynierii tkankowej (ang. Tissue Engineered Products; TEP) – to produkty lecznicze o możliwe podobnym składzie do leków SCTMP, przy czym posiadające właściwości regeneracji, naprawy lub zastępowania uszkodzonej tkanki ludzkiej, stosowane w celu naprawy tej samej tkanki, z której pochodziły; mogą również zawierać dodatkowe składowe, jak bioaktywne cząsteczki lub biozgodne rusztowania; • produkty lecznicze skojarzonej terapii zaawansowanej (ang. combined ATMP; cATMP) – to produkty lecznicze będące połączeniem GTMP, SCTMP lub TEP z wyrobem medycznym. Rycina 7. Schemat przedstawiający cztery kategorie produktów ATMP. Zmodyfikowano i przygotowano na podstawie [120], rycina własna. Na podstawie złożonego przez twórcę produktu leczniczego wniosku, dotyczącego wyznaczenia jednej z czterech kategorii produktu ATMP (Rycina 7), Komitet ds. Terapii Zaawansowanych (ang. Committee for Advanced Therapies; CAT) przy Europejskiej Agencji Leków (ang. European Medicines Agency; EMA) dokonuje klasyfikacji produktu leczniczego. Wydana rekomendacja CAT jest niezbędna podczas ubiegania się o zgodę na wytwarzanie produktu ATMP-HE przed GIF oraz do właściwego i legalnego zastosowania produktu u pacjentów [117,121]. W celu transferu metody wytwarzania komórkowych produktów leczniczych z konwencjonalnego laboratorium badawczo-rozwojowego (ang. Research & Development laboratory; R&D laboratory) do laboratorium GMP, tj. miejscu wytwarzania produktów leczniczych terapii komórkowej (określanym później skrótem „Wytwórni”), konieczne jest uprzednie uwzględnienie wytycznych zawartych w Rozporządzeniu Ministra Zdrowia (MZ) w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania (w skrócie: „Rozporządzenie GMP”) [122], dotyczących m.in. wymogów stawianych dla pomieszczeń przeznaczonych do czynności wytwórczych. Pomieszczenia, w których prowadzone jest wytwarzanie oraz pomieszczenia z nimi powiązane (np. służące do magazynowania surowców), zależnie od klasy czystości powietrza, podlegają ścisłej kontroli czystości pyłowej oraz mikrobiologicznej powietrza [122,123]. Pomiędzy poszczególnymi pomieszczeniami wymagane jest zapewnienie kaskady ciśnień w celu utrzymania warunków środowiskowych dla danej klasy czystości powietrza. Ponadto, sprzęt laboratoryjny wykorzystywany na terenie Wytwórni podlega rutynowym przeglądom serwisowym oraz okresowej kwalifikacji. Co więcej, należy również zapewnić możliwości śledzenia oraz rejestracji istotnych parametrów pracy sprzętu laboratoryjnego, np. w przypadku: (a) komory laminarnej: możliwość śledzenia szybkości przepływu powietrza oraz liczby cząstek wewnątrz komory, (b) inkubatora: temperatury, wilgotności, poziomu CO2, (c) lodówek i zamrażarek: wahań zadanej temperatury [122]. Na Rycinie 8 przedstawiono przykładowy uproszczony schemat pomieszczeń Wytwórni pracującej zgodnie z wymaganiami GMP, pomiędzy którymi utrzymana jest kaskada ciśnień. Dodatkowo, na rycinie zaznaczono podział na klasy czystości powietrza oraz przedstawiono przykładowe czynności / operacje laboratoryjne możliwe do wykonania w poszczególnych pomieszczeniach, wynikające z zasad zapewnienia jakości ujętych w rozporządzeniu GMP oraz serii norm ISO 14644 [122–125]. Rycina 8. Uproszczony schemat klas czystości powietrza pomieszczeń Wytwórni. Na schemacie przedstawiono przykładowe czynności operacyjne możliwe do wykonania w poszczególnych klasach czystości powietrza (odpowiednio klasa A, B, C i D). Prezentowana klasa czystości powietrza jest tożsama z pojedynczym pomieszczeniem Wytwórni. Czerwonymi grotami strzałek zaznaczono kaskadę ciśnień oraz kierunek przepływu powietrza pomiędzy pomieszczeniami Wytwórni. Zapewnienie kaskady różnicy ciśnień zabezpiecza pomieszczenia czyste oraz pomocnicze przed swobodnym przemieszczaniem się powietrza pomiędzy sklasyfikowanymi pomieszczeniami, potencjalnym zakażeniem pomieszczeń i tym samym zapewnia gotowość do wytwarzania produktu sterylnego. Przygotowano na podstawie zaleceń zamieszczonych w Rozporządzeniu GMP [122] oraz serii norm ISO 14644 [123–125], rycina własna. Ponadto, w Tabeli 4 zamieszczono wytyczne dotyczące kontroli czystości pyłowej powietrza, zgodnie z normą PN-EN ISO 14644-1, jakie musi spełniać Wytwórnia zarówno podczas prowadzenia operacji związanych z wytwarzaniem produktu ATMP-HE (tzw. stan „w operacji”) oraz w przerwach pomiędzy kolejnymi cyklami wytwarzania produktu (tzw. stan „w spoczynku”) [123]. Z kolei, w Tabeli 5 przedstawiono dopuszczalne limity zanieczyszczenia mikrobiologicznego zgodnie z Załącznikiem nr 3 pt. „Szczegółowe wymagania dobrej praktyki wytwarzania produktów leczniczych terapii zaawansowanej” do Rozporządzenia GMP [122]. W przypadku przekroczenia limitów parametrów środowiskowych zamieszczonych w Tabeli 4 i Tabeli 5, kontynuacja działalności wytwórczej nie jest możliwa do czasu zidentyfikowania i usunięcia przyczyny, która wpłynęła na podwyższenie dopuszczalnych limitów. Wszystkie parametry środowiskowe musza być obligatoryjnie monitorowane oraz rejestrowane. Tabela 4. Dopuszczalne stężenie pyłowe czystości powietrza dla wybranych klas czystości powietrza pomieszczeń Wytwórni. Minimalna objętość próby pobranej z jednego punktu pomiarowego to 1m3. Przykładowo, dla klasy czystości powietrza A maksymalna dopuszczalna liczba cząstek ≥ 0,5 µm zarówno w spoczynku (brak podejmowanej czynności wytwórczej) jak i w działaniu (wytwarzanie produktu) wynosi 3 520. ND: nie zdefiniowano. Zmodyfikowano na podstawie [122,123]. Klasa Klasa ISO Maksymalna dopuszczalna liczba cząstek [μm/m3] W spoczynku W działaniu 0,5 μm 5,0 μm 0,5 μm 5,0 μm A 4.8 3 520 20 3 520 20 B 5 – w spoczynku 7 – w działaniu 3 520 29 352 000 2 900 C 7 – w spoczynku 8 – w działaniu 352 000 2 900 3 520 000 29 000 D 8 – w spoczynku ND– w działaniu 3 520 000 29 000 ND ND Tabela 5. Wymagane limity zanieczyszczeń mikrobiologicznych dla każdej klasy czystości powietrza. W przypadku płytek sedymentacyjnych i odciskowych zliczano liczbę JTK. *Dla klasy czystości powietrza A uzyskanie wyniku w liczbie ≥ 1 j.t.k. skutkuje postępowaniem wyjaśniającym zaistniałą przyczynę podwyższonego limitu zanieczyszczenia mikrobiologicznego. **W przypadku płytek sedymentacyjnych, które wystawiane są w tzw. strefie roboczej, czas ich ekspozycji nie powinien być dłuższy niż czas trwania operacji wytwórczych, przy czym czas ten nie może przekroczyć 4 godz. J.T.K: jednostka tworząca kolonię. Zmodyfikowano na podstawie [122]. Klasa czystości powietrza Liczba cząstek w powietrzu [j.t.k./m3] Płytki sedymentacyjne o średnicy 90mm [liczba j.t.k./4 godz.]** Płytki odciskowe o średnicy 55mm [liczba j.t.k./płytkę] A* <1 <1 <1 B 10 5 5 C 100 50 25 D 200 100 50 Powyższe wyniki powinny być uzupełnione danymi obrazującymi pracę (działanie) krytycznych urządzeń laboratoryjnych (np. praca komory laminarnej), które mogą mieć wpływ na jakość i bezpieczeństwo wytwarzanego produktu. W praktyce oznacza to możliwość generowania raportów z pracy danego urządzenia, które jest wykorzystywane podczas wytwarzania produktu ATMP-HE. Przykładowy wykres działania pracy komory laminarnej przedstawiono na Rycinie 9. Rycina 9. Przykładowy raport z pracy komory laminarnej II klasy bezpieczeństwa mikrobiologicznego wyposażonej w podwójny system filtrowania B-[MaxPro]3-130 (Berner) znajdującej się w Laboratorium Hodowli Tkanek i Komórek Jagiellońskiego Centrum Innowacji Sp. z o.o. w Krakowie. Niebieską oraz zieloną linią zaznaczono pracę dwóch komór laminarnych pracujących w niezależnych pomieszczeniach Wytwórni o klasie czystości powietrza B. Zgodnie z Rozporządzeniem GMP traktującym o sterylnym wytwarzaniu produktów leczniczych w klasie czystości powietrza A, obie komory laminarne podczas pracy zapewniały zalecaną szybkość przepływu powietrza w zakresie 0,36-0,54 m/s. Wszystkie te parametry jakości pomieszczeń wymienione w Tabelach 4 i 5 powinny być uwzględnianie podczas przygotowania materiału w standardzie GMP w celu zapewnienia aseptycznego procesu wytwarzania oraz zapobiegania ryzyka wystąpienia zakażenia w wytwarzanym produkcie. Równie istotnym aspektem dotyczącym wytwarzania produktu ATMP-HE jest dobór systemu wytwarzania produktu oraz późniejszy transport produktu. W zależności od m.in. rozkładu pomieszczeń, dostępnej infrastruktury laboratoryjnej, skali produkcji (liczba wytwarzanych produktów leczniczych ATMP-HE), wytwarzanie produktu może odbywać się w tzw. systemie produkcji zamkniętym lub otwartym. Przez system otwarty rozumiemy zastosowanie takiego rozwiązania produkcyjnego, w którym wytwarzany produkt wchodzi w interakcje z powietrzem o klasie czystości powietrza miejsca wytwarzania, np. prowadzenie hodowli komórkowej w butelkach hodowlanych w inkubatorze znajdującym się w tej klasie czystości. Tym samym, zastosowanie takiego rozwiązania produkcyjnego zwiększa ryzyko zanieczyszczenia z otoczenia w porównaniu z zastosowaniem systemu zamkniętego. Zastosowanie systemu zamkniętego np. system CellCelution 800/CRS (Cytori Therapeutics Inc.) czy system CliniMACS Prodigy Adherent Cell Culture System (Miltenyi Biotec), czyli izolatorów pracujących w nadciśnieniu, ogranicza bezpośredni kontakt wytwarzanego produktu z otoczeniem i tym samym możliwość jego kontaminacji [126,127]. Ponadto, stosowane podczas wytwarzania produktu ATMP-HE surowce oraz materiały zużywalne (np. pożywki hodowlane, rękawice laboratoryjne, kombinezony ochronne) również podlegają nadzorowi, w ramach procedury tzw. kwalifikacji dostawców. Oznacza to, że już na etapie prac naukowych w tzw. skali R&D należy tak dobrać dostawców, aby wszystkie materiały zużywalne posiadały odpowiednie certyfikaty analiz jakości, gwarantujące najwyższą jakość stosowanych surowców/ materiałów i mogły tym samym ponownie zostać wykorzystane podczas transferu metody do Wytwórni pracującej w warunkach GMP. Należy również zwrócić uwagę na pyłowość wprowadzanych do Wytwórni materiałów zużywalnych, która może potencjalnie wpłynąć na podwyższenie limitów dopuszczalnej liczby cząstek (Tabela 4) oraz na poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych (Tabela 5) i tym samym uniemożliwić kontynuację czynności wytwórczych. Kolejną ważną kwestią, zawartą w Rozporządzeniu GMP w sprawie warunków transportu, jest zapewnienie przewozu produktu w kontrolowanych warunkach temperaturowych, który to jest realizowany na etapie wydania produktu ATMP-HE do zastosowania u konkretnego pacjenta [122]. Zakres temperatur, w jakich produkt ATMP-HE może być przewożony oraz czas jego transportu/przechowywania wyznaczany jest na podstawie przeprowadzonych wewnętrznie badań laboratoryjnych, obejmujących m.in. badania stabilności produktu (szczegółowy opis postępowania dotyczący wyznaczenia powyższych parametrów zamieszczono w podrozdziale 3.2.1.3. Optymalizacja fazy implementacyjnej). Biorąc pod uwagę fakt, że produkty ATMP-HE wytwarzane są na indywidualne zlecenie lekarza w celu jego zastosowania w leczeniu konkretnego pacjenta, a więc stanowią tym samym spersonalizowane produkty lecznicze, koszty wytworzenia mogą stanowić istotną barierę finansową przed możliwością zastosowania tych produktów u szerszej grupy pacjentów. Całkowita optymalizacja kosztów wytworzenia produktu jest zagadnieniem wieloaspektowym, gdyż wiąże się nie tylko z kosztami surowców i materiałów zużywalnych do procesu wytwarzania, ale również organizacją pracy laboratorium, na którą składają się m.in. takie zagadnienia jak: i) czas potrzebny na wytworzenie produktu do mementu przygotowania końcowej formulacji produktu końcowego, ii) koszty badań kontroli jakości (np. badania jałowości), iii) koszty eksploatacji/utrzymania aparatury badawczej oraz laboratorium (np. coroczne świadectwa kwalifikacji sprzętu laboratoryjnego), iv) koszty transportu produktu do placówki medycznej (transport z Wytwórni do placówki medycznej tzw. Ośrodka aplikującego), v) koszty kadrowe oraz inne związane z utrzymaniem standardu GMP. Kwestie finansowe związane z wytwarzaniem takich produktów powinny zostać już na samym początku rozpatrzone ze względu na ostateczny koszt przygotowania takiej terapii oraz możliwość jej zastosowania dla szerszego grona odbiorców, u których na podstawie wywiadu lekarskiego istnieją przesłanki o zasadności zastosowania produktu ATMP-HE. Co więcej, w przypadku produktów allogenicznych (produkt zawierający komórki innego dawcy niż biorca), koszt takiej terapii będzie niższy niż w przypadku produktów autologicznych (produkt zawierający własne komórki pacjenta), ze względu na możliwość zastosowania tej samej serii wytworzonego produktu leczniczego u szerszego grona odbiorców (w przeciwieństwie do produktu autologicznego, który stanowi klasyczny przykład medycyny spersonalizowanej). Przytoczone powyżej opisy istotnych czynności jakie należy kontrolować w laboratorium klasy GMP, tzw. standardowe procedury postępowania (ang. standard operating procedurę; SOP), stanowią jedynie część z obszernej dokumentacji, jaką zobowiązana jest posiadać każda Wytwórnia produktów zaawansowanej terapii komórkowej i wchodzą w skład tzw. Systemu Zapewnienia Jakości (SZJ) [122]. SZJ stanowi udokumentowany spis wszystkich czynności przeprowadzanych na terenie laboratorium, które na podstawie przygotowanych dokumentów są możliwe do odtworzenia i śledzenia w celu potwierdzenia prawidłowości przeprowadzonego procesu wytwarzania oraz potencjalnego wykrycia, ograniczenia oraz usunięcia ew. zaistniałych nieprawidłowości. Poniżej przestawiono procedury SZJ, obowiązujące Wytwórnie produktówATMP, które to stanowią przedmiot audytów inspekcji organów nadzorujących tego typu produkty (na przykładzie dokumentów będących efektem realizacji niniejszej rozprawy doktorskiej, które zostały przygotowane i wdrożone w Wytówrni na terenie JCI w Krakowie): 1. Nadzór nad dokumentami 2. Nadzór nad zapisami 3. Organizacja pracy personelu 4. Zarządzanie ryzykiem 5. Certyfikacja i zwalnianie serii 6. Kontrola zmian 7. Postępowanie z odchyleniami i odstępstwami 8. Postępowanie w przypadku wystąpienia Istotnych Zdarzeń Niepożądanych (IZN) i sytuacjach nadzwyczajnych 9. Działania korygujące, zapobiegawcze i doskonalące 10. Przegląd SZJ 11. Program Higieny 12. Kwalifikacja dostawców 13. Przyjmowanie, przechowywanie i wydawanie materiałów 14. Kwalifikacja i walidacja 15. Nadzór nad wyposażeniem 16. Postępowanie z wynikiem poza specyfikacją / poza limitem 17. Proces wytwarzania produktu ATMP-HE 18. Kontrola jakości w Banku Tkanek i Komórek (BTiK) 19. Audyty W celu uzyskania zgody na wytwarzanie produktu ATMP-HE, konieczne jest także złożenie wniosku do CAT działającego w ramach EMA, a następnie uzyskanie klasyfikacji opracowywanego produktu (zgodnie z kategoriami produktu ATMP przedstawionymi na Rycinie 7) [128]. Następnie, opinia wydana przez CAT w sprawie klasyfikacji produktu biologicznego, jest załączana do dokumentacji (w tym SZJ) składanej do GIF w celu ubiegania się o zezwolenie na wytwarzanie produktu ATMP-HE. Dokumentacja składana do GIF standardowo obejmuje wniosek stanowiący załącznik do rozporządzenia MZ z dnia 5 lutego 2019 r., poz. 313 [121], w którym należy m.in. wskazać: (i) pochodzenie pobranego materiału wyjściowego (np. materiał ludzki allogeniczny, autologiczny itd.) (ii) rodzaj tkanek / komórek pod względem pochodzenia (np. tkanka tłuszczowa pobrana na drodze liposukcji – dawca autologiczny) (iii) wskazanie do stosowania u pacjentów (np. ortopedyczne, które może obejmować pourazowe zwyrodnienie stawu kolanowego) (iv) sposób podania produktu leczniczego (np. wstrzyknięcie do przestrzeni stawowej). Ponadto, jeśli zakres działalności przedsiębiorstwa obejmuje również działanie BTiK do wniosku do GIF należy dołączyć pozwolenie MZ wydane na deklarowany zakres prowadzonych czynności zgodny z Ustawą o pobieraniu, przechowywaniu i przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów, tzw. Ustawą transplantacyjną, która jest podstawowym aktem prawnym obowiązującym m.in. takie jednostki jak BTiK [129]. W przypadku etapów poprzedzających proces wytwarzania produktu ATMP-HE, które wykonywane mogą być jedynie przez BTiK, zakres takich czynności może obejmować m.in.: gromadzenie (obejmujące takie etapy jak przyjęcie materiału biologicznego i rejestracja), przetwarzanie, przechowywanie oraz dystrybucję tzw. materiału wyjściowego, czyli materiału biologicznego, z którego będzie wytwarzany produkt leczniczy [129]. Wydanie zgody MZ na prowadzenie działalności jako BTiK, poprzedzone jest audytem Krajowego Centrum Bankowania Tkanek i Komórek (KCBTiK) działającego w imieniu MZ. Pozytywne decyzje wyżej wymienionych organów nadzorujących działalność podmiotów zaangażowanych w pozyskiwanie i „przetwarzanie” tkanek ludzkich dla celów aplikacyjnych u pacjentów uprawniają laboratorium / Wytwórnię GMP do wytwarzania produktu ATMP-HE stosowanego w określonym wskazaniu, zgodnie ze złożoną wcześniej dokumentacją rejestracyjną (wykaz takich zgód pozyskanych dla produktu ATMP-HE, uzyskanych dzięki realizacji niniejszej pracy doktorskiej zamieszczono w rozdziale 8. Załączniki). Na Rycinie 10 przedstawiono uproszczony schemat wytwarzania produktu ATMP-HE. Rycina 10. Droga obiegu materiału biologicznego i prowadzonych czynności wytwórczych związanych z przygotowaniem produktu ATMP-HE przeznaczonego do podania u pacjenta. Niniejszy schemat w sposób uproszczony obrazuje kroki jakie należy podjąć aby możliwe było wytwarzanie produktu ATMP-HE w standardzie GMP. Obejmują one m.in.: i) zlecenie przez lekarza prowadzącego pacjenta na wytwarzanie produktu ATMP-HE, ii) transport materiału wyjściowego (np. tkanki tłuszczowej), iii) przyjęcie materiału wyjściowego (realizowane na terenie BTiK, a następnie Wytwórni) oraz iv) izolacja i ekspansja komórek, przygotowanie produktu końcowego do zastosowania u pacjenta. Biorąc pod uwagę charakter wdrożeniowy prowadzonej rozprawy doktorskiej, opracowanie procedur przygotowania preparatów komórkowych opartych o ludzkie MSCs z tkanki tłuszczowej do potencjalnych zastosowań w ubytkach kostno-chrzęstnych stawów, w tym w chorobie zwyrodnieniowej stawów kolanowych, oraz uzyskanie zezwolenia GIF na wytwarzanie produktu ATMP-HE we właściwym Wytwórni GMP, stało się podstawą niniejszej rozprawy doktorskiej. Tym samym, już na wczesnych etapach prac badawczych istotnym było uwzględnienie aspektów prawnych dotyczących Dobrej Praktyki Wytwarzania produktów biologicznych zarówno dotyczących Wytwórni produktu ATMP-HE, jak również opracowania protokołu wytwarzania produktu ATMP-HE. Należy jednak zaznaczyć, że w przypadku produktu ATMP-HE wydana zgoda GIF nie uprawnia przedsiębiorcy do prowadzenia eksperymentu leczniczego lub badawczego oraz udzielania pacjentowi świadczeń zdrowotnych. Zgodnie z art. 2 pkt 33b) Prawa farmaceutycznego decyzja dotycząca zastosowania terapii z udziałem produkt ATMP-HE jest podejmowana wyłącznie przez lekarza na jego wyłączną odpowiedzialność oraz po uzyskaniu zgody lokalnej Komisji Bioetycznej na zastosowanie alternatywnej metody leczenia pacjenta [130]. Według art. 2 rozporządzeniem (WE) nr 1394/2007 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 13 listopada 2007 r. w sprawie produktów leczniczych terapii zaawansowanej oraz zmieniające dyrektywę 2001/83/WE i rozporządzenie (WE) nr 726/2004 [115], produkt ATMP-HE to produkt leczniczy „przygotowany na terytorium Rzeczypospolitej Polskiej, w sposób niesystematyczny zgodnie ze standardami jakości i zastosowany w ramach świadczeń szpitalnych (…) na wyłączną odpowiedzialność lekarza w celu wykonania indywidualnie przepisanego produktu leczniczego dla danego pacjenta”. Podsumowując, uzyskane zgody KCBTiK, GIF oraz opinia CAT, poprzedzone przygotowaniem opisanej powyżej procedury wytwarzania produktu leczniczego w standardzie GMP, dokumentacji SZJ oraz adaptacją laboratorium wraz z przeprowadzeniem badań laboratoryjnych dla produktu ATMP-HE, zapewniają całościowo możliwość wytwarzania produktu ATMP-HE, co podlega nadzorowi i kontroli ze strony instytucji państwowych, takich jak m.in. KCBTiK oraz GIF. 2. CELE PRACY Głównym celem badań prowadzonych w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej o charakterze wdrożeniowym, było opracowanie oraz optymalizacja procedur izolacji i hodowli hAT-MSCs z ludzkiej tkanki tłuszczowej zgodnie z wymaganiami GMP, w celu przygotowania preparatów komórkowych do przyszłego potencjalnego zastosowania klinicznego u pacjentów. Celem była również ocena potencjału biologicznego uzyskanych hAT-MSCs, hodowanych w standardowych warunkach podłoża, jak również na natywnych oraz modyfikowanych podłożach opartych o grafen, zastosowanych w celu potencjalnego wzmocnienia ich potencjału chondrogennego dla potrzeb regeneracji defektów kostno-chrzęstnych, w tym uszkodzenia chrząstki stawowej w przebiegu osteoartrozy. W związku z powyższym, szczegółowe cele badawcze obejmowały: 1. Opracowanie oraz optymalizację protokołów izolacji i ekspansji hAT-MSCs w warunkach in vitro, zgodnie z wymaganiami GMP - w celu ich przyszłego potencjalnego zastosowania w praktyce klinicznej, jako produktów leczniczych. 2. Zbadanie morfologii, fenotypu oraz mezodermalnego potencjału różnicowania hAT-MSCs uzyskanych w standardzie GMP (zgodnie z zaleceniami Towarzystwa Naukowego ISCT [24]). 3. Ocenę potencjału chondrogennego hAT-MSCs w warunkach hipoksji oraz poddanych działaniu podwyższonego ciśnienia in vitro, odzwierciedlających warunki panujące w ludzkiej tkance chrzęstnej. 4. Ocenę aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs w warunkach in vitro w modelowym środowisku stawu objętego procesem OA, w tym w obecności czynników biochemicznych ludzkiego płynu stawowego. 5. Zbadanie wpływu wybranych podłoży grafenowych na fenotyp oraz wybrane funkcje biologiczne hAT-MSCs, w tym ich potencjał chondrogenny in vitro oraz proregeneracyjny w szczurzym modelu osteoartrozy in vivo. 6. Opracowanie standardowych procedur operacyjnych oraz przeprowadzenie walidacji procesu wytwarzania produktu leczniczego ATMP-HE, zawierającego hAT-MSCs jako substancję czynną, w laboratorium pracującym zgodnie z wymaganiami GMP na terenie współpracującej firmy zainteresowanej wdrożeniem wyników niniejszych badań (JCI w Krakowie). W związku z powyższym, dodatkowe cele organizacyjne związane z realizacją niniejszego doktoratu wdrożeniowego, związane z wymogami prawodawstwa polskiego i EU, obejmowały następujące kroki wdrożenia produktu leczniczego dla zatosowań klinicznych: i) opracowanie procedur, formularzy, zapisów i instrukcji stanowiących System Zapewnienia Jakości, ii) złożenie dokumentacji do Krajowego Centrum Bankowania Tkanek i Komórek w celu uzyskania zgody na prowadzenie działalności w zakresie gromadzenia, przechowywania oraz dopuszczenia do obiegu podskórnej tkanki tłuszczowej, jak również iii) złożenie dokumentacji do Głównego Inspektoratu Farmaceutycznego w celu uzyskania zgody na wytwarzanie produktu ATMP-HE. 3. MATERIAŁY I METODY 3.1. MATERIAŁY 3.1.1. Aspirat ludzkiej tkanki tłuszczowej Tkankę tłuszczową pobierano w warunkach jałowych z tkanki podskórnej powłok brzusznych lub uda, od zdrowych dawców (zarówno kobiet, jak i mężczyzn) na drodze liposukcji, przy pomocy urządzenia Body-Jet (Human Med. AG) wyposażonego w kolektory tkanki tłuszczowej tzw. FillerCollector/LipoCollector (Corning), zapewniające wstępne przefiltrowanie oraz płukanie pobranego materiału [131]. Następnie, aspirat tkanki tłuszczowej (o objętości całkowitej ok. 100-150ml) umieszczano w sterylnych strzykawkach BD Plastipack typu Luer-Lock o objętości 60 ml (Becton Dickinson; BD) zamkniętych korkiem CombiStopper (B.Braun) i pakowano do zestawów transportowych, które zapewniały transport materiału w temperaturze 2-8°C, które przewożono do laboratorium. Materiał tkankowy poddawano dalszej obróbce w laboratorium R&D (na terenie Zakładu Biologii Komórki WBBiB UJ), w ciągu 6-8 godz. od pobrania, w celu izolacji frakcji stromalno-naczyniowej (opis szczegółowy procedury zamieszczono w podrozdziale 3.2.1.1. Optymalizacja procedury izolacji frakcji SVF). Każdorazowo, pacjenci byli kwalifikowani do pobrania przez lekarza prowadzącego zabieg oraz podpisywali formularz świadomej zgody na pobranie materiału do celów naukowych, a sama procedura pobrania materiału wykonywana była przez wykwalifikowanego lekarza posiadającego wieloletnie doświadczenie w pobieraniu tkanki tłuszczowej na drodze liposukcji, wskazanego we wniosku do Komisji Bioetycznej związanym z niniejszymi badaniami. Zgodnie z Dyrektywą Komisji Europejskiej 2006/17/WE z dnia 8 lutego 2006 r. [132], tkankę tłuszczową pobierano od dawców z ujemnymi wynikami badań w kierunku HIV, HBV, HCV oraz kiły. Aspiraty tkanki tłuszczowej zostały pozyskane w ramach współpracy z wyznaczonymi we wniosku do Komisji Bioetycznej ośrodkami badawczymi w Krakowie, zgodnie z pozyskaną zgodą Komisji Bioetycznej przy Okręgowej Izbie Lekarskiej w Krakowie nr 72/KBL/OIL/2017. Wykaz pozyskanych lipoaspiratów tkanki tłuszczowej, które wykorzystano w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej w celu przeprowadzenia zaplanowanych badań eksperymentalnych, wraz z podstawowymi parametrami związanymi ze stanem klinicznym dawców (bez ich identyfikacji imiennej), które mogły mieć znaczenie dla właściwości biologicznych pozyskanych komórek, zamieszczono w Tabeli 6. Tabela 6. Charakterystyka pozyskanych lipoaspiratów ludzkiej tkanki tłuszczowej stanowiącej tkankę źródłową do izolacji hAT-MSCs. Numer Płeć Wiek BMI *Wskaźnik masy Choroby Miejsce 1 K 26 22, 9 Prawidłowa masa ciała - Powłoki brzuszne 2 M 41 32,0 Otyłość stopnia I - 3 K 38 33,2 Otyłość stopnia I Palacz 4 K 54 24,2 Prawidłowa masa ciała - 5 K 47 23,5 Prawidłowa masa ciała - 6 M 29 22,0 Prawidłowa masa ciała - 7 K 53 31,2 Otyłość stopnia I - 8 K 31 24,5 Prawidłowa masa ciała - 9 K 47 24,0 Prawidłowa masa ciała - 10 K 32 26,6 Nadwaga - 11 K 47 24,8 Prawidłowa masa ciała - 12 K 37 20,0 Prawidłowa masa ciała - 13 K 44 23,0 Prawidłowa masa ciała - 14 K 32 32,7 Otyłość stopnia I - Tkanka tłuszczowa z obszaru ud 15 K 37 21,2 Prawidłowa masa ciała - K: kobieta; M: mężczyzna; BMI: wskaźnik masy ciała (ang. body mass index); *Klasyfikacja BMI wg WHO : <18.5 – niedowaga; 18.5-24.9 – prawidłowa masa ciała; 25-29.9 – nadwaga; 30-34.9 – otyłość stopnia I; 35-39.9 – otyłość stopnia II; ≥40 – otyłość stopnia III. 3.1.2. Aspirat ludzkiego płynu stawowego Płyn stawowy (ang. human Synovial Fluid; hSF) pobierano jednorazowo od dawców bez oraz z OA, u których nadmiar płynu w jamie stawowej prowadził do niestabilności lub ograniczenia ruchomości stawu kolanowego, przy okazji planowych zabiegów odbarczających prowadzonych w ośrodku klinicznym, przez lekarza ortopedę. Punkcja stawu kolanowego była determinowana zasadnością odbarczenia stawu z nadmiaru płynu oraz potrzebą złagodzenia dolegliwości bólowych. Aseptyczne pobranie hSF na drodze artrocentezy (tj. nakłucia jamy stawowej) przeprowadzano przy wykorzystaniu skompletowanych uprzednio komercyjnie dostępnych, certyfikowanych, dopuszczonych do użytku klinicznego w Polsce i w Europie, jednorazowych jałowych zestawów pobraniowych, tj. sterylnej 30 ml strzykawki BD Plastipack oraz igły do nakłuć BD Spinal Needle 1,2 x 90 mm (BD). Płyn stawowy (o objętości całkowitej ok. 6-10 ml) umieszczano w sterylnych probówkach BD Vacutainer z EDTA o objętości 10ml (BD) i przewożono w zestawach transportowych, które zapewniały transport materiału w temperaturze 2-8°C. Następnie badany materiał zabezpieczano do dalszych analiz poprzez zamrożenie w temperaturze -80oC. Do każdego przekazanego materiału była dołączana dokumentacja, w tym informacja o parametrach klinicznych związanych z dawcą (bez jego identyfikacji imiennej) oraz formularz świadomej zgody pacjenta na wykorzystanie materiału do celów naukowych. Pobrania były wykonywane przez wykwalifikowanych lekarzy specjalistów w zakresie ortopedii i traumatologii narządu ruchu oraz medycyny sportowej, w ośrodku klinicznym Galen-Ortopedia Sp. z o.o. w Bieruniu, na podstawie pozyskanej zgody Komisji Bioetycznej przy Okręgowej Izbie Lekarskiej w Krakowie nr 175/KBL/OIL/2019. Wykaz pozyskanych hSF, które wykorzystano w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej w celu przeprowadzenia zaplanowanych badań eksperymentalnych, wraz z podstawowymi parametrami zawiązanymi ze stanem klinicznym dawców (bez ich identyfikacji imiennej), zamieszczono w Tabeli 7. Tabela 7. Charakterystyka dawców badanego płynu stawowego. Płeć Wiek BMI *Wskaźnik masy ciała **Stopień zaawansowania 47578 M 31 23,3 waga prawidłowa ND 43981 M 76 27, 7 nadwaga Os.IV 78157 M 26 23,8 waga prawidłowa ND 40500 K 88 33,8 I stopień otyłości Os.IV 97185 M 66 37,9 II stopień otyłości Os.III 31726 M 49 23,2 waga prawidłowa ND 30859 K 68 36,0 II stopień otyłości Os.III K: kobieta; M: mężczyzna; Os: choroba zwyrodnieniowa stawów (skrót stosowany w zastosowanej skali klinicznej); BMI: wskaźnik masy ciała (ang. body mass index); *Klasyfikacja BMI wg WHO: <18.5 – niedowaga; 18.5-24.9 – prawidłowa masa ciała; 25-29.9 – nadwaga; 30-34.9 – otyłość stopnia I; 35-39.9 – otyłość stopnia II; ≥40 – otyłość stopnia III. *Pięciostopniowa skala zaawansowania zmian zwyrodnieniowych stawów wg Kellgrena-Lawrence’a: ND - bez uchwytnych zmian radiologicznych; I – drobne osteofity; II – niewątpliwe, umiarkowane osteofity; III – duże osteofity, zwężenia szpar stawowych; IV – bardzo duże osteofity, szpara stawowa bardzo zwężona lub niewidoczna. 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu Naczynia hodowlane polistyrenowe (tj. standardowe płytki do hodowli komórek zwierzęcych i ludzkich; TCPS): płytki 6-dołkowe (Eppendorf) oraz szalki hodowlane o średnicy 100 mm (Eppendorf) lub 150 mm (Sarstedt) opłaszczano roztworami zwierającymi tlenek grafenu (GO) w formie płatkowej, tak aby stopień pokrycia powierzchni hodowlanej wynosił 10 µg/cm2. Roztwory tlenku grafenowu wylane na naczynia hodowlane mieszano co 15-20 min w celu uzyskania jednorodnego pokrycia całej powierzchni naczynia hodowlanego i inkubowano w temperaturze pokojowej (TP) przez okres 6h. Następnie nadmiar roztworu usuwano i naczynia hodowlane suszono w TP pod komorą laminarną w celu zachowania jałowości. W kolejnym dniu naczynia opłaszczone GO jałowiono dodatkowo poprzez zastosowanie 10 min naświetlanie światłem UV pod komorą laminarną oraz 2 godz. inkubację w roztworze soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ang. Phosphate Buffered Saline; PBS; ThermoFisher Scientific) zawierającej 4-krotnie stężony antybiotyk i antymykotyk (100x Antibiotic-Antimycotic; Gibco; ThermoFisher Scientific) oraz 1-krotnie stężoną gentamycynę (50mg/ml Genatamicin; Gibco; ThermoFisher Scientific). Tak przygotowane naczynia hodowlane, po usunięciu roztworów zastosowanych do jałowienia oraz wypłukaniu ich pełną pożywką hodowlaną, stosowano do hodowli komórkowych in vitro. Wszystkie w/w czynności związane z jałowieniem naczyń wykonywano tuż przed założeniem hodowli. W doświadczeniach użyto roztwory grafenowe (Tabela 8) - dostarczone przez partnera naukowego współpracującego w projekcie STRATEGMED3, tj. Sieć Badawczą Łukasiewicz- Instytut Technologii Materiałów Elektronicznych w Warszawie (ITME) lub zostały przygotowane w oparciu o tlenek grafenu zakupiony komercyjnie z firmy Graphenea, Inc., USA (Graphenea). Za każdym razem, kiedy w niniejszej pracy stosuje się określenie „podłoża natywne” (tj. bez dodatkowej modyfikacji chemicznej), wówczas dotyczy ono podłoży GO ITME oraz GO Graphenea, z kolei określenie „podłoża modyfikowane” oznaczają podłoża zawierające GO modyfikowany jonami złota: GO ITME+Au oraz GO Graphenea+Au. Tabela 8. Spis użytych roztworów grafenowych stosowanych w badaniach z hAT-MSCs. Roztwory grafenowe Opis stosowanych roztworów Pr GO ITME Tlenek grafenu syntetyzowany przez ITME ITME GO ITME+Au Tlenek grafenu modyfikowany złotem, syntetyzowany przez ITME ITME GO Graphenea Komercyjnie dostępny, wystandaryzowany tlenek grafenu Graphenea, Inc., USA GO Graphenea+Au Komercyjnie dostępny, wystandaryzowany tlenek grafenu modyfikowany złotem przez ITME Graphenea, Inc., USA 3.1.4. Szczury Do badań in vivo w szczurzym modelu indukowanej chemicznie osteoartrozy, a dotyczących analizy potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs natywnych i różnicowanych na podłożach grafenowych (spis badanych podłoży zamieszczono w podrozdziale 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu w Tabeli 8), wykorzystano szczury RNU Nude (Nude) w wieku 5-8 tyg., zakupione w Charles River Laboratories. Dzięki wykorzystaniu w/w szczepu zwierząt z upośledzoną odpornością, możliwe były dalsze procedury ksenogenicznego podania komórek ludzkich (tu: hAT-MSCs) w celu zbadania ich aktywności in vivo. Opis procedur badań in vivo zamieszczono w podrozdziale 3.2.4.5. Analiza potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs natywnych oraz różnicowanych na podłożach grafenowych – badania in vivo. Badania na zwierzętach przeprowadzono na podstawie pozyskanej zgody II Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Krakowie nr 07/2019 oraz 279/2019. 3.1.5. Materiały i odczynniki certyfikowane do zastosowań klinicznych Obok standardowych materiałów, pożywek i innych odczynników stosowanych w procedurach i hodowlach konwencjonalnych (w standardzie R&D; wymienione w ramach procedur opisanych w dalszej części rozdziału), stosowano także materiały i odczynniki dedykowane do przygotowania produktu ATMP-HE, tj. materiały i odczynniki ze stosownymi certyfikatami do przygotowania preparatu komórkowego do zastosowań klinicznych. Dostawcy odczynników i materiałów podlegali uprzednio procedurze Kwalifikacji Dostawców tj. działaniu mającemu na celu wykazanie, że stosowane materiały / odczynniki spełniają określone wymagania jakościowe i posiadają odpowiednie certyfikaty. W Tabeli 9 zamieszczono spis wybranych odczynników oraz materiałów, które zostały wyselekcjonowane podczas optymalizacji protokołu wytwarzania preparatów komórkowych w standardzie GMP i docelowo wykorzystane w dalszych badaniach ujętych w niniejszej rozprawie doktorskiej. Tabela 9. Spis wybranych odczynników i materiałów wykorzystanych do opracowania procesu wytwarzania produktu ATMP-HE. Produkt Opis i jakość Dokument powierdzający Kolagenaza (Collagenase NB6 GMP Grade; Serva Electrophoresis; Nordmark Biochemicals) – enzym proteolityczny wykorzystywany do trawienia enzymatycznego tkanki tłuszczowej 1) Produkt dedykowany do izolacji komórek z różnych tkanek do ich późniejszego zastosowania klinicznego; 2) Produkt otrzymywany na drodze fermentacji przez Clostridium histolyticum; 3) Produkt wytwarzany zgodnie z GMP (Wytwórca posiada certyfikat GMP); 4) Produkt posiada certyfikat bezpieczeństwa dotyczący przenośnych encefalopatii gąbczastych (ang. transmissible spongiform encephalopathies; TSE); 5) Produkt badany pod kątem jałowości, braku występowania Clostridium histolyticum, endotoksyn bakteryjnych i ogólnego profilu bezpieczeństwa. Certyfikat analizy dostarczony przez producenta MEMalpha medium z glutaminą (αMEM; Macopharma) – pożywka bazowa 1) Pożywka bezsurowicza, nie zawierająca komponentów pochodzenia zwierzęcego; 2) Produkt wytwarzany z zachowaniem zasad GMP (Wytwórca posiada certyfikat ISO 13485); 3) Produkt badany pod kątem jałowości oraz występowania endotoksyn bakteryjnych. Certyfikat analizy dostarczony przez producenta Ludzki lizat płytkowy (MultiPL’30; Macopharma) – suplement dodawany do pożywki αMEM 1) Produkt dedykowany do suplementacji pożywek do hodowli MSCs do aplikacji klinicznych; 2) Produkowany z płytek krwi pochodzących od skwalifikowanych dawców (zgodnie z obowiązującymi dyrektywami europejskimi), surowiec do produkcji lizatu jest dostarczany przez certyfikowane banki krwi; Certyfikat analizy dostarczony przez producenta 3) Produkt wytwarzany z zachowaniem zasad GMP (Wytwórca posiada certyfikat ISO 13485); 4) Wystandaryzowany proces wytwarzania produktu minimalizuje zmienność poszczególnych serii; 5) Produkt wytwarzany w systemie zamkniętym, sterylizowany na drodze zwalidowanego procesu filtracji (0,2 µm); 6) Produkt badany pod kątem bezpieczeństwa wirusologicznego (HBV, HCV, HIV 1 i 2, HTLV 1 i 2); 7) Produkt badany pod kątem jałowości, występowania endotoksyn bakteryjnych oraz mykoplazm; Roztwór soli PBS (Dullbecco’s Phosphate Buffered Saline CTS; Thermofisher Scientific) – roztów stosowany podczas prowadzenia hodowli komórkowej 1) Roztwór dedykowany do wytwarzania produktów komórkowych do aplikacji klinicznych; 2) Produkt wytwarzany z zachowaniem zasad GMP (Wytwórca posiada certyfikat ISO 13485) oraz zgodnie z prawem stanowym tzw. 21 CFR część 820 Zarządzanie Systemem Jakości; 3) Produkt nie zawiera komponentów pochodzenia zwierzęcego; 4) Produkt badany pod kątem jałowości oraz występowania endotoksyn bakteryjnych. Certyfikat analizy dostarczony przez producenta Roztwór soli PBS z jonami Mg2+ oraz Ca2+ (Dullbecco’s Phosphate Buffered Saline CTS; Thermofisher Scientific) – roztwór stosowany do rozpuszczania kolagenazy 1) Roztwór dedykowany do wytwarzania produktów komórkowych do aplikacji klinicznych; 2) Produkt wytwarzany z zachowaniem zasad GMP (Wytwórca posiada certyfikat ISO 13485) oraz zgodnie z prawem stanowym tzw. 21 CFR część 820 Zarządzanie Systemem Jakości; 3) Produkt nie zawiera komponentów pochodzenia zwierzęcego; 4) Produkt badany pod kątem jałowości oraz występowania endotoksyn bakteryjnych. Certyfikat analizy dostarczony przez producenta Tryple Selected Enzyme (Thermofisher Scientific) – roztwór wykorzystywany do pasażu komórek adherentnych 1) Rekombinowany enzym produkowany w procesie fermentacji mikrobiologicznej (nie zawiera komponentów pochodzenia zwierzęcego); 2) Produkt badany pod kątem jałowości, występowania endotoksyn bakteryjnych oraz aktywności biologicznej. Certyfikat analizy dostarczony przez producenta Antibiotic-Antimycotic solution (Thermofisher Scientific) – roztwór zawierający penicylinę, 1) Produkt nie zawiera komponentów pochodzenia zwierzęcego; 2) Produkt badany pod kątem jałowości. Certyfikat analizy dostarczony przez producenta streptomycynę i amfoterycynę B Butelki hodowlane (Eppendorf) - butelki używane podczas hodowli hAT-MSCs, 1) Produkt wolny od pirogenów, DNaz, RNaz, DNA ludzkiego i bakteryjnego pochodzenia; 2) Produkt badany pod kątem jałowości oraz występowania endotoksyn bakteryjnych. 3) Produkt wytwarzany w kontrolowanym środowisku wytwarzania, tzw. pomieszczeniach czystych (cleanroom), zgodnie z normą ISO 14644-1 (i) MEMalpha medium z glutaminą (αMEM; Macopharma) suplementowane 10% ludzkim lizatem płytkowym MultiPL’30 (MultiPL’30; w skrócie: „hPL”; Macopharma) zawiera 30% osocza i 70% dodatkowych składników, jednak producent nie dostarcza informacji o rodzaju pozostałych składników i ich stężeniu); (ii) MSC NutriStem XF Medium (Biological Industries) – zgodnie z zaleceniami producenta, przed wysianiem komórek, naczynia hodowlane opłaszczano roztworem MSC Attachment Solution (Biological Industries), wchodzącym w skład zestawu do hodowli MSCs. W tym celu roztwór MSC Attachment Solution uprzednio rozcieńczony w roztworze soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific) w stosunku 1:100, dodawano na naczynia hodowlane (200 µl /cm2). Naczynia hodowlane inkubowano w inkubatorze w 37oC przez 1 godz., po czym naczynia delikatnie przepłukano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific). Po dodaniu pożywki hodowlanej wysiewano hAT-MSCs; (iii) StemPro MSC SFM (ThermoFisher Scientific) – zgodnie z zaleceniami producenta, przed wysianiem komórek, naczynia hodowlane opłaszczano roztworem CELLStart Substrate (ThermoFisher Scientific) wchodzącym w skład zestawu do hodowli MSCs. W tym celu roztwór CELLStart Substrate rozcieńczony w roztworze soli PBS z jonami Ca2+, Mg2+ (ang. Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline with calcium and magnesium; DPBS z jonami Ca2+ i Mg2; ThermoFisher Scientific) w stosunku 1:50, dodawano na naczynia hodowlane w ilości 78 µl / cm2. Naczynia hodowlane inkubowano w inkubatorze w 37oC przez 1 godz., po czym usuwano nadmiar roztworu CELLStart Substrate. Po dodaniu pożywki hodowlanej wysiewano hAT-MSCs. Certyfikat analizy Heparinum WZF (WZF Polfa) – antykoagulant dodawany do lizatu płytkowego Produkt leczniczy dopuszczony do obrotu (wytwarzany zgodnie z GMP, Wytwórca posiada certyfikat GMP) Charakterystyka produktu leczniczego, numer pozwolenia na dopuszczenie do obrotu Ludzka albumina (human albumin; CSL Behring) – roztwór stanowiący jeden ze składników nośnika komórek hAT-MSCs Produkt leczniczy dopuszczony do obrotu (wytwarzany zgodnie z GMP, Wytwórca posiada certyfikat GMP) Charakterystyka produktu leczniczego, numer pozwolenia na dopuszczenie do obrotu Glukoza (Glucosum 10%; Fresenius Kabi) – roztwór stanowiący jeden ze składników nośnika komórek hAT-MSCs Produkt leczniczy dopuszczony do obrotu (wytwarzany zgodnie z GMP, Wytwórca posiada certyfikat GMP) Charakterystyka produktu leczniczego, numer pozwolenia na dopuszczenie do obrotu Płyn Ringera (płyn Ringera z mleczanami; Fresenius Kabi) – roztwór stanowiący jeden ze składników nośnika komórek hAT-MSCs Produkt leczniczy dopuszczony do obrotu (wytwarzany zgodnie z GMP, Wytwórca posiada certyfikat GMP) Charakterystyka produktu leczniczego, numer pozwolenia na dopuszczenie do obrotu 3.2. METODY 3.2.1. Optymalizacja protokołu wytwarzania preparatów komórkowych w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania 3.2.1.1. Optymalizacja procedury izolacji frakcji SVF Lipoaspiraty tkanki tłuszczowej przenoszono ze strzykawek do probówek 50 ml typu falcon (Sarstedt). Każdą z próbek zawierającą po 20 ml lipoaspiratu uzupełniano 20 ml roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific) zawierającym 2-krotnie stężony antybiotyk i antymykotyk, zawierający streptomycynę, penicylinę i amfoterycynę B (100x Antibiotic-Antimycotic; Gibco; ThermoFisher Scientific), dla których końcowe stężenie wynosiło odpowiednio: 100 µg/ml, 100 U/ml oraz 0,25 µg/ml. W celu usunięcia erytrocytów poprzez ich sedymentację, próbki mieszano i tak przygotowane inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej. Po rozwarstwieniu się aspiratu tkanki tłuszczowej od roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific) zastosowanego do płukania, usuwano dolną wodną frakcję zawierającą większość zagregowanych erytrocytów, pozostawiając górną frakcję zawierającą lipoaspirat. Krok ten powtarzano 4-5- krotnie do momentu uzyskania frakcji tkanki tłuszczowej bez widocznych makroskopowo zanieczyszczeń frakcją erytrocytarną. Następnie, lipoaspirat rozporcjowano po 20ml do próbek i zważono na wadze analitycznej AS 110.R2 (Radwag) (odejmując każdorazowo wagę uprzednio zważonej pustej próbki). W celu wyboru optymalnych warunków trawienia enzymatycznego tkanki tłuszczowej, każdą z próbek zawierającą po 20ml lipoaspiratu uzupełniano dalej 20 ml kolagenazy NB6 GMP Grade (Serva Electrophoresis; Nordmark Biochemicals) dedykowanej do zastosowań klinicznych, o trzech wybranych aktywnościach enzymatycznych, w celu izolacji frakcji SVF. Po dodaniu roztworu w/w kolagenazy do tkanki tłuszczowej, jej końcowa aktywność enzymatyczna wynosiła odpowiednio: i) 0,1 PZ U/ml (aktywność wyrażona w jednostkach PZ według Wünscha [133]), ii) 0,2 PZ U/ml; iii) 0,3 PZ U/ml. Następnie, probówki zawierające lipoaspirat zmieszany z roztworem kolagenazy inkubowano przez 40 min w temperaturze 37°C (w której kolagenaza osiąga optymalną aktywność) w cieplarce Orbital Shaker-Incubator ES-20 (Biosan) z wytrząsarką o szybkości wytrząsania wynoszącej 200 rpm. Po inkubacji, w celu zmniejszenia aktywności enzymatycznej kolagenazy, próbki dopełniano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific) do objętości całkowitej 50 ml i odwirowywano w obniżonej temperaturze (370 x g, 10 min, 16oC) zgodnie z zaleceniami producenta tego odczynnika [133]. Po wirowaniu strawionego lipoaspiratu, nadsącz zawierający frakcję lipidową usuwano, a pelet zawierający przede wszystkim uwolnione komórki jądrzaste tkanki tłuszczowej, czyli tzw. frakcję SVF, rozcieńczano w 2 ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific), następnie zawiesinę filtrowano przez filtr o średnicy porów 100 µm (Corning) i dopełniono roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific) do objętości 30 ml. Próbki wirowano (350 x g, 7 min) w temperaturze pokojowej, po czym nadsącz odciągano pipetą serologiczną, a pelet komórkowy zawieszano w 1 ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific). Komórki zliczano przy użyciu automatycznego licznika komórek ScepterTM 2.0 (Merck Millipore) z wykorzystaniem dedykowanych sensorów 60µm (Scepter Cell Counter Sensors; Merck Millipore). Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. Komórki wysiewano następnie do butelek hodowlanych (Eppendorf) w liczbie 0,1-0,15x106/cm2 powierzchni naczynia i hodowano w pożywce DMEM/F12 (ang. Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12; Sigma Aldrich; Merck Millipore) z dodatkiem 10% bydlęcej surowicy płodowej (ang. fetal bovine serum; FBS; Sigma Aldrich; Merck Millipore) oraz antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml). Komórki nieadherentne odpłukiwano po 48 godz., licząc od momentu wysiania komórek, poprzez zlanie pożywki hodowlanej oraz przepłukanie komórek roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific). Pożywkę wymieniono po 2-3 dniach, licząc od dnia wysiania komórek, aż do momentu pasażu, który wykonywano kiedy hodowla osiągnęła 70-80% konfluencji. Hodowlę prowadzono w standardowych warunkach (37oC, 5% CO2) w inkubatorze Sanyo MCO-19M . Schemat procedury izolacji frakcji SVF, zawierającej m.in. hAT-MSCs, metodą trawienia enzymatycznego zamieszczono na Rycinie 11. Rycina 11. Uproszczony schemat obrazujący standardowy protokół izolacji frakcji SVF tkanki tłuszczowej oraz zainicjowania hodowli hAT-MSCs in vitro. SVF: frakcja stromalno-naczyniowa; TP: temperatura pokojowa. Liza erytrocytów w roztworze hipotonicznym (dodatkowy etap) Dodatkowo (po ustaleniu standardowego protokołu izolacji frakcji SVF z tkanki tłuszczowej opisanego powyżej), w kolejnym etapie przeprowadzono dodatkowy krok optymalizacyjny mający na celu zastosowanie dodatkowego kroku lizy erytrocytów podczas obróbki tkanki tłuszczowej w celu izolacji hAT-MSCs z tkanki tłuszczowej [134–136], poprzez zastosowanie buforu ZAPR RBC Lysing Buffer (INCELL). W tym dodatkowym etapie oceniono wpływu stosowanego buforu na odzysk hAT-MSCs z tkanki oraz na kinetykę proliferacji, żywotność, morfologię oraz tempo ekspansji tych komórek in vitro. W skrócie, preparatykę aspiratów tkanki tłuszczowej prowadzono, jak opisano powyżej do etapu trawienia enzymatycznego z użyciem kolagenazy. Po trawieniu enzymatycznym tkanki tłuszczowej i odwirowaniu próbek z tkanką (370 x g, 10 min, 16oC), komórki zawieszano w 2 ml soli PBS i filtrowano przez filtr o średnicy 100 µm (Corning) w celu usunięcia niestrawionych resztek tkanki tłuszczowej, po czym do zawiesiny dodawano 10ml buforu lizującego, zgodnie z wytycznymi producenta. Zawiesinę komórek delikatnie rozpipetowano i inkubowano przez odpowiednio: (i) 5 min (protokół oznaczony skrótem AP, alternatywny protokół, nr 1) lub (ii) 10 min (protokół oznaczony jako AP nr 2) w TP, po czym rozcieńczano 2-krotnie pożywką hodowlaną. Komórki ponownie wirowano (350 x g, 7 min, TP), zlewano nadsącz, a pelet komórkowy zawieszano w 1 ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone). Komórki zliczano przy użyciu automatycznego licznika komórek ScepterTM 2.0 (Merck Millipore) z wykorzystaniem dedykowanych sensorów 60µm (Scepter Cell Counter Sensors; Merck Millipore). hAT-MSCs wysiewano na butelki hodowlane (Eppendorf) w liczbie 1,0-1,5x104/cm2 i hodowano w pożywce hodowlanej DMEM/F12 (Sigma Aldrich; Merck Millipore) z dodatkiem 10% FBS (Sigma Aldrich; Merck Millipore) oraz antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml). Pożywkę wymieniano co 2-3 dni. Hodowlę prowadzono w standardowych warunkach (37oC, 5 % CO2) w inkubatorze Sanyo MCO-19M. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. Ocena żywotności komórek Przed wysianiem oznaczano żywotność komórek w komorze Bürkera. W tym celu, zawiesinę komórek zmieszano z 0,4% roztworu błękitu trypanu (ThermoFisher Scientific) w stosunku 1:1, delikatnie rozpipetowano, po czym naniesiono 10 µl zawiesiny do komory Bürkera. Następnie, pod mikroskopem świetlnym z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus) wyposażonym w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV zliczano komórki leżące wewnątrz min. 4 dużych kwadratów komory Bürkera, różnicując komórki żywe (niewybarwione) od martwych (wybarwione na niebiesko). Odsetek komórek żywych określano zgodnie ze wzorem: 𝐾𝑜𝑚ó𝑟𝑘𝑖 ż𝑦𝑤𝑒 [%]=całkowita liczba komórek żywych x 100%całkowita liczba komórek Ponadto, codziennie prowadzono obserwacje morfologii komórek wykorzystując w tym celu mikroskop świetlny z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus) wyposażonym w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro Wybór pożywki hodowlanej W celu wyboru optymalnej pożywki hodowlanej, dedykowanej do hodowli ludzkich MSCs oraz spełniającej wymagania GMP w celu opracowania i przygotowania produktów leczniczych terapii komórkowej tj. ATMP-HE, hodowlę hAT-MSCs prowadzono równolegle w trzech następujących wybranych, komercyjnie dostępnych, pożywkach wolnych od produktów odzwierzęcych oraz ksenów: Ponadto, do wyżej wymienionych pożywek hodowlanych dodawano także mieszaninę antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicylinę (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycynę (końcowe stężenie 100 µg/ml), a w przypadku pożywki αMEM z 10% hPL także heparynę WZF (Polfa Warszawa) (końcowe stężenie 2 U/ml), która zapobiega powstawaniu skrzepów lizatu płytkowego. Każdą z w/w pożywek wymieniano co 2-3 dni. Komórki hodowano w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5 %CO2) w inkubatorze Sanyo MCO-19M, monitorując konfluencję hodowli za pomocą mikroskopu świetlnego z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. Wybór pożywki dokonano na podstawie wyników z oceny tempa proliferacji komórek w testowanych pożywkach hodowlanych, których procedury opisano dalej. Pasaż komórek hAT-MSCs Po osiągnięciu przez komórki konfluencji wynoszącej 70-80% pasażowano je za pomocą 1-krotnie stężonego roztworu TrypLE Select CTS (Gibco; ThermoFisher Scientific). Co istotne, roztwór ten jest wolny od produktów odzwierzęcych, a do każdej serii wytwarzanego produktu producent dołącza dokumentację tj. tzw. świadectwa analizy, świadectwa pochodzenia, jak również dostęp do głównej dokumentacji wytwarzanego produktu (ang. drug master file; DMF), która to dokumentacja jest wymagana podczas kwalifikacji dostawców i uwzględniana podczas wytwarzania produktów w standardzie GMP. W celu przeprowadzenia pasażu hAT-MSCs, po usunięciu pożywki hodowlanej, po dwukrotnym przepłukaniu komórek roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone), dodawano 1-krotnie stężony roztwór TrypLE Select CTS, po czym inkubowano komórki w inkubatorze przez kilka minut, poddając je monitorowaniu i obserwacji mikroskopowej. W momencie zaobserwowania oderwania się komórek od podłoża hodowlanego, dodawano odpowiednią, pełną pożywkę hodowlaną (skład pożywek opisano powyżej w pkt. (i)-(iii)) celem zahamowania aktywności roztworu pasażującego, a zawiesinę rozpipetowano kilkukrotnie i przeniesiono do próbek 50 ml typu falcon (Sarstedt). Następnie, komórki wirowano z prędkością 300 x g przez 5min w TP, usuwano nadsącz, a pelet komórkowy zawieszano w pożywce hodowlanej. Komórki zliczano przy użyciu automatycznego licznika komórek ScepterTM 2.0 (Merck Millipore) i wysiewano na nowe naczynia hodowlane (Eppendorf) w liczbie 4,0-4,3x103/cm2. Wybór naczynia hodowlanego W kolejnym etapie optymalizacji protokołu hodowli hAT-MSCs, po wyborze jednej z testowanych w/w pożywek hodowlanych, testowano wpływ wybranych naczyń hodowlanych ze standardowego plastiku hodowlanego (polistyrenu; TCPS), dostarczanych przez różnych producentów, w tym firmy: TPP, Corning, Corning Primaria, BD Falcon oraz Eppendorf – na wydajność hodowli hAT-MSCs. W tym celu, hAT-MSCs na etapie trzech kolejnych pasaży (pasaż nr 1-3) wysiewano na różne butelki hodowlane w liczbie 6,0x103/cm2 powierzchni hodowlanej i hodowano w wybranej wcześniej, optymalnej pożywce. Pożywkę wymieniano co 2-3 dni. Komórki hodowano w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5 %CO2) w inkubatorze Sanyo MCO-19M, monitorując konfluencję hodowli za pomocą mikroskopu świetlnego z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Przez trzy kolejne pasaże wykonywano ocenę tempa proliferacji komórek w testowanych w/w naczyniach hodowlanych przy użyciu automatycznego licznika komórek ScepterTM 2.0 (Merck Millipore). Pasaże komórek prowadzono, jak poprzednio, przy osiągnięciu przez komórki konfluencji wynoszącej 70-80%. Eksperyment wykonano trzykrotnie na dwóch lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. 3.2.1.3. Optymalizacja fazy implementacyjnej produktu leczniczego W celu przeprowadzenia fazy implementacyjnej procesu produkcji produktu ATMP-HE, przeprowadzono walidację wytwarzania trzech serii produktu ATMP-HE zawierającego hAT-MSCs jako substancję czynną, zgodnie z wymaganiami Dobrej Praktyki Wytwarzania. Walidacja procesu miała na celu sprawdzenie czy produkt ATMP-HE otrzymywany jest w sposób powtarzalny i spełnia wewnątrzprocesowe wymagania jakościowe oraz kryteria akceptacji wytwarzania produktu ATMP-HE jak również kryteria akceptacji badanego produktu końcowego. Kryteria te obejmowały dla tkanki źródłowej: liczbę komórek oraz żywotność (zliczaną według opisu zamieszczonego poniżej pt. Pomiar liczby oraz żywotności komórek we frakcji SVF oraz hAT-MSCs), badania jałowości oraz endotoksyn bakteryjnych (wykonaną zgodnie z opisem zamieszczonym poniżej pt. Badania jałowości oraz Badania poziomu endotoksyn bakteryjnych). Z kolei podczas prowadzenia hodowli hAT-MSCs oraz podczas przygotowania produktu końcowego kryteria te obejmowały: potencjalne oznaki zakażenia hodowli, morfologię komórek, konfluencję hodowli, obecność frakcji komórek nieadherentnych, które to parametry monitorowano z użyciem mikroskopu świetlnego z kontrastem faz VisiScope IT 404 (VVR). Z kolei liczbę komórek oraz ich żywotność zliczano przy użyciu fluorescencyjnego licznika komórek ADAM-MC (Nanoentek) (według opisu zamieszczonego poniżej pt. Pomiar liczby oraz żywotności komórek we frakcji SVF oraz hAT-MSCs). Faza implementacyjna została przeprowadzona w pomieszczeniach typu cleanroom o klasach czystości powietrza A i B (zgodnie z normą PN-EN ISO 14644-1 [123], rozporządzeniem GMP [122], jak również wytycznymi Komitetu ds. Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi przy EMA dotyczących produktów terapii komórkowych stosowanych u ludzi [137]). Podczas prowadzenia procesu produkcyjnego monitorowano stężenie pyłowe czystości powietrza dla wybranych klas czystości powietrza (zgodnie z limitami zanieczyszczeń zawartych w Tabeli 4 podrozdziału 1.5 Znaczenie Dobrej Praktyki Wytwarzania w projektowaniu i wytwarzaniu produktu leczniczego terapii zaawansowanej) oraz poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych w pomieszczeniach czystych w działaniu zawartych w Tabeli 5 podrozdziału 1.5 Znaczenie Dobrej Praktyki Wytwarzania w projektowaniu i wytwarzaniu produktu leczniczego terapii zaawansowanej. Wszystkie materiały i odczynniki zastosowane do przygotowania i formulacji produktu, począwszy od etapu preparatyki tkanki do etapu ostatniego pasażu hAT-MSCs posiadały stosowne certyfikaty analiz, potwierdzające możliwość ich wykorzystania podczas opracowywania procedur wytwarzania produktu ATMP-HE (spis wybranych odczynników i materiałów wykorzystanych do opracowania procesu wytwarzania produktu ATMP-HE opisano w Tabeli 9 podrozdziału 3.1.5. Materiały i odczynniki certyfikowane do zastosowań klinicznych). Podczas walidacji wytwarzania produktu ATMP-HE wykonano poniższe badania: ▪ Pomiar liczby oraz żywotności komórek we frakcji SVF oraz hAT-MSCs w hodowli Do oceny liczby oraz żywotności komórek frakcji SVF oraz hAT-MSCs na etapie izolacji oraz kolejnych pasaży hAT-MSCs wyprowadzonych z frakcji SVF i prowadzonych w hodowli in vitro, wykorzystano fluorescencyjny licznik komórek ADAM-MC (Nanoentek), wykorzystującego jednorazowe mikroczipy (ADAM AccuChip Kit, Nanoentek), dedykowany do pracy w warunkach GMP. W celu przygotowania próbki do pomiaru: (i) 50 µl zawiesiny hAT-MSCs w gęstości od 5x104/ml do 4x106/ml barwiono z zastosowaniem 50 µl buforu Accustain Solution T (Nanoentek) zawierającego oranż akrydyny (AO), po czym rozpipetowywano 2-3-krotnie – w celu oceny całkowitej liczby komórek (zarówno żywych jak i martwych); (ii) 50 µl zawiesiny hAT-MSCs w gęstości od 5x104/ml do 4x106/ml barwiono z zastosowaniem 50 µl buforu Accustain Solution N (Nanoentek) zawierającego jodek propidyny (PI), rozpipetowano 2-3 krotnie - w celu oceny liczby komórek nekrotycznych oraz w późnych fazach apoptozy. Następnie nałożono po 12 µl wybarwionej zawiesiny komórek na odpowiednią komorę mikroczipu (komora oznaczona T1 i T2: pomiar całkowitej liczby komórek oraz N1 i N2: pomiar całkowitej liczby martwych komórek) i dokonano odczytu liczby komórek. Całkowitą liczbę komórek żywych obliczono poprzez zastosowanie równania: 𝐶𝑎ł𝑘𝑜𝑤𝑖𝑡𝑎 𝑙𝑖𝑐𝑧𝑏𝑎 𝑘𝑜𝑚ó𝑟𝑒𝑘 ż𝑦𝑤𝑦𝑐ℎ=𝑇1−𝑁1 (dla pierwszego powtórzenia zliczania komórek) oraz 𝐶𝑎ł𝑘𝑜𝑤𝑖𝑡𝑎 𝑙𝑖𝑐𝑧𝑏𝑎 𝑘𝑜𝑚ó𝑟𝑒𝑘 ż𝑦𝑤𝑦𝑐ℎ=𝑇2−𝑁2 (dla drugiego powtórzenia zliczania komórek). Z kolei odsetek komórek żywych odczytano bezpośrednio z wyświetlacza urządzenia. Poprzez pomiar poziomu fluorescencji jodku propidyny możliwe jest odróżnienie komórek żywych od martwych. Izolację frakcji SVF prowadzono zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.1.1. Optymalizacja procedury izolacji frakcji SVF w pożywce αMEM z 10% hPL (Macopharma), a hodowlę hAT-MSCs prowadzono zgodnie z zoptymalizowanym protokołem opisanym w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro. Stosowanie buforów i roztworów antybiotyków ograniczono do etapu izolacji frakcji SVF oraz hodowli hAT-MSCs do pierwszego pasażu, zgodnie z zaleceniami zawartymi w Rozporządzeniu GMP [122] oraz wytycznych Komitetu ds. Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi (ang.committee for medicinal product for human use; CHMP) przy EMA dotyczących produktów terapii komórkowych stosowanych u ludzi [137]. Na Rycinie 12 zamieszczono schemat obrazujący zasadę pomiaru liczby komórek za pomocą licznik komórek ADAM-MC (Nanoentek), który został opisany i włączony do procedur operacyjnych związanych z walidacją procesu wytwarzania. Eksperyment wykonano dla trzech serii produktu ATMP-HE. Rycina 12. Sposób pomiaru liczby komórek w warunkach GMP z wykorzystaniem licznika komórek ADAM-MC (Nanoentek) oraz zintegrowanych z urządzeniem mikroczipów (ADAM AccuChip Kit, Nanoentek). T1 i T2: pomiar całkowitej liczby komórek; N1 i N2: pomiar całkowitej liczby martwych komórek; OA: oranż akrydyny (ang. Acridine Orange); PI: jodek propidyny (ang. Propidium iodide). W celu odróżnienia komórek martwych od żywych przeprowadzono barwienie różnicowe z zastosowaniem AO i PI. AO, niezależnie od stanu błony komórkowej barwi DNA komórki (zarówno żywych, jak i martwych komórek). PI barwi DNA, wnikając do komórek z uszkodzoną błoną komórkową (zarówno komórki nekrotyczne jak i w późnych fazach apoptozy). Zmodyfikowano na podstawie [138]. ▪ Badania stabilności produktu ATMP-HE W celu określenia terminu przydatności finalnego, gotowego do zastosowania produktu ATMP-HE zawierającego hAT-MSCs, przeprowadzono badania stabilności na trzech seriach walidacyjnych wytworzonego produktu. Dla potrzeb przeprowadzenia walidacji wytwarzania produktu ATMP-HE, zgodnie z przygotowanymi protokołami stanowiącymi część SZJ, komórki frakcji SVF wyizolowano zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.1.1. Optymalizacja procedury izolacji frakcji SVF, a następnie hAT-MSCs hodowano w pożywce αMEM (Macopharma) suplementowanej 10% hPL (Macopharma) zgodnie z protokołem przedstawionym w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro. Produkt końcowy ATMP-HE stanowiło 10x106 hAT-MSCs zawieszonych w 2 ml roztworu zawierającego (określany później skrótem „płyn Ringera”): płyn Ringera z mleczanami (ang. Ringer Lactate; Fresenius Kabi) z dodatkiem 2,5% glukozy (Fresenius Kabi) oraz 1% ludzkiej albuminy (CSL Behring) zapakowany do sterylnej strzykawki BD Plastipack typu Luer-Lock (BD) zamkniętej następnie za pomocą korka CombiStopper (B.Braun). Podczas badania stabilności, tak przygotowany produkt końcowy przechowywano w temperaturze 2-8oC. Żywotność hAT-MSCs oraz pomiar temperatury w otoczeniu produktu mierzono co 3 godz. przez 24 godz. Wszystkie materiały i odczynniki zastosowane do formulacji produktu były dedykowane do zastosowania do celów klinicznych oraz posiadały stosowne certyfikaty jakości. Eksperyment wykonano dla trzech serii produktu ATMP-HE. ▪ Badania jałowości W celu zapewnienia sterylności wytwarzanego produktu ATMP-HE, dla każdej wyprodukowanej partii produktu zostały wykonane badania jałowości (mające na celu wykluczenie kontaminacji produktu bakteriami) - w zakresie wykrywania wzrostu drobnoustrojów w warunkach tlenowych i beztlenowych, zgodnie z monografią 2.6.1. Farmakopei Europejskiej. Badany materiał: (i) materiał wyjściowy tj. aspirat tkanki tłuszczowej oraz (ii) produkt końcowy tj. zawiesina hAT-MSCs na etapie formulacji produktu, inokulowano do butelek przeznaczonych do hodowli tlenowej i beztlenowej mikroorganizmów (bakterii i drożdży) - tzw. butelki BACTEC Plus Aerobic/F Culture Vials i BACTEC Plus Anaerobic/F Culture Vials (BD) i inkubowano w temperaturze 35oC przez 14 dni. Następnie dokonano odczytu za pomocą automatycznego systemu BD Bactec FX400. Analiza została wykonana w ramach usługi przez Polski Bank Komórek Macierzystych S.A (PBKM), który dysponuje właściwym certyfikowanym tzw. laboratorium kontraktowym, posiadającym zgody GIF na przeprowadzenie badań mikrobiologicznych dla produktów leczniczych, wymaganym zgodnie z przepisami dla tego typu analiz dla produktów leczniczych ATMP. Badania wykonano dla trzech serii produktu ATMP-HE. ▪ Badania poziomu endotoksyn bakteryjnych Badanie obecności endotoksyn bakteryjnych wykonano dla próbek (i) materiału wyjściowego oraz (ii) produktu końcowego zgodnie z monografią 2.6.14. Farmakopei Europejskiej. Badanie zostało wykonane metodą LAL z użyciem czytnika Endosafe-PTS System, zgodnie z wewnętrzną instrukcją laboratorium wykonującego badanie. Jak poprzednio, analiza została wykonana przez PBKM. Badania wykonano dla trzech serii produktu ATMP-HE. 3.2.2. Ocena fenotypu oraz właściwości biologicznych hAT-MSCs hodowanych w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania 3.2.2.1. Ocena morfologii oraz fenotypu antygenowego hAT-MSCs Ocena morfologiczna Analizę morfologiczną oraz fenotypową hodowli hAT-MSCs pochodzących od wybranych dawców (lista dawców tkanki zamieszczona w podrozdziale 3.1.1. Aspirat ludzkiej tkanki tłuszczowej), która to hodowla została przygotowana zgodnie z zoptymalizowanym protokołem izolacji oraz namnażania, wykonano przy użyciu mikroskopii świetlnej. W tym celu, wyizolowaną z tkanki frakcję komórek SVF (zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.1.1. Optymalizacja procedury izolacji frakcji SVF) wysiewano na naczynia hodowlane (Eppendorf) w liczbie 0,1-0,15x106/cm2 powierzchni naczynia i hodowano w wybranej pożywce hodowlanej α-MEM z 10% hPL (Macopharma) oraz z dodatkiem antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml), a także heparyny WZF (Polfa Warszawa) (końcowe stężenie 2 U/ml), która zapobiega powstawaniu skrzepów lizatu płytkowego. Komórki, które nieadherowały do podłoża odpłukano po 48 godz., licząc od momentu wysiania komórek, poprzez zlanie pożywki hodowlanej oraz przepłukanie komórek roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone). Pożywkę wymieniano po 2-3 dniach, licząc od dnia wysiania komórek. Komórki hodowano w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5%CO2), monitorując morfologię komórek za pomocą mikroskopu świetlnego z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV, która posłużyła również do wykonania dokumentacji w postaci zdjęć. W analizie morfologii zwracano uwagę na frakcję komórek adherentnych, które charakteryzowały się wydłużonym, wrzecionowatym kształtem z widocznym dużym jądrem komórkowym, co stanowi prawidłową morfologię MSCs. Ocenę morfologiczną prowadzono od początku założenia hodowli oraz po każdym pasażu, aż do pasażu nr 3-4. Komórki pasażowano za pomocą 1-krotnie stężonego roztworu TrypLE Select CTS (Gibco; ThermoFisher Scientific), a następnie ponownie wysiewano - zgodnie z protokołem opisanym w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro. Ocena profil antygenowego Następnie, celem potwierdzenia fenotypu komórek wyizolowanych z ludzkiej tkanki tłuszczowej jako typowego dla MSCs, wykonano analizę profilu antygenowego tych komórek kierując się w głównej mierze zaleceniami ISCT [24], z zastosowaniem cytometrii przepływowej. W tym celu, komórki hodowano do pasażu nr 3-4, analogicznie do hodowli opisanej w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro w wybranych warunkach hodowlanych, pożywce αMEM (Macopharma) suplementowanej 10% hPL (Macopharma). Komórki pasażowano z użyciem TrypLE Select CTS (Gibco; ThermoFisher Scientific), zgodnie z protokołem w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro. Następnie, zawiesinę komórek utrwalano w roztworze 4% formaldehydu (PFA; Sigma Aldrich; Merck Millipore) przez 20min i komórki odwirowywano (300 x g, 5min, TP). Pelet komórkowy zawieszono w 1ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) i przechowywano w temperaturze 2-8oC do czasu dalszych analiz. Przed przystąpieniem do analizy cytometrycznej, komórki ponownie odwirowywano (300 x g, 5min, TP), zawieszano w soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) z 2% FBS (Sigma Aldrich; Merck Millipore) oraz rozporcjowywano do probówek cytometrycznych (Falcon; Corning) po 2x105 hAT-MSCs. Komórki znakowano przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko ludzkim antygenom, sprzężonymi z barwnikami fluorescencyjnymi: APC, FITC oraz PE (wymienionymi w Tabeli 10), zgodnie z zaleceniami producenta. Eksperyment wykonano czterokrotnie na dwóch lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. Tabela 10. Spis przeciwciał oraz kontroli izotypowych stosowanych do barwienia immunofluorescencyjnego hAT-MSCs w celu potwierdzenia ich fenotypu mezenchymalnego w trakcie ekspansji ex vivo. FITC: izotiocyjanian fluoresceiny (ang. fluorescein-5-isothiocyanate), APC: allofikocyjanina (ang. allophycocyanin), PE: fikoerytryna (ang. phycoerythrin). Przeciwciała zakupiono w firmie BD Pharmingen oraz BioLegend. Klon Izotyp Fluorochrom Producent CD14 MΦP9 Mouse IgG2b, κ FITC BD Pharmingen CD19 HIB19 Mouse IgG1, κ BD Pharmingen CD90 5E10 Mouse IgG1, κ BioLegend CD34 581 Mouse IgG1, κ APC BD Pharmingen CD45 HI30 Mouse IgG1, κ BioLegend CD105 43A3 Mouse IgG1, κ BioLegend HLA-DR L243 Mouse IgG2a, κ PE BioLegend CD73 AD2 Mouse IgG1, κ BioLegend W skrócie, komórki we wskazanej liczbie 2x105 zawieszano w 200 μl roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) zawierającego 2% FBS (Sigma Aldrich; Merck Millipore), dodawano po 5 μl stosownego przeciwciała i barwiono przez 20 min w 4oC, bez dostępu światła. Po zakończonym barwieniu, do każdej probówki dodawano 1ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone), a następnie próbki wirowano (300 x g, 5 min, 4oC). Uzyskany pelet komórek zawieszano w 200 μl roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) i analizowano za pomocą cytometru przepływowego BD LSRFortesa oraz oprogramowania BD FACS Diva wer. 8.1. (Becton Dickinson). 3.2.2.2. Ocena zdolności różnicowania MSCs w kierunku komórek mezodermy Jednym z podstawowych kryteriów identyfikacji MSCs, zdefiniowanych przez ISCT [24], jest zdolność do różnicowania w kierunku komórek mezodermy tj. komórek tkanki chrzęstnej, kostnej i tłuszczowej in vitro. Zdolność różnicowania hAT-MSCs uzyskanych w zoptymalizowanej procedurze, w kierunku komórek tkanki kostnej, chrzęstnej oraz tłuszczowej oceniano w hodowli stymulującej różnicowanie do danego typu komórek w warunkach in vitro (w stosownej pożywce różnicującej podanej poniżej), zakończonej barwieniem histologicznym uzyskanych komórek, umożliwiającym detekcję: i) proteoglikanów, głównych składników macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki chrzęstnej (dla różnicowania chondrogennego), ii) złogów wapnia (dla różnicowania osteogennego) oraz iii) cytoplazmatycznych kropli lipidowych (dla różnicowania adipogennego). Kontrolę stanowiły hAT-MSCs hodowane w pożywce αMEM (Macopharma) z dodatkiem 2% hPL (Macopharma) pozbawionej czynników różnicujących. Komórki (na pasażu nr 3-4) hodowano w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5 % CO2) w inkubatorze Sanyo MCO-19M. Ponadto, z użyciem systemu AVATAR (opis badań zamieszczono poniżej), w warunkach podwyższonego ciśnienia (2PSI oraz 5PSI) oraz warunkach hipoksji (5%O2) prowadzono hodowlę hAT-MSCs, zarówno w pożywce kontrolnej (αMEM z 2% hPL; Macopharma) jak i w pożywce różnicującej komórki chondrogennie (StemPro Chondrogenesis Differentitation Kit ; Gibco; ThermoFisher Scientific). Różnicowanie prowadzono w trzech niezależnych następujących układach: ▪ Różnicowanie w kierunku adipocytów Różnicowanie komórek w kierunku adipocytów zostało przeprowadzone w komercyjnie dostępnej pożywce dedykowanej do indukcji procesów adipogenezy – StemPro Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific). Komórki wysiewano w gęstości 1 x 104 komórek/cm2 powierzchni hodowlanej na 12-dołkowe płytki hodowlane (Eppendorf) w pożywce αMEM z 2% hPL (Macopharma), po czym po 6 godz. inkubacji, kiedy komórki zaadherowały do podłoża, wymieniano pożywkę na pożywkę StemPro Adipogenesis Differentiation Kit (Gibo; ThermoFisher Scientific). Pożywkę różnicującą wymieniano następnie co 2-3 dni trwania hodowli. Komórki hodowano w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5 % CO2) w inkubatorze Sanyo MCO-19M. W 14 dniu hodowli wybarwiono komórki na obecność wakuoli lipidowych identyfikujących adipocyty. W tym celu usuwano pożywkę różnicującą, komórki przepłukiwano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone), a następnie utrwalano w 4% PFA (Sigma Aldrich; Merck Millipore) przez 20 min. Następnie komórki ponownie przepłukiwano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) i dodawano barwnika Oil-Red-O (Sigma Aldrich; Merck Millipore) – wiążącego lipidy obecne w kroplach tłuszczowych, zgodnie z protokołem producenta. Komórki inkubowano z barwnikiem przez 15 min w TP, a następnie płukano dwa razy wodą destylowaną. Uzyskane preparaty analizowano w mikroskopie świetlnym z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus) wyposażonym w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. ▪ Różnicowanie w kierunku osteocytów Badanie różnicowania MSCs w kierunku osteocytów prowadzono w komercyjnie dostępnej pożywce StemPro Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific). Komórki wysiewano w gęstości w 5x103 komórek/cm2 na 12-dołkowe płytki hodowlane (Eppendorf) i hodowano przez 6 godz. w pożywce αMEM z dodatkiem 2% hPL (Macopharma). Następnie wymieniono pożywkę na StemPro Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific). W trakcie trwania różnicowania osteogennego, pożywkę wymieniano co 2-3 dni. Po 21 dniach hodowli różnicującej, komórki utrwalono (jak poprzednio) przez 20 min w 4% PFA (Sigma Aldrich; Merck Millipore). Mineralizację macierzy w hodowlach osteogennych identyfikowano na podstawienia barwienia 2% czerwienią alizarynową S (ang. Alizarin Red S; Sigma Aldrich; Merck Millipore), która jest wiązana przez złogi wapniowe. W tym celu, przepłukano komórki roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) a następnie inkubowano z barwnikiem (2% czerwienią alizarynową S; Sigma Aldrich; Merck Millipore), do 3 min w TP. Po tym czasie komórki ponownie przepłukano 3-krotnie wodą destylowaną w celu usunięcia niespecyficznych precypitatów. Komórki hodowano w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5 % CO2) w inkubatorze Sanyo MCO-19M. Uzyskane preparaty analizowano w mikroskopie świetlnym z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus) wyposażonym w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV, która posłużyła również do wykonania dokumentacji w postaci zdjęć. ▪ Różnicowanie w kierunku chondrocytów Różnicowanie w kierunku komórek tkanki chrzęstnej prowadzono w pożywce dedykowanej do różnicowania chondrogennego StemPro Chondrogenesis Differentitation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific) przez 21 dni zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta wymienionej pożywki. Komórki wysiewano na płytkach 6-dołkowych (Eppendorf) w postaci „kropli” o objętości 5 μl każda, które sprzyjają tworzeniu struktur trójwymiarowych tzw. mikrociałek, w których umieszczano 8x104 komórek. Następnie płytki umieszczano delikatnie w inkubatorze i inkubowano przez 2 godz. Po tym czasie, do tak wysianych komórek dodawano delikatnie pożywkę αMEM suplementowaną 2% hPL (Macopharma), którą następnie po upływie 6 godz. wymieniano na pożywkę StemPro Chondrogenesis Differentitation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific). Pożywkę różnicującą wymieniano co 2-3 dni, aż do zakończenia hodowli. Komórki hodowano w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5 % CO2) w inkubatorze Sanyo MCO-19M. ▪ Różnicowanie chondrogenne hAT-MSCs z zastosowaniem systemu AVATAR Dodatkowo, wykorzystując unikatowy system AVATAR (Xcellbio), który poprzez możliwość dostosowania poziomu ciśnienia oraz tlenu pozwala w pewnym stopniu naśladować w warunkach in vitro parametry atmosferyczne mikrośrodowiska w ludzkich tkankach, przeprowadzono także różnicowanie chondrogenne hAT-MSCs w warunkach zbliżonych do panujących in vivo, gdzie te komórki miałyby być ostatecznie aplikowane. W tym celu, hodowlę hAT-MSCs przygotowaną zgodnie z powyższym opisem Różnicowanie w kierunku chondrocytów, prowadzono równolegle w czterech różnych warunkach hodowlanych w inkubatorze AVATAR, w zakresie odpowiednio ciśnienia oraz stężenia tlenu: (i) 1 PSI, 21% O2 (warunki kontrolne) (ii) 1 PSI, 5% O2, (iii) 2 PSI, 5% O2, (iv) 5 PSI, 5% O2 – zarówno w pożywce różnicującej StemPro Chondrogenesis Differentitation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific) jak i kontrolnej – αMEM suplementowanej 2% hPL (Macopharma). Ponadto, kierując się obserwacją mikroskopową różnicowanych hAT-MSCs sporządzono półilościową analizę procesu formowania się agregatów komórkowych, co towarzyszy chondrogenezie in vitro. Ocenie poddano liczbę powstałych agregatów komórkowych oraz ich intensywność wybarwienia błękitem alcjanu (identyfikującym proteoglikany w różnicujących strukturach), opisaną jako gęstość agregatów komórkowych. Różnicowanie chondrogenne hAT-MSCs hodowanych zarówno w warunkach standardowych, jak i w systemie AVATAR, oceniano na podstawie identyfikacji proteoglikanów macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki chrzęstnej, po barwieniu błękitem alcjanu (ang. Alcian Blue Staining Solution; Merck Millipore). W tym celu pożywkę różnicującą usuwano, komórki przepłukiwano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) i dodawano do komórek 4% PFA (Sigma Aldrich; Merck Millipore). Komórki utrwalano przez 20 min w TP w ciemności. Następnie komórki płukano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) i dodawano roztwór 1% błękitu alcjanu (Merck Millipore), zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki inkubowano przez 30min w TP, a następnie ponownie przepłukiwano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone). Zdjęcia wybarwionych komórek wykonywano przy pomocy mikroskopu kontrastowo-fazowego Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. 3.2.2.3. Analiza profilu wydzielniczego hAT-MSCs W celu zbadania potencjału wydzielniczego hAT-MSCs przeprowadzono analizę profilu wybranych czynników wydzielanych przez te komórki do pożywki w warunkach in vitro, z wykorzystaniem technologii Luminex oraz zestawu Milliplex Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (Merck Millipore). Profil sekrecji hAT-MSCs porównano w odniesieniu do ludzkich fibroblastów skórnych (ang. Human Dermal Fibroblasts-Adult, NHDF-Ad; Lonza) dla hodowli prowadzonej w standardowej pożywce hodowlanej αMEM suplementowanej 10% hPL (Macopharma). Niezależnie zbadano również aktywność wydzielniczą hAT-MSCs w docelowym nośniku produktu ATMP-HE tj. w płynie Ringera. Hodowlę hAT-MSCs prowadzono zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro. W celu uzyskania warunków umożliwiających porównanie z hAT-MSCs, komórki NHDF-Ad (hodowane standardowo w dedykowanej do hodowli ludzkich fibroblastów skórnych pożywce hodowlanej FGM-2 (ang. Fibroblast Growth Medium-2; Lonza) zawierającej 2% FBS (Sigma Aldrich; Merck Millipore), dostosowano stopniowo do hodowli w pożywce αMEM suplementowanej 10% hPL (Macopharma). Ocena profilu wydzielniczego w warunkach ekspansji hAT-MSCs W celu oceny wydzielanych czynników w warunkach ich ekspansji, na płytkę 6-dołkową (Eppendorf) wysiewano po 5x105 hAT-MSCs (na pasażu nr 3-4) na dołek, które hodowano dalej w pożywce αMEM suplementowanej 10% hPL (Macopharma) do momentu osiągnięcia konfluencji komórek równej 70-80%. Nadsącze z pożywek hodowlanych zebrano (po 3 dniach licząc od momentu wysiania), zwirowano (300 x g, 5 min) w celu eliminacji agregatów komórkowych i białkowych z pożywki hodowlanej i rozporcjowano do probówek typu eppendorf. Rozporcjowany po 1ml nadsącz hodowlany zabezpieczono do czasu dalszych analiz poprzez zamrożenie w temperaturze -80°C. Równolegle prowadzono hodowlę NHDF-Ad, przygotowaną analogicznie jak powyżej dla hAT-MSCs, oraz inkubację samej pożywki hodowlanej αMEM suplementowanej 10% hPL (Macopharma), co zapewniło możliwość późniejszego odcięcia tła (tj. poziomu identyfikowanych składników występujących w pożywce) od uzyskanych wyników związanych z aktywnością wydzielniczą komórek. Ocena profilu wydzielniczego w warunkach końcowej formulacji produktu ATMP-HE Ponadto, biorąc pod uwagę końcową formulację produktu ATMP-HE, analizie poddano także aktywność wydzielniczą hAT-MSCs (na pasażu nr 3-4) po 12h inkubacji w roztworze zawierającym: płyn Ringera z mleczanami (ang. Ringer Lactate; Fresenius Kabi) z dodatkiem 2,5% glukozy (Fresenius Kabi) oraz 1% ludzkiej albuminy (CSL Behring) – stanowiącym nośnik (tzw. excipient) dla produktu ATMP-HE opracowanego w ramach niniejszej pracy doktorskiej. W tym celu, na płytkę 6-dołkową (Eppendorf) wysiewano po 5x105 komórek na dołek, które hodowano w pożywce αMEM zawierającej 10% hPL (Macopharma) do momentu osiągnięcia konfluencji komórek równej 70-80%, po czym komórki przepłukano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) i dodawano płyn Ringera z mleczanami (ang. Ringer Lactate; Fresenius Kabi) z dodatkiem 2,5% glukozy (Fresenius Kabi) oraz 1% ludzkiej albuminy (CSL Behring). Komórki inkubowano przez 12 h w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5% CO2), po czym zebrano nadsącze hodowlane znad tych komórek. Podobnie jak poprzednio, równolegle prowadzono inkubację samego nośnika komórek (płynu Ringera), w celu możliwości odcięcia ew. tła od uzyskanych wyników związanych z aktywnością wydzielniczą komórek. Nadsącze odwirowano (300 x g, 5min) i rozporcjowano do probówek typu eppendorf. Rozporcjowany materiał przechowywano do czasu dalszych analiz w temperaturze -80°C. Eksperymenty wykonano trzykrotnie w duplikatach dla trzech lipoaspiratów pochodzących od różnych dawców. Analiza poziomu wydzielanych czynników z zastosowaniem systemu Luminex Pomiar stężenia wybranych cytokin i chemokin wykonano z zastosowaniem systemu Bioplex 200 (Bio-Rad), która wykorzystuje technologię Luminex, opartą na fluorymetrii przepływowej i równoległej detekcji wielu analitów obecnych w jednej próbce, gdzie na fluorescencyjnie znakowanych mikrokulkach polisterynowych immobilizowane są przeciwciała wychwytujące/ identyfikujące wybrane cząsteczki (m.n.. białka) obecne w badanym materiale [139]. Do pomiaru wykorzystano zestaw Milliplex Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (Merck Millipore), zawierający następujący panel analitów (cytokin, chemokin oraz czynników wzrostu): IL-6, IL-8, MCP-1, GCSF, VEGF, EGF, FGF-2, RANTES, PDGF-AA. Przed przystąpieniem do analizy, zabezpieczone wcześniej (jak opisano powyżej) nadsącze z hodowli komórkowej rozmrożono i procedowano dalej zgodnie z zaleceniami producenta zestawu Milliplex Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (Merck Millipore). W tym celu, płytkę 96-dołkową służącą do detekcji przepłukiwano 3-krotnie 100 μl buforu płuczącego (ang. Wash Buffer; Merck Millipore) z użyciem automatycznej płuczki mikropłytkowej Bio-Plex Pro Wash Station (BioRad), a następnie dodawano do każdego dołka po 25 μl buforu reakcyjnego (Assay Buffer) oraz po 25 μl badanego nadsączu hodowlanego oraz nadsączy kontrolnych (wymienionych powyżej). Następnie, dodawano 25 μl mieszaniny kuleczek opłaszczonych przeciwciałami wychwytującymi (Beads) i inkubowano całość na wytrząsarce BenchMixer (Benchmark Scientific Inc.) przez noc w temperaturze 4oC. Po zakończeniu inkubacji, płytkę ponownie płukano 3-krotnie 100 μl buforu płuczącego (ang. Wash Buffer; Merck Millipore) z użyciem automatycznej płuczki mikropłytkowej Bio-Plex Pro Wash Station (BioRad), po czym dodano przeciwciała detekcyjne (skoniugowane z biotyną) i inkubowano płytkę na wytrząsarce BenchMixer (Benchmark Scientific Inc.) przez 1godz. w TP. Następnie do każdego dołka dodawano po 25 μl odczynnika streptawidyny (SA) skoniugowanej z fikoerytryną (PE), po czym inkubowano na wytrząsarce BenchMixer (Benchmark Scientific Inc.) przez 30 min w TP. Po inkubacji płytkę ponownie przepłukano 3-krotnie 100 μl buforu płuczącego (ang. Wash Buffer; Merck Millipore) z użyciem automatycznej płuczki mikropłytkowej Bio-Plex Pro Wash Station (BioRad). Następnie dodano po 100 μl buforu Running Buffer do każdego dołka płytki 96-dołkowej, wymieszano dodane uprzednio odczynniki poprzez 5 min wytrząsanie na wytrząsarce BenchMixer (Benchmark Scientific Inc.) oraz dokonano pomiaru na stacji roboczej Bio-Plex (Bio-Rad). Wszystkie użyte odczynniki wraz z płytką 96-dołkową, stanowiły część zestawu Milliplex Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (Merck Millipore). Analizę danych wykonano przy użyciu oprogramowania Bioplex Manager (Bio-Rad). Pomiar został wykonany dzięki pomocy Pani dr Elżbiety Karnas, a aparatura badawcza została udostępniona przez Jagiellońskie Centrum Rozwoju Leków w Krakowie, dzięki uprzejmości Pana prof.dr hab. Stefana Chłopickiego. Uproszczony schemat przygotowania próbek do analizy z użyciem platformy Bio-Plex (Bio-Rad) zamieszczono na Rycinie 13. Rycina 13. Schematyczne przedstawienie analizy multipleksowej z zastosowaniem technologii Luminex. Zmodyfikowano na podstawie [139]. 3.2.2.4. Test chemotaksji hAT-MSCs w gradiencie ludzkiego płynu stawowego (hSF) W celu oceny aktywności migracyjnej hAT-MSCs in vitro, w środowisku zbliżonym do docelowego miejsca podania, wykonano test oceny ruchliwości tych komórek w komorze Boydena w gradiencie stężeń płynu stawowego (hSF) pozyskanego od dawców bez oraz z OA. Komórki hAT-MSCs (na pasażu nr 3 i 4) poddano ekspansji w pożywce hodowlanej αMEM z dodatkiem 10% hPL (Macopharma). Przy konfluencji wynoszącej 70-80% przeprowadzono pasaż komórek, a następnie policzono je, zgodnie z procedurą opisaną w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro. Przed ponownym wysianiem hAT-MSCs, w studzienkach płytki 24-dołkowej (Corning), umieszczano inserty z membraną o średnicy porów 8 μm (Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts; Corning), dzięki którym w dołku hodowlanym utworzono dwie komory hodowlane rozdzielone membraną. Inserty pokryto następnie 0,1% roztworem żelatyny (ESGRO Complete Gelatin Solution; Sigma Aldrich; Merck Millipore), dodawanej w objętości 100 µl/insert i inkubowano przez 30 min w inkubatorze przeznaczonym do hodowli komórek eukariotycznych (HeraCell VIOS 160i; ThermoScientific) w temp. 37oC w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2, a następnie nadmiar roztworu żelatyny odciągano. Kolejno, do dolnej komory dodawano po 640 μl odpowiedniej pożywki hodowlanej bez/z hSF: (i) αMEM suplementowany 10% hPL (Macopharma) z dodatkiem antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml) – kontrola 1 (K1); (ii) αMEM suplementowany 0,5% hPL (Macopharma) z dodatkiem antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml) – kontrola 2 (K2); (iii) αMEM (Macopharma) zawierający 10% hSF z dodatkiem antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml); (iv) αMEM (Macopharma) zawierający 25% hSF z dodatkiem antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml); (v) αMEM (Macopharma) zawierający 50% hSF z dodatkiem antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml). (i) αMEM z 2% hPL (Macopharma) stanowiącą pożywkę kontrolną, (ii) StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific) dedykowaną do różnicowania chondrogennego komórek oraz (iii) StemPro Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific) dedykowaną do różnicowania osteogennego komórek. (i) αMEM z 2% hPL (Macopharma) – dla warunków kontrolnych lub (ii) StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific) – dla warunków badanych indukujących proces chondrogenezy. W dalszym etapie testu, na każdy insert wysiewano hAT-MSCs w liczbie 3x104 komórek zawieszonych w objętości 100 µl pożywki αMEM suplementowanej 0,5% hPL (Macopharma). Wybór takiego składu pożywki hodowlanej wykorzystanej do zawieszenia hAT-MSCs podyktowany był koniecznością zachowania wysokiej żywotności komórek (powyżej 80%) przy jednoczesnej względnej eliminacji ewentualnych czynników chemotaktycznych obecnych w lizacie płytkowym, które mogłyby potencjalnie wpływać na migrację tych komórek. Jak wspomniano wcześniej, badano wpływ na aktywność chemotaktyczną hAT-MSCs -czynników obecnych zarówno w hSF pochodzącym od dawców ze zdiagnozowaną OA i podwyższoną masą ciała (określani później jako dawcy chorzy) oraz bez zdiagnozowanej OA i o prawidłowej masie ciała (określani później jako dawcy zdrowi). Spis wykorzystanych hSF zamieszczono w Tabeli 7 podrozdziału 3.1.2. Aspirat ludzkiego płynu stawowego. Próbki hSF, po rozmrożeniu w TP, zostały odwirowane (300 g, 5 min) w celu usunięcia osadu płynu stawowego, w tym elementów morfotycznych, a następnie wykorzystane do przygotowania próbek badanych zawierających hSF odpowiednio o stężeniu 10%, 25% oraz 50%. Uproszczony schemat przygotowania eksperymentu, z uwzględnieniem kontroli oraz grup badanych, zamieszczono na Rycinie 14. Rycina 14. Uproszczony schemat analizy chemotaktycznej rekrutacji hAT-MSCs w gradiencie stężeń płynu stawowego pochodzącego od dawców zdrowych jak i ze zdiagnozowaną chorobą zwyrodnieniową stawów, z wykorzystaniem zmodyfikowanej komory Boydena. K1: kontrola 1; K2: kontrola 2; ND: płyn stawowy pochodzący od zdrowego dawcy; OA: płyn stawowy pochodzący od dawcy ze zdiagnozowaną chorobą zwyrodnieniową stawów; P/S: penicylina i streptomycyna. Migrację komórek badano po 24-godzinnej inkubacji w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5% CO2) w pożywce z dodatkiem wzrastających stężeń hSF pochodzących od dawców z i bez OA. Po zakończonej inkubacji, inserty przełożono do nowych pustych studzienek, po czym je utrwalono i wybarwiono w 700 µl gotowego roztworu odczynnika Wrighta Stain Solution (WSS; Sigma Aldrich; Merck Millipore) tj. roztworu błękitu metylenowego eozyny stosowanego zarówno do utrwalania jak i wybarwiania komórek, przez 15min w TP. Następnie, dodano 700 µl roztworu zawierającego mieszaninę soli Na2HPO4 (Sigma Aldrich; Merck Millipore) i KH2PO4 (Sigma Aldrich; Merck Millipore) w stosunku 1:1 (końcowe stężenie 0,99%) i inkubowano przez kolejne 10 min. Następnie, inserty przełożono do czystych studzienek i płukano 3-krotnie wodą destylowaną. W celu usunięcia komórek, które nie wykazały aktywności chemotaktycznej, górną część membrany insertu delikatnie przetarto bawełnianymi wacikami, jednocześnie uważając, aby nie uszkodzić membrany insertu. Komórki, które wykazały chemotaksję do składników hSF (tj. wybarwione komórki znajdujące się w dolnej części membrany insertu) zostały policzone w pięciu polach widzenia (wpw) przypadających na jeden insert, pod powiększeniem 100X, przy wykorzystaniu odwróconego mikroskopu świetlnego z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus), wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Eksperyment wykonano trzykrotnie, w duplikatach: (i) dla trzech niezależnych dawców hSF z OA i podwyższoną masą ciała oraz (ii) bez zdiagnozowanej OA i o prawidłowej masie ciała. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. 3.2.3. Analiza składu wybranych czynników w płynie stawowym Próbki hSF (spis badanych hSF zamieszczono w podrozdziale 3.1.2 Aspirat ludzkiego płynu stawowego) wykorzystane w doświadczeniu opisanym w podrozdziale 3.2.2.4 Test chemotaksji hAT-MSCs w gradiencie ludzkiego płynu stawowego (hSF), analizowano także pod kątem składu molekularnego, w tym stężenia wybranych cytokin, chemokin i czynników wzrostowych z wykorzystaniem zestawu Milliplex Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (Merck Millipore) na stacji roboczej Bioplex 200 (Bio-Rad). Zestaw ten umożliwia przeprowadzenie analizy multipleksowej poprzez jednoczesną detekcję poziomu stężenia badanych cząsteczek sygnałowych: IFN-γ, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1, TNF-α, VEGF, RANTES. Badane próbki hSF, po rozmrożeniu i zwirowaniu (300 g x 5 min), przygotowano do dalszej analizy multipleksowej zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.2.3 Analiza profilu wydzielniczego hAT-MSCs. Eksperyment wykonano trzykrotnie, w duplikatach dla trzech różnych płynów stawowych pochodzących od niezależnych dawców. 3.2.4. Ocena wpływu wybranych podłoży grafenowych na właściwości biologiczne hAT-MSCs w warunkach in vitro oraz in vivo W ramach niniejszej rozprawy przeprowadzono również część doświadczeń mających na celu optymalizację warunków hodowli oraz ocenę różnicowania hAT-MSCs w kierunku komórek tkanki chrzęstnej na podłożach grafenowych in vitro. Przygotowanie podłoży, opłaszczanie płytek hodowlanych warstwą płatkowego tlenku grafenu (GO) oraz ich jałowienie zostało wykonane zgodnie z procedurami uprzednio zoptymalizowanymi przez nasz zespół badawczy (dr Małgorzata Sekuła-Stryjewska oraz mgr Sylwia Noga), których opis zamieszczono w podrozdziale 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu. 3.2.4.1.Ocena morfologii i fenotypu komórek hAT-MSCs hodowanych na natywnych oraz modyfikowanych podłożach GO Przed przystąpieniem do analizy wpływu podłoży grafenowych na właściwości biologiczne hAT-MSCs, ze względu na zmienność osobniczą badanego materiału biologicznego (hAT-MSCs) i związane z tym różne tempo proliferacji hodowli komórkowej, każdorazowo przeprowadzono optymalizację liczby wysiewanych hAT-MSCs pochodzących od wybranych dawców (lista badanych dawców tkanki tłuszczowej została zamieszczona w podrozdziale 3.1.1. Aspirat ludzkiej tkanki tłuszczowej). Przeprowadzenie optymalizacji gęstości wysiania hAT-MSCs podyktowane było koniecznością dostosowania czasu hodowli hAT-MSCs na potrzeby eksperymentu tj. prowadzenie hodowli hAT-MSCs na badanych podłożach przez 3 dni bez etapu pasażu komórek. Ocena morfologiczna Komórki wysiewano na szalki o średnicy 10cm (Eppendorf) w liczbie 2x106 pokryte roztworami tlenku grafenu (GO) - natywnego oraz modyfikowanego jonami złota (Au) (zgodnie z opisem w podrozdziale 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu) i hodowano przez 72 godz. w standardowych warunkach hodowlanych (37oC, 5 %, CO2) w pożywce α-MEM z 10% hPL (Macopharma), w inkubatorze Sanyo MCO-19M. Kontrolę stanowiły komórki hodowane na TCPS. Po 72 godz. wykonano analizę morfologiczną hAT-MSCs wykorzystując w tym celu mikroskop świetlny z kontrastem faz Olympus IX81 (Olympus) wyposażonym w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Przykładowe zdjęcia hAT-MSCs hodowanych na wybranych podłożach grafenowych wykonano w powiększeniu 100x. Ocena profilu antygenowego Ponadto, metodą cytometrii przepływowej sprawdzono wpływ podłoży opartych o tlenek grafenu na utrzymanie mezenchymalnego fenotypu hAT-MSCs in vitro. W tym celu, 2x106 hAT-MSCs wysiano na szalki o średnicy 10cm (Eppendorf) opłaszczone uprzednio wybranymi roztworami tlenku grafenu, zgodnie z podrozdziałem 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu. Po 72 godz. hodowli komórki pasażowano zgodnie z opisem zawartym w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro, wirowano (300 x g, 10 min, 4oC), a pelet komórkowy utrwalano w 1ml 4% PFA (Sigma Aldrich; Merck Millipore) przez 20min w TP, następnie komórki płukano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) oraz wirowano (300 x g, 10 min, 4oC). Pelet komórkowy zawieszano w 2ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) i przechowywano w temperaturze 2-8oC, zabezpieczając tym samym materiał do dalszej analizy cytometrycznej. Przed przystąpieniem do analizy cytometrycznej, uprzednio zabezpieczony materiał zwirowano (300 x g, 5 min, 4oC), a następnie procedowano zgodnie z opisem w podrozdziale 3.2.2.1. Ocena morfologii oraz fenotypu antygenowego hAT-MSCs, przy czym hAT-MSCs barwiono wybranymi przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z barwnikami fluorescencyjnymi: FITC, APC oraz PE (tj. znakowano markery pozytywne CD73, CD90, CD105), których spis zamieszono w Tabeli 10 podrozdziału 3.2.2.1. Ocena morfologii oraz fenotypu antygenowego hAT-MSCs. Eksperyment wykonano czterokrotnie na dwóch lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. Weryfikację fenotypu mezenchymalnego hAT-MSCs przeprowadzono na cytometrze przepływowym BD LSRFortesa z oprogramowaniem BD FACSDiva (Becton Dickinson). Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. 3.2.4.2.Wpływ podłoży grafenowych na proliferację i żywotność hAT-MSCs in vitro W celu analizy wpływu podłoży grafenowych na potencjał proliferacyjny hAT-MSCs in vitro, na szalki hodowlane o średnicy 10cm (Eppendorf) opłaszczone uprzednio roztworami GO (zgodnie z rozdziałem 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu) wysiewano 2,5x104 komórek/cm2 powierzchni hodowlanej. Kontrolę stanowiły komórki hodowane na TCPS. Pożywkę stanowiło αMEM z 10% hPL (Macopharma). Po 72 godz. hodowli komórki pasażowano, wirowano (300 x g, 5 min), a pelet komórkowy zawieszono w 1ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone). Komórki liczono przy użyciu licznika komórek ScepterTM 2.0 (Merck Millipore) z wykorzystaniem dedykowanych sensorów 60µm (Scepter Cell Counter Sensors; Merck Millipore). Kontrolę stanowiła wyjściowa liczba komórek wysiana na TCPS. Aktywność proliferacyjna była obliczana jako odsetek kontroli hAT-MSCs hodowanych na wszystkich badanych podłożach grafenowych, w porównaniu do komórek hodowanych na TCPS. Ocenę żywotności, w tym ew. procesów apoptozy i nekrozy, które mogłyby być stymulowane hodowlą hAT-MSCs na podłożach opartych o GO, przeprowadzono z użyciem cytometru przepływowego i zestawu Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen), przy czym zamiast jodku propidyny (PI) użyto 7-aminoaktynomycynę (7-AAD). W tym celu, hAT-MSCs po pasażu (przeprowadzonym zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.1.2 Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro) z podłoży GO oraz TCPS (podłoże kontrolne) w liczbie 1x105 zawieszono w 100 µl buforu wiążącego (Binding Buffer), zgodnie z procedurą producenta. Następnie, do każdej próbki dodawano po 5 µl aneksyny V sprzężonej z barwnikiem FITC oraz 5 µl barwnika 7-AAD. Komórki barwiono przez 15 min w TP bez dostępu światła. Po tym czasie analizowane próbki dopełniano 400 µl buforu wiążącego (Binding Buffer) i w przeciągu godziny (licząc od momentu przygotowania próbek do pomiaru) wykonano analizę na cytometrze przepływowym BD LSRFortesa z oprogramowaniem BD FACSDiva (Becton Dickinson). Eksperyment wykonano czterokrotnie na dwóch lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. 3.2.4.3. Ocena zdolności różnicowania hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych w kierunku komórek tkanki chrzęstnej i kostnej in vitro W celu zbadania wpływu podłoży grafenowych na indukcję procesu różnicowania hAT-MSCs w kierunku komórek tkanki chrzęstnej i kostnej in vitro, wysiewano 3,5x104 komórek/cm2 (na pasażu nr 3-4) na przygotowane wcześniej 12-dołkowe płytki hodowlane (Eppendorf) pokryte roztworami GO (przygotowane zgodnie z procedurą zamieszczoną w rozdziale 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu), w pożywce α-MEM z 2% hPL (Macopharma). Kontrolę stanowiły komórki hodowane na TCPS w tej samej pożywce. Po 6 godz. licząc od momentu wysiania komórek na podłoża hodowlane, gdy komórki zaadherowały do podłoża, zmieniono pożywkę i dodano odpowiednio następujące pożywki: Wymianę pożywek prowadzano co 2-3 dni w czasie trwania hodowli różnicującej. Różnicowanie hAT-MSCs prowadzono przez 21 dni. W dniu 3, 7, 14 oraz 21 komórki utrwalano i wybarwiano zgodnie z procedurą opisaną w podrozdziale 3.2.2.2. Ocena zdolności różnicowania MSCs w kierunku komórek mezodermy, opisującym Różnicowanie w kierunku osteocytów oraz Różnicowanie w kierunku chondrocytów. W wybranych punktach czasowych (dzień 3, 7, 14, 21) wykonano analizę morfologii hAT-MSCs przy użyciu mikroskopu kontrastowo-fazowego Olympus IX81 wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Eksperyment powtórzono trzykrotnie na lipoapisratach od różnych dawców. Dodatkowo, kierując się obserwacją mikroskopową różnicowanych hAT-MSCs, sporządzono półilościową analizę uzyskanych wyników. W przypadku różnicowania chondrogennego ocenie poddano liczbę powstałych agregatów komórkowych oraz intensywność ich wybarwienia błękitem alcjanu, opisaną jako gęstość agregatów komórkowych (jak opisano powyżej). Z kolei w przypadku różnicowania osteogennego oceniano stopień pokrycia powierzchni hodowlanej złogami wapnia wybarwionymi 2% czerwienią alizarynową S (Sigma Aldrich; Merck Millipore) oraz intensywność ich wybarwienia. Obserwacje mikroskopową dla badanych podłoży grafenowych porównano z kontrolą, tj. podłożem TCPS. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. 3.2.4.3.1. Analiza profilu ekspresji genów w procesie różnicowania się hAT-MSCs w kierunku chondrocytów in vitro Analizę wpływu podłoży grafenowych na ekspresję wybranych genów zaangażowanych w proces chondrogenezy prowadzono dla hAT-MSCs, w 3, 7 oraz 14 dniu hodowli różnicującej in vitro. Przed przystąpieniem do doświadczenia, indywidualnie dla każdego dawcy, przeprowadzano test gęstości wysiania komórek. Na podstawie uzyskanych wyników wyznaczano optymalną liczbę hAT-MSCs wysiewaną na płytkę hodowlaną., która wyno–iła 3,5 - 4 x103/cm2 powierzchni hodowlanej. Do doświadczeń wykorzystano hAT-MSCs na pasażach 3-4. Etap różnicowania hAT-MSCs na różnych podłożach in vitro W skrócie, komórki poddawano ekspansji w pożywce αMEM z 10% hPL (Macopharma), a następnie pasażowano i wysiewano do hodowli różnicującej, zgodnie z protokołami opisanymi powyżej. hAT-MSCs wysiewano na naczynia pokryte podłożami GO oraz TCPS (warunki kontrolne) w pożywce αMEM z 2% hPL (Macopharma). Po 6 godz., gdy komórki zaadherowały do podłoża hodowlanego, wymieniono pożywkę na: Pożywkę wymieniano co 2-3 dni w czasie trwania hodowli różnicującej. Etap zabezpieczenia próbek/ lizatów komórkowych do analiz ekspresji genów Próbki do dalszych analiz genetycznych zabezpieczano bezpośrednio przed rozpoczęciem różnicowania (tj. z puli komórek wysiewanych do różnicowania) w tzw. dniu „0” (D.0) oraz w 3, 7 i 14 dniu różnicowania (D.3, D.7, D.14) - zarówno dla komórek hodowanych w warunkach kontrolnych, jak i w pożywce różnicującej, na różnych podłożach. W tym celu, w wybranych punktach czasowych usuwano pożywkę znad komórek, przepłukiwano 2-krotnie komórki roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone), po czym bezpośrednio do dołka hodowlanego dodawano bufor lizujący RL (z zestawu do izolacji RNA GeneMATRIX Universal RNA/miRNA Purification Kit; Eurx) zawierający dodatkowo w składzie 1% β-merkaptoetanol (Bound Braker TCEP Solution; ThermoScientific). Lizaty hAT-MSCs przechowywano w temp. -80°C do czasu dalszych analiz. Etapy izolacji RNA oraz ilościowej oceny ekspresji genów w czasie rzeczywistym W celu analizy poziomu ekspresji wybranych genów biorących udział w procesie chondrogenezy przeprowadzono ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (ang. quantitative polymerase chain reaction, qPCR). W tym celu, w pierwszym etapie wykonano izolację całkowitego RNA przy użyciu zestawu GeneMATRIX Universal RNA/miRNA Purification Kit (Eurx), zgodnie z protokołem producenta. W skrócie, rozmrożone lizaty komórkowe (o objętości 400 µl) dokładnie wymieszano poprzez pipetowanie, po czym do lizatów dodano po 650 µl buforu LyseALL (Eurx). Całość wymieszano oraz zwirowano (z maksymalną prędkością tj. 21 130 x g, przez 5 min), a następnie supernatanty naniesiono na minikolumny homogenizacyjne, które wirowano przez 2 min z maksymalną prędkością (21 130 x g). Następnie, do każdego przesączu dodano 1.2 objętości 96% alkoholu etylowego (POCH), rozpipetowano i przeniesiono 700 µl każdej mieszaniny do indywidualnej minikolumny wiążącej RNA, którą następnie wirowano przez 1 min z prędkością 11 000 x g. Krok ten powtarzano 2-krotnie ze względu na wyjściową objętość każdego lizatu komórkowego wynoszącą ponad 700 µl oraz ograniczoną pojemność minikolumny wiążącej (wynoszącą max. 700 µl). Następnie, do każdej minikolumny dodawano po 600 µl buforu płuczącego Wash miRNA (Eurx) i wirowano (11000 x g, 1 min). Następnie każdą minikolumnę umieszczano w nowej probówce typu eppendorf i na membranę wiążącą RNA nakrapiano delikatnie po 40 µl wody RNase-free (Eurx), po czym wirowano (11000 x g, 2 min) odzyskując całkowite RNA. W kolejny kroku, przy użyciu nanospektrofotometru NanoDropOne (ThermoFisher Scientific) dokonano pomiaru stężenia oraz ocenę czystości wyizolowanego RNA, który wykonano poprzez pomiar stosunku absorbancji A260/280. (świadczący o potencjalnym zanieczyszczeniu badanej próbki białkami) oraz A260/230 (świadczący o potencjalnym zanieczyszczeniu próbki rozpuszczalnikami organicznymi). Następnie, przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji z użyciem termocyklera C1000 Touch (BioRad), za pomocą odczynników NG dART RT (Eurx), zgodnie z protokołem producenta. Do reakcji używano każdorazowo 1 μg RNA (zalecenie producenta dotyczą stężenia RNA mieszczącego się w przedziale 10ng-5µg) oraz mieszaniny odczynników wymienionych w Tabeli 11. Tabela 11. Spis składników mieszaniny reakcyjnej stosowany w reakcji odwrotnej transkrypcji. Składnik Składnik Objętość Bufor reakcyjny 5x NG cDNA buffer 4 Losowe heksamery Random hexamers 1 Oligomery tymidylanu Oligo(dT) 1 Odwrotna transkryptaza dART z inhibitorami RNazy hamującymi RNazy A, B i C NG dART RT mix 1 Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej, po dodaniu wody wolnej od RNaz (RNase-free water) wynosiła 13µl. Warunki reakcji odwrotnej transkrypcji zamieszczono w Tabeli 12. W celu uzyskania komplementarnego DNA (cDNA) mieszaninę reakcyjną umieszczono w probówkach dedykowanych do odwrotnej transkrypcji (ThermoFisher Scientific), po czym, przy użyciu termocyklera C1000 Touch (BioRad) przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji. Tabela 12. Warunki termiczne przebiegu reakcji odwrotnej transkrypcji. Etap reakcji Temperatura 25°C 50°C 85°C Czas 10 min 50 min 5 min Otrzymane w ten sposób cDNA przechowywano w temperaturze -20°C, a następnie poddawano reakcji qPCR w celu ilościowej oceny ekspresji wybranych genów, przy użyciu zestawu SG qPCR Master Mix (Eurx) zgodnie z protokołem producenta. Przed rozpoczęciem reakcji qPCR, do dołków płytki reakcyjnej MicroAmp 96-well Base (Thermo Fisher Scientific) pipetowano po 12,5 μl mieszaniny reakcyjnej, której skład podano w Tabeli 13. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodziły także odpowiednie pary starterów (Sigma Aldrich; Merck Millipore), których spis przedstawiono w Tabeli 14. Tabela 13. Spis składników mieszaniny reakcyjnej używanej w qPCR. Składnik Objętość (μl) Barwnik SYBR Green I SG qPCR Master Mix (2x) 6,25 Pary starterów Starter forward + Starter reverse 1,25 Pasywny barwnik referencyjny ROX ROX Solution (10x) 0,25 Matryca cDNA cDNA 2 Woda wolna od nukleaz Water, nuclease free 2,75 Tabela 14. Spis sekwencji starterów stosowanych w analizie poziomu ekspresji wybranych genów w hAT-MSCs z zastosowaniem metody qPCR. F: starter forward, R: starter reverse. Startery zakupiono w firmie Sigma Aldrich, aktualnie Merck Millipore. Gen Sekwencja startera GAPDH (Dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego) F: CTTTTGCGTCGCCAG R: TTGATGGCAACAATATCCAC SOX9 (czynnik transkrypcyjny Sox9) F: CTCTGGAGACTTCTGAACG R: AGATGTGCGTCTGCTC HAPLN1 (białko łączące hialuronian i proteoglikan 1) F: ATGGCCGTTTTTACTATCTG R: CAATCTGAGCACCATCATTG COL2A1 (Kolagen typu IIA1) F: GAAGAGTGGAGACTACTGG R: CAGATGTGTTTCTTCTCCTTG ACAN (Agrekan) F: CTACACGCTACACCCTCGAC R: ACGTCCTCACACCAGGAAAC ALPL (Fosfataza alkaliczna) F: CCTCCTCGGAAGACACTCTG R: GCAGTGAAGGGCTTCTTGTC Płytki reakcyjne MicroAmp 96-well Base (Thermo Fisher Scientific) zamknięte za pomocą folii MicroAmp Optical Adhesive Film (ThermoFisher Scientific) umieszczano w termocyklerze QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (Life Technologies; ThermoFisher Scientific), stosując warunki reakcji zalecane przez producenta zestawu SG qPCR Master Mix (Eurx), które przedstawiono w Tabeli 15. Tabela 15. Warunki reakcji qPCR w czasie rzeczywistym. Etap reakcji Aktywacja PCR 40 cykli Denaturacja Hybrydyzacja Elongacja Temperatura 95°C 94°C 60°C 72°C Czas 10 min 15 sek. 30 sek. 30 sek. Specyficzność reakcji weryfikowano poprzez monitorowanie krzywych topnienia produktów powstałych w wyniku reakcji qPCR. Analizowano te wartości parametru cyklu progowego (ang. treshold cycle; CT) dla wybranych genów, dla których transkrypty zidentyfikowano, jako specyficzne. Uzyskane wyniki wyrażono jako krotności zmiany poziomu ekspresji badanych genów metodą podwójnej delty, korzystając ze wzoru R=2−∆∆CT (R oznacza względny poziom ekspresji genu). Gen referencyjny stanowiła dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (GADPH) będąca kontrolą wewnętrzną. Reakcję odwrotnej transkrypcji oraz qPCR wykonano we współpracy z dr Martą Pabiś z Małopolskiego Centrum Biotechnologii UJ w Krakowie. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. 3.2.4.5. Analiza potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs natywnych oraz różnicowanych na podłożach grafenowych – badania in vivo W celu zbadania potencjału proregeneracyjnego uzyskanych AT-MSCs - natywnych oraz różnicowanych na podłożach grafenowych, przeprowadzono ocenę histologiczną powierzchni stawowej szczurów szczepu Nude, u których chemicznie wywołano uszkodzenia chrząstki stawu kolanowego, a następnie zaaplikowano zawiesiny hAT-MSCs (opis modelu zwierzęcego przedstawiono w podrozdziale 3.1.4. Szczury). W skrócie, chemiczną indukcję OA u szczurów Nude (dzień 0; D-0) przeprowadzono w IF PAN Kraków) poprzez dostawową iniekcję (i.a.) do stawu kolanowego prawej tylnej łapy, 1 mg monojodooctanu sodu (MIA) rozpuszczonego w 50 µl 0,9% NaCl (Polpharma), powodującego zmiany zwyrodnieniowe w obrębie chrząstki stawowej. W dniu 14 (dzień 14; D-14) eksperymentu, podano zwierzętom poniższe preparaty komórkowe zawierające 1x106 hAT-MSCs / zwierzę zawieszone w 50 µl roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone). Komórki hAT-MSCs wykorzystane do przygotowania preparatów komórkowych, były hodowane były w naszym zespole w ZBK WBBiB UJ na następujących podłożach oraz warunkach: 1. Podłoże: TCPS w pożywce hodowlanej αMEM z 10%hPL (Macopharma); 2. Podłoże: TCPS w pożywce hodowlanej StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific); 3. Podłoże: GO Graphenea w pożywce StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific); 4. Podłoże: GO Graphenea modyfikowane nanocząstkami Au w pożywce StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific). (i) αMEM + 10%hPL (Macopharma), (ii) MSC NutriStem XF Medium (Biological Industries), (iii) StemPro MSC SFM (ThermoFisher Scientific). Zwierzętom kontrolnym podano nośnik komórek do iniekcji dostawowych tj. 50ul 0,9% NaCl (Polpharma) oraz 1 mg MIA rozpuszczonego w 50 ul 0,9% NaCl (Polpharma) w celu indukcji OA. Hodowla natywnych hAT-MSCs na potrzeby realizacji eksperymentu została przeprowadzona przez doktorantkę, na podstawie zoptymalizowanego protokołu wytwarzania preparatów hAT-MSCs zgodnie z procedurami opracowanymi w ramach podrozdziału 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro. Do hodowli hAT-MSCs zarówno na TCPS jak i wybranych podłożach grafenowych, wykorzystano komórki do pasażu nr 3-4. Hodowla hAT-MSCs różnicowanych na podłożach grafenowych została natomiast przeprowadzona zgodnie z procedurą opisaną w podrozdziale 3.2.2.2. Ocena zdolności różnicowania MSCs w kierunku komórek mezodermy / Różnicowanie w kierunku chondrocytów, przy czym na etapie przygotowywania zawiesiny komórkowej do podania do szczurów, komórki zostały przefiltrowane przez filtr o średnicy 100 µm (Corning) w celu usunięcia agregatów komórkowych. Podłoża grafenowe do hodowli hAT-MSCs przygotowano zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu. Dla wszystkich preparatów komórkowych zawierających hAT-MSCs hodowane zgodnie z opisem przedstawionym powyżej w pkt. 1-4, każdorazowo przed iniekcją dostawową oceniano żywotność hAT-MSCs w komorze Bürkera zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.1.1. Optymalizacja procedury izolacji frakcji SVF. Uproszczony schemat eksperymentu dotyczącego analizy wpływu natywnych i różnicowanych na podłożach grafenowych hAT-MSCs w szczurzym modelu osteoartrozy zamieszczono na Rycinie 15. Rycina 15. Schemat badania in vivo. Oceny potencjału regeneracyjnego hAT-MSCs w szczurzym modelu indukowanego chemicznie uszkodzenia chrząstki. W ostatnim 42 dniu (D-42) eksperymentu in vivo (licząc od dnia podania MIA, czyli 28 dni po podaniu komórek) przeprowadzono eutanazję zwierząt, a następnie pobrano stawy kolanowe w celu dalszych analiz. Następnie, pobrany materiał wypłukano w roztworze soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone) i utrwalano w roztworze 10% formaliny (Sigma Aldrich; Merck Millipore). Analiza histologiczna Następnie zabezpieczony materiał poddano analizie histologicznej w Zakładzie Diagnostyki Patomorfologicznej Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. W skrócie, utrwalone w formalinie próbki tkanek stawów szczurów odwapniano przez 5-6 godz. w 5% kwasie azotanowym (Chempur). Wykrojona próbka tkanki, została zalana parafiną w celu uzyskania kostek parafinowych, tzw. formalin-fixed, parafin-embedded tissue sections (FFPE). Następnie, tak przygotowane kostki parafinowe skrojono na mikrotomie firmy Thermo Microm HM 355S uzyskując skrawki o grubości 2,5 µm, które umieszczono na standardowych szkiełkach mikroskopowych. Preparaty w dalszej kolejności zostały deparafinizowane w ksylenie (Stanlab) oraz odwodnione za pomocą szeregu alkoholi o wzrastających stężeniach (tj. 70%, 80%, 95%, 100%) i zabarwione standardową metodą podstawową tj. barwieniem hematoksyliną-eozyną (Sakura Finetek Poland). Tak zabarwione preparaty podlegały ocenie histopatologicznej z wykorzystaniem mikroskopu Olympus BX53. Ocena potencjału chondrogennego hAT-MSCs (zarówno natywnych jak i różnicowanych na wybranych podłożach grafenowych tj. GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au) w regeneracji tkanki chrzęstnej została wykonana poprzez pomiar grubości chrząstki stawowej oraz określenie rodzaju nowopowstałej tkanki, dzięki uprzejmości Pana dr Krzysztofa Szymońskiego (lekarz patolog). Dokonano pomiaru zarówno dojrzałej, w pełni zróżnicowanej zdrowej chrząstki, jak i nowo formującej się, regenerującej się chrząstki występującej w obszarze gojenia się. Badania in vivo, w tym m.in. wykonanie uszkodzenia chrząstki, podanie komórek oraz pobranie tkanek, zostały przeprowadzono w zwierzętarni Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ przez zespół Prof. dr hab. Katarzyny Starowicz-Bubak z Zakładu Neurochemii, Instytut Farmakologii im. Jerzego Maja Polskiej Akademii Nauk w Krakowie, konsorcjanta projektu STRATEGMED3 (w składzie: dr Jakub Chwastek, dr Marta Bryk oraz dr Jakub Mlosta). Doktorantka uczestniczyła w przygotowaniu zawiesiny komórkowej do podania dostawowego, określanej później jako preparat komórkowy, a także brała udział w wyborze i analizie preparatów histologicznych tkanek po podaniu preparatów komórkowych (we współpracy z dr Krzysztofem Szymońskim z Zakładu Diagnostyki Patomorfologicznej Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie). 3.2.5. Analiza statystyczna danych Wyniki przeanalizowano pod kątem istotności statystycznej z wykorzystaniem testu t-studenta lub jednostronnej i/lub dwustronnej analizy wariancji ANOVA z testem Tukey’a. O ile nie wskazano inaczej, wyniki przedstawiono jako wartości średniej ± odchylenie standardowe (ang. standard deviation; SD). Liczbę powtórzeń każdego typu eksperymentu (N) podano przy opisie rycin z wynikami, zamieszczonych w rozdziale 4. Wyniki. Zaobserwowane różnice uznano jako istotne statystycznie, gdy wartość parametru p była mniejsza od 0,05 (p<0,05). Istotność statystyczną określono jako: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001. Do obliczeń i analizy statystycznej używano oprogramowania GraphPad Prism. 4. WYNIKI 4.1. Opracowanie protokołu izolacji i hodowli hAT-MSCs w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania W pierwszym etapie badań podjęto działania eksperymentalne mające na celu opracowanie oraz optymalizację protokołów izolacji oraz hodowli hAT-MSCs in vitro - zgodnie z wymaganiami Dobrej Praktyki Wytwarzania [122], co stanowi cel nadrzędny poniższej pracy doktorskiej. Już na wczesnych etapach opracowywania procedury izolacji i hodowli hAT-MSCs uwzględniono wytyczne stawiane produktom leczniczym terapii zaawansowanej – wyjątków szpitalnych, tzw. produktom ATMP-HE, stąd też stosowano się do rozporządzenia Dobrej Praktyki Wytwarzania [122]. Pobranie, pakowanie i transport materiału źródłowego Ze względu na specyfikę wymogów GMP, proces optymalizacji izolacji i hodowli hAT-MSCs rozpoczął się od ustalenia protokołów pobrania, pakowania oraz transportu materiału biologicznego tzw. materiału wyjściowego, czyli tkanki tłuszczowej stanowiącej materiał źródłowy do izolacji hAT-MSCs. W pierwszych etapach, aspirat tkanki tłuszczowej pobrany w klinice na drodze liposukcji, został przefiltrowany i przepłukany przy pomocy jałowych kolektorów tkanki tłuszczowej tzw. FillerCollector/LipoCollector, z którego został następnie pobrany do jałowych strzykawek BD Plastipack typu Luer-Lock (BD) zamkniętych korkiem CombiStopper (B.Braun), stanowiących tzw. opakowanie bezpośrednie. Tego typu postępowanie zapewnia zgodność z zaleceniami GMP dotyczącymi aseptycznego wytwarzania preparatów komórkowych, które uzależnione jest m.in. od jałowego pobierania materiału wyjściowego. Tym samym sposób pobierania tkanki stanowi kluczowy etap, który należy wziąć pod uwagę przy wytwarzaniu produktu ATMP-HE oraz dedycujący o zwolnieniu produktu do pacjenta. Tak przygotowany do transportu aspirat tkanki tłuszczowej pakowano następnie do zestawów transportowych, które zapewniały odpowiednie zabezpieczenie opakowania bezpośredniego oraz dalszy transport materiału w temperaturze 2-8°C do laboratorium, gdzie miałaby być prowadzona dalsza preparatyka materiału. Etapy te (tj. pobranie, pakowanie, transport) są niezwykle istotne ze względu na potrzebę zachowania sterylności oraz wysokiej żywotności materiału biologicznego, jak również ze względu na unikatowość materiału biologicznego, z czym wiąże się często brak możliwości ponownego pobrania materiału i tym samym założenia hodowli komórkowej do celów wytworzenia produktu ATMP-HE. Co istotne, preparatyka materiału biologicznego odbywała się zawsze tego samego dnia, co pobranie tkanki (tj. w ciągu 6-8 godz. od pobrania), natomiast czas trwania izolacji komórek frakcji SVF na wczesnych etapach optymalizacji protokołów wynosił do 6 godz. i ulegał stopniowemu skrócaniu wraz ze wzrostem doświadczenia „operatora”. Optymalizacja procesu pozyskiwania frakcji SVF z tkanki tłuszczowej W pierwszym etapie optymalizacji procesu wytwarzania produktu ATMP-HE dotyczącego izolacji frakcji SVF z pozyskanych lipoaspiratów, aspiraty tkanki tłuszczowej płukano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (ThermoFisher Scientific; r-r ze stosownym certyfikatem analizy) zawierającym 2-krotnie stężony antybiotyk i antymykotyk, zawierający streptomycynę, penicilinę i amfoterycynę B (100x Antibiotic-Antimycotic; Gibco; ThermoFisher Scientific) w celu usunięcia części czerwonych krwinek oraz eliminacji potencjanego zanieczyszczenia mikrobiologicznego materiału i związanych z tym ewentualnych skutków zakażenia tzw. środowiska produkcyjnego (tj. potencjalnego zanieczyszczenia miejsca wytwarzania produktu ATMP-HE). Stosowanie anybiotyków na wczesnych etapach wytwarzania ATMP-HE ogranicza potencjalne ryzyko obciążenia zakażeniem wytwarzanego materiału biologicznego związanego z pobieraniem tkanki [122]. Co istotne, zaleca sę aby stosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych zostało weliminowane z procesu wytwarzania tak szybko, jak to możliwe [122,137]. Stąd też na etapie przygotowania do wdrożenia (opisanego w dalszej części pracy w podrozdziale 4.5. Przygotowanie do wdrożenia produktu leczniczego terapii zaawansowanej – wyjątek szpitalny (ATMP-HE)) stosowanie buforów i roztworów antybiotyków ograniczono do etapu izolacji frakcji SVF oraz hodowli hAT-MSCs do pierwszego pasażu. W kolejnym kroku, wybrano najbardziej optymalną aktywność enzymatyczną kolagenazy NB6 GMP Grade zawierającej kolagenzaę typu I i II (produkowanej przez certyfikowanego dostawcę – firmę (Serva Electrophoresis; Nordmark Biochemicals) do trawienia tkanki tłuszczowej. Zgodnie z procedurą izolacji opisaną w podrodziale 3.2.1.1. Optymalizacja procedury izolacji SVF, testowano trzy różne aktywności enzymatyczne w/w kolagenazy, tj. 0,1 PZ U/ml, 0,2 PZ U/ml oraz 0,3 PZ U/ml (aktywność została wyrażona w jednostkach PZ według Wünscha [133]). Najniższą efektywność trawienia tkanki oraz izolacji frakcji SVF uzyskano dla wartości aktywności enzymatycznej kolagenazy wynoszącej 0,1 PZ U/ml, co potwierdzają odpowiednio zdjęcia obrazujące znaczące pozostałości niestrawionej tkanki na filtrach oraz najniższa liczba wyizolowanych komórek wynosząca średnio 1,55x105/1g lipoaspiratu (Rycina 16, Panel A i B). Z kolei, najwyższą wydajność izolacji SVF oraz równocześnie najwyższy stopień trawienia tkanki tłuszczowej (tj. brak obserwowanych pozostałości tkanki na filtrach) uzyskano dla wartości aktywności enzymatycznej kolagenazy równej 0,3 PZ U/ml, przy której średnia liczba wyizolowanych komórek wynosiła 2,52x105/1g lipoaspiratu (Rycina 16, Panel A i B). Pośrednie wyniki wydajności izolacji komórek frakcji SVF otrzymano dla aktywności enzymatycznej kolagenazy wynoszącej 0,2 PZ U/ml, przy której zastosowaniu liczba wyizolowanych komórek wynosiła 2,18x105/1g lipoaspiratu, a także obserwowano niewielkie pozostałości niestrawionej tkanki na etapie preparatyki (Rycina 16, Panel A i B). Ponadto, wykazano statystycznie istotną wyższą wydajność izolacji frakcji SVF przy użyciu aktywności enzymatycznej kolagenazy równej 0,3 PZ U/ml w porównaniu z trawieniem tkanki przy użyciu kolagenazy o aktywności enzymatycznej równej 0,1 PZ U/ml (Rycina 16, Panel B). Co jednak istotne z punktu widzenia wytwarzania produktu ATMP-HE, chociaż nie wykazano istotnego wpływu kolagenazy we wszystkich trzech badanych aktywnościach enzymatycznych na żywotność izolowanych komórek, która wynosiła ≥ 95% (Rycina 16, Panel B tabelka), na podstawie obserwacji mikroskopowej prowadzonej hodowli komórkowej zaobserwowano jednak najniższe tempo wzrostu izolowanych komórek frakcji SVF dla aktywności enzymatycznej 0,3 PZ U/ml (Rycina 16, Panel C). Natomiast frakcja komórek SVF izolowana z zastosowaniem kolagenazy o aktywności enzymatycznej równej 0,1 PZ U/ml charakteryzowała się początkowo wysoką zawartością agregatów komórek nieadherujących do podłoża oraz najniższym tempem wzrostu izolowanych komórek (Rycina 16, Panel C). W związku z tym, podjęto decyzję o wyborze kolagenazy o aktywności 0,2 PZ U/ml do dalszych etapów optymalizacji protokołu pozyskiwania hAT-MSCs. Decyzja dotycząca wyboru kolagenazy o aktywności enzymatycznej równej 0,2 PZ U/ml podyktowana była uzyskaniem: i) zadawalającej, średniej wydajności izolacji frakcji SVF, ii) wysokiej żywotności tej frakcji oraz iii) wyższym stopniowym tempem wzrotu izolowanych komórek adherentnych, w porównaniu do warunkow, w których zastosowano kolagenazę o aktywności 0,3 PZ U/ml. Potencjał do podjęcia wzrostu przez izolowane komórki adherentne frakcji SVF, wśród których znajdowały się także hAT-MSCs, było najistotniejszym kryterium wyboru, ze względu na konieczność pozyskiwania komórek o nienaruszonym potencjale biologicznym do dalszego przygotowania produktu ATMP-HE dla zastosowań u pacjentów. Ponadto, brano również pod uwagę aspekt finansowy dotyczący kosztów wytworzenia docelowego produktu, istotny pod kątem potencjału wdrożeniowego opracowywanego produktu ATMP-HE, który przekłada się w dużym stopniu na koszt zużycia roztworu kolagenazy w standardzie GMP (jednego z droższych odczynników używanych na etapie preparatyki tkanki źródłowej). Dla aktywności enzymatycznej kolagenazy wynoszącej 0,3 PZ U/ml, oszacowany przeze mnie koszt wytworzenia pojedyńczego preparatu wynikający ze zużycia roztworu w/w kolagenazy był 1,5 razy wyższy niż w przypadku zastosowania enzymu o aktywności 0,2 PZ U/ml. Aktywność enzymatyczna kolagenazy wynosząca 0,2 PZ U/ml, wybrana jako najbardziej optymalna, została stosowana w kolejnych etapach badań w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej. Rycina 16. Optymalizacja procedury izolacji frakcji SVF z lipoaspiratów. A. Makroskopowa ocena pozostałości tkanki tłuszczowej po trawieniu enzymatycznym (widoczne filtry po oczyszczaniu frakcji SVF z niestrawionych fragmentów tkanki; flitr Ø100µm). Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia z etapu izolacji komórek SVF. Czerwoną strzałką zaznaczono niestrawione pozostałości tkanki B. Analiza wpływu kolagenazy NB 6 GMP Grade (Serva Electrophoresis; Nordmark Biochemicals) o wybranych aktywnościach enzymatycznych na wydajność izolacji frakcji SVF. Po rozporcjowaniu lipoaspiratów ale jeszcze przed trawieniem enzymatycznym lipoaspiraty zważono na wadze analitycznej AS 110.R2 (Radwag), a następnie inkubowano w trzech testowanych roztworach kolagenazy o aktywności enzymatycznej wynoszącej odpowiednio: 0,1 PZ U/ml, 0,2 PZ U/ml oraz 0,3 PZ U/ml przez 40 min w cieplarce z wytrząsarką o szybkości wytrząsania 200 rpm w temperaturze 37°C. Po zakończonym trawieniu, próbówki zawierające strawioną tkankę odwirowano, a następnie policzono liczbę komórek frakcji SVF. Wydajność trawienia enzymatycznego przedstawiono jako liczbę wyizolowanych komórek na 1 g lipoaspiratu. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; *p<0,05; (test ANOVA z testem Tukeya, test post hoc); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). C. Morfologia komórek adherentnych poddanych ekspansji ex vivo w dedykowanej pożywce hodowlanej w pierwszych dniach hodowli. Przykładowe zdjęcia z wysiania komórek frakcji SVF pochodzącej od tego samego dawcy wykonano w dniu 4, 6 hodowli oraz dniu 9 po pierwszym pasażu komórek. Komórki hodowano w pożywce DMEM/F12 (Sigma Aldrich; Merck Millipore) suplementowanej 10% FBS (Sigma Aldrich; Merck Millipore) z dodatkiem antybiotyków (ThermoFisher Scientific): penicyliny (końcowe stężenie 100 U/ml) i streptomycyny (końcowe stężenie 100 µg/ml). Skala oznacza 50 μm. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. Podczas przeprowadzonych prac ustalono także objętość lipoaspiratu niezbędną do przeprowadzenia wytworzenia pojedynczego preparatu komórkowego, która wynosiła 50-100 ml. Objętość tę określono uwzględniając liczbę komórek frakcji SVF wyizolowanych z tkanki tłuszczowej oraz biorąc pod uwagę, że końcowo w wytworzonym produkcie ATMP-HE umieszczano 10,0x106 hAT-MSCs. W kolejnym etapie, kierując się przesłankami literaturowymi rekomendującymi zastosowanie buforu do lizy erytrocytów podczas izolacji MSCs z tkanki tłuszczowej [134–136], przeprowadzono ocenę możliwości zastosowania buforu lizującego ZAPR™ RBC Lysing Buffer (INCELL) w optymalizowanym protokole, oceniając także jego wpływ na morfologię, żywotność oraz kinetykę proliferacji izolowanych komórek. Hipotoniczny bufor do lizy erytrocytów stosuje się przy wstępnej preparatyce materiału biologicznego celem usunięcia w badanym materiale krwinek czerwonych (ang. red blood cells; RBC), co pozwala uzyskać na wczesnych etapach izolacji bardziej jednorodną frakcję MSCs z frakcji SVF [140]. W przeprowadzonych badaniach bufor lizujący dodawano do zawiesiny komórek SVF zawierającej komórki jądrzaste oraz pozostałe, nieodpłukane erytrocyty na 5 min (protokół AP nr 1) lub 10 min (protokół AP nr 2) lizy. Uzyskane wyniki wskazują, że modyfikacja protokołu izolacji frakcji SVF związana z dodaniem dodatkowego kroku pozwoliła wyizolować bardziej oczyszczoną frakcję komórek pod względem zawartości RBC, na co wskazuje obserwacja mikroskopowa założonej hodowli komórek pierwotnych (Rycina 17, panel A). Ponadto, wyniki efektywności izolacji frakcji SVF wykazały, że zastosowanie buforu do lizy erytrocytów (protokół AP nr 1 oraz AP nr 2) istotnie zmniejszyło wydajności izolacji hAT-MSCs w porównaniu ze standardowym protokołem (Rycina 17, panel B i C). Wykazano statystycznie wyższą kumulatywną liczbę komórek pozyskana z naczyń hodowlanych dla standardowego protokołu na etapie pasażu nr 1 i 2, w porównaniu do protokołu AP nr 2 (dane liczbowe przedstawiono na Rycinie 17, panel B). Z kolei, w przypadku protokołów AP nr 1 i 2, odnotowano istotnie wyszą kumulatywną liczbę komórek dla protokołu AP nr 1, czyli protokołu o krótszym czasie inkubacji komórek frakcji SVF z buforem lizującym RBC, w porównaniu do protokołu AP nr 2 (o dłuższym czasie inkubacji komórek z buforem lizującym RBC). Co ciekawe, na podstawie obserwacji mikroskopowej oraz liczby komórek otrzymanych z 1 cm2 powierzchni hodowlanej, w kolejnych etapach prowadzenia hodowli komórkowej obserwowano stopniowy spadek liczby komórek pozyskanych z 1cm2, co było związane ze zwiększaniem się powierzchni komórkowej hAT-MSCs podczas kolejnych pasaży (Rycina 17, panel C). Co istotne, wyniki z analizy żywotności komórek wskazują, że bufor do lizy erytrocytów spowodował istotne obniżenie żywotności izolowanych komórek frakcji SVF (odpowiednio żywotność dla AP 1 oraz 2 wynosiła: 88,0±2,2% oraz 82,9±0,1%) w porównaniu ze standardowym protokołem przy użyciu którego żywotność wyizolowanych komórek wynosiła 96,0±0,8% (Rycina 17, Panel D). Na podstawie otrzymanych wyników, ze względu na obniżoną żywotność komórek oraz niższy odzysk komórek po izolacji, zadecydowano aby nie włączać kroku związanego z lizą RBC do protokołu izolacji frakcji SVF. Rycina 17. Wpływ dodatkowego etapu lizy erytrocytów na wydajność izolacji, morfologię oraz żywotność izolowanych komórek. Wpływ testowanych protokołów izolacji frakcji SVF (standardowy protokół, zmodyfikowane alternatywne protokoły AP nr 1 oraz AP nr 2) na wydajność izolacji oraz hodowli hAT-MSCs. A. Morfologia komórek wyizolowanych przy zastosowaniu trzech różnych protokołów izolacji frakcji SVF (odpowiednio: standardowy protokół, AP nr 1 oraz AP nr 2). Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia wysianych komórek frakcji SVF zawierających populację hAT-MSCs po 5 dniach hodowli (przed pierwszym pasażem). Skala: 50 μm. B. Prezentowane wartości przedstawiają kumulatywną liczbę komórek frakcji SVF, które zostały wysiane na naczynia hodowlane (w przeliczeniu na liczbę wysianych butelek) oraz hAT-MSCs zebranych ze wszystkich butelek hodowlanych na etapie dwóch kolejnych pasaży. Średnia ± SD; **p<0,01, ***p<0,001 ; (test ANOVA z testem Tukeya, test post hoc); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). C. Wykres przedstawia liczbę wyizolowanych komórek SVF w przeliczeniu na 1 cm2 powierzchni hodowlanej oraz hAT-MSCs otrzymanych z 1cm2 powierzchni hodowlanej na etapie dwóch kolejnych pasaży (odpowiednio P.1 oraz P.2). Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; **p<0,01, ***p<0,001 ; (test ANOVA z testem Tukeya, test post hoc); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). D. Ocena żywotność komórek frakcji SVF dla trzech testowanych protokołów izolacji frakcji SVF. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; **p<0,05; (test ANOVA z testem Tukeya, test post hoc); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). Optymalizacja procesu namnażania hAT-MSCs in vitro Po zoptymalizowaniu protokołu izolacji frakcji SVF, w kolejnym kroku przeprowadzono optymalizację warunków hodowli i namnażania hAT-MSCs in vitro. W pierwszej kolejności testowano trzy pożywki hodowlane: Wszystkie z wyżej wymienionych pożywek dedykowane są do ekspansji ludzkich komórek MSCs w celach aplikacyjnych oraz spełniają wymagania GMP i posiadają stosowne certyfikaty jakości. Dla pożywek αMEM suplementowanej 10%hPL oraz StemPro MSC SFM, otrzymane wyniki badań wykazały porównywalną zarówno kumulatywną liczbę komórek w hodowli (Rycina 18, panel A) oraz liczbę komórek otrzymanych z 1 cm2 powierzchni hodowlanej (Rycina 18, panel B) na etapie trzech kolejnych pasaży, tj. pasaży 1-3 (procedurę pasażowania oraz zliczania komórek opisano w podrozdziale 3.2.1.2. Optymalizacja warunków hodowli hAT-MSCs in vitro). W przypadku kumulatywnej liczby hAT-MSCs zebranych ze wszystkich naczyń hodowlanych dla obu w/w pożywek hodowlanych wykazano najwyższą liczbę pozyskanych hAT-MSCs, co wskazuje na utrzymanie się potencjału do namnażania się hAT-MSCs w trakcie trwania hodowli w obu pożywkach (Rycina 18, panel A). Ponadto, odnotowano stopniowy spadek liczby komórek zbieranych z 1cm2 powierzchni hodowlanej (liczba ta oscylowała w przedziale pomiędzy 7,3x104 komórek/cm2 oraz 9,6x104 komórek/cm2) (Rycina 18, panel B), co mogło być związane ze zwiększaniem się powierzchni komórkowej hAT-MSCs podczas kolejnych pasaży, co zaobserwowano podczas obserwacji mikroskopowej hodowli hAT-MSCs. Najniższą wydajność hodowli, szczególnie po drugim i trzecim pasażu, uzyskano dla pożywki NutriStem XF Medium (Rycina 18, panel A i B). Obserwacja mikroskopowa dla wszystkich trzech testowanych pożywek wykazała, że komórki hodowane we wszystkich badanych warunkach hodowlanych charakteryzowały się wrzecionowatym, wydłużonym kształtem, o morfologii zbliżonej do fibroblastów, co jest charakterystyczne również dla komórek MSCs (Rycina 18, panel C). Podobnie jak wcześniej, biorąc pod uwagę zarówno otrzymane wyniki oraz koszty zakupu pożywki (co w rezultacie przekłada się na późniejszy koszt wytwarzanego produktu), do hodowli hAT-MSCs wybrano pożywkę αMEM suplementowaną 10% hPL (Macopharma). Rycina 18. Optymalizacja protokołu hodowli hAT-MSCs in vitro – wybór pożywki hodowlanej. W skrócie, hAT-MSCs izolowano z użyciem roztworu kolagenazy NB6 GMP Grade (Serva Electrophoresis; Nordmark Biochemicals) o aktywności enzymatycznej wynoszącej 0,2 PZ U/ml. Komórki frakcji SVF wysiewano w trzech testowanych pożywkach hodowlanych: αMEM suplementowany 10%hPL (Macopharma), StemPro MSC SFM (ThermoFisher Scientific) lub MSC NutriStem XF Medium (Biological Industries). A. Analiza wpływu trzech testowanych pożywek hodowlanych na proliferację komórek, którą przedstawiono jako kumulatywna liczba hAT-MSCs zebranych ze wszystkich naczyń hodowlanych zliczaną podczas trzech kolejnych pasaży (P) komórek (oznaczonych jako P.1, P.2, P.3). Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; *p<0,05, **p<0,01; (test t-studenta); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). B. Porównanie wpływu trzech testowanych pożywek hodowlanych na proliferację komórek, którą przedstawiono jako liczbę hAT-MSCs otrzymanych z 1cm2 powierzchni hodowlanej, zliczaną podczas trzech kolejnych pasaży (P) komórek (oznaczonych jako P.1, P.2, P.3). Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; Brak istotnych statystycznie różnic (p>0,05); (test t=studenta); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). C. Morfologia hAT-MSCs poddanych ekspansji ex vivo w wybranych pożywkach hodowlanych: αMEM + 10%hPL (Macopharma), MSC NutriStem XF Medium (Biological Industries) oraz StemPro MSC SFM (ThermoFisher Scientific). Reprezentatywne zdjęcia z dnia 6 (wykonano przed pierwszym pasażem) oraz z dnia 9 (po pierwszym pasażu), przy użyciu mikroskopu Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV, techniką obrazowania w kontraście faz w powiększeniu 100x, skala: 50 μm. Następnie, w celu wyboru optymalnego naczynia hodowlanego, analizowano kumulatywną liczbę hAT-MSCs zarówno zebranych ze wszystkich naczyń hodowlanych oraz liczbę komórek pozyskiwanych z 1 cm2 powierzchni hodowlanej butelek hodowlanych dostarczonych przez następujących producentów: TPP, Corning, Corning Primaria, BD Falcon, Eppendorf, które posiadały odpowiednie certyfikaty jakości tzw. CoA (ang. Certificate of Authenticity). Liczbę hAT-MSCs analizowano podczas ich hodowli na kolejnych następujących pasażach nr 1-3. Przeprowadzone badania wykazały istotne statystycznie różnice liczby hAT-MSCs hodowanych na butelkach Corning (pomiędzy pasażem nr 1 i 2) oraz na butelkach Corning Primaria (pomiędzy pasażami nr 1 i 2 oraz 2 i 3) (Rycina 19, panel A). Ponadto, w przypadku liczby hAT-MSCs pozyskanych z 1 cm2 wykazano istotność jedynie dla naczynia Corning (pomiędzy pasażem nr 2 i 3) (Rycina 19, panel B). Co ważne, kumulatywna liczba komórek zebrana z naczyń hodowlanych (Rycina 19, panel A) wykazała najwyższy wzrost proliferacji komórek w naczyniach Eppendorf, pomimo spadku liczby hAT-MSCs zbieranych z 1cm2 (Rycina 19, panel B). Spadek ten był związany ze stopniowym wzrostem powierzchni komórkowej hAT-MSCs, postepujacej wraz z hodowlą, co stwierdzono podczas obserwacji mikroskopowej hodowli hAT-MSCs. Biorąc zatem pod uwagę porównywalne wyniki z kumulatywnej liczby hAT-MSCs oraz liczbę pozyskanych hAT-MSCs/cm2 dla naczyń hodowlanych Corning Primaria, BD Falcon oraz Eppendorf, zdecydowano o wyborze podłoży hodowlanych produkowanych przez firmę Eppendorf, które dodatkowo posiadały zakrętki wyposażone w wysokiej jakości filtry chroniące przed zanieczyszczeniami np. mykoplazmami [141]. Na wyselekcjonowanych naczyniach hodowlanych z firmy Eppendorf przeprowadzono dodatkową weryfikację kumulatywnej liczby komórek zebranych z naczyń hodowlanych (dane liczbowe zamieszczono na Rycinie 19, panel C) oraz liczby komórek uzyskiwanych z 1 cm2 powierzchni hodowlanej kolejno na pasażach 1-3 (odpowiednio: 5,9x104 ± 0,3 x104 hAT-MSCs/cm2, 5,9x104 0,6 x104 hAT-MSCs/cm2, 5,0x104 ± 0,8 x104 hAT-MSCs/cm2) (Rycina 19, panel D). Zaobserwowano istotny statystycznie wzrost kumulatywnej liczby komórek pomiędzy pasażami nr 1 i 2 , nr 1 i 3 oraz pasażami nr 2 i 3, przy jedoczesnym spadku liczby komórek pozyskiwanym z 1 cm2 powierzchni hodowlanej (Rycina 19, panel D), co może wynikać ze zwiększania się powierzchni komórek w miarę postępu hodowli. Rycina 19. Optymalizacja protokołu hodowli hAT-MSCs in vitro – wybór naczyń hodowlanych. W skrócie, hAT-MSCs izolowano z użyciem roztworu kolagenazy NB6 GMP Grade (Serva Electrophoresis; Nordmark Biochemicals) o aktywności enzymatycznej wynoszącej 0,2 PZ U/ml. Hodowane w optymalnej pożywce (αMEM z 10%hPL; Macopharma)) hAT-MSCs wysiewano na pięć testowanych naczyń hodowlanych: TPP, Corning, Corning Primaria, BD Falcon oraz Eppendorf. A. Analiza wpływu testowanych butelek hodowlanych na proliferację komórek, którą przedstawiono jako kumulatywna liczba hAT-MSCs zebranych ze wszystkich naczyń hodowlanych zliczaną podczas trzech kolejnych pasaży (P) komórek (oznaczonych jako P.1, P.2, P.3). Pasaż komórek wykonywano przy konfluencji 70-80%. Komórki zliczano przy użyciu licznika ScepterTM 2.0 Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; *p<0,05, **p<0,01; (test t-studenta); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). B. Wydajność hodowli hAT-MSCs na wybranych naczyniach hodowlanych. Wydajność hodowli przedstawiono jako liczbę hAT-MSCs otrzymanych z 1cm2 powierzchni hodowlanej pięciu różnych naczyń hodowlanych (TPP, Corning, Corning Primaria, BD Falcon, Eppendorf) dla trzech kolejnych pasaży, Pasaż komórek wykonywano przy konfluencji 70-80%. Komórki zliczano przy użyciu licznika ScepterTM 2.0 Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *p<0,05; (test t-studenta); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). C. Ocena proliferacji hAT-MSCs na wyselekcjonowanych naczyniach hodowlanych produkowanych przez firmę Eppendorf. Wykres przedstawia kumulatywna liczbę hAT-MSCs zebranych ze wszystkich naczyń hodowlanych zliczaną podczas trzech kolejnych pasaży (P) komórek (oznaczonych jako P.1, P.2, P.3). Pasaż komórek wykonywano przy konfluencji 70-80%. Komórki zliczano przy użyciu licznika ScepterTM 2.0 Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; ***p<0,001; (test t-studenta); N=3. Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców. D. Ocena proliferacji hAT-MSCs na wyselekcjonowanych naczyniach hodowlanych produkowanych przez firmę Eppendorf. Wykres przedstawia liczbę hAT-MSCs otrzymaną z 1cm2 powierzchni hodowlanej dla trzech kolejnych pasaży. Komórki pasażowano, gdy konfluencja hodowli komórkowej wynosiła 70-80%. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; Brak istotnych statystycznie różnic (p>0,05); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). Podsumowując, zastosowanie na etapie izolacji frakcji SVF roztworu kolagenazy NB6 GMP Grade (Serva Electrophoresis; Nordmark Biochemicals) o aktywności enzymatycznej równej 0,2 PZ U/ml, bez dodatkowego etapu lizy RBC, pozwoliło efektywnie wyizolować komórki hAT-MSCs z tkanki tłuszczowej. Co istotne, hAT-MSCs wysiane w dedykowanej pożywce αMEM suplementowanej 10% hPL (Macopharma) na naczynia hodowlane produkowane przez firmę Eppendorf podejmowały aktywność proliferacyjną o powtarzalnym tempie proliferacji podczas kolejnych pasaży (P.1-P.3). Komórki hAT-MSCs wyizolowane oraz namnożone przy użyciu opisanych wystandaryzowanych protokołów, zostały wykorzystane w celu oceny ich właściwości biologicznych w dalszych eksperymentach objętych niniejszą pracą doktorską. 4.2. Ocena właściwości biologicznych hAT-MSCs hodowanych in vitro w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania Ocena potencjału biologicznego określonego rodzaju komórek, które planuje się do zastosowania w określonym wskazaniu medycznym, stanowi podstawę do opracowania tego produktu terapii komórkowej. Ze względu na stosowanie różnych metod izolacji oraz ekspansji komórek hAT-MSCs (np. nieenzymatyczne oraz enzymatyczne trawienie tkanki tłuszczowej, stosowanie różnych pożywek hodowlanych) [142–144] oraz przyjmowanie różnych podejść do charakterystyki i analizy komórek MSCs [145,146], panel badań podejmowanych przez różne grupy badawcze w celu określenia właściwości biologicznych tych komórek różni się pomiędzy laboratoriami [147]. W związku z powyższym, mając na uwadze charakter wdrożeniowy badań wykonywanych w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej ukierunkowanej na opracowywanie produktu ATMP-HE, scharakteryzowano otrzymane hAT-MSCs przyjmując minimalne kryteria identyfikacji MSCs wyznaczone przez Międzynarodowe Towarzystwo ds. Terapii Komórkowej (ISCT) [24]. 4.2.1. Analiza morfologii oraz fenotypu hAT-MSCs W celu oceny morfologii oraz profilu antygenowego, stanowiących jedne z podstawowych kryteriów klasyfikacji komórek jako MSCs, przeprowadzono analizę mikroskopową oraz cytometryczną wyizolowanych komórek adherentnych z tkanki tłuszczowej, zgodnie z kryteriami identyfikacji MSCs opublikowanymi przez ISCT [24]. Analizie zostały poddane hAT-MSCs na wczesnych etapach hodowli (pasaż nr 3-4) otrzymane zgodnie z opracowanymi, zoptymalizowanymi, wewnętrznymi standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP). W tym celu, hAT-MSCs hodowane były w pożywce αMEM suplementowanej 10% hPL dedykowanej do ekspansji komórek na podłożu TCPS (Eppendorf) zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.2.1. Ocena morfologii oraz fenotypu antygenowego hAT-MSCs. W pierwszej kolejności, na podstawie obserwacji mikroskopowej, potwierdzono, że wyizolowane komórki adherentne pozyskane z ludzkiej tkanki tłuszczowej posiadały wydłużoną wrzecionowatą morfologię, przypominającą fibroblasty, natomiast w warunkach hodowli in vitro tworzyły pojedynczą warstwę adherentnych komórek o wysokim potencjale proliferacyjnym (Rycina 20). Taki jednorodny obraz komórek uzyskano po drugim pasażu, podczas gdy na początkowym etapie hodowli obserwowano heterogenną populację komórek, stanowiącą zarówno frakcję komórek adherentnych o różnym fenotypie oraz komórek nieadherentnych. Rycina 20. Morfologia frakcji komórek SVF oraz hAT-MSCs poddanych dalszej ekspansji ex vivo. W skrócie, frakcje SVF izolowano z użyciem roztworu kolagenazy NB6 GMP Grade (Serva Electrophoresis; Nordmark Biochemicals) o aktywności enzymatycznej wynoszącej 0,2 PZ U/ml. Spasażowany i zwirowany pelet komórkowy wysiano na butelki hodowlane (Eppendorf) w pożywce αMEM suplementowanej 10% hPL (Macopharma). Reprezentatywne zdjęcia z dnia 0 wykonano przed pierwszym pasażem, z dnia 6 po drugim pasażu, z kolei zdjęcia z dnia 12 wykonano po czwartym pasażu, przy użyciu mikroskopu Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV, techniką obrazowania w kontraście faz w powiększeniu 100x, skala: 50 μm. Następnie, po wstępnych pasażach hodowli (pasaż nr 3-4), które pozwoliły na uzyskanie żywotnej homogennej populacji hAT-MSCs, komórki poddano ocenie pod względem profilu antygenowego powszechnie stosowanego do potwierdzania tożsamości MSCs przy wykorzystaniu cytometrii przepływowej. W tym celu komórki barwiono immunofluorescencyjnie przeciwciałami skierowanymi przeciwko antygenom obecnym na powierzchni MSCs. Analizę fenotypową przeprowadzono na populacji prawidłowych morfologicznie komórek, po odcięciu artefaktów i fragmentów komórkowych (bramka P1; Rycina 21, panel A). Na podstawie uzyskanych wyników wykazano wysoki odsetek hAT-MSCs pozytywnych pod względem ekspresji markerów komórek mezenchymalnych tj. CD73, CD90 oraz CD105, który wynosił średnio powyżej 94% (Rycina 21, panel A). Negatywne markery powierzchniowe stanowiły antygeny charakterystyczne dla komórek hematopoetycznych, które obejmowały: CD14, CD19, CD34, CD45 oraz antygen zgodności tkankowej klasy II (HLA-DR) (Rycina 21, panel A). Odsetek komórek pozytywnych pod względem ekspresji markerów komórek hematopoetycznych wśród wyizolowanych komórek hAT-MSCs wynosił poniżej 5%, co świadczy o wysokiej czystości uzyskanych frakcji hAT-MSCs już po pasażu nr 3-4. Uzyskane uśrednione wyniki ilościowe, przedstawione na Rycinie 21 (panel B), pozwoliły potwierdzić prawidłowy mezenchymalny fenotyp antygenowy dla ludzkich MSCs zdefiniowany przez ISCT. Rycina 21. Charakterystyka fenotypowa populacji komórek hAT-MSCs wyizolowanych z tkanki tłuszczowej. Po izolacji frakcji SVF, komórki hodowano w pożywce αMEM suplementowanej 10% lizatem płytkowym (Macopharma). Następnie, hAT-MSCs pasażowano (pasaż nr 3 i 4) zwirowano i barwiono immunofluorescencyjnie za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko wybranym pozytywnym (CD 105, CD90, CD73) oraz negatywnym (HLA-DR, CD45, CD34, CD19, CD14) markerom powierzchniowym charakterystycznym dla komórek MSCs. Wybarwione komórki analizowano za pomocą cytometru przepływowego BD LSRFortessa. A. Przykładowy dot-plot obrazujący rozkład komórek pod względem ich ziarnistości (SSC) oraz wielkości (FSC). Komórki znjadujące się w bramce P1 podlegały dalszej analizie fenotypowej. Reprezentatywne histogramy z analizy cytometrycznej profilu wieloantygenowego reprezentatywnej próbki hAT-MSCs z uwzględnieniem wykonanych kontroli izotypowych. B. Analiza ilościowa ekspresji wybranych antygenów powierzchniowych hAT-MSCs. Wykres przedstawia średni odsetek (%) komórek wykazujących ekspresję danego badanego antygenu w całej populacji (identyfikowanej w bramce P1). Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; N=4 (Eksperyment wykonano czterokrotnie na dwóch lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). 4.2.2. Ocena potencjału różnicowania hAT-MSCs in vitro Jedną z kluczowych właściwości biologicznych komórek MSCs jest ich zdolność do różnicowania w kierunku komórek linii mezodermalnej, w tym komórek tkanki tłuszczowej, chrzęstnej i kostnej, co wynika z ich właściwości multipotencjalnych. Dlatego też komórki MSCs są obecnie szeroko badane w aspekcie ich potencjalnego wykorzystania w naprawie tkankowej i medycynie regeneracyjnej, jako preparaty komórkowe [148,149] oraz w inżynierii tkankowej wykorzystującej m.in. podłoża hodowlane do stymulacji kierunkowego różnicowania tych komórek [150–153], szczególnie w kontekście naprawy ubytków chrzęstno-kostnych. Do analizy mulipotencjalnego charakteru hAT-MSCs wykorzystano komórki będące na pasażach nr 3-4, które hodowano w stosownych pożywkach stymulujących proces różnicowania w kierunku adipocytów, chondrocytów lub osteocytów in vitro. W trakcie różnicowania adipogennego obserwowano zmianę morfologii komórek z charakterystycznej dla komórek mezenchymalnych – wydłużonych, wrzecionowatych komórek w komórki o zaokrąglonym kształcie, na komórki zaokrąglone zawierające liczne wakuole lipidowe zlokalizowane w cytoplazmie, które wybarwiły się na czerwono w reakcji z czerwienią oleistą (Rycina 22, panel 1A). Weryfikując zdolność różnicowania hAT-MSCs w kierunku komórek tkanki chrzęstnej obserwowano postępującą w czasie zmianę w morfologii komórek, które tworzyły gwieździście rozchodzące się agregaty/ rozety komórkowe zwane również mikrociałkami lub sferoidami. Błękitem alcjanowym wybarwiono proteoglikany stanowiące główną komponentę ECM tkanki chrzęstnej (Rycina 22, panel 2A). W przypadku różnicowania osteogennego obserwowano mineralizację macierzy zewnątrzkomórkowej w postaci depozytów wapnia o różnym rozkładzie i skupieniu, barwiących się czerwienią alizarynową na kolor czerwony (Rycina 22, panel 3A). Równolegle hAT-MSCs prowadzone w hodowli kontrolnej w pożywce namnażającej, tj. niestymulującej różnicowanie (tj. αMEM z 2% hPL) charakteryzowały się wydłużonym, wrzecionowatym kształtem komórek, o morfologii zbliżonej do fibroblastów oraz nie wybarwiały się stosowanymi barwnikami, co świadczyło o braku spontanicznego procesu różnicowania w takich warunkach (Rycina 22, panel 1B-3B). Rycina 22. Ocena multipotencjalnego potencjału różnicowania hAT-MSCs in vitro. A. hAT-MSCs hodowane w pożywkach różnicujących, a następnie wybarwione w przypadku: (1) różnicowania adipogennego - czerwienią oleistą (Lipid Staining Kit, Sigma Aldrich; Merck Millipore) barwiącą wakuole lipidowe; (2) różnicowania chondrogennego - 1% błękitem alcjanu (Sigma Aldrich) wiążącego kwaśne proteoglikany wchodzące w skład macierzy zewnątrzkomórkowej; (3) różnicowania osteogennego - 2% czerwienią alizarynową (Sigma Aldrich; Merck Millipore) wiążącą polimorficzne odmiany depozytów wapnia. B. Hodowla kontrolna – tj. hAT-MSCs hodowane w pożywce αMEM z 2% hPL (Macopharma) oraz wybarwione odpowiednio w/w barwnikami identyfikacyjnymi. Przykładowe zdjęcia komórek w kontraście faz wykonano za pomocą mikroskopu Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Strzałkami zaznaczono przykładowe obszary różnicowania hAT-MSCs. Skala: 50 μm. Ponadto, biorąc pod uwagę tematykę prowadzonej rozprawy doktorskiej dotyczącej zastosowania MSCs dla potrzeb regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych, badano również wpływ ciśnienia oraz obniżonej podaży tlenu na potencjał chondrogenny hAT-MSCs, co odpowiadałoby warunkom zbliżonym do niszy tkankowej, gdzie te komórki miałyby być docelowo podawane. Dzięki unikatowemu systemowi AVATAR (Xcellbio), przeprowadzono unikatowe badania, których celem było dobór takich parametrów środowiskowych hodowli komórkowej (tj. poziom ciśnienia oraz tlenu), które są zbliżone do warunków panujących w tkance chrzęstnej, w tym w stawach kolanowych. Różnicowanie chondrogenne hAT-MSCs prowadzono zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.2.2. Ocena zdolności różnicowania MSCs w kierunku komórek mezodermy / Różnicowanie w kierunku chondrocytów, przy czym hodowlę hAT-MSCs prowadzono w pożywce stymulującej proces chondrogenezy, równolegle w czterech różnych warunkach hodowli w zależności od ciśnienia otoczenia oraz stężenie tlenu, tj.: (i) 1PSI, 21%O2; (ii) 1PSI, 5%O2; (iii) 2PSI, 5%O2; (iv) 5PSI, 5%O2. Kontrolę stanowiły hAT-MSCs hodowane w pożywce αMEM suplementowanej 2% hPL w warunkach atmosferycznego ciśnienia oraz stężenia tlenu 1PSI, 21%O2. Na podstawie obserwacji mikroskopowej wykazano, że w warunkach zwiększonego ciśnienia (2PSI oraz 5PSI) oraz ograniczonej podaży tlenu (5% O2), hAT-MSCs wysiane w postaci struktur trójwymiarowych tzw. mikrociałek i hodowane w pożywce różnicującej StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit z czasem tworzyły w hodowli coraz większe i bardziej zwarte agregaty komórkowe. Ponadto, hAT-MSCs hodowane w warunkach ciśnienia 2PSI oraz 5PSI najliczniej formowały nowe rozetki komórkowe, które z czasem zaczęły się nawarstwiać się i zwiększać swoją objętość zauważalną podczas obserwacji nie tylko mikroskopowej, ale również makroskopowej w porównaniu do komórek hodowanych standardowej pożywce hodowlanej (αMEM suplementowanej 2% hPL). W przypadku komórek hodowanych w pożywce kontrolnej (tj. αMEM suplementowanej 2% hPL) obserwowano również formowanie się rozetek komórkowych, przy czym ich liczba oraz wielkość była zdecydowanie mniejsza w porównaniu do hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej. Co ciekawe, dla warunków kontrolnych formowanie rozetek komórkowych postępowało zdecydowanie wolniej, co szczególnie było zauważalne dla warunków 5PSI oraz 5%O2, w porównaniu do hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej. Przykładowe zdjęcia z morfologii hodowli komórkowej hAT-MSCs zamieszono na Rycinie 23. Rycina 23. Ocena potencjału chondrogennego hAT-MSCs in vitro - w warunkach obniżonej podaży tlenu oraz podwyższonego ciśnienia zbliżonych do warunków panujące w tkance chrzęstnej. Komórki poddano różnciowaniu w pożywce różnicującej StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific) przez 21 dni w następujących warunkach hodowlanych: (i) 1PSI, 21% O2; (ii) 1PSI, 5%O2; (iii) 2PSI, 5%O2; (iv) 5PSI 5%O2. Kontrolę stanowiły hAT-MSCs hodowane w pożywce αMEM z 2% lizatem płytkowym (Macopharma). Po zakończonym różnicowaniu, utrwalone komórki wybarwiono 1% błękitu alcjanu (Sigma Aldrich; Merck Millipore), który wiąże kwaśne proteoglikany wchodzące w skład macierzy zewnątrzkomórkowej. Przykładowe, reprezentatywne zdjęcia komórek z jednego wybranego eksperymentu w kontraście faz wykonano za pomocą mikroskopu Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Na wybranych zdjęciach strzałkami zaznaczono przykładowe obszary różnicowania hAT-MSCs. Skala: 50 μm. Wyniki z analizy półilościowej przedstawione w Tabeli 16, wykazały, że w warunkach obniżonej podaży tlenu (5% O2) oraz podwyższonego ciśnienia (2PSI oraz 5PSI), a zatem warunkach bliższych tym panujących w tkankach, w hodowli hAT-MSCs prowadzonej w pożywce różnicującej dochodziło do formowania największej liczby agregatów komórkowych, które charakteryzowały się bardziej zwartą budową oraz większymi wymiarami - w porównaniu do hodowli prowadzonej w standardowej pożywce hodowlanej, co mogłoby świadczyć o intensywniej przebiegającym procesie chondrogenezy. W przypadku hodowli hAT-MSCs w pożywce kontrolnej, w warunkach: 1PSI / 21% O2, 1PSI / 5% O2 oraz 2PSI / 5% O2 obserwowano stopniową tendencję do formowania się rozetek komórkowych, przy czym etap ten przebiegał wolniej w porównaniu do hodowli prowadzonej w pożywce różnicującej. Dla warunków 5PSI / 5%O2 dla hodowli kontrolnej obserwowano stopniową kondensację komórek w postaci formowania agregatów komórkowych, przy czym nie obserwowano zwiększania ich gęstości. Tabela 16. Półilościowa analiza różnicowanych chondrogennnie hAT-MSCs in vitro przy użyciu systemu AVATAR. Względna wartość ocenianego parametru: - niska, + średnia, ++ wysoka, +++ bardzo wysoka. Warunki hodowli komórkowej 1PSI / 21% O2 1PSI / 5% O2 2PSI / 5% O2 5PSI / 5% O2 Liczba agregatów komórkowych Kontrola + ++ ++ - Różnicowanie chondrogenne ++ +++ ++++ +++ Gęstość agregatów komórkowych Kontrola + ++ ++ - Różnicowanie chondrogenne ++ +++ ++++ ++++ Podsumowując, otrzymane wyniki z różnicowania hAT-MSCs w kierunku adipocytów, chondroblastów i osteoblastów in vitro, a także badania dotyczące wpływu podwyższonego ciśnienia na potencjał chondrogenny komórek, potwierdziły właściwości multipotencyjne hAT-MSCs. Ponadto, co istotne ze względu na opracowywany produkt ATMP-HE dla zastosowań w ubytkach kostno-chrzęstnych stawów, wykazano, że w przypadku hodowli różnicującej hAT-MSCs w warunkach środowiskowych zbliżonych do warunków oddziałujących chrząstke w tkance, dochodziło do formowania najbardziej zwartych agregatów komórkowych o największej objętości, w porównaniu z kontrolą. Tym samym, obserwowane zmiany w morfologii hAT-MSCs, związane z ich agregacją oraz stopniową kondensacją mogą świadczyć o promującym wpływie podwyższonego ciśnienia oraz obniżonej zawartości tlenu na różnicowanie chondrogenne hAT-MSCs i tym samym mogą wskazywać na potencjał aplikacyjny hAT-MSCs w uszkodzeniach tkanki chrzęstnej. 4.2.3. Analiza profilu sekrecji hAT-MSCs Aktywność wydzielnicza komórek, związana z uwalnianiem do mikrośrodowiska cytokin, czynników wzrostowych oraz chemokin, może stanowić istotny mechanizm regulacji procesów biologicznych obejmujących m.in. procesy zapalne toczące się w określonych tkankach, a także mających istotny wpływ na przebudowę uszkodzonych tkanek, a tym samym może odgrywać istotną rolę w procesach regeneracji i naprawy tkankowej. Ma to szczególne znaczenie w przypadku hAT-MSCs, które stanowią populację MSCs znanych ze swojej szerokiej aktywności wydzielniczej, parakrynnie oddziałującej na komórki w miejscu podania [154]. Cytokiny, czynniki wzrostowe oraz chemokiny, poprzez pośredniczenie w przekazywaniu informacji do komórek o zmianach zachodzących w mikrośrodowisku, mogą regulować m.in. proliferację, różnicowanie komórek akceptorowych oraz stymulować migrację komórek zgodnie z gradientem stężeń wytwarzanych czynników chemotaktycznych (chemokin) [155]. Badanie wykonane w ramach niniejszej pracy doktorskiej miało na celu analizę profilu wydzielniczego hAT-MSCs hodowanych w standardowej pożywce hodowlanej oraz porównanie jej do fibroblastów skórnych (NHDF-Ad), również hodowanych w tej samej pożywce (Rycina 24). Analizę obecności wybranych czynników wykonano w nadsączach z hodowli komórkowej hAT-MSCs, zebranych po osiągnieciu przez komórki konfluencji równej 70-80% oraz po odcięciu tła pochodzącego z pożywki hodowlanej zawierającej w składzie różne cytokiny, chemokiny i czynniki wzrostowe. W przypadku IL-6 wykazano istotnie statystycznie wyższy poziom tego czynnika w nadsączach hodowlanych zebranych znad hAT-MSCs (1049,1±65,3 pg/ml), w porównaniu do fibroblastów skórnych (156,2±22,0 pg/ml) (Rycina 24). Co ciekawe, w przypadku IL-8 wykazano istotnie statystycznie niższy poziom tej cytokiny wydzielonej przez hAT-MSCs w porównaniu do fibroblastów skórnych (Rycina 24). Ponadto, fibroblasty skórne wydzielały ponad 7- krotnie razy więcej w/w cytokiny (1778,0 ±148,3 pg/ml), która bierze udział we włóknieniu tkanki łącznej [155], w porównaniu do hAT-MSCs hodowane w standardowej pożywce hodowlanej (242,2±6,0 pg/ml) (Rycina 24). Z kolei, istotnie niższy poziom chemokiny MCP-1, m.in. aktywującej makrofagi i rekrutującej monocyty podczas uszkodzenia tkanki [156], odnotowano dla NHDF-Ad i był o ponad 3 razy niższy w porównaniu do hAT-MSCs hodowanych w standardowej pożywce hodowlanej (odpowiednio: 1226,1±123,5 pg/ml vs. 3976,1±238,8 pg/ml) (Rycina 24). Co ciekawe, zaobserwowano wysoki poziom czynnika RANTES wydzielanego przez fibroblasty skórne (1604,7±930,1 pg/ml), podczas gdy nie obserwowano wydzielania tego czynnika przez hAT-MSCs. Co istotne, w przypadku obu typów komórek, tj. NHDF-Ad oraz hAT-MSCs hodowanych w w tej samej, standardowej pożywce hodowlanej, nie stwierdzono wydzielania do supernatantów hodowlanych następujących czynników wzrostu: FGF-2, EGF, PDGF-AA, które również badano (poniżej progu detekcji; nie przedstawiono na Rycinie 24). Rycina 24. Aktywność wydzielnicza hAT-MSCs oraz fibroblastów skóry in vitro. Hodowlę komórek hAT-MSCs i NHDF-Ad prowadzono w pożywce na αMEM suplementowany 10% hPL (Macopharma) do momentu osiągnięcia konflunecji ok. 70-80%. Nadsącze z pożywek hodowlanych oraz samą pożywkę (kontola) analizowano z użyciem technologii Luminex, przy wykorzystaniu stacji roboczej Bioplex 200 (Bio-Rad) w celu określenia stężenia następujących analitów: IL-6, IL-8, MCP-1, GCSF, PDGF-AA, VEGF, FGF-2, EGF, RANTES. Stężenie badanych białek przedstawiono w przeliczeniu na 1x106 hAT-MSCs oraz NHDF-Ad, po odjęciu poziomów cytokin w samej pożywce (tło). Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; **p<0,01, ***p<0,001; (test t-studenta); N=3 (Eksperymenty wykonano trzykrotnie w duplikatach dla trzech lipoaspiratów pochodzących od różnych dawców). Niezależnie od opisanego powyżej badania podstawowej aktywności wydzielniczej komórek hodowanych w pożywce standardowej, zapewniającej optymalny wzrost i kondycję hAT-MSCs, przeprowadzono również analizę profilu sekrecji tych komórek po 12 godz. inkubacji w pożywce, która stanowi docelowy nośnik komórek w produkcie ATMP-HE. Pożywka ta zawierała płyn Ringera z mleczanami (ang. Ringer Lactate; Fresenius Kabi) z dodatkiem 2,5% glukozy (Fresenius Kabi) oraz 1% ludzkiej albuminy (CSL Behring). Wyniki z przeprowadzonej analizy potwierdziły, że hAT-MSCs zachowują swoja aktywność wydzielniczą w w/w nośniku i aktywnie wydzielają następujące analizowane cząsteczki: IL-6, IL-8, MCP-1, GCSF, VEGF, RANTES, PDGF-AA, FGF-2, EGF (Rycina 25). Co ciekawe, w powyższych warunkach zaobserwowano wysoki istotny poziom chemokiny RANTES (4588,5±725,2 pg/ml) pdodukowanej przez hAT-MSCs, która wcześniej nie była obserwowana w hodowlach hAT-MSCs w pożywce pełnej (powyżej tła) (Rycina 25), a która pełni rolę chemoatraktanta promującego m.in. rekrutację MSCs do uszkodzonych tkanek [157–159]. Podobnie, jak w przypadku hAT-MSCs namnażanych w pożywce pełnej, zaobserwowano istotnie statystycznie wysoki poziom chemokiny MCP-1 wydzielanej przez komórki w płynie Ringera (2949,9±523,7 pg/ml) (Rycina 25), która m.in. aktywuje makrofagi oraz sprzyja rekrutacji monocytów podczas uszkodzenia tkanki [156]. Zaobserwowano także istotnie statystycznie wysoki poziom cytokiny IL-6 dla obu grup badanych (1438,0±174,5 pg/ml - dla hAT-MSCs w płynie Ringera oraz 1049,1±80,0 pg/ml - dla hAT-MSCs w pożywce αMEM sz 10% hPL), która może brać udział, na wczesnych etapach rozwoju OA, w naprawie chrząstki poprzez min. zmniejszenie wytwarzania IL-8 [160]. Co ważne, wyniki ankiety lekarskiej przeprowadzonej przed pobraniem tkanki tłuszczowej, donoszą o braku występowania chorób przewlekłych u dawców (zgodnie z opisem w Tabeli 6 podrozdziału 3.1.1. Aspirat ludzkiej tkanki tłuszczowej), co potwierdza, że obserwowany profil sekrecji hAT-MSCs nie jest wynikiem toczących się chorób przewlekłych. Rycina 25. Aktywność wydzielnicza hAT-MSCs w warunkach ekspansji oraz nośniku ATMP-HE in vitro. Hodowlę hAT-MSCs (na pasażu nr 3 i 4) prowadzoną w pożywce αMEM suplementowanej 10% hPL (Macopharma) w momencie osiągnięcia konflunecji równej 70-80%, przepłukano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+, a następnie inkubowano odpowiednio w płynie Ringera (słupki granatowe) lub ponownie w pełnej pożywce hodowlanej (słupki niebieskie). Otrzymane pożywki kondycjonowane z hodowli hAT-MSCs oraz same pożywki hodowlane, w których te komórki były wyjściowo inkubowano (kontrole tła) analizowano następnie z użyciem technologii Luminex, przy wykorzystaniu stacji roboczej Bioplex 200 (Bio-Rad) w celu określenia stężenia następujących analitów: IL-6, IL-8, MCP-1, GCSF, PDGF-AA, VEGF, FGF-2, EGF, RANTES. Stężenie badanych analitów przedstawiono w przeliczeniu na aktywność wydzielniczą 1x106 hAT-MSCs, po odjęciu poziomów cytokin w samej pożywce hodowlanej (tło). Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; *p<0,05,**p<0,01; (test t-studenta); N=3 (Eksperymenty wykonano trzykrotnie w duplikatach dla trzech lipoaspiratów pochodzących od różnych dawców). Podsumowując, hAT-MSCs charakteryzują się wysoką aktywnością wydzielniczą, przy czym aktywność ta jest uzależniona od mikrośrodowiska, w tym warunków hodowli, w której te komórki się znajdują. Biorąc pod uwagę, że aktywność parakrynna MSCs stanowi istotny mechanizm regulacji procesów biologicznych obejmujących m.in. procesy zapalne toczące się w określonych tkankach, będące niejednokrotnie jednym z etapów poprzedzających procesy naprawy uszkodzonych tkanek [161], jak również stymulować endogenne komórki w miejscu podania, można przypuszczać, że hAT-MSCs podane w miejsce uszkodzenia tkankowego mogą promować regenerację uszkodzonych tkanek, co stało się podstawą dalszych badań objętych niniejszą pracą doktorską. 4.2.4. Ocena aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs w obecności hSF in vitro Kolejnym etapem badań była analiza aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs w środowisku biochemicznym płynu stawowego, pochodzącego zarówno od zdrowych oraz chorych dawców (z OA), w wybranych stężeniach. Za zdrowego dawcę uznawano pacjenta bez interwencji medycznych oraz chorób współtowarzyszących, o prawidłowym wskaźniku masy ciała mieszczącym się w przedziale 18,5-24,9 (ang. body mass index, BMI) oraz bez rozwiniętej osteoartrozy. Jako chorych pacjentów uznano dawców z rozwiniętą osteoartrozą (stopień III-IV) oraz BMI >24,9 (nadwaga lub I-II stopień otyłości). Dane o zdrowiu pacjenta zostały pozyskane na podstawie przeprowadzonej przez lekarza ankiety oceny stanu zdrowia poprzedzającej pobranie płynu stawowego. Pomiar aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs wykonano zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.2.4. Test chemotaksji hAT-MSCs w gradiencie ludzkiego płynu stawowego (hSF), z zastosowaniem komory Boydena. Badanie to pozwoliło zatem pośrednio określić potencjał migracyjny hAT-MSCs (które stanowią substancję czynną produktu ATMP-HE podawanego w formie iniekcji dostawowej) w obecności hSF pochodzących zarówno od zdrowych, jak i dawców z OA (tzw. dawcy chorzy). Należy również nadmienić, że do tej pory nie odnotowano prac badawczych dotyczących analizy aktywności migracyjnej hAT-MSCs w obecności płynu stawowego pochodzącego zarówno od dawców zdrowych i chorych, obciążonych OA. Wyniki z przeprowadzonej analizy wskazują na wzrost aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs w obecności hSF, w porównaniu do hAT-MSCs umieszczonych w środowisku pożywki kontrolnej (K2), tj. αMEM z dodatkiem 0,5% hPL (Rycina 26). Zaobserwowano ponadto, że aktywność migracyjna hAT-MSCs wzrastała wraz ze wzrostem stężenia hSF pochodzących zarówno od zdrowych, jak i chorych dawców. Co ciekawe, istotnie statystycznie wyższa aktywność chemotaktyczna hAT-MSCs obserwowana była jednakże w przypadku hAT-MSCs migrujących w kierunku pożywki zawierającej hSF pochodzący od dawców chorych z rozwiniętą OA i wynosiła ona odpowiednio: (i) dla 10% hSF w pożywce: 23,8±3,2 liczba migrujących komórek/insert), (ii) dla 25% hSF w pożywce: 30,4±2,6 liczba migrujących komórek/insert) oraz (iii) dla 50% hSF w pożywce: 31,2±5,81 liczba migrujących komórek/insert, w pożywce, w porównaniu z hAT-MSCs inkubowanych z αMEM z 0,5% hPL bez dodatku hSF (K2) (Rycina 26). Ponadto, zaobserwowano najwyższą aktywność chemotaktyczną hAT-MSCs inkubowanych z najwyższymi stężeniem hSF tj. 50% hSF, w porównaniu do K2, które to warunki eksperymentu ze względu na najwyższe stężenie hSF (50%) były najbliższe warunkom panującym w przestrzeni stawowej i tym samym stanowiły najbliższą próbę odtworzenia naturalnej niszy komórkowej w stawie (Rycina 26, panel B). Rycina 26. Analiza aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs poddanych działaniu czynników obecnych w ludzkim płynie stawowym. hAT-MSCs wysiano na inserty komory Boydena z membraną o średnicy porów 8 μm (Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts; Corning) w gęstości 3x104/ insert, a nastepnie komórki inkubowano przez 24 godziny w obecności pożywki αMEM (Macopharma) z dodatkiem odpowiednio: 10%, 25% lub 50% płynu stawowego pochodzącego od zdrowych lub chorych dawców, w przedziale dolnym komory. Jako kontrolę użyto pożywek bez dodatku hSF: i) kontrolę 1 (K1) stanowiły hAT-MSCs inkubowane w pożywce αMEM z dodatkiem 10% hPL, ii) kontrolę 2 (K2) stanowiły hAT-MSCs inkubowane w pożywkce αMEM z dodatkiem 0,5% hPL. Następnie zbadano migrację komórek poprzez utrwalenie i wybarwienie hAT-MSCs roztworem Wrighta Stain Solution (Sigma Aldrich; Merck Millipore) A. Reprezentatywne zdjęcia hAT-MSCs wykazujących aktywność chemotaktyczną wykonano za pomocą mikroskopu kontrastowo-fazowego Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Skala: odpowiednio 20 µm oraz 50 µm. B. Wykres słupkowy przedstawiający liczbę hAT-MSCs wykazujących aktywność chemotaktyczną dla wybranych stężeń płynu stawowego. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001; (test t-studenta); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie, w duplikatach: (i) dla trzech niezależnych dawców hSF z OA i podwyższoną masą ciała oraz (ii) bez zdiagnozowanej OA i o prawidłowej masie ciała). Czerwoną linią oznaczono liczbę migrujących hAT-MSCs inkubowanych w pożywce αMEM z dodatkiem 0,5% hPL, stanowiące kontrolę z niską zawartością hPL (K2). Podsumowując, wyniki z przeprowadzonej analizy wskazują na aktywną migrację hAT-MSCs w kierunku składników molekularnych obecnych w ludzkim płynie stawowym, przy czym aktywność migracyjna uzależniona była zarówno od stężenia hSF, jak i kondycji zdrowotnej dawców. Tym samym wynik ten potwierdza zdolność migracyjną hAT-MSCs, mogącą mieć wpływ na promowanie procesów proregeneracyjnych, w tym zasiedlania niszy komórkowej i integracji komórek z uszkodzoną tkanką chrzęstną in vivo. 4.3. Ocena składu molekularnego hSF Płyn stawowy stanowi od strony molekularnej mieszaninę składników osocza dyfundujących do przestrzeni stawowej oraz składników wytwarzanych w obrębie jamy stawowej przez komórki obecne w tej niszy, z jego głównymi składowymi, jakimi są hialuroniany i lubrycyny [162]. Diagnostyczna ocena hSF związana z m.in. oceną barwy, przejrzystości, lepkości, oznaczeniem elementów morfotycznych, osadów hSF, która ma na celu ocenę zmian zachodzących w jamie stawowej, a co stanowi jedno z kryteriów do rozpoznania choroby zwyrodnieniowej stawów, jest niewystarczająca. Zachodzące zmiany biochemiczne w obrębie płynu stawowego mogą pojawiać się znacznie wcześniej przed wystąpieniem pierwszych objawów OA [163]. Stąd też uznano w trakcie realizacji niniejszego projektu, że istotna byłaby bardziej szczegółowa analiza składu molekularnego hSF, która mogłaby również wskazać na potencjalne składniki mogące mieć wpływ na funkcje hAT-MSCs, które miałyby być docelowo podane do przestrzeni stawowej, jako produkt leczniczy ATMP-HE. W niniejszej pracy analizie poddano płyn stawowy pobrany na drodze artrocentezy, która została wykonana zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.3. Analiza składu wybranych czynników w płynie stawowym. Listę analizowanych hSF, pochodzących zarówno od zdrowych jak i chorych dawców zamieszczono w Tabeli 7 podrozdziału 3.1.2. Aspirat ludzkiego płynu stawowego. W badaniach podjęto próbę oceny zawartości istotnych czynników biorących m.in. udział w regulacji stanu zapalnego, w tym wybranych cytokin i chemokin tj. IFNγ, IL-6, IL-8, IL-10, MCP-1, TNF-α, VEGF, RANTES, a także ustalenia potencjalnych korelacji pomiędzy stężeniem tych czynników w hSF, a występowaniem choroby zwyrodnieniowej stawów. W przeprowadzonych badaniach nie wykazano istotnych statystycznie różnic w składzie molekularnym hSF pomiędzy próbkami płynu stawowego pochodzącego od zdrowych i chorych dawców (z OA), oprócz czynnika wzrostu VEGF biorącego udział w angiogenezie, jak również co istotne w patogenezie OA [164–166]. Dla wspomnianego czynnika wzrostu wykazano istotnie wyższy poziom w przypadku dawców chorych (obarczonych osteoartrozą) w porównaniu z dawcami zdrowymi (o prawidłowym współczynniku BMI oraz bez zdiagnozowanej OA) i wynosił on: ▪ 99,9±13,3 pg/ml – dla dawców zdrowych ▪ 159,8±14,1 pg/ml – dla dawców chorych (Rycina 27). Pomimo braku istotności statystycznej, wyniki z przeprowadzonych badań wskazują na nieco wyższe stężenie badanych czynników w płynach stawowych pochodzących od dawców chorych w porównaniu do dawców zdrowych (Rycina 27). Najwyższe stężenia zarówno w grupie zdrowych, jak i chorych dawców hSF otrzymano dla: i) chemokiny MCP-1, biorącej udział m.in. w procesach rekrutacji makrofagów i monocytów w miejscu uszkodzenia [167,168]), ii) IL-6, cytokiny o opisanych właściwościach zarówno chondroprotekcyjnych, jak i chondrodegeneracyjnych w zależności od sytuacji klinicznej [169–172]. Wartości te wynosiły odpowiednio w przypadku: ▪ MCP-1 - u dawców zdrowych:1019,4±225,2 pg/ml; natomiast w dawców chorych: 1655,8±685,9 pg/ml, ▪ IL-6 - u dawców zdrowych: 98,6±21,7 pg/ml; natomiast w dawców chorych: 195,3±80,4 pg/ml, W przypadku następujących cytokin: i) IFNγ, który indukuje MSCs do wytwarzania bioaktywnych czynników immunosupresyjnych [173,174]), ii) IL-8, biorącej udział w procesach włóknienia tkanki łącznej [155], a także promującej różnicowanie i migrację hBM-MSCs [175] , iii) IL-10, wykazującej właściwości przeciwzapalne [176–178]) oraz iv) TNF-α, cytokiny prozapalnej, która może być także zaangażowana m.in. w degradację macierzy tkanki chrzęstnej [177,179,180]), poziom ich stężenia nie przekraczał wartości 60 pg/ml w przypadku dawców zarówno zdrowych, jak i z OA, co wskazuje raczej na ich niską zawartość w badanych płynach stawowych. Rycina 27. Analiza stężenia składu molekularnego ludzkiego płynu stawowego. hSF pobrano na drodze artrocentezy i analizowano obecność wybranych czynników z użyciem technologii Luminex, przy wykorzystaniu stacji roboczej Bioplex 200 (Bio-Rad). Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; *p<0,05; (test t-studenta); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie, w duplikatach dla trzech różnych płynów stawowych pochodzących od niezależnych dawców). W przeprowadzonych badaniach nie obserwowano znaczących różnic w poziomie badanych cząsteczek pomiędzy dawcami zdrowymi, a chorymi, co może potencjalnie wskazywać na ew. stan zapalny toczący się w obrębie jamy stawowej w obu grupach dawców hSF, pomimo, że dawcy określani jako zdrowi nie byli diagnozowani jako osoby z OA. Ponadto, analizując powyższe wyniki należy zwrócić uwagę na poziom bazalny badanych cząsteczek (tzw. wartości referencyjne) obecnych w płynie stawowym, który jak do tej pory nie został wystandaryzowany, co może być związane z dużą zmiennością osobniczą oraz nielicznymi badaniami zajmującymi się diagnostyką molekularną hSF. Aby ustalić taki poziom należałoby przeprowadzić badania na większej liczbie aspiratów płynu stawowego od całkowicie zdrowych dawców, tj. bez żadnych schorzeń stawu kolanowego, co może być jednak utrudnione ze względów etycznych. Skład molekularny płynu stawowego – obejmujący m.in. wybrane cytokiny, chemokiny oraz czynniki wzrostowe obecne w płynie stawowym, może być uzależniony od wielu czynników, w tym m.in. od patofizjologii tkanki chrzęstnej i mikrośrodowiska tkankowego [181]), a jego skład może być różny w zależności od dawcy (zmienność osobnicza) [182,183]. 4.4. Analiza możliwości wykorzystania hAT-MSCs hodowanych w warunkach Dobrej Praktyki Wytwarzania w inżynierii tkankowej Tworzenie biomateriałów i rusztowań odpowiednich do wspierania wzrostu i różnicowania się komórek, w tym MSCs, w kierunku pożądanego fenotypu, związane jest z ograniczeniami w naśladowaniu in vitro warunków hodowlanych odzwierciedlających warunki panujące w natywnej tkance, które są kluczowe w inicjacji różnych procesów komórkowych, w tym ukierunkowanego różnicowania. Przeprowadzone w niniejszej pracy badania oceny biozgodności (tzw. biotolerancji) biomateriału, czyli oceny, żefektu cytotoksycznego względem badanych komórek [184,185], miały na celu wstępne określenie możliwego potencjału aplikacyjnego wybranych podłoży grafenowych - zbudowanych z warstw natywnego tlenku grafenu o dwóch źródłach pochodzenia (tj. GO ITME i GO Graphenea) oraz GO zmodyfikowanego poprzez biofunkcjonalizację jonami złota (GO ITME+Au i GO Graphenea+Au), w kontekście ich połączenia z hAT-MSCs w celu promowania procesów regeneracji w uszkodzonej tkance chrzęstno-kostnej. Spis użytych podłoży znajduje się w Tabeli 8 podrozdziału 3.1.3. Przygotowanie podłoży pokrytych tlenkiem grafenu. 4.4.1. Analiza morfologii oraz fenotypu hAT-MSCs hodowanych na natywnych oraz modyfikowanych podłożach grafenowych in vitro Charakterystyka morfologii oraz profilu antygenowego komórek jest jednym z podstawowych i wskaźników stanu fizjologicznego komórek [186], która pozwala m.in. wstępnie ocenić wpływ środowiska na podstawowe cechy badanych komórek. W celu oceny morfologii hAT-MSCs hodowanych na wybranych podłożach grafenowych, w pierwszej kolejności przeprowadzono analizę mikroskopową fenotypu tych komórek z użyciem mikroskopu kontrastowo-fazowego, której wyniki przedstawiono na Rycinie 28. W trakcie hodowli hAT-MSCs na podłożach grafenowych zaobserwowano różnice w morfologii komórek względem komórek hodowanych na podłożu kontrolnym (TCPS). Komórki hodowane na podłożach grafenowych charakteryzowały się niższą konfluencją, jak również tworzyły liczne sferyczne agregaty komórkowe tzw. mikrociałka, w porównaniu do komórek hodowanych na podłożu kontrolnym (TCPS), na którym dominowała populacja komórek o wydłużonym wrzecionowatym kształcie oraz tendencji do tworzenia monowarstwy (Rycina 28, panel A), co mogło sugerować m.in. wpływ badanych podłoży na proliferację hAT- MSCs (dane liczbowe opisano w podrozdziale 4.4.2. Ocena wpływu natywnych i modyfikowanych podłoży grafenowych na proliferację i żywotność hAT-MSCs in vitro). Komórki hAT-MSCs wysiane na podłoża grafenowe stopniowo zmieniały także swoją morfologię w czasie trwania hodowli, zwiększając swoją ziarnistość oraz rozmiary w porównaniu do komórek hodowanych na podłożu kontrolnym (TCPS) (Rycina 28, panel B). Dodatkowo, analiza cytometryczna wykazała, że hAT-MSCs hodowane na podłożach pokrytych natywnym GO tworzyły bardziej zwartą populację komórek o niższych wartościach parametrów SSC i FSC oznaczonych w cytometrii przepływowej (co odpowiada mniejszym komórkom o niższej ziarnistości) niż te komórki, które hodowano na podłożach GO modyfikowanych jonami Au, dla których obserwowano wyższe wartości parametrów SSC i FSC (co odpowiada większym komórkom o wyższej ziarnistości) (Rycina 28, panel B). Zaobserwowane różnice mogą mieć związek z wychwytywaniem cząstek złota na drodze endocytozy [187]. Co ciekawe, hAT-MSCs hodowane na podłożach pokrytych warstwą natywnego i modyfikowanego GO tworzyły skupiska w postaci mniej lub bardziej zwartych agregatów, które mogą potencjalnie świadczyć o indukcji procesu różnicowania hAT-MSCs pod wpływem badanego biomateriału, ponieważ są to struktury często charakterystyczne przy różnicowaniu MSCs w kierunku chondrocytów in vitro [188,189]. Niemniej jednak, może to być również związane z hydrofobowymi właściwościami zawiesin GO i agregacją płatków grafenowych [190], co mogło potencjalnie wpływać na nierównomierne pokrycie naczyń hodowlanych badanym biomateriałem. Ponadto, obserwacja długoterminowej hodowli hAT-MSCs (szczegóły z obserwacji morfologicznej dla hodowli długoterminowej opisano w podrozdziale 4.4.3. Ocena wpływu natywnych i modyfikowanych podłoży grafenowych na indukcję procesów chondrogenezy oraz osteogenezy hAT-MSCs in vitro) wykazała zwiększoną tendencję hAT-MSCs do adhezji do podłoży grafenowych, kondensacji oraz zwiększania objętości agregatów komórkowych, co także może świadczyć o indukcji kierunkowego różnicowania hAT-MSCs pod wpływem kompozytów grafenowych, pomimo hodowli w pożywce kontrolnej dedykowanej do ekspansji komórek (zdjęcia z obserwacji morfologicznej dla hodowli długoterminowej zamieszczono w podrozdziale 4.4.3. Ocena wpływu natywnych i modyfikowanych podłoży grafenowych na indukcję procesów chondrogenezy oraz osteogenezy hAT-MSCs in vitro). Zatem wpływ podłoży grafenowych na funkcje hAT-MSCs wspomniane wcześniej, w tym proliferację, potencjał różnicowania, postanowiono zbadać w dalszej części pracy. Prowadząc jednak pogłębioną analizę morfologiczna hodowanych komórek i porównując morfologię hAT-MSCs różnicowanych w kierunku komórek tkanki chrzęstnej na podłożu kontrolnym TCPS z wyglądem hAT-MSCs hodowanych na podłożach pokrytych GO w standardowej pożywce hodowlanej (Rycina 28, panel A), na podstawie obserwacji mikroskopowej oraz biorąc pod uwagę podobieństwo w morfologii hAT-MSCs (tj. tworzenie samoorganizujących się skupisk/agregatów komórek) można przypuszczać, że dochodziło do możliwej indukcji spontanicznego różnicowania chondrogennego w hAT-MSCs hodowanych na podłożach pokrytych GO w standardowej pożywce hodowlanej in vitro. Może to sugerować prochondrogenne działanie samego podłoża pokrytego związkami GO w hAT-MSCs. Nie mniej jednak należy zaznaczyć, że wniosek ten opiera się tylko i wyłącznie na obserwacji mikroskopowej i wymaga potwierdzenia wykonując dalsze analizy w kierunku oceny różnicowania komórek, co przedstawiono w dalszych podrozdziałach niniejszej pracy doktorskiej. Rycina 28. Analiza morfologiczna hAT-MSCs hodowanych na podłożach natywnych oraz modyfikowanych tlenkiem grafenu in vitro. Podłoża hodowlane przygotowano poprzez wylanie zawiesin płatków GO w celu uzyskania warstwy pokrycia powierzchni wynoszącej 10 µg/cm2. hAT-MSCs hodowano przez 72godz. w pożywce αMEM suplementowanej 10% lizatem płytkowym (Macopharma) na podłożach GO natywnych (GO ITME oraz GO Graphenea) oraz modyfikowanych podłożach grafenowych (GO ITME+Au oraz GO Graphenea+Au). Kontrolę stanowiły komórki hodowane na TCPS (podłoże niepokryte GO) A. Reprezentatywne zdjęcia morfologii hAT-MSCs po 72 godz. hodowli. Czerwonymi strzałkami zaznaczono pojawiające się agregaty komórek. Skala: 50 µm. B. Reprezentatywne wykresy (typu dot-plot) z analizy cytometrycznej hAT-MSCs hodowanych na podłożu kontrolnym (TCPS) oraz na badanych podłożach grafenowych, obrazujące rozkład komórek pod względem ich morfologii, tj. względnej wielkości (FSC) oraz ziarnistości (SSC). W następnym etapie, porównano zatem profil ekspresji wybranych antygenów powierzchniowych hAT-MSCs hodowanych na podłożu kontrolnym (TCPS) oraz na podłożach pokrytych natywnym i modyfikowanym GO. Wykonana analiza cytometryczna obejmowała wybrane markery powierzchniowe powszechnie wykorzystywane do oceny tożsamości MSCs, jako markery występujące na tych komórkach (pozytywne), w tym CD73, CD90, CD105. Wykazano wysoką ekspresję pozytywnych markerów powierzchniowych MSCs, wynoszącą średnio 98,2±2,5% oraz 99,8±0,1%, odpowiednio dla antygenów CD73 oraz CD90, a także 90,0±8,3% dla antygenu CD105 na powierzchni hAT-MSCs hodowanych na podłożach pokrytych GO i modyfikowanym GO, a także podłożach kontrolnych (TCPS), co świadczy o braku istotnego wpływu podłoży grafenowych na profil antygenowych hAT-MSCs. Wyniki z przeprowadzonych analiz komórek na podłożach GO przedstawiono na Rycinie 29. Rycina 29. Analiza fenotypowa hAT-MSCs hodowanych na podłożach natywnych oraz modyfikowanych tlenkiem grafenu. Podłoża hodowlane przygotowano poprzez wylanie zawiesin płatków GO w celu uzyskania warstwy pokrycia powierzchni wynoszącej 10 µg/cm2. hAT-MSCs hodowano przez 72 godz. w pożywce αMEM suplementowanej 10% lizatem płytkowym (Macopharma) na wybranych natywnych i modyfikowanych podłożach pokrytych GO. Kontrolę stanowiły komórki hodowane na TCPS (podłoże niepokryte GO). W celu oceny profilu antygenowego hAT-MSCs, po pasażu komórki barwiono immunofluorescencyjnie za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko wybranym markerom pozytywnym MSCs (CD 73, CD90, CD105). Wybarwione komórki analizowano za pomocą cytometru przepływowego BD LSRFortessa. A. Analiza ilościowa wpływu zastosowanych podłoży GO na ekspresję wybranych antygenów powierzchniowych hAT-MSCs w trakcie ekspansji ex vivo przedstawiona w postaci reprezentatywnych histogramów z jednego eksperymentu wykonanego z zastosowaniem cytometrii przepływowej. B. Wykres przedstawiający średni odsetek hAT-MSCs wykazujących ekspresję wybranego markera w hodowli na różnych podłożach GO oraz na TCPS. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; N=4 (Eksperyment wykonano czterokrotnie na dwóch lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). Podsumowując, wyniki z przeprowadzonych obserwacji wykazały, że hAT-MSCs hodowane na wybranych podłożach grafenowych nie tworzą równomiernej monowarstwy, którą można było zaobserwować w przypadku hodowli na podłożu kontrolnym (TCPS) w hodowlach in vitro. W przypadku hAT-MSCs hodowanych na badanych podłożach opartych o GO obserwowano obszary o wyższej oraz niższej gęstości komórek, co może być związane z nierównomiernym rozkładem płatków grafenowych na podłożu. Co ważniejsze, hAT-MSCs hodowane na podłożach pokrytych GO tworzyły skupiska, które są charakterystyczne dla komórek różnicowanych w kierunku chondrocytów w warunkach in vitro. Uzyskane wyniki mogą zatem sugerować, że podłoża grafenowe potencjalnie stymulują agregację hAT-MSCs lub indukują ich różnicowanie w warunkach in vitro. Ponadto, analiza cytometryczna wykazała utrzymywanie się ekspresji markerów charakterystycznych dla MSCs na powierzchni hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych, co sugeruje brak wpływu (szczególnie niekorzystnego) tych podłoży na profil antygenowy hAT-MSCs. Stanowiło to istotny punkt do dalszych badań podjętych w celu potencjalnego zidentyfikowania najbardziej optymalnego podłoża grafenowego do indukcji chondrogenezy w hAT-MSCs hodowanych in vitro, spośród badanych podłoży opartych o GO. 4.4.2. Ocena wpływu natywnych i modyfikowanych podłoży grafenowych na proliferację i żywotność hAT-MSCs in vitro Utrata żywotności komórek jest jednym z podstawowych objawów potencjalnego wpływu środowiska na komórki, w tym biomateriałów, które nie wykazują właściwej biozgodności. Do śmierci komórki na skutek cytotoksycznego działania środowiska może dochodzić nie tylko na drodze nekrozy, ale także mniej spektakularnie i gwałtownie postępującej śmierci komórki, tj. na drodze apoptozy [191]. Indukcja procesu apoptozy prowadzi do szeregu zmian strukturalnych w obrębie komórek, obejmujących m.in. utratę integralności błony komórkowej, kondensację cytoplazmy oraz fragmentację jądra komórkowego [191,192]. Jedną z najbardziej charakterystycznych i wczesnych zmian apoptotycznych jest stopniowa utrata integralności i asymetryczności błony komórkowej, w trakcie której dochodzi do zmian w lokalizacji fosfolipidów błonowych, w tym do ekspozycji fosfatydyloseryny (ang. phospatidylserine; PS), będącej składnikiem wewnętrznej warstwy plazmalemmy, na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej [192]. W celu określenia potencjalnej cytotoksyczności badanych podłoży grafenowych względem hAT-MSCs, a przez to również zbadanie biotolerancji badanych biomateriałów, definiowanej, jako zgodność biologiczna [184,185], przeprowadzono analizę cytometryczną żywotności komórek badając zarówno proces nekrozy, jak i apoptozy w komórkach hodowanych na badanych podłożach GO. Poprzez zastosowanie podwójnego barwienia komórek za pomocą barwnika 7-AAD (barwiącego jądra komórkowe tylko martwych komórek tj. komórek nekrotycznych oraz późnoapoptotycznych, które utraciły już integralność i nieprzepuszczalność błony komórkowej) oraz aneksyny V sprzężonej z FITC (wiążącej się do PS obecnej na powierzchni zarówno komórek wczesnoapoptoycznych oraz późnoapoptotycznych), przeprowadzono ocenę odsetka komórek: (i) żywych (Aneksyna V FITC–/7-AAD–); (ii) wczesnoapoptotycznych (Aneksyna V FITC+/7-AAD–); (iii) późnoapoptotycznych (Aneksyna V FITC+/7-AAD+); oraz (iv) nekrotycznych (Aneksyna V FITC–/7-AAD+) w hodowli in vitro (Rycina 30). Uzyskane wyniki wskazują na różny wpływ badanych podłoży grafenowych na żywotność hAT-MSCs po 72 godz. hodowli, w porównaniu z komórkami hodowanymi na podłożu kontrolnym (TCPS) (Rycina 30). Dla większości badanych warunków, żywotność hAT-MSCs hodowanych na wybranych podłożach była zbliżona do warunków kontrolnych (TCPS). Jednakże w przypadku hAT-MSCs hodowanych na podłożu GO ITME+Au zaobserwowano niższą żywotność (88,8±5,2%), w porównaniu do hAT-MSCs hodowanych w warunkach kontrolnych, tj. na TCPS (96,2±1,5%). Podobnie, istotnie statystycznie obniżoną żywotność zaobserwowano dla drugiego z podłoży modyfikowanych jonami Au (91,6±1,7%) w porównaniu z kontrolą. Dla pozostałych badanych podłoży grafenowych żywotność hAT-MSCs wynosiła powyżej 92%, podobnie jak w kontroli (Rycina 30, panel B). Rycina 30. Analiza żywotności hAT-MSCs na podłożach opartych o tlenek grafenu. Podłoża hodowlane przygotowano poprzez wylewanie zawiesin płatków GO dla warstwy pokrycia powierzchni wynoszącej 10 µg/cm2. Kontrolę stanowiły komórki hodowane na podłożu kontrolnym (TCPS). A. Reprezentatywne wykresy kropkowe (typu dot-plot) z wybranego eksperymentu, przedstwiające rozkład hAT-MSCs hodowanych na podłożu kontrolnym (TCPS) oraz na badanych podłożach grafenowych, obrazujące następujące subpopulacje komórek: Q1 – nekrotyczne; Q2 – późnoapoptotyczne; Q3 – żywe; Q4 – wczesnoapoptotyczne. B. Wykres odsetka komórek żywych, wczesnoapoptotycznych oraz komórek martwych tj. komórek późnoapoptotycznych oraz nekrotycznych w populacji hAT-MSCs hodowanych na róznych podłożach. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; *p<0,05, **p<0,01; (test t-studenta); N=4 (Eksperyment wykonano czterokrotnie na dwóch lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). Przeprowadzona jednocześnie analiza tempa proliferacji hAT-MSCs hodowanych na wybranych podłożach grafenowych, wykazała spadek liczby komórek hodowanych na wszystkich badanych podłożach grafenowych w porównaniu do komórek kontrolnych na TCPS (Rycina 31). Dla podłoży GO ITME+Au wykazano najniższe tempo proliferacji hAT-MSCs względem warunków kontrolnych (tj. hodowli na TCPS, wyrażonej jako 100%), które wynosiło 64,2±23,6%. Porównywalne, istotnie statystycznie obniżone tempo proliferacji wykazano dla podłoża GO Graphenea (67,5±3,3%), względem TCPS (Rycina 31). Z kolei dla podłoża GO ITME oraz GO Graphenea+Au tempo proliferacji hAT-MSCs było najbliższe warunkom kontrolnym i wynosiło odpowiednio: 86,5±7,4% dla podłoża GO ITME, 82,5±23,2% dla podłoża GO Graphenea+Au (Rycina 31). Rycina 31. Analiza tempa proliferacji hAT-MSCs na podłożach opartych o tlenek grafenu in vitro. Podłoża hodowlane przygotowano poprzez wylanie zawiesin płatków GO na powierzchnię hodowlaną w celu uzyskania warstwy pokrycia powierzchni wynoszącej 10 µg/cm2. Kontrolę stanowiła wyjściowa liczba komórek wysiana na podłoże kontrolne (TCPS). Komórki zliczno przy użyciu licznika komórek ScepterTM 2.0 (Merck Millipore) z wykorzystaniem dedykowanych sensorów 60µm (Scepter Cell Counter Sensors; Merck Millipore). Otrzymane wartości przedstawiono jako procent kontroli. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; ***p<0,0001; (test t-studenta); N=4 (Eksperyment wykonano czterokrotnie na dwóch lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). Podsumowując, w tej części badań wykazano względnie wysoką żywotność hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych, pomimo istotnego statystycznie obniżenia żywotności na podłożu GO Graphenea modyfikowanego jonami złota, względem warunków kontrolnych, i tym samym nie wykazano istotnego efektu cytotoksycznego w/w podłoży grafenowych względem hAT-MSCs, który mógłby uniemożliwić wykorzystanie tych podłoży do namnażania hAT-MSCs i dalszych zastosowań. Obniżona aktywność proliferacyjna hAT-MSCs oraz wcześniej uzyskane wyniki z badań morfologii tych komórek hodowanych na podłożach grafenowych (w tym odnośnie tworzenia się skupisk komórek), mogą świadczyć o potencjalnej indukcji różnicowania chondrogennego tych komórek, na co wskazują liczne przesłanki literaturowe [193,194] i co zbadano także w dalszej części pracy. 4.4.3. Ocena wpływu natywnych i modyfikowanych podłoży grafenowych na indukcję procesów chondrogenezy oraz osteogenezy hAT-MSCs in vitro Podejmowane w ostatnim czasie badania naukowe mają na celu zwiększenie skuteczności terapii komórkowej poprzez wspieranie m.in. procesów zasiedlania oraz ukierunkowanego różnicowania komórek w miejscu przeszczepienia [195–197]. Jednym ze stosowanych podejść umożliwiających różnicowanie komórek macierzystych w określony fenotyp komórek dojrzałych danej tkanki, może być zastosowanie biomateriałów jako podłoży, które poprzez swoją mikrostrukturę mogą wpływać na fenotyp zasiedlających je komórek oraz służyć jako swoiste rusztowania wspierające procesy naprawy i regeneracji powstałych uszkodzeń tkankowych [198]. Biorąc pod uwagę nieliczne doniesienia publikacyjne dotyczące możliwości zastosowania tlenku grafenu, jako podłoża do różnicowania chondrogennego [88,199,200], podjęto próbę oceny wpływu badanych podłoży grafenowych na procesy różnicowania chondrogennego oraz osteogennego hAT-MSCs w warunkach in vitro [150]. W tym celu, różnicowanie komórek prowadzono na podłożach grafenowych zarówno w standardowej pożywce hodowlanej (αMEM suplementowanej 2%hPL) dedykowanej do ekspansji komórek (kontrola) oraz w odpowiednich komercyjnie dostępnych pożywkach stymulujących chondrogenezę lub osteogenezę in vitro. Proces różnicowania prowadzono przez 21dni, monitorując postęp procesów różnicowania w dniach 3, 7, 14 i 21. Wyniki badań odnośnie zmian fenotypowych komórek hAT-MSCs oceniano przy użyciu mikroskopu świetlnego z kontrastem faz, po wcześniejszym wybarwieniu różnicujących komórek barwnikami identyfikującymi związki typowe dla komórek danej tkanki (Rycina 32). Na podstawie obserwacji mikroskopowej różnicujących hAT-MSCs, utrwalonych i wybarwionych błękitem alcjanu, wykazano tworzenie się depozytów proteoglikanów charakterystycznych dla różnicowania chondrogennego (wybarwionych na niebiesko), odpowiadających w obrazie mikroskopowym formowaniu się mniej lub bardziej zwartych agregatów komórkowych (Rycina 32, panel A). Takie skupiska wybarwionych na niebiesko hAT-MSCs obserwowano już w 7 dniu hodowli w pożywce różnicującej (StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit). Najliczniej występujące agregaty komórek obserwowano w przypadku różnicowania hAT-MSCs na podłożach pokrytych GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au (Rycina 32, panel A). Ponadto, dla wszystkich badanych warunków, w kolejnych punktach czasowych tj. dniu 14 i 21, w obserwacji mikroskopowej obserwowano wzrost zagęszczenia utworzonych uprzednio agregatów komórkowych w hodowlach w pożywce różnicującej (Rycina 32, panel A). W przypadku warunków kontrolnych, kiedy hAT-MSCs hodowane były w pożywce hodowlanej αMEM z dodatkiem 2% hPL bez dodatku żadnych czynników różnicujących, tworzenie skupisk komórkowych można było zaobserwować na podłożu TCPS w dniu 14 i 21 (Rycina 32, panel B). W przypadku podłoża GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au, komórki hodowane w standardowej pożywce hodowlanej wykazywały także tendencję do nawarstwiania się i stopniowej kondensacji, jednak zmiana ta zaczynała być widoczna dopiero od dnia 21 różnicowania (Rycina 32, panel B). W przypadku różnicowania osteogennego hAT-MSCs, różnicujące komórki zostały wybarwione czerwienią alizarynową w różnych punktach czasowych (w 3, 7, 14 i 21 dniu różnicowania) w celu wizualizacji zachodzącego w nich procesu mineralizacji macierzy kostnej, charakterystycznego dla tego typu procesu (Rycina 32, panel C). Różnicujące komórki identyfikowano na podstawie wybarwionych na czerwono depozytów wapniowych. Dla wszystkich badanych podłoży, tj. podłoża kontrolnego TCPS oraz podłoży grafenowych, na których hodowano hAT-MSCs w pożywce promującej osteogenezę (StemPro Osteogenesis Differentiation Kit), znaczną mineralizację można było zaobserwować po 21 dniach różnicowania (Rycina 32, panel C). Najliczniejsze wybarwione na czerwono depozyty wapnia stwierdzono w przypadku hodowli hAT-MSCs prowadzonej na podłożach GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au, co oceniano półilościowo na podstawie dokumentacji zdjęciowej. Nieco mniej liczne depozyty wapnia obserwowano dla komórek hodowanych na podłożach GO ITME oraz GO ITME+Au. Dla hAT-MSCs hodowanych w pożywce kontrolnej, czyli bez dodatku czynników różnicujących, nie zaobserwowano gromadzenia się złogów wapnia w trakcie trwania hodowli, na żadnym z badanych podłoży hodowlanych, w tym podłoża kontrolnego TCPS (Rycina 32, panel D). Rycina 32. Analiza morfologiczna różnicowania chondrogennego oraz osteogennego hAT-MSCs na różnych podłożach in vitro. hAT-MSCs (na pasażu nr 3-4) wysiano na płytki 12-dołkowe pokryte odpowiednim podłożem grafenowym lub zawierające podłoże kontrolne (TCPS), w gęstości 3,5x104 komórek/cm2. Komórki inkubowano w pożywce αMEM z dodatkiem 2% hPL (Macopharma) przez 6 godz., celem umożliwienia adhezji komórek do podłoży, po czym zmieniono pożywkę na odpowednią pożywkę różnicującą: odpowiednio StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit lub StemPro Osteogenesis Differentiation Kit. Kontrolę stanowiły komórki hodowane na róznych podłożach w pożywce αMEM z dodatkiem 2% hPL (Macopharma), tj. bez obecności czynników stymulujących różnicowanie. Na panelach przedstawiono reprezentatywne zdjęcia pochodzące z jednego wyranego eksperymentu; N=3 (Eksperyment powtórzony 3-krotnie na różnych lipoaspiratach). A. Ocena procesu chondrogenezy w pożywce różnicującej. W dniach: 3, 7, 14 oraz 21 trwania hodowli w pożywce indukującej proces chondrogenezy komórki zostały utrwalone, a następnie wybarwione 1% roztworem błękitu alcjanu (Merck) wiążącego kwaśne proteoglikany tkanki chęstnej. B. Ocena procesu chondrogenezy w pożywce kontrolnej. W dniach: 3, 7, 14 oraz 21 trwania hodowli w pożywce kontrolnej – tj. αMEM z dodatkiem 2% hPL (Macopharma), komórki zostały utrwalone, a następnie wybarwione jw. błękitem alcjanu. C. Ocena procesu osteogenezy w pożywce różnicującej. W dniach: 3, 7, 14 oraz 21 trwania hodowli w pożywce indukującej proces osteogenezy, komórki zostały utrwalone, a następnie wybarwione 2% roztworem czerwieni alizarynowej (Sigma Aldrich; Merck Millipore), wiążącej depozyty wapnia w tkance kostnej. D. Ocena procesu osteogenezy w pożywce kontrolnej. W dniach: 3, 7, 14 oraz 21 trwania hodowli w pożywce kontrolnej - αMEM z dodatkiem 2% hPL (Macopharma), komórki zostały utrwalone, a następnie wybarwione jw. czerwienią alizarynową. Zdjęcia komórek techniką mikroskopową z kontrastem faz wykonano za pomocą mikroskopu Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. Skala: 50 μm. Dodatkowo przeprowadzona analiza półilościowa przebiegu procesu różnicowania chondrogennego hAT-MSCs na badanych podłożach grafenowych (Tabela 17), wykonana na podstawie dokumentacji zdjęciowej z analizy mikroskopowej, uwzględniająca liczbę agregatów komórkowych oraz ich gęstość na badanych podłożach grafenowych (formujących się od 7 dnia eksperymentu), wskazała m.in., że na podłożach GO Grapehenea oraz GO Graphenea+Au gęstość agregatów komórkowych wybarwionych błękitem alcjanu była względnie najwyższa, z kolei nieznacznie wyższą liczbę agregatów komórkowych/ mikrociałek obserwowano dla podłoży GO ITME oraz GO ITME+Au, w porównaniu do podłoża kontrolnego (TCPS). W przypadku hAT-MSCs hodowanych w pożywce kontrolnej (αMEM z dodatkiem 2% hPL) w ostatnim dniu eksperymentu (21d) obserwowano stopniową kondensację komórek hodowanych na badanych podłożach grafenowych, co szczególnie było widoczne dla podłoży GO Grapehenea oraz GO Graphenea+Au (Tabela 17). Obserwacja ta może sugerować możliwą indukcję różnicowania chondrogennego hAT-MSCs przez badane podłoża grafenowe, w szczególności GO Grapehenea oraz GO Graphenea+Au, kiedy komórki te hodowane są w pożywce pozbawionej czynników różnicujących (Tabela 17). Tabela 17. Półilościowa analiza różnicowania chondrogennego hAT-MSCs na podłożach grafenowych in vitro. Względna wartość ocenianego parametru: - niska, + średnia, ++ wysoka, +++ bardzo wysoka. Warunki hodowli komórkowej TCPS GO ITME GO ITME+Au GO Graphenea GO Graphenea+Au Liczba agregatów komórkowych Kontrola - - - + + Różnicowanie chondrogenne + +++ +++ ++ +++ Gęstość agregatów komórkowych Kontrola - - - + + Różnicowanie chondrogenne + ++ ++ +++ +++ W przypadku analogicznej analizy półilościowej oceniającej przebieg procesu różnicowania osteogennego w hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych in vitro (Tabela 18), w ostatnim dniu eksperymentu (21d) obserwowano wybarwione na czerwono złogi wapnia tylko w przypadku hodowli komórek w pożywce różnicującej, czego nie obserwowano dla hodowli hAT-MSCs prowadzonych w pożywce kontrolnej (αMEM z 2% hPL). Dla podłoży grafenowych, najwyższy stopień pokrycia powierzchni hodowlanej przez złogi wapniowe oraz ich gęstość obserwowano dla podłoży GO Grapehenea oraz GO Graphenea+Au (Tabela 18). Tabela 18. Półilościowa analiza różnicowania osteogennego hAT-MSCs na podłożach grafenowych in vitro. Względna wartość ocenianego parametru: - niska, + średnia, ++ wysoka, +++ bardzo wysoka. Warunki hodowli komórkowej TCPS GO ITME GO ITME+Au GO Graphenea GO Graphenea+Au Stopień pokrycia powierzchni hodowlanej złogami wapniowymi Kontrola - - - - - Różnicowanie osteogenne +++ ++ ++ +++ +++ Gęstość złogów wapniowych Kontrola - - - - - Różnicowanie osteogenne +++ ++ + +++ +++ Podsumowując, wykonana analiza różnicowania hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej na podłożach opartych o tlenek grafenu wykazała: (i) w przypadku różnicowania chondrogennego: widoczny proces różnicowania na wszystkich podłożach w pożywce różnicującej oraz niewielką stymulacje tego procesu przez same podłoża GO (GO Grapehenea i GO Graphenea+Au) w pożywce kontrolnej, co może sugerować ich działanie prochondrogenne oraz (ii) w przypadku różnicowania osteogennego: obecność osteoblastów wykazujących produkcję złogów wapnia w dniu 21 różnicowania na wszystkich badanych podłożach w pożywce różnicującej, czego nie odnotowano dla komórek hodowanych na badanych podłożach w pożywce kontrolnej, co może z kolei sugerować, że podłoża GO nie stymulują osteogenezy bez dodatkowej obecności czynników biochemicznych stymulujących ten proces. Zatem, analiza półilościowa potwierdziła, że podłoża grafenowe w hodowli hAT-MSCs prowadzonej w pożywce pozbawionej czynników różnicujących, mogą potencjalnie indukować chondrogenne różnicowanie hAT-MSCs (w szczególności podłoża GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au), czego nie obserwowano dla hodowli kontrolnej. Tym samym, uzyskane wyniki mogą sugerować, że podłoża GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au mogłyby być potencjalnie dalej wykorzystane, jako sprzyjające różnicowaniu chondrogennemu hAT-MSCs in vitro, co było badane dalej. 4.4.4. Ocena zmian ekspresji genów na poziomie RNA związanych z chondrogenezą w hAT-MSCs hodowanych na natywnych oraz modyfikowanych podłożach grafenowych Powszechną metodą badającą zarówno potencjał jak i stopień różnicowania komórek w określony fenotyp jest także badanie poziomu ekspresji transkryptów genów zaangażowanych w ukierunkowany proces różnicowania komórek. Wzrost poziomu ekspresji genów odpowiedzialnych za różnicowanie komórek w danym kierunku, w daną linię tkankową, może świadczyć o zachodzącym ukierunkowanym różnicowaniu tych komórek. Ekspresja czynnika transkrypcyjnego SOX9 jest jednym z kluczowych etapów indukcji różnicowania chondrogennego w MSCs, w wyniku którego następuje zmiana ich pierwotnego fenotypu w kierunku fenotypu charakterystycznego dla chondrocytów [201,202]. Wykazano, że niepoprawne funkcjonowanie genu SOX9 prowadzi do nieprawidłowości w funkcjonowaniu progenitorów chondroblastów, a przez to skutkuje zaburzeniami formowania się tkanki chrzęstnej [203]. Z kolei, w przypadku heterozygotycznych mutantów tego genu dochodzi do rozwoju dysplazji kamptomelicznej, co prowadzi do zaburzeń w rozwoju tkanki kostnej i chrzęstnej, czego efektem są nieprawidłowości w budowie stawu [204]. Ponadto, czynnik ten bierze udział w regulacji ekspresji innych białek związanych z procesem chondrogenezy, w tym białek macierzy zewnątrzkomórkowej charakterystycznej dla tkanki chrzęstnej, tj. białek ACAN, COL2A1, HAPLN1 [205,206]. W przypadku produktu białkowego genu HAPLN1, tworzy on w chrząstce kompleks z kwasem hialuronowym oraz agrekanem [207] oraz działa jako czynnik wzrostu poprzez stymulację syntezy agrekanu i kolagenu typu II [206]. W niniejszej pracy, przeprowadzono zatem analizę ekspresji wybanych, kluczowych genów kodujących białkowe markery wczesnego (SOX9; HAPLN1) i późnego (ACAN; COL2A1) procesu różnicowania chondroblastów, w hAT-MSCs. Ponadto, zmierzono ekspresję genu kodującego białkowy marker wczesnego procesu różnicowania osteoblastów (ALPL). Analizę ekspresji wspomnianych genów prowadzono na poziomie mRNA w 3, 7 oraz 14 dniu hodowli, zarówno w hAT-MSCs hodowanych w pożywce kontrolnej tj. αMEM z dodatkiem 2% hPL, jak również pożywce różnicującej, tj. StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit. Jako punkt odniesienia, względem którego była mierzona ekspresja genów, przyjęto ekspresję badanych genów w hAT-MSCs hodowanych w pożywce kontrolnej, zmierzoną w dniu rozpoczęcia eksperymentu (dzień 0), dla którego poziom ekspresji oznaczono, jako równy 1,0. Jako gen referencyjny zastosowano GADPH, kodujący białko metabolizmu podstawowego, stale obecne w komórce. Na Rycinie 33 i 34 przedstawiono odpowiednio ekspresję badanych genów zarówno dla grupy badanej tj. hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej, jak i kontroli tj. hAT-MSCs hodowanych w pożywce αMEM z dodatkiem 2% hPL. Analiza poziomu ekspresji na poziomie mRNA z wykorzystaniem metody qPCR wykazała, że badane geny (SOX9, HAPLN1, ACAN, COL2A1, ALPL) ulegają ekspresji zarówno w komórkach hodowanych w pożywce różnicującej, jak i kontrolnej, jednak poziom transkryptów tych genów różnił się w zależności od stosowanej pożywki hodowlanej oraz podłoża hodowlanego (Ryciny 33 i 34). Dla hodowli komórkowej prowadzonej w pożywce różnicującej StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit zaobserwowano wyższy poziom w/w markerów charakterystycznych dla różnicowania chondrogennego (za wyjątkiem genu HAPLN1) w szczególności na podłożach GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au (Rycina 33, panel A, C-D), w porównaniu z kontrolą (Rycina 34, panel A, C-D). W analizie porównanwczej w kolejnych punktach czasowych eksperymentu (tj. dzień 3, 7 i 14) zaobserwowano wzrost ekspresji genu kodującego wczesny czynnik transkrypcyjny regulujący chondrogenezę - SOX9, w hAT-MSCs stymulowanych pożywką różnicującą (Rycina 33, panel A) w porównaniu z kontrolą (Rycina 34, panel A), niemniej przeprowadzona analiza nie wykazała istotności statystycznej. Najwyższy wzrost ekspresji genu SOX9 wykazano dla hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej na podłożu GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au, którego poziom w dniu 14 hodowli wzrósł 4-krotnie względem ekspresji tego genu w dniu rozpoczęcia eksperymentu (dzień 0) (Rycina 33, panel A). W przypadku ekspresji genu HAPLN1 w hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit wykazano istotny, 2-krotny spadek ekspresji tego genu w dniu 14 hodowli na podłożu GO Graphenea+Au, w porównaniu do komórek hodowanych na podłożu kontrolnym (TCPS) (Rycina 33, panel B), przy czym poziom ekspresji tego genu (zarówno dla podłoża grafenowego jak i TCPS) wzrastał stopniowo w kolejnych dniach hodowli. Podobnie, obserwowano porównywalny wzrost ekspresji tego genu w kolejnych dniach hodowli zarówno na podłożu kontrolnym, jak i pozostałych podłożach grafenowych (Rycina 33, panel B). W późniejszej fazie hodowli hAT-MSCs w pożywce różnicującej (dzień 14) obserwowano wzrost ekspresji genów kodujących tzw. późne białkowe markery chondrogenezy, stanowiące składniki macierzy zewnątrzkomórkowej - COL2A1, ACAN, względem kontroli (Rycina 33, panel C i D). Efekt ten szczególnie był widoczny w hAT-MSCs hodowanych na podłożach GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au (Rycina 33, panel C i D). Co istotne, zaobserwowano ponad 375-krotną istotną statystycznię zmianę ekspresji genu ACAN w hAT-MSCs różnicowanych na podłożu GO Graphenea w stosunku do kontroli, podczas gdy poziom tego genu był jeszcze dodatkowo dwa razy wyższy w hAT-MSCs różnicowanych na podłożu GO Grapenea+Au (Rycina 33, panel C). Podobną zależność w poziomie transkryptów genów wykazano dla genu COL2A1, gdzie w hAT-MSCs różnicowanych na podłożu GO Graphenea odnotowano blisko 7-krotny wzrost ekspresji tego genu względem kontroli, podczas gdy komórki hodowane na podłożu GO Grapenea+Au wykazywały ponad 14-krotny wzrost ekspresji genu w odniesieniu do poziomu ekspresji genu hAT-MSCs w kontroli, tj. w dniu 0 (wartość ekspresji genu równa 1,0) (Rycina 33, panel D). Hodowla hAT-MSCs w pożywce kontrolnej (αMEM z dodatkiem 2% hPL) na różnych podłożach hodowlanych, wykazała, że podłoża pokryte tlenkiem grafenu działają stymulująco na różnicowanie hAT-MSCs w kierunku komórek tkanki chrzęstnej, przy czym wzrost ekspresji genów w pożywce kontrolnej jest na niższym poziomie (Rycina 34, panel A-D) w porównaniu z ekspresją tych genów w hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej (Rycina 33, panel A-D). Dla wszystkich badanych podłoży grafenowych, jak również podłoża kontrolnego TCPS, krotność ekspresji genu SOX9 była nieznaczna i oscylowała średnio w przedziale od 1,0 do 2,0 (Rycina 34, panel A). Z kolei dla genu HAPLN1, dla którego nie odnotowano istotnie statystycznych różnic ekspresji tego genu na badanych podłożach, obserwowano, podobnie jak w przypadku hodowli różnicującej hAT-MSCs, wzrost krotności ekspresji tego genu w kolejnych dniach hodowli (dzień 3, 7, 14) zarówno dla podłoża kontrolnego, jak i badanych podłoży grafenowych (Rycina 34, panel B). W przypadku genu ACAN najwyższą ekspresję tego genu (>9-krotny wzrost krotności ekspresji) wykazano w dniu 14 dla podłoża GO Graphenea, porównywalną do ekspresji tego genu dla hAT-MSCs hodowanych na podłożu TCPS (Rycina 34, panel C). W przypadku genu COL2A1 wykazano nieznaczny (średnio 2-3 krotny) wzrost ekspresji tego genu w komórkach hodowanych na badanych podłożach grafenowych GO ITME oraz GO Graphenea, względem poziomu ekspresji tego genu z dnia 0 (Rycina 34, panel D). Co ciekawe, odnotowano wysoki bazalny poziom ekspresji genu ALPL w hAT-MSCs (Rycina 34, panel E), który w kolejnych dniach eksperymentu spadał stopniowo i nie zmieniał się w trakcie różnicowania (Rycina 33, panel E). Jest to istotne, ponieważ może świadczyć, że komórki nie różnicowały w kierunku komórek tkanki kostnej, ale przechodziły stopniowe różnicowanie w kierunku chondroblastów in vitro. Rycina 33. Wpływ natywnych i modyfikowanych powierzchni pokrytych tlenkiem grafenu na ekspresję wybranych genów związanych z procesami chondrogenezy w hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej in vitro. hAT-MSCs (pasaże numer 3-4) wysiano na płytkę hodowlaną w gęstości 3,5 - 4 x103/cm2 powierzchni hodowlanej i inkubowano w pożywce αMEM z dodatkiem 2% hPL (Macopharma) przez 6 godz., po czym pożywkę zmieniono i komórki hodowano dalej w pożywce różnicującej StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific). A-E. Wyniki poziomu ekspresji wybranych genów zmierzonych metodą qPCR w komórkach hAT-MSCs w 3, 7 oraz 14 dni różnicowania. Wyniki przedstawiono jako względną ekspresję w stosunku do poziomu ekspresji danego genu w komórkach wyjściowych (z dnia 0), dla których wartość ekspresji oznaczono jako 1,0. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; *p<0,05, **p<0,01; (test t-studenta); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). Rycina 34. Wpływ natywnych i modyfikowanych powierzchni pokrytych tlenkiem grafenu na ekspresję wybranych genów związanych z procesami chondrogenezy w hAT-MSCs hodowanych w pożywce kontrolnej in vitro. hAT-MSCs (pasaże numer 3-4) wysiano na płytkę hodowlaną i inkubowano w pożywce αMEM z dodatkiem 2% hPL (Macopharma) przez 6 godz., po czym pożywkę zmieniono i komórki hodowano dalej w pożywce αMEM z dodatkiem 2% hPL (Macopharma). A-E. Wyniki poziomu ekspresji wybranych genów zmierzonych metodą qPCR w hAT-MSCs w 3, 7 oraz 14 dni różnicowania. Wyniki przedstawiono jako względną ekspresję w stosunku do poziomu ekspresji danego genu w komórkach wyjściowych (z dnia 0), dla których wartość ekspresji oznaczono jako 1,0. Prezentowane wartości przedstawiają: Średnia ± SD; Brak istotnych statystycznie różnic (p>0,05); (test t-studenta); N=3 (Eksperyment wykonano trzykrotnie na trzech lipoaspiratach pochodzących od różnych dawców). Podsumowując, uzyskane wyniki wskazują, że podłoża GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au mogą prowadzić do dodatkowej stymulacji procesu chondrogenezy w hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej, zawierającej czynniki wzrostowe aktywujące chondrogenezę, a zatem podłoża te mogłyby być dalej optymalizowane i potencjalnie zastosowane w celu wstępnej hodowli MSCs dla dalszych aplikacji i naprawy uszkodzonej tkanki chrzęstnej. 4.4.5. Ocena potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs in vivo w szczurzym modelu osteoartrozy W celu oceny potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs wchodzących w skład opracowanego produktu ATMP-HE, wykorzystano ich dostawowe podanie w szczurzym modelu chemicznego uszkodzenia tkanki chrzęstnej in vivo, które pod względem rozwoju objawów odpowiada zamianom obserwowanym również w osteoartrozie. W tym celu wykorzystano hAT-MSCs różnicowane na wybranych podłożach hodowlanych, w tym pokrytych GO lub na podłożach kontrolnych (TCPS). Szczury szczepu RNU Nude (Nude), które ze względu na deficyt immunologiczny mogą przyjmować przeszczepy ksenogeniczne (w tym komórek ludzkich), zostały poddane procedurze chemicznej indukcji osteoartrozy stawu kolanowego poprzez dostawową iniekcję roztworu monojodooctanu sodu (MIA), który działa uszkadzająco na chrząstkę stawową (opis w podrozdziale 3.2.4.5. Analiza potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs natywnych oraz różnicowanych na podłożach grafenowych – badania in vivo). Po rozwinięciu objawów OA, zwierzętom podano preparaty komórkowe zawierające 1x106 hAT-MSCs, które były hodowane i przygotowywane w różnych warunkach hodowlanych ex vivo, podanych poniżej: 1. Hodowla w warunkach standardowych: tj. na podłożu TCPS w pożywce namnażającej (αMEM z 10%hPL); 2. Hodowla na standardowym podłożu TCPS w pożywce różnicującej, tj. stymulującej chondrogenezę (StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit); 3. Hodowla na podłożu pokrytym GO Graphenea w pożywce różnicującej, tj. stymulującej chondrogenezę (StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit); 4. Hodowla na podłożu pokrytym GO Graphenea modyfikowanym jonami Au w pożywce różnicującej, tj. stymulującej chondrogenezę (StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit). (i) obszary nowo formującej się chrząstki po podaniu hAT-MSCs hodowanych na TCPS oraz GO Graphenea w pożywce różnicującej (Rycina 35, odpowiednio panel D i E), odpowiadającej w obrazie mikroskopowym chrząstce szklistej oraz (ii) chrząstkę szklistą w pełni zróżnicowaną/ dojrzałą po podaniu hAT-MSCs hodowanych na TCPS w pożywce αMEM z 10%hPL oraz na podłożu GO Graphenea w pożywce różnicującej (Rycina 35, panel C i F). Każdorazowo, przed podaniem preparatów komórkowych oceniano żywotność hAT-MSCs w komorze Bürkera, która wynosiła > 95%. Zwierzętom kontrolnym zamiast komórek podawano natomiast sam nośnik użyty do zawieszenia komórek do iniekcji dostawowych (tj. 0,9% NaCl). Po 28 dniach od podania komórek (co odpowiadało 42 dniom od podania MIA w celu indukcji OA), zakończono procedurę badawczą, zgodnie ze schematem badania zamieszczonym w podrozdziale 3.2.4.5. Analiza potencjału proregeneracyjnego hAT-MSCs natywnych oraz różnicowanych na podłożach grafenowych – badania in vivo). Następnie zabezpieczono tkanki dla dalszych analiz, w tym powierzchnie stawowe w obrębie stawu kolanowego, które poddano analizie histologicznej, której część i analizę wstępną przedstawiono w niniejszej pracy. Barwienia histologiczne i ich ocena histologiczna zostały wykonane w Zakładzie Diagnostyki Patomorfologicznej Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie przez dr Krzysztofa Szymońskiego. Wstępna ocena efektu proregeneracyjnego w tkance chrzęstnej po podaniach preparatów kontrolnych oraz komórkowych zawierających hAT-MSCs hodowane na podłożach kontrolnych we wspomnianych pożywkach, tj. namnażającej (αMEM z 10%hPL) lub różnicującej (StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit), jak również na podłożach pokrytych związkami grafenowymi i w obecności pożywki różnicującej, która została przedstawiona w niniejszej pracy - została oparta przede wszystkim na pomiarze grubości chrząstki stawowej leczonego stawu kolanowego oraz na ocenie rodzaju nowopowstałej tkanki. We wszystkich badanych preparatach histologicznych, w obrazie mikroskopowym obserwowano występowanie chrząstki szklistej pokrywającej powierzchnie stawowe, mające bezpośredni kontakt z jamą stawową i narażonej w pierwszej kolejności na potencjalną degradację swojej struktury. Obszary degradacji chrząstki powstałe na skutek podania MIA do stawu kolanowego szczurów były widoczne na prawie wszystkich zdjęciach analizowanych grup zwierząt (Rycina 35, panel B-F). Co ważne, w analizie mikroskopowej fragmentów tkanek zaobserwowano zarówno: Ponadto, w grupach badanych, czyli szczurach z indukowaną OA, którym podawano preparaty komórkowe (Rycina 35, panel C-F), w obrazie mikroskopowym można wyróżnić chondroblasty tworzące zbiory kilku komórek otoczonych istotą podstawową tworząc szkliste obszary zwane terytoriami chrzęstnymi, co może wskazywać na formowanie się tkanki chrzęstnej szklistej [208]. Co więcej, porównując grubość chrząstki stawowej pomiędzy kontrolą zdrową (czyli zwierzętami, u których nie indukowano uszkodzenia chrząstki), w której wynosiła ona 373,09 µm (Rycina 35, panele A), a grupami badanymi tj.: (i) grupą zwierząt z OA, którym podawano hAT-MSCs hodowane na podłożu TCPS w standardowej pożywce hodowlanej, której grubość wynosiła 120,78 µm (Rycina 35, panele C) oraz (ii) grupami zwierząt z OA, którym podano hAT-MSCs hodowane na TCPS oraz na podłożach GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au w pożywce różnicującej, gdzie grubość chrząstki wynosiła odpowiednio 236,87 µm, 258,19 µm oraz 260,063 µm (Rycina 35, panele D-F), zaobserwowano prochondrogenny wpływ pożywki różnicującej oraz badanych podłoży grafenowych na hAT-MSCs poddane wstępnej hodowli w tych warunkach przed podaniem do zwierząt. Sugeruje to zatem zwiększony potencjał chondrogenny tak przygotowanych i podanych hAT-MSCs w uszkodzeniach tkanki chrzęstnej w warunkach in vivo. Rycina 35. Ocena przebudowy tkanki chrzęstnej w stawie kolanowym szczurów po chemicznej indukcji OA in vivo. Do oceny potencjału proregneracyjnego hAT-MSCs hodowanych na natywnych i modyfikowanych podłożach grafenowych wykorzystano szczury RNU Nude (Nude) z indukowaną chemicznie osteoartrozą. Reprezentatywne zdjęcia tkanek powierzchni stawowej wykonane w przekroju poprzecznym, barwione roztworem hematoksyliny-eozyny (HE). Wybarwiona na fioletowo struktura (zaznaczona białą strzałką) wskazuje obecność chrząstki stawowej. Przykładowe obszary degradacji chrząstki stawowej zaznaczono czerwonym krzyżykiem. Przykładowe obszary z obecnymi terytoriami chrzęstnymi zaznaczono zieloną strzałką. Obszary pomiaru chrząstki zaznaczono kolorem czarnym (chrząstka dojrzała, nieuszkodzona) oraz zielonym (chrząstka nowopowstała). Skala: 200 μm. A-B. Kontrole: (A): kontrola zdrowa (KZ) – szczury zdrowe, którym dokolanowo podano kontrolnie nośnik komórek – roztwór soli fizjologicznej (B): Kontrola bez leczenia (KB) – szczury z indukowaną OA, którym zamiast preparatów komórkowych podano kontolnie sól fizjologiczną; C-F. Grupy badane to szczury z indukowaną OA, którym podawano następujące preparaty zawierających komórki hAT-MSCs: (C): hodowane na podłożu TCPS w standardowej pożywce hodowlanej (αMEM z 10%hPL); (D): hodowane na podłożu TCPS w pożywce różnicującej; (E): hodowane na podłożu GO Graphenea w pożywce różnicującej; (F): hodowane na podłożu GO Graphenea+Au w pożywce różnicującej. Jako pożywkę różnicującą wykorzystano StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco; ThermoFisher Scientific). Podsumowując, wstępne dane z analizy histologicznej preparatów chrząstki stawowej stawów kolanowych szczurów z uszkodzoneniem chrząstki na skutek podania MIA (i.a.), wykazały znaczną regenerację w grupach zwierząt, którym podano preparaty komórkowe zawierające hAT-MSCs hodowane na podłożach kontrolnych, jak również na podłożach pokrytych GO w pożywce stymulującej różnicowanie chondrogenne tych komórek ex vivo, w porównaniu do zwierząt z uszkodzoną chrząstką, które nie otrzymały preparatów zawierających hAT-MSCs. Uzyskane wyniki sugerują, że zarówno natywne MSCs, jak i komórki hodowane na podłożach grafenowych mogłyby być potencjalnie wykorzystane w w celu naprawy uszkodzonej tkanki chrzęstnej in vivo. Pełne badania in vivo w w/w modelu oraz z uwzględnieniem wymienionych preparatów komórkowych zawierających hAT-MSCs zostaną w pełnym zakresie wykonane i uzupełnione przez grupę badawczą kierowaną przez prof. dr hab. Katarzynę Starowicz (IF PAN Kraków), z którą współpracowałam w ramach tego eksperymentu. 4.5. Przygotowanie do wdrożenia produktu leczniczego terapii zaawansowanej – wyjątek szpitalny (ATMP-HE) Ostatni etap prac podjętych w ramach realizacji niniejszej pracy doktorskiej był w sposób istotny związany z wdrożeniowym charakterem tego doktoratu. Działania podjęte w tym etapie dotyczyły przeniesienia opracowanej metody izolacji oraz hodowli hAT-MSCs do warunków GMP, w ramach przygotowanego uprzednio laboratorium typu cleanroom pracującego w standardzie GMP na terenie Jagiellońskiego Centrum Innowacji w Krakowie, tj. firmy współpracującej w ramach niniejszego doktoratu wdrożeniowego. W tym celu przygotowano procedury wytwarzania oraz kontroli jakości produktu ATMP-HE zawierającego hAT-MSCs jako substancję czynną, a następnie wykonano walidację wytwarzania tego produktu, która następnie umożliwiła uzyskanie niezbędnych zgód na prowadzenie przez Wytwórnię działalności, jako Bank Tkanek i Komórek oraz uzyskania stosownego zezwolenia na wytwarzanie produktu ATMP-HE. W ramach procesu walidacji wytworzono trzy serie produktu ATMP-HE, a następnie wykonano wymagane prawodawstwem polskim i EU badania kontroli jakości, w celu potwierdzenia, że wyniki analityczne otrzymane dla serii produktu są zgodne z przyjętymi kryteriami akceptacji produktu ATMP-HE. Proces walidacji wytwarzania produktu ATMP-HE został przeprowadzony zgodnie z Aneksem 15 pt. Kwalifikacja i walidacja Rozporządzenia GMP [122], i został podzielony na następujące etapy: (i) badanie materiału wyjściowego; (ii) kontrole międzyoperacyjne, (iii) badania produktu końcowego. Parametry badane na etapie wytwarzania produktu ATMP-HE dotyczące materiału wyjściowego obejmowały: ocenę liczby wyizolowanych komórek (tj. liczby wyizolowanych komórek frakcji SVF), ocenę ich żywotność oraz jałowości materiału wyjściowego, a także ocenę poziomu endotoksyn w materiale wyjściowym. Z kolei parametry oceniane na etapie hodowli AT-MSCs, podczas której przeprowadzano kontrole międzyprocesowe oraz na etapie badań produktu końcowego, obejmowały: obecność oznak potencjalnego zakażenia hodowli komórkowej, morfologię i stopień konfluencji hodowli komórkowej, obecności nieadherentnej frakcji komórek pozostałej w pożywce hodowlanej, liczbę komórek namnażanych i ich żywotność. Otrzymane wyniki z badań analitycznych przeprowadzonych podczas walidacji procesu (etap (i)-(iii)) wytwarzania produktu ATMP-HE (wykonane zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.1.3. Optymalizacja fazy implementacyjnej produktu leczniczego) potwierdziły, że wytworzone produkty ATMP-HE spełniają wszystkie wymagania jakościowe i kryteria akceptacji do zwolnienia, tj. wydania produktu, przedstawione w Tabeli 19. Tabela 19. Wewnątrzprocesowe wymagania jakościowe oraz kryteria akceptacji do zwolnienia/wydania wytwarzanego produktu ATMP-HE. Materiał wyjściowy tj. aspirat tkanki tłuszczowej oraz produkt końcowy tj. produkt ATMP-HE. Zakresy/ wyniki podane jako prawidłowe dla produktu ATMP-HE wytwarzanego w standardzie GMP [122] określone na podstawie wytycznych Komitetu ds. Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi przy EMA dotyczących produktów terapii komórkowych [137] jak również monografii 2.6.1. (badania jałowości) oraz 2.6.14 (endotoksyny) Farmakopei Europejskiej. Badanie materiału wyjściowego Oceniany parametr Metoda Prawidłowy wynik (akceptowalny) Nieprawidłowy wynik Liczba komórek Metoda barwienia różnicowego oranżem akrydyny i jodkiem propidyny zintegrowana z fluorescencyjnym automatycznym licznikiem komórek ADAM-MC™ (Nanoentek) Obecność komórek frakcji SVF, po izolacji z tkanki tłuszczowej Brak wyizolowanych komórek frakcji SVF Żywotność komórek Metoda barwienia różnicowego oranżem akrydyny i jodkiem propidyny ≥ 60% dla gęstości wysiania 5-11x103/cm2 ≤ 60% zintegrowana z fluorescencyjnym automatycznym licznikiem komórek ADAM-MC™ (Nanoentek) Jałowość materiału wyjściowego Bezpośrednia inokulacja materiału wyjściowego do fiolek przeznaczonych do hodowli tlenowej i beztlenowej mikroorganizmów (bakterii i drożdży) tzw. butelki BACTEC Plus Aerobic/F Culture Vials i BACTEC Plus Anaerobic/F Culture Vials (BD) oraz odczyt za pomocą automatycznego systemu BD Bactec FX400 Jałowy (kontynuacja hodowli komórkowej) Niejałowy (utylizacja materiału biologicznego) Obecność endotoksyn bakteryjnych w materiale wyjściowym Metoda LAL z użyciem czytnika Endosafe®-PTS™ System < 2,0 EU/ml (kontynuacja hodowli komórkowej) > 2,0 EU/ml (utylizacja materiału biologicznego) Kontrole międzyoperacyjne (hodowla hAT-MSCs) Oceniany parametr Metoda Prawidlowy wynik (akceptowalny) Nieprawidłowy wynik Potencjalne oznaki zakażenia hodowli komórkowej Obserwacj makroskopowa oraz obserwacja mikroskopowa hodowli (mikroskopia świetlna) Klarowna pożywka hodowlana o kolorze czerwono-malinowym lub pomarańczowym (kontynuacja hodowli komórkowej) Mętna pożywka lub pożywka o kolorze żółtym, zmiana morfologii komórek (utylizacja materiału biologicznego) Morfologia komórek Mikroskopia świetlna Charakterystyczna dla MSCs (wydłużone, wrzecionowate komórki o morfologii zblizonej do fibroblastów) (kontynuacja hodowli komórkowej) Wszelkie odstępstwa od morfologii prawidłowej (utylizacja materiału biologicznego) Konfluencja hodowli komórkowej Mikroskopia świetlna ≥ 60% → pasaż komórek oraz kontynuacja hodowli komórkowej ≤ 60% → kontynuacja hodowli komórkowej < 10% → ocena obecności nieadherentnej frakcji komórek Obecność frakcji komórek nieadherentnych (ocena jakościowa) Mikroskopia świetlna Nieliczne nieadherentne komórki pływające w pożywce hodowlanej Liczne nieadherentne komórki pływające w pożywce hodowlanej (utylizacja materiału biologicznego) (kontynuacja hodowli komórkowej) Liczba komórek Metoda barwienia różnicowego oranżem akrydyny i jodkiem propidyny zintegrowana z fluorescencyjnym automatycznym licznikiem komórek ADAM-MC™ (Nanoentek) Co najmniej dwa razy więcej komórek niż liczba komórek wysianych (kontynuacja hodowli komórkowej) Poniżej podwójnej liczby komórek w porównaniu z liczbą komórek wysianych (utylizacja materiału biologicznego) Żywotność komórek Metoda barwienia różnicowego oranżem akrydyny i jodkiem propidyny zintegrowana z fluorescencyjnym automatycznym licznikiem komórek ADAM-MC™ (Nanoentek) ≥ 70% (kontynuacja hodowli komórkowej) < 70% (utylizacja materiału biologicznego) Badania produktu końcowego (zakończenie hodowli hAT-MSCs oraz przygotowanie końcowej formulacji produktu ATMP-HE) Oceniany parametr Metoda Prawidlowy wynik (akceptowalny) Nieprawidłowy wynik Parametry z kontroli międzyoperacyjnych tj. Potencjalne oznaki zakażenia hodowli komórkowej, Morfologia komórek, Konfluencja hodowli komórkowej, Obecność frakcji komórek nieadherentnych (ocena jakościowa) Żywotność komórek Metoda barwienia różnicowego oranżem akrydyny i jodkiem propidyny zintegrowana z fluorescencyjnym automatycznym licznikiem komórek ADAM-MC™ (Nanoentek) ≥ 70% → przygotowanie produktu końcowego) < 70% → produkt końcowy nie jest zwalniany do podania do pacjenta (utylizacja materiału biologicznego) Liczba komórek Metoda barwienia różnicowego oranżem akrydyny i jodkiem propidyny zintegrowana z fluorescencyjnym automatycznym licznikiem komórek ADAM-MC™ (Nanoentek) 10 x 106 żywotnych hAT-MSCs <10 x 106 żywotnych hAT-MSCs → do decyzji lekarza prowadzącego (zlecającego wytworzenie produktu ATMP-HE) Ponadto, na podstawie uzyskanych wyników z walidacji wytwarzania produktu ATMP-HE, zdefiniowano kryteria akceptacji produktu końcowego (Tabela 20). Na podstawie uzyskanych wyników potwierdzono zachowanie prawidłowej wydłużonej, wrzecionowatej morfologii hAT-MSCs oraz wysokiej żywotności komórek (97,3 ± 0,9%) zawieszonych w końcowej formulacji produktu końcowego. Wykonany (zgodnie z monografią 2.6.1 Jałowość Farmakopei Europejskiej) posiew mikrobiologiczny potwierdził jałowość produktu końcowego, a przeprowadzone badania w kierunku występowania endotoksyn bakteryjnych (których dopuszczalny limit stężenia wyznaczono zgodnie z parametrami zamieszczonymi w Farmakopei Europejskiej - 2.6.14 Endotoksyny bakteryjne i wynosił on <2.00 EU/ml) nie wykazały przekroczenia wskazanych limitów i tym samym produkt końcowy został uznany za wolny od endotoksyn bakteryjnych. Każdorazowo dla wytwarzanej serii produktu końcowego uzyskano wymaganą liczbę komórek na jedną dawkę produktu ATMP-HE, tj. 10 x 106 żywotnych hAT-MSCs. Tabela 20. Charakterystyka produktu końcowego obejmująca kryteria akceptacji do zwolnienia/ wydania produktu, przeprowadzona w ramach walidacji procesu wytwarzania produktu ATMP-HE. Walidacja procesu wytwarzania produktu ATMP-HE Oceniany parametr Limit / zakres Uzyskany wynik [badana seria wytwarzanego produktu: uzyskany wynik} Morfologia komórek Charakterystyczna dla MSCs (wydłużone, wrzecionowate komórki o morfologii zblizonej do fibroblastów) Seria nr 1: prawidłowy Seria nr 2: prawidłowy Seria nr 3: prawidłowy Obecność endotoksyn bakteryjnych < 2,0 EU/ml Seria nr 1: prawidłowy Seria nr 2: prawidłowy Seria nr 3: prawidłowy Posiew mikrobiologiczny Ujemny Seria nr 1: ujemny Seria nr 2: ujemny Seria nr 3: ujemny Żywotność komórek ≥ 70% Seria nr 1: 98% Seria nr 2: 96% Seria nr 3: 98% Liczba komórek / dawkę 10 x 106 żywotnych hAT-MSCs Seria nr 1: 10 x 106 żywotnych hAT-MSCs Seria nr 2: 10 x 106 żywotnych hAT-MSCs Seria nr 3: 10 x 106 żywotnych hAT-MSCs Dodatkowo, w ostatnim etapie prac wdrożeniowych przeprowadzono badania stabilności produktu końcowego ATMP-HE (wykonane zgodnie z opisem zamieszczonym w podrozdziale 3.2.1.3. Optymalizacja fazy implementacyjnej produktu leczniczego), zawierającego 10 x 106 żywotnych hAT-MSCs zawieszonych (po pasażu nr 3) w docelowym nośniku tj. w płynie Ringera z dodatkiem 2,5% glukozy oraz 1% albuminy i umieszczonych w sterylnej strzykawce BD Plastipack typu Luer-Lock (BD) zamkniętej korkiem CombiStopper (B.Braun) (Rycina 36). Wyniki z przeprowadzonych badań potwierdziły, że hAT-MSCs w końcowej formulacji produktu ATMP-HE zachowują wysoką żywotność, wynoszącą ponad 95% w temperaturze 2-8oC, aż do 24 godz., licząc od momentu przygotowania końcowej formulacji produktu ATMP-HE (Rycina 36, panel A i B). Rycina 36. Analiza stabilności końcowej formulacji produktu ATMP-HE. A. Wykres przedstawia zależność żywotności komórek od czasu, mierzoną co 3 godz. przez okres 24 godz. od momentu zawieszenia docelowej dawki produktu ATMP-HE (10 x 106 żywtonych hAT-MSCs) w końcowej formulacji produktu, dla trzech serii produktu (N=3). Po trzecim pasażu, hAT-MSCs w liczbie 10x106 żywych komórek, zostały zawieszone w docelowym nośniku i przeniesione do opakowania bezpośredniego produktu (sterylna strzykawka BD Plastipack typu Luer-Lock (BD) zamknięta korkiem CombiStopper (B.Braun)), a następnie były przechowywane w temperaturze 2-8oC, w kontrolowanych i monitorowanych warunkach temperatury. Żywotność komórek mierzono za pomocą licznika komórek ADAM NanoEnTek. Dolną akceptowalną granicę żywotności komórek zaznaczono czerwoną linią i wyznaczono na poziomie 70%. B. Pomiar temperatury przechowywania preparatu komórkowego. Czerwonymi liniami zaznaczono górny i dolny limit warunków temperaturowych przechowywania produktu końcowego. Za dolny akceptowalny zakres temperatury uznano 2oC, podczas gdy górny limit nie przekraczał 8oC. Analiza trzech serii walidacyjnych (N=3). Ponadto, w celu uzyskania zgody na wytwarzanie produktu ATMP-HE, oprócz powyżej wspominanych prac badawczych, przed przystąpieniem do walidacji wytwarzania produktu konieczne było opracowanie dokumentacji, która obejmowała tzw. System Zapewnienia Jakości (SZJ) dla w/w laboratorium JCI w Krakowie. Dokumentacja ta obejmowała także procedury izolacji oraz hodowli hAT-MSCs oraz badania wykonywane w ramach kontroli jakości. Ramowy spis procedur postępowania, który został stworzony podczas realizacji mojej pracy doktorskiej oraz na potrzeby wdrożenia produktu ATMP-HE w laboratorium JCI w Krakowie, tj. w firmie, w której jestem zatrudniona i która współpracowałam przy realizacji niniejszej pracy doktorskiej, przedstawiono w rozdziale 8. Załączniki, Tabela 21. Należy podkreślić, że procedury te stanowią udokumentowany spis wszystkich czynności przeprowadzanych na terenie laboratorium typu cleanroom pracującego w standardzie GMP, które na podstawie przygotowanej dokumentacji są możliwe do odtworzenia i śledzenia w celu wykrycia, ograniczenia oraz usunięcia ewentualnych zaistniałych nieprawidłowości. Przygotowana dokumentacja, w postaci procedur i zapisów SZJ, podlegała następnie ocenie oraz inspekcji: 1) Krajowego Centrum Bankowania Tkanek i Komórek (KCBTiK), która odbyła się w celu uzyskania ze strony Ministerstwa Zdrowia pozwolenia na gromadzenie, przechowywanie oraz dopuszczenie do obiegu materiału wyjściowego tj. ludzkiej tkanki tłuszczowej oraz 2) Głównego Inspektoratu Farmaceutycznego (GIF), która umożliwiła uzyskać zgodę na wytwarzanie produktu ATMP-HE, jako produktu leczniczego. Uzyskane zgody przedstawiono w rozdziale 8. Załączniki (Rycina 38-40). Z kolei na Rycinie 37 przedstawiono uproszczony schemat postępowania w ramach procedury rejestracji ATMP-HE. Rycina 37. Schemat podsumowujący główne prace zrealizowane w ramach postępowania dotyczącego rejestracji produktu ATMP-HE. Podsumowując, badania oraz działania przeprowadzone w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej pozwoliły na opracowanie zoptymalizowanych protokołów wytwarzania preparatów mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej (hAT-MSCs), z uwzględnieniem wymagań GMP dla produktów ATMP-HE, co stanowi główne osiągnięcie wdrożeniowe niniejszej pracy doktorskiej. Należy jednak nadmienić, że w kolejnym etapie prac badawczych (nie objętych niniejszą rozprawą doktorską), w ramach kontroli jakości produktu końcowego planowane jest przeprowadzenie badań walidacyjnych obejmujących m.in. badania na obecność mykoplazm, badania kariotypu a także potwierdzenie tożsamości wyizolowanych komórek z tkanki tłuszczowej. 5. DYSKUSJA Wdrożenie technologii wytwarzania produktu leczniczego terapii zaawansowanej (ang. Advanced Therapy Medicinal Products; ATMP), którego substancję aktywną (ang. Active Pharmaceutical Ingredient; API) stanowią komórki ludzkie, przykładowo MSCs pochodzące z różnych tkanek, wymaga opracowania, a następnie standaryzacji procesu wytwarzania takiego produktu leczniczego zgodnie z europejskimi regulacjami Europejskiej Agencji Leków (EMA) oraz wymogami prawnymi lokalnych organów nadzorujących (tj. zależnie od zakresu prowadzonej działalności: Krajowego Centrum Bankowania Tkanek i Komórek (KCBTiK) oraz Głównego Inspektoratu Farmaceutycznego (GIF)), działających w Polsce [109,122]. Opracowywany w ramach niniejszej pracy doktorskiej produkt terapii komórkowej zawierający namnożone hAT-MSCs, zgodnie z rekomendacją Komitetu ds. Terapii Zaawansowanych EMA (CAT), został sklasyfikowany jako produkt inżynierii tkankowej (ang. Tissue Engineered Products; TEP) (podsumowanie opinii CAT dotyczące wnioskowanego produktu terapii komórkowej zostało zamieszczone w rozdziale 8. Załączniki). Zgodnie z definicją zawartą w art. 2 Rozporządzenia (WE) nr 1394/2007 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 13 listopada 2007 r. w sprawie produktów leczniczych terapii zaawansowanej oraz zmieniające dyrektywę 2001/83/WE i Rozporządzenia (WE) nr 726/2004 [115] (w skrócie: Rozporządzenia nr 1394/2007) - jest to zatem taki produkt leczniczy, który zawiera komórki lub tkanki, które podlegały znacznym modyfikacjom w warunkach ex vivo (np. trawieniu enzymatycznemu tkanki źródłowej w celu izolacji określonej frakcji komórek, pasażowi komórek w trakcie ich hodowli, etc.) i stosowany jest w celu regeneracji, naprawy albo zastępowania tkanki ludzkiej [115]. Tym samym, tak sklasyfikowany produkt terapii komórkowej (produkt TEP), który opracowano w niniejszej pracy doktorskiej, spełnia wymagania stawiane przed produktami leczniczymi terapii zaawanasowanej, o których mowa w art. 17 rozporządzenia nr 1394/2007 [115], a jego główny mechanizm działania opiera się na i) potencjale ludzkich hAT-MSCs do chondrogennego oraz osteogennego różnicowania w miejscu uszkodzenia [209], jak również potencjalnej możliwości integracji hAT-MSCs z uszkodzoną tkanką chrzęstną oraz kostną wspierając tym samym odbudowę występujących w niej miejsc ubytku, a także na ii) wydzielaniu przez hAT-MSCs czynników troficznych wspomagających proces regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych in vivo. Dostępne strategie leczenia uszkodzeń tkanki chrzęstnej oraz kostnej obejmują leczenie farmakologiczne, a w przypadku bardziej zaawansowanych zmian - inwazyjne leczenie chirurgiczne, które często związane jest z koniecznością przeprowadzenia zabiegu endoprotezoplastyki (zastosowania sztucznej protezy), a w niektórych przypadkach potrzebą wykonywania rewizji w celu wymiany protezy [109]. Niezależnie od przyjętego planu leczenia, stosowanie konwencjonalnych metod terapeutycznych koncentruje się głównie na leczeniu objawowym, w tym niwelowaniu dolegliwości bólowych oraz usprawnieniu aparatu ruchu poprzez zapewnienie ciągłości tkanek lub ich wymianę na implanty protezowe [108]. Trudności w regeneracji chrząstki stawowej są związane z brakiem występowania w jej obrębie naczyń krwionośnych, limfatycznych oraz brakiem jej unerwienia [208]. W związku z tym, tkanka ta cechuje się niską aktywnością proliferacyjną chondrocytów, a tym samym ograniczonymi możliwościami odbudowy powstałego w niej ubytku [71,75]. Dzięki naturalnym mechanizmom regeneracji tkanek, ubytki w chrząstce zastępowane są tkanką włóknistą, odporną na zerwania dzięki obecności w jej strukturze licznych włókien kolagenowych (kolagen typu I), ale niestety o mniejszej sprężystości i odporności na ścieranie niż najbardziej zewnętrzna warstwa chrząstki stawowej tj. chrząstka szklista, której odbudowa jest trudna do uzyskania [208]. W związku z powyższym, od jakiegoś czasu celem leczenia uszkodzeń chrząstki z zastosowaniem różnych opracowywanych podejść, w tym opartych o terapie komórkowe, stało się z jednej strony przywrócenie ciągłości tkanki, natomiast z drugiej odtworzenie utraconej powierzchni chrząstki stawowej o parametrach bliskich chrząstce szklistej [210,211]. Niemniej jednak, im bardziej rozległa powierzchnia oraz głębokość ubytku chrząstki, tym trudniejsze jest odtworzenie w pełni biomechanicznej, funkcjonalnej powierzchni chrząstki stawowej [212]. Obecnie duże nadzieje wiąże się z terapiami komórkowymi, w tym w szczególności z zastosowaniem MSCs, których podanie w momencie pojawienia się pierwszych niewielkich uszkodzeń chrzęstno-kostnych (zależnie od obszaru ubytku oraz jego głębokości), takich jak wywołanych m.in. postępująca osteoartrozą (OA), może prowadzić do naprawy uszkodzonej powierzchni chrząstki, dzięki właściwościom biologicznym tych komórek [209]. Podanie komórek we wczesnych etapach rozwoju uszkodzenia chrząstki może spowalniać procesy prowadzące do dalszego uszkodzenia tej tkanki i tym samym potencjalnie oddalić w czasie lub nawet całkowicie wyeliminować konieczność wszczepienia protezy stawu. W badaniach przeprowadzonych przez grupę Liu i wsp. określono tzw. krytyczne progi uszkodzenia chrząstki, mające istotny wpływ na efekt terapeutyczny defektów kostno-chrzęstnych przy zastosowaniu preparatów MSCs [209]. Przy zastosowaniu modelu predykcyjnego, tzw. sztucznych sieci neuronowych, wykazano m.in., że dla obszaru ubytku do 6% powierzchni chrząstki oraz głębokość powstałego w niej ubytku do 22% grubości warstwy chrzęstnej, można uzyskać najwyższą skuteczność terapii po podaniu MSCs (przy stosowaniu dawki równej 17-25x106 MSCs) [209]. Do standardowo stosowanych obecnie dopuszczonych do obrotu terapii komórkowych, które mają na celu promowanie procesów regeneracji powstałego defektu kostno-chrzęstnego (wykaz wybranych produktów ATMP stosowanych we wskazaniach ortopedycznych zamieszczono w Tabeli 2 podrozdziału 1.4. Zastosowanie terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej – ze szczególnym uwzględnieniem ubytków chrzęstno-kostnych), należy implantacja autologicznych chondrocytów, czyli tzw. ACI (ang. Autologous Chondrocyte Implantation), czy też implantacja chondrocytów w połączeniu z odpowiednim biomateriałem, tzw. MACI (ang. Matrixassociated Autologous Chondrocyte Implantation) [113,213]. Terapie te związane są jednak z potrzebą przeprowadzenia dwóch interwencji medycznych na już obciążonej ubytkiem powierzchni stawowej. Pierwszy zabieg przeprowadza się w celu pobrania wycinka tkanki z powierzchni stawowej nieobjętej zmianą/ubytkiem, z którego izoluje się ludzkie autologiczne chondrocyty, a następnie zakłada się hodowlę komórek przeznaczonych do przeszczepu. Drugi zabieg dotyczy już samej implantacji namnożonych komórek, które podawane są w miejsce oczyszczonego uprzednio podłoża ubytku [83,213]. Jednak, często spotykanym problemem już na etapie hodowli komórkowej jest niska wydajność izolacji i ekspansji chondrocytów, co związane jest z niską aktywnością proliferacyjną komórek tkanki chrzęstnej [71,75]. Podczas prowadzenia hodowli chondrocytów in vitro może dochodzić do utraty ich pierwotnego fenotypu [110], co w efekcie skutkuje obniżoną ekspresją kolagenu typu II oraz podwyższoną ekspresją kolagenu typu I [214]. W konsekwencji, implantacja takich chondrocytów sprzyjała formowaniu tkanki chrzęstnej włóknistej o gorszych właściwościach biomechanicznych niż bardziej pożądana chrząstka szklista [208]. Aplikacja chondrocytów, które częściowo utraciły swój pierwotny fenotyp oraz podanie zbyt niskiej liczby prawidłowych fenotypowo komórek w konsekwencji może nie przynieść pożądanych korzyści terapeutycznych, w tym także spowodować niepowodzenie zastosowanej terapii, na które to implikacje zwraca uwagę EMA [215]. W związku z powyższym, narodziła się potrzeba poszukiwania nowych alternatywnych typów komórek oraz źródeł pozyskiwania tych komórek, które będą wspierać konwencjonalne metody leczenia uszkodzenie tkanki chrzęstnej oraz sprzyjać formowaniu lub odbudowie tkanki, jak najbardziej zbliżonej parametrami do tkanki chrzęstnej szklistej, co stanowi obecnie wyzwanie dla inżynierii tkankowej. Ze względu na to, że MSCs stanowią jedną z lepiej przebadanych oraz bezpiecznych w zastosowaniach in vivo populacji komórek [216], posiadają unikatowe właściwości biologiczne tj. wysoką aktywność parakrynną, w tym właściwości immunomodulujące [217] oraz mogą różnicować w komórki pochodzenia mezodermalnego [87], stały się one obiecującym kandydatem w leczeniu uszkodzeń tkanek, w tym defektów kostno-chrzęstnych [218]. Obecnie trwają liczne badania kliniczne nad możliwością regeneracji chrząstki stawowej, w których jedną z głównych badanych populacji są MSCs ze szpiku kostnego (spis aktywnych badań klinicznych zaprezentowano w Tabeli 1 podrozdziału 1.4. Zastosowanie terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej – ze szczególnym uwzględnieniem ubytków chrzęstno kostnych) [110,111]. Chociaż szpik kostny stanowi od lat najlepiej poznane źródło pozyskiwania MSCs, efektywność oraz stosunkowo inwazyjny sposób izolacji tych komórek ze szpiku kostnego, szczególnie u starszych dawców, w istotny sposób ogranicza ich potencjalne zastosowanie w praktyce klinicznej [31,219]. Wykazano ponadto, że frakcja komórek jednojądrzastych ze szpiku kostnego zawiera ok. 0,001-0,01% MSCs [219], podczas gdy frakcja komórek SVF wyizolowana z tkanki tłuszczowej zawiera ok. 5-25,9% MSCs [29]. Stąd też alternatywnym dla szpiku kostnego źródłem pozyskiwania MSCs od kilku lat stała się także ludzka tkanka tłuszczowa [220], która może być pobierana w sposób stosunkowo mało inwazyjny, przykładowo jako odpad medyczny przy okazji zabiegów chirurgii plastycznej [221]. W związku z powyższym, w badaniach objętych niniejszą rozprawą doktorską, tkanką źródłową do izolacji MSCs była ludzka tkanka tłuszczowa, która stanowiła odpad medyczny po zabiegach liposukcji lub innych interwencjach chirurgicznych. Łatwość pozyskania tkanki tłuszczowej, stosunkowo niewielka objętość potrzebnego materiału do wyizolowania wystarczającej liczby komórek MSCs do zainicjowania ich efektywnej hodowli (50-150 ml) oraz możliwość częstego pozyskiwania tej tkanki [222,223], jak również wysoka wydajność izolacji MSCs z tkanki tłuszczowej [29,222], stanowią niewątpliwą przewagę tego materiału, jako źródła MSCs w porównaniu ze szpikiem kostnym. W literaturze dostępne są liczne protokoły izolacji oraz ekspansji MSCs z tkanki tłuszczowej w warunkach ex vivo, niemniej jednak wciąż nie zoptymalizowano metody izolacji komórek frakcji SVF (np. stosując metodę mechaniczną versus metodę trawienia enzymatycznego tkanki źródłowej). Protokoły te także są w szczególności opracowane dla celów działań badawczo-rozwojowych [224]. Ostatecznie, wybór właściwej metody bezpośredniej izolacji komórek z tkanki tłuszczowej przekłada się na wydajność izolacji frakcji SVF oraz ekspansji MSCs ex vivo, której efektywność jest istotna ze względu na liczbę wymaganych do przeszczepu komórek [220,225–227]. Ponadto, wyselekcjonowanie optymalnych warunków hodowli MSCs wpływa na czas prowadzenia hodowli, a tym samym koszt wytworzenia jednostkowego produktu ATMP-HE, jeśli proces namnażania prowadzi się już w warunkach GMP. Im dłuższy czas hodowli, tym większe zużycie surowców i materiałów pośrednich, a także większe zaangażowanie kadrowe, co generuje dodatkowy koszt i tak już drogiej terapii komórkowej. Optymalizacja finansowa stanowi zatem ważny aspekt podczas opracowywania strategii terapeutycznych, gdyż ostatecznie decyzja o próbie potencjalnego wdrożenia produktu ATMP będzie wiązać się z poniesieniem znacznych kosztów związanych z prowadzeniem badań klinicznych, w tym kosztów wytwarzanego produktu ATIMP. W związku z powyższym, podczas optymalizacji protokołów izolacji i namnażania hAT-MSCs, które stanowiły główną substancję aktywną produktu leczniczego opracownego w niniejszej pracy, uwzględniając aspekt finansowy, zaplanowano następujący podział prac badawczych: (i) prace optymalizacyjne, które były prowadzone w laboratorium typu „research grade” z zachowaniem zaleceń GMP oraz (ii) prace implementacyjne prowadzone w laboratorium typu „GMP grade”, które były realizowane podczas transferu opracowanego protokołu do Wytwórni biologicznych produktów leczniczych terapii zaawansowanej (Laboratorium Hodowli Tkanek i Komórek Jagiellońskiego Centrum Innowacji w Krakowie). Efektem takiego podejścia było opracowanie protokołów izolacji frakcji SVF oraz ekspansji hAT-MSCs, z uwzględnieniem wymogów dotyczących produktów ATMP-HE (zawartych w rozporządzeniu nr 1394/2007) [115] oraz aspektów prawnych dotyczących Dobrej Praktyki Wytwarzania produktów biologicznych (zawartych w rozporządzeniu Ministra Zdrowia z dnia 19 czerwca 2017r. w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania) [122]. Etap prac optymalizacyjnych obejmował m.in. weryfikację takich kroków jak: i) trawienie enzymatyczne tkanki tłuszczowej (w tym wybór optymalnej aktywności enzymatycznej kolagenazy), ii) wybór pożywki hodowlanej zgodnej z wymogami GMP (tj. m.in. pozbawionej produktów odzwierzęcych, zaopatrzonej w stosowne certyfikaty) oraz iii) wybór naczyń hodowlanych. Etap implementacyjny dotyczący wytwarzania serii walidacyjnych produktu ATMP-HE, w skrócie obejmował: i) kwalifikację materiału wyjściowego (tj. tkanki tłuszczowej) do procesu wytwarzania, ii) przetwarzanie tkanki tłuszczowej w celu izolacji frakcji SVF, iii) ekspansję hAT-MSCs in vitro oraz iv) przygotowanie formulacji produktu końcowego (tj. produktu leczniczego ATMP-HE). W pierwszym etapie, dotyczącym preparatyki tkanki tłuszczowej prowadzącej do izolacji frakcji SVF, w celu usunięcia potencjalnych zanieczyszczeń mikrobiologicznych oraz usunięcia erytrocytów, lipoaspiraty kilkukrotnie płukano roztworem buforowanej soli fizjologicznej z dodatkiem mieszaniny antybiotyków oraz antymykotyków, co pozwoliło m.in. na uzyskanie pozbawiaonej większości erytrocytów, homogennej frakcji tkanki tłuszczowej. Następnie przeprowadzono optymalizację etapu trawienia enzymatycznego tkanki tłuszczowej poprzez testowanie trzech wybranych aktywności enzymatycznych kolagenazy. Potwierdzono, że aktywność enzymatyczna kolagenazy wynosząca 0,2 P ZU/ml umożliwia efektywną (porównywalną z aktywnością 0,3 P ZU/ml) izolację frakcji SVF przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności komórek (>95%) oraz zapewnieniu stosunkowo wysokiej zdolności wyizolowanych komórek adherentnych do podejmowania aktywnego wzrostu. Co więcej, wybór kolagenazy o aktywności 0,2 P ZU/ml, który to odczynnik jest jednym z najdroższych zużywanych surowców na etapie preparatyki tkanki, pozwolił nieznacznie obniżyć koszt wytworzenia pojedynczego produktu ATMP-HE w porównaniu do najwyższej testowanej aktywności enzymatycznej tego enzymu, tj. 0,3 P ZU/ml. Co istotne, wybrano optymalną aktywność enzymatyczną, a nie stężenie kolagenazy, co ze względu na potencjalne różne odczynniki tego typu dedykowane do GMP, umożliwi utrzymanie efektywności wystandaryzowanego protokołu izolacji w oparciu o tę samą aktywność enzymatyczną kolagenazy. Zastosowanie metody trawienia enzymatycznego tkanki tłuszczowej pozwoliło na zachowanie wysokiej wydajności izolacji SVF, w porównaniu do zastosowania metod nieenzymatycznych, co zostało potwierdzone w licznych doniesieniach naukowych [220,225]. W przypadku zastosowania mechanicznych metod izolacji MSCs z tkanki tłuszczowej, oprócz zmniejszenia wydajności izolacji SVF, czas prowadzenia hodowli komórkowej (czas liczony od momentu izolacji komórek SVF do osiągnięcia pierwszego pasażu komórek) był 2,5-krotnie wydłużony [220], a jak wspomniano uprzednio takie podejście potencjalnie zwiększa koszt wytworzenia produktu końcowego. Co więcej, zastosowanie metody trawienia enzymatycznego zwiększa prawdopodobieństwo izolacji MSCs z ich naturalnej niszy okołonaczyniowej w porównaniu z użyciem metod mechanicznych, których niższa wydajność izolacji komórek może wiązać się z pozostaniem cennej puli MSCs w większych fragmentach tkanek [220,226]. W kolejnym etapie prac objętych niniejszą rozprawą doktorską, wybrano optymalną pożywkę hodowlaną do ekspansji hAT-MSCs – tj. pożywkę αMEM suplementowaną 10% lizatem płytkowym MultiPL’30 (hPL; Macopharma). Ze względu na stanowisko organów nadzorujących (EMA, KCBTiK, GIF) w kwestii suplementowania pożywki hodowlanej czynnikami odzwierzęcymi (w tym surowicą bydlęcą, FBS) oraz stosowania innych produktów pochodzenia zwierzęcego, z którymi to identyfikuje się m.in. ryzyko immunizacji pacjenta poprzez m.in. internalizację białek bydlęcych oraz kwasów sialowych tj. kwas N-glikoliloneuraminowego (Neu5Gc)), czy też potencjalnej transmisji prionów, w niniejszych pracach optymalizacyjnych, jako substytut FBS wybrano ludzki lizat płytkowy (hPL) [228–232]. Należy podkreślić, że pożywka hodowlana zawierająca FBS, przeznaczona typowo do badań laboratoryjnych (R&D), a która jest następnie stosowana do hodowli komórek w celu wytworzenia produktu ATMP, ogranicza zasadniczo możliwość potencjalnej przyszłej aplikacji takiego produktu u pacjentów [233,234]. Ludzki lizat płytkowy, przygotowany w standardzie GMP oraz pozbawiony czynników wirulentnych (tzw. viral inactivated), ze względu na brak składników pochodzenia zwierzęcego, nie budzi obaw dotyczących bezpieczeństwa biologicznego i dlatego prowadzenie hodowli komórkowej w pożywce suplementowanej hPL zapewnia możliwość potencjalnego zastosowania klinicznego wytworzonego preparatu leczniczego [235]. Dodatkowym argumentem za suplementacją pożywki hodowlanej hPL jest zaobserwowane zarówno w tej pracy, jak i przez innych badaczy, skrócenie czasu podwojenia populacji hAT-MSCs [236], co było także obserwowane w przypadku hBM-MSCs [229], a co sprzyja szybkiemu namnażaniu komórek. Co istotne, wykazano, że hPL nie wpływa niekorzystnie na potencjał do różnicowania BM-MSCs w kierunku linii mezodermalnej, ich właściwości immunomodulujące [229] oraz stabilność genetyczną, w porównaniu z komórkami hodowanymi w pożywce suplementowanej surowicą bydlęcą (FBS) [229,237]. Pomimo, że na rynku dostępne są gotowe do użycia pożywki hodowlane wytwarzane w standardzie GMP i dedykowane do hodowli MSCs dla celów aplikacyjnych, które były również przedmiotem badań w niniejszej pracy, na podstawie uzyskanych wyników z przeprowadzonych badań wybrano jednak pożywkę hodowlaną αMEM (Macopharma) suplementowaną 10% hPL (Macopharma), która nie wymagała wprowadzenia dodatkowego etapu opłaszczania naczyń hodowlanych, wymaganego w przypadku innych pożywek, szczególnie bezsurowiczych (tzw. serum free). Skraca to znacznie pracę, jak również poprzez ograniczenie wykonywanych czynności laboratoryjnych (co jest rekomendowane w GMP), częściowo zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia ewentualnego zanieczyszczenia mikrobiologicznego hodowli oraz jest korzystne ze względu na koszt przygotowania pojedynczego produktu końcowego w odniesieniu do pozostałych testowanych pożywek hodowlanych. W następnym etapie badań, wobec braku występowania istotnych różnic dotyczących wpływu testowanych naczyń hodowlanych na czas prowadzenia hodowli komórkowej oraz wydajność samej hodowli na poszczególnych jej etapach (mierzoną jako kumulatywne liczby komórek uzyskanych w czasie hodowli, jaki i liczby hAT-MSCs pozyskiwanych z 1 cm2 powierzchni hodowlanej), zdecydowano o wyborze naczyń hodowlanych firmy Eppendorf, które dodatkowo posiadały zakrętki wyposażone w wysokiej jakości filtry, o średnicy porów 0.2 µm, chroniące przed zanieczyszczeniami biologicznymi, w tym mykoplazmą [141], która stanowi jeden z często spotykanych problemów zakażenia hodowli komórkowej [238]. Po wyborze optymalnych warunków izolacji frakcji SVF oraz hodowli hAT-MSCs, zweryfikowano zasadność ewentualnego, dodatkowego zastosowania rekomendowanego w licznych protokołach izolacji i hodowli MSCs [134–136] - buforu do lizy erytrocytów tzw. ZAPR™ RBC Lysing Buffer (INCELL), w celu dodatkowego oczyszczenia izolowanych frakcji z pozostałych zanieczyszczeń krwinkami czerwonymi. Po zastosowaniu wspomnianego buforu lizującego, wyizolowano wprawdzie bardziej jednorodną frakcję komórek, tj. bardziej oczyszczoną z erytrocytów, która cechowała się jednak mniejszą adhezją do polisterynowych powierzchni naczyń hodowlanych, na co wskazywała obserwacja mikroskopowa, oraz niższą żywotnością - w porównaniu do standardowego protokołu hodowli (tj. z pominięciem etapu lizy RBC). Wyniki te są zgodne z badaniami przeprowadzonymi m.in. przez Li i wsp., w których potwierdzono, że zastosowanie buforu do lizy erytrocytów może zmniejszyć tempo proliferacji hAT-MSCs [64], a jak niektórzy badacze donoszą, stosowane bufory do lizy erytrocytów mogą ponadto wpływać na integralność błony komórkowej traktowanych komórek i tym samym wpływać na ich żywotność [236]. Tym samym, uwzględniając powyższe przesłanki literaturowe oraz wyniki z przeprowadzonych badań oraz mając na celu zapewnienie wysokiej żywotności oraz wydajności ekspansji hAT-MSCs, w celu zastosowań jako produktu leczniczego dla pacjentów, zdecydowano o pominięciu kroku związanego z lizą RBC podczas preparatyki tkanki tłuszczowej oraz nie włączaniu tego kroku to protokołu przygotowania produktu ATMP-HE. Charakterystyka morfologiczna oraz fenotypowa hAT-MSCs została przeprowadzona na pasażu nr 3 i 4, co odpowiada etapowi hodowli hAT-MSCs, w którym pobiera się z niej komórki w celu przygotowania formulacji końcowej produktu ATMP-HE, zgodnie z przyjętą wewnętrzną procedurą Wytwórni pt. Proces wytwarzania ATMP-HE oraz zgodnie z zaleceniami ISCT [24]. Przeprowadzona ocena hAT-MSCs potwierdziła, że wyizolowane komórki posiadają zdolność do adhezji do polisterynowych powierzchni naczyń hodowlanych (TCPS) oraz w warunkach hodowli in vitro hAT-MSCs posiadały wydłużoną wrzecionowatą morfologię, przypominającą fibroblasty, o wysokim potencjale proliferacyjnym in vitro. Natomiast, uzyskane wyniki analizy profilu antygenowego - tj. wysoki odsetek komórek pozytywnych (>94%) pod względem ekspresji markerów komóek mezenchymalnych (CD73, CD90, CD105) oraz niski odsetek (<5%) komórek wykazujących ekspresję markerów komórek hematopoetycznych (CD14, CD19, CD34, CD45) oraz antygenu zgodności tkankowej klasy II (HLA-DR), pozwoliły potwierdzić prawidłowy mezenchymalny fenotyp zdefiniowany dla ludzkich MSCs przez ISCT [24]. Ponadto wykazano potencjał hAT-MSCs do różnicowania w kierunku komórek linii mezodermalnej tj. adipocytów, chondroblastów oraz osteoblastów w warunkach in vitro. Biorąc pod uwagę wskazanie do stosowania opracowanego produktu ATMP-HE dotyczące regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych, zbadano również wpływ bodźców mikrośrodowiskowych, takich jak zawartość tlenu oraz ciśnienia zewnętrznego na potencjał chondrogenny hAT-MSCs in vitro. Należy wziąć pod uwagę, że naturalne mikrośrodowisko chrząstki stawowej charakteryzuje się niską zawartością tlenu (ok. 2-5% O2) [239], jak również podwyższonym ciśnieniem (fizjologiczne wartości mogą dochodzić nawet do blisko 3 PSI), którego wartość docelowa zależna jest od obciążenia aparatu ruchu, na co wpływ ma również waga ciała [240]. W związku z tym, w przeprowadzonych badaniach uwzględniono powyższe warunki, aby zbadać potencjał chondrogenny hAT-MSCs w warunkach bardziej zbliżonych to tych panującej w niszy stawowej. W zastosowanych warunkach obniżonego stężenia tlenu (5% O2) oraz podwyższonego ciśnienia (2 PSI oraz 5 PSI) zaobserwowano najliczniejsze formowanie się rozetek komórkowych o najbardziej zwartej budowie, w porównaniu do standardowych warunków hodowlanych (21% O2, 1 PSI), co może wskazywać na potencjalne promowanie fenotypu chondrogennego hAT-MSCs w tych warunkach in vitro. Otrzymane wyniki potwierdzają także, że uzyskane hAT-MSCs zachowują swój potencjał różnicowania w warunkach odpowiadających niszy tkankowej, do której będą docelowo podawane. Warto zwrócić uwagę, że w powyżej opisanym badaniu wybrana wartość ciśnienia dla normoksji równa 1 PSI podyktowana była przesłankami publikacyjnymi, w których wykazano, że dla standardowych warunków hodowli, dla których stężenie O2 wynosi 20-21%, wyjściowe ciśnienie parcjalne O2 jest równe 160 mmHg [241], przy czym na poziomie komórkowym (z powodu zużycia przez komórki O2) szacuje się, że wartość tego ciśnienia wynosi 20-80 mmHg [242], co odpowiada przedziałowi 0,4-1,5 PSI. Co ciekawe, w badaniach przeprowadzonych przez Pattappa i wsp., podczas różnicowania chondrogennego ludzkich BM-MSCs prowadzonego w warunkach hipoksji wynoszącej 2%O2, obserwowano zwiększenie wydzielania przez te komórki glikozaminoglikanów (GAG) oraz kolagenu typu II (typowych składników ECM chrząstki) - w porównaniu do hodowli tych komórek w warunkach normoksji (20% O2) [239], natomiast w przypadku różnicowania tych komórek w warunkach zadanego zmiennego podwyższonego ciśnienia, po 28 dniach hodowli agregaty BM-MSCs charakteryzowały się istotnym wzrostem zawartości proteoglikanów oraz kolagenu [243]. Natomiast badania przeprowadzone na MSCs z Galarety Warthona wskazują, że poprzez zastosowanie podwyższonego ciśnienia (tj. 2PSI, 5%O2, 37oC) podczas prowadzenia hodowli komórkowej można zwiększyć tempo proliferacji hWJ-MSCs, jak również uzyskać optymalną dawkę terapeutyczną preparatu komórkowego już na wczesnych pasażach, w porównaniu do komórek hodowanych tylko w warunkach hipoksji (1PSI, 5%O2, 37oC) lub w standardowych warunkach hodowlanych (1PSI, 20-21% O2, 5%CO2, 37oC) [244]. Powyższe doniesienia publikacyjne, jak również wyniki własne uzyskane w tej pracy, potwierdzają, że hAT-MSCs wykazują potencjał do różnicowania chondrogennego w warunkach bardziej zbliżonych do panujących w stawie kolanowym, co zwiększa w naszej ocenie możliwość ich zastosowania do regeneracji ubytków kostno-chrzęstnych. Nie mniej jednak, w dalszej perspektywie interesujące byłoby wykonanie dodatkowego panelu badań z użyciem systemu AVATAR w celu określenia w różnicowanych chondrogennie hAT-MSCs ekspresji genów oraz białek, charakterystycznych dla tkanki chrzęstnej / kostnej oraz analizy histologicznej powstałych in vitro agregatów komórkowych, które to badania mogłyby potwierdzić różnicowanie hAT-MSCs w kierunku komórek tkanki chrzęstnej oraz kostnej, jako jeden z mechanizmów działania hAT-MSCs po ich podaniu do uszkodzonego stawu kolanowego. W kolejnym kroku prac badawczych, biorąc pod uwagę doniesienia dotyczące zmiennego sekretomu hAT-MSCs w odpowiedzi na mikrośrodowisko tkankowe [245,246], zweryfikowano profil wydzielniczy tych komórek w różnych warunkach, w tym komórek zawieszonych w roztworze dedykowanym do przygotowania końcowej formulacji produktu ATMP-HE (w skrócie „płyn Ringera” o składzie: płyn Ringera z mleczanami z dodatkiem 2,5% glukozy oraz 1% ludzkiej albuminy), który zoptymalizowano celem podtrzymania wysokiej żywotności tych komórek w produkcie oraz w standardowej pożywce hodowlanej, którą stosowano do ekspansji hAT-MSCs in vitro (αMEM suplementowany 10% hPL). W pierwszy etapie wykazano wysoką aktywność wydzielniczą hAT-MSCs, w porównaniu do komórek bardziej zróżnicowanych, jak fibroblasty skórne (również hodowanych w pożywce αMEM z 10% hPL), szczególnie w odniesieniu do następujących czynników sygnalizacyjnych, jak IL-6 oraz MCP-1. W badaniach przeprowadzonych przez zespół Park i wsp., w których analizowano aż 120 róznych cytokin i innych czynników, podobny profil wydzielniczy jak w niniejszje pracy, obserwowano dla hBM-MSCs hodowanych również w pożywce namnażającej [165]. Najwyższe stężenie cytokin dla hBM-MSCs odnotowano dla IL-6, MCP-1, jak również dla VEGF, IL-8 oraz OPG (osteoprotegeryna), podczas gdy pozostała grupa badanych cytokin występowała w stężeniu będącym na lub poniżej progu detekcji [165]. W przypadku IL-6, postuluje się jej plejotropowe działanie, ponieważ interleukina ta może indukować zarówno mechanizmy anaboliczne (m.in. produkcja macierzy tkanki chrzęstnej), jak i kataboliczne (m.in. hamowanie produkcji lub rozkład kolagenu typu II) w tkance chrzęstnej [247–249]. Typowo, opisuje się szeroko przede wszystkim udział tego czynnika w regulacji procesów zapalnych. Przykładowo, cytokina ta wspomaga proliferację hematopoetycznych komórek progenitorowych, odgrywa kluczową rolę w inicjacji mielopoezy oraz regulacji procesów zapalnych [250]. Co ciekawe, w badanach in vivo przeprowadzonych na myszach dzikich (IL-6 +/+) oraz pozbawionych ekspresji IL-6 (IL-6 -/-), w modelu endotoksycznego uszkodzenia płuc oraz endotoksemii po wziewnej ekspozycji mysz na endotoksynę (LPS), wykazano znacząco wyższe poziomy cytokin prozapalnych (TNF-α oraz białka zapalnego makrofagów 2, MIP-2) u mysz pozbawionyhc ekspresji IL-6 (IL-6 -/-) w porównaniu do mysz IL-6 +/+, przy czym poziomy cytokin przeciwzapalnych (np. IL-10) był podobny w obu grupach tj. u mysz IL-6 +/+ oraz IL-6 -/- [251]. Tym samym autorzy badania sugerują, że IL-6 może odgrywać istotną rolę przeciwzapalną, polegającą na hamowaniu uwalniania cytokin prozapalnych, przy braku istotnego wpływu na produkcję cytokin przeciwzapalnych [251]. Niemniej, w badaniach in vitro przeprowadzonych na mysich chondrocytach traktowanych wysokimi dawkami IL-6 (stężenia tej cytokiny mieściły się w przedziale: 5-100 ng/ml), wykazano wzrost ekspresji MMP-3 oraz MMP-13 [252], których mechanizm działania związany jest z degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki [253]. Należy jednak zwrócić uwagę, że w tym badaniu, zastosowano ponadfizjologiczne stężenie IL-6, co może prowadzić do niekorzystanych efektów obserwowanych w tkance chrzęstnej [252]. Przykładowo, w płynie stawowym pobranym od pacjentów z osteoartrozą, której przebieg związany jest często ze stanem zapalnym lub od pacjentów z ubytkami chrząstki - stężenie IL-6 mieściło się w przedziale 0,001-20 ng/ml [254]. Sugeruje to, że indukowanie lub stosowanie w modelach uszkodzeń tkankowych, stężeń IL-6 ponad poziom obserwowany w stanach zapalnych in vivo, może prowadzić do indukcji efektów typowo nieobserwowanych w tkankach. Co istotne, fizjologiczne stężenia IL-6 podobne do występujących w płynie stawowym, zwykle nie mają niekorzystnego wpływu na ekspresję białek macierzy tkanki chrzęstnej [254]. Działanie przeciwzapalne IL-6 związane jest również z hamowaniem aktywności chemokiny IL-8, co pośrednio wpływa na zahamowanie rekrutacji neutrofili w kierunku ogniska zapalnego lub uszkodzenia tkankowego, przy jednoczesnej aktywacji ekspresji MCP-1 [255]. W światowych badaniach wykazano m.in., że IL-8 bierze udział w procesach włóknienia tkanki łącznej [155], a także różnicowaniu i migracji BM-MSCs [175], co może sprzyjać naprawie tkankowej. Co ciekawe, grupa Yang i wsp. potwierdziła, że IL-8 - poprzez aktywację szlaku sygnałowego PI3k/Akt, w którym pośredniczy białko CXCR2 będące receptorem dla IL-8, indukuje chondrogenne różnicowanie BM-MSCs [245]. Z kolei MCP-1 to chemokina, o której wiadomo, że m.in. aktywuje makrofagi i rekrutuje monocyty do miejsca uszkodzenia tkankowego [156], co może sprzyjać przebudowie tkankowej. Potwierdzają to także wyniki badań, które wykazały, że chemokina MCP-1 wydzielana jest zarówno przez osteoblasty, jak i osteoklasty i tym samym bierze udział w procesach przebudowy kości [256]. Nie znaleziono jednak znaczącej różnicy w stężeniach MCP-1 w surowicy pobranej od zdrowych pacjentów oraz pacjentów z OA [257], co sugeruje konieczność dalszego prowadzenia badań nad ewentualnym udziałem tego czynnika w patogenezie lub przebudowie tkanki chrzęstnej. Analiza opublikowanych badań wskazuje na wielokierunkowe i często przeciwstawne działania badanych w pracy czynników wydzielanych przez hAT-MSCs, co może zależeć m.in. od rodzaju uszkodzenia lub innych procesów toczących się w tkance, rodzaju tkanki, jak również rodzajów komórek obecnych w niszy, które wzajemnie na siebie oddziałują. Rozbieżności jakie zaobserwowano podczas przeglądu literatury dotyczące także różnic w odnotowanych stężeniach badanych cytokin, chemokin jak i czynników wzrostu, co utrudnia często porównanie otrzymanych wyników z doniesieniami publikacyjnymi, mogą także potencjalnie wynikać ze stosowania różnych grup kontrolnych i badanych (np. dobór różnej grupy pacjentów zdrowych jak i chorych czy też pacjentów chirurgicznych, z defektami chrząstki stawowej oraz pacjentów niechirurgicznych z OA), warunków hodowli komórkowej oraz sposobu końcowej prezentacji wyników [257]. Warto zauważyć, że w niniejszej pracy w celu normalizacji otrzymanych wyników oraz uzyskania możliwości porównania grup badanych między sobą, prezentowana aktywność wydzielnicza komórek została przeliczona na 1x106 komórek w jednostce pg/ml] po odjęciu wartości otrzymanych dla tła tj. stosowanych pożywek hodowlanych, w których inkubowano komórki. W pracy Amable i wsp., dotyczącej analizy porównawczej profilu sekrecyjnego różnych typów ludzkich MSCs, w tym hAT-MSCs, aktywność wydzielnicza komórek została także przeliczona na 1x106 komórek, przy czym końcowa prezentacja wyników została wyrażona jako pg/106 komórek/dzień [258]. Warto zwrócić uwagę, że hAT-MSCs inkubowano we wspomnianych doświadczeniach w pożywce α-MEM z zawartością surowicy bydlęcej (10% FBS), co również mogło wpływać na profil wydzielniczy komórek [258]. W badaniach tych wykazano jednak zbieżny poziom IL-6 oraz FGF, z wynikami uzyskanymi w ramach pracy doktorskiej i wynosił on odpowiednio: (i) dla IL-6: 1428.7 ± 113.7 pg/106 AT-MSCs/dzień oraz FGF: 27.0 ± 6.0 pg/106 AT-MSCs/dzień - dla badań przeprowadzonych przez grupę Amble i wsp. [258] (ii) dla IL-6: 1437,96 ± 142,51 pg/ml oraz dla FGF: 19,28 ± 14,36 pg/ml dla hAT-MSCs inkubowanych w roztworze Ringera – dla badań własnych, przeprowadzonych w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej. Niemniej, w przypadku pozostałych analizowanych czynników odnotowano różnice w ich poziomach. Przykładowo, w pracy Amable i wsp. stężenie IL-8 wydzielanej przez hAT-MSCs, hodowane w obecności surowicy bydlęcej (10% FBS), było ponad 7,5 razy wyższe, w porównaniu do wyników niniejszych badań własnych dla hAT-MSCs inkubowanych w płynie Ringera (odpowiednio, 887,5±111,6 pg/106 hAT-MSCs/dzień oraz 115,46±13,11 pg/ml), a także ponad 3,5 razy wyższe w porównaniu z hAT-MSCs inkubowanych w pożywce αMEM z ludzkim lizatem płytkowym (10% hPL), gdzie poziom ten wynosił 242,19 ±7,28 pg/ml. Co ciekawe, stężenie chemokiny RANTES: (i) w badaniach Amable i wsp. wykazano na relatywnie niskim poziomie 5.7 ± 3.6 pg/106 hAT-MSCs/dzień (w pożywce z 10% FBS), podczas gdy (ii) w niniejszej pracy dla hAT-MSCs inkubowanych w αMEM z 10%hPL nie wykazano aktywności wydzielniczej dla tej chemokiny (poniżej progu detekcji metody), a (iii) dla hAT-MSCs inkubowanych w roztworze Ringera (zawierającego m.in. 1% ludzkiej albuminy) poziom ten był znacząco wyższy i wynosił 4588,49 ± 592,119 pg/ml [258]. Tym samym wyniki te potwierdzają zmienną aktywność wydzielniczą hAT-MSCs w zależności od stosowanych warunków hodowli, co może wskazywać na istotny wpływ mikrośrodowiska tkankowego na sekretom komórek [246]. Znaczenie mogą mieć w tym przypadku zarówno czynniki zawarte w zasadniczych komponentach pożywek, czyli surowicy bydlęcej oraz lizacie płytkowym, jak również albumina ludzka, która była istotnym składnikiem nośnika dla hAT-MSCs [259]. Badania donoszą, że ludzkie MSCs eksponowane na albuminę ludzką mogą modulować zapalną odpowiedź innych komórek, w tym komórek kanalików nerkowych, obniżając poziom m.in. cytokin zapalnych [259]. Ekspozycja na albuminę w warunkach in vitro może bowiem zwiększać produkcję szeregu czynników przez MSCs, które mogą działać właśnie w mikrośrodowisku danej tkanki, odpowiedzialne za obniżenie stanu zapalnego w miejscu podania lub w danym układzie badawczym [259]. Ponadto, w badaniach in vivo przeprowadzonych w mysim modelu indukowanej choroby zwyrodnieniowej stawów skroniowo-żuchwowych wykazano, że po zablokowaniu receptora chemokinowego CC typu 1 (CCR1) dla RANTES, migracja BM-MSCs znakowanych uprzednio białkiem zielonej fluorescencji (ang. green fluorescent protein; GFP) w kierunku osteoartrotycznej chrząstki była obniżona w porównaniu do migracji BM-MSCs obserwowanej u myszy, u których nie zastosowano antagonisty (BX471) receptora dla RANTES [159], co wskazuje na udział tej cytokiny w migracji MSCs. Co więcej, u myszy z chorobą zwyrodnieniową stawów skroniowo-żuchwowych, wszczepione BM-MSCs różnicowały do komórek tkanki chrzęstnej, co wykazano na podstawie analizy immunohistochemicznej. Tym samym, badania te pozwoliły wysunąć wniosek, że chemokina RANTES może pełnić istotną rolę w regeneracji tkanek, w tym tkanek uszkodzonych w wyniku choroby zwyrodnieniowej stawów skroniowo-żuchwowych, m.in. poprzez aktywację migracji przeszczepionych komórek [157,159]. Dodatkowo, zaobserwowano także istotny wpływ chemokiny RANTES na przebudowę tkanki kostnej, poprzez aktywację różnicowania MSCs do osteoblastów oraz zahamowanie aktywności osteoklastów [260,261], jak również poprzez rekrutację osteoblastów do uszkodzonego miejsca [262], co może mieć również znaczenie w odbudowie kości podchrzęstnej w uszkodzonym stawie w przebiegu OA. Zatem zwiększona sekrecja tego czynnik przez hAT-MSCs w obecności nośnika (zawierającego płyn Ringera z zawartością 2,5% glukozy oraz 1% ludzkiej albuminy ) może mieć stymulujące działanie na tkanki chrzęsto-kostne po podaniu tych komórek in vivo. Co więcej, zależność związaną z zastosowanymi warunkami hodowlanymi wykazano również dla czynników wzrostu: PDGF-AA, FGF-2, EGF, badanych w niniejszej pracy. Komórki hAT-MSCs inkubowane w roztworze dedykowanym do przygotowania końcowej formulacji produktu ATMP-HE (w płynie Ringera z 2,5% glukozy oraz 1% ludzkiej albuminy) wykazywały aktywność wydzielniczą dla: PDGF-AA, FGF-2, EGF, czego nie wykazano dla hAT-MSCs oraz dojrzałych fibroblastów skórnych inkubowanych w standardowej pożywce hodowlanej (αMEM suplementowanej 10% hPL). Natomiast hAT-MSCs inkubowane zarówno w płynie Ringera, jak i pożywce αMEM z 10% hPL, wydzielały VEGF i G-CSF, przy czym poziomy tych czynników znacznie się różniły. Wykazano bowiem ponad 12-krotnie wyższe poziomy tych czynników dla hAT-MSCs inkubowanych w pożywce αMEM z 10% hPL w porównaniu do hAT-MSCs inkubowanych w płynie Ringera. Co istotne, w przypadku czynników, których wyższą ekspresję obserwowano w przypadku komórek zawieszonych w nośniku produktu ATMP-HE, a zatem w środowisku w którym zostaną docelowo podane u pacjenta, opisano ich aktywność proregeneracyjną w tkance chęstnej. Przykładowa rola tych czynników wzrostu, wiąże się w przypadku PDGF-AA z promowaniem proliferacji i migracji chondrocytów [263], FGF-2 z indukcją proliferacji m.in. komórek błony maziowej [264], co może mieć istotne znaczenie dla poprawy funkcji samej tkanki chęstnej oraz mechaniki całego stawu. Z kolei sygnalizacja od receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), dla którego ligandem jest EGF, pełni kluczową rolę w zachowaniu homeostazy tkankowej, w tym rozwoju chrząstki stawowej poprzez m.in. promowanie ekspresji chondrogennego proteoglikanu (ang. Proteoglycan 4; Prg4) [265]. Z kolei w przypadku czynnika VEGF, znanego głównie z jego aktywności proangiogennej ze względu na oddziaływanie na komórki śródbłonka oraz jego progenitory [266], wykazano, że jego zwiększony poziom w płynie stawowym koreluje z występowaniem OA [267]. Uważa się, że VEGF może być czynnikiem zwiększającym przeżywalność chondrocytów, ale podczas rozwoju embrionalnego, co może mieć zasadnicze znaczenie dla rozwoju tkanki kostno-chrzęstnej oraz wzrostu szkieletu [166]. Jednakże, w badaniach in vivo przeprowadzonych w szczurzym modelu choroby zwyrodnieniowej stawów u dorosłych już zwierząt, wykazano, że dostawowe wstrzyknięcie VEGF przyspieszało degenerację chrząstki stawowej [268]. Co istotne, zastosowana dawka VEGF (0,1 mg/ml) [268] była ponad 3 mln razy wyższa w porównaniu do sekrecji tego czynnika jaką wykazano w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej dla hAT-MSCs inkubowanych w roztworze dedykowanym do przygotowania końcowej formulacji produktu ATMP-HE (dla których wynosiła 30,81 pg/ml). Dodatkowo należy wspomnieć, że rola G-CSF, którego niższe stężenie obserwowano w przypadku zawieszenia hAT-MSCs w nośniku ATMP-HE (w porównaniu z pełną pożywką do ekspansji), jest związane głównie z aktywnością prozapalną i promowaniem proliferacji granulocytów oraz aktywacją komórek szpiku kostnego [256]. Zatem przytoczone doświadczenia innych grup badawczych, mogą świadczyć, że obecność czynników VEGF oraz G-CSF może wręcz niekorzystnie wpływać na stan tkanki chrzęstno-kostnej w rozwoju OA, a zatem ich obniżone stężenie w obecności nośnika komórek w ATMP-HE (tj. płynu Ringera z 2,5% glukozy oraz 1% ludzkiej albuminy) może być pożądane przy dostawowym aplikowaniu hAT-MSCs. Warto również zwrócić uwagę, że stan zapalny związany z degradacją chrząstki wywołaną OA może stanowić stan przejściowy związany z przebudową (ang. remodelling) kości oraz próbą ustanowienia homeostazy tkankowej tj. usunięcia uszkodzonej macierzy poprzez aktywację szklaków proteolitycznych w celu zastąpienia jej nową tkanką [269]. Tym samym, mechanizmy leżące u podstaw aktywności wydzielniczej MSCs, w tym hAT-MSCs wskazują, że w proces regeneracji defektów kostno-chrzęstnych zaangażowanych jest wiele cząsteczek sygnałowych [269–271]. Podsumowując, plejotropowe działanie cytokin, chemokin i czynników wzrostowych oraz zależność poziomu tych czynników sygnałowych od mikrośrodowiska tkankowego, który w przypadku analizy materiału biologicznego może cechować się dużą zmiennością osobniczą oraz może zależeć od przyjętego modelu doświadczalnego stanowi spore wyzwanie w interpretacji uzyskanych wyników. Wobec powyższego, wydaje się, że cennym byłaby możliwość poszerzenia zarówno panelu analizowanych cytokin/chemokin, uwzględniającego zarówno czynniki przeciwzapalne, jak i prozapalne oraz zwiększenie liczby prób analizowanego materiału biologicznego. Ponadto, warto zauważyć, że hAT-MSCs, których sekretom analizowano w niniejszych badaniach wykorzystano również w nieco później opisywanych badaniach chemotaktycznej rekrutacji komórek w gradiencie hSF, jak również w badaniach in vivo, potwierdzając proregeneracyjne właściwości tych komórek. Biorąc pod uwagę również potencjał migracyjny komórek w kierunku czynników obecnych w miejscu toczącego się stanu zapalnego [246,272], w dalszym etapie niniejszej pracy przeprowadzono badania aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs w gradiencie różnych stężeń płynu stawowego, pochodzącego od dawców bez zdiagnozowanej OA oraz dawców ze zdiagnozowaną OA. Przeprowadzone badania potwierdziły aktywną migrację hAT-MSCs w odpowiedzi na czynniki znajdujące w płynie stawowym – wzrastającą wraz ze wzrastającymi stężeniami hSF, przy czym liczba migrujących komórek była nieznacznie wyższa w przypadku inkubacji hAT-MSCs z hSF pochodzącym od dawców ze zdiagnozowaną OA, w porównaniu z dawcami zdrowymi. Może to wskazywać na promowanie aktywności chemotaktycznej hAT-MSCs przez czynniki obecne w niszy komórkowej o cechach zapalnych i tym samym na możliwość lepszego zasiedlenia uszkodzonej tkanki przez hAT-MSCs, co w rezultacie może zwiększać naprawę uszkodzonej tkanki chrzęstno-kostnej u pacjentów z OA [273]. Z drugiej strony, jak sugerują Endres i wsp. na podstawie wykonanych przez siebie badań na frakcji MSCs pochodzących ze szpiku kostnego - nieznaczne różnice w aktywności chemotaktycznej pomiędzy BM-MSCs inkubowanymi z hSF od zdrowych dawców lub od pacjentów z OA mogą sugerować raczej, że mikrośrodowisko choroby zwyrodnieniowej stawów nie zmienia zasadniczo migracji komórek MSCs [274]. Jednocześnie, w niniejszej pracy w celu wyjaśnienia zaobserwowanej wyższej migracji hAT-MSCs w odpowiedzi na płyn stawowy pochodzący od dawców obciążonych OA, a także ze względu na docelowe miejsce dostawowej iniekcji produktu ATMP-HE, porównano profil występowania wybranych cytokin, chemokin oraz czynników wzrostowych w płynie stawowym pochodzącym od obu grup dawców. W przypadku analizy składu molekularnego ludzkiego płynu stawowego, nieznacznie wyższe stężenia następujących badanych czynników: MCP-1, IL-6, VEGF, IFNγ, IL-8, IL-10, TNF-α, obserwowano u pacjentów ze zdiagnozowaną OA, którym towarzyszyła również wyższa wartość BMI, w porównaniu do pacjentów bez zdiagnozowanej OA oraz prawidłowej wartości BMI (prawidłowa waga). Spośród badanych czynników najwyższe stężenie odnotowano dla chemokiny MCP-1, które było ok. 1,5-krotnie wyższe w hSF od dawców z OA w porównaniu z hSF od zdrowych dawców (odpowiednio: 1655,88 ± 658,83 pg/ml vs. 1019,43 ± 225,21 pg/ml). Biorąc pod uwagę wspomniane wysokie stężenie w hSF oraz fakt, że MCP-1 został opisany jako czynniki, który może promować migrację nie tylko komórek jądrzastych krwi obwodowej, ale również MSCs [275], można przypuszczać, że zaobserwowana w niniejszej pracy zwiększona aktywność migracyjna hAT-MSCs w obecności hSF od dawców z OA, może być częściowo zależna od obecności tego czynnika w płynie stawowym. Badania zespołu Bigoni i wsp. wykazały, że na mierzony poziom stężenia cytokin w płynie stawowym mogą mieć również wpływ m.in. płeć i wiek pacjenta, rozległość urazu oraz czasu jaki upłynął od powstałego defektu tkanki [276]. Grupa Ren i wsp. przeprowadzając analizę 250 próbek surowicy i płynu maziowego pobranych od pacjentów z OA z różnych stawów, zwróciła natomiast uwagę na odmienne stężenia takich czynników sygnałowych jak: EGF, FGF-2, IL-8 [277], sugerując jednocześnie na podstawie tych badań, że przebieg OA może wiązać się z różnym przebiegiem stanu zapalnego w zależności od rodzaju dotkniętych stawów (np. staw biodrowy versus staw kolanowy). Wyższe poziomy EGF, FGF-2 oraz IL-8 odnotowano w surowicy pobranej od pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawu biodrowego w porównaniu do stawu kolanowego. Z kolei w przypadku płynu stawowego pobranego od dawców z OA, wyższe stężenia IL-8 oraz MCP-1 obserwowano w hSF pobranym ze stawu kolanowego w porównaniu do hSF pobranego ze stawu biodrowego [277]. Podsumowując, wykazano zbliżone profile cytokin, chemokin oraz czynników wzrostowych obecnych w hSF pochodzących zarówno od dawców bez zdiagnozowanej oraz ze zdiagnozowaną OA, przy czym nieznacznie wyższe stężenia badanych czynników sygnalizacyjnych wykazano w hSF pochodzących od dawców z OA. Wobec braku znacznych różnic w poziomach badanych czynników sygnalizacyjnych pomiędzy zdrowymi dawcami oraz dawcami z OA, można także przypuszczać, że w obu grupach dawców mógł potencjalnie występować stan zapalny [278]. Jednak biorąc pod uwagę małą liczebność próby (trzy powtórzenia biologiczne wykonane dla trzech różnych płynów stawowych pochodzących od niezależnych dawców) obserwowany profil czynników sygnalizacyjnych może też być związany z innymi zmiennymi, np. zależnymi od dawcy, a niezależnymi od stopnia zaawansowania samego schorzenia (OA) [278]. Warto jednak zwrócić uwagę, że potencjalna zmiana składu molekularnego hSF, która może świadczyć o zmianach zachodzących w samej niszy stawowej, gdzie miałby być aplikowany opracowany w niniejszej pracy produkt ATMP-HE, może potencjalnie wpływać na profil sekrecji MSCs i tym samym modulować właściwości biologiczne tych komórek, co wcześniej zostało już wykazane [279]. W pracy Cifù i wsp. potwierdzono, że czynniki o charakterze zapalnym (m.in. TNF-α , IL-1α , IL-1β , IL-6, MMP-3 i MMP-9) obecne w hSF od dawców z OA są niezbędne do promowania immunomodulującego potencjału hAT-MSCs oraz wydzielania przez te komórki chemokin (CCL21, CCL27, CXCL15 i CXCL16), będących chemoatraktantami dla limfocytów T oraz neutrofili [279]. Tym samym potwierdzono, że mikrośrodowisko zapalne (tj. składniki płynu stawowych od dawców z OA) wzmacnia potencjał immunomodulujący hAT-MSCs [279]. Z racji, że medycyna regeneracyjna, w tym inżynieria tkankowa dąży do możliwości wzmocnienia procesów regeneracji uszkodzonych tkanek poprzez zastosowanie połączenia biokompatybilnych rusztowań, z biozgodnych naturalnych bądź syntetycznych biomateriałów, z komórkami w tym komórkami macierzystymi [73,76], w kolejnym kroku niniejszych badań przeprowadzono ocenę wpływu natywnych podłoży grafenowych oraz podłoży grafenowych modyfikowanych jonami złota na potencjał chondrogenny hAT-MSCs. Możliwość modyfikacji powierzchni GO poprzez adsorbcję do ich powierzchni bioaktywnych cząsteczek może stanowić istotne narzędzie w promowaniu kierunkowego różnicowania komórek [280,281] i tym samym wzmocnić potencjał proregeneracyjny komórek, w tym hAT-MSCs [96,97]. Zatem celem jest stworzenie takiej nanostruktury powierzchni biomateriału, która będzie najlepiej naśladować przykładowo macierz zewnątrzkomórkową danej tkanki oraz jej strukturę, a przez to promować adhezję, proliferację czy też kierunkowe różnicowanie się komórek [282], co w konsekwencji może przełożyć się na lepszą integrację takiego konstruktu z docelową tkanką i jego efektywność naprawczą. Przeprowadzona w niniejszej pracy analiza morfologiczna hAT-MSCs hodowanych w standardowej pożywce hodowlanej (αMEM z 10% hPL) na natywnych i modyfikowanych podłożach grafenowych, wykazała zwiększoną adhezję tych komórek do wszystkich badanych podłoży, jak również tworzenie się samoorganizujących się skupisk komórkowych. W innych badaniach wykazano, że taki obraz morfologii komórek, związany z ich zlokalizowaną adhezją do podłoża hodowlanego, może wynikać m.in. z topografii powierzchni podłoży grafenowych [283], na którą wpływa w dużym stopniu nierównomierny rozkład płatków GO typowych dla tego typu podłoży, jak również modyfikacja ich struktury poprzez przyłączenie związków organicznych i nieorganicznych, mającej potencjalny wpływ na indukcję procesu chondrogenezy [284]. Przykładowo, wykazano, że WJ-MSCs hodowane na podłożach GO modyfikowanych nanocząstkami Au (GO+Au) charakteryzowały się wyższą aktywnością migracyjną oraz potencjałem do różnicowania osteogennego w porównaniu do komórek hodowanych na podłożach pokrytych niemodyfikowanym GO w warunkach in vitro oraz in vivo [285]. Co ciekawe, analiza skrawków pobranych z powierzchni grzebietowej szczurów, którym uprzednio wszczepiano podskórnie nanokopozyty GO+Au, wykazała, że tkanki otaczające takie grafty wykazywały niższą zawartość makrofagów typu M1 (tj. o fenotypie prozapalnym i antyangiogennym, CD86+) przy jednoczesnym wyższym poziomie ekspresji makrofagów M2 (tj. o fenotypie przeciwzapalnym i proangiogennym, CD163+) w porównaniu do skrawków pochodzących z powierzchni grzbietowej z wszczepionymi niemodyfikowanymi nanokompozytami GO oraz do skrawków od zwierząt kontrolnych (tj. bez podań graftów GO oraz GO+Au) [285]. Tym samym wyniki te sugerują, że podłoża GO+Au wykazują potencjalnie większą biozgodność immunologiczną i mogą potencjalnie działać przeciwzapalnie poprzez stymulacje polaryzacji makrofagów do fenotypu M2 in vivo. W przeprowadzonych w niniejszej pracy obserwacjach mikroskopowych zauważono, że hAT-MSCs hodowane na podłożach opartych o GO nie tworzą równomiernej monowarstwy, a skupiska komórek o wyższej oraz niższej gęstości, w porównaniu do hodowli na podłożu kontrolnym (TCPS). Podczas takiej stopniowej agregacji hAT-MSCs w mikrociałka, która może być efektem zachodzących procesów chondrogenezy [286], może dochodzić do odziaływania receptorów błonowych (głównie integryn) z białkami ECM [287], jak również wzmożonej syntezy N-kadheryny przez komórki, co skutkuje formowaniem bardziej zbitej formy agregatów komórkowych. W pracy Yang i wsp., przeprowadzono interesujące badanie w warunkach in vitro, polegające na formowaniu struktur komórkowych będących efektem połączeniem BM-MSCs oraz wytworzonej przez te komórki macierzy komórkowej [284]. Struktury te tworzono poprzez wydłużoną hodowlę BM-MSCs (o 10 dni, licząc od momentu osiągnięcia przez hodowlę komórkową konfluencji równej ok. 100%), w celu wytworzenia przez te komórki wystarczającej ilości macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Po tym czasie komórki trypsynizowano, w celu zmiany morfologii komórek z wrzecionowatej na zaokrąglony, przy czym nie dopuszczano do oderwania się komórek od powierzchni naczyń hodowlanych. Po usunięciu trypsyny, takie struktury BM-MSCs-ECM hodowano w pożywce różnicującej komórki w kierunku tkanki chrzęstnej [284]. Analizując ekspresję genów (Sox9, COL2 oraz ACAN) oraz przeprowadzając ocenę histologiczną wytworzonych struktur (tj. agregatów BM-MSCs zawieszonych w wytworzonej przez te komórki macierzy komórkowej), wykazano, że taka hodowla MSCs w agregatach komórkowych promowała proces chondrogenezy oraz formowania się tkanki podobnej do chrząstki szklistej [284]. Ponadto, obserwowana w niniejszej pracy obniżona proliferacja hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych (stopień pokrycia GO 10µg/cm2) przy zachowaniu wysokiej żywotności tych komórek, może wskazywać, jak niektórzy badacze sugerują, na przejściowe zatrzymanie cyklu komórkowego, które jest silnie skorelowane z wytwarzaniem przez te komórki macierzy zewnątrzkomórkowej [200], stanowiącej w przypadku tkanki chrzęstnej główną (95%) komponentę tej tkanki, poza chondrocytami (5% tej tkanki) [288]. Należy jednak również wspomnieć, że niektóre dane literaturowe opisują również toksyczny wpływ związków GO na komórki. Przykładowo, grupa Wang i wsp. wykazała, że GO dodawany bezpośrednio do pożywki hodowlanej w stężeniu nie przekraczającym 20 μg/ml nie miał efektu cytotoksycznego na ludzkie fibroblasty skóry (ang. human dermal fibroblasts; HDF), podczas gdy GO w stężeniu powyżej 50 μg/ml charakteryzował się wysoką cytotoksyczność powodującą spadek adhezji komórek do podłoża oraz wzrost odsetka komórek apoptotycznych [289]. Z kolei grupa Park i wsp. w badaniach biozgodności GO (płatki GO dodawane były bezpośrednio do pożywki hodowlanej), wykazała, że obecność płatków GO w pożywce w stężeniu końcowym powyżej 20 μg/ml obniża żywotność BM-MSCs do wartości poniżej 80% [290]. Warto jednak nadmienić, że badany w niniejszej pracy doktorskiej układ doświadczalny znacząco różnił się od opisywanych w literaturze modeli badawczych zarówno ze względu na odmienne źródło izolacji komórek, jak również rodzaj oraz sposób przygotowania podłoża grafenowego. W przeprowadzonych przez nasz zespół badaniach ukierunkowanych na określenie wpływu różnych rozmiarów płatków, poziomów redukcji jak również stopnia pokrycia podłoża warstwą GO, nie zaobserwowano negatywnego wpływu GO na właściwości biologiczne hUC-MSCs, w tym min. na żywotność, cykl komórkowy, aktywność migracyjną, adhezję komórek, ich mezenchymalny fenotyp), hodowanych na tych podłożach [291,292]. Zatem, wpływ GO na właściwości biologiczne populacji MSCs uzależniony jest m.in. od stosowanego stężenia roztworu GO, ale również jego końcowej formulacji, tj. czy jest dodawany bezpośrednio formie płatków do pożywki hodowlanej, czy stosowany w wersji stałego podłoża, do hodowli komórek [289–292]. W kolejnym kroku, w celu weryfikacji wpływu badanych podłoży grafenowych na fenotyp hAT-MSCs, zbadano profil ekspresji wybranych markerów powierzchniowych charakterystycznych dla MSCs, tj. CD73, CD90 oraz CD105. Wykazano m.in. wysoką ekspresję antygenów: CD73 (98,2±2,5% komórek pozytywnych) oraz CD90 (99,8±0,1% komórek pozytywnych), zgodną z kryteriami dotyczącymi profilu antygenowego MSCs zdefiniowanymi przez ISCT [24]. W przypadku antygenu CD105 (endogliny), stanowiącego receptor klasy II dla VEGF, wykazano nieznacznie obniżoną ekspresję tego antygenu (90,0±8,3% komórek pozytywnych). Co ciekawe, w badaniach in vitro przeprowadzonych na mysich AT-MSCs wyodrębniono dwie subpopulacje komórek różniące się ekspresją tego antygenu, tj. frakcje CD105- oraz CD105+, z których subpopulacja CD105- charakteryzowała się wyższym potencjałem do różnicowania w kierunku osteocytów oraz powodowała hamowanie proliferacji limfocytów T w porównaniu do frakcji CD105+ MSCs [293]. Co istotne, wykazano, że wysoki poziom białka endogliny był charakterystyczny dla chondrocytów pobranych od pacjentów z OA, w porównaniu do chondrocytów pochodzących od pacjentów zdrowych, bez OA [294]. Powyższe wyniki mogą sugerować, że ekspresja markera powierzchniowego CD105 może potencjalnie identyfikować MSCs o większym potencjale chondrogennym, co może mieć znaczenie dla potencjału regeneracyjnego przeszczepionych komórek in vivo. Ponadto, mając na uwadze możliwość zastosowania GO jako podłoża wspierającego różnicowanie hAT-MSCs, zbadano wpływ badanych podłoży grafenowych na indukcję różnicowania hAT-MSCs w kierunku chondroblastów oraz osteoblastów w warunkach in vitro, co mogłoby mieć wpływ na efektywniejsze przygotowanie tych komórek dla celów naprawy i regeneracji defektów kostno-chrzęstnych in vivo. Wyniki z przeprowadzonych badań wskazują na szybsze formowanie się agregatów komórkowych oraz większą liczbę samoorganizujących się kolonii zawierających proteoglikany co obserwowano dla hodowli komórkowej hAT-MSCs prowadzonej w pożywce promującej różnicowanie chondrogenne, w szczególności na podłożach GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au, w porównaniu do hodowli komórkowej prowadzonej w standardowej pożywce hodowlanej na podłożach pokrytych natywnymi oraz modyfikowanymi wersjami GO. Dzięki przeprowadzonym badaniom wykazano pozytywny wpływ GO, w szczególności podłoży GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au, na indukcję procesów chondrogenezy w hAT-MSCs. Z kolei w przypadku różnicowania osteogennego hAT-MSCs, gromadzenie się depozytów wapnia obserwowano w 21 dniu hodowli komórkowej prowadzonej na podłożach grafenowych, przy czym w przypadku hAT-MSCs hodowanych w standardowej pożywce hodowlanej (tj. nieróżnicującej) nie obserwowano formowania się depozytów wapniowych podczas trwania procesu różnicowania. Otrzymane wyniki te są zgodne z doniesieniami publikacyjnymi wskazującymi na potencjalną możliwość zastosowania GO jako rusztowania do różnicowania chondrogennego i osteogennego MSCs [88,199,200]. Wiele grup badawczych wykorzystuje właściwości adsorpcyjne GO, jako narzędzia do dodatkowego zwiększenia potencjału opartych o nie podłoży, do sterowanego różnicowania komórek [295]. Wykazano przykładowo, że poprzez modyfikację powierzchni GO czynnikami stymulującymi różnicowanie osteogenne tj. deksametazonem oraz β-glicerolfosforanem, zwiększono efektywność różnicowania BM-MSCs w kierunku komórek tkanki kostnej, w porównaniu do BM-MSCs hodowanych na podłożach z niemodyfikowanych czystych odmian GO [295]. Doświadczenia te dowodzą, że biomateriały oparte o GO mogą promować różnicowanie MSCs w różne rodzaje komórek somatycznych tj. chondroblasty czy osteoblasty, natomiast możliwość adsorpcji do ich powierzchni dodatkowych bioaktywnych cząsteczek może dodatkowo wzmocnić ich potencjał do promowania właściwości MSCs ważnych z punktu widzenia regeneracji ubytków tkanki chrzęstnej/kostnej [88,199,200,295]. Ponadto, przeprowadzona w niniejszej pracy analiza molekularna profilu ekspresji genów aktywowanych w przebiegu chondrogenezy, w hAT-MSCs, potwierdziła indukcję różnicowania tych komórek w kierunku komórek tkanki chrzęstnej we wszystkich badanych grupach doświadczalnych tj. w hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych zarówno w pożywce kontrolnej, jak i różnicującej. Potwierdzono również, że rodzaj pożywki hodowlanej ma istotny wpływ na poziom ekspresji badanych genów. Co istotne, wykazano również wzrost ekspresji genów pomimo zastosowania standardowej (nieróżnicującej) pożywki dedykowanej do ekspansji komórek MSCs (tzw. pożywka kontrolna), co może wskazywać na pozytywny wpływ samych badanych podłoży grafenowych na indukcję chondrogennego różnicowania hAT-MSCs nawet przy braku obecności induktorów biochemicznych w pożywce. Dla hodowli hAT-MSCs prowadzonej na podłożach grafenowych w pożywce kontrolnej wykazano nieznaczny wzrost ekspresji genów charakterystycznych dla tkanki chrzęstnej, przy czym jedynie dla wczesnego markera chondrogenezy (ACAN) wykazano istotność statystyczną. W przypadku genu Sox9, który odgrywa kluczową rolę w różnicowaniu chondrocytów oraz promuje ekspresję innych genów kodujących białka macierzy chrząstki (tj. COL2A1, ACAN) [296], potwierdzono pozytywną korelację wzrostu ekspresji tego genu ze znamiennie istotnym wzrostem relatywnych poziomów transkryptów dla genów kodujących kolagen typu II (CO2A1) oraz agrekan (Acan) w przypadku hAT-MSCs hodowanych w pożywce różnicującej. Wyniki z powyższych analiz in vitro sugerują, że hAT-MSCs hodowane na podłożach grafenowych, w szczególności GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au, różnicują w kierunku komórek o fenotypie chondroblastów, na co wskazywał istotny wzrost genów Acan (widoczny podczas stosowania zarówno pożywki różnicującej, jak i pożywki kontrolnej), COL2A1 oraz HAPLN1 (niezbędnego do zachowania integralności ECM poprzez stabilizacje kompleksów agrekan-hialuronian [297]) w komórkach hodowanych w pożywce różnicującej. Ponadto, w celu weryfikacji możliwej hipertrofii chondrocytów, co wiąże się m.in. z obniżoną produkcją składników macierzy zewnątrzkomórkowej (agrekan, kolagen) oraz promowaniem mineralizacji tkanki, przeprowadzono również analizę poziomu ekspresji genu fosfatazy alkalicznej (ang. alkaline phosphatase; ALPL). Obserwowano obniżony poziom mRNA dla genu ALPL, co może wskazywać na brak widocznej inicjacji mineralizacji macierzy oraz przerostu (hipertrofii) różnicowanych hAT-MSCs i tym samym wskazywać na przydatność zastosowania podłoży grafenowych, w szczególności GO Graphenea oraz GO Grapehenea+Au, w indukcji różnicowania komórek w kierunku komórek tkanki chrzęstnej. W kolejnym kroku, wykorzystując szczurzy model uszkodzenia chrząstki stawu kolanowego in vivo, zbadano potencjał proregeneracyjny hAT-MSCs różnicowanych na wyselekcjonowanych uprzednio podłożach grafenowych najbardziej sprzyjających promowaniu procesu chondrogenezy (GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au). Wstępna analiza histologiczna preparatów powierzchni stawowych stawu kolanowego szczurów potwierdziła formowanie się tkanki odpowiadającej w obrazie mikroskopowym chrząstce szklistej w grupach szczurów z indukowaną OA, którym podawano następnie preparaty zawierające hAT-MSCs hodowane na podłożu TCPS oraz na podłożach GO Graphenea i GO Graphenea+Au w pożywce różnicującej. Takich obszarów tkanki szklistej nie obserwowano zasadniczo w przypadku zwierząt kontrolnych, czyli z uszkodzoną chrząstką, którym podawano nośnik hAT-MSCs tj. roztwór buforowanej soli PBS. Co istotne, w przypadku podania preparatów komórkowych, zawierających hAT-MSCs hodowane zarówno w pożywce kontrolnej jak i różnicującej na TCPS oraz różnicowanych na podłożach grafenowych, można było wyróżnić w tkankach chondroblasty pogrupowane w klastry, co wskazuje na formowanie się chrząstki włóknistej, ale co istotne również chondroblasty otoczone zagęszczoną substancją międzykomórkową tzw. macierzą terytorialną, charakterystyczną dla chrząstki szklistej. Porównując nowopowstałą tkankę chrzęstną, całkowita grubość jej warstwy była wyższa u szczurów, którym podano preparaty zawierające hAT-MSCs różnicowane na podłożach grafenowych oraz TCPS w porównaniu do zwierząt, którym podano hAT-MSCs hodowane w warunkach kontrolnych (tj. bez stymulacji czynnikami pożywki, ani podłożem). Tym samym, wykazano, że zarówno natywne jak i hodowane na podłożach grafenowych hAT-MSCs mogą potencjalnie wspierać odbudowę uszkodzonej tkanki chrzęstnej in vivo, co wymaga jednak dalszych badań. Należy wspomnieć, że w ramach przedstawionych badań objętych w/w ekskrementem na zwierzętach, wykonany został także , już poza obrębem niniejszej pracy doktorskiej, panel doświadczeń behawioralnych na szczurach z indukowaną chemicznie OA, przeprowadzony przez zespół Profesor Katarzyny Starowicz-Bubak (Zakład Neurochemii, Instytut Farmakologii im. Jerzego Maja Polskiej Akademii Nauk w Krakowie), konsorcjanta projektu STRATEGMED3. We wszystkich badanych grupach u szczurów po indukcji OA, którym aplikowano dostawowo m.in. hAT-MSCs hodowane zarówno w standardowej pożywce hodowlanej, jak i różnicowane uprzednio na podłożach grafenowych (tj. GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au), potwierdzono zahamowanie rozwoju reakcji bólowej w porównaniu do szczurów kontrolnych z uszkodzoną chrząstką oraz podaniem neutralnego nośnika komórek, u których obserwowano stopniowy wzrost rozwoju reakcji bólowej [298]. Autorzy doświadczenia postulują, że podane preparaty komórkowe wspomagały regenerację chrząstki stawowej, a w konsekwencji ograniczały rozwój reakcji bólowej [298]. Wyniki te dodatkowo potwierdzają proregeneracyjne właściwości zarówno natywnych hAT-MSCs, jak i hAT-MSCs hodowanych na podłożach grafenowych (GO Graphenea oraz GO Graphenea+Au) i zostaną wkrótce opublikowane po przeprowadzeniu dodatkowych badan molekularnych na materiale tkankowym pozyskanym od wymienionych grup zwierząt. W oparciu o prace badawcze przeprowadzone w laboratorium typu „research grade”, w dalszym etapie przystąpiono do realizacji fazy implementacyjnej, która w pierwszej kolejności polegała na opracowaniu dokumentacji wytwarzania produktu ATMP-HE zawierającego hAT-MSCs jako substancję aktywną i obejmowała m.in. zdefiniowanie kryteriów akceptacji (m.in. limitów ilościowych, wyników z obserwacji mikroskopowej oraz innych parametrów pozwalających na kontynuację prowadzenia hodowli komórkowej i tym samym operacji wytwórczych) dla poszczególnych etapów procesu wytwarzania produktu leczniczego. Zgodnie z zaprojektowanym procesem wytwarzania i obowiązującymi regulacjami prawnymi [115,118,122–124,129,130,132], tkanka źródłowa zastosowana do izolacji hAT-MSCs (tzw. materiał wyjściowy), pobierana była wyłącznie od dawców posiadających negatywne wyniki następujących badań laboratoryjnych: HIV, HBV, HCV i kiła, co umożliwia, po weryfikacji spełnienia wymagań jakościowych, zwolnienie materiału wyjściowego do procesu wytwarzania - zgodnie z przyjętą specyfikacją jakościową tkanki źródłowej obejmującą m.in. właściwą liczbę komórek, żywotność, jałowość oraz brak obecności endotoksyn bakteryjnych w materiale wyjściowym. Następnie wykonano walidację procesu wytwarzania produktu ATMP-HE, której przeprowadzenie jest obligatoryjne i pozwala podjęcie działalności wytwórczej, po wydaniu stosownych zgód przez organy nadzorujące [299]. Otrzymane wyniki z badań analitycznych przeprowadzonych podczas walidacji procesu potwierdziły, że wytworzone trzy serie produktu ATMP-HE spełniają wszystkie wymagania jakościowe i kryteria akceptacji tj. zachowanie prawidłowej morfologii oraz wysokiej żywotności hAT-MSCs (97,3±0,9%), zawieszonych w końcowej formulacji produktu końcowego. Wykonany przez stosowny podmiot zewnętrzny - zgodnie z przyjętą metodyką zawartą w monografii 2.6.1 Jałowość Farmakopei Europejskiej - posiew mikrobiologiczny, potwierdził jałowość produktu końcowego. Podobnie badania w kierunku ew. występowania w produkcie endotoksyn bakteryjnych - wykonane także zgodnie z monografią Farmakopei Europejskiej: 2.6.14 Endotoksyny bakteryjne, wykazały brak przekroczenia limitów tychże i tym samym produkt końcowy został uznany za wolny od endotoksyn bakteryjnych. Niemniej, ze względu na krótki okres ważności produktu komórkowego, który wynosi średnio od 18 do 36 godz. [300,301] oraz długi okres oczekiwania na wyniki z badań mikrobiologicznych (do 14 dni), zwolnienie tak wytworzonego produktu, czyli jego wydanie do aplikacji u pacjenta bezpośrednio po zakończeniu hodowli komórkowej, odbywało się przed uzyskaniem wyników z badań jałowości oraz oznaczenia poziomu endotoksyn bakteryjnych, ale na podstawie wyników z badań mikrobiologicznych materiału wyjściowego (tkanki tłuszczowej) oraz kontroli międzyoperacyjnych prowadzonej hodowli hAT-MSCs. Należy bowiem podkreślić, że w ramach zminimalizowania ryzyka wydania potencjalnie zanieczyszczonego mikrobiologicznie produktu ATMP-HE, w celu sprawdzenia sterylności prowadzonej hodowli komórkowej istnieje możliwość pobrania materiału (tj. zawiesiny komórkowej) na badania mikrobiologiczne prowadzone w trakcie namnażania [300], przy czym wyniki z takich badań nie stanowią potwierdzenia braku występowania tego typu zanieczyszczeń w produkcie końcowym oraz nie zwalniają Wytwórcy z obowiązku wykonywania badań sterylności dla produktu końcowego zgodnie z Farmakopeą Europejską [300]. W celu wyeliminowania ryzyka wydania produktu potencjalnie zanieczyszczonego mikrobiologicznie można wdrożyć do procesu wytwarzania etap krioprezerwacji produktu ATMP-HE. W takim schemacie, dopiero po uzyskaniu ujemnych wyników z badań mikrobiologicznych dla produktu końcowego, produkt ATMP-HE mógłby zostać wydany do potencjalnego zastosowania aplikacyjnego. Warto jednak zauważyć, że opracowanie procedur krioprezerwacji produktu ATMP-HE wymaga przeprowadzenia dodatkowych badań potwierdzających m.in. długoterminową stabilność przechowywanego produktu uwzględniając takie parametry jak brak znaczącego spadku żywotności przy zachowaniu właściwości biologicznych komórek czy też potwierdzenie jego stabilności chromosomalnej [302,303], co nie zostało uwzględnione w niniejszej pracy. W badaniach przeprowadzonych przez Pogozhykh i wsp. na podstawie analizy cytometrycznej wykazano, że po 7 dniach krioprezerwacji mezenchymalnych komórek podścieliska owodni (hAMSC) w liczbie 1x105 zawieszonych w soli fizjologicznej z dodatkiem 10% dimetylosulfotlenku (DMSO), żywotność hAMSC spadła o około 58,6±5,2%, podczas gdy w roztworze Ringera zawierającym także 10% DMSO, jak również roztworze soli Henksa z 10% DMSO - żywotność hAMSC spadła średnio o 34,2±2,95% [304]. Z kolei grupa Kumar i wsp. wykazała, że długoterminowa krioprezerwacja (przez okres nawet 12 lat, w temperaturze -191oC) hAT-MSCs w liczbie 1x106, zabezpieczonych w roztworze zawierającym DMEM-Ham’s F12 z dodatkiem 20% FBS i 10% DMSO, nie wpłynęła na żywotność komórek, która średnio wynosiła powyżej 80% (w przedziale 69-92% zależnie od dawcy materiału), jak również nie zmieniła potencjału do różnicowania w kierunku komórek mezodermy oraz utrzymanie fenotypu mezenchymalnego [305]. Zatem żywotność MSCs uzależniona jest w dużej mierze od stosowanego krioprotektanta [306], przy czym krioprezerwacja MSCs nie wpływa na ich właściwości biologiczne [306,307]. Przykładowo, w badaniach in vivo przeprowadzonych na szczurach poddanych zabiegowi meniscektomi (usunięcia łąkotki przyśrodkowej) wykazano, że dostawowa aplikacja 1x106 niemrożonych mezenchymalnych komórek błony maziowej, jak również aplikacja tej samej dawki rozmrożonych komórek, po wcześniejszej krioprezerwacji, wywierała porównywalny hamujący wpływ na progresję OA [307]. W niniejszej rozprawie przygotowanie produktu ATMP-HE zgodnie z przyjętymi protokołami objętymi systemem zapewnienia jakości (SZJ) wytwórni, nie zakładało etapu krioprezerwacji hAT-MSCs. Bankowanie produktu pośredniego (tj. zawiesiny komórek pobranej na etapie prowadzenia hodowli komórkowej) lub produktu końcowego (tj. produktu gotowego do użycia w celach leczniczych) stanowi często kolejny etap procedury wytwarzania produktu terapii komórkowej [308]. Etap ten jest zależny od przyjętej strategii przygotowania i zwolnienia końcowej formulacji produktu do zastosowania u pacjenta tj. produkt przygotowywany i wydany bezpośrednio po zakończeniu hodowli komórkowej lub wydanie produktu mrożonego. Nie mniej, ze względu na złożoność logistyki związanej z przygotowaniem produktu ATMP-HE i w tym samym czasie koniecznością gotowości pacjenta do zabiegu, etap krioprezerwacji jest warty rozważenia i wdrożenia w czasie przyszłych działań w wytwórni. W ramach przeprowadzonych badań stabilności produktu końcowego, które miały na celu analizę m.in. żywotności komórek w docelowym nośniku i tym samym określenie terminu przydatności tak przygotowanego preparatu komórkowego zawierającego jako substancję aktywną hAT-MSCs, potwierdzono zachowanie wysokiej żywotności komórek (>96%) przez 24 godz. w temperaturze 2-8oC, w optymalnie dobranym nośniku dla zawiesiny hAT-MSCs (płyn Ringera z dodatkiem 2,5% glukozy oraz 1% albuminy ludzkiej) oraz w przyjętej gęstości przygotowanej zawiesiny komórkowej (1x106 hAT-MSCs/ 1ml). Tym samym określono 24-godzinną przydatność produktu do użycia przy zapewnieniu warunków przechowywania produktu w temperaturze 2-8oC. Otrzymane wyniki badania stabilności produktu ATMP-HE są zgodne wynikami ujętymi w metaanalizie doniesień publikacyjnych (n=826) [309], w których najwyższą żywotność odnotowano dla MSCs zawieszonych w komercyjnie dostępnym roztworze HypoThermosol FRS oraz roztworze Ringera suplementowanym 1% HSA, która wynosiła średnio odpowiednio 92,5% oraz 85,6%, po 24 godzinach przechowywania w temperaturze 4°C [309]. Co ciekawe, wykazano, że stabilność produktu leczniczego jest również silnie skorelowana z liczbą komórek zawieszonych w docelowym nośniku. W gęstych zawiesinach komórkowych (33,3 x 106/1ml) obserwowano tendencję do zwiększania agregacji komórek w porównaniu do zawiesiny komórkowej o mniejszej gęstości (14,3 x 106/1ml), co ostatecznie istotnie wpływało na żywotność oraz potencjał migracyjny komórek [309,310]. Podsumowując, otrzymane wyniki z badań stabilności produktu ATMP-HE potwierdzają zachowanie wysokiej żywotności hAT-MSCs w docelowym nośniku, która stanowi jeden z kluczowych parametrów produktu leczniczego, o znaczeniu dla skuteczności zastosowanej terapii komórkowej. Ostatecznie opracowany w niniejszej pracy doktorskiej protokół wytwarzania produktu ATMP-HE wraz z pozostałymi procedurami SZJ oraz przygotowaniem Wytwórni (laboratorium typu cleanroom) do wytwarzania produktów ATMP-HE, otrzymał pozytywne rekomendacje KCBTiK oraz GIF, tj. odpowiednio pozwolenie na gromadzenie, przechowywanie oraz dopuszczenie do obiegu materiału wyjściowego, czyli tkanki tłuszczowej (zgodnie z Ustawą transplantacyjną) oraz zgodę na wytwarzanie produktu ATMP-HE (zgodnie z Ustawą Prawo farmaceutyczne) [129,130]. Należy jednak zaznaczyć, że badania i działania przeprowadzone w ramach realizacji niniejszego doktoratu wdrożeniowego stanowią wstępne wyniki i działania, które nie upoważniają jeszcze wytwórni produktów ATMP-HE (JCI w Krakowie) do rutynowego zwalniania produktu ATMP-HE w celu jego zastosowania u pacjenta. Zastosowanie produktu ATMP-HE wymaga podjęcia odpowiedniej decyzji przez lekarza oraz pozyskania zgody Komisji Bioetycznej na przygotowanie produktu komórkowego przez wytwórnię GMP oraz na jego zastosowanie u konkretnego pacjenta, w konkretnym wskazaniu. Aby móc stosować rutynowo produkt leczniczy oparty o komórki, niezbędne jest przeprowadzenie dobrze zaplanowanych i zorganizowanych badań klinicznych tzw. badanego produktu leczniczego terapii zaawansowanej (ang. Advanced Therapy Investigational Medicinal Product; ATIMP), których wyniki stają się podstawą do rejestracji produktu, jako leku. Jak opisano w pracy Lechanteur i wsp. liczba badań produktu komórkowego może być znacznie szersza i wykonywana zarówno w Wytwórni (m.in. badania mikrobiologiczne, żywotność, fenotyp, kariotyp) jak również w ośrodku aplikującym produkt (m.in. żywotność, sterylność) [308]. Możliwe jest również przeprowadzenie dodatkowych badań produktu, w tym aktywności telomerazy [311] oraz stabilności chromosomalnej (badanie kariotypu) na próbce referencyjnej wytwarzanego produktu terapii komórkowej [311]. Ponadto, w przypadku tego typu produktów (produkt ATIMP) zaleca się prowadzenie kontroli mikrobiologicznej preparatu komórkowego, której zakres obejmuje: sterylność na zgodność z Ph.Eur. 2.6.1, obecność endotoksyn na zgodność z Ph.Eur. 2.6.14 oraz dodatkowo zakażenie mykoplazmą na zgodność z Ph.Eur. 2.6.7 [311]. Reasumując, w przeprowadzonych badaniach zaprezentowano podejście procesowe umożliwiające wdrożenie zoptymalizowanych procedur wytwarzania produktu ATMP-HE do Wytwórni biologicznych produktów komórkowych. Podczas realizacji niniejszej pracy doktorskiej, opracowano wydajne protokoły izolacji frakcji SVF z ludzkiej tkanki tłuszczowej oraz ekspansji hAT-MSCs przy zastosowaniu odczynników i materiałów zgodnych z wymogami GMP (tj. posiadających odpowiednie certyfikaty jakości i/lub wytwarzane w standardzie GMP), które zostały wdrożone i zwalidowane w Banku Tkanek i Komórek oraz Wytwórni - Laboratorium Tkanek i Komórek Jagiellońskiego Centrum Innowacji w Krakowie. Ponadto, biorąc pod uwagę charakter prowadzonej rozprawy doktorskiej realizowanej w ramach programu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego pt. „Doktorat Wdrożeniowy”, po opracowaniu protokołu wytwarzania preparatu komórkowego oraz towarzyszącej mu dokumentacji miejsca wytwarzania (SZJ), złożono wnioski do odpowiednich urzędów (CAT, KCBTiK, GIF) oraz po audytach/inspekcjach w/w urzędów w miejscu wytwarzania (Laboratorium Tkanek i Komórek Jagiellońskiego Centrum Innowacji) uzyskano pozytywne decyzje i zgody w/w instytucji, tj: pozwolenie na gromadzenie, przechowywanie oraz dopuszczenie do obiegu tkanki tłuszczowej oraz zgoda na wytwarzanie produktu ATMP-HE dla potrzeb regeneracji defektów kostno-chrzęstnych. Co więcej, mając na uwadze próbę optymalnego odtworzenia funkcji chrząstki stawowej oraz regenerację miejsc ubytków, w celu potencjalnego wzmocnienia potencjału chondrogennego hAT-MSCs wykorzystano biokompatybilne natywne i modyfikowane podłoża grafenowe. Na podstawie przeprowadzonych analiz wykazano m.in, że podłoża grafenowe natywne i modyfikowane nanocząstkami Au, mogą indukować różnicowanie hAT-MSCs w kierunku komórek tkanki chrzęstnej in vitro. Ponadto, we wstępnych badaniach przeprowadzonych w szczurzym modelu indukowanego chemicznie uszkodzenia chrząstki stawu kolanowego in vivo, wykazano potencjał proregeneracyjny hAT-MSCs, w tym udział w formowaniu się tkanki chrzęstnej szklistej. Podsumowując, rezultaty uzyskane w ramach realizacji niniejszej rozprawy doktorskiej mogą w dalszej perspektywie stanowić punkt odniesienia przy przyszłym rozwijaniu produktów leczniczych terapii zaawanasowanych opartych o ludzkie MSCs, dla uszkodzeń tkanki chrzęstnej oraz wskazują na złożoność ścieżki merytorycznej oraz formalno-prawnej wymaganej w celu uzyskania w możliwości prowadzenia terapii eksperymentalnych wykorzystujących preparaty zawierające żywe komórki, jako substancję leczniczą. Ponadto przeprowadzony panel doświadczeń na podłożach opartych o związki grafenu może przyczynić się do przyszłego potencjalnego zastosowania tych materiałów, w celu zwiększenia potencjału proregeneracyjnego ludzkich komórek MSCs, co wymaga jednak dalszych badań. 6. PODSUMOWANIE WYNIKÓW I WNIOSKI KOŃCOWE W ramach działań badawczych niniejszej rozprawy doktorskiej uzyskano m.in. następujące wyniki oraz osiągnięcia związane z realizacją przeprowadzonych badań: 1. Opracowano protokoły izolacji frakcji SVF z ludzkiej tkanki tłuszczowej oraz ekspansji hAT-MSCs przy wykorzystaniu materiałów i odczynników w standardzie GMP lub przeznaczonych do zastosowań klinicznych, zgodnie z wymogami Dobrej Praktyki Wytwarzania, dla celów potencjalnego zastosowania w naprawie tkankowej. 2. Potwierdzono tożsamość uzyskanych hAT-MSCs, jako frakcji MSCs identyfikowanej i definiowanej zgodnie z przyjętymi wytycznymi towarzystwa ISCT, tj. jako frakcję adherentną, o fibroblastopodobnej morfologii, ekspresji o zestawu antygenów powierzchniowych typowych dla ludzkich MSCs oraz zdolności do różnicowania do komórek linii mezodermalnej in vitro. 3. Wykazano, że aktywność wydzielnicza hAT-MSCs obejmująca także czynniki potencjalnie uczestniczące w naprawie tkankowej, a także czynniki zapalne, jest zależna od warunków hodowlanych, co może wskazywać na istotny wpływ hodowli in vitro oraz mikrośrodowiska tkankowego na profil wydzielniczy hAT-MSCs w miejscu podania in vivo. 4. Wykazano zwiększoną aktywność chemotaktyczną hAT-MSCs w kierunku czynników obecnych w płynie stawowym, w szczególności pochodzącym od pacjentów z OA, w warunkach in vitro, co może wskazywać na zwiększoną aktywność migracyjną hAT-MSCs w środowisku objętym stanem zapalnym. 5. Wykazano, że podłoża oparte o tlenek grafenu (GO) są biozgodne dla hAT-MSCs oraz mogą indukować różnicowanie w kierunku komórek tkanki chrzęstnej in vitro. 6. Wykazano, że hAT-MSCs różnicowane na podłożach grafenowych natywnych oraz modyfikowanych nanocząstkami złota (Au) wykazują wyższą ekspresję genów związanych z chondrogenezą (SOX9, COL2A1, ACAN oraz HAPLN1). 7. Wykazano wstępnie, potencjał proregeneracyjny hAT-MSCs natywnych, jak również hodowanych na podłożach grafenowych, w warunkach in vivo w szczurzym modelu uszkodzenia chrząstki stawowej. 8. Potwierdzono spełnienie wymagań jakościowych i kryteriów akceptacji dla trzech serii produktu ATMP-HE, wytworzonego w ramach walidacji procesu w Wytwórni produktów ATMP. Najważniejsze wnioski: 1. Opracowany w ramach niniejszej pracy doktorskiej produkt ATMP-HE może stanowić potencjalny produkt leczniczy terapii komórkowej przeznaczony do regeneracji ubytków chrząstki stawowej oraz może stanowić produkt wyjściowy do opracowania produktów ATIMP dla do przyszłych badań klinicznych. 2. Podłoża oparte o tlenek grafenu (GO), ze względu na promowanie różnicowania chondrogennego hAT-MSCs, mogą potencjalnie zostać wykorzystane jako podłoża stymulujące różnicowanie hAT-MSCs w kierunku komórek tkanki chrzęstnej, przed ich zastosowaniem dla celów naprawy wspomnianej tkanki w warunkach in vivo. W ramach działań organizacyjnych podjętych w czasie realizacji części wdrożeniowej niniejszej pracy doktorskiej, po opracowaniu zoptymalizowanego protokołu wytwarzania produktu ATMP-HE (o którym mowa w pkt.1), przygotowano dokumentację oraz System Zapewnienia Jakości w celu uzyskania zgody KCBTiK na prowadzenie działalności w zakresie gromadzenia, przechowywania oraz dopuszczenia do obiegu podskórnej tkanki tłuszczowej oraz zgody GIF na wytwarzanie produktu ATMP-HE dla Laboratorium Hodowli Tkanek i Komórek Jagiellońskiego Centrum Innowacji w Krakowie (tj. firmy uczestniczącej w realizacji niniejszego doktoratu wdrożeniowego) 7. SPIS PIŚMIENNICTWA 1. Bindu H, Stem Cell Res Ther J, Bindu HA. Potency of Various Types of Stem Cells and their Transplantation. J Stem Cell Res Ther Cit Hima Bind A, Srilatha B. 2011;1: 115. doi:10.4172/2157-7633.1000115 2. Zakrzewski W, Dobrzyński M, Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther 2019 101. 2019;10: 1–22. doi:10.1186/S13287-019-1165-5 3. Kolios G, Moodley Y. Introduction to Stem Cells and Regenerative Medicine. Respiration. 2013;85: 3–10. doi:10.1159/000345615 4. Ratajczak MZ, Zuba-Surma EK, Wysoczynski M, Wan W, Ratajczak J, Kucia M. Hunt for Pluripotent Stem Cell – Regenerative Medicine Search for Almighty Cell. J Autoimmun. 2008;30: 151. doi:10.1016/J.JAUT.2007.12.003 5. Antman EM, Givertz MM, Josephson ME, de Lemos J, Oparil S, Sacks FM, editors. Gene Therapies and Stem Cell Therapies. Third Edit. Cardiovascular Therapeutics. Elsevier Inc.; 2007. doi:10.1016/B978-1-4160-3358-5.50009-7 6. Klimczak A, Kozlowska U. Mesenchymal stromal cells and tissue-specific progenitor cells: Their role in tissue homeostasis. Stem Cells Int. 2016;2016. doi:10.1155/2016/4285215 7. Goldberg NRS, Blurton-Jones M. Can Stem Cells Be Used to Enhance Cognition? Knafo S, Venero C, editors. Cognitive Enhancement: Pharmacologic, Environmental and Genetic Factors. Academic Press; 2015. doi:10.1016/B978-0-12-417042-1.00008-5 8. Haas S, Trumpp A, Milsom MD. Causes and Consequences of Hematopoietic Stem Cell Heterogeneity. Cell Stem Cell. 2018;22: 627–638. doi:10.1016/J.STEM.2018.04.003 9. Visvader JE, Clevers H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nat Cell Biol 2016 184. 2016;18: 349–355. doi:10.1038/ncb3332 10. Klimczak A, Kozlowska U, Kurpisz M. Muscle Stem/Progenitor Cells and Mesenchymal Stem Cells of Bone Marrow Origin for Skeletal Muscle Regeneration in Muscular Dystrophies. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66: 341. doi:10.1007/S00005-018-0509-7 11. Lin R-Z, Moreno-Luna R, Li D, Jaminet S-C, Greene AK, Melero-Martin JM. Human endothelial colony-forming cells serve as trophic mediators for mesenchymal stem cell engraftment via paracrine signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111: 10137. doi:10.1073/PNAS.1405388111 12. Hooper CES. Cell turnover in epithelial populations. J Histochem Cytochem. 1956;4: 531–540. doi:10.1177/4.6.531 13. Ciemerych MA. Zarodkowe komórki macierzyste w poszukiwaniu pluripotencji. Postępy Biol Komórki. 2008;35: 183–205. 14. Zhang Y, Atala A. Regenerative Medicine of the Bladder. Principles of Regenerative Medicine. Academic Press; 2019. pp. 1263–1279. doi:10.1016/B978-0-12-809880-6.00072-2 15. Gurusamy N, Alsayari A, Rajasingh S, Rajasingh J. Adult Stem Cells for Regenerative Therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 2018;160: 1–22. doi:10.1016/BS.PMBTS.2018.07.009 16. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 2006;126: 663–676. doi:10.1016/J.CELL.2006.07.024 17. Weissman IL. Stem Cells: Units of Development, Units of Regeneration, and Units in Evolution. Cell. 2000;100: 157–168. doi:10.1016/S0092-8674(00)81692-X 18. Hentze H, Soong PL, Wang ST, Phillips BW, Putti TC, Dunn NR. Teratoma formation by human embryonic stem cells: Evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2009;2: 198–210. doi:10.1016/J.SCR.2009.02.002 19. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 2006;126: 663–676. doi:10.1016/J.CELL.2006.07.024 20. Elahi KC, Klein G, Avci-Adali M, Sievert KD, Macneil S, Aicher WK. Human Mesenchymal Stromal Cells from Different Sources Diverge in Their Expression of Cell Surface Proteins and Display Distinct Differentiation Patterns. 2016 [cited 4 Aug 2021]. doi:10.1155/2016/5646384 21. Xiang M, Lu M, Quan J, Xu M, Meng D, Cui A, et al. Direct in vivo application of induced pluripotent stem cells is feasible and can be safe. Theranostics. 2019;9: 290–310. doi:10.7150/THNO.28671 22. Xin L, Li W, Fu X, Xu Y. The Immunogenicity and Immune Tolerance of Pluripotent Stem Cell Derivatives. Front Immunol. 2017;8: 645. doi:10.3389/FIMMU.2017.00645 23. Liu a Z, Tang Y, Lu S, Jin Z, Du Z, Duan C, et al. The tumourigenicity of iPS cells and their differentiated derivates. J Cell Mol Med. 2013;17: 782–791. doi:10.1111/JCMM.12062 24. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Krause DS, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8: 315–317. doi:10.1080/14653240600855905 25. Berebichez-Fridman R, Montero-Olvera PR. Sources and clinical applications of mesenchymal stem cells state-of-the-art review. Sultan Qaboos Univ Med J. 2018;18: e264–e277. doi:10.18295/squmj.2018.18.03.002 26. Labedz-Maslowska A, Bryniarska N, Kubiak A, Kaczmarzyk T, Sekula-Stryjewska M, Noga S, et al. Multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells—impact of 3d and hypoxic environment on osteogenesis in vitro. Int J Mol Sci. 2020;21: 1–28. doi:10.3390/ijms21176172 27. Han Y, Li X, Zhang Y, Han Y, Chang F, Ding J. Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Cells. 2019;8: 886. doi:10.3390/cells8080886 28. El-Badawy A, Amer M, Abdelbaset R, Sherif SN, Abo-Elela M, Ghallab YH, et al. Adipose stem cells display higher regenerative capacities and more adaptable electro-kinetic properties compared to bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Sci Rep. 2016;6: 1–11. doi:10.1038/srep37801 29. Raposio E, Simonacci F, Perrotta RE. Adipose-derived stem cells: Comparison between two methods of isolation for clinical applications. Ann Med Surg. 2017;20: 87. doi:10.1016/J.AMSU.2017.07.018 30. Thitilertdecha P, Lohsiriwat V, Poungpairoj P, Tantithavorn V, Onlamoon N. Extensive Characterization of Mesenchymal Stem Cell Marker Expression on Freshly Isolated and In Vitro Expanded Human Adipose-Derived Stem Cells from Breast Cancer Patients. Stem Cells Int. 2020;2020. doi:10.1155/2020/8237197 31. Ganguly P, El-Jawhari JJ, Burska AN, Ponchel F, Giannoudis P V., Jones EA. The Analysis of in Vivo Aging in Human Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Using Colony-Forming Unit-Fibroblast Assay and the CD45lowCD271+ Phenotype. Stem Cells Int. 2019;2019. doi:10.1155/2019/5197983 32. Zhang Y, Ravikumar M, Ling L, Nurcombe V, Cool SM. Age-Related Changes in the Inflammatory Status of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Cell Therapy. Stem Cell Reports. 2021;16: 694–707. doi:10.1016/J.STEMCR.2021.01.021 33. Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: Differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp Cell Res. 2001;268: 189–200. doi:10.1006/excr.2001.5278 34. Jezierska-Woźniak K, Nosarzewska D, Tutas A, Mikołajczyk A, Okliński M, Jurkowski MK. Wykorzystanie tkanki tłuszczowej jako źródła mezenchymalnych komórek macierzystych. Postepy higieny i medycyny doswiadczalnej. 201064: 326–32. Available: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20679688 35. Langenbach F, Handschel J. Effects of dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate on the osteogenic differentiation of stem cells in vitro. Stem Cell Res Ther. 2013;4: 117. doi:10.1186/SCRT328 36. Zhou Y, Yamamoto Y, Xiao Z, Ochiya T. The Immunomodulatory Functions of Mesenchymal Stromal/Stem Cells Mediated via Paracrine Activity. J Clin Med 2019, Vol 8, Page 1025. 2019;8: 1025. doi:10.3390/JCM8071025 37. Zhou Y, Yamamoto Y, Xiao Z, Ochiya T. The Immunomodulatory Functions of Mesenchymal Stromal/Stem Cells Mediated via Paracrine Activity. J Clin Med 2019, Vol 8, Page 1025. 2019;8: 1025. doi:10.3390/JCM8071025 38. Han Y, Li X, Zhang Y, Han Y, Chang F, Ding J. Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Cells 2019, Vol 8, Page 886. 2019;8: 886. doi:10.3390/CELLS8080886 39. Gupta PK, Das AK, Chullikana A, Majumdar AS. Mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Stem Cell Res Ther. 2012;3: 1–9. doi:10.1186/SCRT116/TABLES/1 40. Lee K, Park N, Jung H, Rim YA, Nam Y, Lee J, et al. Mesenchymal stem cells ameliorate experimental arthritis via expression of interleukin-1 receptor antagonist. PLoS One. 2018;13. doi:10.1371/journal.pone.0193086 41. Paliwal S, Kakkar A, Sharma R, Airan B, Mohanty S. Differential reduction of reactive oxygen species by human tissuespecific mesenchymal stem cells from different donors under oxidative stress. J Biosci. 2017;42: 373–382. doi:10.1007/S12038-017-9691-8 42. Sánchez-Abarca LI, Álvarez-Laderas I, Campelo MD, Caballero-Velázquez T, Herrero C, Muntión S, et al. Uptake and delivery of antigens by mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2013;15: 673–678. doi:10.1016/J.JCYT.2013.01.216 43. Weiss ARR, Dahlke MH. Immunomodulation by Mesenchymal Stem Cells (MSCs): Mechanisms of Action of Living, Apoptotic, and Dead MSCs. Front Immunol. 2019;0: 1191. doi:10.3389/FIMMU.2019.01191 44. Yagi H, Alejandro S-G, Biju P, Kitagawa Y, Tompkins RG, Kobayashi N, et al. Mesenchymal stem cells: Mechanisms of immunomodulation and homing. Cell Transplant. 2010;19: 667–679. doi:10.3727/096368910X508762 45. Wang L-T, Ting C-H, Yen M-L, Liu K-J, Sytwu H-K, Wu KK, et al. Human mesenchymal stem cells (MSCs) for treatment towards immune- and inflammation- mediated diseases: review of current clinical trials. J Biomed Sci 2016 231. 2016;23: 1–13. doi:10.1186/S12929-016-0289-5 46. Li W, Chen W, Huang S, Yao G, Tang X, Sun L. Mesenchymal stem cells prevent overwhelming inflammation and reduce infection severity via recruiting CXCR3+ regulatory T cells. Clin Transl Immunol. 2020;9: e1181. doi:10.1002/CTI2.1181 47. Mancuso P, Raman S, Glynn A, Barry F, Murphy JM. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Osteoarthritis: The Critical Role of the Cell Secretome. Front Bioeng Biotechnol. 2019;0: 9. doi:10.3389/FBIOE.2019.00009 48. Lo Monaco M, Merckx G, Ratajczak J, Gervois P, Hilkens P, Clegg P, et al. Stem Cells for Cartilage Repair: Preclinical Studies and Insights in Translational Animal Models and Outcome Measures. Stem Cells Int. 2018;2018. doi:10.1155/2018/9079538 49. Fahy N, Farrell E, Ritter T, E. R, Mary M. Immune Modulation to Improve Tissue Engineering Outcomes for Cartilage Repair in the Osteoarthritic Joint. https://home.liebertpub.com/teb. 2014;21: 55–66. doi:10.1089/TEN.TEB.2014.0098 50. Ratajczak M, Sakowicz-Burkiewicz M, Kuczkowski J, Gulida G, Starzyńska A, Gawrońska-Skorkowska, Jadwiga Włodarkiewicz, Adam Pawełczyk T. Role of receptor activator of nuclear factor kappa B (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) in the development of the odontogenic cysts and periapical granulomas of the jaws. Nowa Stomatol. 2013. 51. Makarczyk MJ, Gao Q, He Y, Li Z, Gold MS, Hochberg MC, et al. Current Models for Development of Disease-Modifying Osteoarthritis Drugs. https://home.liebertpub.com/tec. 2021;27: 124–138. doi:10.1089/TEN.TEC.2020.0309 52. Lipka D, Boratyński J. Metalloproteinases. Structure and function . Adv Hyg Exp Med. 2008;62: 328–336. Available: https://phmd.pl/resources/html/article/details?id=7447&language=en 53. Xue E-X, Lin J-P, Zhang Y, Sheng S-R, Liu H-X, Zhou Y-L, et al. Pterostilbene inhibits inflammation and ROS production in chondrocytes by activating Nrf2 pathway. Oncotarget. 2017;8: 41988–42000. doi:10.18632/ONCOTARGET.16716 54. Henrotin Y., Bruckner P, Pujol J-P. The role of reactive oxygen species in homeostasis and degradation of cartilage. Osteoarthr Cartil. 2003;11: 747–755. doi:10.1016/S1063-4584(03)00150-X 55. Borroni B, Benussi A. Recent advances in understanding frontotemporal degeneration [version 1; peer review: 2 approved]. F1000Research. 2019;8: 1–11. doi:10.12688/f1000research.20330.1 56. Capra E, Lange-Consiglio A. The biological function of extracellular vesicles during fertilization, early embryo—maternal crosstalk and their involvement in reproduction: Review and overview. Biomolecules. 2020;10: 1–26. doi:10.3390/biom10111510 57. Kusuma G, Li A, Zhu D, McDonald H, Chambers D, Frith J, et al. Engineering mesenchymal stem cell paracrine activity with 3D culture. Cytotherapy. 2020;22: S51. doi:10.1016/J.JCYT.2020.03.064 58. Ludwig AK, Giebel B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. Int J Biochem Cell Biol. 2012;44: 11–15. doi:10.1016/J.BIOCEL.2011.10.005 59. Ratajczak MZ, Ratajczak J. Horizontal transfer of RNA and proteins between cells by extracellular microvesicles: 14 years later. Clin Transl Med. 2016;5. doi:10.1186/S40169-016-0087-4 60. Tofiño-Vian M, Guillén MI, Pérez Del Caz MD, Silvestre A, Alcaraz MJ. Microvesicles from Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells as a New Protective Strategy in Osteoarthritic Chondrocytes. Cell Physiol Biochem. 2018;47: 11–25. doi:10.1159/000489739 61. Boratyńska A, Martyniszyn L, Szulc L, NiemiatŁowski M. Mostki błonowe i ich rola w rozprzestrzenianiu wirusa ektromelii in vitro. Med Weter. 2011;67: 474–477. 62. Spees JL, Olson SD, Whitney MJ, Prockop DJ. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103: 1283. doi:10.1073/PNAS.0510511103 63. Li CJ, Chen PK, Sun LY, Pang CY. Enhancement of Mitochondrial Transfer by Antioxidants in Human Mesenchymal Stem Cells. Oxid Med Cell Longev. 2017;2017. doi:10.1155/2017/8510805 64. Li SH, Liao X, Zhou TE, Xiao LL, Chen YW, Wu F, et al. Evaluation of 2 Purification Methods for Isolation of Human Adipose-Derived Stem Cells Based on Red Blood Cell Lysis with Ammonium Chloride and Hypotonic Sodium Chloride Solution. Ann Plast Surg. 2017;78: 83–90. doi:10.1097/SAP.0000000000000953 65. Spees JL, Lee RH, Gregory CA. Mechanisms of mesenchymal stem/stromal cell function. Stem Cell Res Ther. 2016;7. doi:10.1186/S13287-016-0363-7 66. Rajan TS, Gugliandolo A, Bramanti P, Mazzon E. Tunneling nanotubes-mediated protection of mesenchymal stem cells: An update from preclinical studies. Int J Mol Sci. 2020;21. doi:10.3390/ijms21103481 67. Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp Cell Res. 2001;268: 189–200. doi:10.1006/EXCR.2001.5278 68. Murphy JM, Fink DJ, Hunziker EB, Barry FP. Stem cell therapy in a caprine model of osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2003;48: 3464–3474. doi:10.1002/ART.11365 69. Huurne M ter, Schelbergen R, Blattes R, Blom A, Munter W de, Grevers LC, et al. Antiinflammatory and chondroprotective effects of intraarticular injection of adipose-derived stem cells in experimental osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2012;64: 3604–3613. doi:10.1002/ART.34626 70. Sophia Fox AJ, Bedi A, Rodeo SA. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 2009;1: 461–468. doi:10.1177/1941738109350438 71. Ng J, Little CB, Woods S, Whittle S, Lee FY, Gronthos S, et al. Stem cell-directed therapies for osteoarthritis: The promise and the practice. Stem Cells. 2020;38: 477–486. doi:10.1002/STEM.3139 72. Li Y, Yuan Z, Yang H, Zhong H, Peng W, Xie R. Recent Advances in Understanding the Role of Cartilage Lubrication in Osteoarthritis. 2021; 1–19. 73. Long J, Kim H, Kim D, Lee JB, Kim D-H. A biomaterial approach to cell reprogramming and differentiation. J Mater Chem B Mater Biol Med. 2017;5: 2375. doi:10.1039/C6TB03130G 74. Uto K, Tsui JH, DeForest CA, Kim D-H. Dynamically Tunable Cell Culture Platforms for Tissue Engineering and Mechanobiology. Prog Polym Sci. 2017;65: 53. doi:10.1016/J.PROGPOLYMSCI.2016.09.004 75. OpenStax College. Synovial Joints | Anatomy and Physiology I. In: Rice University [Internet]. Available: https://courses.lumenlearning.com/hccs-ap1/chapter/synovial-joints/ 76. Mao AS, Mooney DJ. Regenerative medicine: Current therapies and future directions. Proc Natl Acad Sci. 2015;112: 14452–14459. doi:10.1073/PNAS.1508520112 77. Bottino MC, Thomas V, Schmidt G, Vohra YK, Chu TMG, Kowolik MJ, et al. Recent advances in the development of GTR/GBR membranes for periodontal regeneration—A materials perspective. Dent Mater. 2012;28: 703–721. doi:10.1016/J.DENTAL.2012.04.022 78. Kreuz PC, Müller S, Ossendorf C, Kaps C, Erggelet C. Treatment of focal degenerative cartilage defects with polymer-based autologous chondrocyte grafts: four-year clinical results. Arthritis Res Ther. 2009;11: R33. doi:10.1186/AR2638 79. BioSeed®-C repairs knee cartilage effectively. Nat Clin Pract Rheumatol 2007 37. 2007;3: 371–371. doi:10.1038/ncprheum0526 80. Spalding T, Carey-Smith R, Carmont M, Dunn K. TruFit Plugs for Articular Cartilage Repair in the Knee: 2 Year Experience, Results and MRI Appearances (SS-59). Arthroscopy. 2009;25: e32–e33. doi:10.1016/J.ARTHRO.2009.04.058 81. AMIC® Chondro-Gide ® in the Knee. In: Geistlich Surgery [Internet]. Available: https://www.geistlich-pharma.com/fileadmin/content/Geistlich_Pharma/Pdf/pdf_Orthopaedical/BRO_AMIC-Knee_EN.pdf 82. Song SJ, Park CH. Microfracture for cartilage repair in the knee: current concepts and limitations of systematic reviews. Ann Transl Med. 2019;7: S108–S108. doi:10.21037/ATM.2019.05.11 83. Vonk LA, Roël G, Hernigou J, Kaps C, Hernigou P. Role of matrix‐associated autologous chondrocyte implantation with spheroids in the treatment of large chondral defects in the knee: A systematic review. Int J Mol Sci. 2021;22. doi:10.3390/ijms22137149 84. F.V. Sciarretta. Use of adipose mesenchymal stem cells for augmented amic one-step cartilage repair technique in the knee. Orthopaedic Proceedings. 2018. Available: https://online.boneandjoint.org.uk/doi/abs/10.1302/1358-992X.99BSUPP_5.ISTA2016-142 85. Griffin M, SA I, Bayat A. Exploring the application of mesenchymal stem cells in bone repair and regeneration. J bone Jt Surg. 2011;93: 427–434. doi:10.1302/0301-620X.93B4.25249 86. Yu Z, Zhu T, Li C, Shi X, Liu X, Yang X, et al. Improvement of intertrochanteric bone quality in osteoporotic female rats after injection of polylactic acid-polyglycolic acid copolymer/collagen type I microspheres combined with bone mesenchymal stem cells. Int Orthop. 2012;36: 2163. doi:10.1007/S00264-012-1543-4 87. Šponer, P., Filip S, Kučera T, Brtková J, Urban K, Palička V, et al. Utilizing Autologous Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and β-Tricalcium Phosphate Scaffold in Human Bone Defects: A Prospective, Controlled Feasibility Trial. Biomed Res Int. 2016;2016. doi:10.1155/2016/2076061 88. Zhou M, Lozano N, Wychowaniec JK, Hodgkinson T, Richardson SM, Kostarelos K, et al. Graphene oxide: A growth factor delivery carrier to enhance chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in 3D hydrogels. Acta Biomater. 2019;96: 271–280. doi:10.1016/j.actbio.2019.07.027 89. Huczko A, Dąbrowska A, Kurcz M. Grafen. Otrzymywanie, charakterystyka, zastosowania. Warsaw University Press; 2016. doi:10.31338/UW.9788323523147 90. Pathmanapan S, Kumar S, Sadagopan A. Graphene and Composite based Biomaterials in Cartilage. Am J Pharmacol. 2018;1: 1–2. 91. Yang Y, Asiri AM, Tang Z, Du D, Lin Y. Graphene based materials for biomedical applications. Mater Today. 2013;16: 365–373. doi:10.1016/j.mattod.2013.09.004 92. Promsawan N, Saipanya S, Rattanakansang S, Themsirimongkon S, Inceesungvorn B, Waenkaew P. Modification of various carbons with various metal oxides and noble metal compositions as electrocatalysts for ethanol oxidation. https://doi.org/101080/0927644020201722522. 2020;27: 1023–1045. doi:10.1080/09276440.2020.1722522 93. Liang H, Xu X, Feng X, Ma L, Deng X, Wu S, et al. Gold nanoparticles-loaded hydroxyapatite composites guide osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells through Wnt/beta-catenin signaling pathway. Int J Nanomedicine. 2019;14: 6151–6163. doi:10.2147/IJN.S213889 94. Suryaprakash S, Li M, Lao Y-H, Wang H-X, Leong KW. Graphene oxide cellular patches for mesenchymal stem cell-based cancer therapy. 2018 [cited 6 Jul 2019]. doi:10.1016/j.carbon.2017.12.031 95. Bellet P, Gasparotto M, Pressi S, Fortunato A, Scapin G, Mba M, et al. Graphene-Based Scaffolds for Regenerative Medicine. Nanomater (Basel, Switzerland). 2021;11: 1–41. doi:10.3390/NANO11020404 96. Li J, Li X, Zhang J, Kawazoe N, Chen G. Induction of Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Biomimetic Gold Nanoparticles with Tunable RGD Density. Adv Healthc Mater. 2017;6. doi:10.1002/adhm.201700317 97. Yi C, Liu D, Fong C-C, Zhang J, Yang M. Gold Nanoparticles Promote Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells through p38 MAPK Pathway. ACS Nano. 2010;4: 6439–6448. doi:10.1021/NN101373R 98. Ma N, Teng X, Zheng Q, Chen P. The regulatory mechanism of p38/MAPK in the chondrogenic differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 2019;14. doi:10.1186/S13018-019-1505-2 99. Mason C, Dunnill P. A brief definition of regenerative medicine. Regen Med. 2007;3: 1–5. doi:10.2217/17460751.3.1.1 100. Year HB, Period F. Global stem cell market (2020 - 2025). 2019. 101. The Heavy Burden of Obesity. The Economics of prevention. 2019. doi:10.1787/67450d67-en 102. King LK, March L, Anandacoomarasamy A. Obesity & osteoarthritis. Indian J Med Res. 2013;138: 185. Available: /pmc/articles/PMC3788203/ 103. Osteoarthritis: A serious disease. 2016. Available: https://oarsi.org/sites/default/files/library/2018/pdf/oarsi_white_paper_oa_serious_disease121416_1.pdf 104. Pera PI, Ferrér MCO, Juarez MN, Juarez EN, Soler LM, Matheu CL, et al. Obesity, knee osteoarthritis, and polypathology: factors favoring weight loss in older people. Patient Prefer Adherence. 2016;10: 957–965. doi:10.2147/PPA.S92183 105. Ji X, Zhang H. Current Strategies for the Treatment of Early Stage Osteoarthritis. Front Mech Eng. 2019;5: 57. doi:10.3389/FMECH.2019.00057/BIBTEX 106. Sarzi-Puttini P, Cimmino MA, Scarpa R, Caporali R, Parazzini F, Zaninelli A, et al. Osteoarthritis: An Overview of the Disease and Its Treatment Strategies. Seminars in Arthritis and Rheumatism. W.B. Saunders; 2005. pp. 1–10. doi:10.1016/j.semarthrit.2005.01.013 107. Redman S, Oldfield S, Archer C. Current strategies for articular cartilage repair. Eur Cells Mater. 2005;9: 23–32. doi:10.22203/eCM.v009a04 108. Guła Z, Korkosz M. Choroba zwyrodnieniowa stawów | Reumatologia - Medycyna Praktyczna dla pacjentów. Medycyna Praktyczna. 2017. Available: https://www.mp.pl/pacjent/reumatologia/choroby/65000,choroba-zwyrodnieniowa-stawow 109. Carr AJ, Robertsson O, Graves S, Price AJ, Arden NK, Judge A, et al. Knee replacement. Lancet (London, England). 2012;379: 1331–1340. doi:10.1016/S0140-6736(11)60752-6 110. Dziedzic K, Zalewski M, Gądek A, Drukała J. Zastosowanie chondrocytów w medycynie regeneracyjnej. Przegl Lek. 2014;71: 334–339. Available: http://www.wple.net/plek/numery_2014/numer-6-2014/334-339.pdf 111. Mesenchymal Stem Cells Market Size Report, 2021-2028. Available: https://www.grandviewresearch.com/industry-analysis/mesenchymal-stem-cells-market 112. Detela G, Lodge A. EU Regulatory Pathways for ATMPs: Standard, Accelerated and Adaptive Pathways to Marketing Authorisation. 2019 [cited 12 Sep 2021]. doi:10.1016/j.omtm.2019.01.010 113. Kato Y, Chavez J, Yamada S, Hattori S, Takazawa S, Ohuchi H. A large knee osteochondral lesion treated using a combination of osteochondral autograft transfer and second-generation autologous chondrocyte implantation: A case report. Regen Ther. 2019;10: 10–16. doi:10.1016/J.RETH.2018.10.002 114. Rejestr wytwórców produktów leczniczych terapii zaawansowanej wyjątków szpitalnych (ATMP-HE). Available: http://rejestr.gif.gov.pl/libs/raportC.php 115. Rozporządzenie (WE) nr 1394/2007 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 13 listopada 2007 r. w sprawie produktów leczniczych terapii zaawansowanej i zmieniające dyrektywę 2001/83/WE oraz rozporządzenie (WE) nr 726/2004. (WE) nr 1394/2007 Parlamanet Europejski; 2007. 116. Hanna E, Rémuzat C, Auquier P, Toumi M. Advanced therapy medicinal products: current and future perspectives. J Mark Access Heal Policy. 2016;4: 31036. doi:10.3402/JMAHP.V4.31036 117. Iglesias-Lopez C, Agustí A, Obach M, Vallano A. Regulatory Framework for Advanced Therapy Medicinal Products in Europe and United States. Front Pharmacol. 2019;0: 921. doi:10.3389/FPHAR.2019.00921 118. Dyrektywa 2001/20/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 4 kwietnia 2001 r. w sprawie zbliżania przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych Państw Członkowskich, odnoszących się do wdrożenia zasady dobrej praktyki klinicznej w prowadzeniu ba. 2001/20/WE Parlament Europejski; 2001. 119. Dyrektywa 2001/83/WE Parlamentu Europejskiego i Rady przez określenie szczegółowych zasad dotyczących zabezpieczeń umieszczanych na opakowaniach produktów leczniczych stosowanych u ludzi. 2001/83/WE Parlament Europejski; 2001. 120. Jiskoot W. Advanced Therapy Medicinal Products: What’s in a Name? J Pharm Sci. 2020;109: 3282–3284. doi:10.1016/J.XPHS.2020.08.017 121. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 5 lutego 2019 r. w sprawie wzoru wniosku o wydanie zgody na wytwarzanie produktu leczniczego terapii zaawansowanej - wyjątku szpitalnego oraz wniosku o zmianę tej zgody. Minister Zdrowia; 2013 pp. 1–10. 122. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 16 września 2020 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzania. Minister Zdrowia; 2020. 123. PN-EN ISO 14644-1:2016 Pomieszczenia czyste i związane z nimi środowiska kontrolowane -- Część 1: Klasyfikacja czystości powietrza na podstawie stężenia cząstek. 14644–1 Polski Komitet Normalizacyjny; 2016. 124. PN-EN ISO 14644-4:2006 Pomieszczenia czyste i związane z nimi środowiska kontrolowane -- Część 4: PN-EN ISO 14644-1:2016-03 Pomieszczenia czyste i związane z nimi środowiska kontrolowane -- Część 1: Projekt, budowa i uruchomienie. Polski Komitet Normalizacyjny; 2014 p. 2006. 125. Informacji B, Sabb L, Krzykowska SONJ. PN-EN ISO 14644-5:2016 Pomieszczenia czyste i związane z nimi środowiska kontrolowane -- Część 5: Obsługa. Polski Komitet Normalizacyjny; 2014 p. 2006. 126. Preventing occupational exposures to antineoplastic and other hazardous drugs in health care settings. The National Institute for Occupational Safety and Health; 2004. Report No.: 2004−165. Available: https://www.cdc.gov/niosh/docs/2004-165/pdfs/2004-165.pdf?id=10.26616/NIOSHPUB2004165 127. NIOSH List of Antineoplastic and Other Hazardous Drugs in Healthcare Settings. The National Institute for Occupational Safety and Health; 2016. Available: https://www.cdc.gov/niosh/docs/2016-161/pdfs/2016-161.pdf?id=10.26616/NIOSHPUB2016161 128. Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 29 czerwca 2011 r. w sprawie zgody na wytwarzanie produktów leczniczych terapii zaawansowanej. Minister Zdrowia; 2011 pp. 8793–8802. 129. Ustawa z dnia 23 marca 2017 r. o zmianie ustawy o pobieraniu, przechowywaniu i przeszczepianiu komórek, tkanek i narządów. Minister Zdrowia; 2017 pp. 1–16. 130. Ustawa z dnia 6 września 2001 r. Prawo farmaceutyczne. Minister Zdrowia; 2001. 131. Labedz-Maslowska A, Szkaradek A, Mierzwinski T, Madeja Z, Zuba-Surma E. Processing and Ex Vivo Expansion of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cells for the Development of an Advanced Therapy Medicinal Product for Use in Humans. Cells 2021, Vol 10, Page 1908. 2021;10: 1908. doi:10.3390/CELLS10081908 132. Dyrektywa Komisji 2006/17/WE z dnia 8 lutego 2006 r. wprowadzająca w życie dyrektywę 2004/23/WE Parlamentu Europejskiego i Rady w odniesieniu do niektórych wymagań technicznych dotyczących dawstwa, pobierania i badania tkanek i komórek ludzkich. 2006/17/WE Parlament Europejski; 2006. 133. Collagenase NB 6 GMP Grade, Datasheet. Available: https://search.cosmobio.co.jp/cosmo_search_p/search_gate2/docs/SER_/17458.20050426.pdf 134. Horn P, Bork S, Diehlmann A, Walenda T, Eckstein V, Ho AD, et al. Isolation of human mesenchymal stromal cells is more efficient by red blood cell lysis. Cytotherapy. 2008;10: 676–685. doi:10.1080/14653240802398845 135. Najar M, Rodrigues RM, Buyl K, Branson S, Vanhaecke T, Lagneaux L, et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: Comparison of Ficoll gradient centrifugation and red blood cell lysis buffer treatment purification methods. Cytotherapy. 2014;16: 1220–1228. doi:10.1016/j.jcyt.2014.05.021 136. Horn P, Bork S, Wagner W. Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis. Methods Mol Biol. 2011;698: 23–35. doi:10.1007/978-1-60761-999-4_3 137. Guideline on human cell-based medicinal products. European Medicines Agency; 2006. 138. NanoEntek. [cited 31 Aug 2021]. Available: http://www.nanoentek.com/theme/nanont2_en/shop/02/product01_view.php?it_id=1617609972 139. Bio-Plex Multiplex Immunoassays | Bio-Rad Laboratories. [cited 30 Aug 2021]. Available: https://www.bio-rad.com/en-pl/applications-technologies/bio-plex-multiplex-immunoassays?ID=LUSM0ZMNI 140. Wangdee C, Panasophonkul S, Thadavirul N, Soontornvipart K, Pavasant P, Supaphol P, et al. Comparison of isolation techniques for bone marrow derived canine mesenchymal stem cells (MSCs) and the compatibility of MSCs loaded onto polycarpolactone hydroxyapatite. Thai J Vet Med. 2018;48: 529–539. 141. Eppendorf. Available: https://www.eppendorf.com/product-media/doc/en/790300/Consumables_White-Paper_054_Cell-Culture-Flask_Mycoplasma-Protection-Eppendorf-Cell-Culture-Flasks-Advanced-Filter-Technology.pdf 142. Sherman LS, Condé-Green A, Naaldijk Y, Lee ES, Rameshwar P. An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells. 2019 [cited 13 Jun 2021]. doi:10.3791/59419 143. Raposio E, Simonacci F, Perrotta RE. Adipose-derived stem cells: Comparison between two methods of isolation for clinical applications. Ann Med Surg. 2017;20: 87–91. doi:10.1016/j.amsu.2017.07.018 144. Czapla J, Matuszczak S, Kulik K, Wiśniewska E, Pilny E, Jarosz-Biej M, et al. The effect of culture media on large-scale expansion and characteristic of adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther. 2019;10. doi:10.1186/S13287-019-1331-9 145. Helmy MA, Mohamed AF, Rasheed HM, Fayad AI. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria J Med. 2020;56: 42–50. doi:10.1080/20905068.2020.1750863 146. Schneider S, Unger M, Van Griensven M, Balmayor ER. Adipose-derived mesenchymal stem cells from liposuction and resected fat are feasible sources for regenerative medicine. Eur J Med Res. 2017;22: 17. doi:10.1186/s40001-017-0258-9 147. Riis S, Zachar V, Boucher S, Vemuri MC, Pennisi CP, Fink T. Critical steps in the isolation and expansion of adipose-derived stem cells for translational therapy. 2015. doi:10.1017/erm.2015.10 148. Parekkadan B, Milwid JM. Mesenchymal Stem Cells as Therapeutics. 2010. doi:10.1146/annurev-bioeng-070909-105309 149. Mirzaei H, Sahebkar A, Sichani LS, Moridikia A, Nazari S, Nahand JS, et al. Therapeutic application of multipotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. Wiley-Liss Inc.; 2018. pp. 2815–2823. doi:10.1002/jcp.25990 150. Dexheimer V, Frank S, Richter W. Proliferation as a Requirement for In Vitro Chondrogenesis of Human Mesenchymal Stem Cells. doi:10.1089/scd.2011.0670 151. Kim T-H, Yang L, Yin PT, Khaled H⊥, Conley B, Choi J-W, et al. Controlling Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells Using Combinatorial Graphene Hybrid-Pattern Arrays HHS Public Access. ACS Nano. 2015;9: 3780–3790. doi:10.1021/nn5066028 152. Stanco D, Boffito M, Bogni A, Puricelli L, Barrero J, Soldati G, et al. 3d bioprinting of human adipose-derived stem cells and their tenogenic differentiation in clinical-grade medium. Int J Mol Sci. 2020;21: 1–23. doi:10.3390/ijms21228694 153. Lee J, Lee S, Kim SM, Shin H. Size-controlled human adipose-derived stem cell spheroids hybridized with single-segmented nanofibers and their effect on viability and stem cell differentiation. Biomater Res. 2021;25: 1–14. doi:10.1186/s40824-021-00215-9 154. Xu H, Lee CW, Wang YF, Huang S, Shin LY, Wang YH, et al. The Role of Paracrine Regulation of Mesenchymal Stem Cells in the Crosstalk With Macrophages in Musculoskeletal Diseases: A Systematic Review. Front Bioeng Biotechnol. 2020;8: 1339. doi:10.3389/FBIOE.2020.587052/BIBTEX 155. Maśliński W, Kontny E. Podstawy immunologii dla reumatologów. Narodowy Instytut Geriatrii, Reumatologii i Rehabilitacji im. prof. dr hab. med. Eleonory Reicher; 2015. Available: www.spartanska.pl 156. Wyler S. Role of Monocyte Chemoattractant Protein-1 During Liver Regeneration. Boise State University Graduate College. 2015. Available: https://scholarworks.boisestate.edu/td/942 157. Nam Y, Jung SM, Rim YA, Jung H, Lee K, Park N, et al. Intraperitoneal infusion of mesenchymal stem cell attenuates severity of collagen antibody induced arthritis. PLoS One. 2018;13. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0198740 158. Baek SJ, Kang SK, Ra JC. In vitro migration capacity of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells reflects their expression of receptors for chemokines and growth factors. Exp Mol Med. 2011;43: 596–603. doi:10.3858/emm.2011.43.10.069 159. Lu L, Zhang X, Zhang M, Zhang H, Liao L, Yang T, et al. RANTES and SDF-1 Are Keys in Cell-based Therapy of TMJ Osteoarthritis: http://dx.doi.org/101177/0022034515604621. 2015;94: 1601–1609. doi:10.1177/0022034515604621 160. Henrotin YE, De Groote DD, Labasse AH, Gaspar SE, Zheng SX, Geenen VG, et al. Effects of exogenous IL-1β, TNFα, IL-6, IL-8 and LIF on cytokine production by human articular chondrocytes. Osteoarthr Cartil. 1996;4: 163–173. doi:10.1016/S1063-4584(96)80012-4 161. Wang Z, Le H, Wang Y, Liu H, Li Z, Yang X, et al. Instructive cartilage regeneration modalities with advanced therapeutic implantations under abnormal conditions. Bioact Mater. 2021 [cited 3 Dec 2021]. doi:10.1016/J.BIOACTMAT.2021.10.002 162. Goldring SR, Goldring MB. Biology of the Normal Joint. Ninth. Kelley’s Textbook of Rheumatology. Ninth. W.B. Saunders; 2013. pp. 1-19.e6. doi:10.1016/B978-1-4377-1738-9.00001-3 163. Mabey T, Honsawek S. Cytokines as biochemical markers for knee osteoarthritis. World J Orthop. 2015;6: 95–105. doi:10.5312/wjo.v6.i1.95 164. Tsuchida AI, Beekhuizen M, ’t Hart MC, Radstake TRDJ, Dhert WJA, Saris DBF, et al. Cytokine profiles in the joint depend on pathology, but are different between synovial fluid, cartilage tissue and cultured chondrocytes. Arthritis Res Ther. 2014;16. doi:10.1186/s13075-014-0441-0 165. Park CW, Kim K-S, Bae S, Son HK, Myung P-K, Hong HJ, et al. Cytokine Secretion Profiling of Human Mesenchymal Stem Cells by Antibody Array. Int J Stem Cells. 2009;2: 59. doi:10.15283/IJSC.2009.2.1.59 166. Nagao M, Hamilton JL, Kc R, Berendsen AD, Duan X, Cheong CW, et al. Vascular Endothelial Growth Factor in Cartilage Development and Osteoarthritis. Sci Reports 2017 71. 2017;7: 1–16. doi:10.1038/s41598-017-13417-w 167. Yuankun X, Yan K, Bin W, Jian-Hao L. Monocyte chemoattractant protein 1 induced chondrocytes degeneration and cartilage degradation in osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. Elsevier; 2016. pp. S140–S141. doi:10.1016/J.JOCA.2016.01.275 168. Siddiqui JA, Partridge NC. CCL2/Monocyte Chemoattractant Protein 1 and Parathyroid Hormone Action on Bone. Front Endocrinol (Lausanne). 2017;0: 49. doi:10.3389/FENDO.2017.00049 169. Flannery CR, Little CB, Hughes CE, Curtis CL, Caterson B, Jones SA. IL-6 and its soluble receptor augment aggrecanase-mediated proteoglycan catabolism in articular cartilage. Matrix Biol. 2000;19: 549–553. doi:10.1016/S0945-053X(00)00111-6 170. de Hooge AS, van de Loo FA, Bennink MB, Arntz OJ, de Hooge P, van den Berg WB. Male IL-6 gene knock out mice developed more advanced osteoarthritis upon aging. Osteoarthr Cartil. 2005;13: 66–73. doi:10.1016/J.JOCA.2004.09.011 171. Schaible H-G, Banchet GS von, Boettger MK, Bräuer R, Gajda M, Richter F, et al. The role of proinflammatory cytokines in the generation and maintenance of joint pain. Ann N Y Acad Sci. 2010;1193: 60–69. doi:10.1111/J.1749-6632.2009.05301.X 172. Namba A, Aida Y, Suzuki N, Watanabe Y, Kawato T, Motohashi M, et al. Effects of IL-6 and Soluble IL-6 Receptor on the Expression of Cartilage Matrix Proteins in Human Chondrocytes. http://dx.doi.org/101080/03008200701587513. 2009;48: 263–270. doi:10.1080/03008200701587513 173. Pemmari A, Leppänen T, Hämäläinen M, Moilanen T, Moilanen E. Chondrocytes from Osteoarthritis Patients Adopt Distinct Phenotypes in Response to Central TH1/TH2/TH17 Cytokines. Int J Mol Sci 2021, Vol 22, Page 9463. 2021;22: 9463. doi:10.3390/IJMS22179463 174. Polchert D, Sobinsky J, Douglas G, Kidd M, Moadsiri A, Reina E, et al. IFN-γ activation of mesenchymal stem cells for treatment and prevention of graft versus host disease. Eur J Immunol. 2008;38: 1745–1755. doi:10.1002/EJI.200738129 175. Yang A, Lu Y, Xing J, Li Z, Yin X, Dou C, et al. IL-8 Enhances Therapeutic Effects of BMSCs on Bone Regeneration via CXCR2-Mediated PI3k/Akt Signaling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2018;48: 361–370. doi:10.1159/000491742 176. Behrendt P, Preusse-Prange A, Klüter T, Haake M, Rolauffs B, Grodzinsky AJ, et al. IL-10 reduces apoptosis and extracellular matrix degradation after injurious compression of mature articular cartilage. Osteoarthr Cartil. 2016;24: 1981–1988. doi:10.1016/J.JOCA.2016.06.016 177. Behrendt P, Häfelein K, Preusse-Prange A, Bayer A, Seekamp A, Kurz B. IL-10 ameliorates TNF-α induced meniscus degeneration in mature meniscal tissue in vitro. 2017;1: 197. doi:10.1186/s12891-017-1561-x 178. Behrendt P, Feldheim M, Preusse-Prange A, Weitkamp JT, Haake M, Eglin D, et al. Chondrogenic potential of IL-10 in mechanically injured cartilage and cellularized collagen ACI grafts. Osteoarthr Cartil. 2018;26: 264–275. doi:10.1016/J.JOCA.2017.11.007 179. Byun S, Sinskey YL, Lu YCS, Frank EH, Grodzinsky AJ. Transport and Binding of Tumor Necrosis Factor-α in Articular Cartilage Depend on its Quaternary Structure. Arch Biochem Biophys. 2013;540: 1. doi:10.1016/J.ABB.2013.10.003 180. Chisari E, Yaghmour KM, Khan WS. The effects of TNF-alpha inhibition on cartilage: a systematic review of preclinical studies. Osteoarthr Cartil. 2020;28: 708–718. doi:10.1016/J.JOCA.2019.09.008 181. Leuning DG, Beijer NRM, Du Fossé NA, Vermeulen S, Lievers E, Van Kooten C, et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Sci Reports 2018 81. 2018;8: 1–9. doi:10.1038/s41598-018-25700-5 182. Zhang C, Zhou L, Wang Z, Gao W, Chen W, Zhang H, et al. Eradication of specific donor-dependent variations of mesenchymal stem cells in immunomodulation to enhance therapeutic values. Cell Death Dis 2021 124. 2021;12: 1–11. doi:10.1038/s41419-021-03644-5 183. Paradisp M, Alviano F, Pirondi S, Lanzoni G, Fernandez M, Lizzo G, et al. Human mesenchymal stem cells produce bioactive neurotrophic factors: source, individual variability and differentiation issues. Int J Immunopathol Pharmacol. 2014;27: 391–402. 184. Williams DF. The Williams Dictionary of Biomaterials. Liverpool University Press. 1999. doi:10.5949/upo9781846314438 185. Świeczko - Żurek B. Biomateriały. Wydawnicwo Politech Gdańskiej. 2009;4: 32–45. 186. Juneau PM, Garnier A, Duchesne C. Monitoring of adherent live cells morphology using the undecimated wavelet transform multivariate image analysis (UWT-MIA). Biotechnol Bioeng. 2017;114: 141–153. doi:10.1002/bit.26064 187. Yuan L, Qi X, Qin G, Liu Q, Zhang F, Song Y, et al. Effects of gold nanostructures on differentiation of mesenchymal stem cells. Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2019;184: 110494. doi:10.1016/J.COLSURFB.2019.110494 188. Sridharan B, Lin SM, Hwu AT, Laflin AD, Detamore MS. Stem Cells in Aggregate Form to Enhance Chondrogenesis in Hydrogels. 2015. doi:10.1371/journal.pone.0141479 189. Welter JF, Solchaga LA, Penick KJ. Simplification of aggregate culture of human mesenchymal stem cells as a chondrogenic screening assay. Biotechniques. 2007;42: 732–737. doi:10.2144/000112451 190. Peng E, Todorova N, Yarovsky I. Effects of Size and Functionalization on the Structure and Properties of Graphene Oxide Nanoflakes: An in Silico Investigation. 2018. doi:10.1021/acsomega.8b00866 191. Paduch R, Klatka M, Klatka J. Rodzaje śmierci komórki. Pom J Life Sci. 2015;61: 411–418. Available: www.pum.edu.pl/uczelnia/wydawnictwo 192. Crowley LC, Marfell BJ, Scott AP, Boughaba JA, Chojnowski G, Christensen ME, et al. Dead cert: Measuring cell death. Cold Spring Harb Protoc. 2016;2016: 1064–1072. doi:10.1101/pdb.top070318 193. Sarem M, Otto O, Tanaka S, Shastri VP. Cell number in mesenchymal stem cell aggregates dictates cell stiffness and chondrogenesis. [cited 14 Jun 2021]. doi:10.1186/s13287-018-1103-y 194. Jayasinghe HG, Madihally S V., Vasquez Y. Formation of Stem Cell Aggregates and Their Differentiation on Surface-Patterned Hydrogels Based on Poly(2-hydroxyethyl Methacrylate). ACS Appl Bio Mater. 2019;2: 4911–4921. doi:10.1021/acsabm.9b00661 195. Bellio MA, Khan A. Improving Cell Production Techniques to Enhance Autologous Cell Therapy. Circ Res. 2018;122: 191–193. doi:10.1161/CIRCRESAHA.117.312393 196. Srijaya TC, Ramasamy TS, Kasim NHA. Advancing stem cell therapy from bench to bedside: lessons from drug therapies. J Transl Med 2014 121. 2014;12: 1–17. doi:10.1186/S12967-014-0243-9 197. Liguori GR, Zhou Q, Liguori TTA, Barros GG, Kühn PT, Moreira LFP, et al. Directional topography influences adipose mesenchymal stromal cell plasticity: Prospects for tissue engineering and fibrosis. Stem Cells Int. 2019;2019. doi:10.1155/2019/5387850 198. Xia H, Li X, Gao W, Fu X, Fang RH, Zhang L, et al. Tissue repair and regeneration with endogenous stem cells. Nat Rev Mater 2018 37. 2018;3: 174–193. doi:10.1038/s41578-018-0027-6 199. Palmieri V, Barba M, Di Pietro L, Conti C, De Spirito M, Lattanzi W, et al. Graphene Oxide Induced Osteogenesis Quantification by In-Situ 2D-Fluorescence Spectroscopy. Int J Mol Sci. 2018;19. doi:10.3390/ijms19113336 200. Kang E-S, Song I, Kim D-S, Lee U, Kim J-K, Son H, et al. Size-dependent effects of graphene oxide on the osteogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2018;169: 20–29. doi:10.1016/J.COLSURFB.2018.04.053 201. Stöckl S, Bauer RJ, Bosserhoff AK, Göttl C, Grifka J, Grässel S. Sox9 modulates cell survival and adipogenic differentiation of multipotent adult rat mesenchymal stem cells. J Cell Sci. 2013;126: 2890–2902. doi:10.1242/jcs.124305 202. Stöckl S, Göttl C, Grifka J, Grässel S. Sox9 modulates proliferation and expression of osteogenic markers of adipose-derived stem cells (ASC). Cell Physiol Biochem. 2013;31: 703–717. doi:10.1159/000350089 203. Williams GM, Klisch SM, Sah RL. Bioengineering Cartilage Growth, Maturation, and Form. Pediatr Res. 2008. 204. Kwok C, Weller PA, Guioli S, Foster JW, Mansour S, Zuffardi O, et al. Mutations in SOX9, the Gene Responsible for Campomelic Dysplasia and Autosomal Sex Reversal. Am J Hum Genet. 1995;57: 1028–1036. 205. Wang T, Nimkingratana P, Smith CA, Cheng A, Hardingham TE, Kimber SJ. Enhanced chondrogenesis from human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2019;39: 101497. doi:10.1016/j.scr.2019.101497 206. Chiaradia E, Pepe M, Orvietani PL, Renzone G, Magini A, Sforna M, et al. Proteome Alterations in Equine Osteochondrotic Chondrocytes. Int J Mol Sci 2019, Vol 20, Page 6179. 2019;20: 6179. doi:10.3390/IJMS20246179 207. Spicer AP, Joo A, Bowling RA. A Hyaluronan Binding Link Protein Gene Family Whose Members Are Physically Linked Adjacent to Chrondroitin Sulfate Proteoglycan Core Protein Genes. J Biol Chem. 2003;278: 21083–21091. doi:10.1074/JBC.M213100200 208. Cichocki T, Litwin JA, Mirecka J. Kompendium histologii : podręcznik dla studentów nauk medycznych i przyrodniczych. V. Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego; 2016. 209. Fredik Liu YY, Lu Y, Oh S, Conduit GJ. Machine learning to predict mesenchymal stem cell efficacy for cartilage repair. PLOS Comput Biol. 2020;16: e1008275. doi:10.1371/JOURNAL.PCBI.1008275 210. Bornes TD, Adesida AB, Jomha NM. Mesenchymal stem cells in the treatment of traumatic articular cartilage defects: a comprehensive review. Arthritis Res Ther 2014 165. 2014;16: 1–19. doi:10.1186/S13075-014-0432-1 211. Hjelle K, Solheim E, Strand T, Muri R, Brittberg M. Articular cartilage defects in 1,000 knee arthroscopies. Arthrosc J Arthrosc Relat Surg. 2002;18: 730–734. doi:10.1053/JARS.2002.32839 212. Moran CJ, Ramesh A, Brama PAJ, O’byrne JM, O’brien FJ, Levingstone TJ. The benefits and limitations of animal models for translational research in cartilage repair. 2011. doi:10.1186/s40634-015-0037-x 213. Gille J, Behrens P, Schulz AP, Oheim R, Kienast B. Matrix-Associated Autologous Chondrocyte Implantation: A Clinical Follow-Up at 15 Years. Cartilage. 2016;7: 309. doi:10.1177/1947603516638901 214. Dufour A, Lafont JE, Buffier M, Verset M, Cohendet A, Contamin H, et al. Repair of full-thickness articular cartilage defects using IEIK13 self-assembling peptide hydrogel in a non-human primate model. Sci Reports 2021 111. 2021;11: 1–17. doi:10.1038/s41598-021-83208-x 215. Reflection paper on in-vitro cultured chondrocyte containing products for cartilage repair of the knee. 2010. 216. Musiał-Wysocka A, Kot M, Majka M. The Pros and Cons of Mesenchymal Stem Cell-Based Therapies. Cell Transplant. 2019;28: 801. doi:10.1177/0963689719837897 217. Kyurkchiev D. Secretion of immunoregulatory cytokines by mesenchymal stem cells. World J Stem Cells. 2014;6: 552. doi:10.4252/wjsc.v6.i5.552 218. Windt TS de, Vonk LA, Slaper-Cortenbach ICM, Broek MPH van den, Nizak R, Rijen MHP van, et al. Allogeneic Mesenchymal Stem Cells Stimulate Cartilage Regeneration and Are Safe for Single-Stage Cartilage Repair in Humans upon Mixture with Recycled Autologous Chondrons. Stem Cells. 2017;35: 256–264. doi:10.1002/STEM.2475 219. Thitilertdecha P, Lohsiriwat V, Poungpairoj P, Tantithavorn V, Onlamoon N. Extensive Characterization of Mesenchymal Stem Cell Marker Expression on Freshly Isolated and In Vitro Expanded Human Adipose-Derived Stem Cells from Breast Cancer Patients. Stem Cells Int. 2020;2020: 1–12. doi:10.1155/2020/8237197 220. Shah FS, Wu X, Dietrich M, Rood J, Gimble JM. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 2013;15: 979–985. doi:10.1016/J.JCYT.2013.04.001 221. Labedz‐Maslowska A, Szkaradek A, Mierzwinski T, Madeja Z, Zuba‐Surma E. Processing and ex vivo expansion of adipose tissue‐derived mesenchymal stem/stromal cells for the development of an advanced therapy medicinal product for use in humans. Cells. 2021;10: 1908. doi:10.3390/CELLS10081908/S1 222. Alonso-Goulart V, Ferreira LB, Duarte A, Lemos De Lima I, Ferreira R, Candido De Oliveira B, et al. Mesenchymal stem cells from human adipose tissue and bone repair: a literature review. Biotechnol Res Innov. 2018;2: 74–80. doi:10.1016/j.biori.2017.10.005 223. Bertassoli BM, De Assis Neto AC, De Oliveira FD, Machado Arroyo MA, Pires Ferrão JS, Da Silva JB, et al. Mesenchymal stem cells: emphasis in adipose tissue. Brazilian Arch Biol Technol. 2013;56: 607–617. doi:10.1590/S1516-89132013000400011 224. Sanz-Nogués C, O’Brien T. Current good manufacturing practice considerations for mesenchymal stromal cells as therapeutic agents. Biomater Biosyst. 2021;2: 100018. doi:10.1016/j.bbiosy.2021.100018 225. Markarian CF, Frey GZ, Silveira MD, Chem EM, Milani AR, Ely PB, et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnol Lett. 2014;36: 693–702. doi:10.1007/s10529-013-1425-x 226. Zuttion MSSR, Wenceslau CV, Lemos PA, Takimura C. Adipose Tissue-Derived Stem Cells and the Importance of Animal Model Standardization for Pre-Clinical Trials. Rev Bras Cardiol Invasiva. 2013;21: 281–287. doi:10.1016/S2214-1235(15)30145-9 227. Hassan MNF Bin, Yazid MD, Yunus MHM, Chowdhury SR, Lokanathan Y, Idrus RBH, et al. Large-Scale Expansion of Human Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. 2020;2020. doi:10.1155/2020/9529465 228. Haque N, Abu Kasim NH, Rahman MT. Optimization of pre-transplantation conditions to enhance the efficacy of mesenchymal stem cells. Int J Biol Sci. 2015;11: 324–334. doi:10.7150/ijbs.10567 229. Becherucci V, Piccini L, Casamassima S, Bisin S, Gori V, Gentile F, et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: a cell factory experience. Stem Cell Res Ther. 2018;9. doi:10.1186/S13287-018-0863-8 230. Dessels C, Potgieter M, Pepper MS. Making the Switch: Alternatives to Fetal Bovine Serum for Adipose-Derived Stromal Cell Expansion. Front Cell Dev Biol. 2016;0: 115. doi:10.3389/FCELL.2016.00115 231. Wei Z, Batagov AO, Carter DRF, Krichevsky AM. Fetal Bovine Serum RNA Interferes with the Cell Culture derived Extracellular RNA. Sci Reports 2016 61. 2016;6: 1–6. doi:10.1038/srep31175 232. Guiotto M, Raffoul W, Hart AM, Riehle MO, di Summa PG. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: a systematic review. J Transl Med 2020 181. 2020;18: 1–14. doi:10.1186/S12967-020-02489-4 233. Kinzebach S, Bieback K. Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal cells under xenogenic-free culture conditions. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2013;129: 33–57. doi:10.1007/10_2012_134 234. Witzeneder K, Lindenmair A, Gabriel C, Höller K, Theiß D, Redl H, et al. Human-Derived Alternatives to Fetal Bovine Serum in Cell Culture. Transfus Med Hemotherapy. 2013;40: 417–423. doi:10.1159/000356236 235. Guiotto M, Raffoul W, Hart AM, Riehle MO, di Summa PG. Human Platelet Lysate Acts Synergistically With Laminin to Improve the Neurotrophic Effect of Human Adipose-Derived Stem Cells on Primary Neurons in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 2021;0: 162. doi:10.3389/FBIOE.2021.658176 236. Ballesteros OR, Brooks PT, Haastrup EK, Fischer-Nielsen A, Munthe-Fog L, Svalgaard JD. Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Culture: Effects of Different Concentrations of Human Platelet Lysate in Media. Cells Tissues Organs. 2020;209: 257–265. doi:10.1159/000513604 237. Kandoi S, L P kumar, Patra B, Vidyasekar P, Sivanesan D, S. V, et al. Evaluation of platelet lysate as a substitute for FBS in explant and enzymatic isolation methods of human umbilical cord MSCs. Sci Reports 2018 81. 2018;8: 1–12. doi:10.1038/s41598-018-30772-4 238. Nikfarjam L, Farzaneh P. Prevention and Detection of Mycoplasma Contamination in CellCulture. Cell J. 2012;13: 203. Available: /pmc/articles/PMC3584481/ 239. Pattappa G, Schewior R, Hofmeister I, Seja J, Zellner J, Johnstone B, et al. Physioxia Has a Beneficial Effect on Cartilage Matrix Production in Interleukin-1 Beta-Inhibited Mesenchymal Stem Cell Chondrogenesis. Cells. 2019;8: 936. doi:10.3390/CELLS8080936 240. Montagne K, Onuma Y, Ito Y, Aiki Y, Furukawa KS, Ushida T. High hydrostatic pressure induces pro-osteoarthritic changes in cartilage precursor cells: A transcriptome analysis. PLoS One. 2017;12: e0183226. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0183226 241. McKeown SR. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours—implications for treatment response. Br J Radiol. 2014;87. doi:10.1259/BJR.20130676 242. Place TL, Domann FE, Case AJ. Limitations of oxygen delivery to cells in culture: An underappreciated problem in basic and translational research. Free Radic Biol Med. 2017;113: 311–322. doi:10.1016/J.FREERADBIOMED.2017.10.003 243. Park, S. E., Kim H, Kwon S, Choi SJ, Oh SY, Ryu GH, et al. Cyclic hydrostatic pressure enhances the chondrogenic phenotype of human mesenchymal progenitor cells differentiated in vitro. J Orthop Res. 2003;21: 451–457. doi:10.1016/S0736-0266(02)00230-9 244. Park SE, Kim H, Kwon S, Choi S, Oh S, Ryu GH, et al. Pressure Stimuli Improve the Proliferation of Wharton’s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells under Hypoxic Culture Conditions. Int J Mol Sci 2020, Vol 21, Page 7092. 2020;21: 7092. doi:10.3390/IJMS21197092 245. Yang A, Lu Y, Xing J, Li Z, Yin X, Dou C, et al. IL-8 Enhances Therapeutic Effects of BMSCs on Bone Regeneration via CXCR2-Mediated PI3k/Akt Signaling Pathway. Cell Physiol Biochem. 2018;48: 361–370. doi:10.1159/000491742 246. Xing J, Hou T, Jin H, Luo F, Change Z, Li Z, et al. Inflammatory Microenvironment Changes the Secretory Profile of Mesenchymal Stem Cells to Recruit Mesenchymal Stem Cells. Cell Physiol Biochem. 2014;33: 905–919. doi:10.1159/000358663 247. Blasioli DJ, Kaplan DL. The Roles of Catabolic Factors in the Development of Osteoarthritis. Tissue Eng Part B Rev. 2014;20: 355. doi:10.1089/TEN.TEB.2013.0377 248. Tsuchida AI, Beekhuizen M, Rutgers M, Osch GJ van, Bekkers JE, Bot AG, et al. Interleukin-6 is elevated in synovial fluid of patients with focal cartilage defects and stimulates cartilage matrix production in an in vitro regeneration model. Arthritis Res Ther. 2012;14: R262. doi:10.1186/AR4107 249. Villiger P, Kusari A, Dijke P ten, Lotz M. IL-1 beta and IL-6 selectively induce transforming growth factor-beta isoforms in human articular chondrocytes. J Immunol. 1993;6: 3337–3344. 250. Hauser SP, Kajkenova O, Lipschitz DA. The pivotal role of interleukin 6 in formation and function of hematopoietically active murine long-term bone marrow cultures. Stem Cells. 1997. pp. 125–132. doi:10.1002/stem.150125 251. Xing Z, Gauldie J, Cox G, Baumann H, Jordana M, Lei XF, et al. IL-6 is an antiinflammatory cytokine required for controlling local or systemic acute inflammatory responses. J Clin Invest. 1998;101: 311. doi:10.1172/JCI1368 252. Ryu J-H, Yang S, Shin Y, Rhee J, Chun C-H, Chun J-S. Interleukin-6 plays an essential role in hypoxia-inducible factor 2α–induced experimental osteoarthritic cartilage destruction in mice. Arthritis Rheum. 2011;63: 2732–2743. doi:10.1002/ART.30451 253. Hashimoto M, Nakasa T, Hikata T, Asahara H. Molecular Network of Cartilage Homeostasis and Osteoarthritis. Med Res Rev. 2007;28: 464–481. doi:10.1002/med.20113 254. McNulty AL, Miller MR, O’Connor SK, Guilak F. The Effects of Adipokines on Cartilage and Meniscus Catabolism. Connect Tissue Res. 2011;52: 523. doi:10.3109/03008207.2011.597902 255. Kany S, Vollrath JT, Relja B. Cytokines in Inflammatory Disease. Int J Mol Sci. 2019;20. doi:10.3390/IJMS20236008 256. Kisand K, Tamm AE, Lintrop M, Tamm AO. New insights into the natural course of knee osteoarthritis: early regulation of cytokines and growth factors, with emphasis on sex-dependent angiogenesis and tissue remodeling. A pilot study. Osteoarthr Cartil. 2018;26: 1045–1054. doi:10.1016/J.JOCA.2018.05.009 257. Kosek E, Finn A, Ultenius C, Hugo A, Svensson C, Ahmed AS. Differences in neuroimmune signalling between male and female patients suffering from knee osteoarthritis. J Neuroimmunol. 2018;321: 49–60. doi:10.1016/J.JNEUROIM.2018.05.009 258. Amable PR, Teixeira MVT, Carias RBV, Granjeiro JM, Borojevic R. Protein synthesis and secretion in human mesenchymal cells derived from bone marrow, adipose tissue and Wharton’s Jelly. Stem Cell Res Ther. 2014. doi:10.1186/scrt442 259. Wu HJ, Yiu WH, Li RX, Wong DWL, Leung JCK, Chan LYY, et al. Mesenchymal stem cells modulate albumin-induced renal tubular inflammation and fibrosis. PLoS One. 2014;9. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0090883 260. Brylka LJ, Schinke T. Chemokines in Physiological and Pathological Bone Remodeling. Front Immunol. 2019;10: 2182. doi:10.3389/FIMMU.2019.02182 261. Liu YC, Kao YT, Huang WK, Lin KY, Wu SC, Hsu SC, et al. CCL5/RANTES is important for inducing osteogenesis of human mesenchymal stem cells and is regulated by dexamethasone. Biosci Trends. 2014;8: 138–143. doi:10.5582/BST.2014.01047 262. Yano S, Mentaverri R, Kanuparthi D, Bandyopadhyay S, Rivera A, Brown EM, et al. Functional expression of beta-chemokine receptors in osteoblasts: role of regulated upon activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) in osteoblasts and regulation of its secretion by osteoblasts and osteoclasts. Endocrinology. 2005;146: 2324–2335. doi:10.1210/EN.2005-0065 263. Zhao G, Zhang L, Liu Y, Fang J, Li H, Gao K, et al. Effects of platelet-derived growth factor on chondrocyte proliferation, migration and apoptosis via regulation of GIT1 expression. Mol Med Rep. 2016;14: 897–903. doi:10.3892/MMR.2016.5291 264. Fortier Dvm LA, Barker JU, Strauss EJ, Mccarrel TM, Cole BJ. SYMPOSIUM: CLINICALLY RELEVANT STRATEGIES FOR TREATING CARTILAGE The Role of Growth Factors in Cartilage Repair. doi:10.1007/s11999-011-1857-3 265. Jia H, Ma X, Tong W, Doyran B, Sun Z, Wang L, et al. EGFR signaling is critical for maintaining the superficial layer of articular cartilage and preventing osteoarthritis initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113: 14360. doi:10.1073/PNAS.1608938113 266. Li L, Liu H, Xu C, Deng M, Song M, Yu X, et al. VEGF promotes endothelial progenitor cell differentiation and vascular repair through connexin 43. Stem Cell Res Ther. 2017;8: 237. doi:10.1186/S13287-017-0684-1/FIGURES/5 267. Kim HR, Lee JH, Kim KW, Kim BM, Lee SH. The relationship between synovial fluid VEGF and serum leptin with ultrasonographic findings in knee osteoarthritis. Int J Rheum Dis. 2016;19: 233–240. doi:10.1111/1756-185X.12486 268. Deng S, Zhou J, Peng H, Fang H, Liu F, Weng J. Local intra‑articular injection of vascular endothelial growth factor accelerates articular cartilage degeneration in rat osteoarthritis model. Mol Med Rep. 2018;17: 6311–6318. doi:10.3892/MMR.2018.8652 269. Loeser RF. Molecular Mechanisms of Cartilage Destruction: Mechanics, Inflammatory Mediators, and Aging Collide. Arthritis Rheum. 2006;54: 1357. doi:10.1002/ART.21813 270. Almeida-Porada G, Atala AJ, Porada CD. Therapeutic Mesenchymal Stromal Cells for Immunotherapy and for Gene and Drug Delivery. Mol Ther - Methods Clin Dev. 2020;16: 204–224. doi:10.1016/J.OMTM.2020.01.005 271. Wang Y, Chen X, Cao W, Shi Y. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 2014;15: 1009–1016. doi:10.1038/NI.3002 272. Spaeth EL, Kidd S, Marini FC. Tracking inflammation-induced mobilization of mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 2012;904: 173–190. doi:10.1007/978-1-61779-943-3_15 273. Zhang S, Hu B, Liu W, Wang P, Lv X, Chen S, et al. Articular cartilage regeneration: The role of endogenous mesenchymal stem/progenitor cell recruitment and migration. Semin Arthritis Rheum. 2020;50: 198–208. doi:10.1016/J.SEMARTHRIT.2019.11.001 274. Endres M, Neumann K, Häupl T, Erggelet C, Ringe J, Sittinger M, et al. Synovial fluid recruits human mesenchymal progenitors from subchondral spongious bone marrow. J Orthop Res. 2007;25: 1299–1307. doi:10.1002/JOR.20394/FORMAT/PDF 275. VeDepo MC, Flores K, Jacot JG. Chemokine-Induced PBMC and Subsequent MSC Migration Toward Decellularized Heart Valve Tissue. Cardiovasc Eng Technol. 2021;12: 325–338. doi:10.1007/S13239-021-00522-1/FIGURES/7 276. Bigoni M, Turati M, Sacerdote P, Gaddi D, Piatti M, Castelnuovo A, et al. Characterization of synovial fluid cytokine profiles in chronic meniscal tear of the knee. J Orthop Res. 2017;35: 340–346. doi:10.1002/JOR.23272 277. Ren G, Lutz I, Railton P, Wiley JP, McAllister J, Powell J, et al. Serum and synovial fluid cytokine profiling in hip osteoarthritis: distinct from knee osteoarthritis and correlated with pain. BMC Musculoskelet Disord 2018 191. 2018;19: 1–11. doi:10.1186/S12891-018-1955-4 278. Vangsness CT, Burke WS, Narvy S, Fedenko AN. Human knee synovial fluid cytokines correlated with grade of knee osteoarthritis: A pilot study. [cited 15 Nov 2021]. Available: https://www.researchgate.net/publication/51754829 279. Cifù A, Domenis R, Pozzi-Mucelli M, Di Benedetto P, Causero A, Moretti M, et al. The Exposure to Osteoarthritic Synovial Fluid Enhances the Immunomodulatory Profile of Adipose Mesenchymal Stem Cell Secretome. Stem Cells Int. 2020;2020. doi:10.1155/2020/4058760 280. Bahrami S, Baheiraei N, Shahrezaee M. Biomimetic reduced graphene oxide coated collagen scaffold for in situ bone regeneration. Sci Reports 2021 111. 2021;11: 1–10. doi:10.1038/s41598-021-96271-1 281. Maleki M, Zarezadeh R, Nouri M, Sadigh AR, Pouremamali F, Asemi Z, et al. Graphene Oxide: A Promising Material for Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Biomol Concepts. 2020;11: 182–200. doi:10.1515/BMC-2020-0017 282. Li M, Hao M, Jiang D, Chen Y, Wang W. In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye. JoVE (Journal Vis Exp. 2017;2017: e56273. doi:10.3791/56273 283. Lu J, Cheng C, He Y-S, Lyu C, Wang Y, Yu J, et al. Multilayered Graphene Hydrogel Membranes for Guided Bone Regeneration. Adv Mater. 2016;28: 4025–4031. doi:10.1002/ADMA.201505375 284. Yang Y, Liu Y, Lin Z, Shen H, Lucas C, Kuang B, et al. Condensation-Driven Chondrogenesis of Human Mesenchymal Stem Cells within Their Own Extracellular Matrix: Formation of Cartilage with Low Hypertrophy and Physiologically Relevant Mechanical Properties. Adv Biosyst. 2019;3: 1900229. doi:10.1002/ADBI.201900229 285. Hung H-S, Kung M-L, Chen F-C, Ke Y-C, Shen C-C, Yang Y-C, et al. Nanogold-Carried Graphene Oxide: Anti-Inflammation and Increased Differentiation Capacity of Mesenchymal Stem Cells. Nanomater 2021, Vol 11, Page 2046. 2021;11: 2046. doi:10.3390/NANO11082046 286. Gadjanski I, Spiller K, Vunjak-Novakovic G. Time-dependent processes in stem cell-based tissue engineering of articular cartilage. Stem Cell Rev. 2012;8: 863. doi:10.1007/S12015-011-9328-5 287. Kamiya N, Watanabe H, Habuchi H, Takagi H, Shinomura T, Shimizu K, et al. Versican/PG-M Regulates Chondrogenesis as an Extracellular Matrix Molecule Crucial for Mesenchymal Condensation. J Biol Chem. 2006;281: 2390–2400. doi:10.1074/JBC.M509341200 288. Akkiraju H, Nohe A. Role of Chondrocytes in Cartilage Formation, Progression of Osteoarthritis and Cartilage Regeneration. J Dev Biol. 2015;3: 177. doi:10.3390/JDB3040177 289. Wang K, Ruan J, Song H, Zhang J, Wo Y, Guo S, et al. Biocompatibility of Graphene Oxide. Nanoscale Res Lett. 2011;6: 8. doi:10.1007/S11671-010-9751-6 290. Park J, Kim B, Han J, Oh J, Park S, Ryu S, et al. Graphene Oxide Flakes as a Cellular Adhesive: Prevention of Reactive Oxygen Species Mediated Death of Implanted Cells for Cardiac Repair. ACS Nano. 2015;9: 4987–4999. doi:10.1021/NN507149W 291. Jagiełło J, Sekuła-Stryjewska M, Noga S, Adamczyk E, Dźwigońska M, Kurcz M, et al. Impact of Graphene-Based Surfaces on the Basic Biological Properties of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells: Implications for Ex Vivo Cell Expansion Aimed at Tissue Repair. Int J Mol Sci. 2019;20: 4561. doi:10.3390/IJMS20184561 292. Sekuła-Stryjewska M, Noga S, Dźwigońska M, Adamczyk E, Karnas E, Jagiełło J, et al. Graphene-based materials enhance cardiomyogenic and angiogenic differentiation capacity of human mesenchymal stem cells in vitro - Focus on cardiac tissue regeneration. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2021;119. doi:10.1016/J.MSEC.2020.111614 293. Anderson P, Carrillo-Gálvez AB, García-Pérez A, Cobo M, Martín F. CD105 (Endoglin)-Negative Murine Mesenchymal Stromal Cells Define a New Multipotent Subpopulation with Distinct Differentiation and Immunomodulatory Capacities. PLoS One. 2013;8: 76979. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0076979 294. Finnson KW, Parker WL, Chi Y, Hoemann CD, Goldring MB, Antoniou J, et al. Endoglin differentially regulates TGF-β-induced Smad2/3 and Smad1/5 signalling and its expression correlates with extracellular matrix production and cellular differentiation state in human chondrocytes. Osteoarthr Cartil. 2010;18: 1518–1527. doi:10.1016/j.joca.2010.09.002 295. Lee WC, Lim CHYX, Shi H, Tang LAL, Wang Y, Lim CT, et al. Origin of enhanced stem cell growth and differentiation on graphene and graphene oxide. ACS Nano. 2011;5: 7334–7341. doi:10.1021/NN202190C 296. Südbeck P, Schmitz ML, Baeuerle PA, Scherer G. Sex reversal by loss of the C-terminal transactivation domain of human SOX9. Nat Genet. 1996;13: 230–232. doi:10.1038/NG0696-230 297. Mahony CB, Pasche C, Braunersreuther V, Savvides SN, Agostini A de, Bertrand JY. Hapln1b organizes the ECM to modulate kit signaling and control developmental hematopoiesis in zebrafish. bioRxiv. 2020; 2020.06.23.161406. doi:10.1101/2020.06.23.161406 298. Bryk M, Mlost J, Labedz-Maslowska A, Szkaradek A, Karnas E, Kmiotek-Wasylewska K, et al. Mesenchymal stem cells cultured on innovate composites and their derivatives as a novel cell therapy approaches in the treatment of osteoarthritis In Vivo. Osteoarthr Cartil. 2020;28: S506–S507. doi:10.1016/J.JOCA.2020.02.796 299. Gao G, Grimm D, Cohen IR, Lambris JD. Regulatory Aspects of Gene Therapy and Cell Therapy Products. A Global Perspective. Cristina Galli M, Serabian M, editors. American Society of Gene & Cell Therapy; 2015. doi:10.1007/978-3-319-18618-4 300. Gebo JET, Lau AF. Sterility Testing for Cellular Therapies: What Is the Role of the Clinical Microbiology Laboratory? J Clin Microbiol. 2020;58: 1–14. doi:10.1128/JCM.01492-19 301. Morrow D, Ussi A, Migliaccio G. Addressing Pressing Needs in the Development of Advanced Therapies. Front Bioeng Biotechnol. 2017;5. doi:10.3389/FBIOE.2017.00055 302. Crookes H, McCaffrey J, Hawkins R, Guest R. Stability consideration for cryopreserved starting material to facilitate large-scale production of ATMPs. Cytotherapy. 2020;22: S142. doi:10.1016/J.JCYT.2020.03.284 303. Belotti D, Gaipa G, Bassetti B, Cabiati B, Spaltro G, Biagi E, et al. Full GMP-compliant validation of bone marrow-derived human CD133(+) cells as advanced therapy medicinal product for refractory ischemic cardiomyopathy. Biomed Res Int. 2015;13: 230–232. doi:10.1155/2015/473159 304. Pogozhykh D, Prokopyuk V, Pogozhykh O, Mueller T, Prokopyuk O. Influence of factors of cryopreservation and hypothermic storage on survival and functional parameters of multipotent stromal cells of placental origin. PLoS One. 2015;10. doi:10.1371/journal.pone.0139834 305. Kumar A, Xu Y, Yang E, Wang Y, Du Y. Fidelity of long-term cryopreserved adipose-derived stem cells for differentiation into cells of ocular and other lineages. Exp Eye Res. 2019;189. doi:10.1016/j.exer.2019.107860 306. Yuan Z, Lourenco SDS, Sage EK, Kolluri KK, Lowdell MW, Janes SM. Cryopreservation of human mesenchymal stromal cells expressing TRAIL for human anti-cancer therapy. Cytotherapy. 2016;18: 860–869. doi:10.1016/J.JCYT.2016.04.005 307. Horiuchi K, Ozeki N, Endo K, Mizuno M, Katano H, Akiyama M, et al. Thawed cryopreserved synovial mesenchymal stem cells show comparable effects to cultured cells in the inhibition of osteoarthritis progression in rats. Sci Reports 2021 111. 2021;11: 1–14. doi:10.1038/s41598-021-89239-8 308. Mazini L, Ezzoubi M, Malka G. Overview of current adipose-derived stem cell (ADSCs) processing involved in therapeutic advancements: flow chart and regulation updates before and after COVID-19. Stem Cell Res Ther. 2021;12. doi:10.1186/S13287-020-02006-W 309. Ścieżyńska A, Soszyńska M, Szpak P, Krześniak N, Malejczyk J, Kalaszczyńska I. Influence of hypothermic storage fluids on mesenchymal stem cell stability: A comprehensive review and personal experience. Cells. 2021;10. doi:10.3390/cells10051043 310. Kim HS, Lee NK, Yoo D, Lee J, Choi SJ, Oh W, et al. Lowering the concentration affects the migration and viability of intracerebroventricular-delivered human mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2017;493: 751–757. doi:10.1016/J.BBRC.2017.08.115 311. Torre ML, Lucarelli E, Guidi S, Ferrari M, Alessandri G, De Girolamo L, et al. Ex Vivo Expanded Mesenchymal Stromal Cell Minimal Quality Requirements for Clinical Application. Stem Cells Dev. 2015;24: 677–685. doi:10.1089/scd.2014.0299 8. ZAŁĄCZNIKI Tabela 21. Spis procedur Systemu Zarządzania Jakością powstałych w celu uzyskania zgody administracyjnej na wytwarzanie produktu ATMP-HE, uwzględniających infrastrukturę laboratorium typu cleanroom. Opracowano na podstawie dokumetacji SZJ Jagiellońskiego Centrum Innowacji, sporządzonej celem możliwości rejestracji produktu ATMP-HE. SZJ: System Zapewnienia Jakości; IZN: Istotne Zdarzenia Nieporządane; GMP: Dobra Praktyka Wytwarzania (ang. Good Manufacturing Practice); ATMP-HE: produktu leczniczy terapii zaawansowanej – wyjątek szpitalny (ang. Advanced Medicinal Therapy Product, Hospital Exemption); GDP: Dobra Praktyka Dystrybucji (ang. Good Distribution Practice); BTiK: Bank Tkanek i Komórek. Spis procedur obejmujących SZJ Nazwa procedury Przedmiot procedury Nadzór nad dokumentami proces postępowania z dokumentami systemowymi tworzącymi dokumentację SZJ Nadzór nad zapisami zapewnienie właściwego prowadzenia, utrzymania i bezpiecznego przechowywania zapisów w ramach SZJ Organizacja pracy personelu zasady dotyczące organizacji pracy personelu w tym zakresu zadań, uprawnień i odpowiedzialności pracowników, działalności szkoleniowej, która ma zapewniać właściwe kwalifikacje i kompetencje pracowników Zarządzanie ryzykiem proces efektywnego zarządzania ryzykiem w obszarze jakości, zapewniający właściwą jakość i bezpieczeństwo stosowania produktu leczniczego dla pacjenta poprzez zapewnienie odpowiednich środków pozwalających na identyfikację i kontrolę potencjalnego ryzyka związanego z rozwojem produktu i jego wytwarzaniem Certyfikacja i zwalnianie serii ocena zgodności wytworzonego produktu ATMP-HE z wymaganiami SZJ, które obejmują wymagania Prawa Farmaceutycznego, GMP oraz prowadzenie działalności jako Bank Tkanek i Komórek Kontrola zmian tryb postępowania podczas opiniowania, wdrażania, nadzoru nad wdrażaniem oraz oceną wdrożonych zmian w procesach wytwarzania produktów ATMP-HE łącznie z jego środowiskiem wytwarzania i powiadamiania o zmianach właściwych organów nadzorujących Postępowanie z odchyleniami i odstępstwami sposób dokumentowania oraz ocena (z zastosowaniem analizy ryzyka) odchyleń i odstępstw występujących w procesie wytwarzania od momentu przyjęcia tkanki/ komórek przez etapy wytwarzania, którym podlegają materiały wyjściowe i opakowaniowe oraz powstające w trakcie prowadzenia procesu hodowli produkty łącznie z produktem końcowym Postępowanie w IZN i sytuacjach nadzwyczajnych tryb postępowania w przypadku wystąpienia sytuacji nadzwyczajnej i zdarzenia niepożądanego, w szczególności powiadomienia o tym fakcie stosownych instytucji, opracowania działań mających na celu zapewnienie bezpieczeństwa biorcy/dawcy oraz zapobiegających/monitorujących wystąpieniu w/w sytuacji w przyszłości Działania korygujące, zapobiegawcze i doskonalające dokumentowanie działań korygujących, zapobiegawczych i doskonalących, zapewniających skuteczne wyeliminowanie potencjalnych i rzeczywistych przyczyn powstawania niezgodności Przegląd SZJ tryb postępowania przy planowaniu, prowadzeniu i dokumentowaniu przeglądów SZJ, w tym przeglądu jakości produktu oraz monitorowania realizacji działań poprzeglądowych Program Higieny zasady dotyczące zachowania się personelu, sposobu przygotowania pomieszczeń, materiałów oraz urządzeń tak, żeby nie stanowiły źródła zanieczyszczeń dla wytwarzanych produktów ATMP-HE oraz skuteczna kontrola procesów utrzymania higieny poprzez monitorowanie parametrów warunków środowiskowych Kwalifikacja dostawców zapewnienie określonej i powtarzalnej jakości materiałów, produktów i usług, a także określenie zasad i organizacji procesu kwalifikacji dostawców, ustanowienie listy zatwierdzonych dostawców spełniających wymagania jakościowe określone w dokumentacji SZJ oraz specyfikacjach jakościowych Przyjmowanie, przechowywanie i wydawanie materiałów proces poprawnego składania zamówień na materiały wyjściowe, opakowaniowe i pośrednie, ich przyjmowanie, zwalnianie oraz magazynowanie, w tym monitorowanie warunków przechowywania Kwalifikacja i walidacja zasady planowania, zarządzania działaniami walidacyjnymi oraz utrzymywania osiągniętego w wyniku działań walidacyjnych statusu przy uwzględnieniu wymagań Prawa Farmaceutycznego, GMP, GDP, norm ISO oraz regulacji prawnych związanych z wytwarzaniem produktów leczniczych terapii zaawansowanych Nadzór nad wyposażeniem zasady dotyczące zarządzania wyposażeniem, którego stosowanie zapewnia prawidłowe wytwarzanie produktu AMTP-HE oraz uzyskanie miarodajnych i wiarygodnych wyników przeprowadzonych badań Postępowanie z wynikiem poza specyfikacją / poza limitem tryb postępowania w przypadku pojawienia się wyniku poza specyfikacją oraz wyniku poza limitem, które ma prowadzić do podjęcia odpowiednich działań i/ lub podjęcia decyzji o zwolnieniu/ odrzuceniu produktu Proces wytwarzania ATMP-HE organizacja procesu wytwarzania zgodnie z zasadami GMP, w tym: ▪ wymagania ogólne dla procesu wytwarzania (personel, warunki środowiskowe, materiały) ▪ organizacja przeprowadzenia procesów wytwarzania w BTiK, ▪ sposób dokumentowania procesów wytwarzania, ▪ zgłaszanie odchyleń i niezgodności w procesie wytwarzania Kontrola jakości w BTiK podejmowanie czynności kontroli i badań, oceny jakościowej produktów i materiałów oraz zwalnianie / odrzucanie produktów i materiałów, które są dokumentowane i przeprowadzane w sposób zorganizowany, gwarantujący właściwą jakość wytwarzanych produktów ATMP-HE Audyty utrzymanie i doskonalenie SZJ poprzez ustalenie sposobu postępowania podczas planowania, przeprowadzania i dokumentowania audytów wewnętrznych oceniających funkcjonowanie SZJ oraz zewnętrznych u dostawców i podmiotów współpracujących Rycina 38. Podsumowanie opinii Komisji ds. Terapii Zaawansowanych (CAT) dotyczącej klasyfikacji wnioskowanego produktu terapii komórkowej (część 1/2). Przedstawione zalecenia CAT, w formie tabelarycznej (część 1/2, kolejna cześć na następnej stronie) wskazują, ze opracowany produkt terapii komórkowej wpisuje się w definicje tzw. produktu inżynierii tkankowej (TEP) o właściwości regeneracji, naprawy lub zastępowania uszkodzonej tkanki ludzkiej, stosowany w celu przywrócenia jej pierwotnej funkcji. Klasyfikacja CAT wymagana jest podczas ubiegania się o zgodę Głównego Inspektoratu Farmaceutycznego na wytwarzanie produktu ATMP-HE. Cd Rycina 38. Podsumowanie opinii Komisji ds. Terapii Zaawansowanych (CAT) dotyczącej klasyfikacji wnioskowanego produktu terapii komórkowej (część 2/2). Rycina 40. Decyzja Głownego Inspektoratu Farmaceutycznego (GIF) na wytwarzanie wnioskowanego produktu ATMP-HE. Po przeprowadzeniu przez GIF inspekcji w miejscu wytwarzania produktu ATMP-HE i spełnieniu wymagań Dobrej Praktyki Wytwarzzania, wydanie zgody dokonywane jest na drodze decyzji administracyjnej, zgodnie z art. 38a ust. 6 ustawy z dnia 6 września 2001 r. - Prawo farmaceutyczne.