Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Anna Łabędź-Masłowska Ocena potencjału biologicznego mikropęcherzyków z hodowli antygenowo zdefiniowanych komórek macierzystych szpiku kostnego dla celów regeneracji tkanek Praca doktorska Promotor: dr hab. Ewa Zuba-Surma, prof. UJ Pracę wykonano w Zakładzie Biologii Komórki na Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Kraków 2018 Pragnę serdecznie podziękować: Pani dr hab. Ewie Zubie-Surmie, Prof. UJ promotorowi mojej pracy, za stworzenie warunków rozwoju naukowego, poświęcony mi czas, życzliwość, wszechstronną pomoc oraz nieocenione wsparcie merytoryczne podczas całego okresu realizacji niniejszej pracy doktorskiej. Panu Prof. Buddhadeb Dawn’owi z Cardiovascular Research Institute, Division of Cardiovascular Diseases, Univeristy of Kansas Medical Center, Kansas City z USA – opiekunowi zagranicznemu podczas mojego pobytu na stażu w kierowanym przez niego Instytucie, za umożliwienie mi realizacji części badań do niniejszej pracy doktorskiej, wsparcie merytoryczne oraz cenne uwagi. Panu Prof. Ramaroson’owi Andriantsitohaina z INSERM U1063, Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques, Institut de Biologie en Santé, Universite d’Angers, Angers z Francji – opiekunowi zagranicznemu podczas mojego pobytu na stażu w kierowanym przez niego Instytucie, za umożliwienie mi realizacji części badań do niniejszej pracy doktorskiej, wsparcie merytoryczne oraz cenne uwagi. Koleżankom i Kolegom z Zakładu Biologii Komórki WBBiB UJ, z Cardiovascular Research Institute, Univeristy of Kansas Medical Center, z INSERM U1063, Institut de Biologie en Santé, Universite d’Angers, za okazaną pomoc, życzliwość oraz stworzenie miłej atmosfery pracy. Anna Łabędź-Masłowska Praca została zrealizowana w ramach projektu TEAM/2012-9/6 z Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej pt.: „Bioaktywne mikrofragmenty z komórek macierzystych, jako nowe narzędzie w regeneracji tkanek” kierowanego przez dr. hab. Ewę Zubę-Surmę, prof. UJ, na Wydziale Biochemii Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Wykonane w pracy eksperymenty były również finansowane ze środków Narodowego Centrum Badań i Rozwoju w ramach grantu badawczego POIG 01-01-02-00-109/09 pt. „Innowacyjne metody wykorzystania komórek macierzystych w medycynie” współrealizowanego przez dr. hab. Ewę Zubę-Surmę, prof. UJ na Wydziale Biochemii Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Doktorantka uzyskała także środki finansowe w ramach stypendium doktorskiego na rok akademicki 2016/2017 z Narodowego Centrum Nauki w ramach projektu Etiuda nr 2016/20/T/NZ3/00516 pt. „Ocena potencjału biologicznego mikropęcherzyków z hodowli antygenowo zdefiniowanych komórek macierzystych szpiku kostnego dla celów regeneracji tkanek”, dzięki któremu część badań objętych niniejszą pracą wykonała w czasie stażu w ośrodku zagranicznym (CVRI Kansas University Medical Center, USA). NAJWAŻNIEJSZE OSIĄGNIĘCIA DOKTORANTKI Publikacje doświadczalne: 1. Labedz-Maslowska A, Lipert B, Berdecka D, Kedracka-Krok S, Jankowska U, Kamycka E, Sekula M, Madeja Z, Dawn B, Jura J, Zuba-Surma EK. Monocyte Chemoattractant Protein-Induced Protein 1 (MCPIP1) Enhances Angiogenic and Cardiomyogenic Potential of Murine Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. PLoS One. 2015 Jul 27;10(7):e0133746. 2. Labedz-Maslowska A, Kamycka E, Bobis-Wozowicz S, Madeja Z, Zuba-Surma EK. Identification of New Rat Bone Marrow-Derived Population of Very Small Stem Cell with Oct-4A and Nanog Expression by Flow Cytometric Platforms. Stem Cells Int. 2016;2016:5069857. 3. Bobis-Wozowicz S, Kmiotek K, Kania K, Karnas E, Labedz-Maslowska A, Sekula M, Kedracka-Krok S, Kolcz J, Boruczkowski D, Madeja Z, Zuba-Surma EK. Diverse impact of xeno-free conditions on biological and regenerative properties of hUC-MSCs and their extracellular vesicles. J Mol Med (Berl). 2017 Feb;95(2):205-220. 4. Niewiarowska-Sendo A, Łabędź-Masłowska A, Kozik A, Guevara-Lora I. Bradykinin B2 receptor and dopamine D2 receptor cooperatively contribute to the regulation of neutrophil adhesion to endothelial cells. Acta Biochim Pol. 2018;65(3):367-375. 5. Koczurkiewicz P, Kowolik E, Podolak I, Wnuk D, Piska K, Łabędź-Masłowska A, WójcikPszczoła K, Pękala E, Czyż J, Michalik M. Synergistic Cytotoxic and Anti-invasive Effects of Mitoxantrone and Triterpene Saponins from Lysimachia ciliata on Human Prostate Cancer Cells. Planta Med. 2016 Dec;82(18):1546-1552. 6. Luty M, Kwiecień E, Firlej M, Łabędź-Masłowska A, Paw M, Madeja Z, Czyż J. Curcumin augments the cytostatic and anti-invasive effects of mitoxantrone on carcinosarcoma cells in vitro. Acta Biochim Pol. 2016;63(3):397-401. 7. Guevara-Lora I, Stalinska K, Augustynek B, Labedz-Maslowska A. Influence of kinin peptides on monocyte-endothelial cell adhesion. J Cell Biochem. 2014 Nov;115(11):1985 95. 8. Guevara-Lora I, Labedz A, Skrzeczynska-Moncznik J, Kozik A. Bradykinin and des-Arg10kallidin enhance the adhesion of polymorphonuclear leukocytes to extracellular matrix proteins and endothelial cells. Cell Commun Adhes. 2011 Aug;18(4):67-71. Artykuły przeglądowe: 1. Dąbkowski K, Łabędź-Masłowska A, Zuba-Surma E, Starzyńska T. [Role of the bone marrow derived stem cells in pancreatic inflammatory disorders]. Pol Merkur Lekarski. 2017 Apr 21;42(250):137-141. 2. Zuba-Surma E, Labedz-Maslowska A, Kamycka E, Madeja Wieloparametryczna klasyczna i obrazowa cytometria przepływokomórek macierzystych. Cytometria polska 2012;1(1):127-141. Z, wa Raw tajczak identyf MZ. ikacji Projekty własne: „Ocena potencjału biologicznego mikropęcherzyków z hodowli antygenowo zdefiniowanych komórek macierzystych szpiku kostnego dla celów regeneracji tkanek” (2016/2017) -Projekt Etiuda finansowany przez Narodowe Centrum Nauki. Udział w innych projektach naukowych realizowanych w grupie, kierowanych przez opiekuna pracy: 1. "Bioaktywne mikrofragmenty z komórek macierzystych jako nowe narzędzie w regeneracji tkanek" (2012-2015) - Projekt TEAM finansowany przez Fundację na Rzecz Nauki Polskiej. 2. „Innowacyjne metody wykorzystania komórek macierzystych w medycynie” (2010-2015) – projekt POIG finansowany ze środków Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju. 3. „Badania efektywności mikrofragmentów z komórek macierzystych modyfikowanych genetycznie jako nośników miRNA o działaniu proangiogennym i kardiomiogennym” (20142017) - Projekt SONATA BIS finansowany przez Narodowe Centrum Nauki. 4. "Optymalizacja złożonych biokompatybilnych rusztowań opartych o grafen oraz zdefiniowane populacje komórek macierzystych dla celów regeneracji tkanek” (2015-2019) Projekt SYMFONIA finansowany przez Narodowe Centrum Nauki. 5. "Opracowanie zoptymalizowanych metod leczenia uszkodzeń tkankowych w oparciu o innowacyjne kompozyty oraz mezenchymalne komórki macierzyste i ich pochodne u pacjentów z chorobami cywilizacyjnymi" (2017-2020) - Projekt STRATEGMED III „Profilaktyka i leczenie chorób cywilizacyjnych” finansowany przez przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju. Staże naukowe: 1. The University of Kansas Medical Center, Cardiovascular Research Institute, Kansas City, USA; 01.07.2017 – 30.09.2017 r. 2. Jagiellońskie Centrum Innowacji Sp. z o.o., Laboratorium Hodowli Tkanek i Komórek, Kraków, Polska; 15.07.2016 – 15.01.2017 r. 3. Universite d’Angers, Institut de Biologie en Santé, INSERM U1063, Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques, Angers, France; 07.07.2015 – 11.09.2015 r. Prezentacje konferencyjne: 1. “Extracellular Vesicles derived from Mesenchymal Stem Cells as a new promising tool in regeneration of ischemic tissue injury”. Konferencja: XLIII Szkoła Zimowa Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego; Zakopane, Polska; 1620.02.2016 r. 2. “Intravenous injected mesenchymal stem cell- derived extracellular vesicles are localized in site of ischemic injury and improve blood flow recovery in vivo”. Konferencja: Regenerative potential of bone marrow derived cells used fresh or propagated in clinical settings; Wrocław, Polska; 14-16.12.2015 r. 3. “In vivo Very Small Embryonic-like Stem Cells are activated by acute tissue injury and participate in regeneration of ischemic tissue”. Konferencja: World Conference on Regenerative Medicine; Leipzig, Niemcy; 21-23.10.2015 r. 4. “Activation of Bone Marrow- Derived Very Small Embryonic-Like Stem Cells by Acute Tissue Injury in vivo”. Konferencja: Biological and Clinical Aspects of the use of Somatic Stem Cells in Regenerative Medicine; Wrocław, Polska; 16-17.12.2013 r. SPIS TREŚCI WYKAZ SKRÓTÓW ............................................................................................................... 8 STRESZCZENIE ................................................................................................................... 11 ABSTRACT .......................................................................................................................... 13 1. WSTĘP ................................................................................................................................ 15 1.1. Choroby niedokrwienne i metody ich leczenia ............................................................ 15 1.2. Komórki macierzyste w regeneracji niedotlenionych tkanek ...................................... 19 1.3. Mezenchymalne komórki macierzyste - miejsce w klasyfikacji i właściwości biologiczne ............................................................................................................................... 21 1.4. Mechanizmy działania komórek MSCs w procesach regeneracji niedotlenionych tkanek ……………………………………………………………………………………….. 24 1.5. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.................................................................................. 29 1.5.1. Klasyfikacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, mechanizmy powstania i ich skład molekularny ................................................................................................................ 29 1.5.2. Mechanizmy działania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ................................. 32 1.5.3. Funkcja i znaczenie biologiczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych .................. 34 1.5.4. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez komórki macierzyste i próby ich wykorzystania w regeneracji tkanek .................................................................................... 36 2. CELE PRACY .................................................................................................................... 40 3. MATERIAŁY I METODY ................................................................................................ 41 3.1. Materiał badawczy ....................................................................................................... 41 3.1.1. Zwierzęta .................................................................................................................. 41 3.1.2. Hodowle komórkowe ............................................................................................... 41 3.1.2.1. Izolacja oraz hodowla komórek MSCs ............................................................ 41 3.1.2.2. Hodowla mysich komórek śródbłonka serca (MCEC) ..................................... 43 3.1.3. Izolaty pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z komórek MSCs (MSC-EVs) ........ 43 3.2. Metody i protokoły analityczne ................................................................................... 43 3.2.1. Analiza morfologii i profilu antygenowego komórek MSCs ................................... 43 3.2.2. Analiza żywotności komórek ................................................................................... 45 3.2.3. Analiza cyklu komórkowego ................................................................................... 46 3.2.4. Badanie potencjału różnicowania komórek MSCs in vitro ...................................... 46 3.2.5. Izolacja EVs z komórek MSCs ................................................................................ 48 3.2.5.1. Kolekcjonowanie pożywek kondycjonowych z hodowli komórek MSCs ....... 48 3.2.5.2. Izolacja EVs z pożywek kondycjonowanych metodą sekwencyjnego wirowania ………………………………………………………………………………...48 3.2.6. Pomiar stężenia białka metodą Bradforda ................................................................ 50 3.2.7. Ocena integralności ultrastruktury MSC-EVs .......................................................... 50 3.2.8. Analiza wielkości MSC-EVs ................................................................................... 51 3.2.9. Analiza wybranych markerów białkowych w preparatach MSC-EVs .................... 51 3.2.10. Globalna analiza proteomiczna MSC-EVs .......................................................... 53 3.2.11. Analiza składu mikroRNA w MSC-EVs ............................................................. 55 3.2.12. Analiza obecności transkryptów mRNA w MSC-EVs ........................................ 58 3.2.13. Analiza profilu antygenów powierzchniowych MSC-EVs .................................. 60 3.2.14. Ocena internalizacji MSC-EVs przez komórki MCEC in vitro ........................... 61 3.2.15. Ocena wpływu MSC-EVs na potencjał angiogenny komórek MCEC in vitro ... 62 3.2.16. Analiza ekspresji markerów aktywowanego śródbłonka naczyniowego na powierzchni komórek MCEC in vitro .................................................................................. 64 3.3. Modele i procedury badań in vivo................................................................................ 65 3.3.1. Badania in vivo z wykorzystaniem mysiego modelu ostrego zawału mięśnia sercowego ............................................................................................................................. 65 3.3.1.1. Badanie retencji MSC-EVs w narządach po uszkodzeniu AMI ...................... 66 3.3.1.2. Badanie potencjału regeneracyjnego MSC-EVs po uszkodzeniu AMI ........... 68 3.3.1.3. Analiza funkcjonalna serca in vivo - Badania echokardiograficzne (ECHO) .. 70 3.3.1.4. Analiza histologiczna tkanek serca post mortem - Barwienie histochemiczne 70 3.3.2. Badania in vivo z wykorzystaniem mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny .............................................................................................................................. 72 3.3.2.1. Badanie retencji MSC-EVs w narządach po niedokrwiennym uszkodzeniu kończyny ………………………………………………………………………………...73 3.3.2.2. Badanie potencjału regeneracyjnego MSC-EVs po niedokrwiennym uszkodzeniu kończyny ..................................................................................................... 74 3.3.2.3. Analiza funkcjonalna in vivo - Badanie przepływu krwi w kończynach metodą Dopplera ………………………………………………………………………………...76 3.3.2.4. Analiza histologiczna tkanek kończyny post mortem - Badania immunohistochemiczne i biochemiczne .......................................................................... 76 3.3.2.4.1. Pomiar produkcji tlenku azotu (NO) oraz anionu ponadtlenkowego (O2-) techniką Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR) ................................ 77 3.3.2.4.2. Badanie ekspresji białek związanych z angiogenezą w tkankach ................ 78 3.3.2.4.3. Barwienie immunofluorecencyjne skrawków mrożeniowych ..................... 79 3.4. Analiza statystyczna wyników ..................................................................................... 80 4. WYNIKI .............................................................................................................................. 81 4.1. Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna mysich komórek MSCs ......................... 81 4.2. Pozyskiwanie pożywek kondycjonowanych z hodowli komórek MSCs w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ...................................................................................... 85 4.3. Ocena morfologii i wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowli komórek MSCs ……………………………………………………………………………………….. 86 4.4. Charakterystyka MSC-EVs na podstawie obecności markerów EVs .......................... 88 4.5. Charakterystyka bioaktywnej zawartości molekularnej przenoszonej przez MSC-EVs ………………………………………………………………………………………...96 4.5.1. Globalna analiza proteomiczna MSC-EVs .............................................................. 96 4.5.2. Analiza transkryptów miRNA i mRNA w komórkach MSCs oraz preparatach MSC-EVs……… ......................................................................................................................... 108 4.6. Oddziaływanie MSC-EVs z komórkami śródbłonka naczyń serca i ich wpływ na wybrane funkcje komórek in vitro ......................................................................................... 113 4.7. Badanie retencji MSC-EVs podanych dożylnie w mysim modelu zawału mięśnia sercowego in vivo .................................................................................................................. 119 4.8. Badanie retencji MSC-EVs podanych dożylnie w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo ............................................................................................... 124 4.9. Ocena potencjału regeneracyjnego MSC-EVs oraz komórek MSCs w mysim modelu zawału mięśnia sercowego in vivo ......................................................................................... 127 4.10. Ocena potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo ............................................................................................... 132 4.11. Analiza biochemiczna tkanek mięśniowych pobranych od myszy w modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo ................................................................... 136 5. DYSKUSJA ....................................................................................................................... 139 6. PODSUMOWANIE I WNIOSKI KOŃCOWE ............................................................. 158 7. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................. 159 8. ZAŁĄCZNIKI .................................................................................................................. 176 WYKAZ SKRÓTÓW ABC (ang. ammonium bicarbonate) - wodorowęglan amonu ACN (ang. acetonitrile) - acetonitryl ADM (ang. adrenomedullin) - adrenomodulina AFM (ang. atomic force microscopy) - mikroskopia sił atomowych Akt (ang. protein kinase B) – kinaza białkowa B AMI (ang. acute myocardial infarction) - ostry zawał mięśnia sercowego ANG-1 (ang. angiopoietin 1) - angiopoetyna 1 AT-MSCs (ang. adipose tissue-derived mesenchymal stem cells) - komórek MSCs z tkanki tłuszczowej BF (ang. brieght-field) – jasne pole BM-MSCs (ang. Bone marrow- derived mesenchymal stem cells) - komórki MSCs pochodzące ze szpiku kostnego BMP-2 (ang. bone morphogenetic protein-2) białko morfogenetyczne kości 2 BRUB (ang. Britton and Robinson universal buffer) - bufor uniwersalny Britton & Robinson BSA (ang. bovine serum albumin) - albumina z surowicy bydlęcej CFU-F (ang. Colony Forming Unit- Fibroblast) – jednostka tworząca kolonię fibroblastów CLI (ang. critical limb ischemia) - przebieg ostry choroby niedokrwiennej kończyny CMCs (ang. cardiomyocytes) - kardiomiocyty CSCs (ang. cardiac stem cells) - komórki macierzyste serca CPCs (ang. cardiac progenitor cells) – komórki progenitorowe serca DTT (ang. dithiothreitol) - ditiotreitol ECM (ang. extracellular matrix protein) - białko macierzy pozakomórkowej ECs (ang. endothelial cells) - komórki śródbłonka naczyń eNOS (ang. nitric-oxide synthase) – syntaza tlenku azotu EPCs (ang. endothelial progenitor cells) - komórki progenitorowe śródbłonka EPO (ang. erythropoietin) - erytropoetyna EPR (ang. electron paramagnetic resonanse) - elektronowy rezonans paramagnetyczny ERK (ang. extracellular signal-regulated kinases) – zewnątrzkomórkowe kinazy regulowane sygnałem ESCRT (ang. Endosomal Sorting Complex Required for Transport) – endosomalny kompleks białkowy wymagany do transportu EVs (ang. Extracellular Vesicles) - pęcherzyki zewnątrzkomórkowe; mikropęcherzyki komórkowe FACS (ang. Fluorescence-activated cell sorting) – analiza komórek w oparciu o ich właściwości fluorescencyjne techniką cytometrii przepływowej FBS (ang. fetal bovine serum) - bydlęca surowica płodowa FDR (ang. false discovery rate) - współczynnik fałszywych odkryć FGF-2 (ang. fibroblast growth factor-2) - czynnik wzrostu fibroblastów-2 FGF-7 (ang. fibroblast growth factor-7) - czynnik wzrostu fibroblastów-7 GFP (ang. Green Fluorescent Protein) – białko zielonej fluorescencji GO (ang. Gene Ontology) - Ontologia Genów HGF (ang. hepatocyte growth factor) - czynnik wzrostu hepatocytów HIF-1α (ang. hypoxia-inducible factor 1α) - czynnik indukujący niedotlenienie-1α HSCs (ang. hematopoietic stem cells) - krwiotwórcze komórki macierzyste i.m. (ang. intramuscular) – podanie domięśniowe i.v. (ang. intraventricular) – podanie dożylne I/R (ang. ischemia/ reperfusion injury) – uszkodzenie wywołane ischemią i reperfuzją IGF-1 (ang. insulin-like growth factor-1) - insulinopodobny czynnik wzrostu 1 IHD (ang. Ischemic Heart Disease) - choroba niedokrwienna serca IL-10 (ang. interleukin-10) interleukina 10 IL-1β (ang. interleukin-1β) interleukina 1β IL-4 (ang. interleukin-4) interleukina 4 IL-6 (ang. interleukin-6) interleukina 6 iPS (ang. induced pluripotent stem cells) - indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste ISCT (ang. International Society for Cellular Therapy) - Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej ISEV (ang. International Society for Extracellular Vesicles) - Międzynarodowe Towarzystwo Naukowe zajmujące się badaniami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych KM (ang. stem cells) - komórki macierzyste LAD (ang. left anterior descending artery) - tętnica przednia zstępująca LC-MS/MS (ang. liquid chromatography-tandem mass spectrometry) - chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas LI (ang. limb ischemia) - uszkodzenie niedokrwienne kończyny LK (ang. left ventricle) - lewa komora lncRNA (ang. long non-coding RNA) - długie niekodujące RNA LVEDD (ang. LV end diastolic diameter) - końcowo- rozkurczowy wymiar wewnętrzny (średnica) LK serca LVEDV (ang. LV end diastolic volume) - końcowo- rozkurczowa objętość LK serca LVEF (ang. left ventricle (LV) ejection fraction) - objętość wyrzutowa LK serca LVESV (ang. left ventricle (LV) end-systolic volume) - objętość końcowo-skurczowa lewej komory (LK) serca MACS (ang. magnetic-activated cell sorting) – sortowanie komórek w oparciu o właściwości magnetyczne komórek MALS (ang. middle angle light scatter) -średni kąt rozproszenia światła (parametr stosowany w wysokorozdzielczej cytometrii przepływowej) MAPK (ang. mitogen- activated protein kinase) - kinaza białkowa aktywowana mitogenem MCEC (ang. mouse cardiac endothelial cells) - mysie komórki śródbłonka serca MFI (ang. mean fluorescence intensity) -średnia intensywność fluorescencji miRNA (ang. microRNA) - mikroRNA MMP-1 (ang. matrix metalloproteinase 1) -metaloproteinaza macierzy 1 MMP-2 (ang. matrix metalloproteinase 2) -metaloproteinaza macierzy 2 MMP-9 (ang. matrix metalloproteinase 9) -metaloproteinaza macierzy 9 MS (ang. mass spectrometry) - spektrometria mas MSC-EVs (ang. Mesenchymal Stem/ Stromal Cells- derived Extracellular Vesicles) – pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez mezenchymalne komórki macierzyste/ stromalne MSCs (ang. Mesenchymal Stem/ Stromal Cells) - mezenchymalne komórki macierzyste/ stromalne MVB (ang. multi-vesicular body) – ciało wielopęcherzykowe MVs (ang. microvesicles) - mikropęcherzyki NO (ang. nitric oxide) - tlenek azotu O2-(ang. superoxide anion) - anion ponadtlenkowy PDGF-BB (ang. Platelet-Derived Growth Factor-BB) -płytkopochodny czynnik wzrostu BB PGE2 (ang. prostaglandin E2) - prostaglandyna E2 PGF (ang. prostaglandin F) - prostaglandyna F PI (ang. propidium iodide) - jodek propidyny PU (ang. perfusion unit) – jednostka perfuzji krwi ROS (ang. reactive oxygen species) - reaktywne formy tlenu SDF-1 (ang. stromal cell-derived factor-1) - czynnik komórek zrębu 1 SFRP2 (ang. Secreted frizzled-related protein 2) wydzielane białko spokrewnione z białkami frizzled 2 TB-4 (ang. thymosin beta 4) - tymozyna 4 TEM (ang. transmission electron microscopy) - transmisyjna mikroskopia elektronowa TFA (ang. trifluoroacetic acid) - kwas trifluorooctowy TGF-β (ang. transforming growth factor-β) -transformujący czynnik wzrostu β TIMP-1 (ang. tissue inhibitor of metalloproteinase-1) -tkankowy inhibitor metaloproteinazy- 1 TIMP-2 (ang. tissue inhibitor of metalloproteinase-2) -tkankowy inhibitor metaloproteinazy- 2 TIMP-9 (ang. tissue inhibitor of metalloproteinase-9) -tkankowy inhibitor metaloproteinazy- 9 TNF-α (ang. tumor necrosis factor-α) - czynnik martwicy nowotworów-α TSP-1 (ang. trombospondin 1) - trombospondyna 1 UC-MSCs (ang. umbilical cord-derived mesenchymal stem cells) - MSCs izolowanych z galarety Whartona sznura pępowinowego VEGF (ang. vascular endothelial growth factor) - czynnik wzrostu śródbłonka naczyń VSMCs (ang. vascular smooth muscle cells) - komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych STRESZCZENIE Komórki macierzyste (KM) od lat stanowią przedmiot szeregu badań, których celem jest m.in. poznanie biologii i mechanizmów działania tych komórek w odbudowie tkankowej, co daje nadzieje na ich praktyczne zastosowania w regeneracji uszkodzonych tkanek i narządów. Dotychczasowe wyniki wskazują, że jednym z istotnych mechanizmów odpowiedzialnych za efekty regeneracyjne zależne od KM jest ich aktywność parakrynna, związana z wydzielaniem szeregu bioaktywnych związków mających bezpośredni efekt na komórki endogenne w miejscu uszkodzenia. Populacją komórek, której w szczególności przypisuje się działanie parakrynne w stymulacji procesów naprawy tkankowej są komórki macierzyste mezenchymalne (ang. mesenchymal stem/ stromal cells, MSCs), pozyskiwane z różnych źródeł, w tym m.in. ze szpiku kostnego. Bioaktywne związki o działaniu parakrynnym mogą być wydzielane do środowiska bezpośrednio lub uwalniane w formie zamkniętej w tzw. pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (ang. extracellular vesicles, EVs) uwalnianych przez komórki, w tym KM, w warunkach fizjologicznych, jak i po aktywacji. EVs stanowią sferyczne obłonione pęcherzyki, które są nośnikami bioaktywnych cząsteczek pomiędzy komórkami, w tym m.in.: białek błonowych i cytoplazmatycznych, cząsteczek mRNA i mikroRNA oraz lipidów. Dzięki temu EVs odgrywają istotną rolę w komunikacji międzykomórkowej, zapewniając wymianę bioaktywnych związków pomiędzy różnymi komórkami wpływając wzajemnie na ich funkcje. Rosnąca liczba doniesień z badańświatowych wskazuje, że również EVs wydzielane przez KM mogą modulować funkcje innych komórek, w tym endogennych komórek somatycznych, progenitorowych i macierzystych rezydujących w tkankach, zwiększając tym samym również procesy regeneracyjne zachodzące w tkankach. Celem badań wykonanych w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej było zbadanie właściwości biologicznych EVs wydzielanych przez mysie szpikowe komórki MSCs (MSC-EVs), w tym m.in. ich morfologii, fenotypu i składu molekularnego oraz ich wpływu na funkcje wybranych komórek somatycznych in vitro, a także potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w mysich modelach uszkodzenia tkankowego in vivo, w tym: i) ostrego niedotlenienia mięśnia sercowego oraz ii) niedokrwiennego uszkodzenia kończyny. W pierwszym etapie wyizolowano oraz oceniono profil wieloantygenowy mysich szpikowych komórek MSCs, jako komórek rodzicielskich dla badanych EVs. Następnie z pożywek kondycjonowanych z hodowli komórek MSCs izolowano MSC-EVs -z zastosowaniem metody sekwencyjnego wirowania obejmującego ultrawirowanie. Wykazano, że MSC-EVs stanowią heterogenną populację pęcherzyków z przeważającą komponentą mikrofragmentów błonowych (ektosomów) o wielkości około 170 nm. Dalsze badania izolatów MSC-EVs wykazały m.in. obecność frakcji wykazujących ekspresję tetraspanin (CD9, CD63, CD81), co świadczy o zawartości frakcji egzosomalnej, a także potwierdziły wzbogacenie badanych EVs we frakcję ektosomów przenoszących na swojej powierzchni antygeny błonowe typowe dla komórek rodzicielskich, w tym antygenów CD29, CD44, CD90, Sca-1 oraz receptora dla VEGF. W kolejnych etapach obejmujących m.in. poszerzoną analizę proteomiczną oraz transkryptomiczną, wykazano, że MSC-EVs przenoszą szereg białek regulujących m.in. morfogenezę tkanek i struktur anatomicznych, odpowiedź na uszkodzenie, gojenie się uszkodzeń oraz odpowiedzialnych za komunikację i adhezję międzykomórkową, jak również transkrypty mRNA dla genów o działaniu proangiogennym oraz prokardiomiogennym, a także cząsteczki mikroRNA zaangażowane m.in. w regulację procesów regeneracji tkanek. W dalszych badaniach in vitro wykazano także wpływ MSC-EVs na wybrane funkcje dojrzałych komórek śródbłonka naczyń serca, w tym na ich potencjał angiogenny. Wykazano także efekt cytoprotekcyjny MSC-EVs względem tych komórek, w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego in vitro. W kolejnym etapie oceniono potencjał regeneracyjny izolowanych MSC-EVs w dwóch mysich modelach niedokrwiennego uszkodzenia tkankowego in vivo. W modelu ostrego niedotlenienia mięśnia sercowego obserwowano istotną poprawę parametrów hemodynamicznych pracy serca oraz zmniejszenie rozmiarów blizny pozawałowej u zwierząt, którym MSC-EVs przeszczepiano domięśniowo w strefie okołozawałowej miokardium - w porównaniu do zwierząt kontrolnych, po miesiącu od przeszczepu. Uzyskane wyniki potwierdziły pozytywny wpływ MSC-EVs na anatomię i funkcję uszkodzonego miokardium in vivo. W mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo, po 24 godzinach od dożylnego podania MSC-EVs, obserwowano ich akumulację w niedotlenionych tkankach, w porównaniu ze zdrową kończyną oraz innymi tkankami. Po dłuższym czasie obserwacji (po 21 dniach od przeszczepu) zaobserwowano zwiększenie perfuzji tkanek w uszkodzonej kończynie po dożylnym podaniu MSC-EVs - w porównaniu do myszy grupy kontrolnej, która korelowała m.in. z aktywacją szlaków proangiogennych oraz wyższą liczbą kapilar obecnych w tkankach. Wyniki uzyskane w tym modelu wskazują m.in. na proangiogenny efekt MSC-EVs w niedotlenionych tkankach in vivo. Podsumowując, w przeprowadzonych badaniach objętych niniejszą rozprawą doktorską wykazano, że EVs wydzielane przez mysie szpikowe komórki MSCs mogą przenosić szereg bioaktywnych cząsteczek, w tym białka zaangażowane m.in. w procesy naprawy uszkodzonych tkanek i organów oraz komunikację międzykomórkową, jak również transkrypty mRNA genów zaangażowanych w procesy angiogenezy i kardiomiogenezy oraz mikroRNA regulujące te procesy. MSC-EVs przenoszą także na swej powierzchni szereg antygenów charakterystycznych dla komórek MSCs, w tym cząsteczki adhezyjne i receptory biorące udział m.in. w angiogenezie. W badaniach in vitro, wykazano proangiogenny i cytoprotekcyjny efekt MSC-EVs w mysich komórkach śródbłonka naczyń, co może być wynikiem działania bioaktywnych cząsteczek przenoszonych przez MSC-EVs. Natomiast w mysich modelach niedokrwiennego uszkodzenia tkanek, wykazano poprawę anatomii oraz funkcji uszkodzonych organów, co potwierdza potencjał regeneracyjny MSC-EVs in vivo. ABSTRACT Stem cells (SCs) have been recently an important subject of many studies focusing on their biology and mechanisms of action in tissue regeneration, which may result in their practical application in regeneration of several damaged tissues and organs. Current evidence from in vitro and in vivo studies strongly indicate that major mechanisms of stem cell-mediated tissue repair include not only effective stem cell differentiation, but also secretion of several factors impacting on endogenous cells in a paracrine manner. The population, which particular is attributed to such paracrine effects in the stimulation of tissue repair processes, are mesenchymal stem/ stromal cells (MSCs) obtained from various sources including bone marrow. Bioactive compounds exerting paracrine activity can be released either directly into the environment or enclosed in extracellular vesicles (EVs) - secreted by cells (including SCs) under physiological conditions as well as after activation. EVs represent membraneenclosed spherical vesicles, which are carriers of bioactive molecules between cells such as e.g. membrane and cytoplasmic proteins, mRNAs, microRNAs and lipids. As a result, EVs play an important role in cell-to-cell communication ensuring an exchange of bioactive compounds between different cells and affecting their functions. Growing number of reports indicate that also EVs secreted by the SCs may modulate functions of other cells including endogenous somatic cells, progenitors and SCs residing in tissues, thereby increasing regenerative processes in the tissues. The aim of the research carried out under this doctoral thesis was to investigate the biological properties of EVs secreted by murine bone marrow- derived MSCs (MSC-EVs) including their morphology, phenotype and molecular composition as well as their influence on functions of selected somatic cells in vitro as well as their regenerative potential in murine models of tissue damage in vivo including in: i) acute myocardial infarction and ii) limb ischemia models. In the first step, bone marrow-derived MSCs were isolated and then their multiantigen profile was examined. MSCs were cultured under conditions in vitro that ensure their normal growth and phenotype and they constitute the parental cells for the EV studies. Then, MSC-EVs were isolated from the MSC conditioned media using a sequential centrifugation method including ultracentrifugation. MSC-EVs have been shown to contain a heterogeneous population of vesicles with the predominant component of membrane microfragments (ectosomes) of approximately 170 nm. Further studies conducted on EVs isolates showed presence of fractions expressing tetraspanins (CD9, CD63, CD81), which proves the content of exosomal fraction and confirmed the enrichment of the EVs in the ectosomal fraction possesing on their surface antigens typical for parental cells including CD29, CD44, CD90, Sca-1 antigens and the VEGFR2 receptor. In the next stages, molecular content of MSC-EVs was characterized and extended proteomic and transcriptomic analysis revealed that MSC-EVs carry a great number of regulatory proteins - including proteins involved in morphogenesis of tissues and anatomical structures, response to injury, wound healing and responsible for communication and intercellular adhesion, as well as mRNA transcripts for proangiogenic and procardiomyogenic genes and microRNA molecules involved in regulation of tissue regeneration processes. Further in vitro studies have also demonstrated the effect of MSC-EVs on selected functions of mature vascular endothelial cells (ECs) including on their angiogenic potential. Then, the cytoprotective effect of MSC-EVs on ECs have also been demonstrated under inflammatory conditions in vitro. In the next stage, the regenerative potential of isolated MSC-EVs was evaluated in two murine models of ischemic tissue damage in vivo. In the first model of acute myocardial infarction (AMI), MSC-EVs were transplanted intramuscularly in the border zone of the AMI. One month after administration, in the group of mice treated with MSC-EVs, a significant improvement in hemodynamic parameters of the heart and a reduction in the size of the post-infarction scar was observed when compared to animals in control groups. The obtained results confirmed the positive effect of MSC-EVs on the anatomy and function of damaged myocardium in vivo. The regenerative potential of MSC-EVs was then examined in a murine model of limb ischemia (LI) in vivo. At 24 hours after intravenous (i.v.) administration of MSC-EVs, retention of MSC-EVs was observed mainly in hypoxic tissues when compared to healthy limb and other tissues. At 21 days post injury, we observed statistically significant improvement of tissue perfusion in the injured limb when compared to control healthy limb after i.v. administration of MSC-EVs, compared to control groups, which correlated with the activation of proangiogenic pathways and a greater number of capillaries present in the muscle tissues. The results obtained in this model indicate the proangiogenic effect of MSC-EVs exerted in hypoxic tissues in vivo. In conclusion, the conducted studies have shown that EVs secreted by murine MSCs carry a great number of bioactive molecules including proteins involved e.g. in the processes of repairing damaged tissues and organs and intercellular communication, as well as mRNA transcripts for genes involved in angiogenesis and cardiomyogenesis and microRNAs involved in these processes. MSC-EVs also possess on their surface antigens characteristic for MSCs including adhesion molecules and receptors involved in angiogenesis. In in vitro studies, both pro-angiogenic and cytoprotective effects of MSC-EVs have been demonstrated in murine ECs, which may be the result of the activity of bioactive molecules carried by MSC-EVs. In contrast, in murine models of ischemic tissue injury, improved anatomy and function of damaged organs has been demonstrated, which confirms the regenerative potential of MSC-EVs in vivo. 1. WSTĘP 1.1. Choroby niedokrwienne i metody ich leczenia Zjawisko niedokrwienia tkanek charakteryzuje się niedostatecznym dopływem krwi do danych tkanek różnych narządów lub określonych części ciała (np. kończyn). Zmniejszona perfuzja krwi powoduje niedostateczny transport tlenu oraz substancji odżywczych do komórek rezydujących w tkankach, w konsekwencji czego może prowadzić do niedotlenienia, a ostatecznie do uszkodzenia tkanek i narządów. Główną przyczyną niedokrwienia tkankowego jest zwężenie lub zablokowanie światła tętnicy, najczęściej w następstwie tworzenia się blaszek miażdżycowych, skrzeplin lub skurczu określonej tętnicy (1). Zaburzenie napływu krwi do określonych narządów lub części ciała może mieć charakter przewlekły - rozwija się przez kilka miesięcy lub lat, lub ostry, gdy pojawia się nagle (m.in. podczas wysiłku fizycznego) i zwykle ma bardziej gwałtowny przebieg, a jego konsekwencje mają niejednokrotnie gorsze rokowania. Niedokrwienie w następstwie zmian miażdżycowych najczęściej występuje w obrębie mięśnia sercowego, kończyn dolnych, a także mózgu (1–3). Niedokrwienie może pociągać za sobą szereg zmian funkcjonalnych na poziomie pojedynczych komórek budujących tkanki, powodując ich dysfunkcję, a także często śmierć na skutek nekrozy bądź apoptozy (4–7). W przebiegu niedotlenienia będącego wynikiem ostrego zawału mięśnia sercowego (ang. acute myocardial infarction, AMI) oraz następującego po nim gojenia się uszkodzonego organu, możemy wyróżnić następujące etapy: 1) śmierć kardiomiocytów następującą już w pierwszej godzinie od momentu zamknięcia światła tętnicy wieńcowej, 2) rozwój stanu zapalnego, który rozpoczyna migracja monocytów i neutrofili do uszkodzonego obszaru mięśnia sercowego trwający do ok. 4 dnia od AMI, 3) tworzenie tkanki ziarninowej będącej efektem depozycji białek macierzy pozakomórkowej trwającej do 2 tygodni od momentu wystąpienia AMI, oraz 4) tworzenie blizny pozawałowej w wyniku depozycji m.in. kolagenu w obrębie tkanki objętej uszkodzeniem następujące do 2 miesięcy od momentu wystąpienia uszkodzenia (8,9). Wymienione etapy przedstawiono na Rycinie 1. W pierwszych godzinach po AMI rozpoczyna się migracja neutrofili i monocytów do miejsca uszkodzenia, natomiast wydzielane przez nie metaloproteinazy powodują degradację białek macierzy pozakomórkowej (ang. extracellular matrix protein, ECM) w obrębie uszkodzonej tkanki (10). Rozpoczyna się także proces fagocytozy martwych komórek oraz zdegradowanych białek ECM (8). W kolejnym etapie następuje tworzenie tkanki ziarninowej, któremu towarzyszy różnicowanie fibroblastów do miofibroblastów. Powstałe miofibroblasty wykazują aktywność wydzielniczną, proliferacyjną oraz kurczliwą w miejscu uszkodzenia (11). Makrofagi naciekające miejsce niedokrwienia wydzielają cytokiny i czynniki wzrostu, poprzez co stymulują fibroblasty serca do wytwarzania szeregu białek ECM, w tym kolagenu, proteoglikanów i glikoprotein, które stanowią główne komponenty tkanki ziarninowej, a następnie blizny pozawałowej (12,13). Główną funkcją tworzącej się blizny pozawałowej jest utrzymanie integralności tkanki objętej uszkodzeniem i jej ochrona przed rozerwaniem (13). Podsumowując, następstwem utraty kardiomiocytów w rejonie tkanki serca objętej niedotlenieniem i stopniowym pogarszaniem funkcji tego organu, następuje patologiczna przebudowa anatomiczna mięśnia sercowego (1) widoczna w badaniach ultrasonograficznych jako zmiejszenie grubości ściany mięśnia sercowego w rejonie AMI (10). Proces gojenia się i przebudowymięśnia sercowego uszkodzonego w wyniku niedotlenienia Faza 1 Faza 2 Faza 3 Faza 4 1 godzina 4 dni 2 tygodnie 2 miesiące Rycina 1. Proces gojenia się i przebudowy tkanek mięśnia sercowego w następstwie niedotleniania wywołanego zawałem. Proces gojenia się i przebudowy mięśnia sercowego po AMI można podzielić na cztery fazy: 1) śmierć kardiomiocytów na drodze apoptozy lub nekrozy; 2) rozwój ostrego stanu zapalnego; 3) tworzenie tkanki ziarninowej w rejonie wystąpienia niedotlenienia; oraz 4) tworzenie blizny pozawałowej. Na schemacie zaznaczono długość trwania poszczególnych faz. Źródło grafiki: (8), zmienione. Choroba niedokrwienna serca (ang. Ischemic Heart Disease, IHD) spowodowana miażdżycą naczyń wieńcowych, a także jej powikłania w postaci ostrego zawału mięśnia sercowego oraz następującej po nim niewydolności serca, stanowią jedne z najczęstszych przyczyn zgonów w Polsce oraz na całym świecie (14,15). Współczesna metoda leczenia „świeżego” zawału serca polega na jak najszybszym podaniu leku rozpuszczającego skrzeplinę oraz wykonaniu interwencji kardiologicznej w postaci otwarcia światła zamkniętego naczynia tętniczego, co ma na celu ograniczenie uszkodzenia, a następnie martwicy tkanek serca (1). Pacjenci, u których wystąpiło niedotlenienie mięśnia sercowego na skutek zablokowania przepływu krwi w tętnicy wieńcowej, zgodnie z aktualnymi wytycznymi światowymi, w tym wytycznymi Europejskiego Towarzystwa Kardiologicznego, mogą być poddani następującemu leczeniu inwazyjnemu: 1) wszczepieniu pomostów aortalno- wieńcowych, których rolą jest wytworzenie sztucznych połączeń pomiędzy tętnicą główną a tętnicami wieńcowymi, które omijają miejsce zwężenia, poprawiając ukrwienie niedokrwionego obszaru mięśnia sercowego, 2) przezskórnej wewnątrznaczyniowej angioplastyce wieńcowej, której celem jest poszerzenie światła zwężonej tętnicy z równoczesnym zastosowaniem stentów (16–18). W leczeniu choroby niedokrwiennej stosuje się także leczenie farmakologiczne, podczas którego pacjentom aplikuje się m.in. leki przeciwzakrzepowe, które zapobiegają zakrzepicy naczyń wieńcowych, czy też leki obniżające poziom cholesterolu we krwi (np. statyny) (17). Wymienione inwazyjne oraz farmakologiczne metody ograniczania oraz leczenia skutków niedotlenienia mięśnia sercowego, kładą główny nacik na poprawę jakości oraz przedłużenie życia pacjenta, natomiast nie są w stanie odwrócić skutków niedokrwienia tkanek serca, którym jest m.in. utrata funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego (19,20). Pomimo znaczącego rozwoju metod leczenia, metody te nie przynoszą oczekiwanych korzyści u wszystkich pacjentów, stąd pojawia się potrzeba ciągłego poszukiwania nowych metod leczenia zastępujących lub wspierających klasyczne metody terapeutyczne (21). Co ważniejsze, odsetek zgonów w Polsce na tle innych państw europejskich, jest ciągle stosunkowo wysoki (22). Duże nadzieje pokłada się dziś w metodach niefarmakologicznych, a wśród nich w terapiach opierających się na preparatach komórkowych, w tym na wykorzystaniu różnych typów komórek macierzystych i progenitorowych oraz ich pochodnych (tzw. leczenie regeneracyjne), jak również zdefiniowanych cząsteczek, np. zmodyfikowanych mikroRNA (tzw. terapia molekularna) (19,21,23). Innym przykładem choroby niedokrwiennej jest postępujące niedokrwienie tkanek kończyny dolnej (ang. Limb Ischemia, LI) będące najczęściej wynikiem rozwijającej się miażdżycy naczyń obwodowych (24). Terminem tym określa się spadek perfuzji krwi w kończynie powodujący zagrożenie dla funkcji, a nawet żywotności całego organu (25). Głównymi przyczynami niedokrwienia może być zakrzepica, zatorowość, ale także uraz naczynia oraz tętniak obwodowy (26). Chorzy są często obciążeni innymi chorobami związanymi z postępującymi zmianami wewnątrznaczyniowymi, takimi jak m.in nadciśnienie tętnicze, choroba niedokrwienna serca, choroby naczyń mózgowych (27). Choroba ta może mieć charakter przewlekły lub ostry (28). Niedokrwienie kończyny dolnej występuje jednak zazwyczaj jako przewlekły, nasilający się z czasem proces, którego charakterystycznym objawem klinicznym jest chromanie przestankowe, czyli bóle mięśni pojawiające się podczas wysiłku fizycznego skutkujące ograniczeniem ruchowym pacjenta (27). Podczas stopniowego zwężania światła tętnicy, rozwija się krążenie oboczne, które łączy pień tętniczy poniżej i powyżej zablokowanego naczynia. Ilość krwi płynącej drogą krążenia obocznego jest zwykle wystarczająca do zapewnienia spoczynkowej przemiany materii w tkankach, natomiast niewystarczająca do zapewnienia przemiany materii podczas aktywności fizycznej (29). W przebiegu ostrym choroby niedokrwiennej kończyny (ang. critical limb ischemia, CLI), dochodzi do nagłego oraz szybko postępującego niedokrwienia kończyny, które może prowadzić do rozległej martwicy tkanek zagrażając choremu utratą tego organu (29). Na Rycinie 2 przedstawiono zmiany na poziomie komórek i tkanek na narastające niedotlenienie. Rycina 2. Zmiany na poziomie tkanek i komórek w odpowiedzi na niedotlenienie w przebiegu choroby niedokrwiennej tętnic obwodowych. W wyniku powstałej zmiany miażdżycowej w świetle tętnicy obwodowej, następuje zmiejszenie ciśnienia krwi w tętnicy, skutkujące zmniejszoną perfuzją tkanek. Następnie pojawia się adaptacja do warunków hipoksji, której towarzyszy powstanie stanu zapalnego oraz powstawania krążenia obocznego. W wyniku pogłębiania się hipoksji, obserwuje się dysfunkcjęśródbłonka naczyniowego. Kolejne pogłębianie się niedotlenienia, powoduje powstanie stresu oksydacyjnego oraz uszkodzenie mitochondriów w komórkach, co skutkuje uszkodzeniem włókien mięśniowych. W aspekcie kondycji pacjenta objętego chorobą niedokrwienną naczyń obwodowych, ból spoczynkowy przechodzi w pojawienie się trudno gojących się ran, z których rozwijać się może gangrena niosąca ryzyko amputacji organu. Źródło grafiki: (30), zmienione. Pierwszym etapom niedotlenienia towarzyszy zmiana hemodynamiki przepływu krwi (spadek ciśnienia w naczyniach krwionośnych skutkujący niższą perfuzją tkanek) będący wynikiem ograniczenia drożności tętnicy. W tkankach rozpoczyna się proces zapalny oraz proces apoptozy komórek rezydujących w tkankach, w tym komórek mięśniowych. Wraz ze wzrostem nasilenia hipoksji, adaptacje w obrębie naczyń krwionośnych nie są już w stanie zrekompsensować niedotleniania, co powoduje dysfunkcjęśródbłonka naczyń krwionośnych oraz rozprzestrzenianie się stanu zapalnego. Co więcej, nasila się proces powstawania wolnych rodników, któremu towarzyszy uszkodzenie mitochondriów w komórkach. W wyniku zmian za poziomie biochemicznym w obrębie organelli komórkowych i przedłużającego się stanu zapalnego, następuje uszkodzenie włókien mięśniowych, co przekłada się na powstawanie przewlekłych, nie gojących się ran, gangreny, a także ryzyko amputacji kończyny (30). Ze względu na szybko posuwające się procesy degeneracji w niedotlenionej kończynie dolnej, w celu jej uratowania przed amputacją i zachowania jej funkcji, konieczne jest podjęcie prób rewaskularyzacji i przywrócenia przepływu krwi (26,29). W przypadku CLI, stosuje się następujące leczenie inwazyjne: 1) endowaskularyzację -metodą angioplastyki balonowej niejednokrotnie połączoną z implantacją stentu naczyniowego, 2) wszczepienie pomostu naczyniowego - w celu ominięcia miejsca zwężenia oraz poprawy ukrwienia niedokrwionego obszaru mięśni kończyny, 3) miejscowe leczenie fibrynolityczne (29,31). Natomiast w leczeniu farmakologicznym wykorzystywane są m.in.: leki obniżające poziom cholesterolu, a także leki przeciwzakrzepowe czy też prostaglandyny wykazujące działanie rozkurczowe na system małych naczyń tętniczych (32). Dodatkowo, coraz większym zainteresowaniem cieszy się terapia energotonowa, której mechanizm działania polega m.in. na podwyższeniu potencjału energetycznego komórek poprzez wprowadzenie do tkanek określonej dawki energii (pochodzącej z prądu elektrycznego o określonych zakresach częstotliwości) pochodzącej m.in. z aparatu Hi-Top, co w efekcie stymuluje metabolizm komórek, a przez to pobudza naturalne mechanizmy naprawcze oraz normalizuje zaburzoną równowagę fizykochemiczną tkanek (33). Wyniki dotychczasowych badań wskazują, że metody leczenia niedokrwienia kończyny dolnej oparte o pojedyncze protokoły nie dają pożądanych efektów terapeutycznych, a także nie mogą być zastosowane u wszystkich pacjentów, stąd wynika ciągła potrzeba łączenia dostępnych podejść leczniczych, a także poszukiwanie nowych strategii leczenia, np. przy użyciu substancji pochodzenia biologicznego (27). 1.2. Komórki macierzyste w regeneracji niedotlenionych tkanek W ciągu ostatniej dekady coraz większą uwagę poświęca się właściwościom regeneracyjnym komórek macierzystych (KM), w kontekście biologicznych strategii leczenia polegających na zastąpieniu komórek uszkodzonej tkanki nowymi komórkami pochodzącymi z KM, w tym mięśnia sercowego uszkodzonego w wyniku niedotlenienia (34,35). KM bierze się także pod uwagę, jako komórki mogące brać udział w neowakularyzacji niedotlenionych tkanek, w tym tkanek serca, co może również odgrywać istotną rolę w poprawie funkcji tego organu (36–38). Jednym z typów komórek, które od lat bada się w aspekcie ich potencjalnego przyszłego wykorzystania w medycynie regeneracyjnej w leczeniu uszkodzeń mięśnia sercowego lub poprawiających perfuzję w obszarze tkanki mięśniowej kończyn, są mezenchymalne/ stromalne KM (ang. mesenchymal stem/ stromal cells, MSCs) izolowane m.in. ze szpiku kostnego. Komórki te rezydujące zarówno u młodych, jak i dojrzałych dawców, od lat stanowią ważne i interesujące źródło KM przede wszystkim dla autotransplantacji i obecnie stanowią najszerzej wykorzystywaną populację KM w badaniach klinicznych na świecie ((36,39,40); clinicaltrial.gov). W chwili obecnej w światowej bazie rejestrującej badania kliniczne -ClinicalTrials.gov - zarejestrowanych jest 878 prób klinicznych (w tym 243 zakończone), w których wykorzystuje się komórki MSCs. Biorąc pod uwagę kryteria wyszukiwania wg słów kluczowych: Ischemic Heart Disease oraz Mesenchymal Stem Cells, w bazie są zarejestrowane 44 próby kliniczne (w tym 15 zakończonych), w których wykorzystuje się komórki MSCs pochodzące z różnych źródeł w leczeniu choroby niedokrwiennej serca, natomiast przeszukując bazę ClinicalTrials.gov z wykorzystaniem słów kluczowych: Limb ischemia oraz Mesenchymal Stem Cells, można znaleźć 22 próby kliniczne (w tym 1 zakończoną) wykorzystujące komórki MSCs do regeneracji niedotlenionej kończyny (ClinicalTrials.gov). Na Rycinie 3A przedstawiono mapęświata, natomiast na Rycinie 3B mapę Europy z zaznaczoną liczbą prób klinicznych w różnych krajach, w których wykorzystuje się komórki MSCs. Rycina 3. Próby kliniczne wykorzystujące komórki MSCs. A. Liczba prób klinicznych na świecie. B. Liczba prób klinicznych w Europie. Źródło grafiki: https://clinicaltrials.gov. W Polsce są zarejestrowane 4 próby kliniczne, w tym dwie aktualnie rekrutujące pacjentów w leczeniu uszkodzeń po zawale mięśnia sercowego (ang. Myocardial Infarction) i stwardnieniu zanikowym bocznym (ang. Amyotrophic Lateral Sclerosis) oraz dwie, które jeszcze nie rozpoczęły rekrutacji pacjentów z niewydolnością serca (ang. Heart Failure) oraz krytycznym niedokrwieniem kończyn (ang. Critical Limb Ischemia) (ClinicalTrials.gov). 1.3. Mezenchymalne komórki macierzyste -miejsce w klasyfikacji i właściwości biologiczne Historię badań nad mezenchymalnymi komórkami macierzystymi określanymi także mezenchymalnymi komórkami zrębu (ang. Mesenchymal stem/ stromal cells) rozpoczął się w latach 70-tych XX wieku Friendenstein i wsp., którzy zaobserwowali wydłużone, wrzecionowate komórki tworzące kolonie fibroblastyczne (ang. Colony Forming Unit- Fibroblast, CFU-F) w hodowli in vitro adherentnej frakcji komórek szpiku kostnego (41). Co więcej, ich wcześniejsze badania wykazały, że subpopulacje komórek szpiku kostnego wykazują zdolność do różnicowania w kierunku m.in. osteoblastów (42). Odkrycia te zapoczątkowały wzrost zainteresowania komórkami MSCs oraz poszukiwania tych komórek także w innych tkankach. W hierarchii komórek macierzystych, uszeregowanej na podstawie ich zdolności do różnicowania w różne typy tkanek, na samym szczycie znajdują się komórki totipotencjalne, czyli dające początek zarówno wszystkim tkankom zarodka, jak również tkankom pozazarodkowym, czyli łożysku (43). Następną grupę w hierarchii stanowią komórki pluripotencjalne mogące różnicować w komórki wszystkich trzech listków zarodkowych, ale tracące zdolność wytwarzania tkanek łożyska (43,44). Najlepiej poznanym przykładem takich komórek są tzw. KM embrionalne izolowane najczęściej ze stadium blastocysty w rozwoju zarodkowym (45). Kolejną grupę stanowią komórki multipotencjalne, do których należą m.in. komórki MSCs, dające początek najczęściej komórkom różnych tkanek pochodzących z jednego listka zarodkowego (43). Ostatnią grupę komórek stanowią komórki unipotencjalne, czyli progenitorowe, rezydujące w różnych tkankach i różnicujące w jeden, konkretny typ komórek danej tkanki (44). Komórki multipotencjalne, jakimi są komórki MSCs - wykazują wyższy stopień ukierunkowania tkankowego niż komórki pluripotencjalne, a zatem również bardziej ograniczone zdolności do różnicowania. Obecnie współcześni badacze podejmują dyskusję naukową oraz badania mające na celu ponowną weryfikację spełnienia następujących kryteriów „macierzystości” przez komórki MSCs: 1) zdolności do samoodnawiania na drodze symetrycznych podziałów komórkowych, w wyniku których powstają dwie identyczne komórki potomne o takim samym potencjale różnicowania (46); 2) zdolności do ukierukowanego różnicowania, gdzie na drodze podziałów asymetrycznych lub w wyniku specyficznej stymulacji - tworzą bardziej dojrzałe komórki progenitorowe lub zróżnicowane komórki efektorowe (46,47); 3) zdolności do różnicowania w różne typy tkanowe, w tym adipocyty, chondrocyty, osteoblasty, a także kardiomiocyty i komórki śródbłonka (48–58). Niezależnie od toczących się dyskusji naukowych, komórki MSCs ze względu na swoje właściwości biologiczne, które opisane zostaną w dalszej części tego rozdziału, stanowią przedmiot wielu badań przedklinicznych oraz klinicznych, jako komórki uczestniczące na drodze różnych mechanizmów działania – w naprawie uszkodzonych tkanek. Jednym z głównych, a zarazem najbardziej poznanych źródeł komórek MSCs jest szpik kostny (59,60). Komórki o zbliżonej morfologii i cechach biologicznych można znaleźć także w innych tkankach pobranych od dorosłych dawców takich jak m.in. krew obwodowa (61), tkanka tłuszczowa (62), miazga zębowa (63), a także w tkankach płodowych, jak krew pępowinowa i galareta Whartona sznura pępowinowego (64). Komórki MSCs pochodzące ze szpiku kostnego (ang. bone marrow- derived mesenchymal stem cells, BM-MSCs) wykazują podobieństwo morfologiczne i fenotypowe (w tym fenotyp wieloantygenowy: CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD166+, HLA-ABC+, CD11b-, CD14-, CD19a-, CD34-, CD45-, CD79-, HLA-DR-) do komórek MSCs z tkanki tłuszczowej (ang. adipose tissue-derived mesenchymal stem cells, AT-MSCs), jak również do komórek MSCs izolowanych z galarety Whartona sznura pępowinowego (ang. umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs) (48,65,66). Tkanki źródłowe, z których izoluje się komórki MSCs różnią się jednak zawartością tych KM. Dla przykładu, częstość występowania komórek MSCs w szpiku kosnym jest niższa niż częstość występowanich tych komórek w tkance tłuszczowej (67,68). Szpik kostny zawiera od 0,0017 do 0,02% komórek MSCs pośród wszystkich komórek jednojądrzastych, podczas gdy w tkance tłuszczowej komórki te stanowią nawet od 5,0 do 25,6% wszystkich komórek tzw. frakcji stromalno- naczyniowej pozyskanej z tej tkanki (67,69). Liczba kolonii CFU-F powstałych po wysianiu takiej samej liczby komórek wyizolowanych ze szpiku kostnego lub tkanki tłuszczowej jest kilkukrotnie wyższa w przypadku tkanki tłuszczowej w odniesieniu do szpiku kostnego (48). Także komórki UC-MSCs cechują się wyższą częstością tworzenia kolonii CFU-F niż komórki BM-MSCs (70). Biorąc pod uwagę potencjał do różnicowania komórek BM-MSCs, AT-MSCs oraz UC-MSCs, komórki te wykazują porównywalną zdolność do różnicowania do osteoblastów, chondrocytów i adipocytów (48,49), co potwierdza ich pochodzenie mezodermalne. Co więcej, komórki MSCs pochodzące z różnych w/w tkanek źródłowych, mogą być także różnicowane in vitro do komórek zbliżonych fenotypowo do kardiomiocytów, komórek śródbłonka naczyniowego oraz komórek nerwowych, jednak wydajność takiego różnicowania jest zmienna i uzależniona od ich pochodzenia tkankowego (51–57,71–78). Ponadto, w obrębie jednej hodowli komórek MSCs mogą występować komórki bardziej lub mniej predystynowane do różnicowania do określonego fenotypu komórki dojrzałej (47). Pomimo podobieństwa morfologicznego oraz antygenowego pomiędzy komórkami MSCs pochodzącymi z różnych tkanek źródłowych, wyniki badańświatowych pokazują, że komórki BM-MSCs mogą wykazywać inny profil ekspresji wielu genów w porównaniu do komórek MSCs pochodzących z łożyska (47), co sugeruje, że również komórki MSCs pochodzące ze szpiku kostnego, galarety Whartona oraz tkanki tłuszczowej mogą różnić się pomiędzy sobą w aspekcie ich kompozycji molekularnej oraz zdolności do różnicowania. Porównanie komórek MSCs pochodzących z wybranych w/w tkanek przedstawiono w Tabeli 1. Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej (ang. International Society for Cellular Therapy, ISCT), w celu uporządkowania nomenklatury oraz zdefiniowania cech charakterystycznych dla ludzkich komórek MSCs, a także w celu łatwiejszego porównywania wyników badań pomiędzy laboratoriami na całym świecie, zaproponowało trzy minimalne kryteria charakteryzujące ludzkie komórki MSCs (79), które przedstawiono w Tabeli 2. Tabela 1. Porównanie komórek MSCs pochodzących z trzech głównych źródeł: szpiku kostnego (BM-MSCs), tkanki tłuszczowej (AT-MSCs) oraz sznura pępowinowego (UC-MSCs). Oznaczenia: (+/-) Niska wydajność różnicowania. (#) Komórki UC-MSCs wykazują wyższy potencjał do różnicowania w kierunku komórek śródbłonka naczyniowego niż BM-MSCs. (*) Wzrost MSCs przy zachowaniu tych samych warunków ekspansji pomiędzy P0-P3. Rodzaj komórek BM-MSCs AT-MSCs UC-MSCs Referencje Pochodzenie Szpik kostny Tkanka tłuszczowa Galareta Whartona sznura pępowinowego (41,62, 79) Morfologia komórek Wydłużone, wrzecionowate adherentne komórki o morfologii zbliżonej do fibroblastów (48,65) Profil antygenowy Markery negatywne CD11b, CD14, CD19a, CD34, CD45, CD79a, CD133, CD144, HLA-II, HLA-DR (48,65,66 ,81) Markery pozytywne CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, HLA-I, HLA-ABD Liczba dni w hodowli do momentu osiągnięcia pasażu 3* 25,0 ± 3,9 15,5 ± 0,7 26,7 ± 7,2 (65) Maksymalny osiągalny pasaż 7 8 >10 (48) Zdolność do różnicowania w komórki o cechach fenotypowych zbliżonych do: osteoblastów + + + (48,49) chondrocytów + + + (48,49) adipocytów + + +/- (48,49) komórek śródbłonka + + +# (50,55– 58,76) kardiomiocytów +/- + - (51– 55,77) komórek nerwowych + + + (71– 76,78) Tabela 2. Cechy charakterystyczne dla ludzkich komórek MSCs na podstawie zaleceń Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (79). L.p. Cechy charakterystyczne komórek MSCs 1. Zdolność do adhezji Adhezja do plastikowych powierzchni naczyń hodowlanych w standardowych warunkach hodowli in vitro 2. Profil antygenowy Markery pozytywne: CD105, CD90 oraz CD73 (antygeny występują na powierzchni ≥95% komórek) Markery negatywne: CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α lub CD19, HLA klasy II (antygeny występują na powierzchni <2% komórek MSCs) 3. Potencjał do różnicowania Zdolność do różnicowania w osteoblasty, adipocyty oraz chondrocyty w standardowych pożywkach różnicujących w warunkach in vitro Pomimo tego, że nie ma zdefiniowanych kryteriów charakterystycznych dla komórek MSCs pochodzenia mysiego, wyniki badańświatowych wskazują, że komórki MSCs izolowane z mysich tkanek wykazują ekspresję następujących antygenów powierzchniowych: CD29, CD44, CD73, CD105, CD106 oraz Sca-1, przy równoczesnym braku antygenów charakterystycznych dla komórek śródbłonka oraz komórek krwiotwórczych (hematopoetycznych), w tym CD31, Ter-119, CD45, CD11b (82–84). Podobnie jak komórki ludzkie, MSCs izolowane z tkanek zwierzęcych również posiadają zdolność do adhezji do polistyrenowych powierzchni naczyń hodowlanych oraz zdolność do różnicowania do komórek pochodzenia mezodermalnego (82). Dzięki licznym badaniom światowym wskazującym na stosunkowo szeroki potencjał komórek MSCs do różnicowania w różne typy tkanek, komórki te – stanowiące populację pozyskiwaną z tkanek dojrzałych, od lat cieszą się zainteresowaniem badaczy w kontekście ich potencjalnego wykorzystania w regeneracji tkanek (85–87). 1.4. Mechanizmy działania komórek MSCs w procesach regeneracji niedotlenionych tkanek Multipotencjalne komórki MSCs wykazują wiele cech pożądanych z punktu widzenia ich potencjalnego wykorzystania w regeneracji uszkodzonych tkanek – nie tylko w transplantacjach autologicznych, ale również allogenicznych, dlatego też w ciągu ostatniej dekady, podejmowane są liczne badania mające na celu wyjaśnienie mechanizmów działania tych komórek podanych w miejsce uszkodzenia tkankowego. Pierwszy proponowany mechanizm działania komórek MSCs podanych w miejsce uszkodzenia tkankowego np. niedotlenionego mięśnia sercowego, opiera się na zdolności komórek MSCs do różnicowania w komórki dojrzałe, w tym komórki budujące mięsień sercowy, tj. w komórki o fenotypie kardiomiocytów (ang. cardiomyocytes, CMCs), komórki śródbłonka naczyń krwionośnych (ang. endothelial cells, ECs) oraz komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (ang. vascular smooth muscle cells, VSMCs) (55,85–90). Toma i wsp. w badaniach in vivo wykazali, że komórki MSCs podane do mięśnia sercowego, po 14 dniach od podania wykazują fenotyp komórek różnicujących w CMCs i ekspresję markerów kardiomiocytów takich jak m.in: łańcuch ciężki β-miozyny, α-aktyninę oraz sercową troponinę C, jednak wszczepienie tych komórek jest niewielkie (88). Z kolei Makino i wsp., wyizolowali spośród komórek BM-MSCs różnicowanych w kierunku kardiomiocytów in vitro, komórki nie tylko wykazujące ekspresję markerów CMCs, ale także spontaniczne bijące, co może świadczyć o ich terminalnym przekształceniu się do dojrzałych komórek zdolnych podjąć właściwe dla nich funkcje (87). Pomimo, że komórki MSCs w warunkach in vitro wykazują potencjał do różnicowania w kierunku CMCs, na różnicowanie natywnych KM do komórek budujących tkanki uszkodzonego narządu w układzie in vivo ma istotny wpływ wiele innych czynników, w tym m.in. ich zdolność do zasiedlania uszkodzonego obszaru narządu, jak równieżżywotność tych komórek po podaniu (85,91). Pomimo obserwowanej niskiej retencji KM w niedotlenionym mięśniu sercowym po ich podaniu, wyniki badańświatowych wskazują m.in. na poprawę parametrów funkcjonalnych pracy serca, w tym objętości wyrzutowej lewej komory serca (ang. left ventricular ejection fraction, LVEF) oraz zahamowanie niekorzystnej przebudowy tkanek mięśnia sercowego (55,85,88,91). W związku z tym nasuwa się pytanie, czy poprawa funkcjonalna w obrębie uszkodzonego organu obserwowana po podaniu komórek MSCs jest spowodowana wyłącznie wszczepianiem i różnicowaniem komórek MSCs do komórek budujących określone tkanki i narządy i czy zależy również od innych mechanizmów? W odpowiedzi na to pytanie, rosnąca liczba badań wskazuje na drugi proponowany mechanizm działania komórek MSCs, który oparty jest o ich właściwości immunomodulacyjne (92). Komórki MSCs, dzięki zdolności do wydzielania szeregu rozpuszczalnych cząsteczek, w tym interleukin i cytokin o charakterze przeciwzapalnym, które mogą modulować odpowiedź układu odpornościowego (93,94). Dla przykładu, IL-4 i IL-10 wydzielane przez komórki MSCs hamują proliferację limfocytów T (95), czynnik wzrostu hepatocytów (ang. hepatocyte growth factor, HGF) hamuje proliferację limfocytów T CD4+ (96), natomiast indukowana syntaza tlenku azotu oraz prostaglandyna E2 (ang. prostaglandin E2, PGE2) hamują proces zapalny (97,98). Z kolei trzeci proponowany mechanizm działania komórek MSCs jest oparty o szerszą aktywność wydzielniczą tych komórek, polegającą na wydzielaniu szeregu cytokin, chemokin czy też czynników wzrostu - bezpośrednio do środowiska lub zamkniętych w postaci tzw. pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (ang. extracellular vesicles, EVs), które to bioaktywne cząsteczki mogą regulować parakrynnie szereg procesów biologicznych w miejscu przeszczepienia MSCs (99–101). Na Rycinie 4 przedstawiono listę przykładowych bioaktywnych cząsteczek wydzielanych przez komórki MSCs, które są istotne z punktu widzenia niniejszej pracy, wraz z przyporządkowaną im funkcją biologiczną, ze szczególnym uwzględnieniem ich roli w niedokrwiennym uszkodzeniu tkanek (102). VEGF, IGF-1, HGF, BMP-2, Regeneracja mięśnia sercowego TGF-β, SDF-1, FGF-2, Sfrp2 VEGF, IGF-1, HGF, FGF-2, FGF-7, PDGF-BB, PGF, Ang-1, Neowaskularyzacja TGF-β, SDF-1, MMP-2, MMP-9 IL-4, IL-10, PGE2, HIF-1α, TGF-Właściwości przeciwzapalne β, TSP-1, IL-6 MMP-1, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-9, IL-10, TB-4, Hamowanie patologicznej przebudowy serca TGF-β, HGF, Tenascyna C, SDF-1, TNF-α, ADM, IGF-1 VEGF, IGF-1, HGF, FGF-2, TNF-α, SDF-1, TB-4, Sfrp1, Właściwości anty-apoptotyczneMSCs Sfrp2, EPO, ADM, BMP-2 Bioaktywne pęcherzyki Stymulacja endogennych vv zewnątrzkomórkowe komórek/ Efekty parakrynne Rycina 4. Aktywność parakrynna komórek MSCs. Komórki MSCs mogą wydzielać szereg czynników stymulujących regenerację uszkodzonych tkanek m.in. mięśnia sercowego (np. VEGF, IGF-1, HGF, SDF-1) oraz wpływających korzystnie na procesy neowaskularyzacji (np. VEGF, IGF-1, HGF, FGF-2, PDGF-BB, PGF), wykazujących właściwości przeciwzapalne (np. IL-4, IL-6, IL-10), hamujących patologiczną przebudowę serca (np. MMP-2, MMP-9). Przygotowano na podstawie (102), rycina własna. Do czynników proangiogennych wydzielanych przez komórki MSCs należą m.in. czynniki wzrostu fibroblastów- 2 i 7 (ang. fibroblast growth factor-2, 7, FGF-2, FGF-7) stymulujące proliferację komórek ECs oraz VSMCs (96,100), płytkopochodny czynnik wzrostu BB (ang. platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB) stymulujący proliferację komórek VSMCs (100) oraz silnie proangiogenny czynnik wzrostu śródbłonka naczyń (ang. vascular endothelial growth factor, VEGF) stymulujący m.in. proliferację komórek ECs, jak również ich migrację oraz tworzenie struktur nowych naczyń krwionośnych (96,103). Z kolei do czynników stymulujących przebudowę macierzy pozakomórkowej należą m.in. metaloproteinazy typu 1, 2 i 9 (ang. metalloproteinase-1, 2, 9, MMP-1, 2, 9) rozluźniające strukturę macierzy zewnątrzkomórkowej, jak również aktywator plazimogenu oraz czynnik martwicy nowotworów-α (ang. tumor necrosis factor-α, TNFα), które powodują degradację białek ECM (100). Osobną grupę czynników wydzielanych przez komórki MSCs stanowią cząsteczki zaangażowane w proliferację KM, ich przeżywalność oraz migrację do miejsca uszkodzenia tkankowego, do których należą m.in. FGF-2 stymulujący proliferację komórek ECs oraz komórek VSMCs (103), insulinopodobny czynnik wzrostu-1 (ang. insulin-like growth factor-1, IGF-1) regulujący wzrost i różnicowanie komórek, a także hamujący apoptozę (96), czynnik komórek zrębu typu 1 (ang. stromal cell-derived factor-1, SDF-1) hamujący apoptozę oraz stymulujący migrację komórek (104), wydzielnicze białko spokrewnione z białkiem frizzled 2 (ang. Secreted frizzled-related protein 2, SFRP2) stymulące przeżywalność kardiomiocytów w miejscu objętym niedotlenieniem in vivo (104). Jak wspomniano wcześniej, komórki macierzyste, w tym komórki MSCs, mogą wydzielać także pęcherzyki zewnątrzkomórkowe – nanocząstki przenoszące szereg   bioaktywnych cząsteczek oraz zaangażowane w komunikację międzykomórkową (105), które szczegółowo opisano w dalszych rozdziałach. Na Rycinie 5 przedstawiono podstawowe mechanizmy działania komórek MSCs uczestniczące w regeneracji mięśnia sercowego. Komórki MSCs podane w miejsce uszkodzenia tkankowego, np. powstałego na skutek zawału mięśnia sercowego, mogą stymulować regenerację uszkodzonego organu poprzez m.in. stymulację tworzenia nowych naczyń krwionośnych w sercu oraz odnowę puli kardiomiocytów (106). W przypadku odbudowy naczyń, komórki MSCs mogą bezpośrednio różnicować w komórki ECs lub komórki VSMCs (55,56,85,107), lub też korzystnie modulować proces angiogenezy (106). W procesach odbudowy puli kardiomiocytów, komórki MSCs mogą różnicować bezpośrednio w fenotyp identyfikowany, jako fenotyp kardiomiocytów (55,85–90) lub ulegać fuzji z endogennymi kardiomiocytami stymulując ich funkcje (108–110). Rycina 5. Mechanizmy działania komórek MSCs uczestniczące w regeneracji mięśnia sercowego. Odnowa kardiomiocytów oraz regeneracja naczyń krwionośnych stanowią dwa podstawowe efekty regeneracyjne w tkankach serca, obserwowane po podaniu komórek MSCs. Najnowsze wyniki badań wskazują, że komórki MSCs uwalniają szereg czynników rozpuszczalnych, natomiast efekty parakrynne wywierają istotny wpływ na regenerację uszkodzonego mięśnia sercowego poprzez aktywację endogennych mechanizmów naprawczych. Przygotowano na podstawie: (106); rycina własna. Podane dosercowo komórki MSCs wykazują jednak przed wszystkim wysoką aktywność wydzielniczą i parakrynną, z którą to wiąże się większość efektów proregeneracyjnych i poprawiających strukturę i funkcję uszkodzonego organu po przeszczepieniu komórek MSCs (100,101,107,108,111,112). Bioaktywne cząsteczki wydzielane przez komórki MSCs podane w miejsce uszkodzenia mogą m.in: i) stymulować proliferację i różnicowanie endogennej populacji komórek progenitorowych rezydujących w sercu, tzw. KM serca (ang. cardiac stem cells, CSCs) w kierunku CMCs, a także wpływać na ich mobilizację do strefy objętej niedotlenieniem i strefy okołozawałowej (z doniesień literaturowych wynika, że w miejscu objętym zawałem obserwowano 2-krotne zwiększenie liczby komórek CSCs w grupie zwierząt, której podano komórki MSCs w odniesieniu do grupy kontrolnej zwierząt, natomiast w strefie okołowałowej 150-krotne zwiększenie puli komórek CSCs w tej samej grupie zwierząt) (113), ii) stymulować proliferację kardiomiocytów, ich kurczliwość oraz pobudzać ich metabolizm in vivo (113), iii) wydzielać czynniki cytoprotekcyjne działające ochronnie na różne typy komórek tkanki sercowej, co zostało potwierdzone w badaniach in vitro oraz in vivo (101,111,114). Wszystkie wymienione działania komórek MSCs mogą prowadzić do efektów ochronnych w endogennych tkankach, jak również promować korzystną przebudowę tego organu opartą o endogenne komórki (Rycina 5). Dodatkowo bioaktywne czynniki wydzielane przez komórki MSCs, wywierają efekt przeciwzapalny oraz antyapoptotyczny, co wszystko razem może zwiększać efekt regeneracyjny (97,98,100,101,107,108,111,112,115). Badania potencjału regeneracyjnego komórek MSCs wykazały poprawę funkcji serca po ich podaniu, tj. wzrost frakcji wyrzutowej lewej komory (LK) oraz zmniejszenie obszaru blizny pozawałowej w zwierzęcym modelu zawału serca in vivo (112). Meta-analiza przeprowadzona przez grupę Profesora B. Dawn’a i uwzględniająca wyniki 48 randomizowanych prób klinicznych, obejmująca 2602 pacjentów z chorobą niedokrwienną serca, którym podano komórki szpiku kostnego, jako terapię komórkową, wykazała m.in. istotny statystycznie wzrost frakcji wyrzutowej LK serca, redukcję wielkości obszaru pozawałowego oraz złagodzenie niekorzystnej przebudowy tkanek serca (116). Biorąc pod uwagę ograniczoną jednak retencję KM podanych do mięśnia sercowego (117,118), coraz częściej postuluje się, że efekt terapeutyczny obserwowany po podaniu tych komórek jest spowodowany głównie ich aktywnością parakrynną (55,85,88,91). Obserwowana poprawa frakcji wyrzutowej LK wynosząca średnio 2,92% (p=95%) wydaje się stosunkowo niewielka (116), ale pomimo tego należy podkreślić fakt, że zobserwowano 15% redukcjęśmiertelności pacjentów włączonych do prób klinicznych, w których stosowano preparaty komórkowe szpiku kostnego (119). Należy tu mocno podkreślić, że dotychczasowe standardowe metody leczenia skutków zawału mięśnia sercowego – oparte głównie o metody interwencyjne i środki farmakologiczne – również skutkują porównywalną efektywnością poprawy parametrów funkcji serca (120,121). W tym kontekście należy spojrzeć z nadzieją na efekty uzyskiwane w terapii z zastosowaniem KM, w tym z dojrzałych tkanek, jako na obiecujące podejście terapeutyczne, mogące stanowić dodatkowy element do standardowych metod leczenia farmakologicznego, stosowanych dziś w chorobie niedokrwiennej serca. 1.5. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe 1.5.1. Klasyfikacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, mechanizmy powstania i ich skład molekularny Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (ang. extracellular vesicles, EVs) są kulistymi strukturami składającymi się z fragmentu cytoplazmy - zawierającego charakterystyczne dla komórki rodzicielskiej białka, peptydy, RNA oraz DNA, otoczonego błoną lipidową (122,123). EVs stanowią heterogenną populację pęcherzyków uwalnianych przez różne typy komórek, w tym komórki zwierzęce, w warunkach fizjologicznych oraz po ich aktywacji (124–126). Biorąc pod uwagę parametr wielkości, wyróżnia się następujące frakcje EVs wydzielanych przez prawidłowe (nieapoptotyczne) komórki ssacze: i) mikrofragmenty błonowe zwane także ektosomami (o wielkości w zakresie: ok. 100 -1000 nm) oraz egzosomy (o średnicy: ok. 40 - 100 nm) (127,128). Poszczególne rodzaje EVs różnią się także między sobą biogenezą, co warunkuje m.in. ich zawartość molekularną odpowiadającą za funkcje biologiczne (129,130). Niezależną grupę EVs stanowią ciałka apoptotyczne (o średnicy nawet powyżej 1000 nm) wydzielane przez komórki umierające na drodze apoptozy (131). Najwięcej doniesień literaturowych opisuje obecnie mechanizmy powstania egzosomów (132). Egzosomy powstają poprzez wpuklenie błony do światła późnych endosomów nazywanych też ciałami wielopęcherzykowymi (ang. multi-vesicular body, MVB), a następnie uwolnienia nanocząstek poza błonę komórkową. Jeden z najlepiej opisanych mechanizmów powstania MVB, dowodzi, że w biogenezę MVB (a tym samym egzosomów) jest zaangażowany kompleks białkowy ESCRT (ang. Endosomal Sorting Complex Required for Transport) (132,133). Hessvik i wsp. przedstawili (na podstawie dostępnej literatury) listę około 40-u białek (np. TSG101, ALIX, syntenina-1, Rab35), lipidów (np. cholosterol) oraz modyfikacji warunków hodowli komórek (np. hipoksja, naświetlanie) zaangażowanych oraz modulujących biogenezę i uwalnianie egzosomów (134). Pomimo licznych badań dotyczących roli kompleksu białkowego ESCRT w biogenezie MVB, wciąż nie jest jasne czy poszczególne subpopulacje MVB przenoszą ładunek przeznaczony do degradacji w lizosomach, autofagosomach, czy też MVB ulegną fuzji z błoną komórkową, wskutek czego egzosomy zostaną wydzielone do przestrzeni zewnątrzkomórkowej (133). Ostatnie doniesienia literaturowe wskazują, że potranslacyjna modyfikacja białek MVB polegająca na dołączaniu białka ISG15 działającego podobnie jak ubikwityna (z ang. ISGylation) - szczególnie indukowana w czasie infekcji, stresu oksydacyjnego, a także uszkodzeniem DNA oraz w starzejących się komórkach - może kierować MVB na ścieżkę degradacji w lizosomach (135,136). Transport MVB do błony komórkowej jest zależny od ich interakcji z mikrofilamentami aktynowymi oraz mikrotubulami, które tworzą swoiste drogi transportu wewnątrzkomórkowego, po których odbywa się transport MVB za pośrednictwem białek motorycznych (137). Sekrecja egzosomów do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, zachodzi w wyniku fuzji MVB z błoną komórkową, co z kolei następuje z udziałem transbłonowego kompleksu białkowego SNARE (ang. soluble N – ethylmaleiamide-sensitive factor attachment protein receptor), w czym mogą pośredniczyć małe GTPazy (133,138). Na powierzchni MVB znajduje się kompleks białkowy v-SNARE (ang. vesicle SNARE), podczas gdy na wewnątrzkomórkowej części plazmalemmy występują docelowe kompleksy białkowe t-SNARE (ang. target SNARE). Białka v-SNARE są rozpoznawane swoiście przez komplementarne białka t-SNARE, co umożliwia powstanie kompleksu fuzującego, a po przekroczeniu bariery energetycznej następuje fuzja błon i uwolnienie zawartości MVB – tj. egzosomów - do przestrzeni pozakomórkowej (139). Jak wcześniej wspomniano, kompozycja molekularna egzosomów jest ściśle związana z mechanizmem ich powstania (129,130). Najlepiej opisaną grupę cząstek występującą w egzsomomach stanowią białka zaangażowane w różne funkcje, takie jak m.in. formowanie MVB (m.in. TSG101, ALIX), transport błonowy i fuzję błon (m.in. aneksyna I, II, V, białka SNAP, białko RabGDI), białka wykazujące aktywność enzymatyczną (m.in. GTPazy, kinazy lipidowe), białka szoku cieplnego (m.in. Hsp70), białka zaangażowane w przewodzenie sygnałów (m.in. Erk2, syntenina-1) oraz tetraspaniny (m.in. CD63, CD81) uważane za markery egzosomów (140,141). Wyniki innej grupy badawczej wskazują, że następujące cząsteczki: syntenina-1, EHD4 (ang. EH domain-containing protein 4), aneksyna XI oraz cząsteczka ADAM10 (ang. a disintegrin and metallopeptidase domain 10) są molekułami występującymi specyficznie we frakcji egzosomów (142). Listę 100 białek najczęściej występujących w egzosomach można znaleźć w bazie danych ExoCarta, która stanowi swoiste kompendium wiedzy na temat molekularnej kompozycji egzosomów (143). Kolejną grupę cząstek występujących w egzosomach stanowią lipidy takie jak m.in. cząsteczki rezydujące w błonach biologicznych - cholesterol, sfingolipidy, fosfolipidy, glicerofosfolipidy (144). W egzosomach występują także kwasy nukleinowe, takie tak DNA oraz cząsteczki należące do różnych klas RNA, w tym mRNA, mikroRNA oraz długie niekodujące RNA (ang. long non-coding RNA, lncRNA) (126,145,146). W przeciewieństwie do egzosomów, większe pechęrzyki zewnątrzkomórkowe ektosomy, powstają wskutek uwypuklania się plazmalemmy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co jest spowodowane dynamiką i zmianami w kompozycji składników białkowych i lipidowych w obrębie dwuwarstwy błony, które z kolei powodują zmiany elastyczności i asymetrii błony komórkowej, umożliwiając „złuszczanie” się pęcherzyków z powierzchni błony komórkowej (147). Reorganizacja ułożenia fosfolipidów w błonie komórkowej spowodowana jest m.in. uwolnieniem jonów Ca2+ z retikulum endoplazmatycznego, które inaktywują działania flipazy przy równoczesnej aktywacji działania flopazy i skramblazy, wskutek czego dochodzi do zmiany asymetrii ułożenia fosfolipidów pomiędzy obiema warstwami błony, a także następuje zerwanie wiązań pomiędzy włóknami cytoszkieletu aktynowego, a fosfolipidami błonowymi (147,148). Co więcej, jony Ca2+ aktywują kolejne enzymy - kalpainę (ang. calpain) i żelzolinę (ang. gelsolin), które mają zdolność do częściowej hydrolizy wiązań pomiędzy aktyną, a glikoproteinami błonowymi (149,150). Zmiany te zwiększają płynność błon i ułatwiają uwalnianie ektosomów bezpośrednio z powierzchni plazmalemmy. Ektosomy są charakteryzowane głównie na podstawie obecności białek błonowych charakterystycznych dla komórek rodzicielskich (151,152), i tak np. ektosomy wydzielane przez komórki MSCs mogą posiadać na swojej powierzchni następujące antygeny: CD29, CD44, CD105 oraz Sca-1 (ten ostatni antygen - w przypadku ektosomów wydzielanych przez komórki mysie) (153,154). Wyniki badańświatowych pokazują, że pęcherzyki te mogą przenosić wiele białek komórek rodzicielskich, takich jak m.in. białka błonowe i cytoplazmatyczne (155). Do białek przenoszonych przez ektosomy, które są zaangażowane w przekaźnictwo sygnałów należą: receptory błonowe (m.in. CXCR4, receptor EGFR), cząsteczki adhezyjne (w tym integryny, np. Mac-1), chemokiny (m.in. CXCL4, CXCL4), czynniki wzrostu (m.in. TGF-β), białka ECM (m.in. fibronektyna) (156–158). Wśród cząsteczek przenoszonych przez ektosomy zidentyfikowano także metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej (ang. matrix metalloproteinases, MMPs), a wśród nich cząsteczkę MMP-2, która jest uznawana za marker ektosomów (159). Co więcej, ektosomy wykazują także wzbogacenie w aktyninę-4 (ang. actinin-4) oraz mitofilinę (ang. mitofilin) (142), co może odróżniać je od frakcji egzosomów. Kolejną grupę związków budujących ektosomy stanowią lipidy. Najwyższy odsetek lipidów stanowią fosfolipidy - głównie fosfatydylocholina. W obrębie błony ektosomów występuje także sfingomielina, fosfatydyloetanoloamina oraz fosfatydyloseryna (160). Biorąc pod uwagę transkryptom ektosomów, wykazano, że cząsteczki te mogą przenosić mRNA oraz miRNA (formy dojrzałe i prekursorowe) (161–163). W Tabeli 3 przedstawiono porównanie subpopulacji EVs – egzosomów oraz ektosomów. Tabela 3. Porównanie populacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wydzielanych przez prawidłowe komórki zwierzęce i ludzkie. Przygotowano na podstawie: (142,159,164,165). Rodzaj EVs Pochodzenie i mechanizm powstania Wielkość [nm] Białka markerowe Skład molekularny Egzosomy Pochodzenie: szlak endosomalno- lizosomalny; powstają poprzez uwypuklenie błony do światła późnych endosomów, a następnie uwolnienia egzosomów do przestrzeni zewnątrzkomórkowej na drodze egzocytozy (w wyniku fuzji MVB z błoną komórkową) 40 – 100 Tetraspaniny (CD9, CD63, CD81), syntenina-1, EHD4, aneksyna XI, ADAM10, Alix, Tsg101, aneksyny, flotyliny, GTPazy, integryny, białka szoku cieplnego mRNA, miRNA, lncRNA, białka cytoplazmatyczne i błonowe, lipidy Ektosomy Pochodzenie: błona komórkowa; powstają poprzez odpączkowanie błony komórkowej 100 – 1000 MMP-2, aktynina4, mitofilina oraz integryny, glikoproteiny, receptory błonowe, MMPs, białka cytoszkieletu mRNA, miRNA, lncRNA, białka cytoplazmatyczne i błonowe, lipidy Międzynarodowe Towarzystwo Naukowe zajmujące się badaniami pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (ang. International Society for Extracellular Vesicles, ISEV), skupiające badaczy z całego świata, opublikowało listę przykładowych, referencyjnych grup białek, które mogą występować w egzosomach oraz w pełnej frakcji EVs, a które zaleca się stosować, jako markery identyfikujące te nanocząstki biologiczne (166). Grupy tych białek wraz z przykładami zostały wymienione w Tabeli 4. Tabela 4. Kategorie białek oraz ich występowanie we frakcjach EVs (wraz z wybranymi przykładami – w nawiasach). Źródło: (166). Kategoria Białka Białka Białka Białka białek: transbłonowe/ białka ECM związane z lipidami EVs cytoplazmatyczne przedziałów/ organelli wewnątrz-komórkowych pozakomórkowe Opis Występują w egzosomach i ektosomach; Egzosomy i ektosomy - wzbogacone w te białka Niewystępujące w egzosomach/ rzadko występujące w ektosomach Związane gł. z plazmalemmą; zmienne występowanie w EVs; związane gł. z ektosomami Przykłady Tetraspaniny (CD9, CD63, CD81), integryny, cząstki adhezyjne, receptory czynników wzrostu, heterotrimeryczne białka G, białka wiążące fosfatydyloserynę Białka endosomów, białka wiążące się do błony komórkowej (Tsg101, aneksyny, białka Rab), białka sygnałowe oraz cytoszkieletu (syntenina) Białka reticulum endoplazmatycznego (Grp94, kalneksyna), białka aparatu Golgiego (GM130), białka mitochondrialne (cytochrom C), białka jądrowe (histony) Acetylocholinesteraza, albumina, białka ECM (fibronektyna, kolagen) Towarzystwo Naukowe ISEV wydało także zalecenia dotyczące izolacji EVs oraz ich charakterystyki molekularnej oraz funkcjonalnej, co umożliwia przeprowadzenie porównywalnej identyfikacji EVs przez niezależne grupy badawcze na całym świecie oraz w efekcie umożliwia porówanie wyników przeprowadzonych badań (166,167). 1.5.2. Mechanizmy działania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Frakcją EVs najwcześniej opisywaną w literaturze były mikrocząstki (ang. microparticles) wydzielane przez płytki krwi (168), ale już od wczesnych latach 2000 zaczęły pojawiać się coraz liczniejsze doniesienienia wskazujące, że również inne komórki wydzielają nanopęcherzyki, które mogą przenosić bioaktywną zawartość (białka oraz mRNA) pomiędzy komórką donorową (rodzicielską), a komórką akceptorową (docelową), wpływając w ten sposób na jej właściwości biologiczne (105). W związku z bioaktywnym ładunkiem przenoszonym przez EVs, nanocząstki te mogą modulować właściwości komórek docelowych na kilka sposobów, które zostały opisane poniżej. Pierwszy mechanizm wymiany informacji za pośrednictwem EVs polega na bezpośredniej stymulacji komórki docelowej poprzez albo dostarczenie liganda wiążącego się do receptora w błonie komórki, bądź przez wiązanie aktywnego liganda występującego na powierzchni komórki akceptorowej, której efektem może być aktywacja komórki docelowej, w tym m.in. do wydzielania innych bioaktywnych cząsteczek (np. cytokin, czynników wzrostu) (169,170). Dla przykładu, EVs posiadające na swojej powierzchni cząsteczkę Mac-1 mogą wiązać się z płytkami krwi, powodując ich aktywację, a także nanocząstki te mogą aktywować komórki ECs (170,171). Drugi mechanizm działania EVs polega na przenoszeniu receptorów pomiędzy komórkami, i tak np. EVs wydzielane przez płytki krwi mogą przenosić receptor błonowy CD14 do błony komórek promonocytarnych, a także receptory adhezyjne m.in. CD54 do błony komórek ECs zwiększając tym samym ich właściwości adhezji (172). Kolejny, trzeci mechanizm działania EVs, polega na przenoszeniu białek enzymatycznych pomiędzy komórką rodzicielską dla EVs, a komórką docelową. Przykładowo, monocyty inkubowane z endotoksynami wydzielają EVs przenoszące kaspazę-1, a następnie nanocząstki te indukują apoptozę komórek VSMCs (173). Czwarty mechanizm działania EVs polega na horyzontalnym transferze informacji genetycznej pomiędzy komórkami. Przykładowo, EVs wydzielane przez mysie embrionalne komórki macierzyste mogą przenosić mRNA dla markerów komórek pluripotencjalnych do komórek docelowych, modulując ich właściwości biologiczne (105). EVs wydzielane przez te komórki mogą podnosićżywotność hematopoetycznych komórek macierzystych/ progenitorowych, wzmacniać ekspresję markerów charakterystycznych dla wczesnego etapu pluripotencji oraz markerów komórek hematopoetycznych, a także indukować fosforylację kinazy MAP p42/44 oraz białka Akt (105). Ponadto, EVs mogą przenosić liczne cząsteczki mikroRNA do komórek docelowych, a tym samym regulować translację określonych białek w tych komórkach (174). Podstawowe mechanizmy wymiany informacji pomiędzy komórką rodzicielską EVs, a komórką docelową przedstawiono na Rycinie 6. Komórka Rycina 6. Mechanizmy komunikacji międzykomórkowej pomiędzy komórką donorową, a komórką akceptorową za pośrednictwem EVs. Do głównych mechanizmów wymiany informacji pomiędzy komórką donorową (komórką rodzicielską, z której pochodzą EVs), a komórki akceptorową należą: i) bezpośrednia stymulacja komórki docelowej poprzez dostarczanie określonego liganda przez EVs lub wiązanie liganda występującego na powierzchni EVs, ii) przenoszenie receptorów powierzchniowych pomiędzy komórką donorową, a komórką akceptorową; iii) przenoszenie białek (m.in. enzymów, czynników transkrypcyjnych) pomiędzy komórką donorową, a komórką akceptorową; oraz iv) przenoszenie informacji genetycznej w postaci m.in. mRNA, miRNA z komórki donorowej do komórki akceptorowej. Przygotowano na podstawie: (175), zmodyfikowano. Podsumowując, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe uczestniczą w komunikacji międzykomórkowej i dzięki swej bioaktywnej zawartości, mogą modulować właściwości biologiczne komórek docelowych. Efekt funkcjonalny w komórkach docelowych jest uzależniony od bioaktywnego składu molekularnego EVs. 1.5.3. Funkcja i znaczenie biologiczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Jak wspomniano wyżej, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają istotną rolę w komunikacji międzykomórkowej, tj. w wymianie informacji - w postaci bioaktywnych cząsteczek białek, lipidów i kwasów nukleinowych - pomiędzy komórkami donorowymi i komórkami akceptorowymi (105,176), powodując wpływ na funkcje biologiczne tych ostatnich. Efektem związania się EVs do komórki docelowej może być m.in. zmiana w ich aktywności proliferacyjnej, żywotności, metaboliźmie, aktywności wydzielniczej, czy też ekspresji różnych genów związanych np. z procesami różnicowania (105,169,170,177). Wymiana informacji za pośrednictwem EVs odbywa się nie tylko pomiędzy sąsiadującymi komórkami, ale dzięki swoim małym rozmiarom EVs wraz z płynami ustrojowymi mogą przemieszczać się na znaczne odległości, a następnie wiązać się do komórek docelowych w innych tkankach (176). Obecne wyniki badańświatowych dostarczają nam wiedzy na temat charakterystyki biologicznej i molekularnej EVs występujących w wielu płynach ustrojowych, takich jak m.in. krew, mocz, płyn owodniowy, które to EVs posiadają cechy charakterystyczne dla komórek, z których pochodzą (178–180). Komunikacja międzykomórkowa za pośrednictwem EVs odgrywa istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych. Przykładowo, w obrębie nisz KM, komórki stromalne wydzielają biologicznie aktywne EVs, które oddziałują m.in. z KM hematopoetycznymi, powodując utrzymanie stałej puli tych komórek w niszy, poprzez hamowanie ich apoptozy oraz utrzymanie potencjału różnicowania (181). Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, a szczególnie te pochodzące z komórek immunokompetentnych, mogą odgrywać także istotną rolę w przenoszeniu białek głównego kompleksu zgodności tkankowej i innych antygenów z powierzchni jednej do powierzchni drugiej komórki układu immunologicznego, a także pośredniczyć w prezentacji antygenu (182–184). Z kolei EVs wydzielane przez komórki epitelialne kanalików nerkowych (ang. renal tubular epithelial cells) mogą indukować pojawienie się markerów oraz cech charakterystycznych dla komórek nabłonkowych w komórkach MSCs (185). Jak wspomniano we wcześniejszych rozdziałach, bioaktywne cząstki przenoszone przez EVs odzwierciedlają rodzaj komórek rodzicielskich, z których pochodzą te pęcherzyki. Dla przykładu, egzosomy wydzielane przez kardiomiocyty wykazują wzbogacenie w białka charakterystyczne dla sarkomerów (186) oraz odgrywają istotną rolę w komunikacji z komórkami śródbłonka serca, stymulując ich migrację, co może mieć istotne znaczenie dla procesów regeneracji uszkodzonego mięśnia sercowego m.in. poprzez indukcję neowaskularyzacji (187). Z kolei badania przeprowadzone przez nasz zespół wykazały, że EVs wydzielane przez mysie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ang. induced pluripotent stem cells, iPS) mogą korzystnie modulować potencjał angiogenny komórek śródbłonka serca oraz wywierać na nie efekt cytoprotekcyjny in vitro (114). Poza procesami fizjologicznymi, EVs odgrywają także istotną rolę w procesach towarzyszącym stanom patologicznym w naszym organizmie. Wyniki badań wykonanych w mysim modelu AMI, wykazały wzrost wydzielania EVs przez kardiomiocyty oraz komórki śródbłonka w następstwie uszkodzenia niedokrwiennego tego organu, a następnie ich wychwyt przez napływające monocyty (188). EVs wyizolowane z tkanek mięśnia sercowego objętego niedotlenieniem wywierały inny efekt biologiczny na komórki docelowe w porównaniu do EVs wyizolowanych z nieuszkodzonych tkanek mięśnia sercowego (188), co może świadczyć o odmiennym składzie molekularnym pęcherzyków wydzielanych w stanach fizjologicznych oraz patologicznych. W związku z tym, w ostatnim czasie prowadzone są badania EVs, jako potencjalnych biomarkerów chorób, które mogłyby pomóc szybciej zdiagnozować pewne schorzenia. W chwili obecnej w światowej bazie rejestrującej badania kliniczne - ClinicalTrials.gov - zarejestrowanych jest 9 badań, których celem jest m.in. charakterystyka krążących EVs wydzielanych przez komórki wysepek Langerhansa w przebiegu cukrzycy, czy też w przebiegu choroby Alzheimera. Co więcej, również komórki nowotworowe wydzielają EVs, które mogą oddziaływać na komórki immunokompetentne i odgrywać rolę w rozwoju nowotworów i tworzeniu przerzutów (189), co stanowi odrębą ważną gałąź badawczą nad rolą EVs w komunikacji międzykomórkowej w warunkach prawidłowych i patologicznych. 1.5.4. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez komórki macierzyste i próby ich wykorzystania w regeneracji tkanek Wyniki badańświatowych koncentrujących się na procesach naprawy tkankowej, wykazały m.in. że EVs wydzielane przez KM mogą przenosić bioaktywną zawartość, która może wpływać na funkcje komórek docelowych, w tym m.in. proces regeneracji uszkodzonych tkanek (114,126,190). W chwili obecnej badacze na całym świecie podejmują liczne badania w badaniach przedklinicznych mające na celu określenie potencjału regeneracyjnego EVs pozyskiwanych z KM w wielu zwierzęcych modelach uszkodzeń tkanek i narządów, takich jak m.in. uszkodzenie nerek i wątroby, uszkodzenie płuc, udar mózgu, czy też niedotlenienie mięśnia sercowego (114,124,191–197). Wybrane zwierzęce modele in vivo, w których badano potencjał regeneracyjny EVs, ze szczególnym uwzględniemiem EVs wydzielanych przez komórki MSCs oraz informacją o dawce i schemacie podania EVs zamieszczono w Tabeli 5. Badania przeprowadzone w mysim modelu uszkodzenia nerek indukowanych cisplatyną, wykazały, że MSC-EVs podawane dożylnie (i.v.) zwiększają przeżycie tych zwierząt, przy czym procent przeżywających zwierząt był wyższy w przypadku kilkukrotnego podania preparatów MSC-EVs w porównaniu do procentu przeżycia obserwowanego w przypadku podania jednokrotnego (191). Z kolei te same cząsteczki badane w modelu niedokrwiennego uszkodzenia wątroby in vivo, powodowały korzystne obniżenie poziomu cytokin prozapalnych w osoczu zwierząt, co było skorelowane ze zmniejszeniem wartości markerów charakterystycznych dla uszkodzonej wątroby (w tym m.in. ALT, ASP) (192). Podobnie, efekt przeciwzapalny mediowany przez MSC-EVs był obserwowany także w mysim modelu ostrego uszkodzenia płuc indukowanego endotoksynami bakteryjnymi (193). Co ciekawe, w literaturze można znaleźć także wyniki badań in vivo, które pokazują korzystny wpływ MSC-EVs na parametry neurologiczne mózgu myszy w mysim modelu udaru mózgu in vivo. Wyniki analiz przeprowadzonych na tkance mózgowej pobranej od tych zwierząt wykazały wyższą gęstość neuronów w obszarze niedokrwienienia skorelowaną z wyższą proliferacją komórek w tym rejonie, potwierdzając równocześnie występowanie neurogenezy i angiogenezy w rejonie niedotlenienia mózgu (124). W modelu tym MSC-EVs podawane były dożylnie (124), co świadczy, że cząsteczki te ze względu na swoje małe rozmiary, mogą przenikać przez barierę krew- mózg. Biorąc pod uwagę zwierzęcy model ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI), obserwowano poprawę funkcji skurczowej lewej komory serca, a także zmniejszenie obszaru blizny pozawałowej w następstwie podania EVs, w tym m.in. MSC-EVs (114,194–196). Opublikowane wyniki badań in vivo w modelu AMI, przedstawiają korzystny wpływ EVs wydzielanych przez różne populacje KM, które podawane były bezpośrednio do mięśnia sercowego (114,194–196). Nie mniej jednak, zdolność do internalizacji EVs przez komórki w warunkach in vivo w modelu AMI po ich podaniu dożylnym, nie była dotąd przedstawiana w literaturze. Podanie domięśniowe preparatów opartych o KM lub ich pochodne, stanowi główną drogę podania. Jednak w przebiegu niektórych uszkodzeń tkankowych, jak np. udar mózgu, podanie bezpośrednie do rejonu uszkodzenia może być obarczone dużym ryzykiem powikłań. Dlatego też, bardzo ważne jest znalezienie alternatywnych oraz bezpieczniejszych dróg podania preparatów biologicznych, które będą mogły efektywnie promować efekty regeneracyjne uszkodzonych tkanek, w tym podania dożylne lub dotętnicze, co stanowi przedmiot już prowadzonych badań (198). Charakterystyka molekularna EVs wpływająca na ich oddziaływanie z komórkami docelowymi, w tym komórkami śródbłonka, jak również wyjaśnienie tego oddziaływania w oparciu o molekularną kompozycję EVs, nie były jak dotąd przedmiotem pogłębionych analiz w mysim modelu AMI oraz LI. Chociaż w literaturze można znaleźć doniesienia przedstawiające charakterystykę molekularną EVs na poziomie białka (190) lub mikroRNA (126), jednak nie ma prac przedstawiających dogłębną wieloaspektową analizę MSC-EVs, skorelowaną z jej wpływem na właściwości funkcjonalne komórek docelowych in vitro. Co więcej, zasadne wydaje się także sprawdzenie ich potencjału regeneracyjnego w wybranych modelach uszkodzeń niedokrwiennych tkanek, w tym AMI i LI (ze szczególnym uwzględnieniem innej drogi podania niż podanie domięśniowe) oraz wskazanie potencjalnych mechanizmów działania tych cząsteczek w oparciu o ich skład molekularny oraz zmiany obserwowane na poziomie histologicznym oraz biochemicznym po podaniu preparatów EVs in vivo. Tabela 5. Próby wykorzystania EVs w regeneracji uszkodzonych tkanek in vivo. Model in vivo uszkodzenia tkankowego Rodzaj EVs, dawka i droga podania Obserwowane efekty regeneracyjne Referencja Uszkodzenie BM-MSC-EVs Podanie jednokrotne EVs: (191) nerek 6 podań i.v.: - zwiększone przeżycie myszy o 40% indukowane 1-sze podanie: - poprawa czynności nerek cisplatyną 100 µg, kolejne podania: 50 µg - w ocenie histologicznej brak oznak uszkodzenia nerek (ang. Cisplatin- Podanie wielokrotne EVs: induced acute - zwiększone przeżycie myszy o 80% kidney injury) - znaczna poprawa czynności nerek - w ocenie histologicznej brak oznak uszkodzenia nerek Niedokrwienne BM-MSC-EVs, - zmniejszenie wartości ekspresji markerów (192) uszkodzenie 1-o podanie i.v. charakterystycznych dla uszkodzonej wątroby 2x1010 cząstek wątroby (m.in. ALT, AST, ALP, kreatyniny) (ang. hepatic - zmniejszenie obszaru nekrozy tkanek ischemia - obniżenie poziomu cytokin prozapalnych reperfusion) w osoczu Ostre uszkodzenie płuc BM-MSC-EVs 1-o podanie i.v. dawka: EVs - zmniejszenie obrzęku płuc - redukcja napływu komórek układu odpornościowego do miejsca uszkodzenia (193) indukowane bakteryjnymi endotoksynami (ang. endotoxin-induced acute lung injury) wydzielone przez 3x106 komórek Udar mózgu BM-MSC-EVs - poprawa parametrów neurologicznych (124) (ang. stroke) 1-o podanie i.v. dawka: EVs wydzielone przez 2x106 komórek - wyższa gęstość neuronów w obszarze niedokrwienienia skorelowana z wyższą proliferacją komórek w tym rejonie - występowanie neurogenezy i angiogenezy w rejonie uszkodzenia Ostry zawał mięśnia sercowego (ang. acute myocardial infarction) BM-MSC-EVs, 1-o podanie i.m. dawka: 80 µg, wydzielone przez 2x106 komórek - zmniejszenie obszaru zawału - poprawa ukrwienia niedotlenionych obszarów poprzez stymulację angiogenezy w tych obszarach (194) iPS-EVs, - poprawa funkcji LK serca (m.in. frakcji (114) 1-o podanie i.m. wyrzutowej) dawka: 100 µg - zmniejszenie obszaru blizny pozawałowej - zatrzymanie niekorzystnej przebudowy tkanek serca CPC-EVs, - poprawa funkcji LK serca (m.in. frakcji (195) 1-o podanie i.m. wyrzutowej) dawka: 300 µg - zahamowanie apoptozy kardiomiocytów - zmniejszenie rozmiaru blizny pozawałowej - stymulacja angiogenezy w obszarze objętym niedotlenieniem MSC-egzosomy - poprawa funkcji skurczowej LK serca (196) 1-o podanie i.v. (m.in. frakcji wyrzutowej) dawka: 0,4 µg/ - zahamowanie apoptozy kardiomiocytów 1 ml buforu - zmniejszenie rozmiaru blizny infuzyjnego pozawałowej - przywrócenie fizjologiczne poziomu ATP/ADP oraz NADH/NAD+, a także redukcja stresu oksydacyjnego w komórkach tkanki mięśnia sercowego (ochrona przed uszkodzeniem spowodowanym reperfuzją) Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez KM budzą coraz większe zainteresowanie w kontekście ich potencjalnego wykorzystania w regeneracji uszkodzonych tkanek, w tym w chorobach niedokrwiennych. Badania w tym zakresie stanowią rozwijąjąca się obecnie dziedzinę badań i stawiają badaczom nowe wyzwania merytoryczne oraz metodologiczne. Niewątliwie główną zaletą EVs jest fakt, że są one nośnikami bioaktywnych cząstek takich jak: białka, mRNA, mikroRNA. W związku z tym, EVs mogą oddziaływać aktywnie na komórki docelowe modulując ich funkcje. Wykorzystanie EVs w nowych podejściach regeneracyjnych może być bezpiecznejsze od stosowanych dotychczas podań całych komórek, szczególnie w tkankach, do których dotarcie jest utrudnione oraz może nieść dodatkowe ryzyko uszkodzenia, jak np. w przypadku tkanek mózgu lub serca. W tym kontekście, poznanie charakterystki molekularnej oraz biologicznej populacji EVs wydzielanych przez KM, w tym MSCs, oraz scharakteryzowanie ich oddziaływania na komórki docelowe w modelach in vitro i in vivo, może dostarczyć cennych informacji na temat możliwych przyszłych zastosowań tych preparatów w regeneracji uszkodzonych tkanek. W związku z powyższym, w niniejszej pracy doktorskiej podjęto badania mające na celu pogłębioną charakterystykę molekularną bioaktywnych MSC-EVs w aspekcie przenoszonych przez nie cząsteczek, które mogą być zaangażowane w procesy regeneracji uszkodzonych tkanek, jak również zbadanie internalizacji MSC-EVs przez komórki docelowe w modelu in vitro i in vivo oraz poznanie potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w modelach niedokrwiennego uszkodzenia tkanek in vivo. 2. CELE PRACY Głównym celem badań realizowanych w ramach niniejszej pracy doktorskiej była ocena fenotypu, składu molekularnego oraz aktywności biologicznej, w tym potencjału regeneracyjnego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych uwalnianych przez mysie mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego, w kontekście ich potencjalnej możliwości zastosowania w regeneracji tkanek uszkodzonych w wyniku niedotlenienia in vivo. Do szczegółowych celów badawczych należało: 1. Oczyszczenie mikropęcherzyków zewnątrzkomórkowych wydzielanych przez mysie antygenowo-zdefiniowane mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs) szpiku kostnego w hodowli in vitro (preparaty MSC-EVs). 2. Zbadanie morfologii, wielkości i fenotypu wieloantygenowego uzyskanych preparatów MSC-EVs zgodnie z zaleceniami Towarzystwa Naukowego ISEV (166). 3. Zbadanie składu molekularnego MSC-EVs na poziomie białka, mRNA oraz miRNA. 4. Zbadanie wpływu MSC-EVs na wybrane funkcje biologiczne mysich komórek śródbłonka naczyń serca (MCEC) in vitro, w tym na ich przeżywalność w warunkach niedotlenienia oraz stanu zapalnego, a także potencjał angiogenny i poziom aktywacji w środowisku zapalnym. 5. Zbadanie retencji MSC-EVs podawanych dożylnie, w organach objętych uszkodzeniem niedokrwiennym in vivo, w tym w mysich modelach: a) ostrego zawału mięśnia sercowego z uszkodzeniem wywołanym ischemią i reperfuzją (ang. acute myocardial infarction; AMI; ischemia/ reperfusion injury; I/R), oraz b) uszkodzenia niedokrwiennego kończyny (ang. limb ischemia, LI). 6. Zbadanie potencjału regeneracyjnego MSC-EVs in vivo, w przedklinicznych modelach niedokrwiennego uszkodzenia tkanek, w tym: a) ostrego zawału mięśnia sercowego u myszy z uszkodzeniem wywołanym ischemią i reperfuzją (AMI; I/R), oraz b) uszkodzenia niedokrwiennego kończyny (LI). 3. MATERIAŁY I METODY 3.1. Materiał badawczy 3.1.1. Zwierzęta Materiał wyjściowy do wyprowadzenia hodowli mysich mezenchymalnych komórek macierzystych (ang. mesenchymal stem/stromal cells, MSCs) oraz wykorzystany w kolejnych etapach przygotowywania preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych otrzymanych z hodowli komórek MSCs (MSC-EVs) -stanowił mysi szpik kostny izolowany z kości udowych oraz piszczelowych myszy następujących szczepów: 1) C57Bl/6J (szczep dziki) oraz 2) C57Bl/6-Tg(GFP)J (szczep transgeniczny wykazujący endogenną ekspresję znacznika eGFP we wszystkich komórkach). Myszy obu szczepów w wieku 8-10 tygodni kupowano od hodowcy Charles River (Animalab) lub pozyskiwano z hodowli własnej Zwierzętarni Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie. Doświadczenia związane z wykorzystaniem zwierzęcego materiału biologicznego zostały wykonane za zgodą I Lokalnej Komisji Bioetycznej w Krakowie (Uchwała nr 183/2012). Badania potencjału regeneracyjnego MSC-EVs otrzymanych z hodowli komórek MSCs prowadzono w dwóch modelach zwierzęcych in vivo: 1) Mysim modelu ostrego zawału mięśnia sercowego (ang. acute myocardial infarction, AMI). Doświadczenia - z udziałem 12-14 tygodniowych myszy szczepu C57Bl/6J (szczep dziki) - wykonane zostały w instytucji współpracującej: Cardiovascular Research Institute, University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, USA, na podstawie protokołów zaakceptowanych przez American Association for Laboratory Animal Science (no. 2015-2269 oraz 2015-2269.12); 2) Mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny (ang. limb ischemia, LI). Doświadczenia - z udziałem 10-13 tygodniowych myszy szczepu C57Bl/6J (szczep dziki) - wykonane zostały w instytucji współpracującej: INSERM, U1063, Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques, Institut de Biologie en Santé, Universite d’Angers, Angers, Francja, zgodnie z zastosowaniem zatwierdzonych protokołów instytucjonalnych (no. CEEA.2012.125). 3.1.2. Hodowle komórkowe 3.1.2.1. Izolacja oraz hodowla komórek MSCs Komórki MSCs izolowano z mysiego szpiku kostnego zgodnie z protokołem opublikowanym przez Soleimani i Nadri (199) z niewielkimi modyfikacjami, zgodnie z poniższą procedurą. Szpik kostny izolowano z kości udowych oraz piszczelowych kończyn myszy szczepu C57Bl/6J oraz C57Bl/6-Tg(GFP)J poprzez wypłukanie jam szpikowych za pomocą pożywki hodowlanej DMEM/F12 (Sigma-Aldrich) umieszczonej w strzykawce o obj. 1 ml z igłą (Polfa Lublin). Wypłukaną półpłynną tkankę szpiku aspirowano kilkukrotnie do strzykawki celem doprowadzenia komórek do jednolitej zawiesiny, którą następnie umieszczano w probówce kolekcyjnej (o objętości 15 lub 50 ml; BD Falcon) po wcześniejszym przefiltrowaniu przez filtr Ø 70 µm (BD Falcon) i odwirowano z prędkością 350xg, przez 6 min. w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Pelet komórkowy zawieszano w świeżej pełnej pożywce DMEM/F12 suplementowanej 10% bydlęcą surowicą płodową (ang. fetal bovine serum, FBS; Sigma-Aldrich) i umieszczano na lodzie. Kości pozostałe po wypłukaniu tkanki szpikowej fragmentowano mechanicznie i trawiono następnie enzymatycznie w mieszaninie kolagenazy I i II (o stężeniu końcowym: 1 mg/ml każda, ThermoFisher Scientific) przez 90 min. w temp. 37oC. Po trawieniu, enzymy inaktywowano poprzez dodanie 5-krotnej objętości pożywki DMEM/F12 z 10% FBS (Sigma-Aldrich), a następnie całość przenoszono przez filtr Ø 70 µm (BD Falcon) do nowej probówki wirowniczej celem usunięcia niestrawionych tkanek. Zawiesinę uwolnionych komórek odwirowywano z prędkością 350xg, przez 6 min. w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Pelet komórkowy zawieszano w świeżej pożywce DMEM/F12 z 10% FBS (Sigma-Aldrich), a następnie łączono z zawiesiną komórek szpiku kostnego wyizolowanych w pierwszym etapie. Komórki następnie wysiewano na naczynia hodowlane typu BD Primaria (75 cm2, dedykowane hodowlom pierwotnym, BD Falcon), w gęstości 40 x 106 wyizolowanych komórek/ 75 cm2 powierzchni hodowlanej, w 20 ml pożywki DMEM/F12 z 10% FBS (Sigma-Aldrich) oraz z dodatkiem mieszaniny antybiotyków: penicyliny (st. końcowe: 100 U/ml) oraz streptomycyny (st. końcowe: 100 µg/ml; ThermoFisher Scientific). Hodowlę wstępną prowadzono w inkubatorze CO2 przeznaczonym do hodowli komórek eukariotycznych (Memmert, Indiamart), w temp. 37oC w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2, przez 72h bez zmiany pożywki, ponieważ komórki MSCs pozyskiwano poprzez adhezję do polistyrenowych powierzchni naczyń hodowlanych. Po 72h hodowli wszystkie nieadherentne komórki usuwano z hodowli poprzez zmianę całości pożywki. Frakcja adherentna komórek zawierająca komórki MSCs była nadal namnażana do momentu osiągnięcia 80-90% konfluencji, kiedy to komórki pasażowano. W tym celu usuwano pożywkę hodowlaną, komórki dwukrotnie przepłukiwano 10 ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), a następnie inkubowano w obecności 2 ml 0,25% roztworu trypsyny z EDTA (ThermoFisher Scientific) do momentu zaokrąglenia się i oderwania się pierwszych komórek MSCs od powierzchni plastiku hodowlanego. Wtedy komórki zalewano 10 ml pełnej pożywki hodowlanej (DMEM/F12 z 10% FBS; Sigma-Aldrich), pipetowano kilkukrotnie celem uwolnienia komórek do zawiesiny i całość przenoszono do probówek kolekcyjnych 15 lub 50 ml (BD Falcon). Komórki odwirowywano z prędkością 350xg, przez 6 minut w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Komórki wysiewano na nowe naczynia hodowlane typu BD Primaria w stosunku ilościowym 1:2 w celu dalszego namnażania. Hodowlę prowadzono do 6 pasażu (P6). Celem ujednolicenia wyników badań i zminimalizowania różnic wynikających z jednej strony z heterogenności frakcji komórek na wczesnych etapach hodowli, a z drugiej strony m.in. z postępującego starzenia się komórek w hodowlach pierwotnych, w niniejszej pracy wykorzystywano komórki MSCs znajdujące się pomiędzy pasażem 4, a pasażem 6 hodowli (P4-P6). 3.1.2.2. Hodowla mysich komórek śródbłonka serca (MCEC) Mysie komórki śródbłonka serca (ang. mouse cardiac endothelial cells, MCEC) zakupiono z firmy CELLutions Biosystems Inc. i hodowano na płytkach Ø 10 cm lub Ø 6 cm (BD Falcon) opłaszczonych roztworem żelatyny (st. końcowe: 0,1%, Sigma-Aldrich) w pożywce DMEM (zawierającej 4500 mg/L glukozy, 0,584 g/L L-glutaminy, 3,7 g/L wodorowęglanu sodu oraz bez dodatku pirogronianu sodu; Sigma-Aldrich) suplementowanej: 10 mM buforem HEPES (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), 5% FBS (Sigma-Aldrich) oraz mieszaniną penicyliny (st. końcowe: 100 U/ml) oraz streptomycyny (st. końcowe: 100 µg/ml; ThermoFisher Scientific). Hodowlę prowadzono w inkubatorze CO2 przeznaczonym do hodowli komórek eukariotycznych (Memmert, Indiamart), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2. W momencie osiągnięcia przez komórki 80% konfluencji wykonywano pasaż komórek. W tym celu pożywkę usuwano z hodowli, komórki dwukrotnie przepłukiwano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), a następnie pasażowano przy użyciu roztworu TrypLE Select Enzyme 1X (ThermoFisher Scientific). Komórki odwirowywano z prędkością 300xg, przez 5 min. w temp. pokojowej, przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Komórki wysiewano na nowe naczynia hodowlane opłaszczonych żelatyną (st. końcowe: 0,1%, Sigma-Aldrich), w stosunku ilościowym 1:5. 3.1.3. Izolaty pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z komórek MSCs (MSC-EVs) Kolejny kluczowy materiał badawczy wykorzystywany w niniejszej pracy stanowiły pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wydzielane przez mysie komórki MSCs szpiku kostnego (tj. MSC-EVs). Procedury pozyskiwania, oczyszczania oraz charakteryzacji morfologicznej oraz molekularnej MSC-EVs opisano w dalszej części tego rozdziału. 3.2. Metody i protokoły analityczne 3.2.1. Analiza morfologii i profilu antygenowego komórek MSCs W celu oceny morfologii komórek MSCs, komórki poddawano codziennej obserwacji przy użyciu mikroskopu świetlnego Olympus IX81 (Olympus) z kontrastem faz, wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV. W celu dokładnej analizy zmian morfologii komórek w czasie hodowli, każdorazowo wykonano zdjęcia tych komórek. Komórki MSCs (na pasażu 4-6) poddawano analizie z zastosowaniem cytometrii przepływowej. W tym celu, po speletowaniu komórek po pasażu, komórki płukano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), a następnie zawieszano w pożywce DMEM/F12 suplementowanej 2% FBS (Sigma-Aldrich) stanowiącej optymalne środowisko do przyżyciowego barwienia immunofluorescencyjnego komórek MSCs. Komórki rozdzielano następnie do próbówek cytometrycznych (BD Falcon) o objętości 5 ml (2x105 komórek/próbkę), a następnie barwiono specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko następującym antygenom powierzchniowym: CD45, CD29, CD44, CD90, CD105, Sca-1, VEGFR2 (CD309), CD63, CD81, SSEA-1, CD11b, CD45R, c-kit (CD117), Tie-2 (CD202b), CD31, CD62E, TCR β chain, γδ T-Cell Receptor, HGFR, CD184 (CXCR4), CD11a/CD18, CD49d, CD49e, CD54, CD106, CD62P, CD162, CD98, CD104 oraz CD147 (opisanymi w Tabeli 6) przez 30 min., na lodzie, bez dostępu światła. Po barwieniu komórki płukano objętością 3 ml roztworu soli PBS bez Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences) i odwirowywano z prędkością 350xg, przez 6 min. w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Komórki zawieszano w pożywce DMEM/F12 suplementowanej 2% FBS (Sigma-Aldrich) i analizowano przy użyciu cytometru przepływowego BD LSR Fortessa (BD Bioscence) w celu identyfikacji antygenów występujących na powierzchni komórek MSCs. Tabela 6. Lista przeciwciał wykorzystanych do analizy cytometrycznej komórek MSCs. Przeciwciało przeciwko antygenowi Fluorochrom Klon Producent CD11a/CD18 APC H155-78 Biolegend CD11b PE M1/70 BD Bioscences CD29 APC HMβ1-1 Biolegend CD31 PE MEC13.3 Biolegend CD44 APC IM7 Biolegend CD45 FITC PE 30-F11 BD Bioscences CR45R PE RA3-6B2 BD Bioscence CD49d APC R1-2 Biolegend CD49e Alexa Fluor 488 5H10-27 Biolegend CD54 APC YN1/1.7.4 Biolegend CD62E PE 10E9.6 BD Bioscences CD62P Alexa Fluor 647 RB40.34 BD Bioscences CD63 PE NVG-2 BD Bioscences CD81 PE Eat2 BD Bioscences CD90 PE 30-H12 Biolegend CD98 Alexa Fluor 647 RL388 Biolegend CD104 FITC 346-11A Biolegend CD105 APC MJ7/18 Biolegend CD106 APC 429 Biolegend CD117 (c-kit) PE 2B8 BD Bioscences CD147 FITC RL73 eBioscence CD162 Alexa Fluor 647 2PH1 BD Bioscences CD184 Alexa Fluor 647 L276F12 Biolegend CD202b (Tie-2) APC TEK4 Biolegend CD309 (VEGFR2) APC 89B3A5 Biolegend c-Met (HGFR) PE eBioclone 7 eBioscence Sca-1 PE E13-161.7 BD Bioscences Biolegend SSEA-1 PE MC-480 Biolegend γδ T-Cell Receptor PE GL3 BD Bioscences TCR β Chain PE H57-597 BD Bioscences 3.2.2. Analiza żywotności komórek Żywotność komórek MSCs, które były źródłem EVs i znad których zbierano pożywki kondycjonowane, jak również komórki MCEC - poddawane stymulacji cytokinami prozapalnymi oraz MSC-EVs (procedury opisane poniżej), każdorazowo analizowano z zastosowaniem cytometrii przepływowej, przy użyciu komercyjnego zestawu Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Bioscence) zgodnie z instrukcją dołączoną przez producenta. W skrócie, po pasażu komórki odwirowano z prędkością 300xg, przez 6 min. w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Nadsącz usuwano, a następnie komórki zawieszano w 20 ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences) i wirowano prędkością 300xg, przez 6 min. w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Następnie, komórki zawieszano w roztworze 1X Binding Buffer w gęstości 106 komórek/ml. Po 100 µl zawiesiny komórek zawierającej 105 komórek przenoszono do nowych probówek cytometrycznych (BD Falcon). Do właściwej probówki do analizy dodawano 5 µl Aneksyny V oraz 5 µl jodku propidyny (ang. propidium iodide, PI) – znajdujących się w zestawie. Do próbek przygotowywanych w celu wykonania kompensacji kolorów, dodawano 2 µl Aneksyny V lub 2 µl PI. Zawartość probówek mieszano, a następnie inkubowano przez 15 min., w temp. pokojowej, bez dostępu światła. Po zakończonym barwieniu, do każdej probówki dodawano po 400 µl roztworu 1X Binding Buffer. Bezpośrednio po wybarwieniu, komórki analizowano przy użyciu cytometru przepływowego BD LSR Fortessa (Becton Dickinson). Zastosowany schemat analizy wykorzystujący barwienie jąder komórkowych w martwych komórkach za pomocą barwnika PI oraz wiązanie Aneksyny V do fosfatydyloseryny na powierzchni komórek apoptotycznych, umożliwił nie tylko ocenę odsetka komórek żywych (Aneksyna V-/ PI-) w hodowli, ale także na identyfikację komórek wczesnoapoptotycznych (Aneksyna V+/ PI-), późnoapoptotycznych (Aneksyna V+/ PI+) oraz nekrotycznych (Aneksyna V-/ PI+). 3.2.3. Analiza cyklu komórkowego Komórki MSCs poddawano także analizie z zastosowaniem cytometrii przepływowej w celu oceny ich aktywności proliferacyjnej i rozkładu populacji w poszczególnych fazach cyklu komórkowego. W tym celu, zawiesinę komórek MSCs (w liczbie 1x106) wirowano z prędkością 350xg, przez 5 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf), a następnie pelet zawieszano w 500 µl soli PBS bez Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences). W kolejnym etapie dodawano 1 ml zmrożonego (-20oC) 70% etanolu (POCH) mieszając próbkę. Komórki utrwalano przez 60 min., na lodzie, a następnie dodawano 4 ml roztworu soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences) i całość wirowano z prędkością 400xg, przez 10 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Pelet komórkowy płukano następnie trzykrotnie dodając po 4 ml soli PBS bez Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences) i odwirowując całość z prędkością 400xg, przez 10 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Otrzymany pelet komórkowy zawieszono następnie w 200 µl roztworu soli PBS (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), a następnie dodawano roztwór RNazy (st. końcowe: 100 µg/ml, Ambion) i całość inkubowano przez 5 min., w temp. pokojowej, celem strawienia obecnego w próbce RNA. Do próbki dodawano następnie 1 ml PI (st. końcowe: 50 µg/ml, Sigma-Aldrich) i całość inkubowano przez 30 min. w temp. w 37oC. Po skończonej inkubacji, komórki płukano dodając do próbki 4 ml roztworu soli PBS (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), a następnie całość wirowano z prędkością 400xg, przez 10 min, w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Komórki zawieszano w 500 µl soli PBS bez Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences) i filtrowano do nowej probówki celem usunięcia agregatów komórkowych (filtr Ø 40 µm, BD Falcon). Próbki analizowano na cytometrze przepływowym BD LSR Fortessa (Becton Dickinson) przy przepływie nie przekraczającym 400 obiektów/s. 3.2.4. Badanie potencjału różnicowania komórek MSCs in vitro W celu potwierdzenia charakteru multipotencjalnego komórek MSCs, komórki te poddawano hodowlom różnicującym w kierunku linii komórek mezodermalnych, przy użyciu komercyjnie dostępnych pożywek różnicujących, zgodnie z zaleceniami producenta, a następnie identyfikowano zróżnicowane komórki określonego fenotypu z zastosowaniem metod histochemicznych. Hodowle różnicujące komórek MSCs Komórki MSCs zebrane na pasażu 4-6, wysiewano na płytkę 6-dołkową (Eppendorf) w następujący sposób: W przypadku różnicowania w kierunku adipopocytów: 104 komórek/ cm2 w pożywce DMEM/F12 + 10% FBS (Sigma-Aldrich) na 1 dołek, W przypadku różnicowania osteogennego: 5x103 komórek/ cm2 w pożywce DMEM/F12 + 10% FBS (Sigma-Aldrich) na 1 dołek; W przypadku różnicowania chondrogennego: komórki zawieszano w pożywce DMEM/F12 + 10% FBS (Sigma-Aldrich) tak, aby 8x104 komórek znajdowało się w objętości 5 µl zawiesiny. Następnie na każdy dołek nakrapiano 3-4 pojedyncze krople o objętości 5 µl każda, które następnie inkubowano przez 1h (celem utworzenia agregatów komórkowych) przed dodaniem 2 ml pożywki hodowlanej DMEM/F12 + 10% FBS (Sigma-Aldrich) do całości dołka; Wysiane komórki MSCs hodowano następnie przez 24h w standardowych warunkach hodowlanych (w temp. 37oC w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2 w inkubatorze CO2 przeznaczonym do hodowli komórek eukariotycznych; Memmert, Indiamart), a następnie usuwano standardową pożywkę hodowlaną. Komórki następnie przepłukiwano jednokrotnie 1 ml soli PBS z jonami Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences) i umieszczano w 2 ml specjalistycznych pożywek różnicujących: W przypadku różnicowania w kierunku adipopocytów: Pożywka StemXVivo Human/Mouse Osteogenic/Adipogenic Base Medium (R&D Systems) suplementowa StemXVivo Adipogenic Supplement (R&D Systems) – pożywka stymulująca powstanie kropli tłuszczu w komórkach świadczących o przebiegu procesu różnicowania. W przypadku różnicowania osteogennego: Pożywka StemXVivo Human/Mouse Osteogenic/Adipogenic Base Media (R&D Systems) suplentowana StemXVivo Mouse Osteogenic Supplement (R&D Systems) – pożywka stymulująca mineralizację pojawiającą się podczas różnicowania osteogennego komórek. W przypadku różnicowania chondrogennego: Pożywka StemXVivo Human/Mouse Chondrogenic Base Media (R&D Systems) suplementowane StemXVivo Human/Mouse Chondrogenic Supplement (R&D Systems) – pożywka stymulująca wytwarzanie glikozaminoglikanów świadczących o różnicowaniu chondrogennym. Hodowle różnicujące w w/w pożywkach stymulujących różnicowanie w poszczególne linie mezodermalne, prowadzono przez 11 dni w przypadku różnicowania w kierunku adipocytów oraz 15 dni w przypadku różnicowania w kierunku chondrocytów i osteoblastów, w inkubatorze CO2 (Memmert, Indiamart), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2. Barwienie histochemiczne zróżnicowanych komórek MSCs Po zakończonym różnicowaniu usuwano pożywkę różnicującą i komórki przepłukiwano 1 ml roztworu soli PBS z jonami Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), a następnie utrwalano 4% roztworem paraformaldehydu (przygotowanym w roztworze PBS bez jonów Ca2+, Mg2+, HyClone, GE Healthcare Life Sciences) (POCh) przez 15 min. w temp. pokojowej. Następnie komórki wybarwiano odpowiednio: W przypadku różnicowania w kierunku adipopocytów: ze względu na krople tłuszczu widoczne w polu mikroskopowym, nie wykonywano barwienia histochemicznego komórek różnicowanych w tym kierunku. W przypadku różnicowania osteogennego: barwiono czerwienią alizarynową (EMD Millipore) o stężeniu 2% przez 3 min., w temp. pokojowej. Po zakończonym barwieniu, komórki przepłukiwano wodą destylowaną. Wykonane barwienie umożliwiło detekcję mineralizacji świadczącej o różnicowaniu osteogennym. W przypadku różnicowania chondrogennego: barwiono błękitem alcjańskim (EMD Millipore) o stężeniu 1% przez 30 min., w temp. pokojowej. Po zakończonym barwieniu, komórki przepłukano roztworem 0.1N HCl (POCH), a następnie wodą destylowaną. Zastosowane barwienie umożliwiło wybarwienie powstałej chrząstki na kolor niebieski. Po zakończonych barwieniach wykonywano zdjęcia komórek przy użyciu mikroskopu Olympus IX81 (Olympus) wyposażonego w kolorową kamerę MicroPublisher 3.3 RTV, celem udokumentowania potencjału multipotencjalnego komórek MSCs. 3.2.5. Izolacja EVs z komórek MSCs 3.2.5.1. Kolekcjonowanie pożywek kondycjonowych z hodowli komórek MSCs Komórki MSCs będące na pasażu 4-6 hodowli, przepłukiwano dwukrotnie roztworem soli PBS bez Ca2+, Mg2+ w momencie osiągnięcia przez nie 80% - 90% konfluencji, a następnie inkubowano w pożywce DMEM/F12 zawierającej 0,5% surowiczą albuminę wołową (ang. bovine serum albumin, BSA; Miltenyi Biotec) przez 24h w celu zebrania pożywek kondycjonowanych niezawierających surowicy mogącej być również źródłem egzogennych EVs. Pożywkę kondycjonowaną zbierano do 50 ml probówek typu Falcon (BD Falcon), a następnie - w celu usunięcia martwych komórek oraz większych szczątków komórkowych, zebrane pożywki wirowano z prędkością 350xg, przez 10 minut w temp. 4oC, wykorzystując wirówkę Eppendorf 5810R (Eppendorf). Następnie nadsącze przenoszono do nowych próbówek kolekcyjnych w/w formatu i umieszczano w temp. -80oC. Pożywki kondycjonowane przechowywano w temp. -80oC do momentu izolacji EVs. 3.2.5.2. Izolacja EVs z pożywek kondycjonowanych metodą sekwencyjnego wirowania Pożywki kondycjonowane rozmrażano w temp. 37oC i odwirowywano z prędkością 500xg, przez 20 min., w temp. 4oC w celu usunięcia pozostałych martwych komórek i większych szczątków komórkowych. Po przeniesieniu nadsączy do nowych probówek kolekcyjnych (50 ml; BD Falcon), próbki następnie wirowano z prędkością 2000xg, przez 20 min., w temp. 4oC, w celu usunięcia mniejszych szczątków komórkowych oraz ciałek apoptotycznych. Uzyskane supernatanty przenoszono następnie do polipropylenowych probówek dedykowanych do ultrawirowania (28 ml; PP Oak Ridge Tube, ThermoFisher Scientific) i poddawano ultrawirowaniu z prędkością 100 000xg, przez 75 min., w temp. 4oC przy użyciu ultrawirówki Optima XPN (Beckman Coulter) oraz rotora stałokątowego typu T-865 (Thermo Fisher Scientific). Uzyskane pelety zawierające MSC-EVs następnie rozpipetowywano w 1 ml ultraczystego roztworu soli PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza), przenoszono do nowej probówki zbiorczej dedykowanej do ultrawirowania (28 ml; PP Oak Ridge Tube, ThermoFisher Scientific) po czym ponownie ultrawirowano z prędkością 100 000xg, przez 75 min., w temp. 4oC. Schemat kolejnych kroków sekwencji wirowań zastosowanych do izolacji EVs przedstawiono na Rycinie 7. Pelet MSC-EVs - uzyskany w każdej probówce na etapie drugiego ultrawirowania, zawieszano następnie w 300 µl ultraczystego roztworu PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza), porcjowano na mniejsze obętości i umieszczano w probówkach o objętości 1,5 ml typu LoBind Protein Tubes (Eppendorf). Tak uzyskane, wysokoskoncentrowane preparaty MSC-EVs przechowywano w temp. -80oC i rozmrażano maksymalnie dwukrotnie w celu prowadzenia dalszych analiz. Stężenie EVs w preparatach oznaczano bezpośrednio przed użyciem w eksperymentach - metodą pośrednią z zastosowaniem metody Bradforda opartej o pomiar ilości białka obecnego w próbce (procedura opisana poniżej). W Tabeli 7 przedstawiono przykładowe wyniki przedstawiające efektywność izolacji MSC-EVs - w oparciu o ilość białka wyizolowanego z pożywki kondycjonowanej zabezpieczonej znad komórek MSCs, w przeliczeniu na liczbę komórek zebranych z powierzchni 75cm2 w chwili zebrania pożywki kondycjonowanej. Pożywka kondycjonowana Usunięcie komórek 350xg, 10 min, 4oC Nadsącz Usunięcie martwych komórek oraz większych 500xg, 20 min, 4oC szczątków komórkowych Nadsącz Usunięcie mniejszych szczątków komórkowych 2 000xg, 20 min, 4oC oraz ciałek apoptotycznych Nadsącz 100 000xg, 75 min, 4oC EVs (ektosomy + egzosomy) + kompleksy białko/ RNA Podczyszczanie 100 000xg, 75 min, 4oC preparatów EVs EVs (ektosomy + egzosomy) + kompleksy białko/ RNA Rycina 7. Schemat przedstawiający kolejne etapy oczyszczania MSC-EVs z pożywek kondycjonowanych zebranych z hodowli komórek MSCs. Tabela 7. Efektywność izolacji MSC-EVs z pożywek kondycjonowanych zebranych z hodowli komórek MSCs. Wartości przedstawiają: Średnie ± SD. N=3. Liczba komórek zebranych z powierzchni hodowlanej 75 cm2 Objętość pożywki kondycjonowanej zebranej z powierzchni hodowlanej 75 cm2 Ilość białka w preparacie MSC-EVs uzyskana z objętości pożywki kondycjonowanej zebranej z 75 cm2 (2,50 ± 0,76) x 106 12,33 ± 0,25 ml 11,53 ± 1,22 ug 3.2.6. Pomiar stężenia białka metodą Bradforda Stężenie białka w próbkach MSC-EVs, lizatach komórkowych oraz tkankowych (stosowanych w różnych etapach pracy) oznaczano kolorymetryczną metodą Bradforda (200). Przygotowanie lizatów komórek do pomiaru stężenia białka zostało opisane w podrozdziale 3.2.9., natomiast przygotowanie lizatów tkanek w podrozdziale 3.3.2.4.2. W przypadku izolatów MSC-EVs - stężenie białka oznaczano bez wykonania uprzedniego etapu lizy. W celu wykonania krzywej standardowej, przygotowano roztwory standardu białkowego (BSA; Sigma-Aldrich) o następujących stężeniach: 0,0; 0,031; 0,062; 0,125; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 mg/ml, a następnie do każdej próbki standardu dodawano błękit Coomassie (odczynnik Bradforda, Sigma-Aldrich). Równolegle przygotowano roztwory badanych próbek (izolatów MSC-EVs lub lizatów komórkowych lub tkankowych) poprzez dodanie do rozcieńczonej próbki 1 ml odczynnika Bradforda. Wszystkie próbki inkubowano przez 10 min., w temp. pokojowej, bez dostępu światła, a następnie nakładano po 200 µl/dołek do płytki 96-dołkowej (Corning), w triplikacie. Pomiar absorbancji wykonano przy długości fali λ=595 nm za pomocą spektrofotometru MultiskanTM FC (Thermo Scientific) w przypadku analizy próbek MSC-EVs oraz lizatów komórek MSCs lub spektrofotometru Mithras LB 940 Multimode Microplate Reader (Berthold Technologies Bioanalytic) w przypadku analizy lizatów tkanek. Stężenie białka związanego z MSC-EVs oraz w lizatach komórek i tkanek oznaczono w odniesieniu do krzywych wzorcowych standardu BSA. 3.2.7. Ocena integralności ultrastruktury MSC-EVs W celu zbadania morfologii i integralności ultrastruktury MSC-EVs, wykonywano analizy obrazowe EVs zgodnie z zaleceniami ISEV (167), wykorzystując mikroskopię sił atomowych (ang. atomic force microscopy, AFM). W tym celu, kroplę zawiesiny MSC-EVs (zawierającą 5-10 ug MSC-EVs w przeliczeniu na białko) umieszczano na atomowo równej powierzchni miki i inkubowano przez 20 min., w temp. pokojowej. Następnie powierzchnię płukano delikatnie roztworem ultraczystej soli PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza). Pomiar wykonano od razu w kropli roztworu PBS. Topografię powierzchni obrazowano techniką PeakForce Tapping, umożliwiającą bezpośrednie monitorowanie siły oddziaływania pomiędzy sondą i powierzchnią próbki. Technika PeakForce Tapping znacząco zmniejsza tę siłę, a tym samym powierzchnię oddziaływania pomiędzy sondą a próbką, co poprawia rozdzielczość skanowania w płaszczyźnie XY oraz umożliwia skuteczne i bezpieczne skanowanie próbek delikatnych, takich jak EVs (201). Analizy przeprowadzono we współpracy z dr Michałem Sarną z Zakładu Biofizyki, Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, zgodnie z protokołami opracowanymi we współpracy z tym laboratorium w celu analiz morfologicznych EVs (114,145). 3.2.8. Analiza wielkości MSC-EVs Rozkład wielkości cząstek w izolatach MSC-EVs mierzono wykorzystując unikalną technikę TPRS (ang. Tunable Resistive Pulse Sensing), która umożliwia wysokoprzepustowe pomiary pojedynczych cząstek przy użyciu systemu IZON qNano (Izon Science Ltd.) wykorzystującego nanopory. W celu kalibracji urządzenia, wykorzystywano kulki kalibracyne CPC200 Beads (Izon Science) zgodnie z instrukcją producenta. Próbki MSC-EVs rozcieńczano 20X w ultraczystym roztworze soli PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza), a następnie w celu usunięcia dużych agregatów filtrowano przez filtry strzykawkowe Acrodisc Minispike Ø 0.45 µm (Sigma-Aldrich). Dodatkowo, w celu wykluczenia zanieczyszczenia nanocząstkami pochodzącymi z nośnika- soli PBS, każdorazowo sprawdzano zawartość cząstek w tym roztworze. Próbki MSC-EVs analizowano używając nanopora NP200 (analizowany zakres wielkości cząstek: 100-400 nm) stosując w czasie pomiaru ciśnienie 10 oraz 20 mbar. Dla każdej wartości stosowanego ciśnienia, próbki analizowano przez 5 minut lub do momentu zebrania 1000 obiektów. Otrzymane wyniki analizowano przy użyciu oprogramowania Izon Control Suite Software v2.2 (Izon Science). 3.2.9. Analiza wybranych markerów białkowych w preparatach MSC-EVs W celu oceny występowania markerów charakteryzujących EVs w preparatach MSC-EVs stosowano metodę Western blot - zoptymalizowaną pod kątem analizy EVs. W tym celu, do próbek MSC-EVs (oraz dla kontroli również komórek MSCs) o obj. 77,5 µl zawierających 60 µg białka zlizowanych uprzednio przy użyciu zimnego buforu lizującego (1x Cell Lysis Buffer, Cell Signalling) zawierającego mieszaninę inhibitorów proteaz (Halt Protease Inhibitor Coctail, 100X, Thermo Scientific) w stosunku ilościowym 1 µl inhibitorów proteaz/ 100 µl buforu lizującego, dodawano 22,5 µl buforu Laemmli (Bio-Rad). Próbki denaturowano w temp. 70°C przez 10 min. Tak przygotowane próbki nakładano następnie do studzienek żelu poliakrylamidowego 4-15% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free (Bio-Rad) w objętości 22,2 µl/ dołek (co odpowiada 20 µg białka/ dołek), a następnie prowadzono rozdział elektroforetyczny białek w warunkach redukujących (SDS-PAGE), w buforze TSG (Bio-Rad), przez 35 min. przy stałym napięciu 200 V. Rozdzielone na żelu białka przenoszono następnie na membranę nitrocelulozową poprzez transfer przy użyciu aparatu Transblot Turbo (Bio-Rad), przy następujących warunkach transferu: 1,3 A, 25 V, 7 min. Następnie, po przepłukaniu membrany buforem TBS-T [ang. Tris-Buffered Saline with Tween; skład: 1,72 g NaCl (Sigma-Aldrich); 0,1 g Tween 20 (Sigma-Aldrich); 1,576 Trizma hydrochloride (Sigma-Aldrich) na 190 ml H2O], prowadzono godzinną inkubację w 1% roztworze BSA (Sigma-Aldrich) rozpuszczonego w buforze TBS-T (pH 7,6) - celem zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania dla przeciwciał stosowanych w dalszych etapach. Membrany inkubowano następnie z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w buforze TBS-T przez 30 min., w temp. pokojowej (stosowane przeciwciała umieszczono w Tabeli 8), a następnie kontynuowano inkubację w 4oC przez noc. Membrany płukano następnie trzykrotnie roztworem TBS-T, po czym inkubowano przez 1h z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonym z peroksydazą chrzanową (ang. horseradish peroxidase, HRP), rozcieńczonymi odpowiednio w buforze TBS-T. Membrany płukano trzykrotnie TBS-T i inkubowano z chemiluminescencyjnym substratem dla HRP- Luminata Crescendo Western HRP Substrate (EMD Millipore), a następnie wizualizowano przy użyciu systemu Gel Doc (Bio-Rad). Tabela 8. Lista przeciwciał użytych do analizy Western blot. Przeciwciało przeciwko antygenowi: Rozcieńczenie Pochodzenie Producent Masa molekularna białka [kDa] Przeciwciało I-rzędowe β-aktyna 1:2000 mysie ThermoFisher Scientific 42 CD9 1:1000 królicze AntibodyGenie 24 Kalneksyna 1:500 kozie ThermoFisher Scientific 100 Syntenina 1:1000 królicze ThermoFisher Scientific 30 Przeciwciało II-rzędowe Przeciwciała mysie (HRP Anty- mysie) 1:4000 kozie ThermoFisher Scientific - Przeciwciała królicze (HRP Anty-królicze) 1:4000 kozie Dako - Przeciwciała kozie (HRP Anty-kozie) 1:4000 królicze ThermoFisher Scientific - 3.2.10. Globalna analiza proteomiczna MSC-EVs Celem poszerzonej oceny składu białkowego MSC-EVs oraz celem porównania zawartości białek pomiędzy EVs oraz komórkami MSCs, wykonano globalną analizę proteomiczną z zastosowaniem spektrometrii masowej. Liza próbek biologicznych do analizy porównawczej proteomu Komórki MSCs płukano dwukrotnie roztworem PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), a następnie spasażowano zgodnie z procedurą opisaną w pkt. 3.1.3.1. Po odwirowaniu komórek po pasażu, komórki te przepłukiwano roztworem soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences) i odwirowywano z prędkością 350xg, przez 6 minut w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Płukanie komórek MSCs wykonywano dwukrotnie. Pelety komórek MSCs, jak również MSC-EVs wyizolowane z pożywek kondycjonowanych znad mysich komórek MSCs rozpuszczano w buforze lizującym zawierającym 4% SDS (Fluka Chemie), 0,1 M Tris (Roche), 0,1 M ditiotreitol (ang. dithiothreitol, DTT; Sigma-Aldrich) o pH 7,6. Materiał biologiczny w buforze lizującym dwukrotnie zhomogenizowano stosując sonikację w trybie impulsowym - 2 razy po 5 min. przy ustawieniu mocy 320 W (intensywność „High”, interwał czasowy 30 s /30 s ON/OFF przy użyciu sonikatora Bioruptor UCD-200, Diagenode). Następnie próbki inkubowano w 95°C przez 5 min. i wirowano z prędkością 16000xg, 15 min., 20°C. Nadsącze przeniesiono do nowych probówek, a następnie przechowywano w temp. -80oC do dalszej analizy. Trawienie próbek do analizy LC-MS/MS Próbki biologiczne przygotowywano do analizy proteomicznej metodą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (ang. liquid chromatographytandem mass spectrometry, LC-MS/MS), stosując procedurę trawienia białek wspomaganą filtracją - metoda FASP (ang. Filter-aided sample preparation) (202). W tym celu, do mieszaniny zawierającej 100 ug białka dodawano 300 µl 8 M roztworu mocznika (POCH) w 50 mM wodorowęglanie amonu (ang. ammonium bicarbonate, ABC; POCH), a następnie dodawano DTT (st. końcowe: 50 mM; Sigma-Aldrich), po czym wytrząsano przez 15 min. Próbki odwirowano z prędkością 21 000xg, 15 min., 20°C, a następnie nałożono na kolumienki VIVACON 500 (Sartorius Stedim Biotech GmbH) z wartością odcięcia równą 30 kDa w celu zagęszczenia próbek. Kolejne etapy – alkilację, płukanie roztworem mocznika oraz płukanie roztworem ABC – wykonano zgodnie z instrukcją dołączoną do FASP™ Protein Digestion Kit (Expendeon) z modyfikacją polegającą na przygotowaniu roztworu 8 M mocznika (POCH) w 50 mM roztworze ABC (POCH). Po cyklu płukań, na każdą kolumienkę nakładano 1 ug protezy LysC rozpuszczonej w 75 µl 50 mM roztworu ABC (POCH). Trawienie prowadzono w 37°C przez noc. Po zakończonym trawieniu, próbki odwirowano z prędkością 14000xg, 15 min, 20°C, a następnie nadsącze zawierające peptydy przeniesiono do nowych probówek kolekcyjnych. Peptydy przepłukiwano dwukrotnie 40 µl 50 mM roztworu ABC (parametry wirowania: 14000xg, 15 min, 20°C). Następnie na każdą kolumienkę dodano po 1 µg trypsyny zawieszonej w 75 µl 50 mM roztworu ABC (POCH). Trawienie prowadzono w 37°C przez noc. Próbki odwirowano z prędkością 14000xg, 15 min, 20°C, a następnie nadsącze zawierające peptydy płukano dwukrotnie 40 ul 50 mM roztworu ABC (POCH) i odwirowano z prędkością 14000xg, 15 min, 20°C. Dla każdej badanej próbki przygotowano dwa roztwory peptydów: i) peptydy po trawieniu protezą LysC; ii) peptydy po trawieniu trypsyną. Frakcjonowanie próbek Otrzymane mieszaniny peptydów frakcjonowano na złożu z anionitem zgodnie z protokołem przedstawionym przez Wiśniewski i wsp., 2013 (203). W skrócie, peptydy po trawieniu LysC były rozdzielane na cztery frakcje z użyciem buforu uniwersalnego Britton & Robinson (ang. Britton and Robinson universal buffer, BRUB) o pH równym odpowiednio 11, 6, 4 i 2. Natomiast peptydy po trawieniu trypsyną rozdzielane były na dwie frakcje z użyciem buforu BRUB o pH 5 i 2. Otrzymane frakcje oczyszczono na złożu C18 w układzie „Stage-Tips” (204) według następującego protokołu: aktywacja złoża metanolem (POCH); płukanie 60% acetonitrylem (ang. acetonitrile, ACN; POCH) z 1% kwasem octowym (POCH); równoważenie złoża 1% kwasem octowym; nałożenie próbki; płukanie 1% kwasem octowym; elucja 60% ACN z 1% kwasem octowym. Próbki po elucji suszono w wyparce próżniowej trifluorooctowym (ang. trifluoroacetic i rozpuszczono acid, TFA; POCH) w 2% ACN/0,05% w celu dalszej analizy. kwasie Analiza LC-MS/MS Próbki komórek MSCs oraz MSC-EVs analizowano przy użyciu wysokorozdzielczego spektrometru masowego Q Exactive (ThermoFisher Scientific) sprzężonego z nanoHPLC (UltiMate 3000 RSLCnano System, ThermoFisher Scientific). Peptydy ładowano na prekolumnę ze złożem C18 o długości 2 cm (wielkość ziaren 3 μm, rozmiar porów 100 Å, ID 75 μm, AcclaimPepMap100 C18, Thermo Scientific) w 2% ACN z 0,05% TFA (POCH), a następnie rozdzielano na kolumnie ze złożem C18 o długości 50 cm (wielkość ziaren 2 μm, rozmiar porów 100 Å, AcclaimPepMapRSLC C18, ThermoFisher Scientific; ID 75 μm) w ciągu 4h w gradiencie ACN od 2% do 40% z dodatkiem 0,05% kwasu mrówkowego (POCH). Do pomiaru MS użyto metody Top 12 z rozdzielczością 70 000 dla skanu MS i 17 500 dla pomiaru MS/MS. Analiza danych MS Uzyskane dane analizowano przy użyciu programu Proteome Discoverer 1.4. Serwer Mascot (v2.5.1, Matrix Science), który wykorzystywano do przeszukania bazy danych SwissProt_2015_09 zawężonej do taksonomii Mus musculus. Parametry przeszukania były następujące: enzym – trypsyna; liczba opuszczonych miejsc cięcia – 2; modyfikacje stałe – karbamidometylacja; modyfikacje zmienne – oksydacja (M); tolerancja masy dla prekursora – 10 ppm; tolerancja masy dla fragmentów – 20 mmu. Dane zebrane dla sześciu frakcji danej próbki były analizowane w jednym przeszukaniu. Walidację wyników przeszukania wykonywano w programie Proteome Discoverer z użyciem algorytmu Percolator (205). Współczynnik FDR (ang. False discovery rate) dla uzyskanych wyników wynosił poniżej 1%. Analiza danych proteomicznych z komórek MSCs oraz MSC-EVs Analizę porównawczą proteomów komórek MSCs oraz MSC-EVs wykonano przy użyciu terminów Ontologii Genów (ang. Gene Ontology, GO), wykorzystując oprogramowanie FatiGO (http://babelomics.bioinfo.cipf.es/). Analizę przeprowadzono przy poziomie GO równym 3-9, a za wartość graniczną poziomu istotności przyjęto P = 0,05. Dodatkowo, w celu określenia występowania w próbkach EVs białek charakterystycznych dla egzosomów, listę białek zidentyfikowanych w MSC-EVs analizowano pod kątem wytępowania 100 białek często identyfikowanych w egzosomach zgodnie z danymi opublikowanymi na stronie ExoCarta (http://www.exocarta.org/). Listę białek zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs analizowano także pod kątem ich przynależności do określonych ścieżek sygnałowych na podstawie adnotacji GO: Panther Pathways (http://www.geneontology.org/) przyjmując FDR poniżej 1%. W dalszym etapie dla białek zidentyfikowanych w próbkach MSC-EVs zaangażowanych w wybrane procesy biologiczne przeprowadzono analizę oddziaływań pomiędzy nimi przy użyciu komercyjnie dostępnej aplikacji STRING Ver. 10.5 (https://string-db.org/). Globalną analizę proteomiczną MSC-EVs oraz komórek MSCs wykonano we współpracy z Panią dr hab. Sylwią Kędracką-Krok z Zakładu Biochemii Fizycznej Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie oraz Pracowni Proteomiki i Spektrometrii Mas Ośrodka Biologii Strukturalnej Małopolskiego Centrum Biotechnologii w Krakowie. 3.2.11. Analiza składu mikroRNA w MSC-EVs W celu określenia bioaktywnej zawartości przenoszonej przez MSC-EVs w postaci cząsteczek miRNA, a także porównania jej z miRNA występującymi w komórkach MSCs, wykonano poszerzoną analizę transkryptomiczną MSC-EVs oraz komórek MSCs z zastosowaniem ilościowej reakcji RT-PCR w czasie rzeczywistym. Izolacja RNA Całkowite RNA wzbogacone w miRNA izolowano z badanych próbek przy użyciu zestawu miRCURY™ RNA Isolation kit (Exiqon) zgodnie z instrukcją dołączoną przez producenta z niewielkimi modyfikacjami. W skrócie, do zawiesiny MSC-EVs lub peletu komórek MSCs dodawano 350 µl roztworu lizującego (Lysis Solution, Exiqon) zawierającego β-merkaptoetanol (st. końcowe: 1%, Bond-Breaker TCEP Solution; Thermo Scientific), a następnie mieszano próbki przez 15 sekund przy użyciu vortexu. Do roztworów dodawano po 200 µl 99,8% etanolu (POCH) i mieszano przez 10 sekund przy użyciu vortexu. Całość mieszanin przenoszono na osobne kolumny Mini Spin Column (Exiqon) umieszczone w probówkach kolekcyjnych (Exiqon), po czym wirowano próbki z predkością 3500xg, przez 1 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5418 R (Eppendorf) w celu związania RNA do powierzchni membran. Następnie, usunięto przesącze, po czym każdą kolumnę płukano przy użyciu 400 µl roztworu Wash Solution (Exiqon), a następnie wirowano z predkością 14 000xg, przez 2 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5418 R (Eppendorf). Usunięto przesącz, po czym na kolumny nakładano po 100 µl roztworu Turbo DNase [przygotowanego wcześniej poprzez zmieszanie 90 µl wody wolnej od RNaz (Eurx), 10 µl 10x Turbo DNase Buffer (Ambion) oraz 0,5 µl Turbo DNase 2U/µl (Ambion)/ 1 próbkę], po czym wirowano kolumny z prędkością 200xg, przez 2 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5418 R (Eppendorf). Kolumny inkubowano przez 10 min., w temp. pokojowej. Następnie dwukrotnie płukano każdą kolumnę przy użyciu 400 µl roztworu Wash Solution (Exiqon), po czym wirowano z predkością 14 000xg, przez 2 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5418 R (Eppendorf) i usuwano przesącze. W celu całkowitego podsuszenia kolumn, umieszczano je w nowych probówkach kolekcyjnych (Exiqon), po czym wirowano z prędkością 14 000xg, przez 2 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5418 R (Eppendorf). Kolumny przeniesiono do indywidulanych probówek kolekcyjnych o objętości 1,5 ml typu Eppendorf (Exiqon), po czym delikatnie nałożono na każdą membranę kolumny po 30 µl buforu do elucji (Elution Buffer, Exiqon) i inkubowano przez 1 min. Kolumny wirowano z prędkością 200xg, przez 2 min., w temp. pokojowej, a następnie ponownie wirowano -z prędkością 14 000xg, przez 1 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5418 R (Eppendorf). RNA przechowywano na lodzie do czasu pomiaru jego stężenia. Czystość i stężenie wyizolowanego RNA oznaczano przy użyciu spektrofotometru Nano Photometer (Implen). Do dalszych analiz wykorzystywano wyłącznie RNA, dla którego stężenie wynosiło >5 ng/µl, natomiast stosunek absorbancji A260/280, świadczący o czystości wyizolowanego RNA, mieścił się w zakresie 1.75 - 2.00 (dla czystego RNA wartość wynosi ~2.0) (206). Odwrotna transkrypcja Wyizolowane RNA przepisywano na cDNA stosując zestaw miRCURY LNA™ Universal RT microRNA Kit (Exiqon) zgodnie z instrukcją dołączoną przez producenta zestawu. Przygotowywano mieszaninę reakcyjną, której skład przedstawiono w Tabeli 9. Mieszaninę umieszczoną w probówkach do odwrotnej transkrypcji o obj. 0,2 ml (ThermoFisher Scientific) umieszczano w termocyklerze C1000 Touch (Bio-Rad), a następnie prowadzono reakcję zgodnie z schematem zawartym w Tabeli 10. Po skończonej reakcji uzyskane cDNA przechowywano w temp. -25oC. Tabela 9. Skład mieszaniny do odwrotnej transkrypcji. Objętości podane zostały w przeliczeniu na 1 badaną próbkę. Skład mieszaniny do odwrotnej transkrypcji Odczynnik Objętość Bufor reakcyjny, 5x stężony 8,0 µl Woda wolna od RNAz 18,0 µl Mieszanina enzymów 4,0 µl Synthetic RNA spike’ins 2,0 µl RNA (o stężeniu 5 ng/ µl) 8,0 µl Całkowita objętość 40,0 µl Tabela 10. Warunki termiczne przebiegu reakcji RT-PCR w celu analizy występowania wybranych miRNA w badanych próbkach. Warunki przebiegu reakcji odwrotnej transkrypcji Temperatura Czas Odwrotna transkrypcja 42oC 60 min. Inaktywacja enzymu 95oC 5 min. Chłodzenie 4oC � Reakcja PCR w czasie rzeczywistym Uzyskane cDNA wykorzystano jako matryce w reakcji PCR w czasie rzeczywistym w celu detekcji miRNA występujących w MSC-EVs oraz komórkach MSCs. Przygotowano mieszaninę do reakcji PCR w czasie rzeczywistym zawierającą: 4000 µl Power SYBR Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific), 4000 µl wody wolnej od RNAz (Eurx) oraz 40 µl cDNA. Całość wymieszano, a następnie przy użyciu pipety Multipette E3 (Eppendorf) precyzyjnie dozowano po 10 µl mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Do badania występowania miRNA w MSC-EVs wykorzystano gotowe, komercyjnie dostępne płytki 384 - dołkowe zawierające mysie primery dla badanych miRNA - Mouse & Rat Panel I+II, V3.M (Exiqon). Płytki zamknięto przy użyciu dedykowanej folii typu MicroAmp Optical Adhesive Film (ThermoFisher Scientific), a następnie odwirowano z prędkością 2000xg, przez 2 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Reakcja PCR w czasie rzeczywistym prowadzona była w aparacie QS6 Real-Time PCR System (ThermoFisher Scientific). Program przebiegu reakcji przedstawiono w Tabeli 11. Uzyskane wyniki poddano analizie przy użyciu oprogramowania GenEx (Exiqon) przy użyciu kalibratorów RNA Spike-ins (Exiqon). Tabela 11. Profil termiczny przebiegu reakcji PCR w czasie rzeczywistym. PCR w czasie rzeczywistym Etap Temperatura Czas Liczba cykli Aktywacja polimerazy DNA 95oC 10 min. 1 cykl Denaturacja 95oC 10 sek. 40 cykli Hybrydyzacja/ elongacja 60oC 1 min. 3.2.12. Analiza obecności transkryptów mRNA w MSC-EVs W celu określenia występowania wybranych transkryptów mRNA w preparatach MSC-EVs w odniesieniu do komórek MSCs, wykonano izolację RNA z obu typów próbek, odwrotną transkrypcję, a następnie reakcję PCR w czasie rzeczywistym. Izolacja RNA oraz przepisanie RNA na cDNA Całkowite RNA izolowano zestawem RNeasy Mini Kit (Qiagen), zgodnie z instrukcją dołączoną przez producenta. Po pomiarze stężenia wyizolowanego RNA (opisanego w podrozdziale 3.2.11.), prowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji w celu uzyskania komplementarnego DNA (cDNA) stosując odczynniki wchodzące w skład zestawu TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific) zgodnie z zaleceniami producenta. Mieszaninę reakcyjną przygotowywano według informacji podanych w Tabeli 12, a następnie przeprowadzano reakcję odwrotnej transkrypcji stosując odpowiednie warunki termiczne wymienione w Tabeli 13 przy użyciu termocyklera C1000 Touch (Bio-Rad). Po skończonej reakcji, cDNA przechowywano w temp. -25oC. Tabela 12. Skład mieszaniny do odwrotnej transkrypcji. Objętości podane zostały w przeliczeniu na 1 analizowaną próbkę. Skład mieszaniny do RT-PCR Odczynnik Objętość Bufor reakcyjny, 10x stężony (10x RT Buffer) 4,0 µl Roztwór MgCl2 (MgCl2 Solution, 25 mM) 8,8 µl Mieszanina deoksynukleotydów (dNTP Mixture, 2.5mM each dNTP) 8,0 µl Losowe heksamery (Random Hexamers, 50 µM) 1,0 µl Oligomery tymidylanu (Oligo dT(16), 50 µM) 1,0 µl Inhibitor RNAz (20 U/µl) 0,8 µl Odwrotna transkryptaza 50 U/μL 1,0 µl RNA Max. 15,4 µl Woda wolna od RNAz 15,4 µl - objętość próbki RNA Całkowita objętość 40,0 µl Tabela 13. Warunki termiczne przebiegu reakcji RT-PCR w celu analizy występowania wybranych miRNA w badanych próbkach. Etap Temperatura Czas Inkubacja 25oC 10 min. Odwrotna transkrypcja 48oC 30 min. Inaktywacja enzymu 95oC 5 min. Chłodzenie 4oC � Reakcja PCR w czasie rzeczywistym W kolejnym kroku prowadzono reakcję PCR w czasie rzeczywistym wykorzystując komercyjnie dostępny odczynnik SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific). W Tabeli 14 zamieszczono skład mieszaniny reakcyjnej, natomiast w Tabeli 15 przedstawiono profil termiczny przebiegu reakcji. Specyficzne pary starterów dla poszczególnych genów wykorzystywane w reakcji PCR w czasie rzeczywistym, zostały zaprojektowane przez nasz zespół i zamówione w firmie Genomed (Polska) - sekwencje przedstawiono w Tabeli 16. Reakcję PCR w czasie rzeczywistym prowadzono w termocyklerze 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific). Każdorazowo generowano krzywe topnienia (ang. melting curves) w celu odróżnienia specyficznych od niespecyficznych produktów reakcji. W niniejszej pracy doktorskiej przedstawiono wyłącznie wyniki ekspresji genów, dla których uzyskano specyficzne produkty reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Tabela 14. Skład mieszaniny do PCR w czasie rzeczywistym. Objętości podane zostały w przeliczeniu na 1 analizowaną próbkę. Skład mieszaniny do PCR w czasie rzeczywistym Odczynnik Objętość Starter forward 1,5 µl Starter reverse 1,5 µl SYBR Green PCR Master Mix, 2x 12,5 µl RNA 2,0 µl Woda wolna od RNAz 7,5 µl Całkowita objętość 25,0 µl Tabela 15. Profil termiczny przebiegu reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Tabela 16. Sekwencje starterów użytych w reakcji PCR w czasie rzeczywistym. PCR w czasie rzeczywistym Etap Temperatura Czas Liczba cykli Aktywacja polimerazy DNA 95oC 10 min. 1 cykl PCR Denaturacja 95oC 15 sekund 40 cykli Hybrydyzacja/ elongacja 60oC 1 min. PCR w czasie rzeczywistym Gen Sekwencja 5’-3’ B2- mikroglobulina F CATACGCCTGCAGAGTTAAGCA R GATCACATGTCTCGATCCCAGTAG Mesp-1 F CAGTCGCAGTCGCTCGGT R GCGTACAGGAACGATGGGT Bcl-2 F CTTTGAGTTCGGTGGGGTCA R GTTCCACAAAGGCATCCCAG Bak-1 F CATCTTGGGTCAGGTGGGTC R TGGAACTCTGTGTCGTAGCG Bax-1 F GATCCAAGACCAGGGTGGC R CTTCCAGATGGTGAGCGAGG VE-kadheryna F TTCAAGCTGCCAGAAAACCA R GAGCCTTGTCAGGGTCTTTGG Gata-2 F TGCACAATGTTAACAGGCCAC R CCTCGAAACATTCAGCCCCT Gata-4 F TCCAGTGCTGTCTGCTCTAAGC R TGGCCTGCGATGTCTGAGT 3.2.13. Analiza profilu antygenów powierzchniowych MSC-EVs Celem oceny obecności wybranych antygenów na powierzchni MSC-EVs, w tym m.in. markerów charakterystycznych dla komórek MSCs, preparaty EVs poddawano analizie przy użyciu wysokorozdzielczego cytometru przepływowego Apogee A50-Micro (Apogee Flow Systems) - dedykowanego do analizy cytometrycznej nanocząstek, a następnie analizie w cytometrii obrazowej. Podczas wykonywania analizy, próbki dodatkowo barwiono wykorzystując barwnik fluorescencyjny SYTO RNA Select green fluorescent cell stain (ThermoFisher Scientific), wiążący się do RNA w celu analizy obecności wybranych antygenów na powierzchni integralnych nanocząstek. Bezpośrednio przed rozpoczęciem analizy cytofluorymetrycznej, do probówek o obj. 1,5 ml typu LoBind Protein Tubes (Eppendorf) dodawano po 350 µl ultraczystego roztworu PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza), a następnie po 0,35 µl barwnika fluorescencyjnego SYTO RNA Select green fluorescent cell stain (ThermoFisher Scientific). Następnie, do każdej z przygotowanych probówek dodawano po 5 µl jednego z pośród wymienionych przeciwciał: anty- CD29, CD44, CD81, CD90, Sca-1 lub odpowiednich kontroli izotypowych (Tabela 17). Probówki wirowano z prędkością 16000xg, przez 20 min., w temp. 4°C w celu osadzenia agregatów barwnika RNA oraz agregatów przeciwciał. Następnie, do nowych probówek o objętości 1,5 ml typu LoBind Protein Tubes (Eppendorf) dodawano po 250 µl odwirowanej mieszaniny ultraczystego roztworu PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza) zawierającego 0,71 µg danego przeciwciała oraz SYTO RNA Select green fluorescent cell stain (st. końcowe: 5 nM; ThermoFisher Scientific). Na końcu do każdej probówki dodawano po 2 µg EVs. Preparaty MSC-EVs barwiono przez 30 min., na lodzie, bez dostępu światła. Po skończonym barwieniu, próbki natychmiast analizowano na cytometrze Apogee A50Micro (Apogee Flow Systems). Przed rozpoczęciem właściwej analizy cytometrycznej, cytometr Apogee A50-Micro kalibrowano wykorzystując zestaw ApogeeMix (Apogee Flow Systems) zawierający mieszaninę silikonowych kulek o określonych średnicach wielkości wynoszących: 180 nm, 240 nm, 300 nm, 590 nm, 880 nm, 1300 nm oraz kulek polistyrenowych o następujących średnicach wielkości: 110 nm i 500 nm, umożliwiających także analizę dystrybucji wielkościowej subpopulacji analizowanych EVs. Tabela 17. Lista przeciwciał wykorzystanych do analiz cytometrycznych MSC-EVs. Przeciwciało przeciwko antygenowi Fluorochrom Klon Izotyp Producent Badane antygeny CD29 APC HMβ1-1 Armenian Hamster IgG Biolegend CD44 APC IM7 Rat IgG2b, κ Biolegend CD81 APC Eat2 Armenian Hamster IgG BD Bioscences CD90 APC 30-H12 Rat IgG2b, κ Biolegend CD309 (VEGFR2) APC Avas12 Rat IgG2a, κ Biolegend Sca-1 APC E13-161.7 Rat IgG2a, κ Biolegend Kontrole izotypowe - APC HTK888 Armenian Hamster IgG Biolegend - APC RTK2758 Rat IgG2a, Κ Biolegend - APC RTK4530 Rat IgG2b, Κ Biolegend W celu wykluczenia z analizy EVs wybarwionych niespecyficznie, podczas analizy od procentu nanocząstek pozytywnych pod kątem ekspresji określonego antygenu, odejmowano wartość procentową otrzymaną dla odpowiadającej kontroli izotypowej. W celu potwierdzenia wyników otrzymanych za pomocą wysokorozdzielczego cytometru Apogee A50-Micro, w analizie obrazowej - wybrane próbki wybarwione zgodnie z wyżej opisanym protokołem, analizowano następnie przy użyciu cytometru obrazowego ImageStream X Mark II (Merck). 3.2.14. Ocena internalizacji MSC-EVs przez komórki MCEC in vitro W celu oceny internalizacji - określanej także jako wychwyt EVs - przez komórki docelowe w warunkach in vitro, wykorzystany został model, w którym komórki śródbłonka naczyń serca (MCEC) inkubowano z MSC-EVs zgodnie z protokołem opublikowanym w Nature Communications przez Mantel i wsp. z niewielkimi modyfikacjami (207). W zaprojektowanym układzie eksperymentalnym, komórki umieszczano w warunkach imitujących mikrośrodowisko uszkodzonego mięśnia sercowego, tj. w hipoksji oraz w obecności cytokin prozapalnych - IL-1β (ang. interleukin1β) oraz TNF-α (ang. tumor necrosis factor-α). W tym celu, komórki MCEC wysiewano na szalki typu Willco (5 x 104 komórek/ szalkę) Ø 35 mm, ze szklanym dnem (WillCo Wells B.V.), opłaszczone wcześniej żelatyną (st. końcowe: 0,1%; Sigma-Aldrich). Po 24h od wysiania, szalki z komórkami podzielono na następujące grupy eksperymentalne: 1) kontrola - dalsza hodowla w pożywce DMEM + 5% FBS (Sigma-Aldrich); w warunkach normoksji (21% O2) w inkubatorze CO2 (Memmert, Indiamart), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2. 2) mikrośrodowisko stanu zapalnego i hipoksji - dalsza hodowla w pożywce DMEM + 1% FBS (Sigma-Aldrich) zawierająca cytokiny prozapalne: IL-1β (st. końcowe: 10 ng/ml; Peprotech) oraz TNF-α (st. końcowe: 10 ng/ml; ThermoFisher Scientific); w warunkach hipoksji (2% O2) w inkubatorze CO2/O2 (Panasonic, Sanyo Electric Co., Ltd.), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 2% O2 i 5% CO2. Po 24h od stymulacji, do komórek obu grup dodawano po 50 µg MSC-EVs wybarwionych fluorescencyjnie zgodnie z protokołem opisanym poniżej. Po 2, 4 oraz 24 godzinach od dodania MSC-EVs, komórki fotografowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica DMI6000B ver. AF7000, wyposażonego w oprogramowanie Leica Application Suite X (Leica Microsystems) w celu późniejszego pomiaru średniej intensywności fluorescencji komórek MCEC. Średnią intensywność fluorescencji komórek mierzono za pomocą programu ImageJ. Barwienie MSC-EVs w celu ich wykorzystania do oceny internalizacji 180 µl preparatu MSC-EVs zawierającego 100 µg białka umieszczano w probówce o objętości 1,5 ml typu LoBind Protein Tubes (Eppendorf). Następnie do probówki dodawano 1 µl lipofilnego barwnika Vybrant DiO Cell-Labeling Solution (stosunek ilościowy: 1:180, ThermoFisher Scientific), który znakuje błony komórkowe oraz dodatkowo barwnik SYTO RNA Select green fluorescent cell stain (st. końcowe: 9 µM; ThermoFisher Scientific) wiążący się do RNA wewnątrz pęcherzyków. MSC-EVs barwiono przez 20 min., w temp. pokojowej, bez dostępu światła. Po zakończonym barwieniu, MSC-EVs dodawano bezpośrednio do pożywek hodowlanych. 3.2.15. Ocena wpływu MSC-EVs na potencjał angiogenny komórek MCEC in vitro W celu oceny wpływu MSC-EVs na potencjał angiogenny komórek śródbłonka naczyń serca in vitro, wykonano test oceniający efektywność tworzenia kapilar na matriżelu (208) przez komórki MCEC inkubowane w obecności MSC-EVs. W tym celu, schłodzoną płytkę 24-dołkową pokrywano półpłynnym podłożem typu Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced (Corning) w ilości 100 µl/ dołek, a następnie umieszczono w inkubatorze CO2 (Memmert, Indiamart), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2 na 30 minut. Na pokryte matriżelem dołki wysiewano następnie komórki MCEC w liczbie 5 x 104 komórek/ dołek, w kompletnej pożywce EGM-2MV (Lonza) dedykowanej hodowli komórek śródbłonka mikrowaskularnego, a następnie podzielono dołki na następujące grupy doświadczalne: 1) mikrośrodowisko kontrolne -dalsza inkubacja w pożywce EGM-2MV (Lonza) 2) mikrośrodowisko stanu zapalnego - do pożywki EGM-2MV dodawano IL-1β (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech) oraz TNFα (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech) 3) mikrośrodowisko kontrolne + MSC-EVs - do pożywki EGM-2MV dodawano MSC-EVs (st. końcowe: 10 µg/ml) 4) mikrośrodowisko stanu zapalnego + MSC-EVs - do pożywki EGM-2MV dodawano IL-1β (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech) oraz TNFα (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech) oraz MSC-EVs (st. końcowe: 10 µg/ml). Płytki hodowlane umieszczano w komorze inkubacyjnej zapewniającej standardowe warunki hodowlane - tj. 5% CO2, 37oC (PeCon GmbH) połączonej z mikroskopem Leica DMI6000B (Leica Microsystems). Proces tworzenia kapilar przez komórki MCEC rejestrowano przy użyciu akwizycji obrazu w trybie time-lapse przez 8h z krokiem czasowym równym 1h. Średnią liczbę kapilar na pole mikroskopowe wyliczano na podstawie analizy przynajmniej 10 zdjęć mikroskopowych wykonanych dla danego punktu czasowego, w których liczono pełne struktury kapilarne utworzone przez komórki MCEC (zgodnie z podejściem przedstawionym na Rycinie 8). Z analizy wykluczano kapilary, których fragment znajdował się poza kadrem obrazu. Rycina 8. Metoda ilościowej oceny liczby kapilar utworzonych przez komórki w teście angiogennym na matriżelu in vitro. Przykładowa analiza zdjęcia mikroskopowego komórek MCEC wysianych na matriżelu, w wyniku której zidentyfikowano 14 zamkniętych kapilar zaznaczonych białymi kółkami. Z analizy wyluczono kapilary, których fragment znajdował się poza kadrem obrazu. Skala: 250 μm. Materiały własne. 3.2.16. Analiza ekspresji markerów aktywowanego śródbłonka naczyniowego na powierzchni komórek MCEC in vitro W celu analizy zmian ekspresji wybranych markerów charakterystycznych dla komórek aktywowanego śródbłonka naczyniowego w modelu in vitro, komórki MCEC wysiewano na szalki hodowlane (Ø 60 mm; BD Falcon) opłaszczone żelatyną (st. końcowe: 0,1%; Sigma-Aldrich) w liczbie 105 komórek/ szalkę w pożywce DMEM + 5% FBS (Sigma-Aldrich), a następnie umieszczano w inkubatorze CO2 (Memmert, Indiamart), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2. Po 24h, wszystkie przygotowane szalki podzielono na następujące grupy doświadczalne: 1) mikrośrodowisko kontrolne – dalsza hodowla w pożywce DMEM + 5% FBS (Sigma-Aldrich), hodowla w warunkach normoksji (21% O2) w inkubatorze CO2 (Memmert, Indiamart), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2 2) mikrośrodowisko stanu zapalnego i hipoksji – do pożywki DMEM + 1% FBS (Sigma-Aldrich) dodawano IL-1β (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech) oraz TNFα (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech), a następnie prowadzono hodowlę w inkubatorze CO2/O2 (Panasonic, Sanyo Electric Co., Ltd.), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 2% O2 i 5% CO2. Po 24h od stymulacji cytokinami prozapalnymi oraz hipoksją, do połowy płytek z warunków mikrośrodowiska stanu zapalnego i hipoksji, dodawano MSC-EVs (st. końcowe: 10 µg/ml) w związku z czym otrzymano następujące grupy doświadczalne: 1) mikrośrodowisko kontrolne – dalsza hodowla w pożywce DMEM + 5% FBS (Sigma-Aldrich), hodowla w warunkach normoksji (21% O2) w inkubatorze CO2 (Memmert, Indiamart), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 21% O2 i 5% CO2 2) mikrośrodowisko stanu zapalnego i hipoksji – dalsza hodowla w pożywce DMEM + 1% FBS (Sigma-Aldrich) do której dodawano IL-1β (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech) oraz TNFα (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech), a następnie prowadzono hodowlę w inkubatorze CO2/O2 (Panasonic, Sanyo Electric Co., Ltd.), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 2% O2 i 5% CO2 3) mikrośrodowisko stanu zapalnego i hipoksji + MSC-EVs – do pożywki DMEM + 1% FBS (Sigma-Aldrich) dodawano IL-1β (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech), TNFα (st. końcowe: 10 ng/ml, Peprotech) oraz MSC-EVs (st. końcowe: 10 µg/ml), a następnie prowadzono hodowlę w inkubatorze CO2/O2 (Panasonic, Sanyo Electric Co., Ltd.), w temp. 37oC, w atmosferze zawierającej 2% O2 i 5% CO2. Po 4 oraz 24h od dodania MSC-EVs, usuwano pożywki hodowlane, komórki delikatnie przepłukiwano roztworem PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences), a następnie komórki pasażowano przy użyciu TrypLE Select Enzyme 1X (zgodnie z protokołem opisanym w podrozdziale 3.1.2.2.). Pelety komórek MCEC z każdej z czterech grup zawieszano w pożywce DMEM suplementowanej 1% FBS (Sigma-Aldrich), rozdzielano do próbówek cytometrycznych (5ml; BD Falcon), a następnie barwiono przeciwciałami skierowanymi przeciwko następującym antygenom charakterystycznym dla aktywowanego śródbłonka naczyniowego: CD54, CD62E, CD62P, CD106 oraz dwóm wybranym antygenom nie związanym z procesem stanu zapalnego, takich jak: CD90 oraz Sca-1 (Tabela 6) zgodnie z instrukcją dołączoną przez producenta przez 30 min., na lodzie, bez dostępu światła. Po barwieniu komórki płukano objętością 3 ml roztworu soli PBS bez Ca2+, Mg2+ (HyClone, GE Healthcare Life Sciences) i odwirowywano z prędkością 300xg, przez 6 min., w temp. pokojowej przy użyciu wirówki Eppendorf 5810R (Eppendorf). Komórki zawieszano w pożywce DMEM suplementowanej 1% FBS (Sigma-Aldrich). Bezpośrednio przed analizą, do zawiesiny komórek dodawano roztwór barwnika jądrowego DAPI (st. końcowe: 3 µM; ThermoFisher Scientific) w celu późniejszego wykluczenia z analizy komórek martwych. Wybarwione komórki analizowano w kierunku antygenów występujących na powierzchni komórek MCEC przy użyciu cytometru przepływowego BD LSR Fortessa (BD Bioscence). Barwienie barwnikiem DAPI pozwoliło dodatkowo określićżywotność komórek MCEC w w/w warunkach eksperymentalnych. 3.3. Modele i procedury badań in vivo 3.3.1. Badania in vivo z wykorzystaniem mysiego modelu ostrego zawału mięśnia sercowego Opis modelu Badania z wykorzystaniem mysiego modelu uszkodzenia serca, wykonane zostały częściowo przez doktorantkę w ramach stażu (zrealizowanego w ramach grantu ETIUDA finansowanego przez NCN) - we współpracy z grupą Prof. Buddhadeb Dawn'a w Cardiovascular Research Institute, Division of Cardiovascular Diseases, University of Kansas Medical Center, Kansas City, USA, która posiada unikatowe doświadczenie w przeprowadzaniu zawału mięśnia sercowego (ang. acute myocardial infarction, AMI) u małych zwierząt - w modelu uszkodzenia ischemiczno-reperfuzyjnego (I/R). Do doświadczeń wykorzystano myszy szczepu dzikiego C57Bl/6J (Charles River) w wieku 12-14 tygodni o masie ciała 22-29 g, które po anestezji wziewnej z zastosowaniem anestetyka AErrane (Baxter) poddawano zabiegowi prowadzącemu do ostrego zawału mięśnia sercowego. W skrócie, po wprowadzeniu myszy w anestezję przystąpiono do ich intubacji, a następnie wentylacji płuc przy użyciu MiniVent Ventilator for Mice (Model 845; Harvard Apparatus). W kolejnym kroku, zwierzętom otwierano klatkę piersiową w celu zablokowania przepływu krwi w tętnicy przedniej zstępującej (ang. left anterior descending artery, LAD) poprzez zawiązanie pętli nici chirurgicznej (o grubości 8-0, Medtronic), która powodowała ucisk na naczynie, a tym samym zablokowanie przepływu krwi. Na Rycinie 9 przedstawiono schemat blokowania przepływu krwi w tętnicy LAD. Po 30 min. pętlę przecinano, w celu przywrócenia przepływu krwi, prowadzącego jednocześnie do reperfuzji i dodatkowego uszkodzenia z tym związanego. Zabieg zakończono założeniem szwów i zamknięciem klatki piersiowej. Myszy po zabiegu umieszczano w regałach pooperacyjnych w celu rekowalescencji. Rycina 9. Schemat wykonania zabiegu podwiązania tętnicy przedniej zstępującej (LAD) w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia tkankowego AMI. Na schemacie zaznaczono następujące struktury anatomiczne: lewy przedsionek (LA), lewą komorę (LV), żyłę wieńcową wielką (GCV), a także założony szew (Suture) oraz podwiązaną tętnicę przednią zstępującą (Occ. LAD). A. Przed założeniem szwu, B. Po założeniu szwu. Źródło zdjęć: (209), zmodyfikowano. Powyższy model uszkodzenia mięśnia sercowego in vivo wykorzystywano w dalszych badaniach, w celu oceny retencji przeszczepionych MSC-EVs oraz ich potencjału regeneracyjnego. Badania te były w części wykonane przez doktorantkę na miejscu, w czasie jej stażu w Cardiovascular Research Institute, Division of Cardiovascular Diseases, University of Kansas Medical Center, Kansas City w USA. 3.3.1.1. Badanie retencji MSC-EVs w narządach po uszkodzeniu AMI W celu określenia retencji MSC-EVs po ich podaniu dożylnym w modelu uszkodzenia tkankowego AMI, wybarwione fluorescencyjnie MSC-EVs lokalizowano w wybranych tkankach z zastosowaniem obrazowania całych organów oraz metod mikroskopowych. W tym celu, na wstępnym etapie wykonano szereg doświadczeń optymalizacyjnych, które umożliwiły dobranie odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego (spośród następujących: Vybrant DiO Cell-Labeling Solution, Vybrant DiI Cell-Labeling Solution DiI, DIR’ DiIC18(7) -1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'etramethylindotricarbocyanine Iodide); ThermoFisher Scientific) oraz aparatury do detekcji (spośród następującej: IVIS Spectrum In Vivo Imaging System, Perkin Elmer oraz In Vivo Optical Imaging System, Bruker), umożliwiającej pomiar sygnału fluorecencyjnego w celu identyfikacji przeszczepionych MSC-EVs w warunkach in vivo. W niniejszej pracy nie przedstawiono sekwencji metod i wyników, które doprowadziły do wyboru optymalnego barwnika fluorescencyjnego - DiR oraz systemu do detekcji - IVIS Spectrum In Vivo Imaging System. W celu wykonania badania, myszy poddawano zabiegowi uszkodzenia tkankowego AMI lub operacji pozorowanej (ang. sham surgery, Sham), podczas której po otwarciu klatki piersiowej, na tętnicy LAD zakładano luźny szew, którym nie powodował zablokowania przepływu krwi w tej tętnicy, której celem było określenie czy sama procedura otwarcia klatki piersiowej nie powoduje powstania sygnału tła. Następnie zwierzęta podzielono na następujące grupy doświadczalne zgodnie z opisem umieszczonym w Tabeli 18. Tabela 18. Grupy doświadczalne myszy w badaniu retencji MSC-EVs w wybranych narządach po uszkodzeniu tkankowym AMI. Grupa Zabieg Czas od zabiegu po którym podawano MSC-EVs/ PBS Podanie Czas od podania po którym pobierano narządy Sham AMI PBS MSC-EVs 1 RT (Kontrola) - - - - - - 2 RT (Kontrola) X 48h X 4h 3 RT (Kontrola) X 48h X 4h 4 RT (Kontrola) X 48h X 4h 5 RT X 48h X 30 min. 6 RT X 48h X 4h 7 RT X 48h X 24h 8 RT X 30 min. X 4h Po 30 min. lub 48h od zabiegu (AMI lub Sham) myszom podawano do żyły szyjnej po 50 µl roztworu soli PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza), który wykorzystywano wcześniej do zawieszania MSC-EVs (kontrola; ang. vehicle) lub po 50 µl wybarwnionych fluorescencyjnie preparatów MSC-EVs zawierających 100 µg białka. Po 30 min., 4h lub 24h od dożylnego podania MSC-EVs lub PBS, zwierzęta usypiano, a następnie pobierano krew z LK serca przy użyciu strzykawki o objętości 1 ml z igłą (BD Falcon) zawierającej 50 µl heparyny (st. końcowe: 50 USP units/ml, Sagent Pharmaceuticals). Następnie pobierano organy: wątrobę, śledzionę, serce, płuca, nerki, przewód pokarmowy oraz kończyny dolne, z których następnie izolowano kości. Za pomocą strzykawki o objętości 5 ml (BD) z kaniulą 20G (Vasofix Certo, Braun) zawierającą roztwór soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (Sigma-Aldrich), z przewodu pokarmowego wypłukiwano treść pokarmową, w celu wyeliminowania sygnału autofluorescencji. Organy umieszczano na lodzie, a następnie po ich schłodzeniu przenoszono je do szalek 12 dołkowych (BD Falcon) zawierających zimny (+4oC) roztwór soli PBS bez jonów Ca2+, Mg2+ (Sigma-Aldrich), zabezpieczając płytkę przed dostępem światła. Barwienie MSC-EVs w celu ich wykorzystania do badania retencji w tkankach Bezpośrednio przed podaniem, MSC-EVs barwiono lipofilnym barwnikiem fluorescencyjnym DIR; DiIC18(7), który znakuje błony komórkowe (st. końcowe: 10 µM; ThermoFisher Scientific) przez 30 min., w temp. pokojowej, bez dostępu światła. Po wybarwieniu, MSC-EVs przenoszono do strzykawki mikrolitrowej typu Hamilton o objętości 100 µl z igłą 30G (Hamilton). Podanie MSC-EVs do żyły szyjnej w celu badania ich retencji w tkankach Po anestezji wziewnej z zastosowaniem anestetyka AErrane (Baxter), za pomocą jałowego skalpela wykonywano ok. 1 cm nacięcie skóry w miejscu przebiegu żyły szyjnej. Do żyły szyjnej bardzo powoli podawano 50 µl roztworu soli PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza) lub 50 µl zawiesiny MSC-EVs. Zabieg zakończono założeniem szwów. Myszy po zabiegu umieszczano w regałach pooperacyjnych w celu rekowalescencji. Analiza obrazowa Detekcję fluorescencji w wyizolowanych organach, pochodzącą od nagromadzonych MSC-EVs, przeprowadzano przy użyciu aparatury In Vivo Optical Imaging System (Bruker) udostępnionej przez The University of Kansas w Lawrence, KS, USA. Analiza mikroskopowa W celu potwierdzenia wyników uzyskanych za pomocą systemu do obrazowania, metodami histologicznymi, wybrane narządy mrożono w medium mrożeniowym Tissue Freezing Medium (Leica Biosystems), a następnie cięto na kriostatcie Leica CM-3050-S (udostępnionym przez Smith IDDRC Histology Equipment, University of Kansas Medical Center). Skrawki tkanek umieszczano na szkiełkach typu Poly-Prep Slides (Sigma-Aldrich), a następnie preparaty zamykano bez etapu utrwalania, przy użyciu medium Vectashield Hard Set Mounting Medium zawierającego w swoim składzie barwnik DAPI (Vector Laboratories), barwiący jądra komórkowe w preparatach. Preparaty analizowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Leica TCS SPE (Leica Biosystems; udostępnionego przez Confocal Imaging Facility, University of Kansas Medical Center) w kierunku identyfikacji fluorescencji pochodzącej od nagromadzonych MSC-EVs. 3.3.1.2. Badanie potencjału regeneracyjnego MSC-EVs po uszkodzeniu AMI W celu oceny potencjału regeneracyjnego MSC-EVs oraz porównania go z potencjałem regeneracyjnym obserwowanym po podaniu komórek MSCs, wykorzystano opisany powyżej model uszkodzenia tkankowego AMI. Bezpośrednio przed zabiegiem, myszom wykonano badanie echokardiograficzne, a następnie poddano je zabiegowi AMI zgodnie z opisem przedstawionym w pkt. 3.3.1. Po 48h od AMI, zwierzęta podzielono na następujące grupy doświadczalne zgodnie z opisem umieszczonym w Tabeli 19. Tabela 19. Grupy doświadczalne myszy w badaniu potencjału regeneracyjnego MSC-EVs oraz komórek MSCs po uszkodzeniu tkankowym AMI. REG- badanie regeneracji. Grupa Zabieg Czas od zabiegu po którym podawano MSC-EVs/ MSCs/ PBS Podanie Sham AMI PBS MSC-EVs Komórki MSCs 1 REG (Kontrola) X 48h X 2 REG X 48h X 3 REG X 48h X Podanie MSC-EVs w strefę okołozawałową w mięśniu sercowym Po anestezji wziewnej z zastosowaniem anestetyka AErrane (Baxter) oraz intubacji zwierząt, myszom ponownie otwierano klatkę piersiową w celu podania w okolicę okołozawałową 30 µl roztworu soli PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza) lub 30 µl zawiesiny MSC-EVs zawierających 100 µg białka lub 30 µl zawiesiny komórek MSCs zawierającej 1x106 tych komórek - za pomocą strzykawki mikrolitrowej typu Hamilton o objętości 50 µl z igłą 30G (Hamilton). Preparaty podawano w okolicę okołozawałową w postaci 5-ciu nakłóć miokardium. Zabieg podania zakończono założeniem szwów i zamknięciem klatki piersiowej. Myszy po zabiegu umieszczano w regałach pooperacyjnych w celu rekowalescencji. W przeprowadzonym badaniu podawano myszom komórki MSCs wykazujące endogenną ekspresję znacznika eGFP oraz MSC-EVs wyizolowane z pożywek kondycjonowanych zebranych z hodowli tych komórek. Schemat badania potencjału regeneracyjnego MSC-EVs, oraz komórek rodzicielskich (MSCs) przedstawiono na Rycinie 10. Rycina 10. Schemat badania potencjału regeneracyjnego MSC-EVs oraz komórek MSCs w mysim modelu ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI). Myszom wykonywano badanie echokardiograficzne (Echo, BSL 0), a następnie poddawano zabiegowi uszkodzenia tkankowego poprzez trwające 30 min. (30 min O) zablokowanie przepływu krwi w tętnicy przedniej zstępującej (LAD). Po 48 godzinnym (48h) okresie reperfuzji (Rep), myszy poddawano badaniu Echo w celu weryfikacji powstania uszkodzenia tkankowego, a następnie zwierzętom ponownie otwierano klatkę piersiową i podawano bezpośrednio do mięśnia sercowego, w okolicę okołozawałową preparaty MSC-EVs lub komórek MSCs lub roztwór soli PBS. Po 9 oraz 32 dniach od zabiegu uszkodzenia tkankowego AMI, myszy poddawano badaniu Echo. Eksperyment zakończono po 32 dniach od AMI (32d). 3.3.1.3. Analiza funkcjonalna serca in vivo -Badania echokardiograficzne (ECHO) Celem oceny funkcji serca in vivo, przed zabiegiem AMI (dzień 0), jak również w dniach 2, 4, 9 i 32 od AMI, u myszy wykonywano badanie echokardiograficzne przy użyciu systemu ultrasonograficznego Vevo 2100 (FUJIFILM Visual Sonics). Wykorzystując głowicę MS400 emitującą ultradźwięki o długości fali 18 - 38 MHz, w trybie B-Mode, wykonywano zdjęcia anatomii serca ustawiając tak głowicę aby uzyskać obraz serca w osi długiej oraz krótkiej, a następnie w trybie M-Mode - pracę (ruch) serca, dzięki czemu uzyskano dane pozwalające ocenić funkcje hemodynamiczne mięśnia sercowego - w szczególności jego lewej komory (LK), a także anatomiczną przebudowę pozawałową (tzw. remodeling serca). Uzyskane dane analizowano następnie ilościowo, indywidualnie dla każdego zwierzęcia, za pomocą oprogramowania VevoStrain (FUJIFILM Visual Sonics). 3.3.1.4. Analiza histologiczna tkanek serca post mortem -Barwienie histochemiczne W celu potwierdzenia wyników uzyskanych za pomocą systemu Vevo 2100, a w szczególności wizualizacji grubości ściany LK w miejscu dotkniętym niedotlenieniem, wykonano barwienia histochemiczne preparatów tkanki mięśnia sercowego. Pobieranie tkanek Po 32 dniach od zabiegu AMI, myszy usypiano za pomocą anestezji wziewnej z zastosowaniem AErrane (Baxter), po czym podawano i.v. 50 µl roztworu heparyny (1000 USP units/ ml, Sagen Pharmaceuticals), a następnie po upływie 5 min. 500 µl 5% roztworu chlorku potasu (Sigma-Aldrich). Zwierzęta perfundowano ustrojowo z zastosowaniem zimnej (+4oC) soli PBS (Sigma-Aldrich) przez 5 min., w celu usunięcia krwi z całości krwioobiegu. W kolejnym etapie pobierano tkanki serca i umieszczano w roztworze formaliny (10 %; Sigma-Aldrich) celem ich utrwalenia na okres 48h. Następnie, tkanki były zatapiane w parafinie w Pracowni Histologicznej na University of Kansas Medical Center. Bloczki parafinowe przechowywano do momentu procesowania w temp. pokojowej. W celu wykonania dalszych badań histochemicznych i immunohistochemicznych, tkanki skrawano na skrawki grubości 4 µm z zastosowaniem mikrotomu Leica RM2255 (Leica Biosystems). W niniejszej pracy doktorskiej przedstawiono wyłącznie barwienie metodą Massona wykonywane zgodnie z procedurą opisaną poniżej. Barwienie metodą Massona W celu oceny grubości ściany LK serca w miejscu niedotlenienia, wykonano barwienie trójkolorowe metodą Massona. W tym celu, pocięte skrawki tkanek serca umieszczano na szkiełkach mikroskopowych pokrytych poly-L-lizyną (szkiełka typu Poly-Prep Slides, Sigma-Aldrich), a następnie suszono w cieplarce (Binder) w temp. 70oC przez 30 min. Skrawki odparafinowywano poprzez umieszczenie szkiełek na 5 min. w czterech zmianach ksylenu (99% każda; Acros Organics, Fisher Scientific), a następnie uwadniano w szeregu alkoholowym, złożonym z alkoholu etylowego (Acros Organics, Fisher Scientific) o malejących stężeniach, tj.: ok. 100% (3 min.), 100% (3 min.), 96% (3 min.), 96% (3 min.), 90% (3 min.) i 80% (3 min.) oraz końcowo w wodzie destylowanej (3 min.). Następnie szkiełka umieszczano w płynie Bouina (Sigma-Aldrich) podgrzanym do temp. 56oC, celem ich utrwalenia, a także wzmocnienia intensywności barwienia, po czym inkubowano temp. 56oC przez 15 min. w cieplarce (Binder). Preparaty delikatnie płukano wodą kranową (o temp. pokojowej) do momentu usunięcia żółtego zabarwienia, po czym w celu wybarwienia jąder komórkowych barwiono roztworem hematoksyliny Weigerta (Sigma-Aldrich) przez 5 min. i ponownie płukano wodą kranową. Kolejno, skrawki barwiono w roztworze Beibrich Scarlet - Acid Fuschin (Sigma-Aldrich) przez 5 min., celem wybarwienia włókien mięśniowych, a następnie płukano wodą destylowaną do momentu usunięcia czerwonego zabarwienia. Preparaty umieszczano w roztworze Phospho- Tungstic- Molybdic (Sigma-Aldrich) na 5 min. oraz przez kolejne 5 min. barwiono w roztworze błękitu anilinowego (Sigma-Aldrich) celem wybarwienia kolagenu. Szkiełka umieszczano następnie w 1% roztworze kwasu octowego (Sigma-Aldrich) na 2 min. w celu uzyskania delikatniejszego zabarwienia struktur morfologicznych, a następnie odpłukano w wodzie destylowanej. Po zakończonym barwieniu, prowadzono proces odwadniania preparatów poprzez trzykrotne zanurzenie szkiełek kolejno w następujących roztworach alkoholu etylowego o wzrastających stężeniach: 80%, 90%, 96%, 100%, 100% (Acros Organics, Fisher Scientific) oraz dwóch zmianach ksylenu (99% każda, Acros Organics, Fisher Scientific). Na wybarwione skrawki tkanek nakładano medium do trwałego zamykania preparatów -Permount Mounting Medium (Fisher Scientific), przykrywano szkiełkiem nakrywkowym i tak przygotowane preparaty analizowano w mikroskopie Zeiss Axio Scope (Zeiss) wyposażonym w kolorową kamerę Axiocam 512. 3.3.2. Badania in vivo z wykorzystaniem mysiego modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny Opis modelu Badania wykorzystujące mysi model niedokrwiennego uszkodzenia kończyny, wykonane zostały przez doktorantkę w czasie stażu naukowego (zrealizowanego w ramach programu ERASMUS+ Praktyki) -we współpracy z grupą Prof. Ramarosona Andriantsitohaina z INSERM U1063, Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques, Institut de Biologie en Santé, Universite d’Angers, Angers we Francji, która posiada wieloletnie doświadczenie w przeprowadzaniu zabiegu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny (ang. limb ischemia, LI) u małych zwierząt. Protokół LI wykorzystywany w INSERM jest zgodny z protokołem opracowanym na Stanford University, Stanford, California w USA (210). Myszy szczepu dzikiego C57Bl/6 (Charles River) w wieku 10-13 tygodni, były usypiane z zastosowaniem anestezji wziewnej za pomocą AErrane (Baxter), a następnie poddawane zabiegowi zablokowania przepływu krwi w tętnicy udowej, prowadzącemu do niedokrwienia i uszkodzenia tkanek kończyny dolnej. W tym celu, za pomocą jałowego skalpela wykonano ok. 1,5 cm nacięcie skóry lewej kończyny w miejscu przebiegu tętnicy udowej, a następnie za pomocą pincety oraz cienkich nici chirurgicznych (grubość 6-0, Ethicon) podwiązano tętnicę udową w dwóch miejscach: 1) w okolicach pachwiny stawu biodrowego oraz 2) w połowie wysokości uda (zgodnie ze schematem przedstawionym na Rycinie 11). Za pomocą precyzyjnych nożyczek przecięto tętnicę udową pomiędzy dwoma miejscami zablokowania przepływu (w miejscu oznaczonym na Rycinie 11 symbolem x), aby całkowicie uniemożliwić przepływ krwi głównym naczyniem. Zabieg zakończono założeniem szwów zamykających ranę oraz oceną skuteczności wykonanej okluzji za pomocą pomiaru perfuzji kończyn metodą Dopplera przy użyciu sytemu Laser Doppler Perfusion Imager PeriScan PIM 3 (Perimed AB). Powyższy mysi model niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo wykorzystywano w dalszych badaniach, w celu oceny retencji przeszczepionych MSC-EVs oraz ich potencjału regeneracyjnego. Badania te zostały wykonane przez doktorantkę na miejscu, w czasie jej stażu w INSERM U1063, Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques, Institut de Biologie en Santé, Universite d’Angers, Angers we Francji. Więzadło pachwinowe Tętnica udowa przyśrodkowa (ang. inguinal ligament) (ang. medial femoral artery) Nerw udowy (ang. femoral nerve) Żyła udowa (ang. femoral vein) Miejsce podwiązania 1 Tętnica udowa (ang. femoral artery) x Miejsce podwiązania 2 Powierzchowna tętnica nadbrzusza Tętnica podkolanowa (ang. superficial epigastric artery) (ang. popliteal artery) Tętnica odpiszczelowa (ang. saphenous artery) Rycina 11. Schemat wykonywania zabiegu podwiązania tętnicy udowej w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny (LI). Na schemacie zaznaczono najważniesze struktury anatomiczne sąsiadujące z tętnicą udową. Za pomocą gwiazdek (*) zaznaczono dwa miejsca podwiązania tętnicy udowej, natomiast za pomocą symbolu (x) miejsce przecięcia tętnicy udowej wykonane w celu całkowitego uniemożliwienia przepływu krwi przez tę tętnicę. Przygotowano na podstawie: (210), zmodyfikowano. 3.3.2.1. Badanie retencji MSC-EVs w narządach po niedokrwiennym uszkodzeniu kończyny Myszy poddawano zabiegowi niedokrwiennego uszkodzenia tkanek LI, a następnie zwierzęta podzielono na następujące grupy doświadczalne zgodnie z opisem umieszczonym w Tabeli 20. Tabela 20. Grupy doświadczalne myszy w badaniu retencji MSC-EVs w wybranych narządach po uszkodzeniu tkankowym LI. Grupa Zabieg LI Czas od zabiegu po którym podawano MSC-EVs/ PBS Podanie Czas od podania po którym pobierano narządy PBS MSC-EVs 1 RT (Kontrola) X 24h X 4h 2 RT X 24h X 4h 3 RT X 24h X 24h Po 24h od zabiegu LI, myszom podawano dożylnie (do żyły ogonowej) po 50 µl roztworu soli PBS (bez jonów Ca2+, Mg2+; Lonza) lub 50 µl zawiesiny MSC-EVs zawierającej 100 µg białka związanego z tymi nanocząstkami. MSCs-EVs wykorzystane w tym modelu wyizolowane zostały z pożywek kondycjonowanych zebranych z hodowli komórek MSCs wykazujących endogenną ekspresję markera eGFP. Po 4 oraz 24h od podania roztworu soli PBS lub MSC-EVs, myszy poddawano eutanazji z zastosowaniem CO2, a następnie indywidualnie od każdego zwierzęcia pobierano krew z LK do probówek BD Vacutainer K2 EDTA (BD), a także wybrane narządy: wątrobę, nerki, śledzionę, płuca oraz kończyny. Narządy umieszczano w roztworze soli PBS w dołkach płytki 12 dołkowej (BD Falcon) i przechowywano w temp. + 4oC, bez dostępu światła, do czasu analizy. W celu izolacji osocza, krew odwirowywano z prędkością 350xg, 7 min, w temp. pokojowej, a następnie osocze przenoszono do nowych probówek o obj. 1,5 ml typu Eppendorf (Eppendorf). Intensywność fluorescencji emitowaną przez osocze, narządy oraz wyizolowane kończyny dolne -świadczącą o stopniu zakumulowania podanych MSC-EVs, mierzono przy użyciu systemu Maestro In-vivo Fluorescence Imaging System (Caliper LifeSciences). Od średnich wartości fluorescencji dla osocza, narządów oraz kończyn uzyskanych dla zwierząt grupy, której podawano MSC-EVs odejmowano średnie wartości fluorescencji uzyskane dla zwierząt grupy kontrolnej (poziom autofluorescencji tkanek), przy użyciu oprogramowania Living Image. 3.3.2.2. Badanie potencjału regeneracyjnego MSC-EVs po niedokrwiennym uszkodzeniu kończyny W celu oceny potencjału regeneracyjnego MSC-EVs podawanych dożylnie, wykorzystano wyżej opisany model niedokrwiennego uszkodzenia kończyny LI in vivo. Myszy szczepu dzikiego C57Bl/6 (Charles River) zostały poddane zabiegowi LI zgodnie z opisem w pkt. 3.3.2., a następnie bezpośrednio po zabiegu podzielone na dwie grupy doświadczalne zgodnie z informacjami zawartymi w Tabeli 21. Tabela 21. Grupy doświadczalne myszy w badaniu potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w wybranych narządach po uszkodzeniu tkankowym LI. * MSCs-EVs wyizolowane zostały z pożywek kondycjonowanych zebranych z hodowli komórek MSCs wykazujących ekspresję endogennego znacznika eGFP. REG- badanie regeneracji. Grupa Zabieg LI Czas od zabiegu po którym pierwszy raz podawano MSC-EVs/ PBS Podanie Całkowita liczba podań i.v. Dawka MSC-EVs/ 1 podanie PBS MSC-EVs* 1 REG (Kontrola) X 1h X 7 - 2 REG (EVs) X 1h X 7 10 µg/ 1 ml krwi myszy Ilość podawanych MSC-EVs (w µg białka mierzonego w preparatach MSC-EVs metodą Bradforda opisaną w podrozdziale 3.2.6. Pomiar stężenia białka metodą Bradforda) obliczano indywidulanie dla każdej myszy w przeliczeniu na masę ciała i objętość krwi. Sposób wykonywania obliczeń przedstawiono poniżej. Obliczanie objętości krwi u wybranej myszy Przykład: Mysz o masie ciała 24,4 g Założenie*: 8 ml krwi – 100,0 g masy ciała myszy x ml krwi – 24,4 g masy ciała myszy Objętość krwi u myszy: 1,95 ml (*) założenie dokonane na podstawie wskazówek technicznych dotyczących pobierania krwi i obliczania jej objętości u myszy opracowanych przez J. Hoff (211). Obliczanie ilości podawanych MSC-EVs Dawka: 10 µg MSC-EVs/ 1 ml krwi 1 ml krwi myszy – 10 µg MSC-EVs 1,95 ml krwi – x µg MSC-EVs Ilość podawanych MSC-EVs: 19,5 µg MSC-EVs (na 1 podanie) W Tabeli 22 zamieszczono wyniki obliczeń ilości podawanych MSC-EVs dla poszczególnych myszy w eksperymencie. Tabela 22. Obliczenia objętości krwi u poszczególnych myszy oraz ilości podawanych MSC-EVs na podstawie masy ciała zwierząt. Zwierzęta ważono w dniu ich zakwalifikowania do eksperymentu. ILOŚĆ MSC-EVs PODAWANYCH DOŻYLNIE DLA POSZCZEGÓLNYCH MYSZY Nr myszy 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Masa [g] 20,0 22,0 21,4 22,0 22,8 24,4 20,7 23,1 24,8 Objętość krwi [ml] 1,60 1,76 1,71 1,60 1,82 1,95 1,66 1,85 1,98 Ilość podawanych MSC-EVs [µg]/ 1 podanie 16,0 17,6 17,1 16,0 18,2 19,5 16,6 18,5 19,8 Schemat badania potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w odniesieniu do myszy kontrolnych w mysim modelu uszkodzenia tkankowego LI in vivo przedstawiono na Rycinie 12. Rycina 12. Schemat badania potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny (LI) in vivo. Myszy poddawano zabiegowi niedokrwiennego uszkodzenia kończyny LI (0d). Bezpośrednio przed zabiegiem, jak również bezpośrednio po zabiegu (0d), a także w dniach 7, 14 oraz 21 wykonywano myszom badanie przepływu krwi w kończynach metodą Dopplera. Począwszy od dnia zabiegu (0d), co trzy dni (tj. w dniach 0, 3, 6, 9, 12, 15 i 18) myszom podawano dożylnie po 10 µg MSC-EVs w przeliczeniu na 1 ml krwi zwierzęcia/ 1 podanie. W dniu 21 zakończono eksperyment i pobierano tkanki do dalszych analiz molekularnych oraz immunohistochemicznych. 3.3.2.3. Analiza funkcjonalna in vivo - Badanie przepływu krwi w kończynach metodą Dopplera W celu oceny perfuzji krwi w tkankach mięśniowych w kończynach dolnych po podaniu MSC-EVs, świadczącej o postępującej regeneracji, w wybranych punktach czasowych myszy poddawano badaniu z zastosowanem systemu Dopplera. Przed wykonaniem zabiegu LI, bezpośrednio po zabiegu (dzień 0), jak również w 7, 14 oraz 21 dniu od zabiegu, myszy poddawano badaniu przepływu krwi w kończynach przy użyciu sytemu Laser Doppler Perfusion Imager PeriScan PIM 3 (Perimed AB). Po anestezji wziewnej za pomocą AErrane (Baxter), myszy umieszczano na platformach podgrzewanych do temp. 37oC - warunkujących stałą temperaturę ciała zwierzęcia podczas badania przepływu krwi. Za pomocą czujnika stale monitorowano temperaturę ciała zwierząt w trakcie pomiaru perfuzji tkanek. Wartość przepływu krwi w poszczególnych kończynach analizowano za pomocą oprogramowania LDPIwin (Perimed AB), gdzie przepływ w uszkodzonej kończynie oceniano jako stosunek perfuzji krwi w kończynie uszkodzonej do perfuzji krwi w kończynie zdrowej stosując parametr PU (ang. perfusion unit). 3.3.2.4. Analiza histologiczna tkanek kończyny post mortem -Badania immunohistochemiczne i biochemiczne W celu oceny procesów regeneracji tkanek mięśniowych przy użyciu metod biochemicznych oraz immunohistochemicznych, tj. produkcji tlenku azotu (NO) oraz anionu ponadtlenkowego (O2-), aktywacji szlaków proangiogennych oraz stopnia neowaskularyzacji w tych tkankach, w 21 dniu od zabiegu LI, zwierzęta poddawano eutanazji, a następnie pobierano od nich tkanki. Pobieranie tkanek Zwierzęta poddawano eutanazji z zastosowaniem CO2, a następnie pobierano tkanki mięśniowe z kończyn dolnych. Każdy wyizolowany mięsień dzielono na 4 części przeznaczone na badanie: 1) i 2) produkcji NO i O2-, 3) aktywacji szlaków związanych z angiogenezą metodą Western blot oraz 4) barwienie immunohistochemiczne; zgodnie z protokołami przedstawionymi poniżej. Płytkę 12 dołkową (BD Falcon) zawierającą fragmenty mięśni przechowywano bardzo krótko na lodzie do momentu zabezpieczenia tkanek na poszczególne analizy. 3.3.2.4.1. Pomiar produkcji tlenku azotu (NO) oraz anionu ponadtlenkowego (O2-) techniką Elektronowego Rezonansu Paramagnetycznego (EPR) W przypadku badania NO w pobranych tkankach, w dniu poprzedzającym zakończenie doświadczenia, przygotowano bufor Krebsa-NO zawierający: chlorek sodu (NaCl, st. końcowe: 58,44 mM, Sigma-Aldrich), chlorek potasu (KCl, st. końcowe: 4,69 mM, Sigma-Aldrich), chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2·2H2O, st. końcowe: 2,50 mM, EMD Millipore), siarczan (VI) magnezu siedmiowodny (MgSO4·7H2O, st. końcowe: 1,10 mM, EMD Millipore), wodorofosforan (V) dipotasu (K2HPO4, st. końcowe: 0,8 mM, Sigma-Aldrich), wodorowęglan (IV) sodu (NaHCO3, st. końcowe: 25,00 mM Sigma-Aldrich), glukozę (st. końcowe: 11,10 mM, Sigma-Aldrich), bufor HEPES (st. końcowe: 20,00 mM, Sigma-Aldrich). 3,6 mg DETC (ang. silver diethyldithiocarbamate; Sigma-Aldrich) oraz 2,3 mg siarczanu (VI) żelaza (II) (FeSO4; Sigma-Aldrich) rozpuszczano indywidualnie każdy w 10 ml zimnego (+4oC) buforu Krebsa-NO odgazowanego przy użyciu N2 (przez 20 min.), a następnie mieszano oba roztwory otrzymując roztwór Fe(DETC)2 o st. końcowym równym 0,4 mM. Roztwór odgazowano przy użyciu N2 (przez 20 min.). Pobrane fragmenty mięśni inkubowano w 0,4 mM roztworze koloidu Fe(DETC)2 przez 45 min w 37oC. Po skończonej inkubacji, fragmenty mięśni umieszczano w odgazowanym roztworze koloidu Fe(DETC)2 w strzykawkach 1 ml (BD), a następnie szybko zamrażano w oparach ciekłego N2. W przypadku badania O2-w pobranych tkankach, w dniu poprzedzającym zakończenie doświadczenia, przygotowywano bufor Krebsa z buforem HEPES chelatowany deferoksaminą zawierający CMH (ang. 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine, st. końcowe: 500,00 µM, Noxygen), deferoksaminę (st. końcowe: 25,00 µM, Sigma-Aldrich) oraz DETC (st. końcowe: 5,00 µM, Sigma-Aldrich). Tkanki inkubowano w przygotwanym buforze przez 45 min. w 37oC. Wymieniony powyżej Bufor Krebsa z HEPES zawierał: NaCl (st. końcowe: 99,00 mM, Sigma-Aldrich), KCl (st. końcowe: 4,69 mM, Sigma-Aldrich), CaCl2·2H20 (st. końcowe: 2,50 mM, EMD Millipore), MgSO4·7H20 (st. końcowe: 1,20 mM EMD Millipore), KH2PO4 (st. końcowe: 1,03 mM Sigma-Aldrich), NaHCO3 (st. końcowe: 25,00 mM Sigma-Aldrich), glukozę (st. końcowe: 5,60 mM Sigma-Aldrich), sól Na-HEPES (st. końcowe: 20,00 mM Sigma-Aldrich). Do 20 ml zimnego (+4oC), buforu Krebsa z HEPES odgazowanego przy użyciu N2 (20 min.) dodawano następnie deferoksaminę oraz DETC (Sigma-Aldrich), natomiast CMH (Noxygen) bezpośrednio przed włożeniem tkanki do roztworu. Po skończonej inkubacji, fragmenty mięśni umieszczano w odgazowanym roztworze Krebs-HEPES-CMH w strzykawkach 1 ml (BD), a następnie szybko zamrażano w oparach ciekłego N2. Pomiar produkcji NO oraz O2-w tkankach wykonano przy użyciu spektrometru Miniscope MS200 (Magnettech) dla następujących parametrów pomiaru: 10 mW of microwave power, 1 mT of amplitude modulation frequency, 60 s of sweep time oraz 3 scans. 3.3.2.4.2. Badanie ekspresji białek związanych z angiogenezą w tkankach Technikę Western blot - zoptymalizowaną w celu oceny markerów białkowych w lizatach tkankowych - wykorzystywano w celu identyfikacji markerów związanych z aktywacją szlaków proangiogennych w mięśniach szkieletowych pobranych od myszy, którym podawano MSC-EVs w odniesieniu do myszy grupy kontrolnej. W tym celu, fragmenty mięśni świeżo wyizolowane od myszy w 21 dniu od zabiegu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny LI, umieszczano w probówkach o objętości 1,5 ml typu Eppendorf (Eppendorf), a następnie zamrażano w oparach ciekłego N2. Przed wykonaniem analizy Western blot, fragmenty mięśni zawieszano w buforze lizującym zawierającym 1% SDS (Fluka Chemie), 10 mM hydrochlorek Tris (Tris-HCl; Sigma-Aldrich), 1 mM ortowanadan sodu (Na3VO4; Sigma-Aldrich) oraz koktajl inhibitorów proteaz (Halt Protease Inhibitor Coctail, 100X, Thermo Scientific) w stosunku ilościowym 1 µl inhibitorów proteaz/ 100 µl buforu lizującego, a następnie rozdrabniano przy użyciu homogenizatora Polytron Pro 250 (Pro Scientific). Po odwirowaniu lizatów z prędkością 14 000xg, 10 min., w temp. 4oC, nadsącze przeniesiono do nowych probówek, a następnie oznaczano stężenie białka w każdej próbce wykorzystując metodę Bradforda (zgodnie z procedurą zamieszczoną w podrozdziale 3.2.6.). Do przeprowadzenia rozdziału elektroforetycznego wykorzystano zestaw Mini Protean 3 (Bio-Rad). W celu przygotowania próbek, do objętości każdej próbki lizatu zawierającego 80 µg białka - dodawano po 4 µl buforu redukującego (NuPAGE Sample Reducing Agent; ThermoFisher Scientific) oraz 10 µl buforu obciążającego (NuPAGE LDS Sample Buffer; ThermoFisher Scientific), a następnie denaturowano próbki w temp. 70oC przez 10 min. Przygotowane próbki nakładano na studzienki żelu poliakrylamidowego NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gel (ThermoFisher Scientific). W celu oceny masy molekularnej rozdzielanych białek, na żel nakładano także barwny marker ProSieve QuadColor Protein Marker (4,6 - 300,0 kDa; Lonza). Elektroforezę prowadzono w buforze elektrodowym NuPAGE MOPS SDS Running Buffer 1X (ThermoFisher Scientific) w warunkach redukujących stosując napięcie 140 V przez 90 min. Transfer na membranę PVDF (Millipore) wykonywano w Transfer Buffer 1X (Bio-Rad) stosując napięcie 110 V przez 90 min w temp. +4oC, a następnie membranę podbarwiono przy użyciu Ponceau S Solution (Sigma-Aldrich). Po trzykrotnym przepłukaniu membrany buforem TBS-T (10 mM Tris/base pH 7.5, 0.1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween 20), blokowano niespecyficzne miejsca wiązania przeciwciał przy użyciu buforu TBS-T zawierającego 5% BSA (Sigma-Aldrich) przez 90 min., w temp. pokojowej. Membrany inkubowano z przeciwciałami I rzędowymi wymienionymi w Tabeli 23 przez całą noc, w temp. 4oC, a następnie po trzykrotnym przepłukaniu buforem TBS-T (5 min. inkubacji dla każdego płukania), membrany inkubowano przez 90 min. w temp. pokojowej z przeciwciałami II-rzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (ang. horseradish peroxidase, HRP) (Tabela 23). Po odpłukaniu niezwiązanych przeciwciał (5-o krotne płukanie; po 2 min. każde, w buforze TBS-T), membrany inkubowano z chemiluminescencyjnym substratem dla HRP obecnym z zestawie do barwienia-ImmunoCruz ABC kit (Santa Cruz Biotechnology) - zgodnie z protokołem producenta. Membrany wizualizowano cyfrowo przy użyciu Image Reader Las-3000 (Fujifilm), a następnie wykonywano analizę densytometryczną wykorzystując program ImageJ, w celu pólilościwej analizy uzyskanych danych. Wyniki pomiarów fosforylowanych form białek przedstawiano w stosunku do białek nieufosforylowanych po ich normalizacji względem białka referencyjnego -β-aktyny. Tabela 23. Lista przeciwciał wykorzystywanych w analizie Western blot. Przeciwciało przeciwko Stosowane rozcieńczenie Pochodzenie Producent Masa molekularna [kDa] Przeciwciało I-rzędowe β-aktyna 1:5000 mysie Sigma-Aldrich 42 Akt 1:1000 królicze Cell Signaling 60 P-Akt (Ser473) 1:2000 królicze Cell Signaling 60 eNOS 1:5000 mysie BD Bioscence 140 P-eNOS 1:1000 królicze Cell Signaling 140 VEGF 1:1000 królicze Santa Cruz Biotechnology 21-42 Przeciwciało II-rzędowe HRP Anty- mysie 1:5000 owcze Amersham Biosciences - HRP Anty-królicze 1:20000 ośle Amersham Biosciences - 3.3.2.4.3. Barwienie immunofluorecencyjne skrawków mrożeniowych W celu oceny ilości naczyń krwionośnych powstałych w tkankach mięśniowych w następstwie ich niedotlenienia oraz podania EVs, pobrane tkanki mięśniowe umieszczano w foremkach Shandon Disposable Base Molds (Fisher Scientific) w medium mrożeniowym Shandon Cryomatrix (Thermo Scientic), a następnie zamrażano w oparach ciekłego N2. Tak przygotowane tkanki przechowywano w temp. -80oC do czasu ich barwienia immunofluorescencyjnego. Bloczki mrożeniowe krojone przy użyciu kriostatu Leica CM3050 S (Leica Biosystems) na skrawki o grubości 7-8 µm, umieszczano na szkiełkach typu Menzel Gläser SUPERFROST Plus (Thermo Scientic) opłaszczonych roztworem poly-L-lizyny (st. końcowe: 0,01%, Sigma-Aldrich). Skrawki mrożeniowe utrwalano następnie przy użyciu zmrożonego 99% metanolu (Sigma-Aldrich) przez 5 min., w temp. -20oC, a następnie trzykrotnie płukano przygotowanym buforem dedykowanym do barwień immunofluorescencyjnych (bufor BI, zawierający: 137,0 mM NaCl, 2,1 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, Sigma-Aldrich). Niespecyficzne miejsca wiązania blokowano przy użyciu buforu BI z dodatkiem 5% roztworu BSA (Sigma-Aldrich) przez 90 min., w temp. pokojowej, a następnie pięciokrotnie płukano szkiełka w/w buforem (5 min. każde). W celu detekcji procesów neowaskularyzacji tkanek mięśniowych, skrawki inkubowano przez całą noc (12h), w temp. 4oC - z przeciwciałem I-rzędowymi skierowanym przeciwko markerowi komórek śródbłonka naczyń (szczurze przeciwciało anty-mysie CD31; BD Pharmingen), rozcieńczonym w stosunku 1:100 w buforze BI. Po inkubacji, szkiełka płukano pięciokrotnie w roztworze BI (5 min. każde), a następnie inkubowano przez 90 min., w temp. pokojowej, bez dostępu światła - z przeciwciałem IIrzędowym skoniugowanym z FITC (kozie przeciwciało skierowane przeciwko szczurzym immunoglobulinom; SouthernBiotech), rozcieńczonym w buforze BI w stosunku 1:100. Preparaty następnie dwukrotnie płukano w roztworze BI (5 min.), wybarwiano jądra komórkowe przy użyciu roztworu DAPI (st. końcowe 300 nM; Sigma-Aldrich) przez 3 min, w temp. pokojowej, w ciemności, po czym trzykrotnie płukano w buforze BI (5 min.), a następnie zamykano preparaty przy użyciu medium Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories). Wykonane preparaty analizowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss). 3.4. Analiza statystyczna wyników Analiza statystyczna uzyskanych wyników przeprowadzona została za pomocą testu t-studenta lub testu U Manna-Whitneya przy użyciu programu GraphPad Prism 8. Liczbę powtórzeń eksperymentów oraz liczbę zwierząt w doświadczeniach, podano każdorazowo w opisie wyników, w dalszej części pracy. 4. WYNIKI 4.1. Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna mysich komórek MSCs Komórki MSCs izolowano z mysiego szpiku kostnego dzięki ich zdolności do adhezji do polistyrenowych powierzchni naczyń hodowlanych. W celu oceny homogenności uzyskanej kultury, komórki na pasażu 4 poddano charakterystyce fenotypowej oraz funkcjonalnej. We wcześniejszych moich badaniach wykazałam, że komórki adherentne szpiku kostnego (wśród których znajdują się komórki MSCs), na początkowych etapach hodowli wykazują swoiste „zanieczyszczenie” komórkami hematopoetycznymi linii monocytarno-makrofagowej (CD45+/CD11b+), które wypasażowują się w miarę postępu hodowli (tj. w pasażach 1-3) i dlatego w niniejszych badaniach stosowałam komórki będące pomiędzy pasażem 4, a pasażem 6 hodowli (P4P6). Analizy wykonywano zgodnie z zaleceniami opublikowanymi przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej odnośnie identyfikacji komórek MSCs pochodzących z tkanek ludzkich (79), które zaimplementowano w niniejszej pracy dla komórek MSCs pochodzenia mysiego. W pierwszym etapie realizacji badań potwierdzono prawidłową morfologię komórek MSCs wyizolowanych poprzez adhezję do polistyrenowych powierzchni naczyń hodowlanych (Rycina 13A), a następnie wykonano ich charakterystykę fenotypową dzięki zastosowaniu wielokolorowej cytometrii przepływowej (Rycina 13B, C). Wykazano, że frakcja komórek adherentnych mysiego szpiku kostnego (na pasażu 4) zawierała w znaczącym odsetku niehematopoetyczne komórki CD45-(95,4 ± 2,8%) (Rycina 13C). W dalszym etapie, komórki CD45-charakteryzowano pod kątem występowania na ich powierzchni innych wybranych markerów występujących na komórkach macierzystych i progenitorowych (Rycina 13B). Zaobserwowano, że komórki CD45-wykazują wysoki stopień ekspresji markerów charakterystycznych dla komórek MSCs, takich jak: CD29, CD44, CD90, CD105 oraz Sca-1, przy równoczesnym braku ekspresji: i) markerów komórek pluripotencjalnych (SSEA-1) oraz hematopoetycznych komórek progenitorowych (c-kit), ii) komórek śródbłonka (CD31, CD62E) oraz iii) dojrzałych komórek krwi (CD11b, TCR-β, CD45R, TCR-γδ) (Rycina 13B, C). Komórki MSCs wykazują również wysoką ekspresję tetraspanin (CD63, CD81), zmienny poziom ekspresji receptora dla VEGF (CD309) oraz bardzo niski poziom ekspresji receptorów dla SDF-1 (CD184) oraz dla czynnika HGF (HGFR). Dane ilościowe tych analiz przedstawiono na Rycinie 13C. Biorąc pod uwagę występowanie cząsteczek adhezyjnych oraz białek odpowiedzialnych za oddziaływanie ze śródbłonkiem naczyniowym, na powierzchni komórek MSCs zaobserwowano występowanie antygenu CD106 (cząsteczki VCAM) oraz zmienny (pomiędzy powtórzeniami biologicznymi) poziom ekspresji antygenu CD54 (cząsteczki ICAM-1) oraz praktycznie brak występowania następujących antygenów: CD11a/CD18, CD49d, CD49e, należących do grupy integryn. Dodatkowo, na powierzchni komórek MSCs (CD45-) zidentyfikowano antygen CD98, charakterystyczny dla komórek aktywnych metabolicznie (Rycina 13C). Ocena obecności oraz poziomu ekspresji tych molekuł w mysich komórkach MSCs była istotna z punktu widzenia dalszej oceny fenotypu oraz funkcji ich pęcherzyków zwnątrzkomórkowych, co wykonano w dalszej części pracy. C Odsetek komórek pozytywnychOdsetek komórek pozytywnych pośród subpopulacji komórek CD45-[%] pośród subpopulacji komórek CD45-[%] Badany antygen Badany antygen A. Morfologia komórek MSCs na pasażu 4 – analiza w mikroskopii świetlnej. Skala = 50 µm. B. Reprezentatywne histogramy z przykładowej analizy cytometrycznej profilu antygenowego komórek MSCs (na pasażu 4) z uwzględnieniem markerów charakterystycznych dla: komórek mezenchymalnych (CD29, CD44, CD90, CD105, Sca-1), komórek pluripotencjalnych (SSEA-1), komórek endotelialnych (CD62E), komórek krwi (CD45, CD45R, CD11b), obecności tetraspanin (CD63, CD81) oraz receptora dla VEGF (VEGFR2). Na histogramach przedstawiono złożenie pików dla próbki niebarwionej, przedstawiający autofluorescencję komórek w danym kanale (pik szary) oraz barwionej określonym przeciwciałem (pik czerwony). Komórki analizowano pod kątem obecności markera leukocytarnego CD45, a następnie pod kątem występowania w/w markerów. Na histogramach zamieszczono wartości procentowe ekspresji analizowanych antygenów pośród komórek CD45-w przykładowym eksperymencie. C. Ocena ilościowa ekspresji wybranych antygenów w populacji komórek CD45-. Wartości liczbowe (średnia ± SD) określają procent komórek pozytywnych pod względem badanego antygenu pośród wszystkich komórek CD45-. N=3. W kolejnym etapie, komórki MSCs poddano różnicowaniu w kierunku osteoblastów, chondrocytyów oraz adipocytów przy użyciu komercyjnie dostępnych pożywek różnicujących - w celu potwierdzenia ich potencjału multipotencjalnego (Rycina 14). Komórki MSCs zróżnicowane w kierunku osteoblastów i chondrocytów identyfikowano na podstawie barwień histochemicznych, natomiast komórki zróżnicowane w kierunku adipocytów – przy użyciu obserwacji mikroskopowych identyfikujących komórki z widocznymi kroplami tłuszczu w cytoplazmie. Komórki różnicujące w kierunku chondrocytów wykazywały widoczne depozyty glikozaminoglikanów (niebieskie kule) po wybarwieniu błękitem alcjańskim (Rycina 14A), natomiast osteoblasty wykazywały znaczną mineralizację po wybarwieniu czerwienią alizarynową (Rycina 14B). Jak wspomniano wyżej, adipocyty identyfikowano na podstawie obecności lipoprotein odkładających się w cytoplaźmie tych komórek podczas adipogenezy (Rycina 14C). Rycina 14. Ocena potencjału różnicowania mysich komórek MSCs. Reprezentatywne zdjęcia przedstawiają wynik prowadzonego: A. Różnicowania chondrogennego (trwającego przez 15 dni), B. Różnicowania osteogennego (trwającego przez 15 dni). C. Różnicowania w kierunku adipocytów (trwającego przez 11 dni). Strzałkami zaznaczono komórki MSCs o właściwym zróżnicowanym fenotypie. Podsumowując, wykonana charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna mysich komórek MSCs szpiku kostnego potwierdziła właściwy fenotyp oraz potencjał różnicowania dla tych komórek, na podstawie kryteriów charakterystycznych dla komórek MSCs. 4.2. Pozyskiwanie pożywek kondycjonowanych z hodowli komórek MSCs w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych W celu izolacji MSC-EVs, mysie komórki MSCs na pasażach 4-6, umieszczano w pożywce do izolacji MSC-EVs - DMEM/F12 suplementowanej 0,5% BSA (bez surowicy) na 24h, a następnie zbierano pożywkę kondycjonowaną zawierającą m.in. MSC-EVs. Komórki rodzicielskie (MSCs) analizowano pod kątem ich żywotności oraz cyklu komórkowego. W badaniach stosowano pożywkę bezsurowiczą w celu izolacji MSC-EVs pozbawionych zanieczyszczenia pęcherzykami pochodzącymi z surowicy, co jest zgodne z zaleceniami Towarzystwa Naukowego ISEV (167). Wykazano, że komórki MSCs inkubowane w w/w pożywce bezsurowiczej, dedykowanej izolacji MSC-EVs, wykazywały nieznacznie obniżonążywotność w porównaniu do komórek hodowanych w pełnej pożywce DMEM/F12 suplementowanej 10% FBS (odpowiednio, 87,9 ± 4,6% vs. 95,9 ± 2,9%, Rycina 15A, B). Przykładowe dot-ploty z analizy żywotności komórek MSCs techniką cytometrii przepływowej, obejmujące także rozkład procentowy subpopulacji komórek nekrotycznych, wczesno-oraz późnoapoptotycznych, przedstawiono na Rycinie 15A. Następnie wykonano badanie cyklu komórkowego komórek MSCs, które wykorzystano do izolacji MSC-EVs (Rycina 15C, D). Wykazano, że komórki MSCs - znad których zbierano pożywkę do izolacji MSC-EVs, znajdowały się głównie w fazie G0/G1 cyklu komórkowego (81,3 ± 4,3% wszystkich komórek w hodowli), co nie odbiegało znacząco od komórek MSCs utrzymywanych w standardowej hodowli (79,9 ± 2,4% komórek). Odsetek komórek w fazie S, podczas której odbywa się replikacja DNA, był porównywalny dla komórek inkubowanych w pożywce bezsurowiczej oraz do komórek hodowanych w pożywce suplementowanej FBS i wynosił odpowiednio 3,2 ± 1,7% oraz 4,2 ± 0,9%. Podobnie, odsetek komórek MSCs w fazie G2 oraz M był także porównywalny dla komórek MSCs inkubowanych w pożywce suplementowanej 0,5% BSA oraz 10% FBS (11,1 ± 2,7% vs. 13,1 ± 1,4%). Uzyskane wyniki świadczą o tym, że komórki MSCs znad których zbierano pożywkę do izolacji MSC-EVs cechowały się wysokążywotnością oraz znajdowały się głównie w fazie G0/G1 cyklu komórkowego. Podsumowując, badania kontrolne komórek MSCs – z hodowli których zbierano pożywki kondycjonowane do izolacji MSC-EVs, wykazywały niewielki spadek żywotności względem komórek kontrolnych oraz nie zaobserwowano różnic w przebiegu faz cyklu komórkowego, w odniesieniu do komórek MSCs hodowanych w standardowej, pełnej pożywce hodowlanej. W związku z powyższym pozyskane pożywki kondycjonowano procesowano w dalszej części pracy celem pozyskania MSC-EVs stosowanych do dalszych badań. A Standardowa hodowla Zbieranie pożywek B Komórki G0/G1 S G2/MPI PI Rycina 15. Ocena żywotności i cyklu komórkowego MSCs po zebraniu pożywki kondycjonowanej do izolacji MSC-EVs. Dane przedstawiają kondycję komórek MSCs inkubowanych przez 24h w pożywce bezsurowiczej, w porównaniu do standardowego pełnego medium hodowlanego. A. Reprezentatywne dot-ploty z pojedynczej analizy żywotności komórek techniką cytometrii przepływowej. Na wykresach przedstawiono odsetek komórek w każdym kwadracie, świadczących o obecności komórek nekrotycznych (Q1), późnoapoptotycznych (Q2), wczesnoapoptotycznych (Q3) oraz żywych (Q4). Oznaczenia: PI- jodek propidyny, Ann V- aneksyna V. B. Analiza ilościowa żywotności komórek MSCs. Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *P<0,05; (test t-studenta), N=5/grupę. C. Reprezentatywne histogramy z przykładowej analizy cyklu komórkowego techniką cytometrii przepływowej. D. Analiza ilościowa odsetka komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego. Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, (test t-studenta), N=3/grupę. 4.3. Ocena morfologii i wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowli komórek MSCs Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe izolowano z pożywek kondycjonowanych zebranych z hodowli komórek MSCs, metodą sekwencyjnego wirowania obejmującego dwa cykle ultrawirowania. Schemat procesu izolacji MSC-EVs z pożywek kondycjonowanych został przedstawiony na Rycinie 7. Zgodnie z zaleceniami Towarzystwa Naukowego ISEV (167), w celu potwierdzenia obecności integralnych pęcherzyków w izolowanych próbkach oraz oceny ich morfologii, izolaty MSC-EVs obrazowano techniką mikroskopii sił atomowych (ang. atomic force microscopy, AFM). W odróżnieniu od transmisyjnej mikroskopii elektronowej, metoda obrazowania AFM umożliwia wizualizację preparatów w czasie rzeczywistym oraz nie wymaga etapu utrwalania analizowanego materiału, co znacznie C D Standardowa hodowla Zbieranie pożywek komórek MSCs do izolacji MSC-EVs zmniejsza ryzyko zniekształcenia kształtów EVs podczas przygotowania preparatów do obrazowania. Dodatkowo, obrazowanie techniką AFM jest jednym z dwóch sposobów obrazowania EVs zalecanych przez Towarzystwo Naukowe ISEV (167). Analiza zdjęć preparatów wykonanych w płaszczyźnie dwu- (2D) oraz trójwymiarowej (3D) wykazała, że badane próbki zawierają cząsteczki o kulistym kształcie i zróżnicowanej wielkości, co wskazuje na wzbogacenie preparatów w pęcherzyki o prawidłowej morfologii (Rycina 16A). W kolejnym etapie, zbadano rozkład wielkości MSC-EVs techniką TRPS (ang. Tunable Resistive Pulse Sensing) przy użyciu systemu IZON qNano, umożliwiającą dokładną ocenę wielkości EVs. Wykonane badania wykazały, że MSC-EVs stanowią heterogenną populację cząsteczek o średniej wielkości równej 172,3 ± 14,4 nm oraz dominancie (tj. wartości najczęściej występującej) wynoszącej 138,0 ± 14,7 nm (Rycina 16B, Tabela 24). W analizowanych preparatach, MSC-EVs występują w przedziale wielkości cząstek od 70 do 420 nm, co mieści się w typowym zakresie wielkości EVs opisywanym w literaturze, jako 40-600 nm (212,213), typowym dla frakcji egzosomów i ektosomów. B Stężenie cząstek/ ml 3,5x109 3,0x109 2,5x109 2,0x109 1,5x109 1,0x109 5,0x108 Średnica (nm) Rycina 16. Analiza morfologii oraz rozkładu wielkości MSC-EVs. A. Obraz morfologii powierzchni próbki MSC-EVs wykonany techniką mikroskopii AFM dla rozmiaru skanu 2,0 μm x 2,0 μm (strona lewa). Trójwymiarowa prezentacja obrazu tego samego zdjęcia (strona prawa). Na zdjęciu widoczne są pojedyncze pęcherzyki o zachowanej integralności oraz morfologii. B. Reprezentatywny rozkład wielkości MSC-EVs wykonany techniką TRPS przy użyciu systemu IZON qNano. Tabela 24. Zestawienie średnicy wielkości oraz dominanty wielkości MSC-EVs. Kolumna druga przedstawia wartości średnicy wielkości dla trzech wybranych preparatów MSC-EVs oraz średnią ± SD z tych pomiarów. W kolumnie trzeciej przedstawiono dominantę (wartość modalną) dla badanych preparatów oraz średnią dominantę ± SD. N= 3. Średnia wielkość [nm] Dominanta [nm] Preparat 1 189 154 Preparat 2 164 135 Preparat 3 164 125 Średnia ± SD 172,3 ± 14,4 138,0 ± 14,7 Podsumowując, dzięki przeprowadzonym badaniom potwierdzono, że wyizolowane preparaty zawierają kuliste, integralne nanocząstki o średnicy wielkości charakterystycznej dla EVs i wynoszącej 172,3 ± 14,4 nm. Wyizolowane preparaty MSC-EVs stosowano w dalszych badaniach. 4.4. Charakterystyka MSC-EVs na podstawie obecności markerów EVs Wykorzystana w niniejszej pracy metoda izolacji EVs na drodze sekwencyjnego wirowania, umożliwia otrzymywanie preparatów heterogennych, które zawierają większe ektosomy oraz mniejsze egzosomy. Zgodnie z aktualnie dostępną literaturą, nanocząstki te mogą posiadać markery charakterystyczne dla nich, dzięki którym możliwa jest identyfikacja w/w frakcji EVs (166). W związku z tym, zgodnie z zaleceniami towarzystwa ISEV (166), poza analizą rozkładu wielkości i morfologii EVs, wskazane jest zbadanie występowania w otrzymanych preparatach wybranych markerów, które jednoznacznie pozwolą zidentyfikować obecność EVs w otrzymanych próbkach. W związku z powyższym, w celu oceny obecności oraz heterogenności MSC-EVs w izolowanych preparatach, wykonano analizę metodą Western blot w celu identyfikacji obecności synteniny-1 i tetraspaniny CD9 (markery EVs) oraz kalneksyny (marker negatywny) w próbkach, z zastosowaniem specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko w/w białkom. Otrzymane wyniki badań wykazały, że MSC-EVs - w przeciwieństwie do samych komórek MSCs, nie zawierają kalneksyny, która jest białkiem integralnym retikulum endoplazmatycznego (Rycina 17). Praparaty MSC-EVs były natomiast wzbogacone w synteninę-1 - białko występujące w cytoplaźmie, które może wiązać się z błoną komórkową i które wskazuje się także, jako białko odróżniające preparaty EVs od lizatów całych komórek (166). kalneksyna syntenina-1 CD9 β-aktyna β-aktyna β-aktyna Rycina 17. Porównanie występowania wybranych białek w preparatach MSC-EVs oraz komórkach MSCs metodą Western blot. Analizowano występowanie białka błonowego-tetraspaniny CD9 oraz białka cytoplazmatycznego - synteniny-1, jak również białka występującego w retikulum endoplazmatycznym - kalneksyny w preparatach MSC-EVs oraz komórkach MSCs. W analizie zastosowano kontrolę endogenną - białko β-aktynę. Marker charakterystyczny dla egzosomów (tetraspanina CD9) był również obecny we frakcjach MSC-EVs stosowanych w badaniach, co świadczy o wzbogaceniu frakcji MSC-EVs w egzosomy. W wykonanej analizie, została wykorzystana kontrola endogenna -β- aktyna, która jest białkiem cytoszkieletu powszechnie występującym w komórkach oraz oznaczanym podczas analiz Western blot. Warto podkreślić jednak, że β- aktyna występowała w próbkach z komórek MSCs oraz w bardzo niskim stopniu w samych MSC-EVs, co utrudnia proces standaryzacji i jest problemem ogólnie znanym w badaniach EVs. Jak dotąd, nie wyznaczono uniwersalnej kontroli endogennej dla próbek EVs, dlatego tego typu analizy normalizuje się w przypadku analiz Western blot - stosując tę samą wyjściową ilość białka. W dalszym etapie, we współpracy z dr hab. Sylwią Kędracką-Krok z Zakładu Biochemii Fizycznej, Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, wykonano globalną analizę proteomiczną preparatów MSC-EVs oraz komórek MSCs, w celu identyfikacji białek wzbogaconych we frakcji MSC-EVs. Otrzymane wyniki badań proteomicznych odnoszących się do próbek MSC-EVs, w pierwszej kolejności analizowano pod kątem obecności markerów białkowych najczęściej występujących w egzosomach, które identyfikowano m.in. dzięki ich obecności w bazie danych dedykowanych składowi molekularnemu EVs - ExoCarta (http://exocarta.org). Baza ta stanowi swoiste kompendium wiedzy na temat bioaktywnej zawartości egzosomów (143). Wykazano, że w badanych preparatach MSC-EVs występują 82 białka często identyfikowane w egzosomach (Tabela 25), co świadczy o wzbogaceniu tych preparatów we frakcję egzosomalną. W przeprowadzonej analizie potwierdzono występowanie w preparatach MSC-EVs m.in. następujących grup białek wskazywanych przez ISEV, jako istotne w identyfikacji EVs:  białek transbłonowych z grupy tetraspanin – w tym teraspaniny CD9, CD63, CD81;  białek cytoplazmatycznych wiążących się do błony komórkowej – w tym m.in. synteniny-1, aneksyny A1, A6, A11;  białek pozakomórkowych związanych z błoną komórkową – w tym m.in. fibronektyny. W Tabeli 25 zamieszczono listę 100 białek najczęściej występujących w egzosomach opublikowaną na stronie ExoCarta z zaznaczeniem ich występowania w preparatach MSC-EVs. Tabela 25. Lista 100 białek często identyfikowanych w egzosomach opublikowanych na stronie ExoCarta oraz ich występowanie w preparatach MSC-EVs. Plus (+) oznacza występowanie danego białka, natomiast (-) oznacza brak białka w badanych preparatach MSC-EVs. Do badania wykorzystano dane otrzymane z globalnej analizy proteomicznej MSC-EVs. L.p. Symbol genu kodującego białko Kod UniProtKB Nazwa białka Występowanie w MSC-EVs 1 CD9 P40240 Antygen CD9 (ang. CD9 antigen) + 2 HSPA8 P63017 Białko szoku cieplnego HSPA8 71 kDa (ang. Heat shock 71 kDa protein 8 ) + 3 PDCD6IP Q9WU78 Białko oddziałujące z białkiem programowanej śmierci komórki-6 (ang. Programmed cell death 6-interacting protein) - 4 GAPDH P16858 Dehydrogenaza gliceraldehydo-3fosforanowa (ang. glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase) - 5 ACTB P60710 Aktyna, izoforma cytoplazmatyczna 1 (ang. Actin, cytoplasmic 1) + 6 ANXA2 P07356 Aneksyna A2 (ang. Annexin A2) + 7 CD63 P41731 Antygen CD63 (ang. CD63 antigen) + 8 SDCBP O08992 Syntenina-1 (ang. Syntenin-1) + 9 ENO1 P17182 α-enolaza (ang. α-enolase) + 10 HSP90AA1 P07901 Białko szoku cieplnego HSP 90α (ang. Heat shock protein HSP 90α) + 11 TSG101 Q61187 Białko Tsg101- Białko genu 101 podatności na nowotwory (ang. Tumor susceptibility gene 101 protein) + 12 PKM P52480 Kinaza pirogronianowa PKM (ang. Pyruvate kinase PKM) + 13 LDHA P06151 Dehydrogenaza L- mleczanowa łańcuch α (ang. L-lactate dehydrogenase α chain) + 14 EEF1A1 P10126 Czynnik elongacyjny 1-α 1 (ang. Elongation factor 1-α 1) + 15 YWHAZ P63101 Białko 14-3-3 ζ/δ (ang. 14-3-3 protein ζ/δ) + 16 PGK1 P09411 Kinaza fosfoglicerynianowa 1 (ang. Phosphoglycerate kinase 1) + 17 EEF2 P58252 Czynnik elongacyjny 2 (ang. Elongation factor 2) + 18 ALDOA P05064 Aldolaza fruktozo-bisfosforanowa A (ang. Fructose-bisphosphate aldolase A) + 19 HSP90AB1 P11499 Białko szoku cieplnego HSP90 β (ang. Heat shock protein HSP 90-β) + 20 ANXA5 P48036 Aneksyna A5 (ang. Annexin A5) + 21 FASN P19096 Syntaza kwasów tłuszczowych (ang. Fatty acid synthase) + 22 YWHAE P62259 Białko 14-3-3 ε (ang. 14-3-3 protein ε) + 23 CLTC Q68FD5 Klatryna łańcuch ciężki 1 (ang. Clathrin heavy chain 1) + 24 CD81 P35762 Antygen CD81 (ang. CD81 antigen) + 25 ALB P07724 Albumina surowicza (ang. Serum albumin) + 26 VCP Q01853 ATPaza przejściowej formy retikulum endoplazmatycznego (ang. Transitional endoplasmic reticulum ATPase) + 27 TPI1 P17751 Izomeraza tri-fosforanowa (ang. Triosephosphate isomerase) + 28 PPIA P17742 Izomeraza cis/trans peptydylo- prolinowa A (ang. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A) + 29 MSN P26041 Moezyna (ang. Moesin) + 30 CFL1 P18760 Kofilina 1 (ang. Cofilin-1) + 31 PRDX1 P35700 Peroksyredoksyna 1 (ang. Peroxiredoxin-1) + 32 PFN1 P62962 Profilina 1 (ang. Profilin-1) + 33 RAP1B Q99JI6 Białko Rap-1b związane z białkami Ras (ang. Ras-related protein Rap-1b) + 34 ITGB1 P09055 Integryna β-1 (ang. Integrin β-1) + 35 HSPA5 P20029 Chaperon BiP retikulum endoplazmatycznego (ang. Endoplasmic reticulum chaperone BiP) - 36 SLC3A2 P10852 Łańcuch ciężki antygenu powierzchniowego 4F2 (ang. 4F2 cell-surface antigen heavy chain) + 37 HIST1H4A P62806 Histon H4 (kodowany przez gen HIST1H4A; ang. Histone H4) + 38 GNB2 P62880 Podjednostka β-2 białka G(I)/G(S)/G(T) wiążącego nukleotyd guaniny (ang. Guanine nucleotide-binding protein subunit β-2) + 39 ATP1A1 Q8VDN2 Podjednostka α-1 ATPazy transportująca sód/ potas (ang. Sodium/potassiumtransporting ATPase subunit α-1) + 40 YWHAQ P68254 Białko 14-3-3 ϑ (ang. 14-3-3 protein ϑ) + 41 FLOT1 O08917 Flotylina 1 (ang. Flotillin-1) + 42 FLNA Q8BTM8 Filamina-A (ang. Filamin-A) + 43 CLIC1 Q9Z1Q5 Wewnątrzkomórkowe białko 1 kanału chlorkowego (ang. Chloride intracellular channel protein 1) + 44 CDC42 P60766 Homolog białka 42 kontrolującego podział komórki (ang. Cell division control protein 42 homolog) + 45 CCT2 P80314 Podjednostka β białka 1 kompleksu T (ang. T-complex protein 1 subunit beta) + 46 A2M Q6GQT1 α-2-makroglobulina-P (ang. α-2macroglobulin-P) + 47 YWHAG P61982 Białko 14-3-3 γ (ang. 14-3-3 protein γ) + 48 TUBA1B P05213 Łańcuch 1B tubuliny α (ang. Tubulin α-1B chain) - 49 RAC1 P63001 Substrat 1 toksyny botulinowej C3 + spokrewnionej z białkiem Ras (ang. Rasrelated C3 botulinum toxin substrate 1) 50 LGALS3B P Q07797 Białko wiążące galektynę-3 (ang. Galectin3-binding protein) + 51 HSPA1A Q61696 Białko szoku cieplnego HSP1A 70 kDa (ang. Heat shock 70 kDa protein 1A) + 52 GNAI2 P08752 Podjednostka alfa 2 białka G(i) wiążącego nukleotyd guaniny (ang. Guanine nucleotide-binding protein G(i) subunit alpha-2) + 53 ANXA1 P10107 Aneksyna A1 (ang. Annexin A1) + 54 RHOA Q9QUI0 Transformujące białko RhoA (ang. Transforming protein RhoA) - 55 MFGE8 P21956 Laktadheryna (ang. Lactadherin) + 56 PRDX2 Q61171 Peroksyredoksyna 2 (ang. Peroxiredoxin-2) - 57 GDI2 Q61598 Inhibitor beta dysocjacji białka Rab GDP (ang. Rab GDP dissociation inhibitor beta) + 58 EHD4 Q9EQP2 Białko 4 zawierające domenę EH (ang. EH domain-containing protein 4) + 59 ACTN4 P57780 α-aktynina-4 (ang. α-actinin-4) + 60 YWHAB Q9CQV8 Białko 14-3-3 α/β (ang. 14-3-3 protein α/β) - 61 RAB7A P51150 Białko Rab-7a związane z białkami Ras (ang. Ras-related protein Rab-7a) + 62 LDHB P16125 Dehydrogenaza L- mleczanowa łańcuch B (ang. L-lactate dehydrogenase B chain) + 63 GNAS P63094 Krótka izoforma podjednostki alfa białka G(s) wiążącego nukleotyd guaniny (ang. Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha isoform short) - 64 TFRC Q62351 Białko 1 receptora dla transferyny (ang. Transferrin receptor protein 1) + 65 RAB5C P35278 Białko Rab-5c związane z białkami Ras (ang. Ras-related protein Rab-5C) - 66 ARF1 P84078 Czynnik 1 ADP-rybozylacji (ang. ADPribosylation factor 1) - 67 ANXA6 P14824 Aneksyna A6 (ang. Annexin A6) + 68 ANXA11 P97384 Aneksyna A11 (ang. Annexin A11) + 69 ACTG1 P63260 Aktyna, izoforma cytoplazmatyczna 2 (ang. Actin, cytoplasmic 2) - 70 KPNB1 P70168 Podjednostka β-1 importyny (ang. Importin subunit β-1) + 71 EZR P26040 Ezryna (ang. Ezrin) + 72 ANXA4 P97429 Aneksyna A4 (ang. Annexin A4) + 73 ACLY Q91V92 Syntaza cytrynianowa ATP (ang. ATPcitrate synthase) + 74 TUBA1C P68373 Łańcuch 1C tubuliny α (ang. Tubulin α-1C chain) - 75 RAB14 Q91V41 Białko Rab-14 związane z białkami Ras (ang. Ras-related protein Rab-14) + 76 HIST2H4A P62806 Histon H4 (kodowany przez gen HIST2H4A; ang. Histone H4) + 77 GNB1 P62874 Podjednostka β-1 białka G(I)/G(S)/G(T) + wiążącego nukleotyd guaniny (ang. Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit β-1) 78 UBA1 Q02053 Enzym 1 aktywujący modyfikator podobny do ubikwityny (ang. Ubiquitin-like modifieractivating enzyme 1) + 79 THBS1 P35441 Trombospondyna-1 (ang. Thrombospondin1) - 80 RAN P62827 Białko jądrowe Ran wiążące GTP (ang. GTP-binding nuclear protein Ran) + 81 RAB5A Q9CQD1 Białko Rab-5A związane z białkami Ras (ang. Ras-related protein Rab-5A) + 82 PTGFRN Q9WV91 Negatywny regulator receptora prostaglandyny F2 (ang. Prostaglandin F2 receptor negative regulator) + 83 CCT5 P80316 Podjednostka ε białka 1 kompleksu T (ang. T-complex protein 1 subunit ε) + 84 CCT3 P80318 Podjednostka γ białka 1 kompleksu T (ang. T-complex protein 1 subunit γ) + 85 BSG P18572 Basigina (ang. Basigin) + 86 AHCY P50247 Adenosylhomocysteinaza (ang. Adenosylhomocysteinase) + 87 RAB5B P61021 Białko Rab-5B związane z białkami Ras (ang. Ras-related protein Rab-5B) - 88 RAB1A P62821 Białko Rab-1A związane z białkami Ras (ang. Ras-related protein Rab-1A) - 89 LAMP2 P17047 Glikoproteina błonowa 2 związana z lizosomem (ang. Lysosome-associated membrane glycoprotein 2) + 90 ITGA6 Q61739 Integryna α-6 (ang. Integrin α-6) + 91 HIST1H4B P62806 Histon H4 (kodowany przez gen HIST1H4B; ang. Histone H4) + 92 GSN P13020 Żelzolina (ang. Gelsolin) + 93 FN1 P11276 Fibronektyna (ang. Fibronectin) + 94 YWHAH P68510 Białko 14-3-3 η (ang. 14-3-3 protein η) + 95 TUBA1A P68369 Łańcuch 1A tubuliny α (ang. Tubulin α-1A chain) - 96 TKT P40142 Transketolaza (ang. Transketolase) + 97 TCP1 P11983 Podjednostka α białka 1 kompleksu T (ang. T-complex protein 1 subunit α) + 98 STOM P54116 Integralne białko błonowe pasma 7 erytrocytów (ang. Erythrocyte band 7 integral membrane protein) + 99 SLC16A1 P53986 Transporter monokarboksylowy 1 (ang. Monocarboxylate transporter 1) - 100 RAB8A P55258 Białko Rab-8A związane z białkami Ras (ang. Ras-related protein Rab-8A) - Całkowita liczba białek zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs 82 Przeprowadzone badania proteomiczne potwierdziły, że wyizolowane preparaty MSC-EVs zawierają białka typowe dla egzosomów, a zatem wykazują wzbogacenie we frakcję egzosomów. W dalszym etapie, preparaty MSC-EVs poddano wieloparametrowej analizie cytometrycznej w celu określenia występowania na ich powierzchni wybranych markerów błonowych komórek MSCs - identyfikujących zatem w szczególności frakcję ektosomów (CD29, CD44, CD90, CD105, Sca-1). Zbadano również obecność wybranych ligandów dla aktywowanego śródbłonka naczyniowego (CD11a/CD18, CD15, CD49d, CD162) oraz receptora dla czynnika proangiogennego VEGF (CD309), co miało istotne znaczenie dla interpretacji badań przeprowadzonych w dalszej części pracy, a związanych z aktywnością proangiogenną badanych MSC-EVs. Analizę cytometryczną przeprowadzono przy użyciu wysokorozdzielczego cytometru przepływowego (A50-Micro, Apogee Flow Systems) dedykowanego do analizy nanocząstek. Wykazano, że MSC-EVs posiadają na swojej powierzchni następujące antygeny powierzchniowe: CD29, CD44, CD81, CD90, CD309 oraz Sca-1 (Rycina 18) oraz nie potwierdzono występowania pozostałych badanych antygenów - w/w czterech molekuł będących ligandami dla antygenów występujących na powierzchni aktywowanego śródbłonka naczyniowego. Pomimo tego, że nie wykazano obecności w/w ligandów aktywowanego śródbłonka naczyniowego, nie można wykluczyć, że na powierzchni MSC-EVs występują inne cząsteczki biorące udział w oddziaływaniu z komórkami docelowymi, w tym ze śródbłonkiem naczyniowym. Na Rycinie 18 przedstawiono wyłącznie markery występujące na powierzchni cząsteczek MSC-EVs. Wykorzystanie syntetycznych kulek kalibracyjnych pozwoliło potwierdzićśrednią wielkość MSC-EVs zmierzoną przy użyciu systemu IZON qNano i wynoszącą ok. 180 nm. Ze względu na fakt, że niektóre izotypy przeciwciał mogą niespecyficznie wiązać się z antygenami, od wartości procentowej ekspresji danego antygenu odjęto wartości procentowe otrzymane dla odpowiedniej kontroli izotypowej skoniugowanej z fluorochromem, z którym skoniugowane było przeciwciało. Najwyższy odsetek MSC-EVs pozytywnych po względem badanego białka powierzchniowego obserwowano dla antygenów Sca-1 (17,3 ± 0,6%) oraz CD90 (17,2 ± 1,3%) (Rycina 18B). W następnym kroku wykonano analizę MSC-EVs przy użyciu cytometru obrazowego ImageStreamX Mark II, która potwierdziła występowanie na powierzchni MSC-EVs badanych antygenów (Rycina 18C). A Kulki Kontrola Kontrola kalibracyjne APCAlx 488 APCAPC APC MALS MALS IgG2a IgG2b Arm. Ham. IgG APC MALS MALS MALS MALS CD29 CD44 CD81 BC Rycina 18. Analiza wybranych antygenów charakterystycznych dla egzosomów oraz ektosomów pochodzących z komórek MSCs w preparatach MSC-EVs. A. Reprezentatywne dot-ploty z analizy ekspresji wybranych antygenów na powierzchni MSC-EVs z zastosowaniem wysokorozdzielczej cytometrii przepływowej dedykowanej do analizy małych obiektów. Na wykresie kontrolnym przedstawiono rozkład wielkości cząsteczek uzyskany przy zastosowaniu mieszaniny syntetycznych kulek kalibracyjnych - polistyrenowych (110 nm, 500 nm) silikonowych (180 nm, 240 nm, 300 nm, 590 nm, 880 nm, 1300 nm). Wykresy przedstawiają zależność intensywności fluorescencji zbieranej w danym kanale fluorescencyjnym (Alx 488 lub APC) i rozproszenia światła MALS (ang. middle angle light scatter), którego wartość koreluje z wielkością badanych cząstek. Do analizy wzięto wyłącznie integralne pęcherzyki zawierające RNA - identyfikowane dzięki barwieniu odczynnikiem RNASelect. Odsetek obiektów pozytywnych pod względem ekspresji danego antygenu powierzchniowego mierzono w odniesieniu do próbek niebarwionych (kontrole) zbieranych w kanałach Alx 488 oraz APC. Dla każdego przeciwciała wykonano odpowiednie kontrole izotypowe. B. Ocena ilościowa ekspresji wybranych antygenów na powierzchni MSC-EVs. Od wartości procentowej ekspresji danego antygenu odejmowano wartość procentową otrzymaną dla odpowiedniej kontroli izotypowej, a następnie przedstawiono na wykresie, jako wartości średnie ± SD. N=3. C. Ocena jakościowa ekspresji wybranych antygenów na powierzchni MSC-EVs przenoszących RNA (wybarwionych barwnikiem SYTO RNASelect, zielony) z zastosowaniem cytometru obrazowego Image Stream X Mark II (Merck). Podsumowując, przeprowadzone badania potwierdziły wzbogacenie badanych preparatów MSC-EVs stosowanych dalej w niniejszej pracy – zarówno we frakcję ektosomów, jak i egzosomów, potwierdzając ich heterogenność subpopulacyjną, jak również skuteczność samych metod ich izolacji, zastosowanych w pracy. 4.5. Charakterystyka bioaktywnej zawartości molekularnej przenoszonej przez MSC-EVs Jak wspomniano we wstępie pracy, wyniki badańświatowych wskazują, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą przenosić bioaktywne cząsteczki takie jak: białka, receptory, mRNA, miRNA oraz lipidy, dzięki czemu mogą odgrywać istotną rolę w komunikacji międzykomórkowej (105,214). W związku z tym, w celu określenia biologicznej zawartości przenoszonej przez MSC-EVs, w dalszej części niniejszej pracy wykonano pogłębioną globalną analizę proteomiczną oraz analizę obecności cząsteczek miRNA oraz wybranych transkryptów mRNA w badanych preparatach MSC-EVs. 4.5.1. Globalna analiza proteomiczna MSC-EVs Globalną analizę proteomiczną komórek MSCs oraz MSC-EVs wykonano metodą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (ang. liquid chromatographytandem mass spectrometry, LC-MS/MS), w celu identyfikacji jak największej liczby białek obecnych przede wszystkim w preparatach MSC-EVs, jak również w komórkach wyjściowych MSCs. W przypadku próbek komórek MSCs, zidentyfikowano w sumie 6487 białek, natomiast w przypadku preparatów MSC-EVs -2242 białka. Liczby białek zidentyfikowane w poszczególnych powtórzeniach biologicznych (N=3) komórek MSCs oraz próbek MSC-EVs były zbliżone. W dalszej analizie, w przynajmniej dwóch (na trzy) analizowanych próbkach, na podstawie dwóch lub więcej unikalnych peptydów, zidentyfikowano 3920 białek wspólnych w komórkach MSCs oraz 818 białek wspólnych w próbkach MSC-EVs. Co więcej, w komórkach MSCs zidentyfikowano 2893 białka różnicowe, czyli takie, które nie występowały (lub były poniżej progu detekcji metody) w próbkach MSC-EVs. Natomiast w próbkach MSC-EVs zidentyfikowano 135 białek (wymienionych w Załączniku, p. 8.1. Tabele, Tabela V), które z kolei były poniżej poziomu detekcji w komórkach MSCs, co świadczy o ich szczególnym wzbogaceniu w badanych pęcherzykach (Tabela 26). Tabela 26. Wyniki globalnej analizy proteomicznej komórek MSCs oraz MSC-EVs z wyszczególnieniem danych dotyczących grup eksperymentalnych i poszczególnych powtórzeń biologicznych. Nazwa grupy/ Nr powt. Suma wszystkich zidentyfikowa -nych białek w grupie Liczba zidentyfikowa -nych białek w grupie Liczba białek zidentyfikowanych na podstawie 2 ≤ peptydów Liczba białek wspólnych w danej grupie, tzn.: zidentyfikowanych w przynajmniej 2 z 3 próbek na podstawie 2 ≤ unikalnych peptydów Liczba białek różnicowych (występujących głównie w badanej grupie) MSCs 1 6487 5577 4248 3920 2893 2 5702 4290 3 5314 3921 MSC-EVs 1 2242 1776 1047 818 135 2 1552 687 3 1570 879 Grupy białek zidentyfikowane w większości próbek (przynajmniej w dwóch próbkach na trzy) i w oparciu o kilka unikalnych peptydów ( 2) uwzględniano w kolejnych analizach. W dalszym etapie, przy użyciu aplikacji Gene Ontology (GO) - służącej do globalnych analiz bioinformatycznych danych proteomicznych, obie pule wspólnych białek wykrytych w komórkach MSCs oraz w preparatach MSC-EVs porównano między sobą. Aplikacja GO umożliwia funkcjonalny podział na następujące trzy grupy białek zaangażowanych w: procesy biologiczne, pełniących funkcje molekularne oraz będących składnikami komórkowymi. W pierwszej kolejności, skupiono się na białkach wspólnych w danej grupie, które są zaangażowane w procesy biologiczne. Wśród najbardziej istotnych grup białek zidentyfikowanych zarówno w komórkach MSCs, jak i próbkach MSC-EVs należą białka uczestniczące i odpowiedzialne za: komunikację międzykomórkową i przekazywanie sygnałów, rozwój organizmów wielokomórkowych i struktur anatomicznych, odpowiedź na bodźce chemiczne, metabolizm białek oraz odpowiedź na uszkodzenie (Rycina 19A). Co interesujące, odsetek białek należących do wymienionych grup był wyższy w preparatach MSC-EVs niż w samych komórkach MSCs. Z kolei komórki MSCs wykazują wzbogacenie w białka zaangażowane i odpowiedzialne za: transkrypcję i jej regulację, metabolizm RNA, mRNA i cząstek zawierających nukleotydy (Rycina 19A). Analogiczną analizę wykonano dla białek różnicowych, czyli takich które zidentyfikowano w próbkach tylko jednej grupy (tj. tylko w komórkach MSCs lub tylko w MSC-EVs). Wykazano, że białka różnicowe zidentyfikowane w próbkach MSC-EVs, a zatem szczególnie w nich zagęszczone, mogą być zaangażowane w podobne procesy biologiczne, jak opisano w przypadku białek wspólnych, tj. w komunikację międzykomórkową i przekazywanie sygnałów, adhezję komórek, rozwój organizmów wielokomórkowych i rozwój struktur anatomicznych, a także w odpowiedź na stres komórkowy oraz gojenie się ran/ uszkodzeń (Rycina 19B). Co istotne, MSC-EVs zawierają wyższy odsetek białek wspólnych i różnicowych zaangażowanych w adhezję komórkową, niż komórki MSCs (11,9% vs. 4,4% w przypadku białek wspólnych oraz 16,3% vs. 2,4% w przypadku białek różnicowych), co może korzystanie wpływać na oddziaływanie MSC-EVs z komórkami akceptorowymi (Rycina 19A, B; Załącznik, p. 8.1. Tabele, Tabela I). Dodatkowo, wzbogacenie MSC-EVs w białka zaangażowane w rozwój struktur anatomicznych i organizmu wielokomórkowego (wynoszący powyżej 20% białek wszystkich białek GO należących do tej grupy) może świadczyć o potencjalnym zaangażowaniu tych cząsteczek w procesy regeneracji tkanek i narządów, w tym proces angiogenezy i kardiomiogenezy, co badano w tej pracy. W związku z tym, uzasadnione było w mojej ocenie, przeprowadzenie dalszej szczegółowej analizy bioinformatycznej białek występujących w MSC-EVs, co wykonano w kolejnej części pracy. Procesy biologiczne A Białka wspólne komórek MSCs oraz MSC-EVs 35 MSCs 30 MSC-EVs 25 20 15 10 5 0 Zawartość białek [%] Zawartość białek [%] B Białka różnicowe komórek MSCs oraz MSC-EVs 35 MSCs 30 MSC-EVs 25 20 15 10 5 0 Rycina 19. Analiza białek zaangażowanych w wybrane procesy biologiczne w komórkach MSCs oraz MSC-EVs wykonana przy pomocy aplikacji Gene Ontology. A. Porównanie zawartości procentowej białek wspólnych dla danej grupy. B. Porównanie zawartości procentowej białek różnicowych - tj. białek, które zostały zidentyfikowane we próbkach jednej grupy i w żadnej próbce drugiej grupy. Do analizy wykorzystano wyłącznie białka zidentyfikowane w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Na osi X przedstawiono poszczególne kategorie procesów biologicznych, natomiast na osi Y- procent białek zaklasyfikowanych do danej kategorii GO zidentyfikowanych w analizowanym zestawie danych.   W dalszym etapie wykazano, że 24,6% białek wspólnych zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs przyporządkowanych według składnika komórkowego stanowią białka związane z błoną komórkową, 7,6% białek stanowią białka macierzy pozakomórkowej, natomiast 14,6% białek stanowią białka cytoplazmatyczne (Rycina 20A). Biorąc pod uwagę białka różnicowe obecne w MSC-EVs wykazano, że 23,0% tych białek stanowią białka związane z błoną cytoplazmatyczną, natomiast 30,4% białek stanowią białka macierzy pozakomórkowej (Rycina 20B). W przypadku białek wspólnych w komórkach MSCs dominują białka występujące w przestrzeni jądra komórkowego, błonach organelli wewnątrzkomórkowych oraz białka mitochondrialne, natomiast w przypadku białek różnicowych znaczny odsetek stanowią białka jądra komórkowego i mitochondrium (Rycina 20A, B). Białka różnicowe zidentyfikowane w komórkach MSCs oraz preparatach MSC-EVs potwierdzają występowanie w otrzymanych preparatach EVs, jednoznacznie odróżniając je od komórek MSCs na podstawie składu białkowego. Spośród białek wspólnych występujących w MSC-EVs, 24,9% zaklasyfikowano zgodnie z funkcją molekularną, jako białka wiążące jony, w tym także konkretne kationy oraz jony metali. Analogiczne wyniki otrzymano dla białek różnicowych występujących w MSC-EVs, w których 37,0% zidentyfikowanych białek wykazuje zdolność do wiązania jonów, w tym jonów metali i kationów (Rycina 21A, B). Dodatkowo, wśród białek wspólnych oraz różnicowych zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs, występują białka wiążące receptory, co może wpływać na ich zdolność do wiązania się do komórek docelowych, a tym samym wpływać na funkcje tych komórek, co było przedmiotem badań opisanych w dalszej części pracy. Składnik komórkowy A Białka wspólne komórek MSCs oraz MSC-EVs 35 MSCs 30 MSC-EVs 25 20 15 10 5 0 B Białka różnicowe komórek MSCs oraz MSC-EVs 35 MSCs 30 MSC-EVs 25 20 15 10 5 0 Zawartość białek [%] Zawartość białek [%] Rycina 20. Analiza białek zidentyfikowanych, jako składnik komórkowy w komórkach MSCs oraz MSC-EVs wykonana przy pomocy aplikacji Gene Ontology (GO). A. Porównanie zawartości procentowej białek wspólnych dla danej grupy. B. Porównanie zawartości procentowej białek różnicowych - białek, które zostały zidentyfikowane we próbkach jednej grupy i w żadnej próbce drugiej grupy. Do analizy wykorzystano wyłącznie białka zidentyfikowane w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Na osi X przedstawiono poszczególne kategorie składnika komórkowego, natomiast na osi Y- procent białek zaklasyfikowanych do danej kategorii GO zidentyfikowanych w analizowanym zestawie danych. Funkcje molekularne Zawartość białek [%] Zawartość białek [%] A Białka wspólne komórek MSCs oraz MSC-EVs 40 MSCs 35 MSC-EVs 30 25 20 15 10 5 0 B Białka różnicowe komórek MSCs oraz MSC-EVs 40 MSCs 35 MSC-EVs 30 25 20 15 10 5 0 Rycina 21. Analiza białek zaangażowanych w wybrane funkcje molekularne. Białka zidentyfikowane w komórkach MSCs oraz MSC-EVs. Analiza wykonana przy pomocy aplikacji Gene Ontology (GO). A. Porównanie zawartości procentowej białek wspólnych dla danej grupy. B. Porównanie zawartości procentowej białek różnicowych- białek, które zostały zidentyfikowane w próbkach jednej grupy i w żadnej próbce drugiej grupy. Do analizy wykorzystano wyłącznie białka zidentyfikowane we wszystkich analizowanych próbkach (powtórzeniach biologicznych) lub w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Na osi X przedstawiono poszczególne kategorie funkcji molekularnych, natomiast na osi Y- procent białek zaklasyfikowanych do danej kategorii GO zidentyfikowanych w analizowanym zestawie danych. Podsumowując, powyższa analiza porównawcza danych proteomicznych próbek komórek MSCs oraz preparatów MSC-EVs wykazała, że MSC-EVs mogą być zaangażowane w regenerację uszkodzonych tkanek ze względu na wzbogacenie w następujące grupy białek zaangażowanych w: odpowiedź na uszkodzenie i bodźce chemiczne, gojenie się ran/ uszkodzeń, rozwój struktur anatomicznych i organów, przekazywanie sygnałów oraz komunikację międzykomórkową. W celu potwierdzenia postawionej hipotezy, wykonano szczegółową analizę bioinformatyczną białek zidentyfikowanych w MSC-EVs (w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie dwóch lub więcej unikalnych peptydów dla danego białka) przy użyciu aplikacji GO z klasyfikacją białek według modułu Panther Pathways. Przeprowadzona analiza bioinformatyczna wykazała m.in., że białka zidentyfikowane w MSC-EVs mogą być zaangażowane w szereg szklaków, takich jak: sygnałowanie od receptora EGF oraz FGF (ang. EGF receptor signaling; FGF signaling), angiogenezę (ang. angiogenesis), sygnałowanie od czynników VEGF i PDGF (ang. VEGF signaling, PDGF signaling), jak również w sygnałowanie integrynowe (ang. integrin signalling) i stan zapalny (ang. inflammation) (Rycina 22). Wszystkie wymienione szlaki są związane pośrednio i bezpośrednio z procesami angiogenezy, co ma istotne znaczenie w regeneracji, szczególnie tkanek uszkodzonych w wyniku niedotlenienia. Doniesienia literaturowe potwierdzają, że szlaki sygnałowe od receptora dla EGF, FGF oraz PDGF są zaangażowane w proces angiogenezy (190,215). MSC-EVs mogą przenosić molekuły zaangażowane w sygnałowanie od heterotrimerycznych białek G (Rycina 22), natomiast białka G uczestniczą w przekaźnictwe sygnałów od receptorów błonowych z nimi związanych (216). Dodatkowo, MSC-EVs wykazują wzbogacenie w białka zaangażowane w inne szlaki sygnałowania, takie jak m.in.: sygnałowanie pochodzące od białek Ras, poprzez receptory dopaminergiczne, receptory muskarynowe, jak również poprzez kinazy MAP (Rycina 22). Wzbogacenie MSC-EVs w białka zaangażowane w liczne w/w szlaki sygnałowania, może świadczyć o potencjale regeneracyjnym mediowanym przez te nanocząstki, co było przedmiotem badań opisanych w dalszej części pracy. Rycina 22. Analiza białek zidentyfikowanych w MSC-EVs przy użyciu aplikacji GO z modułem Panther Pathways. Analiza wykazała zaangażowanie zidentyfikowanych białek w szlaki związane z angiogenezą, które oznaczono symbolem „#”. Do analizy wykorzystano białka zidentyfikowane w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Dla analizy przyjęto, że współczynnik FDR (ang. False discovery rate) wynosił poniżej 5%. Na osi X przedstawiono poszczególne szlaki sygnałowe wyodrębnione przez GO, natomiast na osi Y- liczbę białek zaklasyfikowanych do danej kategorii GO w analizowanym zestawie danych. Wykorzystana aplikacja GO umożliwia dokładną identyfikację listy białek przyporządkowanych do danej grupy funkcjonalnej bądź strukturalnej GO. W związku z tym, w kolejnym etapie sprawdzono czy występują powiązania pomiędzy białkami zaangażowanymi w adhezję komórek, a także czy powiązania takie występują pomiędzy białkami różnych grup GO, w tym białkami zaangażowanymi w adhezję komórek, gojenie się ran/ uszkodzeń oraz rozwój naczyń krwionośnych. W tym celu do analizy zastosowano aplikację STRING (https://string-db.org/). Przeprowadzona analiza wykazała, że pomiędzy białkami zidentyfikowanymi w MSC-EVs, zaangażowanymi w adhezję komórek (wymienionymi w Załączniku, p. 8.1. 104 Tabele, Tabela I), istnieje wiele udokumentowanych oraz przewidywanych interakcji, natomiast nadrzędnym białkiem będącym pierwszym ogniwem interakcji jest antygen CD44 - będący transbłonową glikoproteiną (217) (Rycina 23). Antygen ten jest nie tylko markerem komórek MSCs, ale może także pośredniczyć w ich oddziaływaniu ze śródbłonkiem naczyniowym poprzez wiązanie się tych komórek do kwasu hialuronowego na powierzchni komórek śródbłonka (218). W centrum interaktomu zidentyfikowane zostały również m.in. β1 integryna (Itgb1), α4 integryna (Itga4), α5 integryna (Itga5), αL integryna (Itgal), fibronektyna (Fn1), które mogą uczestniczyć m.in. w wiązaniu się hematopoetycznych KM do białek zrębu niszy (219). W związku z tym, że pomiędzy białkami zaangażowanymi w adhezję komórek, zidentyfikowanymi w MSC-EVs, istnieje wiele interakcji, w kolejnym etapie prześledzono powiązania pomiędzy białkami zaangażowanymi w adhezję komórek, gojenie się ran/ uszkodzeń oraz rozwój naczyń krwionośnych. Przeprowadzona analiza wykazała, że nadrzędnym białkiem będącym pierwszym ogniwem interakcji zidentyfikowanym dzięki analizie STRING, jest kinaza MAPK14 (Rycina 24). W centrum utworzonego interaktomu wyraźnie wyróżniały się dwie grupy białek: i) związana z adhezją komórek – wśród których występuje m.in. β1 integryna (Itgb1), α4 integryna (Itga4), fibronektyna (Fn1), oraz ii) związana ze szlakami sygnałowania oraz adhezją komórek – wśród których występuje m.in. kinaza białkowa 14 aktywowana mitogenem (Mapk14), kinaza białkowa 1 aktywowana mitogenem (Mapk1), winkulina (Vcl), białkowa kinaza tyrozynowa 2β (Ptk2b), antygen CD44 oraz aneksyna A5 (Anxa5). Przeprowadzona analiza wykazała wiele udokumentowanych oraz przewidywanych oddziaływań pomiędzy w/w białkami, co wzmacnia wcześniej postawioną hipotezę zakładającą, że MSC-EVs mogą modulować procesy regeneracji uszkodzonych tkanek poprzez zdolność do adhezji i oddziaływania z komórkami docelowymi. Nadrzędnym celem badawczym realizowanym w ramach niniejszej pracy doktorskiej było uzyskanie odpowiedzi na pytanie czy MSC-EVs przenosząładunek biologiczny, który może stymulować regenerację uszkodzonych tkanek, a w szczególności procesy angiogenezy i kardiomiogenezy. W związku z tym, białka zidentyfikowane w preparatach MSC-EVs, analizowano przy użyciu aplikacji GO pod kątem ich potencjalnej możliwości promowania procesów regeneracji tkanek. W Załączniku, p. 8.1. Tabele, Tabela I wymieniono wszystkie białka, które mogą pośredniczyć w adhezji komórek, a w przypadku MSC-EVs w ich oddziaływaniach z komórkami docelowymi, natomiast w Załączniku, p. 8.1. Tabele, Tabela II i III wymieniono odpowiednio białka, które mogą być zaangażowane w proces angiogenezy i tworzenia nowych naczyń krwionośnych zaklasyfikowanych do tych kategorii procesów biologicznych przy użyciu aplikacji GO. Natomiast Załącznik, p. 8.1. Tabele, Tabela IV zawiera białka związane z proliferacją komórek. Rycina 23. Sieć interakcji pomiędzy białkami zaangażowanymi w adhezję komórek zidentyfikowanymi w MSC-EVs. Czerwoną strzałką zaznaczono pierwsze ogniwo interakcji białko CD44. Liczba linii łączących poszczególne białka koreluje z liczbą interkacji: im większa liczba linii, tym więcej udokumentowanych/ przewidywanych powiązań pomiędzy poszczególnymi białkami. Analizę wykonano przy użyciu aplikacji STRING. Rozwinięcie skrótów białek przedstawionych na interaktomie zamieszczono w Załączniku, p. 8.2. Rozwinięcia skrótów w opisach do Rycin. Czerwona strzałka wskazuje pierwsze ogniwo interakcji - kinazę MAPK14. Pętlą niebieską zaznaczoną grupę białek zaangażowanych w adhezję komórek, pomiędzy którymi istnieją liczne powiązania, natomiast pętla częrwoną – białka zaangażowane w szlaki sygnałowe oraz adhezję komórek o dużej liczbie powiązań pomiędzy poszczególnymi białkami. Analizę wykonano przy użyciu aplikacji STRING. Rozwinięcie skrótów białek przedstawionych na interaktomie zamieszczono w Załączniku, p. 8.2. Rozwinięcia skrótów w opisach do Rycin. Podsumowując, przeprowadzone analizy składu białkowego potwierdzają, że MSC-EVs mogą przenosić liczne białka, pomiędzy którymi istnieje rozbudowana sieć oddziaływań, które mogą promować regenerację niedotlenionych tkanek poprzez oddziaływanie z komórkami docelowymi oraz stymulację procesu tworzenia nowych naczyń krwionośnych. 4.5.2. Analiza transkryptów miRNA i mRNA w komórkach MSCs oraz preparatach MSC-EVs W kolejnym etapie badań, przeprowadzono poszerzoną analizę transkryptów miRNA występujących zarówno w komórkach MSCs oraz MSC-EVs, przy użyciu komercyjnie dostępnych paneli identyfikujących specyficznie kilkaset mysich i szczurzych wariantów miRNA (microRNA Ready-to-Use PCR 384-well plates; Mouse & Rat Panel I+II, V3.M; Exiqon). Analiza wyników przedstawionych na wykresie typu heat map wykazała podobieństwo pomiędzy poszczególnymi próbkami komórek MSCs, jak również pomiędzy próbkami MSC-EVs (Rycina 25). Co istotniejsze, na wykresie widoczne jest także podobieństwo co do składu miRNA pomiędzy dwoma analizowanymi grupami – tj. komórkami MSCs oraz preparatami MSC-EVs. Rycina 25. Globalna analiza transkryptów miRNA w komórkach MSCs oraz MSC-EVs. Różnice kolorystyczne na heat map na określonych wysokościach odzwierciedlają różnice w transkryptach miRNA komórek rodzielskich MSCs oraz MSC-EVs. Analizie poddano 3 próbki komórek MSCs oraz 3 próbki preparatów MSC-EVs. Cząsteczki miRNA, które ulegały amplifikacji w komórkach MSCs oraz MSC-EVs, przedstawiono na wykresie rozproszenia (Rycina 26A), na którym poszczególne punkty odpowiadające określonym miRNA, odnoszą się do numeru cyklu (Ct), w którym produkty ulegają amplifikacji w próbkach MSC-EVs (oś Y) oraz komórkach rodzicielskich (oś X) w czasie reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Rozkład punktów tworzy w większości zależność liniową, co świadczy o podobnej zawartości większości badanych miRNA zarówno w komórkach MSCs, jak i MSC-EVs. W analizie zidentyfikowano 162 cząsteczki miRNA wspólnie występujące w komórkach MSCs oraz w MSC-EVs (Rycina 26B), co świadczy o efektywnym przenoszeniu się większości miRNA z komórek rodzicielskich MSCs do ich pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Przeprowadzona analiza umożliwiła także wytypowanie miRNA, które występują wyłącznie w MSC-EVs (są poniżej progu detekcji w komórkach MSCs, co może świadczyć m.in. o tym, że komórki wykazują tendencję do usuwania tych miRNA poza komórkę), a także miRNA, które występowały wyłącznie w komórkach MSCs (Rycina 26B). Do 10 cząsteczek miRNA unikatowych dla MSC-EVs należą następujące miRNA: 1952, 376a-3p, 182-5p, 668-3p, 1188-5p, 409-5p, 339-3p, 325-3p, 369-3p, 466f-5p, natomiast do 11 cząsteczek miRNA unikatowych dla komórek MSCs należą następujące miRNA: 369-5p, 758-3p, 92b-3p, 671-3p, 466k, 293-3p, 327, 298-5p, 1967, 103-2-5p, 125b-2-3p. W Tabeli 27 przedstawiono listę miRNA, które zidentyfikowano w preparatach MSC-EVs, dla których różnica w ekspresji pomiędzy próbką MSC-EVs, a próbką komórek MSCs wynosiła powyżej 1 cyklu amplifikacji, co świadczy o ich różnym stężeniu w badanych komórkach oraz EVs. Wsród miRNA wzbogaconych, selektywnie pakowanych do MSC-EVs należy m.in. miRNA-182-5p, którego wyciszenie powoduje aktywację proliferacji komórek raka nerkowokomórkowego (220), jak również miRNA-339-3p pełniące rolę inhibitora inwazyjności komórek czerniaka (221), natomiast miRNA-1188 promuje różnicowanie neuronalne komórek MSCs oraz aktywację białka STAT1 (222). Co więcej, zaobserwowano nieznaczne wzbogacenie pęcherzyków MSC-EVs w miRNA-126-3p (Tabela 27), które opisywane jest w literaturze jako miRNA o działaniu proangiogennym (223), co potwierdziły także badania przeprowadzone przez naszą grupę w ramach realizacji innego projektu badawczego. Do ważniejszych miRNA zidentyfikowanych w MSC-EVs należą także: miRNA-132, które hamuje apoptozę i stres oksydacyjny w komórkach miokardium w sytuacji niewydolności serca (224) oraz wzmacnia potencjał proangiogenny komórek śródbłonka (195), a także miRNA-382, którego nadekspresja znacząco zwiększa proliferację komórek śródbłonka, ich migrację oraz tworzenie kapilar (225). Baza miRDB (http://mirdb.org) dostarcza informacji na temat docelowych mRNA dla miRNA. Ze względu na mnogość docelowych mRNA dla wymienionych miRNA, funkcje tych cząstek mogą być inne niż wymienione na podstawie doniesień literaturowych, a także mogą zależeć od działania innych miRNA, które są obecne i aktywne w danym momencie w komórce, co stanowi wyzwanie dla dalszych analiz wyników uzyskanych w niniejszej pracy. A B miR-369-5p miR-1952 miR-758-3p miR-376a-3p miR-92b-3p miR-182-5p miR-671-3p miR-668-3p miR-466k miR-1188-5p miR-293-3p miR-409-5p miR-327 miR-339-3p miR-298-5p miR-325-3p miR-1967 miR-369-3p miR-103-2-5p miR-466f-5p miR-125b-2-3p Rycina 26. Analiza składu miRNA w komórkach MSCs oraz MSC-EVs. A. Wykres rozproszenia (tzw. scatter plot) porównujący ekspresję wszystkich miRNA zidentyfikowanych w komórkach MSCs i MSC-EVs. Punkty wykresu odpowiadają poszczególnym miRNA. Ct- numer cyklu, w którym dany produkt ulega amplifikacji. B. Liczba miRNA zidentyfikowanych w komórkach MSCs oraz MSC-EVs (miRNA wspólne), a także miRNA unikatowych zidentyfikowanych wyłącznie w jednej grupie. Tabela 27. Lista miRNA zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs. Lista zawiera dane przedstawione na wykresie rozproszenia dla których różnica wartości Ct (świadczących pośrednio o koncentracji transkryptów) pomiędzy próbką MSC-EVs a próbką komórek MSCs wynosiła powyżej 1 cyklu amplifikacji (< -1,00). Bardziej ujemna wartość różnicy Ct koreluje z wyższą zawartością danych transkryptów miRNA w preparatch MSC-EVs w odniesieniu do komórek MSCs. Zielonym kolorem zaznaczono miRNA szczególnie istotne z punktu widzenia badań objętych niniejszą pracą doktorską. miRNA Cykl amplifikacji (Ct) Różnica Ct (Y-X) Ct MSCs (X) Ct MSC-EVs (Y) miRNA-1952 40,00 32,11 -7,89 miRNA-376a-3p 40,00 32,31 -7,69 miRNA-182-5p 40,00 32,40 -7,60 miRNA-668-3p 40,00 33,00 -7,00 miRNA-1188-5p 40,00 35,33 -4,67 miRNA-409-5p 40,00 35,72 -4,28 miRNA-339-3p 40,00 36,14 -3,86 miRNA-325-3p 40,00 36,27 -3,73 miRNA-369-3p 40,00 36,39 -3,61 miRNA-382-5p 30,69 27,11 -3,58 miRNA-148b-5p 38,47 35,17 -3,30 miRNA-187-3p 35,82 32,95 -2,87 miRNA-542-5p 35,89 33,09 -2,80 miRNA-344d-3p 36,67 34,03 -2,64 miRNA-344b-3p 36,77 34,30 -2,48 miRNA-409-3p 33,15 30,75 -2,41 miRNA-466f-5p 40,00 37,67 -2,33 miRNA-466f 36,34 34,07 -2,27 miRNA-541-5p 31,17 29,00 -2,18 miRNA-202-3p 37,01 34,87 -2,13 miRNA-761 36,49 34,44 -2,05 miRNA-337-5p 34,31 32,34 -1,97 miRNA-346-5p 38,52 36,56 -1,96 miRNA-433-3p 35,12 33,16 -1,96 miRNA-379-5p 30,19 28,24 -1,95 miRNA-678 38,87 37,00 -1,87 miRNA-543-3p 34,18 32,32 -1,86 miRNA-214-3p 27,90 26,12 -1,78 miRNA-337-3p 34,92 33,18 -1,74 miRNA-669i 36,13 34,41 -1,72 miRNA-2137 29,90 28,23 -1,68 miRNA-411-5p 31,75 30,08 -1,67 miRNA-34c-3p 35,01 33,41 -1,60 miRNA-409a-3p 35,50 33,92 -1,58 miRNA-1951 33,92 32,37 -1,55 miRNA-434-5p 31,35 29,81 -1,54 miRNA-196a-5p 28,10 26,63 -1,47 miRNA-883a-5p 38,93 37,50 -1,43 miRNA-132-3p 30,79 29,36 -1,43 miRNA-106b-3p 34,10 32,70 -1,40 miRNA-127-3p 29,15 27,76 -1,39 miRNA-434-3p 30,89 29,51 -1,38 miRNA-196c-5p 33,30 31,97 -1,33 miRNA-676-3p 32,81 31,49 -1,33 miRNA-126-3p 33,24 31,94 -1,30 miRNA-34b-3p 30,82 29,52 -1,30 miRNA-99b-3p 32,38 31,09 -1,29 miRNA-214-3p 23,28 22,02 -1,26 miRNA-1199-5p 33,82 32,58 -1,25 miRNA-212-3p 32,48 31,24 -1,23 miRNA-871-5p 36,98 35,75 -1,23 miRNA-496a-3p 36,03 34,81 -1,23 miRNA-322-3p 32,75 31,54 -1,21 miRNA-1198-5p 33,60 32,40 -1,20 miRNA-30e-3p 33,75 32,55 -1,20 miRNA-28-3p 32,51 31,33 -1,18 miRNA-10b-5p 35,27 34,11 -1,17 miRNA-574-3p 29,46 28,30 -1,16 miRNA-744-3p 35,02 33,93 -1,09 miRNA-421-3p 33,45 32,38 -1,07 miRNA-134-5p 34,11 33,05 -1,06 miRNA-10b-5p 32,11 31,06 -1,06 let-7b-5p 23,01 21,95 -1,05 miRNA-382-3p 34,20 33,15 -1,04 miRNA-206-3p 31,52 30,50 -1,03 miRNA-30a-3p 33,73 32,72 -1,01 Podsumowując, analiza zawartości miRNA w komórkach rodzicielskich oraz MSC-EVs wykazała przenoszenie cząsteczek miRNA z komórek rodzicielskich do uwalnianych przez nie MSC-EVs. Co więcej, w preparatach MSC-EVs występowały 162 cząsteczki miRNA wspólne dla obu analizowanych grup, jak również miRNA unikatowe dla MSC-EVs, co świadczy o ich szczególnym wzbogaceniu w pęcherzykach. Wśród zidentyfikowanych miRNA znajdowały się cząsteczki potencjalnie istotne z punktu widzenia regulacji procesów towarzyszących regeneracji tkanek uszkodzonych w wyniku niedotlenienia. W kolejnym etapie pracy zbadano amplifikację wybranych transkryptów mRNA obecnych w badanych komórkach MSCs oraz MSC-EVs (Rycina 27). Wykonana analiza wykazała przenoszenie badanych cząsteczek mRNA - zaangażowanych w apoptozę (Bcl-2, Bax-1, Bak-1), angiogenezę (VE-kadheryna, Gata-2) oraz kardiomiogenezę (Gata-4), a także markera komórek MSCs - Mesp-1 - z komórek MSCs do MSC-EVs (Rycina 27). W przypadku genów dla Mesp-1, VE-kadheryny oraz Gata-4, poziom transkryptów w MSC-EVs był porównywalny do poziomu tych transkryptów w komórkach rodzicielskich. W przypadku pozostałych genów transkrypty były obserwowane w niższym stężeniu w pęcherzykach niż w komórkach MSCs, ale wciąż na poziomie wystarczającym do ich detekcji. Podsumowując, przeprowadzona analiza obecności cząsteczek miRNA oraz wybranych transkryptów mRNA wykazała, że MSC-EVs uwalniane przez komórki MSCs mogą zawierać większość tych cząsteczek charakterystycznych dla komórek rodzicielskich, co pozwala przypuszczać, że mogą one także potencjalnie przenosić je do innych komórek docelowych. MSC-EVs Rycina 27. Analiza obecności wybranych mRNA w MSC-EVs. Na wykresie przedstawiono stosunek wartości Ct badanych transkryptów w komórkach MSCs do wartości Ct dla transkryptów w MSC-EVs. Przyjęto, że poziom mRNA dla badanych genów w komórkach MSCs jest równy 1,0. Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, N=3. W związku z powyższym, ze względu na istotne znaczenie biologiczne miRNA oraz innych cząsteczek zidentyfikowanych wewnątrz MSC-EVs, w kolejnym etapie pracy badano wpływ MSC-EVs (przenoszących opisaną bioaktywną zawartość) na komórki docelowe w układzie in vitro. 4.6. Oddziaływanie MSC-EVs z komórkami śródbłonka naczyń serca i ich wpływ na wybrane funkcje komórek in vitro W opisanej powyżej części prac badawczych poświęconej szczegółowej charakterystyce składu molekularnego MSC-EVs, wykazano, że populacja wyizolowanych pęcherzyków z komórek MSCs zawiera zarówno frakcję ektosomów przenoszących antygeny powierzchniowe charakterystyczne dla komórek rodzicielskich, jak również wykazuje wzbogacenie we frakcję egzosomów. Co ważniejsze, MSC-EVs mogą przenosić szereg białek, miRNA i mRNA pochodzących z rodzicielskich komórek MSCs, które to mogą być potencjalnie zaangażowane m.in. w procesy związane z regeneracją uszkodzonych tkanek. Co więcej, analiza bioinformatyczna danych proteomicznych wykazała, że MSC-EVs zawierają 106 białek, które mogą być zaangażowane w adhezję do komórek (lista tych białek została przedstawiona w Załączniku, p. 8.1. Tabele, Tabela I). Obserwacje te pozwalają przypuszczać, że MSC-EVs mogą oddziaływac z komórkami docelowymi i przenosić swoją bioaktywną zawartość modulując ich funkcje, co postanowiono zbadać w dalszej części pracy. W związku z powyższym, w kolejnym etapie prac, zbadano internalizację wybarwionych fluorescencyjnie MSC-EVs przez mysie komórki śródbłonka naczyń serca (ang. mouse cardiac endothelial cells, MCEC). Poziom internalizacji zbadano zarówno w warunkach kontrolnych, jak również w warunkach imitujących mikrośrodowisko uszkodzonego mięśnia sercowego, tj. w hipoksji oraz w obecności cytokin prozapalnych - 113 IL-1β oraz TNF-α. W tym celu, 24h przed dodaniem MSC-EVs do komórek MCEC, komórki te traktowano w/w cytokinami prozapalnymi w warunkach hipoksji, w pożywce z obniżoną zawartością surowicy. Stan zapalny – towarzyszący również niedokrwiennemu uszkodzeniu tkanek - jest procesem, podczas którego następuje aktywacja śródbłonka naczyniowego, wskutek czego wzrasta gęstość określonych antygenów powierzchniowych związanych m.in. z adhezją komórkową (226), co potencjalnie może przyczynić się do zwiększonej internalizacji MSC-EVs przez komórki akceptorowe. W niniejszej pracy, po 2h od dodania wybarwionych fluorescencyjnie MSC-EVs nie obserwowano wzrostu średniej intensywności fluorescencji (ang. mean fluorescence intensity, MFI) komórek MCEC hodowanych w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego w porównaniu do komórek kontrolnych (hodowanych w standardowych warunkach), do których również dodawano MSC-EVs (Rycina 28). Jednakże po 4h od momentu dodania MSC-EVs zaobserwowano istotny wzrost MFI komórek MCEC stymulowanych wcześniej cytokinami prozapalnymi w odniesieniu do komórek kontrolnych, co świadczy o zwiększonej internalizacji MSC-EVs przez aktywowane komórki MCEC. Wzrost ten utrzymywał się do 24h od momentu dodania MSC-EVs, kiedy to zakończono eksperyment (Rycina 28A, B). Uzyskane wyniki świadczą o tym, że komórki śródbłonka internalizują MSC-EVs zarówno w warunkach natywnych, jak również po ich aktywacji. Jednakże komórki aktywowane czynnikami prozapalnymi wykazują zwiększoną internalizację MSC-EVs, co może mieć istotne znaczenie dla ich aktywności biologicznej w komórkach docelowych - w warunkach stanu zapalnego. Obserwacje te miały istotne znaczenie dla interpretacji dalszych wyników uzyskanych w pracy. Rycina 28. Ocena internalizacji MSC-EVs przez komórki MCEC w warunkach kontrolnych oraz w warunkach imitujących mikrośrodowisko uszkodzonego mięśnia sercowego (hipoksja oraz obecność cytokin prozapalnych) in vitro. A. Górny panel - Reprezentatywne zdjęcia komórek MCEC w standardowych warunkach hodowlanych (kontrola) inkubowanych z MSC-EVs wybarwionymi barwnikiem DiO (zielony) oraz CYTO RNA Select (zielony). Dolny panel - Reprezentatywne zdjęcia komórek MCEC w obecności cytokin prozapalnych IL-1β, TNF-α (każda 10 ng/ml) w warunkach hipoksji (1% O2) w pożywce z 1% FBS oraz inkubowanymi z MSC-EVs wybarwionymi DiO (zielony) oraz CYTO RNA Select (zielony) po 2, 4 oraz 24h od momentu dodania MSC-EVs. Skala: 100 µm. B. Analiza półilościowa internalizacji MSC-EVs przez komórki MCEC po 2, 4 oraz 24h od momentu dodania MSC-EVs. Na osi Y przedstawiono średnią intensywność fluorescencji (ang. mean fluorescence intensity, MFI) komórek zmierzoną przy użyciu aplikacji ImageJ. Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *P<0,05; ****P<0,0001 (test t-studenta), N=3. W związku z tym, że internalizacja MSC-EVs przez komórki MCEC w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego jest wyższa niż w standardowych warunkach hodowlanych, w następnym etapie zbadano czy zwiększona internalizacja MSC-EVs w warunkach zapalenia in vitro, może wpływać na właściwości biologiczne komórek akceptorowych. W pierwszej kolejności zbadano wpływ MSC-EVs na żywotność komórek MCEC w warunkach imitujących stan zapalny (w obecności IL-1β i TNF-α), hodowanych w hipoksji w pożywce z obniżoną zawartością surowicy oraz w warunkach kontrolnych. 115 Co istotne, uzyskane wyniki wykazały istotny stastycznie wzrost żywotności komórek inkubowanych w warunkach imitujących stan zapalny - po 4h od momentu dodania MSC-EVs, w porównaniu do komórek, którym nie podano MSC-EVs (odpowiednio 98,7 ± 0,1% vs. 78,2 ± 5,3% komórek żywych, Rycina 29A). Co więcej, żywotność komórek po inkubacji z MSC-EVs była wyższa niżżywotność komórek kontrolnych (98,7 ± 0,1% vs. 91,5 ± 5,1%, Rycina 29A), nawet jeśli komórki śródbłonka nie były eksponowane na działanie cytokin zapalnych. Uzyskane wyniki wskazały na istotny statystycznie spadek odsetka komórek późno-apoptotycznych w populacji aktywowanych komórek śródbłonka, które były następnie inkubowane z MSC-EVs, w porównaniu z komórkami aktywowanymi, ale do których nie dodawano MSC-EVs (Rycina 29A). Analiza żywotności komórek w warunkach kontrolnych, imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego oraz w warunkach mikrośrodowiska stanu zapalnego i obecności MSC-EVs została także niezależnie przeprowadzona przy użyciu barwnika DAPI. Otrzymane wyniki potwierdziły korzystny wpływ MSC-EVs na żywotność komórek docelowych, w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego (Rycina 29B). Rycina 29. Ocena wpływu MSC-EVs na żywotnosć komórek MCEC in vitro. Analiza żywotności komórek MCEC w warunkach kontrolnych (Kontrola) oraz po aktywacji komórek MCEC (za pomocą IL-1β oraz TNF-α), którym następnie niepodawano lub podawano preparaty MSC-EVs. Inkubację z MSC-EVs prowadzono przez 4h, a następnie analizę wykonano przy użyciu cytometrii przepływowej. A. Żywotność komórek oraz poziom komórek apoptotycznych i nekrotycznych w populacji - analizowane przy użyciu zestawu zawierającego aneksynę V oraz jodek propidyny (PI). B. Żywotnosć komórek MCEC oznaczona z zastosowaniem barwnika DAPI. Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *P<0,05; **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 (test t-studenta), N=3. Podsumowując, przeprowadzone badania wykazały, że MSC-EVs wywierają efekt cytoprotekcyjny i antyapoptotyczny na komórki śródbłonka serca – stanowiące model komórek docelowych in vitro, i efekt ten jest widoczny już krótko po dodaniu MSC-EVs do tych komórek. W następnym etapie, zbadano potencjał angiogenny komórek MCEC w warunkach kontrolnych oraz w warunkach obecności mediatorów stanu zapalnego, które były poddawane działaniu MSC-EVs, z zastosowaniem testu formowania kapilar na podłożu matriżelowym in vitro (208) (Rycinia 30). W wyniku przeprowadzonego badania zaobserwowano istotny statystycznie wzrost aktywności angiogennej niestymulowanych cytokinami prozapalnymi komórek MCEC po 5, 6 i 7h po dodaniu MSC-EVs, w porównaniu z komórkami kontrolnymi, które nie były inkubowane z MSC-EVs (Rycina 30). W przypadku komórek inkubowanych wyłącznie z mediatorami stanu zapalnego nie obserwowano wpływu tych mediatorów na potencjał angiogenny komórek MCEC w porównaniu do komórek kontrolnych. Natomiast istotny wzrost aktywności angiogennej komórek MCEC obserwowano także w warunkach imitujących stan zapalny, ale po dodaniu MSC-EVs -w każdym punkcie eksperymentalnym od 2 do 6h trwania eksperymentu (Rycina 30B). A Rycina 30. Ocena wpływu MSC-EVs na potencjał angiogenny komórek MCEC in vitro. A. Reprezentatywne zdjęcia struktur kapilaropodobnych utworzonych przez komórki MCEC w warunkach kontrolnych (kontrola), po stymulacji cytokinami prozapalnymi (IL-1β, TNF-α) oraz w/bez obecności MSC-EVs. Skala: 250 µm. B. Analiza półilościowa liczby struktur kapilaropodobnych w przeliczeniu na pole mikroskopowe dla kontrolnych komórek MCEC oraz komórek MCEC stymulowanych mediatorami stanu zapalnego (IL-1β, TNF-α) oraz w/bez obecności MSC-EVs. Wartości przedstawiają: Średnie ± SD, *P<0,05; **P<0,01, ***P<0,001 (test t-studenta), N=3. W celu wyjaśnienia zaobserwowanej zwiększonej internalizacji MSC-EVs do komórek docelowych, jak również ich wpływu na potencjał angiogenny komórek w mikrośrodowisku zapalnym, w kolejnym etapie zbadano ekspresję wybranych receptorów charakterystycznych dla aktywowanego śródbłonka naczyniowego, takich jak CD54, CD106, CD62E, CD62P oraz dodatkowo dwóch wybranych antygenów kontrolnych (CD90, Sca-1) – na powierzchni aktywowanych oraz kontrolnych komórek MCEC po oraz bez inkubacji z MSC-EVs. Wykazano, że stymulacja komórek MCEC cytokinami prozapalnymi w warunkach hipoksji i ograniczonego stężenia substancji odżywczych spowodowała wzrost gęstości następujących antygenów: CD54, CD106, CD62P oraz antygenu kontrolnego Sca-1 na ich powierzchni - w odniesieniu do komórek kontrolnych (Rycina 31). W przypadku drugiego antygenu kontrolnego, tj. CD90, nie obserwowano istotnego wzrostu gęstości tego antygenu na powierzchni komórek aktywowanych cytokinami prozapalnymi. Ekspresja antygenu CD54, czyli cząsteczki ICAM-1, której ligandem jest integryna LFA-1, ulegała nieznacznemu zwiększeniu w aktywowanych komórkach MCEC po 4h inkubacji z MSC-EVs w odniesieniu do aktywowanych komórek MCEC, ale bez dodatku MSC-EVs (Rycina 31). Co ciekawe, ekspresja antygenu CD106, czyli cząsteczki VCAM-1 oddziałującej z integryną VLA-4, zmalała w komórkach aktywowanych po inkubacji z MSC-EVs, w porównaniu do komórek MCEC stymulowanych cytokinami prozapalnymi, ale nieinkubowanymi z MSC-EVs. Może to sugerować obecność na powierzchni MSC-EVs ligandów wiążacych antygen CD106, wskutek czego dochodzi do wiązania się MSC-EVs do powierzchni tych komórek i blokowania miejsc wiązania przeciwciał skierowanych przeciwko cząsteczkom CD106. Ekspresja antygenu CD106 w komórkach aktywowanych po 24h inkubacji z MSC-EVs była zbliżona do poziomu obserwowanego w tych samych komórkach, ale nieinkubowanych z MSC-EVs. Może to potwierdzać wcześniejsze obserwacje, że spadek CD106 obserwowany po 4h inkubacji z MSC-EVs mógł być spowodowany oddziaływaniem ligandów obecnych na MSC-EVs z cząsteczkami CD106 na powierzchni komórek akceptorowych. Podobne zjawisko obserwowano w przypadku antygenu CD62P, natomiast w przypadku cząsteczki CD62E wartości MFI dla warunków badanych nie wykazały istotnych statystycznie zmian (Rycina 31). Co ciekawe, po 4h inkubacji aktywowanych komórek MCEC z MSC-EVs obserwowano spadek gęstości antygenu Sca-1 na powierzchni badanych komórek. Wyniki badańświatowych wskazują, że antygen Sca-1 może wiązać się z kompleksem integryn αVβ3 i stymulować m.in. adhezję komórek satelitarnych mięśni (227). Ponieważ na powierzchni MSC-EVs występują integryny αV oraz β3, takie oddziaływania mogą zatem zachodzić między komórkami MCEC, a MSC-EVs, co tłumaczy obserwowany spadek dostępności antygenu Sca-1 dla przeciwciała skierowanego przeciwko temu antygenowi obserwowany po dodaniu pęcherzyków. Z przeprowadzonej analizy wynika, że w obecności mediatorów stanów zapalnego zwiększonej ekspresji ulegają te cząsteczki, które są zaangażowane w oddziaływanie śródbłonka naczyniowego z ich swoistymi ligandami w sytuacji toczącego się stanu zapalnego. CD54 CD106 CD62E MFI Kontrola IL-1β + TNF-α Kontrola IL-1β + TNF-α Kontrola IL-1β + TNF-α + EVs + EVs + EVs + EVs + EVs + EVs [4h] [24h] [4h] [24h] [4h] [24h] CD62P CD90 Sca-1 Rycina 31. Ekspresja wybranych antygenów charakterystycznych dla aktywowanego śródbłonka naczyniowego oraz antygenów kontrolnych na powierzchni komórek MCEC. Komórki MCEC stymulowano IL-1β, TNF-α oraz inkubowano z MSC-EVs (EVs), a następnie po 4 i 24h barwiono przeciwciałami skierowanymi przeciwko badanym antygenom. Bezpośrednio przed analizą, do każdej próbki dodawano DAPI w celu odróżnienia komórek żywych od martwych. Analizę cytometryczną przeprowadzono na żywych komórkach (DAPI-). Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *P<0,05; **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001 (test t-studenta), N=3. Podsumowując, przeprowadzone w tej części badania wykazały zwiększoną internalizację MSC-EVs do komórek akceptorowych w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego (obecność cytokin prozapalnych - IL-1β i TNF-α, warunki hipoksji, obniżona zawartość surowicy). MSC-EVs wykazują działanie cytoprotekcyjne na komórki MCEC, a także zwiększają ich potencjał proangiogenny. Co więcej, wykazano, że ekspozycja komórek śródbłonka na działanie mediatorów stanu zapalnego powoduje wzrost gęstości markerów charakterystycznych dla aktywowanego śródbłonka naczyniowego, co częściowo może tłumaczyć zwiększoną internalizację MSC-EVs do komórek docelowych. 4.7. Badanie retencji MSC-EVs podanych dożylnie w mysim modelu zawału mięśnia sercowego in vivo W związku z uzyskanymi wynikami badań in vitro, wskazującymi m.in. na możliwe oddziaływania MSC-EVs z komórkami śródbłonka naczyń serca, a w szczególności w warunkach zapalnych imitujących mikrośrodowisko uszkodzonego w 119 wyniku niedotlenienia mięśnia sercowego (tj. obecność mediatorów stanu zapalnego, hipoksja), w kolejnym etapie badań objętych niniejszą pracą, zbadano retencję wybarwionych fluorescencyjnie nanocząsteczek MSC-EVs podanych dożylnie w mysim modelu ostrego niedotlenienia mięśnia sercowego (ang. acute myocardial infarction, AMI) w różnych narządach, ze szczególnym uwzględnieniem mięśnia sercowego. Badania te zostały wykonane w czasie mojego pobytu w Cardiovascular Research Institute, Division of Cardiovascular Diseases, Univeristy of Kansas Medical Center, Kansas City w USA, finansowanego w ramach projektu ETIUDA pt. „Ocena potencjału biologicznego mikropęcherzyków z hodowli antygenowo zdefiniowanych komórek macierzystych szpiku kostnego dla celów regeneracji tkanek”. W celu przeprowadzenia tych badań, MSC-EVs zostały wybarwione fluorescencyjnie za pomocą lipofilnego barwinika DiR, którego widmo emisja przypada w dalekiej czerwieni (Ex/Em 750/780 nm). Następnie tak wybarwione MSC-EVs podawano do żyły szyjnej zwierząt poddanych zabiegowi AMI w dwóch punktach czasowych: po 48h lub po 30 min. od reperfuzji. W wybranych punktach czasowych, od zwierząt kontrolnych oraz po zabiegu AMI, izolowano narządy w celu detekcji emitowanego sygnału fluorescencji świadczącej o obecności MSC-EVs w tych tkankach. Uzyskane wyniki badań wykazały akumulację MSC-EVs głównie w wątrobie (we wszystkich grupach zwierząt, którym podano wybarwione fluorescencyjnie MSC-EVs), a także w śledzionie (wyłącznie u zwierząt, od których pobrano narządy po 4h od podania MSC-EVs). Co istotne, nie obserwowano natomiast obecności MSC-EVs w sercu, płucach oraz nerkach (Rycina 32). We krwi zwierząt pobranej z lewej komory (LK) serca także nie obserwowano sygnału fluorescencji (Tabela 28), co może świadczyć o tym, że MSC-EVs są bardzo szybko usuwane z krążenia. W Tabeli 28 przedstawiono podsumowanie obrazowania wybranych tkanek i narządów dla badanych grup zwierząt. W kolejnym etapie przygotowano skrawki mrożeniowe wątroby, śledziony oraz serca pobrane od zwierząt po 4h od mometu podania MSC-EVs lub PBS (odpowiednio Gr. 6 RT i Gr. 3 RT), które analizowano techniką mikroskopii konfokalnej w celu weryfikacji wyników uzyskanych za pomocą In Vivo Optical Imaging System. Przeprowadzone badania potwierdziły retencję MSC-EVs w wątrobie oraz śledzionie (Rycina 33 i 34). Nieznaczny wzrost średniej wartości sygnału obserwowano także w mięśniu sercowym (Rycina 34). Co ważniejsze, można było zaobserwować pojedyncze skupisko czerwonych obiektów w tkankach mięśnia sercowego (Rycina 33), co może świadczyć o niewielkiej, ale jednak zachodzącej akumulacji MSC-EVs w tym organie (będącej poniżej progu detekcji wykorzystanej aparatury do obrazowania sygnału fluorescencji całych organów). Pomimo tego, że nie obserwowano znacznej retencji MSC-EVs w mięśniu sercowym, co może być spowodowane m.in. szybką hemodynamiką tego narządu, doniesienia literaturowe wskazują, że EVs uzyskane z hodowli komórek progenitorowych serca podane dożylnie, mogą redukować obszar uszkodzenia pozawałowego mięśnia sercowego (195), a zatem muszą oddziaływać na uszkodzone tkanki w sercu. Wydaje się zatem prawdopodobne, że niewielka ilość MSC-EVs ulega retencji w miejscu uszkodzenia w mięśniu sercowym, jednak sygnał fluorescencji emitowanej po internalizacji MSC-EVs może być poniżej progu detekcji większości dostępnej infrastruktury badawczej. Wątroba Śledziona Serce Płuca Nerki Gr. 1 RT Kontrola Gr. 2 RT Kontrola Sham (48h) + PBS (4h) Gr. 3 RT Kontrola AMI (48h) + PBS (4h) Gr. 4 RT Kontrola Sham (48h) + MSC-EVs (4h) Gr. 5 RT AMI (48h) + MSC-EVs (30 min.) Gr. 6 RT AMI (48h) + MSC-EVs (4h) Gr. 7 RT AMI (48h) + MSC-EVs (24h) Gr. 8 RT AMI (30min) + MSC-EVs (4h) 2.0 1.0 0.0 -1.0 Wydajność promieniowania x106 (P/sec/mm/sq) Rycina 32. Badanie retencji MSC-EVs w wybranych narządach u myszy poddanych zabiegowi AMI. MSC-EVs wybarwiono fluorescencyjnie DiR, a następnie podawano do żyły szyjnej myszy (100 µg w objętości 50 µl). W określonych punktach czasowych, od myszy pobierano narządy w celu ich zobrazowania przy użyciu systemu In Vivo Optical Imaging System. Pod nazwą każdej grupy wpisano skrótowy opis grupy uporządkowany w następującej kolejności: rodzaj zabiegu (czas od reperfuzji po którym podawano MSC-EVs lub PBS) + rodzaj podawanego preparatu (czas od podania po którym zwierzęta poddawano eutanazji w celu pobrania tkanek i narządów). Szczegółowy opis grup zwierząt zamieszczono w rozdziale Materiały i Metody w Tabeli 18. Oznaczenia: (-) - brak sygnału fluorescencji; (+) - występowanie sygnału fluorescencji, (*) autofluorescencja. Tabela 28. Podsumowanie wyników badania retencji wybarwionych fluorescencyjnie MSC-EVs w wybranych narządach i tkankach w mysim modeli AMI. Grupa zwierząt Detekcja w organach i tkankach wątroba śledziona serce płuca nerki przewódpokarmowy krew z LK kości mięsnie kończyn dolnych 1 RT (Kontrola) - - - - - * - - - 2 RT (Kontrola) - - - - - * - - - 3 RT (Kontrola) - - - - - * - - - 4 RT (Kontrola) + + - - - * - - - 5 RT + - - - - * - - - 6 RT + + - - - * - - - 7 RT + - - - - * - - - 8 RT + + - - - * - - - DAPI DIR DAPI/ DIR A PBS Wątroba MSC-EVs B PBS Śledziona MSC-EVs PBS Serce MSC-EVs Rycina 33. Ocena mikroskopowa retencji MSC-EVs w wątrobie, śledzionie oraz sercu myszy poddanych zabiegowi AMI przy wykorzystaniu mikroskopii konfokalnej. Myszy poddano zabiegowi AMI. Po 48h po AMI, myszom podano roztwór soli PBS lub MSC-EVs. Narządy pobrano po 4h od momentu podania. Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia skrawków preparatów mrożeniowych organów pobranych od zwierząt, którym podawano roztwór soli PBS (górny panel) lub MSC-EVs (dolny panel). Zdjęcia wykonano w niebieskim kanale fluorescencji (DAPI) oraz kanale dla dalekiej czerwieni (DiR), jak również przedstawiono żłożenie dwóch kanałów fluorescencji (DAPI/ DiR). A. Skrawki wątroby. B. Skrawki śledziony. C. Skrawki serca. Skala: 10 µm lub 50 µm. wątroba śledziona serce Rycina 34. Analiza półilosciowa retencji MSC-EVs w wątrobie, śledzionie oraz sercu myszy poddanych zabiegowi AMI. Myszy poddano zabiegowi AMI. Po 48h po AMI, myszom podano roztwór soli PBS lub MSCs-EVs. Narządy pobrano po 4h od momentu podania. Analiza wykonana przy użyciu oprogramowani Las X. Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *P<0,05; **P<0,01 (test t-studenta). N = 3 (PBS), N = 6 (MSC-EVs). Podsumowując, przeprowadzone badania wykazały, że MSC-EVs podane dożylnie u zwierząt poddanych zabiegowi AMI wykazują akumulację głównie w wątrobie oraz śledzionie, a jedynie w niewielkim stopniu są obecne w tkankach serca. 4.8. Badanie retencji MSC-EVs podanych dożylnie w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo W następnym etapie realizacji badań w ramach niniejszej pracy doktorskiej zbadano retencję MSC-EVs (otrzymanych z hodowli komórek MSCs wykazujących ekspresję znacznika GFP) w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny (ang. limb ischemia, LI). Badania przeprowadziłam w czasie mojego stażu w INSERM U1063, Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques, Institut de Biologie en Santé, Universite d’Angers w Angers we Francji. W tej części badań, po 24h od niedokrwiennego uszkodzenia kończyny, zwierzętom podawano dożylnie (do żyły ogonowej) znakowane MSC-EVs lub sam nośnik - roztwór soli PBS. Po 4 lub 24h od podania, od myszy izolowano organy oraz pobierano krew z LK w celu detekcji sygnału fluorescencji pochodzącego z MSC-EVs. Organy analizowano przy użyciu systemu do obrazowania - Maestro In Vivo Imaging System. Po 4h od dożylnego podania MSC-EVs, u myszy u których wcześniej wykonano zabieg uszkodzenia tkankowego, wykazano obecność pęcherzyków w następujących organach: wątrobie, nerkach, płucach oraz bardzo słaby sygnał w śledzionie. Po 24h od podania MSC-EVs, bardzo słaby sygnał fluorescencji utrzymywał się w wątrobie, nerkach oraz płucach (Rycina 35A, B). Nie obserwowano sygnału fluorescencji w osoczu krwi, co może świadczyć, że pęcherzyki są bardzo szybko usuwane z krążenia. Ze względu na to, że wykorzystany szczep myszy C57Bl/6J wykazuje autofluorescencję, wartości średniej 124 intensywności fluorescencji (MFI) dla poszczególnych organów przedstawiono w odniesieniu do wartości uzyskanych dla myszy grupy kontrolnej (której podano sól PBS), dla których przyjęto, że procent wartości MFI dla poszczególnych narządów wynosił 100%. Analizie obecności MSC-EVs poddano także kończyny zdrowe oraz ischemiczne (niedotlenione) pobrane od myszy, którym podawano dożylnie MSC-EVs lub roztwór soli PBS. Co istotne, w niedokrwionych kończynach pobranych od zwierząt, którym podano MSC-EVs, zaobserwowano wyższy poziom fluorescencji po 4 oraz 24h od podania MSC-EVs – w porównaniu do kończyn ischemicznych myszy kontrolnych oraz kończyn zdrowych (Rycina 35A). W przypadku tej analizy, wyniki przedstawiono jako stosunek wartości MFI zmierzonej w kończynie niedotlenionej do wartości MFI uzyskanej dla kończyny zdrowej. Stosunek wartosci MFI obserwowany u myszy, którym podawano MSC-EVs wynosił odpowiednio 1,44 ± 0,29 po 4h oraz 4,07 ± 0,01 po 24h, podczas gdy u myszy kontrolnych (którym podano sól PBS) był równy 1,0 (Rycina 35C). Świadczy to o akumulacji MSC-EVs w niedokrwionych tkankach kończyn. Uzyskane wyniki wskazują na znacznie szerszą dystrybucję MSC-EVs w organach w uszkodzeniu ischemicznym kończyny LI niż obserwowano w modelu AMI. Może to być związane zarówno z różnym patofizjologicznym przebiegiem procesów towarzyszących uszkodzeniu w obu modelach, jak również z drogą podania – do żyły szyjnej w AMI oraz żyły ogonowej w LI. Warto wspomnieć, że podczas projektowania przyszłych potencjalnych leków biologicznych opartych o komórki macierzyste lub ich pochodne, efektywna droga podania tych preparatów jest jednym z ważniejszych aspektów badań przedklinicznych. BF GFP BF/ GFP A Wątroba Nerki Śledziona Płuca Osocze Kończyny BC 1600 * 4h 1400 24h 1200 1000 MFI kończyna ischemiczna/ kończyna zdrowa MFI(% Kontroli) 400 200 0 * ** ** ** 4h 24h Rycina 35. Badanie retencji MSC-EVs w wybranych narządach oraz kończynach dolnych u myszy poddanych zabiegowi LI. MSC-EVs otrzymano z hodowli komórek MSCs z endogenną ekspresją znacznika GFP, a następnie po 24h od zabiegu LI podano myszom (po 100 µg GFP+ MSC-EVs do żyły ogonowej w objętości nie większej niż 25 µl). W określonych punktach czasowych od podania MSC-EVs (4 i 24h) od myszy pobierano wybrane narządy, krew oraz kończyny dolne w celu analizy średniego sygnału fluoresecencji (MFI) w tych narządach oraz płynach ustrojowych. Badanie wykonano przy użyciu systemu Maestro In Vivo Imaging System. A. Reprezentatywne zdjęcia wybranych organów, próbki osocza i kończyn dolnych - uzyskane dla myszy kontrolnych (K), którym podawano sól PBS, jak również myszy, od których izolowano narządy po 4 oraz 24h od LI. Zdjęcia wykonano w jasnym polu (BF), w zielonym kanale fluorescencji (GFP), jak również przedstawiono żłożenie jasnego pola i zielonej fluorescencji (BF/GFP). Czerwone strzałki wskazują uszkodzone kończyny. B. Analiza półilościowa retencji MSC-EVs w wybranych organach i osoczu. Wartości MFI dla poszczególnych organów przedstawiono w odniesieniu do wartości uzyskanych dla myszy grupy kontrolnej (PBS), dla których przyjęto, że procent wartości intensywności fluorescencji dla poszczególnych narządów wynosił 100%. C. Analiza ilościowa retencji MSC-EVs w kończynach dolnych. Na wykresie przedstawiono stosunek uzyskanych wartości MFI dla kończyny niedotlenionej do wartości uzyskanych dla kończyny zdrowej. Na wykresach czarną linią zaznaczono MFI dla myszy grupy kontrolnej (K). Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *P<0,05; **P<0,01 vs. Sól PBS (test t-studenta), N=3 myszy/ grupę. Podsumowując, po 4h od dożylnego podania MSC-EVs u zwierząt w modelu LI, pęcherzyki wykryto w następujących organach: wątrobie, nerkach i płucach. Co istotne z punktu wiedzenia aktywności MSC-EVs, przeprowadzone badania wykazały swoisty „tropizm” MSC-EVs do miejsca uszkodzenia tkankowego oraz ich retencję w uszkodzonych kończynach, co może być związane z oddziaływaniem tych cząsteczek z aktywowanym śródbłonkiem naczyniowym w miejscu toczącego się stanu zapalnego, co było analizowane we wcześniejszych badaniach in vitro. Wydaje się zatem prawdopodobne, że MSC-EVs podane dożylnie w modelu LI, będą potencjalnie wpływały na regenerację niedotlenionych tkanek kończyny dzięki ich internalizacji do komórek docelowych i modulację funkcji tych komórek, a szczególnie w miejscu toczącego się procesu zapalnego towarzyszącego uszkodzeniu niedokrwiennemu, co zostało zbadane w dalszej części pracy. 4.9. Ocena potencjału regeneracyjnego MSC-EVs oraz komórek MSCs w mysim modelu zawału mięśnia sercowego in vivo Przeprowadzone badania składu molekularnego MSC-EVs oraz ich oddziaływania na komórki tkanek serca in vitro wykazały, że pęcherzyki te mogą przenosić bioaktywną zawartość do komórek śródbłonka, która może mieć potencjalny istotny wpływ na funkcje tych komórek istotne z punktu widzenia regeneracji uszkodzonych tkanek. Dlatego też, w następnym etapie pracy zbadano potencjał regeneracyjny MSC-EVs w mysim modelu zawału mięśnia sercowego (AMI). Wcześniejsze wyniki badania retencji podanych dożylnie MSC-EVs w tkankach zwierząt po zawale, nie wykazały znacznej akumulacji pęcherzyków w tkankach mięśnia sercowego, co sugeruje, że podobnie jak w przypadku przeszczepiania komórek, podania dożylne są mniej efektywne od bezpośredniego podania miejscowego w przypadku uszkodzeń miokardium. W badaniach potencjału regeneracyjnego, MSC-EVs podawane były zatem bezpośrednio do mięśnia sercowego w okolicę okołozawałową, po 2 dniach od ischemii/ reperfuzji. W wybranych punktach czasowych - tj. bezpośrednio przed zabiegiem, po 2, 9 oraz 32 dniach od zabiegu AMI, myszy poddawane były badaniu echokardiograficznemu przy użyciu systemu Vevo 2100, celem oceny funkcji LK serca. Ocena funkcji skurczowej LK serca wykazała istotny statystycznie wzrost frakcji wyrzutowej LK (ang. LV ejection fraction; LVEF) u myszy, którym podawano komórki MSCs oraz MSC-EVs w 9 dniu po zabiegu AMI (czyli w 7 dniu po przeszczepieniu preparatów terapeutycznych) - w porównaniu do myszy kontrolnych, którym podawano sam nośnik - roztwór soli PBS (Rycina 36A), co świadczy o poprawie funkcji serca u zwierząt traktowanych MSC-EVs lub komórkami MSCs. W tym samym punkcie czasowym, u myszy którym podawano preparat MSC-EVs obserwowano istotne statystycznie zmniejszenie objętości końcowo- skurczowej LK serca (ang. LV end systolic volume; LVESV) (Rycina 36B), co również potwierdza poprawę funkcji serca u tych zwierząt. Co istotne, w 32 dniu od AMI (czyli 30 dni po podaniu preparatów komórkowych lub MSC-EVs) frakcja wyrzutowa LK serca istotnie wzrosła w grupie zwierząt, którym przeszczepiono MSC-EVs – w porównaniu do myszy kontrolnych, którym podano nośnik (sól PBS) lub komórki MSCs (LVEF wynosiła w tym dniu ok. 55% u myszy którym podawano MSC-EVs vs. ok. 35% u myszy którym podawano nośnik vs. ok. 42% u myszy którym podawano komórki MSCs; Rycina 36A). W punkcie tym, objętość końcowo- skurczowa LK serca (LVESV) utrzymywała się na poziomie ok. 25 µl w grupie zwierząt, którym podano MSC-EVs vs. 45 µl w grupie zwierząt, ktorym podano nośnik - sól PBS oraz 40 µl w grupie zwierząt, która otrzymała kontrolne komórki MSCs (Rycina 36B). Otrzymane wyniki badań wykazały, że grubość ściany LK serca objętej zawałem mierzona podczas skurczu (ang. infarct wall systolic diameter) wzrosła w 32 dniu po zawale w grupie zwierząt, której podano MSC-EVs oraz komórki MSCs - w porównaniu do grupy kontrolnej zwierząt (Rycina 36C). Może to świadczyć o częściowym zahamowaniu niekorzystnych zmian histologicznych związanych z powstawaniem blizny pozawałowej i remodelingiem serca prowadzącym do zmniejszenia się grubości ściany LK powiązanej ze wzrostem objętości komory, co w efekcie prowadzi do upośledzenia funkcji całego organu. Obrazy uzyskane podczas badania echokardiograficznego wykazały, że u zwierząt grupy kontrolnej przednia ściana LK jest istotnie cieńsza niż w grupie zwierząt, której podano komórki MSCs oraz MSC-EVs (Rycina 37A). Obserwacje te zostały potwierdzone również na przekrojach poprzecznych serca wybarwionych metodą Massona (Rycina 37B). AB LVEF LVESV 50 80 70 40 *# μl % 60 50 40 30 20 30 10 20 BSL 2d 9d D32 BSL 2d 9d 32d Grubość ściany LK serca objętej zawałem (w skurczu) C 1,3 PBS (N=17) 1,2 MSCs (N=15) MSC-EVs (N=17) 1,1 mm 1,0 0,9 (*) P < 0.05 vs. PBS (#) P < 0.05 vs. MSCs 0,8 Rycina 36. Ocena wybranych parametrów funkcjonalnych lewej komory serca z zastosowaniem echokardiografii (ECHO). Badanie ECHO wykonano przed zabiegiem AMI (tzw. punkt BSL; ang. baseline), 2 dni (2d) po zabiegu - czyli w dniu podania preparatów biologicznych, jak również w 9 i 32 dniu po zabiegu AMI. A. LVEF – frakcja wyrzutowa lewej komory (LK) serca (ang. left ventricle (LV) ejection fraction). B. LVESV – objętość końcowoskurczowa LK serca (ang. LV end systolic volume). C. Grubość ściany LK serca objętej zawałem w skurczu (ang. infarct wall systolic diameter). Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *P<0,05 vs. PBS, #P<0,05 vs. MSCs (test t-studenta), N=15-17 myszy/grupę. A Kontrola (PBS) MSCs MSC-EVs B Kontrola (PBS) MSCs MSC-EVs Rycina 37. Reprezentatywne zdjęcia z badania echokardiograficznego oraz przekroje poprzeczne serca wybarwione metodą Massona. A. Reprezentatywne obrazy z badania echokardiograficznego wykonane podczas analizy serca w osi krótkiej w trybie M-mode przy użyciu systemu Vevo 2100. Na zdjęciach uwidoczniona jest ściana przednia oraz tylna LK. B. Reprezentatywne zdjęcia tkanek oraz anatomii serca na przekrojach poprzecznych serca. Barwienie wskazuje na obecność blizny łącznotkankowej utworzonej przez włókna kolagennowe (kolor niebieski) oraz żywego miokardium (kolor bordowy). Czerwone strzałki wskazują rejon blizny łącznotkankowej. Skala: 500 μm. Dalsza szczegółowa ocena parametrów funkcjonalnych i strukturalnych LK serca wykazała istotne statystycznie zmniejszenie końcowo- rozkurczowej objętości LK serca (ang. LV end diastolic volume; LVEDV) oraz końcowo-rozkurczowego wymiaru wewnętrznego LK serca (ang. LV end diastolic diameter; LVEDD) obserwowanych w 32 dniu po AMI u myszy, którym przeszczepiono dosercowo MSC-EVs - w porównaniu do myszy grupy kontrolnej (Rycina 38A, B). W aspekcie przebudowy tkanek serca, w tym samym punkcie czasowym - u myszy, którym podano MSC-EVs, obserwowano m.in. istotne zwiększenie grubości ściany LK serca objętej zawałem podczas rozkurczu (ang. Infarct Wall Diastolic Diameter), jak również zmniejszenie masy LK serca (ang. LV Mass) w porównaniu do grupy kontrolnej zwierząt, którym podano sól PBS (Rycina 38C-E). A LVEDV B LVEDD Średnica ściany LK serca Grubość ściany tylnej LK C objętej zawałem (w rozkurczu) D serca (w rozkurczu) Masa LK serca E PBS (N=17) MSCs (N=15) mg MSC-EVs (N=17) (*) P < 0.05 vs. PBS (#) P < 0.05 vs. MSCs BSL 2d 9d 32d Rycina 38. Ocena wybranych parametrów funkcjonalnych i strukturalnych lewej komory serca z zastosowaniem echokardiografii. Badanie ECHO wykonano przed zabiegiem AMI (tzw. punkt BSL; ang. baseline), 2 dni po zabiegu - czyli w dniu podania preparatów biologicznych, jak również w 9 i 32 dniu po zabiegu AMI. A. LVEDV- końcowo- rozkurczowa objętość LK serca (ang. LV End-Diastolic Volume). B. LVEDD – końcowo-rozkurczowy wymiar wewnętrzny (średnica) LK serca (ang. LV end-diastolic diameter). C. Średnica ściany LK serca objętej zawałem w rozkurczu (ang. Infarct Wall Diastolic Diameter). D. Grubość ściany tylnej LK serca w rozkurczu (ang. Posterior Wall Thickness in Diastole). E. Masa LK serca (ang. LV Mass). Wartości przedstawiają: Średnia ± SD, *P<0,05 vs. PBS, #P<0,05 vs. MSCs (test t-studenta), N=15-17 myszy/grupę. Zaobserwowane zmiany histologiczne mogąświadczyć o zmniejszeniu niekorzystnej utraty miokardium towarzyszącej przebudowie tkanek serca po uszkodzeniu, jak również o zahamowaniu procesów remodelingu w przypadku zastosowania preparatów opartych o komórki MSCs, a w szczególności MSC-EVs. Przeprowadzone badania w modelu AMI in vivo wykazały, że zarówno przeszczepienie komórek MSCs, jak i samych MSC-EVs, prowadzi do częściowego odwrócenia niekorzystnych procesów remodelingu, któremu podlega mięsień sercowy uszkodzony w wyniku niedotlenienia, co w efekcie przełożyło się na poprawę globalnej funkcji serca w obu grupach traktowanych preparatami biologicznymi – komórkami MSCs oraz MSC-EVs. 4.10. Ocena potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo Przeprowadzone badania retencji MSC-EVs w mysim modelu LI wykazały obecność tych cząsteczek w nerkach, płucach, wątrobie i śledzionie (w 4h od podania), jak również w niedokrwionych kończynach po ich dożylnym podaniu u myszy, co może świadczyć o tym, że tego typu podanie może prowadzić do efektywnego „zasiedlania” uszkodzonego obszaru kończyny przez pęcherzyki. W związku z tym, w następnym etapie przeprowadzono badanie potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny u myszy, gdzie pęcherzyki podawano dożylnie celem długoterminowej obserwacji potencjalnych efektów promujących regenerację. Iniekcje pęcherzyków rozpoczęto w dniu zabiegu i wykonywano co trzy dni, aż do 18 dnia eksperymentu (eksperyment zakończono w 21 dniu). Tego typu schemat wielokrotnego podania MSC-EVs do krwioobiegu, zwiększał prawdopodobieństwo „zasiedlania” przez pęcherzyki uszkodzonych tkanek, co z kolei zwiększało prawdopodobieństwo efektu regeneracyjnego. Wyniki przeprowadzonych badań, w tym analiza przepływu krwi w kończynach z zastosowaniem systemu Dopplera, wykazały istotny wzrost perfuzji krwi w niedotlenionych kończynach myszy, którym podawano preparaty MSC-EVs - już w 7 dniu od zabiegu, w porównaniu do myszy kontrolnych, którym podawano sól PBS. Perfuzja krwi wynosiła odpowiednio 53,6 ± 28,5 % dla myszy którym podawano MSC-EVs vs. 16,2 ± 7,8% dla myszy, którym podawano roztwór soli PBS - w odniesieniu do prawidłowego poziomu perfuzji w tkankach mierzonego indywidualnie dla każdego zwierzęcia przed wykonaniem zabiegu LI, dla którego przyjęto, że wynosi on 100% (Rycina 39A, B). W 14 dniu po zabiegu również obserwowano znamienny wzrost perfuzji niedotlenionych tkanek w grupie myszy, której przeszczepiono MSC-EVs (91,8 ± 42,7%), w odniesieniu do grupy kontrolnej (30,9 ± 6,6%) (Rycina 39B), co sugeruje efekt proangiogenny przeszczepionych MSC-EVs w niedotlenionych tkankach. Zaobserwany wzrost przepływu krwi w niedotlenionych tkankach utrzymywał się na znamiennie wyższym poziomie do 21 dnia eksperymentu w przypadku myszy, którym podano MSC-EVs (68,9 ± 17,9 %) w porównaniu do grupy kontrolnej (44,4 ± 10,7 %) (Rycina 39 B). W przypadku myszy kontrolnych, którym podawano roztwór kontrolny, w miarę upływu czasu również obserwowano wzrost perfuzji krwi w uszkodzonych tkankach, który można tłumaczyć aktywacją endogennych mechanizmów naprawczych, w tym potencjalnie endogennych komórek progenitorowych uczestniczących w regeneracji uszkodzonych tkanek. Wartość perfuzji tkanek u myszy którym podawano preparat MSC-EVs w 21 dniu od zabiegu była nieznacznie niższa niż wartość perfuzji zmierzona w 14 dniu, co może prawdopodobnie wynikać z tego, że nie wszystkie nowopowstałe naczynia krwionośne dojrzewają oraz ulegają stabilizacji (utrwaleniu). Doniesienia literaturowe wskazują, że podanie preparatów opartych o komórki macierzyste w stanie kardiomiopatii niedokrwiennej, powoduje poprawę parametrów hemodynamicznych serca, jednak poprawa ta jest przejściowa (20), co może sugerować, że wielokrotne podania preparatów opartych o komórki macierzyste lub ich pochodne w dłuższych odstępach czasowych, mogą przynieść długotrwałą poprawę ocenianych parametrów. Nie mniej jednak, w każdym punkcie czasowym w przypadku myszy, którym podawano MSC-EVs, obserwowano statystycznie istotną, wyższą perfuzję tkanek niedotlenionej kończyny, w porównaniu do myszy grupy kontrolnej (Rycina 39A, B). A Kontrola (PBS) MSC-EVs Mysz zdrowa B 150 100 50 0 Perfuzja krwikończyna niedotleniona/zdrowa (% Kontroli) Kontrola (PBS) MSC-EVs * * * Mysz 7d 14d 21d zdrowa Rycina 39. Badanie perfuzji krwi w kończynach myszy poddanych zabiegowi LI z zastosowaniem systemu Doppler. Badanie wykonano przed zabiegiem LI (mysz zdrowa), bezpośrednio po zabiegu (0d) w celu sprawdzenia skuteczności przeprowadzonej okluzji naczynia, jak również w 7, 14 oraz 21d po zabiegu LI. A. Reprezentatywne zdjęcia z analizy perfuzji krwi w kończynach dla myszy, którym podawano MSC-EVs oraz kontrolnie sól PBS, a także dla myszy zdrowej. Czerwone strzałki wskazują niedotlenione kończyny. B. Analiza ilościowa perfuzji krwi w kończynach dolnych myszy. Dla każdego zwierzęcia bezpośrednio przed zabiegiem zmierzono perfuzję krwi w obu kończynach dolnych. Przyjęto, że stosunek wyjściowej perfuzji w kończynie lewej (tj. zdrowej, w której wykonano następnie zabieg niedotlenienia) do perfuzji w kończynie prawej (tj. zdrowej, która następnie nie była operowana dla kontroli) wynosi 100%. Wartość perfuzji w poszczególnych punktach czasowych przeliczano w odniesieniu do wartości procentowych dla poszczególnych zwierząt, analizowanych bezpośrednio przed zabiegiem. Wartości przedstawiają: Średnia ± SEM, *P<0,05 vs. sól PBS (test t-studenta), N=8 (kontrola, PBS), N=9 (MSC-EVs). W celu potwierdzenia wzrostu perfuzji krwi w niedotlenionych tkankach, która może być związana m.in. z powstawaniem krążenia obocznego, wykonano barwienia immunocytochemiczne tkanek mięśniowych pobranych od zwierząt po zakończeniu eksperymentu (w 21 dniu) w celu detekcji liczby naczyń krwionośnych w tych tkankach. Przeprowadzone badania wykazały statystycznie istotny wyższy stosunek liczby kapilar w kończynie niedotlenionej do kończyny zdrowej w grupie zwierząt, którym podawano MSC-EVs w porównaniu do myszy grupy kontrolnej (PBS) (Rycina 40A, B). Wyższy stosunek liczby kapilar w grupie myszy, którym podawano MSC-EVs korelował z wyższą perfuzją tkanek obserwowaną w tej grupie zwierząt. Uzyskane wyniki świadczą, że MSC-EVs podane dożylnie istotnie wpływają na poprawę perfuzji krwi w niedotlenionej kończynie, która korelują z wyższą liczbą powstałych nowych naczyń krwionośnych w tych tkankach. Co ważniejsze, wykazano, że w tym modelu uszkodzenia podanie dożylne stanowi efektywną drogę podania preparatów biologicznych. Podsumowując, przeprowadzone badania wykazały istotny statystycznie wzrost perfuzji krwi w niedokrwionych kończynach myszy w grupie zwierząt, której podawano dożylnie MSC-EVs w porównaniu do grupy kontrolnej, której przeszczepiono roztwór kontrolny. Wzrost perfuzji tkanek jest skorelowany z wyższą liczbą kapilar w tych tkankach, co może być związane z powstawaniem krążenia obocznego, stymulowanego bioaktywną zawartością pęcherzyków z komórek MSCs podawanych u tych zwierząt. B Liczba kapilarkończyna niedotleniona/zdrowa Kontrola MSC-EVs (PBS) Rycina 40. Ocena liczby kapilar w tkankach mięśniowych w punkcie końcowym eksperymentu (21d) z zastosowaniem analizy immunohistochemicznej. A. Reprezentatywne zdjęcia skrawków tkanek mięśniowych wybarwionych: w kierunku obecności antygenu CD31 (marker komórek śródbłonka; kolor zielony), DAPI (bawienie jądrowe; kolor niebieski) oraz obraz złożenia sygnałów dla CD31 oraz DAPI. B. Analiza półilościowa liczby kapilar w tkankach. Wynik przedstawiono jako stosunek liczby kapilar w kończynie niedotlenionej do liczby kapilar w kończynie zdrowej (analizowanych z tej samej powierzchni skrawków) - w dwóch grupach zwierząt, którym podano MSC-EVs lub kontrolnie sól PBS. Wartości przedstawiają: Średnia ± SEM, **P<0,01 vs. sól PBS (test U Manna-Whitneya), N=5/grupę. 4.11. Analiza biochemiczna tkanek mięśniowych pobranych od myszy w modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo W 21 dniu od zabiegu LI, czyli w dniu zakończenia eksperymentu, od poszczególnych zwierząt pobrano także tkanki mięśniowe (z kończych niedotlenionych oraz zdrowych) w celu przeprowadzenia wybranych analiz biochemicznych, które mogłyby wskazać na mechanizmy zaangażowane w proangiogenną aktywność MSC-EVs obserwowaną w tkankach po LI. W pierwszej kolejności w pobranych tkankach zbadano poziom produkcji tlenku azotu (ang. nitric oxide, NO) oraz anionu ponadtlenkowego (ang. superoxide anion, O2-) techniką Elekronowego Rezonansu Paramagnetycznego (ang. Electron paramagnetic resonanse, EPR). NO pośredniczy w wielu procesach związanych z angiogenezą (228), natomiast wzrost produkcji reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS) wśród których zaliczyć można O2-może indukować stres oksydacyjny oraz powodować uszkodzenie cząstek lipidów, białek i DNA (229). Celem przeprowadzonej analizy było określenie na poziomie biochemicznym zjawisk zachodzących w tkankach pobranych od myszy w 21 dniu od uszkodzenia, tj. czy podanie MSC-EVs wpływa na wzrost wytwarzania NO (który korzystnie moduluje proces terapeutycznej angiogenezy) w uszkodzonych tkankach oraz równocześnie nie powoduje powstania wtórnego stanu zapalnego. Przeprowadzone przez mnie badania EPR (w czasie stażu w INSERM U1063, Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques, Institut de Biologie en Santé w Angers we Francji, w specjalistycznej Pracowni Spektroskopii EPR) wykazały znaczny wzrost produkcji NO w tkankach mięśniowych niedotlenionych kończyn w grupie zwierząt, którym podawano MSC-EVs - wynoszący 167,4 ± 22,1 % w odniesieniu do zwierząt grupy kontrolnej (którym podawano roztwór soli PBS), dla której przyjęto, że poziom NO w tkankach jest równy 100% (Rycina 41A). W dalszym etapie zbadano wytwarzanie O2-w tkankach mięśniowych w 21 dniu od zabiegu. W tym przypadku nie wykazano znaczącej produkcji tego anionorodnika w tkankach mięśniowych zwierząt, którym podawano MSC-EVs, w porównaniu do zwierząt kontrolnych, co może świadczyć, że same MSC-EVs nie indukują powstania wtórnego stanu zapalnego (Rycina 41B). Ma to istotne znaczenie z punktu widzenia ich potencjalnych przyszłych zastosowań w regeneracji uszkodzonych tkanek. AB końcowym eksperymentu (21d) z zastosowaniem techniki EPR. Poziom NO oraz O2-w mięśniach kończyny niedotlenionej w stosunku do kończyny zdrowej u zwierząt, którym podawano MSC-EVs - przedstawiono, jako procent wartości wyliczonej dla zwierząt kontrolnych (PBS). A. Poziom NO w tkankach mięśniowych kończyn dolnych myszy. B. Poziom O2- w tkankach mięśniowych kończyn dolnych myszy. Wartości przedstawiają: Średnia ± SEM, *P<0,05; sól PBS (test t-studenta), N=4/grupę. W kolejnym etapie, wykorzystując metodę Western blot, wykonano analizę ekspresji wybranych białek w pobranych tkankach mięśniowych, takich jak m.in. białek enzymatycznych eNOS i Akt oraz ich form ufosforylowanych, kaweoliny-1, VEGF oraz Lyve-1, które mogą być potencjalnie zaangażowane w obserwowane procesy regeneracyjne zachodzące m.in. na drodze angiogenezy i limfangiogenezy w tkankach mięśniowych po przeszczepieniu MSC-EVs. Przeprowadzone badania wykazały wzrost ekspresji formy ufosforylowanej białka eNOS (Ser 1177) w odniesieniu do jego całkowitej puli - w tkankach mięśniowych w grupie zwierząt, której podawano MSC-EVs. Wzrost ten wynosił 187,5 ± 104,0 %, w porównaniu do grupy kontrolnej zwierząt, w której poziom usforylowanej formy eNOS względem pełnej puli tego białka, przeliczono jako 100% (Rycina 42A). Zaobserwowano natomiast nieznaczny spadek ekspresji ufosforylowanej formy białka Akt (Ser 473) w stosunku do jego całkowitej ilości w badanych tkankach mięśniowych pobranych od myszy którym podawano MSC-EVs w odniesieniu do grupy kontrolnej zwierząt (Rycina 42B). Nieznaczny wzrost ekspresji ufosforylowanej formy białka eNOS był skorelowany ze spadkiem ekspresji kaweoliny-1 w tkankach pobranych z niedotlenionych kończyn myszy, którym podawano MSC-EVs w odniesieniu do myszy grupy kontrolnej (którym podawano roztwór soli PBS). Kaweolina-1 jest białkiem, które powoduje inaktywację cząsteczki eNOS, w rezultacie czego maleje produkcja NO (230). Wzrost uforforylowanej formy białka eNOS, które bierze udział w produkcji NO, był skorelowany ze wzrostem poziomu NO w tkankach oraz spadkiem ekspresji kaweoliny-1, będącej blokerem ufosforylowanej formy białka eNOS. Co interesujące, nie obserwowano natomiast wzrostu poziomu silnie proangiogenneo czynnika wzrostowego VEGF po podawaniu MSC-EVs. Ze względu na fakt, że analizę wykonano na tkankach pobranych od myszy w 21 dniu od zabiegu, nie można wykluczyć, że wzrost tego białka mógł wystąpić we wcześniejszych punktach doświadczalnych. Co ciekawe, wykazano nieznaczny wzrost ekspresji białka Lyve-1, które 137 uczestniczy w procesach limfangiogenezy. Choć pojawiło się doniesienie naukowe mówiące o udziale limfangiogenezy w procesie regeneracji skóry (231), wciąż niewiele wiadomo o jej udziale w regeneracji niedotlenionych tkanek. A Kontrola MSC-EVs Kontrola MSC-EVs Kontrola MSC-EVs (PBS) (PBS) (PBS) B Kontrola MSC-EVs Kontrola MSC-EVs Kontrola MSC-EVs (PBS) (PBS) (PBS) C DE Kontrola MSC-EVs Kontrola MSC-EVs Kontrola MSC-EVs (PBS) (PBS) (PBS) Rycina 42. Analiza ekspresji wybranych białek związanych z angiogenezą oraz limfangiogenezą w tkankach mięśniowych w punkcie końcowym eksperymentu (21d) metodą Western blot. A-E. Poziom ekspresji poszczególnych badanych białek w próbkach pobranych od zwierząt kontrolnych (PBS) oraz zwierząt, którym podano MSC-EVs.W analizie wykorzystano kontrolę endogenną -β-aktynę do której normalizowano wartości ekpresji dla poszczególnych białek. Wyniki przedstawiono jako stosunek ekspresji wybranego białka w mięśniach kończyny niedotlenionej do kończyny zdrowej. Dla myszy, którym podawano PBS (Kontrola) przyjęto, że stosunek ten jest równy 100%. Poziom ekspresji każdego białka w mięśniach grupy badanej (MSC-EVs) odniesiono do zwierząt kontrolnych (% Kontroli). Wartości przedstawiają: Średnia ± SEM, **P<0,01 vs. sól PBS (test t-studenta), N=5/grupę. Podsumowując, wykonane badania potwierdziły wyższą produkcję NO w tkankach pobranych z niedotlenionych kończyn myszy w odniesieniu do tkanek kończyn zdrowych oraz w odniesieniu do tkanek zwierząt grupy kontrolnej, która koreluje z wyższą ekspresję ufosforylowanej formy białka eNOS oraz niższą ekspresję kaweoliny-1, co świadczy o aktywacji procesów angiogennych w tkankach na skutek podania MSC-EVs. Co więcej, wydaje się wysoce prawdopodobne, że oprócz terapeutycznej angiogenezy, w tkankach zachodzi także limfangiogeneza, co wymaga dalszych badań, które są w tej chwili prowadzone we współpracy z wspomnianym ośrodkiem we Francji. Nie obserwowano wzrostu poziomu reaktywnych form tlenu w grupie myszy, której podawano MSC-EVs w odniesieniu do grupy kontrolnej zwierząt, co świadczy, że samo podanie MSC-EVs nie powoduje dodatkowego stanu zapalnego w tkankach. 5. DYSKUSJA Komórki macierzyste (KM) od lat stanowią przedmiot szeregu badań o charakterze podstawowym oraz przeklinicznym, których celem jest m.in. poznanie biologii i mechanizmów działania tych komórek w odbudowie tkankowej, co daje nadzieje na efektywne praktyczne ich zastosowania w regeneracji uszkodzonych tkanek i narządów. Dotychczasowe wyniki badańświatowych wskazują, że jednym z kluczowych mechanizmów, na drodze którego KM – w szczególności komórki MSCs, wywierają swój efekt regeneracyjny jest ich aktywność parakrynna, związana z wydzielaniem szeregu bioaktywnych związków mających bezpośredni efekt na komórki endogenne w miejscu uszkodzenia (114,124,191–196). W warunkach fizjologicznych, jak i po aktywacji, komórki zwierzęce, w tym komórki macierzyste, wydzielają bezpośrednio do środowiska szereg bioaktywnych cząsteczek, w tym m.in. cytokiny, czynniki wzrostu, a także uwalniają pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (ang. Extracellular Vesicles, EVs) (124–126). Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe stanowią sferyczne, obłonione struktury złuszczane zarówno z powierzchni komórek, jak również uwalniane z wnętrza komórki, które są nośnikami bioaktywnych cząsteczek takich jak m.in: receptory błonowe, białka błonowe i wewnątrzkomórkowe, mRNA, miRNA, lncRNA oraz lipidy, dzięki czemu EVs odgrywają istotną rolę w komunikacji międzykomórkowej, zapewniając wymianę bioaktywnych związków pomiędzy komórkami - określanymi często jako komórki donorowe, oraz komórki akceptorowe, bądź docelowe (105,114,145,176,190,232,233). Transfer bioaktywnych związków przez EVs, niesie określony efekt biologiczny w postaci modyfikacji funkcjonalnej w komórce docelowej (105,114). Dziś rosnąca liczba doniesień z badańświatowych wskazuje, że również EVs wydzielane przez komórki macierzyste odpowiadają za modulację aktywności funkcjonalnej w innych komórkach, w tym w endogennych komórkach somatycznych, progenitorowych i macierzystych rezydujących w tkankach i narządach, co może mieć istotne znaczenie m.in. w stymulacji endogennych mechanizmów naprawczych w tkankach (113,114,194–196). Szczególną populacją KM, której przypisuje się szerokie spektrum aktywności parakrynnej są mezenchymalne/ stromalne komórki macierzyste KM (ang. Mesenchymal Stem/ Stromal Cells, MSCs) (126,234). Ze względu na wspomnianą aktywność wydzielniczą, a także inne istotne cechy, jakie wykazują komórki MSCs, jako komórkowy materiał przeszczepowy, są one dziś najczęściej optymalizowaną i stosowaną populacją KM w próbach leczenia uszkodzeń tkankowych, w tym również w próbach klinicznych u pacjentów (113,235–239). Głównym celem badań w ramach niniejszej pracy doktorskiej była poszerzona analiza składu molekularnego oraz potencjału biologicznego i regeneracyjnego EVs wydzielanych przez mysie komórki MSCs szpiku kostnego (czyli tzw. MSC-EVs), która pozwoliłaby odpowiedzieć na pytanie o potencjalne przyszłe możliwości zastosowań preparatów MSC-EVs w leczeniu uszkodzeń tkankowych wywołanych niedotlenieniem. W tym celu, w ramach niniejszej pracy przeprowadzono szereg badań molekulanych składu MSC-EVs oraz ich aktywności biologicznej w warunkach in vitro, jak również potencjału regeneracyjnego in vivo, w tym w unikatowym modelu ostrego uszkodzenia mięśnia sercowego po ischemii- reperfuzji u myszy (AMI) oraz w mysim modelu niedotlenienia kończyny (LI). Komórki MSCs oraz MSC-EVs Komórki macierzyste szpiku kostnego stanowią heterogenną frakcję komórek, wśród których występują m.in. krwiotwórcze komórki macierzyste (ang. hematopoietic stem cells, HSCs), komórki progenitorowe śródbłonka (ang. endothelial progenitor cells, EPCs) oraz komórki MSCs (113,240–242). Komórki MSCs izoluje się powszechnie z różnych tkanek, w tym tkanek szpiku kostnego poprzez ich zdolność do adhezji do polistyrenowych powierzchni naczyń hodowlanych (199,243). W niniejszej pracy, hodowlę adherentnej frakcji szpikowych komórek mysich prowadzono przez kilka cykli pasaży (do pasażu 4-6) celem wzbogacenia tej frakcji w komórki MSCs, co jest związane ze stopniowym zanikaniem w długoterminowej hodowli komórek o fenotypie hematopoetycznym (244). Komórki poddane takiej długoterminowej ekspansji in vitro, poddano charakterystyce fenotypowej oraz funkcjonalnej w celu potwierdzenia ich tożsamości, jako komórek MSCs, zgodnie z kryteriami objętymi w zaleceniach Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (ISCT) – wydanymi w celu właściwej identyfikacji komórek MSCs w różnych tkankach (79). W związku z tym, że wytyczne ISCT obejmują kryteria identyfikacji ludzkich komórek MSCs (79) oraz nie ma w literaturze zdefiniowanych zbiorczo kryteriów charakteryzujących mysie komórki MSCs, w celu określenia tożsamości izolowanych w niniejszej pracy komórek szpikowych, zaimplementowano kryteria identyfikacji rekomendowane przez ISCT w możliwie jak najwyższym stopniu. Wykazano, że komórki MSCs mysiego szpiku kostnego wyizolowane i wykorzystane w niniejszej pracy, wykazują zdolność do adhezji do powierzchni naczyń hodowlanych, natomiast poszerzona analiza profilu antygenowego (obejmującego m.in. wybrane markery pozytywne i negatywne komórek MSCs według zaleceń ISCT) wykazała ekspresję następujących antygenów powierzchniowych: CD29, CD44, CD90, CD105, Sca-1, CD309 (VEGFR2), CD63, CD81, CD106, CD98 przy równoczesnym braku antygenów: CD45, SSEA-1, c-kit, CD31, CD62E, CD11b, TCR-β, CD45R, TCR-γδ, CD184. Nieznaczny odsetek tych komórek posiada na swojej powierzchni antygeny: CD202b, CD11a/CD18, CD54 oraz CD62P. Zbadany przeze mnie fenotyp otrzymanych komórek odpowiada fenotypowi komórek MSCs, definiowanemu dla komórek ludzkich. W niniejszej pracy zaobserwowano jednak, że odsetek mysich komórek MSCs pozytywnych pod względem ekspresji antygenów CD73, CD90, CD105 jest niższy niż w przypadku rekomendacji opublikowanych dla ludzkich komórek MSCs, co może wynikać z różnicy międzygatunkowej oraz potencjalnie innej kinetyki ekspansji właściwej populacji komórek MSCs w hodowlach in vitro komórek ludzkich oraz mysich. W przypadku ludzkich komórek MSCs, już w krótkoterminowej hodowli (po pierwszym pasażu) zdecydowana większość komórek (prawie 100%) nie wykazuje ekspresji antygenu CD45 (243). Tymczasem w przypadku mysich komórek MSCs, odsetek komórek CD45negatywnych wynosił ok. 95% dopiero na pasażu 4 (doświadczenie własne). Zanikanie 140 komórek o fenotypie hematopoetycznym, w tym komórek CD45+/CD11b+ (reprezentujących głównie linię monocytarno-makrofagową), w miarę postępu hodowli komórek adherentnych mysiego szpiku kostnego, stanowi alternatywę dla usuwania tych komórek na drodze sortowania magnetycznego (82) oraz minimalizuje ryzyko utraty właściwych komórek MSCs lub ich przypadkowej dekontaminacji podczas kolejnych etapów selekcji. Procedurę obejmującą stopniowe wzbogacanie hodowli w komórki MSCs w miarę trwania ekspansji frakcji adherentnej komórek mysiego szpiku kostnego, stosowałam również z sukcesem w celu izolacji i ekspansji komórek MSCs, które użyłam dla innych celów badawczych (245). Z doświadczenia własnego, nabytego podczas pracy w Zakładzie Biologii Komórki WBBiB UJ w Krakowie, wynika, że sortowanie magnetyczne (tzw. metoda MACS) będące jak dotąd jedyną metodą sortowania komórek dopuszczoną dla izolacji komórek dla zastosowań klinicznych (246) - jest techniką umożliwiającą jedynie wstępne wzbogacenie pożądanych frakcji komórkowych, ale nie zapewnia preparatów o bardzo wysokiej czystości, co możliwe jest dopiero dzięki zastosowaniu metody sortowania w oparciu o fluorescencję (FACS) (247,248). W kolejnym etapie, komórki MSCs poddano hodowlom różnicującym w kierunku osteoblastów, chondrocytów i adipocytów przy użyciu komercyjnie dostępnych pożywek hodowlanych dedykowanych do hodowli różnicującej komórek mysich. Potwierdzono zdolność komórek MSCs do różnicowania w w/w komórki pochodzenia mezodermalnego, potwierdzającym tym samym ich charakter multipotencjalny. Przeprowadzone w tej części pracy badania odnośnie fenotypu komórek MSCs - stosowanych, jako komórki wyjściowe dla późniejszych izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych - potwierdziły tożsamość tych komórek, jako MSCs, zgodnie z zaleceniami Międzynarodowego Towarzystwa Terapii Komórkowej (79) zaadoptowanymi dla komórek pochodzenia mysiego. W celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z komórek MSCs, czyli preparatów MSC-EVs, pożywka kondycjonowana była zbierana znad komórek MSCs po całodobowej ich inkubacji w pożywce bezsurowiczej, ale suplementowanej albuminą bydlęcą (0,5% BSA) celem zachowania funkcji i żywotności komórek. Zastosowana metoda zmiany pełnej pożywki hodowlanej zawierającej najczęściej surowicę bydlęcą (FBS) na pożywkę bezsurowiczą, jest procedurą stosowaną przez liczne grupy badawcze pracujące z EVs, a także praktyką zalecaną przez ISEV w celu standardaryzacji metod izolacji pożywek kondycjonowanych dla celów pozyskiwania EVs (126,167). Można znaleźć doniesienia naukowe wskazujące, że EVs izolowane są także z pożywek niesuplementowanych innymi białkami oraz bez dodatku czynników wzrostu (249–251). Obecność surowicy w pożywce hodowlanej jest bowiem źródłem egzogennych EVs i stanowi swego rodzaju zanieczyszczenie układu nanocząstkami niepochodzącymi z badanych komórek (252). W związku z powyższym, w celu izolacji EVs z hodowli komórkowych, zaleca się albo stosowanie pożywek bezsurowiczych, bądź pożywek surowiczych, ale wcześniej pozbawionych nanocząstek poprzez dodatkowe procesowanie (167). Doniesienia naukowe wskazują także, że komórki ssacze hodowane w pożywce suplementowanej surowicą pozbawioną endogennych EVs, wykazują obniżone tempo proliferacji (252). Dodatkową zaletą zastosowania w niniejszej pracy pożywki bezsurowiczej w celu izolacji MSC-EVs (tj. pożywki uboższej, gdzie większość składników odżywczych pochodzenia surowiczego zastąpiono jednym białkiem - albuminą) jest potencjalna możliwośc pozyskania EVs o zwiększonej zawartości czynników proangiogennych. Wyniki badańświatowych wskazują bowiem, że EVs izolowane z pożywek kondycjonowanych zebranych z hodowli komórek prowadzonych w warunkach hipoksji oraz ograniczonego stężenia substancji odżywczych, wykazują wzbogacenie w białka związane z aktywacją szlaków angiogenezy, w tym szlaku od receptorów EGF, FGF, PDGF (190). Żywotność mysich komórek MSCs po zebraniu bezsurowiczych pożywek kondycjonowanych - zbadana w niniejszej pracy - wynosiła 87,9 ± 4,6% i wartość ta jest zbliżona od wartości opisywanych w literaturze, jako typowe dla tego typu preparatyki, w tym np. wartości 86,0 ± 0,5% żywych komórek MSCs, którą uzyskiwali w podobnych warunkach Collino i wsp. (126). Komórki MSCs, z hodowli których zbierano pożywki kondycjonowane do izolacji MSC-EVs, znajdowały się głównie w fazie G0/G1 cyklu komórkowego i nie obserwowano zaburzeń w przebiegu ich cyklu komórkowego w porównaniu do komórek hodowanych w standardowej, pełnej pożywce hodowlanej zawierającej surowicę bydlęcą. MSC-EVs otrzymywano w niniejszej pracy z pożywek kondycjonowanych na drodze sekwencyjnego wirowania obejmującego dwa cykle ultrawirowania (z przyspieszeniem 100 000xg). Ultrawirowanie jest jedną z najszerzej stosowanych metod izolacji EVs, proponowaną również przez ISEV (167). W odniesieniu do innych metod izolacji EVs wzbogacających izolowane frakcje w egzosomy (np. izolacja w gradiencie gęstości OptiPrep lub przy użyciu odczynnika ExoQuick czy też odczynnika Total Exosome Isolation), metoda sekwencyjnego wirowania z ultrawirowaniem cechuje się stosunkowo wysoką wydajnością izolacji EVs, wzbogaceniem w obie frakcje EVs (egzosomy i ektosomy), a pozyskiwane preparaty posiadają stosunkowo niewielkie zanieczyszczenie innymi białkami (253). Co więcej, badania wskazują, że odzysk RNA z preparatów EVs otrzymanych na drodze ultrawirowania jest najwyższy, co może świadczyć, że metoda ta umożliwia izolację integralnych (nienaruszonych) pęcherzyków (253). Wysoki odzysk RNA z preparatów EVs uzyskanych na drodze ultrawirowania jest także zaletą biorąc pod uwagę niskie stężenie RNA obserwowane wyjściowo w pęcherzykach produkowanych przez komórki MSCs, w porównaniu z EVs pochodzącymi z innych typów KM (145,254). Z badań naszego zespołu wynika, że komórki MSCs produkują EVs o znacznie niższej zawartości RNA niż np. komórki iPSCs (114). Zatem również w niniejszej pracy doktorskiej zastosowano protokół sekwencyjnego wirowania z ultrawirowaniem, który z naszych doświadczeń stanowi jak dotąd optymalną procedurę izolacji EVs, szczególnie z komórek MSCs. W kolejnym etapie, zgodnie z zaleceniami towarzystwa ISEV (166), w celu potwierdzenia obecności integralnych pęcherzyków w izolowanych próbkach MSC-EVs oraz w celu oceny ich morfologii, próbki MSC-EVs obrazowano techniką mikroskopii sił atomowych (AFM). Uzyskane wyniki wykazały, że badane próbki zawierają nanocząstki o kulistym kształcie i zróżnicowanej wielkości - typowej dla frakcji ektosomów i egzosomów (114). W odróżnieniu od transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), metoda obrazowania AFM umożliwia wizualizację preparatów w czasie rzeczywistym oraz nie wymaga etapu utrwalania analizowanego materiału, co znacznie zmniejsza ryzyko zniekształcania pęcherzyków podczas przygotowania preparatów do obrazowania. Wykorzystana w pracy metoda izolacji MSC-EVs na drodze sekwencyjnego wirowania obejmującego dwa cykle ultrawirowania umożliwia otrzymanie heterogennych preparatów EVs składających się z większych ektosomów oraz mniejszych egzosomów. W celu wizualizacji heterogenności MSC-EVs, wykonano dodatkowo badania rozkładu wielkości tych nanocząstek przy użyciu systemu IZON qNano, który stanowi jedną z platform analitycznych stosowanych dziś do analiz wielkości nanocząstek (255,256). Przeprowadzona analiza wykazała, że MSC-EVs mieszczą się w zakresie wielkości 70 -420 nm, a średnia wielkość tych nanocząstek wynosi 172,3 ± 14,1 nm przy dominującej populacji o wielkości 138,0 ± 14,7 nm. Wielkość otrzymanych cząstek jest porównywalna do średniej wielkości EVs izolowanych przez innych badaczy z hodowli komórek MSCs, w tym pochodzących z galarety Whartona, gdzie wynosiła pomiędzy 163,0 ± 1,4 nm, a 181,0 ± 25,5 nm, w zależności od rodzaju pożywki hodowlanej zastosowanej w badaniach (257). Wyizolowane MSC-EVs wykazywały ekspresję synteniny-1 - charakterystycznej dla pęcherzyków oraz nie zawierały białka kalneksyny - białka związanego z siateczką śródplazmatyczną, które odróżnia preparaty EVs od preparatów komórkowych (166). Dodatkowo, preparaty MSC-EVs badane w niniejszej pracy, wykazywały wzbogacenie w egzosomy o czym świadczy m.in. obecność tetraspaniny CD9, która jest powszechnie uznawana za jeden z głównych markerów egzosomów (166). Biorąc pod uwagę listę 100 białek najczęściej identyfikowanych w egzosomach dostępnej na stronie internetowej ExoCarta (stanowiącej kompendium wiedzy na temat bioaktywnej zawartości egzosomów (143)), wykazałam, że preparaty MSC-EVs izolowane dla badań objętych niniejszą pracą, zawierają aż 82 białka z tej listy, co jednoznacznie potwierdza wzbogacenie preparatów MSC-EVs w egzosomy. Przeprowadzona analiza białek zidentyfikowanych w MSC-EVs w kontekście minimalnych kryteriów identyfikacji EVs opublikowanych przez ISEV (166), pozwoliła także potwierdzić, że otrzymane przeze mnie preparaty MSC-EVs przenoszą trzy grupy białek charakterystycznych dla pęcherzyków, takich jak: białka transbłonowe (np. CD9, CD63, CD81, integryny), białka cytoplazmatyczne (np. syntenina1, aneksyna A1, A6, A11) oraz białka pozakomórkowe (np. fibronektyna), przy równoczesnym braku białek wewnątrzkomórkowych charakterystycznych dla określonych organelli (np. kalneksyny). Analiza markerów powierzchniowych MSC-EVs wykonana przy użyciu wysokorozdzielczego cytometru przepływowego Apogee A50 dedykowanego do analizy małych obiektów wykazała występowanie na powierzchni badanych nanocząstek następujących antygenów: CD29, CD44, CD81, CD90, CD309 (receptor dla VEGF) oraz Sca-1, co potwierdza także obserwacje innych grup, że pęcherzyki - w tym przypadku głównie ektosomy - przenoszą receptory i inne cząsteczki błonowe, typowe dla komórek rodzicielskich (151,152). Ligandem dla antygenu CD44 jest m.in. hialuronian występujący m.in. na powierzchni komórek śródbłonka (258), co może istotnie wpływać na oddziaływania MSC-EVs z tymi komórkami. Biorąc pod uwagę obecność receptora dla 143 VEGF na powierzchni MSC-EVs oraz mechanizmy działania EVs na komórki docelowe opisywane przez różne grupy badaczy (172,254), wydaje się wysoce prawdopodobne, że MSC-EVs mogą przenosić receptor dla VEGF do komórki akceptorowej, a przez to umożliwiać lub zwiększać aktywację sygnałowania od VEGF w komórkach docelowych, prowadzącego do stymulacji procesów angiogennych. Występowanie antygenów CD29, CD44, CD90 oraz Sca-1 potwierdza wzbogacenie MSC-EVs w ektosomy posiadające markery komórek rodzicielskich (249,251). Z kolei antygen CD81 również obecny na błonie części MSC-EVs, według dotychczasowego stanu wiedzy, jest charakterystyczny dla egzosomów (166). Biorąc pod uwagę, że znaczny odsetek komórek MSCs ekspresjonuje tetraspaniny CD63 i CD81 na swojej powierzchni (co wykazano także w niniejszej pracy), można przypuszczać, że tetraspaniny nie są unikatowymi markerami jedynie egzosomów, ponieważ mogą także występować na większych ektosomach złuszczanych z powierzchni błony komórkowej. Obserwacja taka została także poczyniona przez inne grupy badawcze (142) i w tej chwili w środowisku toczy się dyskusja odnośnie właściwego opisywania frakcji EVs przenoszących teraspaniny, które nie ograniczałby się jedynie do egzosomów, ale także ektosomów (doniesienia własne Zespołu na podstawie udziału w spotkaniach organizowanych przez ISEV). W celu analizy bioaktywnego ładunku przenoszonego przez MSC-EVs, wykonano globalną analizę proteomiczną, a następnie badanie transkryptomu otrzymanych preparatów MSC-EVs, z szczególnym uwzględnieniem transkryptów miRNA oraz wybranych mRNA. W przeprowadzonych w niniejszej pracy badaniach zidentyfikowano 3920 białek wspólnych dla komórek MSCs oraz 818 białek wspólnych obecnych w preparatach MSC-EVs. Co więcej, w komórkach MSCs zidentyfikowano 2893 tzw. białka różnicowe, których nie zidentyfikowano w MSC-EVs, prawdopodobnie ze względu na brak ich obecności lub zbyt niskie stężenie w pęcherzykach - poniżej progu detekcji stosowanej metody. Co ciekawe, w nanocząstkach MSC-EVs zidentyfikowano 135 białek unikalnych dla nich, które były poniżej progu detekcji w komórkach MSCs. Są to prawdopodobnie białka, które ulegają zagęszczeniu w pęcherzykach, dzięki aktywnym mechanizmom pakującym, co było już wcześniej obserwowane także przez innych badaczy (259). Przypuszczalnie białka te albo stanowią frakcję cząsteczek usuwaną lub eksportowaną z komórek w danym momencie aktywności metabolicznej komórki, albo stanowią frakcję cząsteczek istotną z punktu widzenia komunikacji międzykomórkowej (260). Porównanie kompozycji molekularnej MSC-EVs oraz komórek wyjściowych, z których one pochodzą (MSCs), może dystarczyć cennych informacji dotyczących potencjalnego wpływu tych nanocząstek na komórki docelowe. Białka unikatowe oraz wspólne analizowano w niniejszej pracy przy użyciu aplikacji Gene Ontology, biorąc pod uwagę szczególnie ich potencjalne zaangażowanie w różne procesy biologiczne zachodzące w komórce, funkcje molekularne tych białek oraz ich lokalizację pod względem przedziału komórkowego, z którego pochodzą. Biorąc pod uwagę kryterium podziału pod kątem procesów biologicznych, w których zidentyfikowane białka mogą uczestniczyć, zaobserwowałam wzbogacenie MSC-EVs w białka zaangażowane w 144 morfogenezę i rozwój struktur anatomicznych oraz organów, odpowiedź na bodźce chemiczne, sygnały zewnątrzkomórkowe oraz uszkodzenie, komunikację międzykomórkową i przekazywanie sygnałów oraz adhezję komórek. W komórkach MSCs poziom tych białek był niższy niż w pęcherzykach. Z kolei komórki MSCs wykazują wzbogacenie m.in. w białka zaangażowane w transkrypcję i regulację ekspresji genów, czy też metabolizm RNA, które to białka występują w MSC-EVs w niewielkiej ilości. Co ciekawe, białka unikatowe zidentyfikowane w MSC-EVs, czyli występujące w wysokim stężeniu, mogą być z kolei zaangażowane nie tylko w morfogenezę oraz rozwój struktur anatomicznych, organów i organizmu wielokomórkowego, ale również w gojenie się ran/ uszkodzeń, odpowiedź na bodźce chemiczne i uszkodzenie, a także komunikację międzykomórkową i adhezję komórek. Ze względu na zaangażowanie białek unikatowych przenoszonych w MSC-EVs w w/w procesach, a szczególnie w odpowiedź na uszkodzenie oraz gojenie się ran, można przypuszczać, że MSC-EVs mogą być zaangażowane w procesy regeneracji uszkodzonych tkanek po ich przeszczepieniu. Potwierdza to rosnąca liczba doniesień z różnych laboratoriów światowych, wskazujących na potencał regeneracyjny pęcherzyków pochodzących z komórek MSCs w regeneracji różnych tkanek (124,191–194,196). Białka występujące w MSC-EVs pełnią także funkcje sygnałowe, uczestnicząc m.in. w wiązaniu jonów i receptorów oraz same stanowiąc przekaźniki sygnałów. Co więcej, analiza typu Panther Pathways biorąca pod uwagę białka zidentyfikowane w MSC-EVs wykazała, że białka te mogą być zaangażowane m.in. w szlaki sygnałowania takie jak szlak integrynowy, szlaki od receptorów dla EGF, FGF, PDGF, sygnałowanie z udziałem heterotrimerycznych białek G i kaskady kinaz MAP, a także w regulację procesu angiogenezy oraz stanu zapalnego. Biorąc pod uwagę fakt, że regulacja procesu angiogenezy, jak również działanie immunomodulacyjne i aktywujące szereg procesów w endogennych komórkach uszkodzonych tkanek, są wskazywane jako główne mechanizmy aktywności pro-regeneracyjnej komórek MSCs po ich podaniu do uszkodzonych tkanek (91,100,101,107,108,111,112), powyższe obserwacje odnośnie składu białkowego MSC-EVs mocno wskazują, że wspomniane efekty naprawcze zależne od komórek MSCs mogą być w części mediowane przez MSC-EVs wydzielane przez te komórki. Dotychczasowe badania, w tym naszej grupy, wskazują, że bioaktywna zawartość przenoszona przez EVs jest również uzależniona od warunków hodowli komórek (145,249). Dla przykładu, EVs otrzymane z hodowli świńskich komórek MSCs z tkanki tłuszczowej – hodowanych w pożywce α-MEM suplementowanej 5% lizatem płytkowym, która następnie była zmieniona na pożywkęα-MEM bez dodatku żadnych suplementów oraz czynników wzrostu na okres 48h w celu zebrania pożywek do izolacji MSC-EVs, wykazują wzbogacenie w białka zaangażowane m.in. w angiogenezę, remodelowanie macierzy zewnątrzkomórkowej oraz regulację stanu zapalnego (250). Wykazano także, że komórki MSCs inkubowane w pożywce bezsurowiczej w warunkach hipoksji (0% FBS, 1% O2 - warunki imitujące mikrośrodowisko niedotlenionych tkanek) wykazują wyższą ekspresję białek szlaków sygnałowania od FGF, PDGF oraz receptora EGF, które należą do kanonicznych szlaków angiogenezy (190). Co więcej, egzosomy wydzielane przez te komórki również wykazują wzbogacenie w białka szlaków sygnałowania od FGF, PDGF 145 oraz receptora EGF. Nanocząstki te wykazują ekspresję także innych białek zaangażowanych w m.in. sygnałowanie za pośrednictwem receptorów integrynowych, od TGF-β, szlaku Wnt czy też regulację stanu zapalnego (190). Na podstawie uzyskanych w niniejszej pracy wyników zinterpretowanych na tle doniesień pochodzących z analizy ludzkich komórek MSCs i ich EVs (190), można powiedzieć, że biaktywna zawartość białkowa przenoszona przez mysie MSC-EVs jest zasadniczo porównywalna do zawartości białkowej egzosomów wydzielanych przez ludzkie komórki MSCs. EVs mogą przenosić określony ładunek biologiczny, który w warunkach fizjologicznych jest przez nie wykorzystywany do komunukacji międzykomórkowej oraz stymulacji komórek akceptorowych (250). Białka zaangażowane w adhezję komórek występujące w MSC-EVs analizowano także od kątem ich wzajemnych interakcji przy użyciu aplikacji STRING. Wykazano, że w centrum interaktomu znajdowała się m.in. β1 integryna (Itgb1), α4 integryna (Itga4), α5 integryna (Itga5), αL integryna (Itgal), fibronektyna (Fn1) oraz antygen CD44. Co ciekawe, β1 integryna jest białkiem, które uczestniczy w wiązaniu komórek HSCs do białek zrębu niszy hematopoetycznych KM w szpiku kostnym (219), natomiast antygen CD44 umożliwia wiązanie się tych komórek do kwasu hialuronowego na powierzchni komórek śródbłonka naczyń (218). Ligandem dla cząsteczki CD44 może być także osteopontyna oraz kolagen (258). Występowanie aż 106 białek adhezyjnych na powierzchni MSC-EVs, które udało mi się zidentyfikować, może wpływać na ich oddziaływanie z komórkami akceptorowymi w miejscu uszkodzenia lub ze śródbłonkiem naczyniowym po podaniu dożylnym pęcherzyków. W kolejnym etapie zbadano oddziaływanie pomiędzy białkami zaangażowanymi w adhezję komórek, rozwój naczyń krwionośnych oraz gojenie się ran. W centrum utworzonego interaktomu wizulanie wyróżniały się dwie grupy białek: pierwsza związana z adhezją komórek obejmująca białka takie jak m.in.: β1 integrynę (Itgb1), α4 integrynę (Itga4), fibronektynę (Fn1), a druga związana z adhezją komórek oraz przekazywaniem sygnałów, obejmująca m.in.: kinazę białkową 14 aktywowaną mitogenem (Mapk14), kinazę białkową 1 aktywowaną mitogenem (Mapk1), winkulinę (Vcl), białkową kinazę tyrozynową 2β (Ptk2b), antygen CD44 oraz aneksynę A5 (Anxa5). Wyniki licznych badań światowych wskazują na powszechne zaangażowanie szlaków sygnałowania, w których zaangażowane są kinazy białkowe aktywowane mitogenem (ang. mitogen- activated protein kinase, MAPK) w odpowiedź komórek na działanie np. czynników wzrostowych (261). Wykazano m.in., że kinazy MAP uczestniczą w przekaźnictwie sygnału od receptora dla VEGF, czego wynikiem jest aktywacja proliferacji komórek oraz ekspresji określonych genów związnych z angiogenezą, co w rezultacie powoduje rozpoczęcie procesów tworzenia nowych naczyń krwionośnych (262). Z kolei aktywacja receptorowych kinaz tyrozynowych powoduje utworzenie wewnątrzkomórkowego kompleksu sygnalizacyjnego, wskutek czego sygnał biegnie kilkoma szlakami do wielu miejsc przeznaczenia w komórce, a kompleks sygnalizacyjny aktywuje i koordynuje liczne zmiany biochemiczne niezbędne do włączenia tak złożonych odpowiedzi jak proliferacja komórki (137). Co więcej, wykazano, że białkowa kinaza tyrozynowa 2β odgrywa istotną rolę w chemotaksji i migracji komórek (263). Uzyskane w niniejszej pracy wyniki badań odnośnie składu białkowego MSC-EVs, mogą zatem wskazywać na ich potencjalny udział w aktywacji szeregu szlaków sygnałowych w komórkach docelowych, nie tylko zwiazanych bezpośrednio z aktywacją procesów angiogenezy, ale również proliferacji komórek oraz migracji, która stanowi również istotną funkcję komórek w procesach regeneracji tkanek, w tym komórek śródbłonka w czasie tworzenia nowych naczyń (264). W kolejnym etapie pracy przeprowadzono analizę składu cząsteczek miRNA przenoszonych przez MSC-EVs w porównaniu do komórek rodzicielskich. W wyniku przeprowadzonej analizy udało się zidentyfikować 162 wspólne cząsteczki miRNA występujące zarówno w komórkach rodzicielskich (MSCs), jak również MSC-EVs. Co istotne, zidentyfikowano również 10 cząsteczek miRNA unikatowych dla MSC-EVs (miRNA-1952, 376a-3p, 182-5p, 668-3p, 1188-5p, 409-5p, 339-3p, 325-3p, 369-3p, 466f5p) oraz 11 cząsteczek miRNA unikatowych dla komórek MSCs (miRNA-369-5p, 758-3p, 92b-3p, 671-3p, 466k, 293-3p, 327, 298-5p, 1967, 103-2-5p, 125b-2-3p). Taki profil może wynikać z selektywnego pakowania wybranych miRNA do pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, co obserwowano już we wcześniejszych badaniach innych grup (126,249). Cząsteczki miRNA mogą indukować degradację transkryptów mRNA, z którym hybrydyzują lub bezpośrednio hamować jego translację (265). Biorąc pod uwagę fakt, że wiązanie pomiędzy miRNA, a docelowym mRNA nie musi być w pełni komplementarne, jedna cząsteczka miRNA może oddziaływać z transkryptami wielu genów regulując ich ekspresję (266). I tak przykładowo, w bazie sekwencji decelowych dla różnych miRNA (baza miRDB), dla miRNA-182-5p można znaleźć 538 przewidywanych docelowych transkryptów mRNA, dla miRNA-1188-5p – aż 180 przewidywanych docelowych mRNA, natomiast dla miRNA-339-3p - 22 sekwencje mRNA (http://mirdb.org). Z przeglądu literatury wynika natomiast, że wyciszenie miRNA-182-5p powoduje aktywację proliferacji komórek raka nerkowokomórkowego (220), miRNA-339-3p pełni rolę inhibitora inwazyjności komórek czerniaka (221), natomiast miRNA-1188 promuje różnicowanie neuronalne komórek MSCs oraz aktywację białka STAT1 (222). Ze względu na mnogość docelowych mRNA dla wymienionych miRNA, funkcje tych cząstek mogą być inne niż wymienione w innych typach komórek, a także zależeć od działania innych miRNA, które są obecne i aktywne w danym momencie w danej komórce. Zatem udział poszczególnych miRNA wykrytych w MSC-EVs w procesach regeneracji tkanek, wymaga dalszych pogłębionych badań. Co istotne, wśród 162 cząsteczek miRNA wspólnych dla komórek MSCs oraz MSC-EVs, zaobserwowano nieznaczne wzbogacenie pęcherzyków w miRNA-126-3p, które znane jest jako miRNA o działaniu proangiogennym (223). Badania Chen i wsp. wykazały, że podanie komórek MSCs z nadekspresją miRNA-126 w miejsce uszkodzenia tkanek serca powoduje wzrost angiogenezy oraz poprawę parametrów hemodynamicznych pracy serca na drodze sygnałowania ERK/Akt (223). Wiadomo także, że miRNA-126 moduluje odpowiedź komórek śródbłonka na czynnik VEGF poprzez hamowanie inhibitorów szlaku VEGF, takich jak: SPRED1 (ang. sprout-related EVH1 domaincontaining protein 1), czy też PIK3R2 (ang. phosphoinositol-3 kinase regulatory subunit 2), wskutek czego sygnał pochodzący od związanego czynnika wzrostego jest 147 przekazywany przez szlak MAPK/ERK oraz równolegle PI3K/AKT stymulując angiogenezę (267). Z kolei Sicco i wsp. wykazali, że EVs otrzymane z pożywek zebranych znad komórek MSCs inkubowanych w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego (tj. hipoksja, brak subrancji odżywczych) wykazują wzbogacenie w proangiogenne miRNA-126 oraz 199a (249). Do interesujących miRNA zidentyfikowanych w MSC-EVs należą także: miRNA-132, które przeciwdziała apoptozie i stresowi oksydacyjnemu w komórkach miokardium w sytuacji niewydolności serca (224) oraz miRNA-382, którego nadekspresja znacząco zwiększa proliferację komórek śródbłonka, ich migrację oraz tworzenie struktur kapilaropodobnych (225). Uzyskane przeze mnie wyniki badań odnośnie profilu miRNA w MSC-EVs oraz ich odniesienie do danych literaturowych, sugerują udział cząsteczek miRNA przenoszonych przez te pęcherzyki w regulacji m.in. procesów angiogenezy, proliferacji oraz migracji w komórkach endogennych uszkodzonych tkanek, w tym tkanek serca, a także ich działanie cytoprotekcyjne, co ma również istotne znaczenie z punktu widzenia ograniczenia utraty funkcjonalnych komórek danej tkanki. Wspomniana aktywność MSC-EVs w procesach naprawczych w tkankach, może zależeć także od przenoszonych transkryptów mRNA, co potwierdzają również badania uzyskane w tej pracy. Wykazałam bowiem także, że MSC-EVs mogą przenosić m.in. cząsteczki mRNA genów antyapoptotycznych (Bcl-2), jak również związanych z aktywacją procesów angiogenezy (VE-kadheryna, Gata-2) oraz kardiomiogenezy (Gata-4). Poziom transkryptów dla większości tych genów jest wprawdzie niższy w MSC-EVs w porównaniu z komórkami MSCs - z wyjątkiem mRNA dla Gata-4, czyli kluczowego czynnika transkrypcyjnego regulującego kardiomiogenezę (268) - jednakże wciąż może mieć znaczenie w regulacji tych procesów w komórkach docelowych, jeśli transfer tych transkryptów byłby wystarczająco efektywny. Podsumowując, MSC-EVs mogą przenosić biaktywną zawartość pochodzącą z komórek rodzicielskich, na którą składają się m.in. białka, mRNA oraz miRNA, co zbadano w tej pracy. Rosnąca liczba badań wskazuje również, że EVs mogą przenosić także długie niekodujące RNA (lncRNA) o działaniu regulatorowym oraz bioaktywne lipidy (269,270), które nie były badane w tej pracy. Cząsteczki lncRNA, należące wraz z miRNA do grupy niekodujących RNA, mogą także pełnić rolę regulatorową, np. modulować aktywność oraz lokalizację kompleksów regulatorowych chromatyny (271). Tego typy badania zawartości lncRNA w MSC-EVs byłyby interesujące w celu pogłębionej analizy ich bioaktywnej zawartości, a także potencjalnego udziału w regeneracji. Co więcej, wykazano także, że egzosomy wykazują 2-3 krotne wzbogacenie w wybrane lipidy - w porównaniu do komórek rodzicielskich, w tym m.in. w cholesterol, sfingomielinę, glikosfingolipidy oraz fosfatydyloserynę (272). Skład lipidów w MSC-EVs, który nie był badany w tej pracy może mieć również potencjale znaczenie dla ich aktywości biologicznej, co stanowi z pewnością ciekawy aspekt poznawczy i temat dla przyszłych badań. Wpływ MSC-EVs na wybrane funkcje komórek docelowych in vitro W kolejnym etapie badań objętych niniejszą pracą doktorską, zbadano internalizację MSC-EVs przez mysie komórki śródbłonka naczyń serca (MCEC) w warunkach kontrolnych oraz w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego (tj. w obecności mediatorów stanu zapalnego oraz w hipoksji). Wiadomo, że EVs mogą wnikać do komórek akceptorowych na drodze endocytozy niezależnej od klatryny oraz makropinocytozy (273). W wyniku przeprowadzonych w niniejszej pracy eksperymentów, zaobserwowano zwiększoną internalizację MSC-EVs do komórek docelowych w warunkach imitujących stan zapalny w odniesieniu do warunków kontrolnych, szczególnie krótko (po 4h) od momentu dodania MSC-EVs. Na powierzchni komórek śródbłonka naczyniowego aktywowanego cytokinami prozapalnymi (tj. IL-1β, TNF-α), zaobserwowano wzrost ekspresji cząsteczek adhezyjnych VCAM-1 (CD106) oraz ICAM-1 (CD54) oraz selektyny P, które są zaangażowane typowo w adhezję subpopulacji leukocytów do endotelium (226). Jednakże wzrost gęstości antygenów na powierzchni komórek śródbłonka może zwiększać adhezję także innych komórek lub cząsteczek posiadających na swej powierzchni ligadny dla w/w cząsteczek adhezyjnych, w tym potencjalnie również MSC-EVs. Ligandem dla ICAM-1 jest cząsteczka LFA-1 (heterodimer złożony z podjednostki integrynowej αL oraz β2) (274), natomiast ligandem dla VCAM-1 jest cząsteczka VLA-4 (heterodimer złożony z podjednostki integrynowej α4 oraz β1) oraz LPAM-1 (heterodimer złożony z podjednostki integrynowej α4 oraz β7) (275). Na powierzchni MSC-EVs zidentyfikowałam w ramach niniejszej pracy, aż 106 białek uczestniczących w adhezji komórkowej, wśród których znajdowały się także m.in. integryny αL, β2, α4 oraz β1, które mogą oddziałowywać z cząsteczkami adhezyjnymi na aktywowanym śródbłonku naczyniowym, w tym z ICAM-1 i VCAM-1. Z kolei ligandami dla P-selektyny (CD62P) oraz E-selektyny (CD62E) są antygeny CD162, CD24 oraz sialylowana cząsteczka Lewis X (276,277). Obok klasycznej funkcji wiązania frakcji dojrzałych komórek krwi do śródbłonka naczyniowego, E- i P-selektyny mogą być zaangażowane także m.in. w pierwszy etap wiązania się KM krwiotwórczych (HSCs) do komórek śródbłonka naczyniowego, co poprzedza etapy toczenia się tych komórek po powierzchni śródbłonka, a następnie ich przenikania do tkanek (278). Szczególnie istotną rolę w wiązaniu się komórek HSCs do powierzchni śródbłonka, a następnie ich migracji transendotelialnej do niszy osteogennej w szpiku, odgrywają integryny (278). Komórki MCEC - stymulowane w niniejszej pracy czynnikami prozapalnymi - wykazały zwiększoną ekspresję antygenów CD54, CD106 oraz CD62P w porównaniu do niestymulowanych komórek śródbłonka. Z kolei po 4h od momentu dodania MSC-EVs do tych komórek, obserwowano niższy poziom detekcji cząsteczek CD106, CD62E oraz CD62P, co może świadczyć o związaniu się MSC-EVs do powierzchni tych komórek poprzez swoiste oddziaływanie z tymi cząsteczkami, czego efektem było wysycenie części miejsc wiązania dla przeciwciał skierowanych przeciwko tym antygenom, co w efekcie obserwowano jako spadek ekspresji tych antygenów. Wynik ten koreluje z najwyższym poziomem internalizacji MSC-EVs przez te komórki, obserwowanym również po 4h od momentu dodania MSC-EVs. Z kolei po dłuższym czasie koinkubacji komórek śródbłonka z MSC-EVs (po 24h od momentu dodania MSC-EVs), gęstość antygenów CD106, CD62E oraz CD62P zwiększyła się w porównaniu do wartości obserwowanych po 4h. Może to świadczyć o internalizacji MSC-EVs do komórek akceptorowych i powrocie ekspresji cząsteczek błonowych do poziomu zbliżonego do poziomu obserwowanego po stymulacji cytokinami prozapalnymi. W doświadczeniach w niniejszej pracy zbadano także na powierzchni komórek MCEC, gęstość wybranych antygenów typowo występujących na mysich komórkach MSCs, w tym CD90 oraz Sca-1 (82–84). Antygeny te choć powszechnie występują na powierzchni komórek MSCs, mogą występować także na powierzchni komórek śródbłonka myszy (279,280). W przeprowadzonych badaniach, w przypadku antygenu CD90 zaobserwowano spadek gęstości tego antygenu na powierzchni komórek MCEC na skutek stymulacji prozapalnej, natomiast dodanie MSC-EVs spowodowało kolejny spadek jego gęstości na powierzchni tych komórek (po 4h). Z kolei w przypadku antygenu Sca-1, stymulacja prozapalna spowodowała istotny wzrost gęstości tego antygenu, natomiast po 4h od momentu dodania MSC-EVs obserwowano znaczny spadek gęstości tego antygenu, co może świadczyć o związaniu się pęcherzyków do powierzchni MCEC poprzez tę cząsteczkę i wysyceniu miejsc wiązania dla przeciwciała anty-Sca-1. Wyniki innych badań światowych wskazują, że antygen Sca-1 może wiązać się z kompleksem integryn αVβ3 na innych komórkach i stymulować m.in. adhezję komórek satelitarnych mięśni (227). Ponieważ na powierzchni MSC-EVs występują integryny αV oraz β3, takie oddziaływania mogą zatem zachodzić między komórkami śródbłonka, a MSC-EVs, co tłumaczy obserwowany w moich badaniach spadek dostępności antygenu Sca-1 po dodaniu pęcherzyków. Zatem wzrost molekuł adhezyjnych na komórkach śródbłonka w stanie zapalnym może zwiększać oddziaływanie tych komórek z MSC-EVs oraz ich internalizację, co może mieć istotne znaczenie dla działania tych EVs szczególnie w miejscach uszkodzenia tkankowego, gdzie taki stan zapalny się toczy, czyli m.in. w uszkodzonym mięśniu sercowym oraz niedotlenionych tkankach kończyn. Co ważniejsze, wzrost internalizacji MSC-EVs w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego koreluje ze wzrostem żywotności komórek MCEC (mierzonej w 4h od momentu dodania MSC-EVs). Sama ekspozycja komórek śródbłonka na czynniki stanu zapalnego powodowała istotne obniżenie żywotności komórek MCEC w odniesieniu do warunków kontrolnych. Tymczasem dodanie do komórek pęcherzyków (MSC-EVs) powodowało istotny statystycznie wzrost żywotności komórek MCEC – do poziomu zbliżonego do komórek nieeksponowanych na czynniki prozapalne, co wyraźnie świadczy o aktywności cytoprotekcyjnej MSC-EVs względem komórek śródbłonka. Jak wcześniej wspomniano, MSC-EVs mogą przenosić szereg czynników antyapoptotycznych, w tym miRNA-132 oraz miRNA-21-3p, które były już opisywane jako miRNA o znaczeniu cytoprotekcyjnym (224,281). Co więcej, MSC-EVs mogą także przenosić antyapototyczne transkrypty mRNA, w tym dla genu Bcl-2, który stanowi jeden z głównych czynników hamujących apoptozę (282). Wyniki badań opublikowanych przez naszą grupę wskazują, że również EVs otrzymane z hodowli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą podnosićżywotność komórek śródbłonka w warunkach cytotoksycznych, co także jest zależne od zawartości molekularnej EVs, w tym szczególnie miRNA (114). W niniejszej pracy wykazano także, że MSC-EVs mogą zawierać i przenosić także białka oraz miRNA o działaniu proangiogennym. Dlatego też, w celu potwierdzenia wpływu MSC-EVs na potencjał angiogenny komórek akceptorowych (MCEC), wykonałam test tworzenia kapilar na matriżelu, który stanowi jeden z głównych, szeroko stosowanych przez badaczy testów oceniających potencjał angiogenny komórek in vitro (208). Sama ekspozycja komórek MCEC na czynniki stanu zapalnego (tj. inkubacja z cytokinami prozapalnymi IL-1β oraz TNF-α) nie wpłynęła na liczbę tworzonych struktur kapilarnych przez te komórki w porównaniu do komórek kontrolnych. Natomiast co istotne, dodanie MSC-EVs znacząco zwiększało potencjał komórek MCEC do tworzenia kapilar, w porównaniu do komórek kontrolnych. Z kolei, co ważne, dodanie MSC-EVs do komórek MCEC eksponowanych na cytokiny prozapalne, zwiększało potencjał angiogenny tych komórek - szczególnie w pierwszych godzinach trwania obserwacji, co może świadczyć o szybkim efekcie działania MSC-EVs związanym z transferem bioaktywnych cząsteczek do komórek śródbłonka. Otrzymane wyniki świadczą, że nanocząsteczki MSC-EVs mogą odziaływać na kluczowe funkcje komórek akceptorowych, jakimi są komórki śródbłonka, poprzez dostarczenie białek, mRNA, miRNA, czynników transkrypcyjnych, co było również opisywane w literaturze (214). Jak wcześniej wspomniano, MSC-EVs mogą przenosić szereg białek, mRNA oraz miRNA zaangażowanych w regulację procesów angiogenezy, co może tłumaczyć efekt zwiększenia potencjału angiogennego komórek śródbłonka po inkubacji z MSC-EVs, obserwowany w badaniach in vitro. Badanie zasiedlania niedotlenionych tkanek przez MSC-EVs w mysich modelach niedokrwiennego uszkodzenia tkanek in vivo W kolejnym etapie badań objętych niniejszą pracą doktorską zbadano retencję MSC-EVs do różnych tkanek, podanych do żyły szyjnej w mysim modelu ostrego zawału mięśnia sercowego (ang. acute myocardial infarction, AMI). Zaobserwowałam, że niezależnie od czasu jaki upłynął od momentu reperfuzji do momentu dożylnego podania MSC-EVs (tj. 30 min. lub 48h), to krótko po podaniu pęcherzyków (4h) obserwowano ich akumulację przede wszystkim w wątrobie oraz w śledzionie, podczas gdy po 24h sygnał pochodzący od wybarwionych fluorescencyjnie MSC-EVs obserwowano wyłącznie w wątrobie. Świadczy to o tym, że MSC-EVs podane dożylnie ulegają bardzo szybkiemu usuwaniu z krwioobiegu i trafiają głównie do organów, gdzie w pierwszej kolejności napotykają naczynia włosowate, w tym do wątroby (283). Badania dotyczące retencji komórek macierzystych podawanych dożylnie także wskazują, że m.in. wątroba oraz śledziona stanowią te organy, które zatrzymują znaczną część przeszczepionych obiektów, co może zmniejszać efektywność regeneracji (284). W przypadku MSC-EVs, takie badania w modelu AMI jak dotąd nie były prowadzone, natomiast wyniki przedstawione w niniejszej pracy stanowią jedne z pierwszych badań w tym zakresie. Co istotne, nie obserwowano wyraźnego sygnału fluorescencji pochodzącego od przeszczepionych pęcherzyków w tkankach płuc, nerek, przewodu pokarmowego, szpiku kostnego, mięśni szkieletowych, a przede wszystkim w tkankach serca, gdzie doszło do uszkodzenia, co potwierdzono także w badaniach histologicznych z zastosowaniem mikroskopii konfokalnej. Jedynie w tkankach serca - w badaniach obrazowych, zaobserwowano pojedyncze skupisko sygnału fluorescencji pochodzącego od MSC-EVs, świadczące o niskim, ale jednak mającym miejsce „zasiedlaniu” tego organu przez krążące pęcherzyki. Otrzymane wyniki świadczą, że MSC-EVs podane dożylnie nie podlegają znaczącej retencji w mięśniu sercowym, prawdopodobnie z powodu szybkiej hemodynamiki tego narządu. Jednak, wyniki badańświatowych wskazują, że egzosomy uzyskane z hodowli komórek MSCs podane dożylnie mogą redukować obszar uszkodzenia pozawałowego mięśnia sercowego (196), co wyraźnie wskazuje jednak na konieczność „zasiedlania” tej tkanki przez krążące EVs lub na inne mechanizmy odziaływania EVs z tkankami miokardium, które efektywnie mogą stymulować endogenne mechanizmy naprawcze. Pytanie, czy zachodzą one na drodze internalizacji EVs do tkanek miokardium, czy mają charakter działania głównie na komórki śródbłonka serca, pozostaje wciąż otwartym pytaniem. Brak sygnału fluorescencji pochodzącego z mięśnia sercowego wizualizowanego systemem In Vivo Optical Imaging System (przeznaczonego głównie do pomiaru luminescencji), może bowiem świadczyć o zbyt niskiej zdolności rozdzielczej tego urządzenia lub o rzeczywistym bardzo niskim „zasiedlaniu” tkanek serca przez krążące pęcherzyki. Nie można wykluczyć, że zwiększenie dawki podanych dożylnie MSC-EVs mogłoby wzmocnić sygnał i potwierdzić obecność MSC-EVs w sercu. Badania innego zespołu wykazały, że biodystrybucja EVs w tkankach zależy m.in. od rodzaju komórek, z których pochodzą, drogi podania EVs oraz komórek docelowych, z którymi w szczególności oddziałują dzięki specyficznym molekułom, które przenoszą (283). Dla przykładu, EVs otrzymane z hodowli ludzkich komórek MSCs podane do żyły ogonowej zdrowych myszy wykazują retencję w wątrobie, śledzionie, przewodzie pokarmowym oraz płucach (283). W mojej ocenie – wynikającej w własnych badań i obserwacji, obecność sygnału fluorescencji w przewodzie pokarmowym nie jest wynikiem gromadzenia się EVs, ale wynika raczej z wysokiej autofluorescencji treści pokarmowej, ponieważ po jej wypłukaniu z każdego odcinka tego przewodu, fluorescencja przestaje być obserwowana, czego doświadczyłam we własnych badaniach. W modelu zwierzęcym ostrego uszkodzenia nerek obserwowano retencję EVs nie tylko w wątrobie, śledzionie oraz płucach, czyli typowych organach wychwytujących EVs, ale także w nerkach (285), co świadczy, że pęcherzyki mogą wykazywać jednak pewnego rodzaju „tropizm” do miejsca uszkodzenia. Z kolei w szczurzym modelu udaru mózgu, po podaniu dożylnym MSC-EVs, obserwowano ponownie ich akumulację w wątrobie, śledzionie oraz płucach, ale również słaby sygnał w mózgu (286), co potwierdza „zasiedlanie” miejsc uszkodzeń. Biorąc pod uwagę, że niektóre grupy badawcze obserwowały obecność EVs w uszkodzonych nerkach i mózgu po ich dożylnym przeszczepieniu (285,286), w kolejnym etapie badań objętych niniejszą pracą doktorską, zbadano biodystrybucję MSC-EVs podanych do żyły ogonowej w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny (ang. limb ischemia, LI) – w wybranych narządach oraz niedotlenionych kończynach. W związku z tym, że we wcześniejszych badaniach in vitro, internalizację MSC-EVs obserwowałam szczególnie krótko po ich dodaniu (4h) do hodowli komórek MCEC, również w modelu in vivo narządy izolowałam od myszy po 4h od podania MSC-EVs do żyły ogonowej, a następnie po dobie od ich przeszczepienia. W badaniach wykazałam zwiększoną obecność MSC-EVs w nerkach, wątrobie oraz śledzionie myszy po 4h od momentu ich podania do żyły ogonowej, która była już jednak niższa po 24h od podania, co wskazuje na potencjalny szybki wpływ podanych MSC-EVs na komórki endogenne w uszkodzeniu i ich szybkie przemetabolizowanie w komórkach. Co ważniejsze, w badaniach obserwowano także retencję MSC-EVs w uszkodzonych kończynach po 4 oraz 24h od dożylnego podania. Jest to pierwsze doniesienie naukowe pokazujące znaczące „zasiedlanie” pęcherzyków MSC-EVs w niedotlenionych tkankach kończyn dolnych po uszkodzeniu niedokrwiennym. Wcześniejsze badania in vitro, przeprowadzone w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej wykazały, że MSC-EVs przenoszą na swej powierzchni wiele białek związanych z adhezją komórkową, w tym cząsteczki uczestniczące w wiązaniu do powierzchni komórek śródbłonka naczyniowego. Można zatem postulować, że MSC-EVs są bardzo szybko przenoszone wraz z krwią, a następnie podlegają adhezji do aktywowanego śródbłonka naczyniowego, co może częściowo tłumaczyć fenomen „tropizmu” MSC-EVs do miejsca uszkodzenia tkankowego w kończynach. Badania biodystrybucji EVs po podaniu dożylnym wykazały, że cząsteczki te podlegają szybkiej fazie transportu do wątroby, nerek, płuc oraz śledzony, a następnie dłuższej fazie ich usuwania z organizmu za pośrednictwem wątroby i nerek (287,288). U zwierząt zdrowych nie wykazano akumulacji EVs w mięśniach szkieletowych, szpiku kostnym, sercu, żołądku (289). W mysim modelu uszkodzenia nerek, obserwowano retencję EVs w nerkach, wątrobie, śledzionie oraz bardzo słaby sygnał w płucach (285). Fenomen „tropizmu” pęcherzyków do uszkodzonych tkanek nie może być tłumaczony w mojej ocenie aktywną migracją tych obiektów w odpowiedzi na gradient sygnałów chemicznych wydzielanych w miejscu uszkodzenia – jak ma to miejsce w przypadku komórek – ponieważ EVs nie są obiektami żywymi, które w sposób aktywny mogłyby odpowiadać na sygnały chemiczne i podejmować aktywną migrację. Przypuszczam, że obserwowane zjawisko ma związek ze zmianami zachodzącymi na powierzchni aktywowanego śródbłonka – w miejscu, w którym toczy się stan zapalny – co zwiększa „lepkość” tego śródbłonka i wiązanie pęcherzyków w miejscu uszkodzenia. Obserwacje te stanowią istotne przesłanki dla dalszych optymalizacji preparatów leczniczych opartych o EVs, które można by podawać dożylnie – wciąż uzyskując efekt terapeutyczny w uszkodzonych tkankach. Ocena potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w modelach niedokrwiennego uszkodzenia tkanek in vivo W następnym etapie, zbadano potencjał regeneracyjny MSC-EVs w mysim modelu AMI. W tym celu myszy poddano zabiegowi ischemiczno- reperfuzyjnego uszkodzenia mięśnia sercowego, a następnie po 2 dniach po zabiegu podawano MSC-EVs bezpośrednio do mięśnia sercowego, w okolicę okołozawałową. Wybrano podanie bezpośrednio do mięśnia sercowego ze względu na niską retencję po dożylnym podawaniu MSC-EVs w tym narządzie, aby zwiększyć efektywność działania MSC-EVs. Tego typu domięśniowe, epikardialne podania, stanowią jedną z głównych dróg podania komórek w modelach zwierzęcych, jakie opracowano w celu podawania preparatów komórkowych w leczeniu uszkodzeń miokardium, celem zwiększenia ich skuteczności (108). W wybranych punktach czasowych, w badaniach ujętych w niniejszej pracy, wykonywano echokardiografię u każdego zwierzęcia w celu oceny parametrów funkcjonalnych oraz strukturalnych serca. Zaobserwowano, że już w 9 dniu od zabiegu (czyli 7 dni po podaniu preparatów komórkowych lub MSC-EVs), w grupie zwierząt, którym podano MSC-EVs, zaobserwowano istotną poprawę parametru LVEF - frakcji wyrzutowej lewej komory (LK) serca oraz innych parametrów świadczących o poprawie funkcji i anatomii mięśnia sercowego – w porównaniu do grupy kontrolnej zwierząt, której podawano jedynie roztwór soli PBS. W przypadku zwierząt, którym podano komórki MSCs, również obserwowano poprawę parametrów funkcji serca w porównaniu z grupą kontrolną, jednak poprawa ta nie była tak znamienna jak to obserwowano w grupie myszy, którym podawano MSC-EVs. Zaobserwowane efekty po podaniu komórek MSCs, a w szczególności MSC-EVs, utrzymywały się aż do zakończenia eksperymentu, czyli do 32 dnia po zabiegu AMI. W przypadku analizy parametrów anatomicznych serca, u myszy którym podano MSC-EVs obserwowano takze istotną poprawę parametrów świadczących o spowolnieniu procesów niekorzystnej przebudowy (remodelingu) uszkodzonych tkanek serca, w tym istotne zwiększenie grubości ściany LK serca objętej zawałem podczas rozkurczu, w porównaniu do grupy kontrolnej zwierząt. Zaobserwowane zmiany histologiczne mogą świadczyć o zmniejszeniu utraty miokardium, jak również zahamowaniu przerostu pewnych obszarów mięśnia sercowego obserwowanych w grupach zwierząt, którym podawano MSC-EVs oraz komórki MSCs. Otrzymane wyniki potwierdzają zatem także korzystny wpływ podania całych komórek MSCs na parametry funkcjonalne i strukturalne LK serca, co było już wcześniej wielokrotnie opisywane także przez innych badaczy (100,101,107,108,111,112). Jednakże, w związku z tym, że badane parametry funkcji i struktury serca, nie wykazały znacznej poprawy w przypadku podawania całych komórek MSCs, a wręcz przeciwnie ulegały zwiększonej poprawie w przypadku podania MSC-EVs, może to świadczyć, że efekt regeneracyjny obserwowany po podaniu komórek MSCs zależy głównie od ich aktywności parakrynnej, w tym wydzielania MSC-EVs w miejscu przeszczepienia, a nie zależy istotnie od bezpośredniego różnicowania tych komórek w komórki miokardium, co powinno przełożyć się na znamiennie wyższą poprawę funkcji serca. Te obserwacje stoją w zgodzie z dotychczasowymi badaniami wskazujacymi, że poprawa funkcji serca po podaniu komórek MSCs, zależy głównie od ich aktywności wydzielniczej - o działaniu m.in. cytoprotekcyjnym, immunomodulacyjnym oraz aktywującym endogenne mechanizmy naprawcze (102,196,290). Badania uzyskane w niniejszej pracy wskazują, że być może w przyszłości podania całych komórek MSCs będzie można zastąpić przeszczepami preparatów MSC-EVs o porównywalnej (lub większej) efektywności biologicznej i naprawczej. Również nieliczne badania innych zespołów potwierdzają skuteczność terapeutyczną MSC-EVs w leczeniu uszkodzeń mięśnia sercowego w modelach zwierzęcych (194,196). W związku z zaobserwowaną retencją MSC-EVs w uszkodzonych tkankach kończyny, zbadano także potencjał regeneracyjny tych nanocząstek podawanych kilkukrotnie dożylnie (co 3 dni począwszy od dnia wystąpienia niedotlenienia tkanek) w modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny (LI). Przeprowadzone badania wykazały istotnie zwiększoną perfuzję krwi w tkankach uszkodzonej kończyny już w 7 dniu od uszkodzenia w grupie zwierząt, którym podawano MSC-EVs w odniesieniu do grupy kontrolnej, której podawano jedynie neutralny nośnik (sól PBS). Podwyższona perfuzja krwi w uszkodzonej kończynie utrzymywała się w każdym badanym punkcie czasowym aż do 21 dnia od uszkodzenia, kiedy zakończono eksperyment. W przypadku grupy kontrolnej myszy, również obserwowano wzrost perfuzji krwi w badanych punktach czasowych, co świadczy o postępującej samoregeneracji uszkodzonych tkanek. Z wcześniej wykonanych badań w ramach realizacji innego projektu badawczego, wynika, że uszkodzeniu niedokrwiennemu kończyny towarzyszy stan zapalny. Samoustępujące zapalenie jest pierwszym etapem naprawy uszkodzenia/ rany, po którym następuje tworzenie się tkanki ziarninowej i jej ewentualna przebudowa (291,292), w tym tworzenie się nowych naczyń krwionośnych. Różne czynniki uwalniane przez uszkodzony lub aktywowany śródbłonek naczyniowy, w tym reaktywne formy tlenu, mogą stymulować makrofagi, limfocyty oraz fibroblasty do wydzielania cytokin prozapalnych, które mogą mieć działanie niekorzystne dla tkanek, ale mogą także aktywować endogenne komórki macierzyste rezydujące w określonych tkankach i promować efekty regeneracyjne (291). Wzrost perfuzji tkanek kończyny po uszkodzeniu ischemicznym - obserwowany w grupie zwierząt, którym podawano MSC-EVs, był skorelowany ze wzrostem gęstości kapilar w tkankach mięśniowych pobranych post-mortem po zakończeniu eksperymentu (21 dzień). Wzrost liczby kapilar świadczy o powstaniu krążenia obocznego, które zastępuje funkcje zablokowanego i przeciętego głównego naczynia krwionośnego (tętnicy udowej) oraz zaopatruje tkanki kończyny w tlen oraz substancje odżywcze, co obserwuje się w takim uszkodzeniu (8,293). Efektywność powstawania takiego krążenia obocznego jest związana z aktywnością proangiogenną preparatów podawanych do uszkodzonych tkanek (259). Z kolei wzrost liczby kapilar obserwowany po podaniu preparatów MSC-EVs, był skorelowany ze wzrostem poziomu tlenku azotu (NO) w tkankach mięśniowych zwierząt, którym podawano MSC-EVs i był wyraźnie wyższy, w porównaniu do grupy kontrolnej zwierząt. NO ogrywa istotną rolę w modulacji angiogenezy, która polega na stymulacji proliferacji oraz różnicowania komórek śródbłonka, dzięki aktywacji syntazy NO (eNOS) (294). W tkankach mięśni szkieletowych obu grup zwierząt – którym podawano roztwór soli PBS (kontrola) lub MSC-EVs - w końcowym punkcie eksperymentu, w którym pobierano tkanki do dalszych analiz biochemicznych, nie obserwowano zwiększonego poziomu O2-, co świadczy o tym, że MSC-EVs nie wywołują wtórnego stanu zapalnego po przeszczepieniu. Doniesienia literaturowe wskazują, że EVs wydzielane przez komórki MSCs wykazują właściwości przeciwzapalne poprzez m.in. hamowanie szlaku sygnałowania, w który zaagnażowane są białko STAT3, blokowanie funkcji limfocytów T, jak również modyfikację wydzielania cytokin przez komórki dendrytyczne, limfocyty T i komórki NK (295,296). Efekt antyzapalny wywierany przez podane MSC-EVs był także obserwowany przez inne grupy badawcze (249). Badania proteomiczne przeprowadzone w niniejszej pracy wykazały, że MSC-EVs mogą przenosić białka o działaniu proangiogennym. W związku z tym, wykonano analizę Western blot zabezpieczonych tkanek mięśni w celu detekcji aktywacji wybranych szlaków związanych z angiogenezą – szlaków, w które zaangażowane są białka eNOS oraz Akt. Zaobserwowano wzrost ekspresji ufosforylowanej formy eNOS w stosunku do całkowitej puli tego białka, co świadczy o aktywacji tego szlaku w grupie zwierząt której podawano MSC-EVs w odniesieniu do grupy kontrolnej. Natomiast poziom ufosforylowanej formy Akt w tej grupie utrzymywał się na niezmienionym poziomie. Wzrost ekspresji ufosforylowanej formy białka eNOS był skorelowany ze spadkiem ekspresji kaweoliny-1 w tkankach pobranych z niedotlenionych kończyn myszy, którym podawano MSC-EVs w odniesieniu do myszy grupy kontrolnej (którym podawano roztwór soli PBS). Kaweolina-1 jest białkiem, które powoduje inaktywację cząsteczki eNOS, w rezultacie czego maleje produkcja NO (230). Nie obserwowano natomiast wzrostu poziomu silnie proangiogennego czynnika wzrostowego VEGF po podawaniu MSC-EVs. Ze względu na fakt, że analizę wykonano w tkankach pobranych od myszy w 21 dniu od zabiegu, nie można wykluczyć, że wzrost tego białka mógł wystąpić we wcześniejszych punktach doświadczalnych. Co ciekawe, wykazano nieznaczny wzrost ekspresji białka Lyve-1, które uczestniczy w procesach limfangiogenezy. Choć pojawiło się doniesienie naukowe mówiące o udziale limfangiogenezy w procesie regeneracji skóry (231), wciąż niewiele wiadomo o jej udziale w regeneracji niedotlenionych tkanek. W literaturze głównie opisuje się udział limfangiogenezy w procesach nowotworowych (297). Zaobserwowany wzrost ekspresji białka Lyve-1, może świadczyć, że MSC-EVs być może odpowiadają za regenerację uszkodzonych tkanek na drodze stymulacji procesów angiogenezy i limfangiogenezy. Niniejsza praca doktorska zawiera jedno z pierwszych doniesienień mówiących o potencjalnym udziale tego zjawiska w procesie regeneracji niedotlenionych tkanek w modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny LI i jest częścią wspólnej publikacji przygotowywanej obecnie wraz z zespołem Prof. Ramarosona Andriantsitohaina z INSERM U1063, Stress Oxydant et Pathologies Métaboliques, Institut de Biologie en Santé, Angers z Francji, we współpracy z którym ta część badań została wykonana w czasie mojego stażu w tym instytucie. W mojej pracy wykazałam, że MSC-EVs mogą przenosić wiele białek zaangażowanych w proliferację komórek, odpowiedź na uszkodzenie tkankowe, gojenie się ran i uszkodzeń, jak również rozwój struktur anatomicznych, co świadczy o ich potencjalnym udziale w regulacji procesów różnicowania się komórek w tkankach. Co więcej, wykazałam, że mogą one przenosić także szereg czasteczek miRNA, będących regulatorami ekspresji wielu ważnych genów. Wykonane w ramach niniejszej pracy doktorskiej badanie przedkliniczne biodystrybucji MSC-EVs jest pierwszym doniesiem wskazującym na niewielką retencję MSC-EVs w mięśniu sercowym po podaniu dożylnym, a także pierwszym doniesieniem pokazującym taką retencję MSC-EVs w uszkodzonych mięśniach kończyny. Co istotne, potencjał regeneracyjny frakcji MSC-EVs – stanowiącej mieszaninę ektosomów i egzosomów otrzymanych z komórek MSCs szpiku kostnego, zbadany w modelach ostrego zawału mięśnia sercowego oraz niedokrwiennego uszkodzenia kończyny, został w niniejszej pracy skorelowany z szczegółową charakterystyką molekularną i funkcjonalną MSC-EVs, co stanowi w mojej ocenie główny walor przeprowadzonych badań – wskazując na potencjalne mechanizmy działania MSC-EVs w uszkodzonych tkankach. Wyniki badańświatowych pokazują, że komórki MSCs, jak również pochodzące z nich EVs mają podobny mechanizm promowania regeneracji uszkodzonych tkanek poprzez parakrynne działanie na endogenne komórki (298), jednak terapia przy udziale MSC-EVs wydaje się być bezpieczniejsza niż w przypadku podawania całych komórek, co z pewnością wymaga dalszych optymalizacji. Warto zauważyć na zakończenie, że choć EVs nie mają jeszcze swojego miejsca w klasyfikacji biologicznych produktów leczniczych terapii zaawansowanych, jak ma to miejsce w przypadku komórek macierzystych, doniesienia literaturowe pokazują, że podejmowane są działania mające na celu klasyfikację tych nanocząsteczek jako biologicznych produktów leczniczych (299). Co więcej, pierwsze grupy badawcze podejmują działania mające na celu optymalizację procedur wytwarzania tych preparatów zgodnie z zasadami Dobrej Praktyki Wytwarzania (ang. Good Manufacturing Practice), a tym samym także doprecyzowania kryteriów zwolnienia wytworzonych preparatów do podania do pacjentów (300). Z pewnością niedaleka przyszłość przyniesie nie tylko nowe informacje odnośnie natury biologicznej i potencjału EVs pochodzących z KM, w tym MSCs, ale również nowe podejścia do ich wytwarzania w standardzie umożliwiającym przyszłe, praktyczne zastosowania terapeutyczne u pacjentów. 6. PODSUMOWANIE I WNIOSKI KOŃCOWE Najważniejsze osiągnięcia i wyniki uzyskane w niniejszej pracy doktorskiej obejmują: 1. Charakterystykę wieloantygenową oraz potwierdzenie potencjału multipotencjalnego mysich komórek MSCs; 2. Izolację MSC-EVs oraz charakterystykę ich morfologii, rozkładu wielkości oraz składu molekularnego, potwierdzającego obecność bioaktywnej zawartości komórek rodzicielskich MSCs, w tym białek zaangażowanych w komunikację międzykomórkową oraz procesy regeneracji uszkodzonych tkanek, a także transkryptów miRNA oraz mRNA wykazujących działanie proangiogenne oraz cytoprotekcyjne; 3. Ocenę funkcjonalną wpływu MSC-EVs na komórki śródbłonka mięśnia sercowego, w warunkach kontrolnych, jak również imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego, potwierdzającą m.in. potencjał proangiogenny i cytoprotekcyjny badanych preparatów MSC-EVs in vitro, co może mieć istotne znaczenie dla ich potencjału regeneracyjnego in vivo; 4. Analizę retencji MSC-EVs podanych dożylnie w mysim modelu zawału serca in vivo, potwierdzającą niewielką obecność MSC-EVs w tkankach uszkodzonego serca przy takiej drodze podania; 5. Analizę retencji MSC-EVs podanych dożylnie w modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo, potwierdzającą tropizm MSC-EVs do uszkodzonych tkanek kończyny; 6. Porównanie potencjału regeneracyjnego komórek MSCs oraz preparatów MSC-EVs podanych domięśniowo w mysim modelu zawału serca in vivo, gdzie wykazano poprawę czynności mięśnia sercowego oraz zahamowanie niekorzystnej przebudowy tkanek serca po podaniu MSC-EVs; 7. Ocenę potencjału regeneracyjnego MSC-ECs podawanych dożylnie w mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo, gdzie wykazano wzrost perfuzji niedotlenionych tkanek oraz towarzyszący temu wzrost gęstości kapilar w tych tkankach, skorelowany z aktywacją szlaków proangiogennych. Najważniejsze wnioski płynące z przedstawionych badań: 1. Komórki MSCs mogą stanowićźródło pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przenoszących bioaktywną zawartość komórek rodzicielskich, które mogą modulować funkcje komórek docelowych, zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo, co można wykorzystać w regeneracji tkanek. 2. MSC-EVs ze względu na promowane efekty regeneracyjne, mogą częściowo zastąpić preparaty komórkowe – oparte o komórki MSCs, wykorzystywane w regeneracji wybranych uszkodzeń tkankowych. 3. Wykorzystanie bioaktywnych preparatów MSC-EVs w regeneracji uszkodzonych tkanek może stanowić nowy kierunek rozwoju medycyny regeneracyjnej wykorzystującej biologiczne produkty lecznicze terapii zaawansowanej. 7. BIBLIOGRAFIA 1. Wożakowska-Kapłon B. Choroba niedokrwienna serca- aspekty kliniczne i społeczne. Stud Med Akad Świętokrzyskiej. 2003;tom 1:123–33. 2. Novo S, Coppola G, Milio G. Critical Limb Ischemia: Definition and Natural History. Curr Drug Target -Cardiovascular Hematol Disord. 2004;4(3):219–25. 3. Piskorz J, Wójcik G, Iłzecka J, Kozak-Putowska D. Wczesna rehabilitacja pacjentów po udarze niedokrwiennym mózgu. Med Ogólna i Nauk o Zdrowiu. 2014;20(4):351–5. 4. Allen DG, Orchard CH. Myocardial contractile function during ischemia and hypoxia. Circ Res. 1987;60(2):153–68. 5. Pike MM, Luo CS, Clark MD, Kirk KA, Kitakaze M, Madden MC, et al. NMR measurements of Na+ and cellular energy in ischemic rat heart: role of Na(+)-H+ exchange. Am J Physiol. 1993;265(6 Pt 2):H2017-26. 6. Toyoda Y, Shida T, Wakita N, Ozaki N, Takahashi R, Okada M. Evidence of apoptosis induced by myocardial ischemia: A case of ventricular septal rupture following acute myocardial infarction. Cardiology. 1998;90(2):149–51. 7. Hofstra L, Liem IH, Dumont EA, Boersma HH, Van Heerde WL, Doevendans PA, et al. Visualisation of cell death in vivo in patients with acute myocardial infarction. Lancet. 2000;356(9225):209–12. 8. Matsui Y, Morimoto J, Uede T. Role of matricellular proteins in cardiac tissue remodeling after myocardial infarction. World J Biol Chem. 2010;1(5):69–80. 9. Cleutjens JPM, Blankesteijn WM, Daemen MJAP, Smits JFM. The infarcted myocardium: Simply dead tissue, or a lively target for therapeutic interventions. Cardiovasc Res. 1999;44(2):232–41. 10. Cohn JN, Ferrari R, Sharpe N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. J Am Coll Cardiol. 2000;35(3):569–82. 11. Van Den Borne SWM, Diez J, Blankesteijn WM, Verjans J, Hofstra L, Narula J. Myocardial remodeling after infarction: The role of myofibroblasts. Nat Rev Cardiol. 2010; 7(1):30-7. 12. Barallobre-Barreiro J, Didangelos A, Schoendube FA, Drozdov I, Yin X, Fernández-Caggiano M, et al. Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury. Circulation. 2012;125(6):789–802. 13. Cleutjens JP, Verluyten MJ, Smiths JF, Daemen MJ. Collagen remodeling after myocardial infarction in the rat heart. Am J Pathol. 1995; 147(2):325-338. 14. Mozaffarian D, Benjamin EJ, Go AS, Arnett DK, Blaha MJ, Cushman M, et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update a report from the American Heart Association. Circulation. 2016; 133(4):38-48. 15. Cierniak-Piotrowska M, Marciniak G, Stańczak J. Statystyka zgonów i umieralności z powodu chorób układu krążenia. In: Strzelecki Z, Szymborski J, editors. Zachorowalność i umieralność na choroby układu krążenia a sytuacja demograficzna Polski. Główny Urząd Statystyczny; 2015. p. 1– 28. 16. Patel MR, Calhoon JH, Dehmer GJ, Grantham JA, Maddox TM, Maron DJ, et al. ACC/AATS/AHA/ASE/ASNC/SCAI/SCCT/STS 2017 Appropriate Use Criteria for Coronary Revascularization in Patients With Stable Ischemic Heart Disease: A Report of the American College of Cardiology Appropriate Use Criteria Task Force, American Association for T. J Am Coll Cardiol. 2017;69(17):2212–41. 17. Steg PG, James SK, Atar D, Badano LP, Blomström-Lundqvist C, Borger MA, et al. Wytyczne ESC dotyczące postępowania w ostrym zawale serca z przetrwałym uniesieniem odcinka ST. Kardiol Pol. 2012;70(supl. VI):255–318. 18. Nordmann AJ, Hengstler P, Harr T, Young J, Bucher HC. Clinical outcomes of primary stenting versus balloon angioplasty in patients with myocardial infarction: a meta-analysis of randomized controlled trials. Am J Med. 2004;116(4):253–62. 19. Gapska P, Kurpisz M. Perspective in optimization of stem cell therapies for heart regeneration. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej. 71(0):975–87. 20. Gapska P, Kurpisz M. Badania przedkliniczne i próby kliniczne z zastosowaniem czynników proangiogennych w chorobach naczyniowo-sercowych – genetycznie modyfikowane mioblasty. Postępy Pol Med i Farm. 2011;1(1):67–74. 21. Drozdz T, Debicka-Dabrowska D, Styczkiewicz K, Czarnecka D, Kawecka-Jaszcz K. [New nonpharmacological treatment methods in heart failure]. Przegl Lek. 2014;71(8):441–6. 22. Hartley A, Marshall DC, Salciccioli JD, Sikkel MB, Maruthappu M, Shalhoub J. Trends in mortality from ischemic heart disease and cerebrovascular disease in Europe: 1980 to 2009. Vol. 133, Circulation. 2016;133(20):1916–26. 23. Yu H, Lu K, Zhu J, Wang J. Stem cell therapy for ischemic heart diseases. Vol. 121, British Medical Bulletin. 2017;121(1):135–54. 24. Fowkes FGR, Rudan D, Rudan I, Aboyans V, Denenberg JO, McDermott MM, et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: A systematic review and analysis. Vol. 382, The Lancet. 2013;232(9901):1329–40. 25. Socha P, Dyś K, Witkiewicz W, Masłowski L. Wewnątrznaczyniowe leczenie ostrego niedokrwienia kończyn dolnych. 2013;214–8. 26. Callum K, Bradbury A. ABC of arterial and venous disease: Acute limb ischaemia. BMJ. 2000;320(7237):764–7. 27. Bulińska K, Kropielnicka K, Jasiński T, Dąbrowska G, Jasiński R, Katarzyna S-T, et al. Kompleksowa rehabilitacja pacjentów z chromaniem przestankowym w przewlekłym niedokrwieniu kończyn dolnych. Fizjoterapia. 2012;20(4):3–16. 28. Budge J, Patterson B, Loftus I. Acute and chronic limb ischaemia. Surg (United Kingdom). 2016;34(4):183–7. 29. Kwiatkowski A, Nosek R. Choroby układu naczyniowego. In: Chirurgia Ogólna dla Stomatologów. Wydawnictwo Lekarskie PZWL. 2006. 30. Krishna SM, Moxon J V., Golledge J. A review of the pathophysiology and potential biomarkers for peripheral artery disease. Int J Mol Sci. 2015;16(5):11294–322. 31. Chudek J, Ziaja D. Cilostazol w leczeniu niedokrwienia kończyn dolnych Cilostazol in the therapy of lower limb ischemia. Chir Pol. 2014;6–11. 32. Goldstein JA, Mishkel G. Choosing the correct therapeutic option for acute limb ischemia. Vol. 3, Interventional Cardiology. 2011;3:381–9. 33. Szymańska J, Nawotny J, Nowakowska I, Brzęk A, Nawotny-Czupryna O. Wpływ terapii energotonowej na zasięg chodu pacjentów z przewlekłym niedokrwieniem kończyn dolnych. 2011;1(1):279–92. 34. Trounson A, McDonald C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Vol. 17, Cell Stem Cell. 2015;17(1):11–22. 35. Zuba-Surma EK, Guo Y, Taher H, Sanganalmath SK, Hunt G, Vincent RJ, et al. Transplantation of expanded bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells (VSEL-SCs) improves left ventricular function and remodelling after myocardial infarction. J Cell Mol Med. 2011;15(6):1319– 28. 36. Gao LR, Chen Y, Zhang NK, Yang XL, Liu HL, Wang ZG, et al. Intracoronary infusion of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: Double-blind, 160 randomized controlled trial. BMC Med. 2015;13(162):1–15. 37. Zhang J, Wu Y, Chen A, Zhao Q. Mesenchymal stem cells promote cardiac muscle repair via enhanced neovascularization. Cell Physiol Biochem. 2015;35(3):1219–29. 38. Yan B, Abdelli LS, Singla DK. Transplanted induced pluripotent stem cells improve cardiac function and induce neovascularization in the infarcted hearts of db/db mice. Mol Pharm. 2011;8(5):1602–10. 39. Hare JM, Traverse JH, Henry TD, Dib N, Strumpf RK, Schulman SP, et al. A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled, Dose-Escalation Study of Intravenous Adult Human Mesenchymal Stem Cells (Prochymal) After Acute Myocardial Infarction. J Am Coll Cardiol. 2009;54(24):2277–86. 40. Houtgraaf JH, Den Dekker WK, Van Dalen BM, Springeling T, De Jong R, Van Geuns RJ, et al. First experience in humans using adipose tissue-derived regenerative cells in the treatment of patients with ST-segment elevation myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2012;59(5):539–40. 41. Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, Lalykina KS. The development of Fibroblast Colonies in Monolayer Cultures of Guinea�Pig Bone Marrow and Spleen Cells. Cell Prolif. 1970;3(4):393–403. 42. Friedenstein AJ, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova K V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J Embryol Exp Morphol. 1966;16(3):381–90. 43. Elahi KC, Klein G, Avci-Adali M, Sievert KD, Macneil S, Aicher WK. Human mesenchymal stromal cells from different sources diverge in their expression of cell surface proteins and display distinct differentiation patterns. Stem Cells Int. 2016;5646384:1–9. 44. Hayes M, Curley G, Ansari B, Laffey JG. Clinical review: Stem cell therapies for acute lung injury/acute respiratory distress syndrome - hope or hype? Crit Care. 2012;16(205):1–14. 45. Ratajczak MZ. Komórki macierzyste i ich potencjalne wykorzystanie w klinice. Rocz Teol Katol. 2012;XI/1:95–107. 46. Sarugaser R, Hanoun L, Keating A, Stanford WL, Davies JE. Human mesenchymal stem cells selfrenew and differentiate according to a deterministic hierarchy. PLoS One. 2009;4(8):e6498. 47. Elahi KC, Klein G, Avci-Adali M, Sievert KD, Macneil S, Aicher WK. Human mesenchymal stromal cells from different sources diverge in their expression of cell surface proteins and display distinct differentiation patterns. Stem Cells Int. 2016;5646384:1–9. 48. Kern S, Eichler H, Stoeve J, Klüter H, Bieback K. Comparative Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, or Adipose Tissue. Stem Cells. 2006;24(5):1294– 301. 49. Li C, Wu X, Tong J, Yang X, Zhao J, Zheng Q, et al. Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue under xeno-free conditions for cell therapy. Stem Cell Res Ther. 2015;6(1):55. 50. Kim K Il, Park S, Im G Il. Osteogenic differentiation and angiogenesis with cocultured adiposederived stromal cells and bone marrow stromal cells. Biomaterials. 2014;35(17):4792–804. 51. Shen X, Pan B, Zhou H, Liu L, Lv T, Zhu J, et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes is regulated by miRNA-1-2 via WNT signaling pathway. J Biomed Sci. 2017;24(29):1–8. 52. Li H, Yu B, Zhang Y, Pan Z, Xu W, Li H. Jagged1 protein enhances the differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2006;341(2):320–5. 53. Song K, Wang Z, Li W, Zhang C, Lim M, Liu T. In vitro culture, determination, and directed differentiation of adult adipose-derived stem cells towards cardiomyocyte-like cells induced by angiotensin II. Appl Biochem Biotechnol. 2013;170(2):459–70. 54. Rangappa S, Fen C, Lee EH, Bongso A, Wei ESK. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes. Ann Thorac Surg. 2003;75(3):775–9. 55. Nagata H, Ii M, Kohbayashi E, Hoshiga M, Hanafusa T, Asahi M. Cardiac Adipose-Derived Stem Cells Exhibit High Differentiation Potential to Cardiovascular Cells in C57BL/6 Mice. Stem Cells Transl Med. 2016;5(2):141–51. 56. Oswald J, Boxberger S, Jørgensen B, Feldmann S, Ehninger G, Bornhäuser M, et al. Mesenchymal Stem Cells Can Be Differentiated Into Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 2004;22(3):377–84. 57. Chen MY, Lie PC, Li ZL, Wei X. Endothelial differentiation of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in comparison with bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Exp Hematol. 2009;37(5):629–40. 58. Janeczek-Portalska K, Leferink A, Groen N, Fernandes H, Moroni L, van Blitterswijk C, et al. Endothelial Differentiation of Mesenchymal Stromal Cells. PLoS One. 2012;7(10):e46842. 59. Islam A, Bielat KL, Glomski C, Henderson ES. In vitro growth and hemopoietic differentiation of mouse bone marrow-derived adherent stromal cells in long-term culture: formation of spheroidal bodies mimicking hemopoietic anlagen. J Med. 1989;20(3–4):193–207. 60. Kadner A, Hoerstrup SP, Zund G, Eid K, Maurus C, Melnitchouk S, et al. A new source for cardiovascular tissue engineering: Human bone marrow stromal cells. Eur J Cardio-thoracic Surg. 2002;21(6):1055–60. 61. Marlicz W, Zuba-Surma E, Kucia M, Blogowski W, Starzynska T, Ratajczak MZ. Various types of stem cells, including a population of very small embryonic-like stem cells, are mobilized into peripheral blood in patients with Crohn’s disease. Inflamm Bowel Dis. 2012;18(9):1711–22. 62. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 2002;13(12):4279–95. 63. Sharpe PT. Dental mesenchymal stem cells. Development. 2016;143(13):2273–80. 64. Lu L, Liu Y, Yang S, Zhao Q, Wang X, Gong W, et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 2006;91(8):1017–26. 65. Barberini D, Freitas NP, Magnoni M, Maia L, Listoni A, Heckler M, et al. Equine mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue and umbilical cord: immunophenotypic characterization and differentiation potential. Stem Cell Res Ther. 2014;5(1):25. 66. Jin Jin H, Bae YK, Kim M, Kwon S-J, Jeon HB, Choi SJ, et al. Parametric studies of space infrared sensors. Comp Anal Hum Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, Umbilical Cord Blood as Sources Cell Ther. 2013;14:17989–8001. 67. Alvarez-Viejo M, Menendez-Menendez Y, Blanco-Gelaz MA, Ferrero-Gutierrez A, Fernandez-Rodriguez MA, Gala J, et al. Quantifying mesenchymal stem cells in the mononuclear cell fraction of bone marrow samples obtained for cell therapy. Transplant Proc. 2013;45(1):434–9. 68. Minonzio G, Corazza M, Mariotta L, Gola M, Zanzi M, Gandolfi E, et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 2014;69(2):211–6. 69. Raposio E, Simonacci F, Perrotta RE. Adipose-derived stem cells: Comparison between two methods of isolation for clinical applications. Ann Med Surg. 2017;20:87–91. 70. Lu LL, Liu YJ, Yang SG, Zhao QJ, Wang X, Gong W, et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 2006;91(8):1017–26. 71. Gao S, Zhao P, Lin C, Sun Y, Wang Y, Zhou Z, et al. Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells into Neuron-Like Cells Which Are Compatible with Photocurable Three-Dimensional Scaffolds. Tissue Eng Part A. 2014;20(7–8):1271–84. 72. Mu MW, Zhao ZY, Li CG. Comparative study of neural differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by different induction methods. Genet Mol Res. 2015;14(4):14169–76. 162 73. Parivar K, Baharara J, Sheikholeslami A. Neural differentiation of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells treated with sex steroid hormones and basic fibroblast growth factor. Cell J. 2015;17(1):27–36. 74. Hospital TE, Science V, Zhang W, Science V. Differentiation of isolated human umbilical cord mesenchymal stem cells into neural stem cells. Int J Ophthalmol. 2016;9(1):41–7. 75. Rafieemehr H, Kheirandish M, Soleimani M. Improving the neuronal differentiation efficiency of umbilical cord blood�derived mesenchymal stem cells cultivated under appropriate conditions. Iran J Basic Med Sci. 2015;18(11):1100–6. 76. Ikegame Y, Yamashita K, Hayashi S-I, Mizuno H, Tawada M, You F, et al. Comparison of mesenchymal stem cells from adipose tissue and bone marrow for ischemic stroke therapy. Cytotherapy. 2011;13(6):675–85. 77. Martin-Rendon E, Sweeney D, Lu F, Girdlestone J, Navarrete C, Watt SM. 5-Azacytidine-treated human mesenchymal stem/progenitor cells derived from umbilical cord, cord blood and bone marrow do not generate cardiomyocytes in vitro at high frequencies. Vox Sang. 2008;95(2):137–48. 78. Abdanipour A, Tiraihi T, Delshad A. Trans-differentiation of the adipose tissue-derived stem cells into neuron-like cells expressing neurotrophins by selegiline. Iran Biomed J. 2011;15(4):113–21. 79. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;7(5):393–5. 80. Montanucci P, Basta G, Pescara T, Pennoni I, Giovanni F Di, Calafiore R. New Simple and Rapid Method for Purification of Mesenchymal Stem Cells from the Human Umbilical Cord Wharton Jelly. Tissue Eng Part A. 2011;17(21–22):2651–61. 81. Kolf CM, Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther. 2007;9(1):204. 82. Baddoo M, Hill K, Wilkinson R, Gaupp D, Hughes C, Kopen GC, et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 2003;89(6):1235–49. 83. Da Silva Meirelles L. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 2006;119(Pt11):2204–13. 84. Da Silva Meirelles L, Nardi NB. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: Isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 2003;123(4):702–11. 85. Henry C. Quevedo. KE. Allogeneic mesenchymal stem cells restore cardiac function in chronic ischemic cardiomyopathy via trilineage differentiating capacity. PNAS. 2009;106(33):14022–14027. 86. Shake JG, Gruber PJ, Baumgartner WA, Senechal G, Meyers J, Redmond JM, et al. Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: Engraftment and functional effects. Ann Thorac Surg. 2002;73(6):1919–26. 87. Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, Konishi F, Kodama H, Pan J, et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest. 1999;103(5):697–705. 88. Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler PD. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 2002;105(1):93–8. 89. Choi YS, Dusting GJ, Stubbs S, Arunothayaraj S, Han XL, Collas P, et al. Differentiation of human adipose-derived stem cells into beating cardiomyocytes. J Cell Mol Med. 2010;14(4):878–89. 90. Stem MM, Via C, Stat T. microRNA-124 Regulates Cardiomyocyte Differentiation of Bone. Stem Cells. 2012;1746–55. 91. Hong KU, Guo Y, Li QH, Cao P, Al-Maqtari T, Vajravelu BN, et al. c-kit+ cardiac stem cells alleviate post-myocardial infarction left ventricular dysfunction despite poor engraftment and 163 negligible retention in the recipient heart. PLoS One. 2014;9(5):e96725. 92. Karantalis V, Hare JM. Use of mesenchymal stem cells for therapy of cardiac disease. Circ Res. 2015;116(8):1413–1430. 93. Zhang Q, Shi S, Liu Y, Uyanne J, Shi Y, Shi S, et al. Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Gingiva Are Capable of Immunomodulatory Functions and Ameliorate Inflammation-Related Tissue Destruction in Experimental Colitis. J Immunol. 2009;183(12):7787–7798. 94. van Buul GM, Villafuertes E, Bos PK, Waarsing JH, Kops N, Narcisi R, et al. Mesenchymal stem cells secrete factors that inhibit inflammatory processes in short-term osteoarthritic synovium and cartilage explant culture. Osteoarthr Cartil. 2012;20(10):1186–96. 95. Kim HW, Song WJ, Li Q, Han SM, Jeon KO, Park SC, et al. Canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate severe acute pancreatitis by regulating T cells in rats. J Vet Sci. 2016;17(4):539–548. 96. Gnecchi M. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cellmediated cardiac protection and functional improvement. FASEB J. 2006;20(6):661–9. 97. Sato K, Ozaki K, Oh I, Meguro A, Hatanaka K, Nagai T, et al. Nitric oxide plays a critical role in suppression of T-cell proliferation by mesenchymal stem cells. Blood. 2007;109(1):228–34. 98. Spaggiari GM, Capobianco A, Abdelrazik H, Becchetti F, Mingari MC, Moretta L. Mesenchymal stem cells inhibit natural killer-cell proliferation, cytotoxicity, and cytokine production: Role of indoleamine 2,3-dioxygenase and prostaglandin E2. Blood. 2008;111(3):1327–33. 99. Williams AR, Hare JM. Mesenchymal stem cells: Biology, pathophysiology, translational findings, and therapeutic implications for cardiac disease. Circ Res. 2011;109(8):923–40. 100. Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, Lee CW, Barr S, Fuchs S, et al. Marrow-Derived Stromal Cells Express Genes Encoding a Broad Spectrum of Arteriogenic Cytokines and Promote In Vitro and In Vivo Arteriogenesis Through Paracrine Mechanisms. Circ Res. 2004;94(5):678–85. 101. Uemura R, Xu M, Ahmad N, Ashraf M. Bone marrow stem cells prevent left ventricular remodeling of ischemic heart through paracrine signaling. Circ Res. 2006;98(11):1414–21. 102. Wen Z, Zheng S, Zhou C, Wang J, Wang T. Repair mechanisms of bone marrow mesenchymal stem cells in myocardial infarction. J Cell Mol Med. 2011;15(5):1032–43. 103. Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, Shou M, Lee CW, Barr S, et al. Local Delivery of Marrow-Derived Stromal Cells Augments Collateral Perfusion Through Paracrine Mechanisms. Circulation. 2004;109(12):1543–9. 104. Mirotsou M, Zhang Z, Deb A, Zhang L, Gnecchi M, Noiseux N, et al. Secreted frizzled related protein 2 (Sfrp2) is the key Akt-mesenchymal stem cell-released paracrine factor mediating myocardial survival and repair. Proc Natl Acad Sci. 2007;104(5):1643–8. 105. Ratajczak J, Miekus K, Kucia M, Zhang J, Reca R, Dvorak P, et al. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: Evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery. Leukemia. 2006;20(5):847–56. 106. Gnecchi M, Danieli P, Cervio E. Mesenchymal stem cell therapy for heart disease. Vascul Pharmacol. 2012;57(1):48–55. 107. Silva G V., Litovsky S, Assad JAR, Sousa ALS, Martin BJ, Vela D, et al. Mesenchymal stem cells differentiate into an endothelial phenotype, enhance vascular density, and improve heart function in a canine chronic ischemia model. Circulation. 2005;111(2):150–6. 108. Noiseux N, Gnecchi M, Lopez-Ilasaca M, Zhang L, Solomon SD, Deb A, et al. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol Ther. 2006;14(6):840–50. 109. Alvarez-Dolado M, Pardal R, Garcia-Verdugo JM, Fike JR, Lee HO, Pfeffer K, et al. Fusion of bone 164 marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 2003;425(6961):968–73. 110. Shadrin IY, Yoon W, Li L, Shepherd N, Bursac N. Rapid fusion between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes yields electrically active, non-contractile hybrid cells. Sci Rep. 2015;5:12043. 111. Xu M, Uemura R, Dai Y, Wang Y, Pasha Z, Ashraf M. In vitro and in vivo effects of bone marrow stem cells on cardiac structure and function. J Mol Cell Cardiol. 2007;42(2):441–8. 112. Cai M, Shen R, Song L, Lu M, Wang J, Zhao S, et al. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells (BM-MSCs) Improve Heart Function in Swine Myocardial Infarction Model through Paracrine Effects. Sci Rep. 2016;6(28250):1–12. 113. Hatzistergos KE, Quevedo H, Oskouei BN, Hu Q, Feigenbaum GS, Margitich IS, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation. Circ Res. 2010;107(7):913–22. 114. Adamiak M, Cheng G, Bobis-Wozowicz S, Zhao L, Kedracka-Krok S, Samanta A, et al. Induced Pluripotent Stem Cell (iPSC)-Derived Extracellular Vesicles Are Safer and More Effective for Cardiac Repair than iPSCs. Circ Res. 2017;122(2):296-309. 115. Haynesworth SE, Baber MA, Caplan AI. Cytokine expression by human marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro: Effects of dexamethasone and IL-1?? J Cell Physiol. 1996;166(3):585–92. 116. Afzal M, Samanta A, Shah Z, Jeevanantham V, Abdel-Latif A, Zuba-Surma E, et al. Adult Bone Marrow Cell Therapy for Ischemic Heart Disease: Evidence and Insights from Randomized Controlled Trials. 2015;117(6):558–75. 117. Hong KU, Li Q-H, Guo Y, Patton NS, Moktar A, Bhatnagar A, et al. A highly sensitive and accurate method to quantify absolute numbers of c-kit+ cardiac stem cells following transplantation in mice. Basic Res Cardiol. 2013;108(3):346. 118. Guo Y, Wysoczynski M, Nong Y, Tomlin A, Zhu X, Gumpert AM, et al. Repeated doses of cardiac mesenchymal cells are therapeutically superior to a single dose in mice with old myocardial infarction. Basic Res Cardiol. 2017;112(2):18. 119. Strauer BE, Steinhoff G. 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: From the methodological origin to clinical practice. J Am Coll Cardiol. 2011;58(11):1095–104. 120. Cleland JGF, Bunting K V., Flather MD, Altman DG, Holmes J, Coats AJS, et al. Beta-blockers for heart failure with reduced, mid-range, and preserved ejection fraction: An individual patient-level analysis of double-blind randomized trials. Eur Heart J. 2018;39(1):26–35. 121. van Loon RB, Veen G, Kamp O, Baur LHB, van Rossum AC. Left ventricular remodeling after acute myocardial infarction: The influence of viability and revascularization -an echocardiographic substudy of the VIAMI-trial. Trials. 2014;15(329). 122. Holme PA, Ørvim U, Hamers MJAG, Solum NO, Brosstad FR, Barstad RM, et al. Shear-induced platelet activation and platelet microparticle formation at blood flow conditions as in arteries with a severe stenosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1997;17(4):646–53. 123. Zaborowski MP, Balaj L, Breakefield XO, Lai CP. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 2015;65(8):783–97. 124. Doeppner TR, Herz J, Görgens A, Schlechter J, Ludwig A-K, Radtke S, et al. Extracellular Vesicles Improve Post-Stroke Neuroregeneration and Prevent Postischemic Immunosuppression. Stem Cells Transl Med. 2015;4(10):1131–43. 125. Njock M-S, Boudreau E, Roufaiel M, Cybulsky MI, Schober A, Fish JE. Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiin fl ammatory microRNAs. Blood. 2015;125(20):3202–13. 126. Collino F, Pomatto M, Bruno S, Lindoso RS, Tapparo M, Sicheng W, et al. Exosome and Microvesicle-Enriched Fractions Isolated from Mesenchymal Stem Cells by Gradient Separation Showed Different Molecular Signatures and Functions on Renal Tubular Epithelial Cells. Stem Cell Rev Reports. 2017;13(2):226–43. 127. Osteikoetxea X, Balogh A, Szabó-Taylor K, Németh A, Szabó TG, Pálóczi K, et al. Improved characterization of EV preparations based on protein to lipid ratio and lipid properties. PLoS One. 2015;10(3):e0121184. 128. Kalra H, Simpson RJ, Ji H, Aikawa E, Altevogt P, Askenase P, et al. Vesiclepedia: A Compendium for Extracellular Vesicles with Continuous Community Annotation. PLoS Biol. 2012;10(12):e1001450. 129. Crescitelli R, Lässer C, Szabó TG, Kittel A, Eldh M, Dianzani I, et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. J Extracell Vesicles. 2013;2(20677). 130. Yáñez-Mó M, Siljander PRM, Andreu Z, Zavec AB, Borràs FE, Buzas EI, et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 2015;4(2015):1–60. 131. Atkin-Smith GK, Paone S, Zanker DJ, Duan M, Phan TK, Chen W, et al. Isolation of cell typespecific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Sci Rep. 2017;7(39846). 132. Colombo M, Moita C, van Niel G, Kowal J, Vigneron J, Benaroch P, et al. Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles. J Cell Sci. 2013;126(24):5553–65. 133. Bebelman MP, Smit MJ, Pegtel DM, Baglio SR. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacology and Therapeutics. 2018;188:1-18. 134. Hessvik NP, Llorente A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cell Mol Life Sci. 2018;75(2):193–208. 135. Villarroya-Beltri C, Baixauli F, Mittelbrunn M, Fernández-Delgado I, Torralba D, Moreno-Gonzalo O, et al. ISGylation controls exosome secretion by promoting lysosomal degradation of MVB proteins. Nat Commun. 2016;7(13588). 136. Villarroya-Beltri C, Guerra S, Sánchez-Madrid F. ISGylation – a key to lock the cell gates for preventing the spread of threats. J Cell Sci. 2017;130(18):2961–9. 137. Alberts B, Bray D, Hopkin K, Johnson A, Lewis J, Raff M, et al. Podstawy biologii komórki. 2005. Wydawnictwo Naukowe PWN. 2005. 138. Hyenne V, Apaydin A, Rodriguez D, Spiegelhalter C, Hoff-Yoessle S, Diem M, et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 2015;211(1):27–37. 139. Pelham HRB. SNAREs and the specificity of membrane fusion. Trends Cell Biol. 2001;11(3):99– 101. 140. Mears R, Craven RA, Hanrahan S, Totty N, Upton C, Young SL, et al. Proteomic analysis of melanoma-derived exosomes by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics. 2004;4(12):4019–31. 141. Sun Y, Huo C, Qiao Z, Shang Z, Uzzaman A, Liu S, et al. Comparative Proteomic Analysis of Exosomes and Microvesicles in Human Saliva for Lung Cancer. J Proteome Res. 2018;17(3):1101–7. 142. Kowal J, Arras G, Colombo M, Jouve M, Morath JP, Primdal-Bengtson B, et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci. 2016;113(8):E968–77. 143. Keerthikumar S, Chisanga D, Ariyaratne D, Al Saffar H, Anand S, Zhao K, et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 2016;428(4):688–92. 144. LAULAGNIER K, MOTTA C, HAMDI S, ROY S, FAUVELLE F, PAGEAUX J-F, et al. Mast cell- 166 and dendritic cell-derived exosomes display a specific lipid composition and an unusual membrane organization. Biochem J. 2004;380(1):161–71. 145. Bobis-Wozowicz S, Kmiotek K, Kania K, Karnas E, Labedz-Maslowska A, Sekula M, et al. Diverse impact of xeno-free conditions on biological and regenerative properties of hUC-MSCs and their extracellular vesicles. J Mol Med. 2017;95(2):205–20. 146. Fatima F, Nawaz M. Vesiculated Long Non-Coding RNAs: Offshore Packages Deciphering Trans-Regulation between Cells, Cancer Progression and Resistance to Therapies. Non-Coding RNA. 2017;3(1):10. 147. Tricarico C, Clancy J, D’Souza-Schorey C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 2017;8(4):220–32. 148. McMahon HT, Boucrot E. Membrane curvature at a glance. J Cell Sci. 2015;128(6):1065–70. 149. Fox JEB, Austin CD, Boyles JK, Steffen PK. Role of the membrane skeleton in preventing the shedding of procoagulant-rich microvesicles from the platelet plasma membrane. J Cell Biol. 1990;111(2):483–93. 150. Fox JEB, Austin CD, Reynolds CC, Steffen PK. Evidence that agonist-induced activation of calpain causes the shedding of procoagulant-containing microvesicles from the membrane of aggregating platelets. J Biol Chem. 1991;266(20):13289–95. 151. Leroyer AS, Isobe H, Lesèche G, Castier Y, Wassef M, Mallat Z, et al. Cellular Origins and Thrombogenic Activity of Microparticles Isolated From Human Atherosclerotic Plaques. J Am Coll Cardiol. 2007;49(7):772–7. 152. Abid Hussein MN, Meesters EW, Osmanovic N, Romijn FPHTM, Nieuwland R, Sturk A. Antigenic characterization of endothelial cell-derived microparticles and their detection ex vivo. J Thromb Haemost. 2003;1(11):2434-43. 153. Cosenza S, Ruiz M, Toupet K, Jorgensen C, Noël D. Mesenchymal stem cells derived exosomes and microparticles protect cartilage and bone from degradation in osteoarthritis. Sci Rep. 2017;7(16214). 154. Kim HS, Choi DY, Yun SJ, Choi SM, Kang JW, Jung JW, et al. Proteomic analysis of microvesicles derived from human mesenchymal stem cells. J Proteome Res. 2012;11(2):839–49. 155. Surman M, Stępień E, Hoja-Łukowicz D, Przybyło M. Deciphering the role of ectosomes in cancer development and progression: focus on the proteome. Clin Exp Metastasis. 2017;34(3–4):273–89. 156. Dean WL, Lee MJ, Cummins TD, Schultz DJ, Powell DW, Dean B. Proteomic and functional characterisation of platelet microparticle size classes. Thromb Haemost. 2009;102(4):711–8. 157. Rozmyslowicz T, Majka M, Kijowski J, Murphy SL, Conover DO, Poncz M, et al. Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV. AIDS. 2003;17(1):33–42. 158. Al-Nedawi K, Meehan B, Micallef J, Lhotak V, May L, Guha A, et al. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 2008;10:619–24. 159. Kalra H, Drummen GPC, Mathivanan S. Focus on extracellular vesicles: Introducing the next small big thing. Int J Mol Sci. 2016;17(2):170. 160. Weerheim AM, Kolb AM, Sturk A, Nieuwland R. Phospholipid composition of cell-derived microparticles determined by one-dimensional high-performance thin-layer chromatography. Anal Biochem. 2002;302(2):191–8. 161. Collino F, Deregibus MC, Bruno S, Sterpone L, Aghemo G, Viltono L, et al. Microvesicles derived from adult human bone marrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected pattern of miRNAs. PLoS One. 2010;5(7):e11803. 162. Chen TS, Lai RC, Lee MM, Choo ABH, Lee CN, Lim SK. Mesenchymal stem cell secretes 167 microparticles enriched in pre-microRNAs. Nucleic Acids Res. 2009;38(1):215–24. origin target and support hematopoietic stem and progenitor cells. J Cell Biol. 2017;216(7):2217–30. 163. Tomasoni S, Longaretti L, Rota C, Morigi M, Conti S, Gotti E, et al. Transfer of Growth Factor Receptor mRNA Via Exosomes Unravels the Regenerative Effect of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 2013;22(5):772–80. 164. Keerthikumar S, Gangoda L, Liem M, Fonseka P, Atukorala I, Ozcitti C, et al. Proteogenomic analysis reveals exosomes are more oncogenic than ectosomes. Oncotarget. 2015;6(17):15375–96. 165. Minciacchi VR, You S, Spinelli C, Morley S, Zandian M, Aspuria P-J, et al. Large oncosomes contain distinct protein cargo and represent a separate functional class of tumor-derived extracellular vesicles. Oncotarget. 2015;6(13):11327–41. 166. Lotvall J, Hill AF, Hochberg F, Buzas EI, Vizio D Di, Gardiner C, et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: A position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 2014;3(1):1–6. 167. Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, Bora A, Lässer C, Lötvall J, et al. Standardization of sample collection , isolation and analysis methods in extracellular vesicle research Need for standardization ISEV 2012 workshop on evRNA. J Extracell Vesicles. 2014;2(2013):1–29. 168. Wolf P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 1967;13(3):269–88. 169. Gebraad A, Kornilov R, Kaur S, Miettinen S, Haimi S, Peltoniemi H, et al. Monocyte-derived extracellular vesicles stimulate cytokine secretion and gene expression of matrix metalloproteinases by mesenchymal stem/stromal cells. FEBS J. 2018;285(12):2337–59. 170. Barry OP, Praticò D, Lawson JA, FitzGerald GA. Transcellular activation of platelets and endothelial cells by bioactive lipids in platelet microparticles. J Clin Invest. 1997;99(9):2118–27. 171. Andrews RK, Berndt MC. Platelet physiology and thrombosis. Thromb Res. 2004;114(5–6 SPEC. ISS.):447–53. 172. Barry OP, Praticò D, Savani RC, FitzGerald GA. Modulation of monocyte-endothelialinteractions by platelet microparticles. J Clin Invest. 1998;102(1):136–44. cell 173. Sarkar A, Mitra S, Mehta S, Raices R, Wewers MD. Monocyte derived microvesicles deliver a cell death message via encapsulated caspase-1. PLoS One. 2009;4(9):e7140. 174. Yuan A, Farber EL, Rapoport AL, Tejada D, Deniskin R, Akhmedov NB, et al. Transfer of microRNAs by embryonic stem cell microvesicles. PLoS One. 2009;4(3):e4722. 175. Chen J, Li C, Chen L. The role of microvesicles derived from mesenchymal stem cells in lung diseases. Biomed Res Int. 2015;2015(985814):1–6. 176. Simons M, Raposo G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 2009;21(4):575–81. 177. Fong MY, Zhou W, Liu L, Alontaga AY, Chandra M, Ashby J, et al. Breast-cancer-secreted miR-122 reprograms glucose metabolism in premetastatic niche to promote metastasis. Nat Cell Biol. 2015;17(2):183–94. 178. Arraud N, Linares R, Tan S, Gounou C, Pasquet JM, Mornet S, et al. Extracellular vesicles from blood plasma: Determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 2014;12(5):614–27. 179. Keller S, Rupp C, Stoeck A, Runz S, Fogel M, Lugert S, et al. CD24 is a marker of exosomes secreted into urine and amniotic fluid. Kidney Int. 2007;72(9):1095–102. 180. Asea A, Jean-Pierre C, Kaur P, Rao P, Linhares IM, Skupski D, et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J Reprod Immunol. 2008;79(1):12–7. 181. Stik G, Crequit S, Petit L, Durant J, Charbord P, Jaffredo T, et al. Extracellular vesicles of stromal 182. Mack M, Kleinschmidt A, Brühl H, Klier C, Nelson PJ, Cihak J, et al. Transfer of the chemokine receptor CCR5 between cells by membrane- derived microparticles: A mechanism for cellular human immunodeficiency virus 1 infection. Nat Med. 2000;6(7):769–75. 183. Smith VL, Cheng Y, Bryant BR, Schorey JS. Exosomes function in antigen presentation during an in vivo Mycobacterium tuberculosis infection. Sci Rep. 2017;7(43578):1–12. 184. Denzer K, van Eijk M, Kleijmeer MJ, Jakobson E, de Groot C, J. Geuze H. Follicular Dendritic Cells Carry MHC Class II-Expressing Microvesicles at Their Surface. J Immunol. 2000;165(3):1259–65. 185. Chiabotto G, Bruno S, Collino F, Camussi G. Mesenchymal stromal cells epithelial transition induced by renal tubular cells-derived extracellular vesicles. PLoS One. 2016;11(7):e0159163. 186. Malik ZA, Kott KS, Poe AJ, Kuo T, Chen L, Ferrara KW, et al. Cardiac myocyte exosomes: stability, HSP60, and proteomics. AJP Hear Circ Physiol. 2013;304(7):H954–65. 187. Vrijsen KR, Sluijter JPG, Schuchardt MWL, van Balkom BWM, Noort WA, Chamuleau SAJ, et al. Cardiomyocyte progenitor cell-derived exosomes stimulate migration of endothelial cells. Vol. 14, Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2010;14(5):1064–70. 188. Loyer X, Zlatanova I, Devue C, Yin M, Howangyin K-Y, Klaihmon P, et al. Intra-Cardiac Release of Extracellular Vesicles Shapes Inflammation Following Myocardial Infarction. Circ Res. 2018;123(1):100–6. 189. Zheng Y, Liu L, Chen C, Ming P, Huang Q, Li C, et al. The extracellular vesicles secreted by lung cancer cells in radiation therapy promote endothelial cell angiogenesis by transferring miR-23a. PeerJ. 2017;5:e3627. 190. Anderson JD, Johansson HJ, Graham CS, Vesterlund M, Pham MT, Bramlett CS, et al. Comprehensive Proteomic Analysis of Mesenchymal Stem Cell Exosomes Reveals Modulation of Angiogneesis via NFkB Signaling. Stem Cells. 2016;34(3):601–13. 191. Bruno S, Grange C, Collino F, Deregibus MC, Cantaluppi V, Biancone L, et al. Microvesicles derived from mesenchymal stem cells enhance survival in a lethal model of acute kidney injury. PLoS One. 2012;7(3):e33115. 192. Haga H, Yan IK, Borrelli DA, Matsuda A, Parasramka M, Shukla N, et al. Extracellular vesicles from bone marrow–derived mesenchymal stem cells protect against murine hepatic ischemia/reperfusion injury. Liver Transplant. 2017;23(6):791–803. 193. Zhu Y-G, Feng X-M, Abbott J, Fang X-H, Hao Q, Monsel A, et al. Human Mesenchymal Stem Cell Microvesicles for Treatment of Escherichia coli Endotoxin-Induced Acute Lung Injury in Mice. Stem Cells. 2014;32(1):116–25. 194. Bian S, Zhang L, Duan L, Wang X, Min Y, Yu H. Extracellular vesicles derived from human bone marrow mesenchymal stem cells promote angiogenesis in a rat myocardial infarction model. J Mol Med (Berl). 2014;92(4):387–97. 195. Barile L, Lionetti V, Cervio E, Matteucci M, Gherghiceanu M, Popescu LM, et al. Extracellular vesicles from human cardiac progenitor cells inhibit cardiomyocyte apoptosis and improve cardiac function aftermyocardial infarction. Cardiovasc Res. 2014;103(4):530–41. 196. Arslan F, Lai RC, Smeets MB, Akeroyd L, Choo A, Aguor ENE, et al. Mesenchymal stem cellderived exosomes increase ATP levels, decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury. Stem Cell Res. 2013;10(3):301–12. 197. Koniusz S, Andrzejewska A, Muraca M, Srivastava AK, Janowski M, Lukomska B. Extracellular Vesicles in Physiology, Pathology, and Therapy of the Immune and Central Nervous System, with Focus on Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells as Therapeutic Tools. Front Cell Neurosci. 2016;10:109. 198. Cui LL, Kerkelä E, Bakreen A, Nitzsche F, Andrzejewska A, Nowakowski A, et al. The cerebral embolism evoked by intra-arterial delivery of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells in rats is related to cell dose and infusion velocity. Stem Cell Res Ther. 2015;6(1):11. 199. Soleimani M, Nadri S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 2009;4(1):102–6. 200. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976;72:248–54. 201. Hardij J, Cecchet F, Berquand A, Gheldof D, Chatelain C, Mullier F, et al. Characterisation of tissue factor-bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid peak force AFM. J Extracell Vesicles. 2013;2(1):1–9. 202. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, Mann M, Wi JR. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 2009;6(5):359–62. 203. Wiśniewski JR, Duś K, Mann M. Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10000 proteins. Proteomics - Clin Appl. 2013;7(3– 4):225–33. 204. Rappsilber J, Ishihama Y, Mann M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 2003;75(3):663–70. 205. Käll L, Canterbury JD, Weston J, Noble WS, MacCoss MJ. Semi-supervised learning for peptide identification from shotgun proteomics datasets. Nat Methods. 2007;4(11):923–5. 206. Desjardins P, Conklin D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids 2 . High-Sensitivity Microvolume Nucleic Acid Quantitation Using the NanoDrop 3300. Jove. 2010;45(November):1–4. 207. Mantel PY, Hjelmqvist D, Walch M, Kharoubi-Hess S, Nilsson S, Ravel D, et al. Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria. Nat Commun. 2016;7(12727):1–15. 208. Decicco-skinner KL, Henry GH, Cataisson C, Tabib T, Gwilliam JC, Watson NJ, et al. Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis. J Vis Exp. 2014;10:1–8. 209. Blom JN, Lu X, Arnold P, Feng Q. Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration. J Vis Exp. 2016;(111):1–12. 210. Niiyama H, Huang NF, Rollins MD, Cooke JP. Murine Model of Hindlimb Ischemia. J Vis Exp. 2009;(23):1–4. 211. Hoff J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Anim (NY). 2000;29(10):47–53. 212. Dragovic RA, Gardiner C, Brooks AS, Tannetta DS, Ferguson DJP, Hole P, et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine Nanotechnology, Biol Med. 2011;7(6):780–8. 213. Van Der Pol E, Hoekstra AG, Sturk A, Otto C, Van Leeuwen TG, Nieuwland R. Optical and nonoptical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 2010;8(12):2596–607. 214. Camussi G, Deregibus MC, Bruno S, Grange C, Fonsato V. Exosomes/microvesicle-mediated epigenetic reprogramming of cells. Cancer Res. 2011;1(1):98–110. 215. Todorova D, Simoncini S, Lacroix R, Sabatier F, Dignat-George F. Extracellular vesicles in angiogenesis. Circ Res. 2017;120(10):1658–73. 216. Birnbaumer L. The discovery of signal transduction by G proteins. A personal account and an overview of the initial findings and contributions that led to our present understanding. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 2007;1768(4):756-71. 217. Senbanjo LT, Chellaiah MA. CD44: A Multifunctional Cell Surface Adhesion Receptor Is a Regulator of Progression and Metastasis of Cancer Cells. Front Cell Dev Biol. 2017;5(18):1–6. 218. Fujisaki T, Tanaka Y, Fujii K, Mine S, Saito K, Amada S, et al. CD44 stimulationi nduces integrinmediated adhesion of colon cancer cell lines to endothelial cells by up-regulation of integrins and c-Met and activation of integrins. Cancer Res. 1999;59(17):4427–34. 219. Tamma R, Ribatti D. Bone niches, hematopoietic stem cells, and vessel formation. Int J Mol Sci. 2017;18(1):151. 220. Xu X, Wu J, Li S, Hu Z, Xu X, Zhu Y, et al. Downregulation of microRNA-182-5p contributes to renal cell carcinoma proliferation via activating the AKT/FOXO3a signaling pathway. Mol Cancer. 2014;13(1):1–11. 221. Weber CEM, Luo C, Hotz-Wagenblatt A, Gardyan A, Kordaß T, Holland-Letz T, et al. miR-339-3p is a tumor suppressor in melanoma. Cancer Res. 2016;76(12):3562–71. 222. Khatun Z, Sharma A. Exosome Signalling in Stem Cells. Stem Cell Fundam Pract. 2016;2(2):1. 223. Chen JJ, Zhou SH. Mesenchymal stem cells overexpressing MiR-126 enhance ischemic angiogenesis via the AKT/ERK-related pathway. Cardiol J. 2011;18(6):675–81. 224. Liu X, Tong Z, Chen K, Hu X, Jin H, Hou M. The Role of miRNA-132 against Apoptosis and Oxidative Stress in Heart Failure. Biomed Res Int. 2018;3452748:1–9. 225. Seok JK, Lee SH, Kim MJ, Lee YM. MicroRNA-382 induced by HIF-1α is an angiogenic miR targeting the tumor suppressor phosphatase and tensin homolog. Nucleic Acids Res. 2014;42(12):8062–72. 226. Szmitko PE. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation: Part I. Circulation. 2003;108(16):1917–23. 227. Penvose A, Westerman KA. Sca-1 is involved in the adhesion of myosphere cells to V 3 integrin. Biol Open. 2012;1(9):839–47. 228. Morbidelli L, Donnini S, Ziche M. Role of nitric oxide in the modulation of angiogenesis. Curr Pharm Des. 2003;9(7):521–30. 229. Schieber M, Chandel NS. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol. 2014;24(10):R453–62. 230. Chen Z, Bakhshi FR, Shajahan AN, Sharma T, Mao M, Trane A, et al. Nitric oxide-dependent Src activation and resultant caveolin-1 phosphorylation promote eNOS/caveolin-1 binding and eNOS inhibition. Mol Biol Cell. 2012;23(7):1388–98. 231. Rutkowski JM. Characterization of lymphangiogenesis in a model of adult skin regeneration. AJP Hear Circ Physiol. 2006;291(3):H1402–H1410. 232. Bellingham SA, Coleman BM, Hill AF. Small RNA deep sequencing reveals a distinct miRNA signature released in exosomes from prion-infected neuronal cells. Nucleic Acids Res. 2012;40(21):10937–49. 233. Llorente A, Skotland T, Sylvänne T, Kauhanen D, Róg T, Orłowski A, et al. Molecular lipidomics of exosomes released by PC-3 prostate cancer cells. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Biol Lipids. 2013;1831(7):1302–9. 234. Dabrowski FA, Burdzinska A, Kulesza A, Sladowska A, Zolocinska A, Gala K, et al. Comparison of the paracrine activity of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord, amniotic membrane and adipose tissue. J Obstet Gynaecol Res. 2017;43(11):1758-1768. 235. Squillaro T, Peluso G, Galderisi U. Clinical Trials With Mesenchymal Stem Cells: An Update. Cell Transplant. 2016;25(5):829-48. 236. Hare JM, Fishman JE, Gerstenblith G, DiFede Velazquez DL, Zambrano JP, Suncion VY, et al. 171 Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: The POSEIDON randomized trial. JAMA - J Am Med Assoc. 2012;308(22):2369–79. 237. Yubo M, Yanyan L, Li L, Tao S, Bo L, Lin C. Clinical efficacy and safety of mesenchymal stem cell transplantation for osteoarthritis treatment: A meta-analysis. PLoS One. 2017;12(4):e0175449. 238. Jeong H, Yim HW, Park HJ, Cho Y, Hong H, Kim NJ, et al. Mesenchymal stem cell therapy for ischemic heart disease: Systematic review and meta-analysis. Int J Stem Cells. 2018;11(1):1–12. 239. Lalu MM, McIntyre L, Pugliese C, Fergusson D, Winston BW, Marshall JC, et al. Safety of Cell Therapy with Mesenchymal Stromal Cells (SafeCell): A Systematic Review and Meta-Analysis of Clinical Trials. PLoS One. 2012;7(10):e47559. 240. Asahara T, Masuda H, Takahashi T, Kalka C, Pastore C, Silver M, et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res. 1999;85(3):221–228. 241. Nombela-Arrieta C, Pivarnik G, Winkel B, Canty KJ, Harley B, Mahoney JE, et al. Quantitative imaging of haematopoietic stem and progenitor cell localization and hypoxic status in the bone marrow microenvironment. Nat Cell Biol. 2013;15:533–43. 242. Ratajczak MZ, Zuba-Surma EK, Wojakowski W, Ratajczak J, Kucia M. Bone marrow - Home of versatile stem cells. Transfus Med Hemotherapy. 2008;35(3):248–59. 243. Lech W, Figiel-Dabrowska A, Sarnowska A, Drela K, Obtulowicz P, Noszczyk BH, et al. Phenotypic, Functional, and Safety Control at Preimplantation Phase of MSC-Based Therapy. Stem Cells Int. 2016;2016(2514917):1–14. 244. Hu Y, Lou B, Wu X, Wu R, Wang H, Gao L, et al. Comparative Study on In Vitro Culture of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. 2018;2018(6704583):1–15. 245. Labedz-Maslowska A, Lipert B, Berdecka D, Kedracka-Krok S, Jankowska U, Kamycka E, et al. Monocyte Chemoattractant Protein-Induced Protein 1 (MCPIP1) Enhances Angiogenic and Cardiomyogenic Potential of Murine Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Qin G, editor. PLoS One. 2015;10(7):e0133746. 246. Tomlinson MJ, Tomlinson S, Yang XB, Kirkham J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J Tissue Eng. 2013;4(2041731412472690):1–14. 247. Kekarainen T, Mannelin S, Laine J, Jaatinen T. Optimization of immunomagnetic separation for cord blood-derived hematopoietic stem cells. BMC Cell Biol. 2006;7(30). 248. Li Q, Zhang X, Peng Y, Chai H, Xu Y, Wei J, et al. Comparison of the sorting efficiency and influence on cell function between the sterile flow cytometry and immunomagnetic bead purification methods. Prep Biochem Biotechnol. 2013;43(2):197–206. 249. Sicco C Lo, Reverberi D, Balbi C, Ulivi V, Principi E, Pascucci L, et al. Mesenchymal stem cellderived extracellular vesicles as mediators of anti-inflammatory effects: Endorsement of macrophage polarization. Stem Cells Transl Med. 2017;6(3):1018–28. 250. Eirin A, Zhu X-Y, Puranik AS, Woollard JR, Tang H, Dasari S, et al. Comparative proteomic analysis of extracellular vesicles isolated from porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem/stromal cells. Sci Rep. 2016;6(1):36120. 251. Ramos TL, Sánchez-Abarca LI, Muntión S, Preciado S, Puig N, López-Ruano G, et al. MSC surface markers (CD44, CD73, and CD90) can identify human MSC-derived extracellular vesicles by conventional flow cytometry. Cell Commun Signal. 2016;14(1). 252. Eitan E, Zhang S, Witwer KW, Mattson MP. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. J Extracell Vesicles. 2015;4(2015):1–10. 253. Van Deun J, Mestdagh P, Sormunen R, Cocquyt V, Vermaelen K, Vandesompele J, et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. J Extracell Vesicles. 2014;3(1). 254. Bobis-Wozowicz S, Kmiotek K, Sekula M, Kedracka-Krok S, Kamycka E, Adamiak M, et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microvesicles Transmit RNAs and Proteins to Recipient Mature Heart Cells Modulating Cell Fate and Behavior. Stem Cells. 2015;33(9):2748–61. 255. Vogel R, Coumans FAW, Maltesen RG, Böing AN, Bonnington KE, Broekman ML, et al. A standardized method to determine the concentration of extracellular vesicles using tunable resistive pulse sensing. J Extracell Vesicles. 2016;5(1). 256. Maas SLN, De Vrij J, Broekman MLD. Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing. J Vis Exp. 2014;(92):e51623. 257. Bobis-Wozowicz S, Kmiotek K, Kania K, Karnas E, Labedz-Maslowska A, Sekula M, et al. Diverse impact of xeno-free conditions on biological and regenerative properties of hUC-MSCs and their extracellular vesicles. J Mol Med. 2017;95(2). 258. Goodison S, Urquidi V, Tarin D. CD44 cell adhesion molecules. Mol Pathol. 1999;52(4):189–96. 259. Soleti R, Benameur T, Porro C, Panaro MA, Andriantsitohaina R, Martínez MC. Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors. Carcinogenesis. 2009;30(4):580–8. 260. Pink D, Donnelier J, Lewis J, Braun JEA. Cargo-Loading of Misfolded Proteins into Extracellular Vesicles: The Role of J Proteins. bioRxiv [Internet]. 2018; Available from: https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/05/08/310219.full.pdf 261. Katz M, Amit I, Yarden Y. Regulation of MAPKs by growth factors and receptor tyrosine kinases. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 2007;1773(8):1161–76. 262. Giles FJ. The vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway: a therapeutic target in patients with hematologic malignancies. Oncologist. 2001;6(suppl 5):32–9. 263. Cheung SMS, Ostergaard HL. Pyk2 Controls Integrin-Dependent CTL Migration through Regulation of De-Adhesion. J Immunol. 2016;197(5):1945–56. 264. Xie H, Wang Z, Zhang L, Lei Q, Zhao A, Wang H, et al. Extracellular Vesicle-functionalized Decalcified Bone Matrix Scaffolds with Enhanced Pro-angiogenic and Pro-bone Regeneration Activities. Sci Rep. 2017;7:45622. 265. Chen Y, Gorski DH. Regulation of angiogenesis through a microRNA (miR-130a) that downregulates antiangiogenic homeobox genes GAX and HOXA5. Blood. 2008;111(3):1217-26. 266. Tétreault N, De Guire V. MiRNAs: Their discovery, biogenesis and mechanism of action. Clin Biochem. 2013;45(10–11):842–5. 267. Qu M, Pan J, Shi X, Zhang Z, Tang Y, Yang G. MicroRNA-126 is a prospective target for vascular disease. Neuroimmunol Neuroinflammation. 2018;5(10):1–7. 268. Yilbas AE, Hamilton A, Wang Y, Mach H, Lacroix N, Davis DR, et al. Activation of GATA4 gene expression at the early stage of cardiac specification. Front Chem. 2014;2(12). 269. Sun Z, Yang S, Zhou Q, Wang G, Song J, Li Z, et al. Emerging role of exosome-derived long noncoding RNAs in tumor microenvironment. Mol Cancer. 2018;17(82):1–9. 270. Subra C, Laulagnier K, Perret B, Record M. Exosome lipidomics unravels lipid sorting at the level of multivesicular bodies. Biochimie. 2007;89(2):205–12. 271. Meller VH, Joshi SS, Deshpande N. Modulation of Chromatin by Noncoding RNA. Annu Rev Genet. 2015;49(1):673–95. 272. Skotland T, Sandvig K, Llorente A. Lipids in exosomes: Current knowledge and the way forward. Prog Lipid Res. 2017;66:30–41. 273. Costa Verdera H, Gitz-Francois JJ, Schiffelers RM, Vader P. Cellular uptake of extracellular vesicles is mediated by clathrin-independent endocytosis and macropinocytosis. J Control Release. 2017;266(September):100–8. 274. Long EO. Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1): Getting a Grip on Leukocyte Adhesion. 2011;186(9):1–5. 275. Chigaev A, Wu Y, Williams DB, Smagley Y, Sklar LA. Discovery of Very Late Antigen-4 (VLA-4, α4β 1 integrin) allosteric antagonists. J Biol Chem. 2011;286(7):5455–63. 276. Varki A. Selectin ligands. Proc Natl Acad Sci. 1994;91(16):7390–7. 277. Yoshio K. Selective E-selectin ligands. Blood. 2013;122(24):3858–61. 278. Sahin AO, Buitenhuis M. Molecular mechanisms underlying adhesionhematopoietic stem cells. Cell Adh Migr. 2012;6(1):39–48. and migration of 279. Wetzel A, Chavakis T, Preissner KT, Sticherling M, Haustein U-F, Anderegg U, et al. Human Thy-1 (CD90) on Activated Endothelial Cells Is a Counterreceptor for the Leukocyte Integrin Mac-1 (CD11b/CD18). J Immunol. 2004;172(6):3850–9. 280. Xiao Q, Zeng L, Zhang Z, Margariti A, Ali ZA, Channon KM, et al. Sca-1+ progenitors derived from embryonic stem cells differentiate into endothelial cells capable of vascular repair after arterial injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26(10):2244–51. 281. Li C, Hu Y, Deng X, Shen X, Mao N, Xiong T, et al. Anti-apoptotic roles of MicroRNA-21 via activating PTEN/PI3K/Akt pathway in lipopolysaccharide-induced acute lung injury. Int J Clin Exp Pathol. 2017;10(4):4339–47. 282. Czabotar PE, Lessene G, Strasser A, Adams JM. Control of apoptosis by the BCL-2 protein family: Implications for physiology and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15(1):49–63. 283. Wiklander OPB, Nordin JZ, O’Loughlin A, Gustafsson Y, Corso G, Mäger I, et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. J Extracell Vesicles. 2015;4(2015):1–13. 284. Schmuck EG, Koch JM, Centanni JM, Hacker TA, Braun RK, Eldridge M, et al. Biodistribution and Clearance of Human Mesenchymal Stem Cells by Quantitative Three-Dimensional Cryo-Imaging After Intravenous Infusion in a Rat Lung Injury Model. Stem Cells Transl Med. 2016;5(12):1668-75. 285. Grange C, Tapparo M, Bruno S, Chatterjee D, Quesenberry PJ, Tetta C, et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. Int J Mol Med. 2014;33(5):1055–63. 286. Otero-Ortega L, Laso-García F, Del Carmen Gómez-De Frutos M, Rodríguez-Frutos B, Pascual-Guerra J, Fuentes B, et al. White matter repair after extracellular vesicles administration in an experimental animal model of subcortical stroke. Sci Rep. 2017;7(March):1–11. 287. Lai CP, Mardini O, Ericsson M, Prabhakar S, Maguire CA, Chen JW, et al. Dynamic biodistribution of extracellular vesicles in vivo using a multimodal imaging reporter. ACS Nano. 2014;8(1):483–94. 288. Morishita M, Takahashi Y, Nishikawa M, Sano K, Kato K, Yamashita T, et al. Quantitative analysis of tissue distribution of the B16BL6-derived exosomes using a streptavidin-lactadherin fusion protein and Iodine-125-Labeled biotin derivative after intravenous injection in mice. J Pharm Sci. 2015;104(2):705–13. 289. Smyth T, Kullberg M, Malik N, Smith-Jones P, Graner MW, Anchordoquy TJ. Biodistribution and delivery efficiency of unmodified tumor-derived exosomes. J Control Release. 2015;199:145–55. 290. Chai R, Arslan F, May M, Siu N, Sze K, Choo A, et al. Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia / reperfusion injury. Stem Cell Res. 2010;4(3):214–22. 291. Karin M, Clevers H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. 2016;529(7586):307–15. Nature. 292. Gurtner GC, Werner S, Barrandon Y, Longaker MT. Wound repair and regeneration. Nature. 2008;453:314–321. 293. Rosero O, Németh K, Turóczi Z, Fülöp A, Garbaisz D, Győrffy A, et al. Collateral circulation of the rat lower limb and its significance in ischemia–reperfusion studies. Surg Today. 2013;44(12):2345– 53. 294. Morbidelli L, Donnini S, Ziche M. Role of nitric oxide in the modulation of angiogenesis. Curr Pharm Des. 2003;9(7):521-30. 295. Sdrimas K, Kourembanas S. MSC Microvesicles for the Treatment of Lung Disease: A New Paradigm for Cell-Free Therapy. Antioxid Redox Signal. 2014;21(13):1905–15. 296. Camussi G, Deregibus MC, Cantaluppi V. Role of stem-cell-derived microvesicles in the paracrine action of stem cells. Biochem Soc Trans. 2013;41(1):283–7. 297. Christiansen A, Detmar M. Lymphangiogenesis and Cancer. Genes and Cancer. 2011;2(12):1146–58. 298. Shao L, Zhang Y, Lan B, Wang J, Zhang Z, Zhang L, et al. MiRNA-Sequence Indicates That Mesenchymal Stem Cells and Exosomes Have Similar Mechanism to Enhance Cardiac Repair. Biomed Res Int. 2017;2017(4150705). 299. Lener T, Gimona M, Aigner L, Börger V, Buzas E, Camussi G, et al. Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials - An ISEV position paper. J Extracell Vesicles. 2015;4(1). 300. Gimona M, Pachler K, Laner-Plamberger S, Schallmoser K, Rohde E. Manufacturing of human extracellular vesicle-based therapeutics for clinical use. Int J Mol Sci. 2017;18(6). 8. ZAŁĄCZNIKI 8.1. Tabele Tabela I. Lista białek zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs zaklasyfikowanych według procesu biologicznego jako białka zaangażowane w adhezję komórek. Analizę wykonano przy użyciu aplikacji Gene Ontology oraz wykorzystano wyłącznie białka zidentyfikowane w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Białka zaangażowane w adhezję komórek zidentyfikowane w preparatach MSC-EVs L.p. Kod UniProtKB Nazwa oryginalna białka 1 P14206 40S ribosomal protein SA 2 P21836 Acetylcholinesterase 3 P60710 Actin, cytoplasmic 1 4 Q7TPR4 Alpha-actinin-1 5 Q9R182 Angiopoietin-related protein 3 6 Q9ES46 Beta-parvin 7 Q9R0G6 Cartilage oligomeric matrix protein 8 P26231 Catenin alpha-1 9 Q02248 Catenin beta-1 10 P30999 Catenin delta-1 11 P15379 CD44 antigen 12 P41731 CD63 antigen 13 P40240 CD9 antigen 14 P60766 Cell division control protein 42 homolog 15 Q9Z1Q5 Chloride intracellular channel protein 1 16 P08121 Collagen alpha-1(III) chain 17 Q04857 Collagen alpha-1(VI) chain 18 Q60847 Collagen alpha-1(XII) chain 19 Q80X19 Collagen alpha-1(XIV) chain 20 O35206 Collagen alpha-1(XV) chain 21 Q02788 Collagen alpha-2(VI) chain 22 Q8CF98 Collectin-10 23 P29268 Connective tissue growth factor 24 P12960 Contactin-1 25 O89053 Coronin-1A 26 P97315 Cysteine and glycine-rich protein 1 27 O35474 EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 28 P21995 Embigin 29 Q99K41 EMILIN-1 30 Q8K482 EMILIN-2 31 P54761 Ephrin type-B receptor 4 32 Q8K1B8 Fermitin family homolog 3 33 Q61554 Fibrillin-1 34 E9PV24 Fibrinogen alpha chain 35 Q8K0E8 Fibrinogen beta chain 36 Q8VCM7 Fibrinogen gamma chain 37 P11276 Fibronectin 38 Q8BTM8 Filamin-A 39 Q60634 Flotillin-2 40 Q6NVD0 FRAS1-related extracellular matrix protein 2 41 P16045 Galectin-1 42 Q07797 Galectin-3-binding protein 43 P14602 Heat shock protein beta-1 44 Q8BKG3 Inactive tyrosine-protein kinase 7 45 P70389 Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit 46 P61622 Integrin alpha-11 47 Q00651 Integrin alpha-4 48 P11688 Integrin alpha-5 49 Q61739 Integrin alpha-6 50 Q9QUM0 Integrin alpha-IIb 51 P24063 Integrin alpha-L 52 P05555 Integrin alpha-M 53 P43406 Integrin alpha-V 54 P09055 Integrin beta-1 55 P11835 Integrin beta-2 56 O54890 Integrin beta-3 57 O70309 Integrin beta-5 58 O55222 Integrin-linked protein kinase 59 P21956 Lactadherin 60 Q60675 Laminin subunit alpha-2 61 P97927 Laminin subunit alpha-4 62 Q61001 Laminin subunit alpha-5 63 P02469 Laminin subunit beta-1 64 P02468 Laminin subunit gamma-1 65 Q99JW4 LIM and senescent cell antigen-like-containing domain protein 1 66 P26041 Moesin 67 Q3THE2 Myosin regulatory light chain 12B 68 Q61879 Myosin-10 69 Q8VDD5 Myosin-9 70 P97798 Neogenin 71 P13595 Neural cell adhesion molecule 1 72 P97333 Neuropilin-1 73 P10493 Nidogen-1 74 O88322 Nidogen-2 75 O35103 Osteomodulin 76 P10923 Osteopontin 77 O70400 PDZ and LIM domain protein 1 78 Q62009 Periostin 79 Q9JHG7 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform 80 Q9JHK5 Pleckstrin 81 B2RXS4 Plexin-B2 82 P97321 Prolyl endopeptidase FAP 83 Q9QVP9 Protein-tyrosine kinase 2-beta 84 Q8BNA6 Protocadherin Fat 3 85 Q2PZL6 Protocadherin Fat 4 86 P63001 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 87 Q05144 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 88 P61027 Ras-related protein Rab-10 89 P61226 Ras-related protein Rap-2b 90 P06800 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C 91 A2A8L5 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F 92 B0V2N1 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase S 93 Q60841 Reelin 94 O55098 Serine/threonine-protein kinase 10 95 Q8BZ03 Serine/threonine-protein kinase D2 96 Q62230 Sialoadhesin 97 Q9R1B9 Slit homolog 2 protein 98 A2AVA0 Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domaincontaining protein 1 99 P26039 Talin-1 100 Q80YX1 Tenascin 101 P01831 Thy-1 membrane glycoprotein 102 P82198 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 103 Q99JR5 Tubulointerstitial nephritis antigen-like 104 P29351 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 105 Q64727 Vinculin 106 Q9Z0G4 WNT1-inducible-signaling pathway protein 2 Tabela II. Lista białek zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs zaklasyfikowanych według procesu biologicznego jako białka zaangażowane bądź regulujące proces angiogenezy. Analizę wykonano przy użyciu aplikacji Gene Ontology oraz wykorzystano wyłącznie białka zidentyfikowane w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Białka regulujące lub zaangażowane w angiogenezę zidentyfikowane w preparatach MSC-EVs L.p. Kod UniProtKB Nazwa oryginalna białka 1 Q99M51 Cytoplasmic protein NCK1 2 P23927 Alpha-crystallin B chain 3 P35235 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 11 4 P42225 Signal transducer and activator of transcription 1 5 Q9JHG7 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform 6 P63085 Mitogen-activated protein kinase 1 7 Q62219 Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein 8 P29351 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 9 P14602 Heat shock protein beta-1 10 P47811 Mitogen-activated protein kinase 14 11 Q02248 Catenin beta-1 12 Q8CIH5 1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2 13 Q63844 Mitogen-activated protein kinase 3 14 P31938 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 15 Q60631 Growth factor receptor-bound protein 2 16 Q8BZ03 Serine/threonine-protein kinase D2 17 P08556 GTPase NRas 18 P68404 Protein kinase C beta type Tabela III. Lista białek zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs zaklasyfikowanych według procesu biologicznego jako białka zaangażowane bądź regulujące rozwój nowych naczyń krwionośnych. Analizę wykonano przy użyciu aplikacji Gene Ontology oraz wykorzystano wyłącznie białka zidentyfikowane w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Białka zaangażowane lub regulujące w rozwój nowych naczyń krwionośnych zidentyfikowane w preparatach MSC-EVs L.p. Kod UniProtKB Nazwa oryginalna białka 1 P08226 Apolipoprotein E 2 P11352 Glutathione peroxidase 1 3 Q8CG19 Latent-transforming growth factor beta-binding protein 1 4 P06745 Glucose-6-phosphate isomerase 5 P54761 Ephrin type-B receptor 4 6 O88393 Transforming growth factor beta receptor type 3 7 Q91ZX7 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 8 P01831 Thy-1 membrane glycoprotein 9 P07356 Annexin A2 10 P39054 Dynamin-2 11 Q64455 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase eta 12 Q9DBG3 AP-2 complex subunit beta 13 P58022 Lysyl oxidase homolog 2 14 O35375 Neuropilin-2 15 Q9JHG7 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform 16 Q01149 Collagen alpha-2(I) chain 17 P46935 E3 ubiquitin-protein ligase NEDD4 18 P43406 Integrin alpha-V 19 P63085 Mitogen-activated protein kinase 1 20 Q8BTM8 Filamin-A 21 Q9QYB1 Chloride intracellular channel protein 4 22 P12815 Programmed cell death protein 6 23 P97321 Prolyl endopeptidase FAP 24 P97333 Neuropilin-1 25 Q8VHY0 Chondroitin sulfate proteoglycan 4 26 P47811 Mitogen-activated protein kinase 14 27 Q02248 Catenin beta-1 28 Q9QVP9 Protein-tyrosine kinase 2-beta 29 E9Q7X6 Protein HEG homolog 1 30 P09470 Angiotensin-converting enzyme 31 P02463 Collagen alpha-1(IV) chain 32 P31938 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 33 P09405 Nucleolin 34 Q9R1B9 Slit homolog 2 protein 35 P97927 Laminin subunit alpha-4 36 Q8BKG3 Inactive tyrosine-protein kinase 7 37 P60766 Cell division control protein 42 homolog 38 P28301 Protein-lysine 6-oxidase 39 P29268 Connective tissue growth factor 40 P21956 Lactadherin 41 Q8BZ03 Serine/threonine-protein kinase D2 42 Q8BH43 Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 2 43 P11276 Fibronectin 44 Q99P72 Reticulon-4 45 Q3UHN9 Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 1 46 Q6ZPF4 Formin-like protein 3 47 P11087 Collagen alpha-1(I) chain 48 Q05793 Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein 49 Q06806 Tyrosine-protein kinase receptor Tie-1 50 Q61879 Myosin-10 51 Q9R182 Angiopoietin-related protein 3 52 P09055 Integrin beta-1 53 P97449 Aminopeptidase N 54 Q61508 Extracellular matrix protein 1 55 Q8VDD5 Myosin-9 56 P27601 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-13 57 E9Q414 Apolipoprotein B-100 58 P08121 Collagen alpha-1(III) chain 59 P56480 ATP synthase subunit beta, mitochondrial 60 Q61982 Neurogenic locus notch homolog protein 3 Tabela IV. Lista białek zidentyfikowanych w preparatach MSC-EVs zaklasyfikowanych według procesu biologicznego jako białka zaangażowane bądź regulujące proliferację komórek. Analizę wykonano przy użyciu aplikacji Gene Ontology oraz wykorzystano wyłącznie białka zidentyfikowane w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Białka regulujące lub zaangażowane w proliferację komórek zidentyfikowane w preparatch MSC-EVs L.p. Kod UniProtKB Nazwa oryginalna białka 1 P11352 Glutathione peroxidase 1 2 P61202 COP9 signalosome complex subunit 2 3 O88393 Transforming growth factor beta receptor type 3 4 Q91ZX7 Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 5 P08752 Guanine nucleotide-binding protein G(i) subunit alpha-2 6 P62874 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1 7 Q62192 CD180 antigen 8 P05555 Integrin alpha-M 9 P58022 Lysyl oxidase homolog 2 10 P63038 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 11 P35700 Peroxiredoxin-1 12 P63085 Mitogen-activated protein kinase 1 13 Q00623 Apolipoprotein A-I 14 P11835 Integrin beta-2 15 P97321 Prolyl endopeptidase FAP 16 P61027 Ras-related protein Rab-10 17 Q9JM99 Proteoglycan 4 18 Q8VHY0 Chondroitin sulfate proteoglycan 4 19 P29351 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 20 P63001 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 21 P82198 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 22 Q02248 Catenin beta-1 23 Q9R0Q7 Prostaglandin E synthase 3 24 Q9DBC7 cAMP-dependent protein kinase type I-alpha regulatory subunit 25 P09470 Angiotensin-converting enzyme 26 P24547 Inosine-5’-monophosphate dehydrogenase 2 27 P31938 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 1 28 Q3USZ8 Deleted in autism protein 1 homolog 29 P55264 Adenosine kinase 30 P29268 Connective tissue growth factor 31 P30993 C5a anaphylatoxin chemotactic receptor 1 32 P70698 CTP synthase 1 33 P24063 Integrin alpha-L 34 Q61879 Myosin-10 35 Q8C3J5 Dedicator of cytokinesis protein 2 36 B2RXS4 Plexin-B2 37 P06800 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C 38 P57716 Nicastrin 39 Q2PZL6 Protocadherin Fat 4 40 P28798 Granulins 41 P26041 Moesin 42 Q99JI6 Ras-related protein Rap-1b Tabela V. Lista białek zidentyfikowanych wyłącznie w MSC-EVs. Analizę wykonano przy użyciu aplikacji Gene Ontology oraz wykorzystano wyłącznie białka zidentyfikowane w przynajmniej dwóch z trzech próbek na podstawie 2 lub większej liczby unikalnych peptydów. Lista białek zidentyfikowanych wyłącznie w preparatach MSC-EVs L.p. A Kod UniProtKB Nazwa oryginalna białka 1 P16627 Heat shock 70 kDa protein 1-like 2 P51942 Cartilage matrix protein 3 P70352 Ecto-ADP-ribosyltransferase 5 4 Q8BH35 Complement component C8 beta chain Q8R121 Protein Z-dependent protease inhibitor 6 Q9ES30 Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 3 7 P06909 Complement factor H 8 P52850 Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 2 9 O89029 Matrilin-4 Q3U6Q4 Phosphoinositide 3-kinase regulatory subunit 6 11 Q3V0K9 Plastin-1 12 Q8BHH2 Ras-related protein Rab-9B 13 O35367 Keratocan 14 O88200 C-type lectin domain family 11 member A P16015 Carbonic anhydrase 3 16 P35802 Neuronal membrane glycoprotein M6-a 17 P47877 Insulin-like growth factor-binding protein 2 18 P97812 Indian hedgehog protein 19 Q06194 Coagulation factor VIII Q9EQF5 Dihydropyrimidinase 21 O08677 Kininogen-1 22 O08858 Somatostatin receptor type 5 23 O35969 Guanidinoacetate N-methyltransferase 24 O54951 Semaphorin-6B O70624 Myocilin 26 O88634 Proteinase-activated receptor 4 27 P07309 Transthyretin 28 P09535 Insulin-like growth factor II 29 P10648 Glutathione S-transferase A2 P26928 Hepatocyte growth factor-like protein 31 P49282 Natural resistance-associated macrophage protein 2 32 P52840 Sulfotransferase 1A1 33 P70274 Selenoprotein P 34 P70695 Fructose-1,6-bisphosphatase isozyme 2 Q3U1J0 Sodium-coupled neutral amino acid transporter 5 36 Q60997 Deleted in malignant brain tumors 1 protein 37 Q769J6 A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 13 38 Q80UE6 Serine/threonine-protein kinase WNK4 39 Q8BG09 Transmembrane protein 184B Q8BJU2 Tetraspanin-9 41 Q8C3I9 Deleted in autism-related protein 1 homolog 42 Q8CEZ1 Single-pass membrane and coiled-coil domain-containing protein 1 43 Q8K1I3 Secreted phosphoprotein 24 44 Q8VCC9 Spondin-1 Q8VI56 Low-density lipoprotein receptor-related protein 4 46 Q91Y02 Protocadherin beta-18 47 Q91Y47 Coagulation factor XI 48 Q99P58 Ras-related protein Rab-27B 49 Q9CXF0 Kynureninase Q9D6F9 Tubulin beta-4A chain 51 Q9DB75 Cell death-inducing p53-target protein 1 52 Q9JHI0 Matrix metalloproteinase-19 53 Q9JKX3 Transferrin receptor protein 2 54 Q62443 Neuronal pentraxin-1 55 A2AQ07 Tubulin beta-1 chain 56 Q9QXY6 EH domain-containing protein 3 57 P12960 Contactin-1 58 Q60675 Laminin subunit alpha-2 59 Q2PZL6 Protocadherin Fat 4 60 Q9WTZ2 Membrane-bound transcription factor site-1 protease 61 P0CG49 Polyubiquitin-B 62 Q61646 Haptoglobin 63 Q8R4V5 Oncoprotein-induced transcript 3 protein 64 O08710 Thyroglobulin 65 P06684 Complement C5 66 Q9R1B9 Slit homolog 2 protein 67 Q9R0G6 Cartilage oligomeric matrix protein 68 Q9WUB3 Glycogen phosphorylase, muscle form 69 Q62000 Mimecan 70 Q60841 Reelin 71 Q02357 Ankyrin-1 72 Q8CG03 cGMP-specific 3’,5’-cyclic phosphodiesterase 73 Q9QUG9 RAS guanyl-releasing protein 2 74 P98064 Mannan-binding lectin serine protease 1 75 P97798 Neogenin 76 Q9Z1T2 Thrombospondin-4 77 Q8CG16 Complement C1r-A subcomponent 78 B0V2N1 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase S 79 Q6KAU4 Multivesicular body subunit 12B 80 P86048 60S ribosomal protein L10-like 81 Q8CF98 Collectin-10 82 Q8CHR6 Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] 83 O35490 Betaine—homocysteine S-methyltransferase 1 84 P09470 Angiotensin-converting enzyme 85 Q8CG85 MAM domain-containing protein 2 86 P00687 Alpha-amylase 1 87 Q3UHN9 Bifunctional heparan sulfate N-deacetylase/N-sulfotransferase 1 88 Q9JHH6 Carboxypeptidase B2 89 E9PV24 Fibrinogen alpha chain 90 Q61147 Ceruloplasmin 91 Q61001 Laminin subunit alpha-5 92 O70628 High affinity cGMP-specific 3’,5’-cyclic phosphodiesterase 9A 93 P35492 Histidine ammonia-lyase 94 P97927 Laminin subunit alpha-4 95 P07310 Creatine kinase M-type 96 O88947 Coagulation factor X 97 Q8R105 Vacuolar protein sorting-associated protein 37C 98 Q64374 Regucalcin 99 Q9R182 Angiopoietin-related protein 3 100 Q06806 Tyrosine-protein kinase receptor Tie-1 101 Q8BX43 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 19L 102 Q9QUM0 Integrin alpha-IIb 103 Q8R0J7 Vacuolar protein sorting-associated protein 37B 104 Q8VDF3 Death-associated protein kinase 2 105 P02104 Hemoglobin subunit epsilon-Y2 106 Q80ZA4 Fibrocystin-L 107 Q8BH00 Aldehyde dehydrogenase family 8 member A1 108 Q8CI19 Platelet-derived growth factor C 109 O35103 Osteomodulin 110 P16301 Phosphatidylcholine-sterol acyltransferase 111 P46412 Glutathione peroxidase 3 112 P49182 Heparin cofactor 2 113 P56400 Platelet glycoprotein Ib beta chain 114 Q5SVL6 Rap1 GTPase-activating protein 2 115 Q61982 Neurogenic locus notch homolog protein 3 116 Q6NVD0 FRAS1-related extracellular matrix protein 2 117 Q8BHJ6 Serine incorporator 5 118 Q8BK62 Olfactomedin-like protein 3 119 Q8K0E8 Fibrinogen beta chain 120 Q8R555 Cartilage acidic protein 1 121 Q8VC12 Urocanate hydratase 122 Q91X88 Protein O-linked-mannose beta-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 123 A2A8L5 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F 124 Q07235 Glia-derived nexin 125 Q8R0W0 Epiplakin 126 Q91X83 S-adenosylmethionine synthase isoform type-1 127 Q99MQ4 Asporin 128 P97321 Prolyl endopeptidase FAP 129 Q61470 Leukocyte antigen CD37 130 P42230 Signal transducer and activator of transcription 5A 131 P21836 Acetylcholinesterase 132 P28665 Murinoglobulin-1 133 P32037 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 3 134 P70389 Insulin-like growth factor-binding protein complex acid labile subunit 135 Q91XD4 Formimidoyltransferase-cyclodeaminase 8.2. Rozwinięcia skrótów w opisach do Rycin Rozwinięcie skrótów białek przedstawionych na interaktomie na Rycininie 23 (Sieć interakcji pomiędzy białkami zaangażowanymi w adhezję komórek zidentyfikowanymi w MSC-EVs). Białka wymienione na interaktomie: Ache – acetylocholinesteraza (ang. acetylcholinesterase) Actg1– aktyna, γ, cytoplazmatyczna 1 (ang. actin, γ, cytoplasmic 1) CD9 – antigen CD9 (ang. CD9 antigen) CD44 – receptor dla kwasu hialuronowego (ang. receptor for hyaluronic acid) CD63 – antygen CD63 (ang. CD63 antigen) Csrp1 – białko wzbogacone w cysteinę oraz glicynę 1 (ang. cysteine and glycine-rich protein 1) Ctgf – czynnik wzrostu tkanki łącznej (ang. connective tissue growth factor) Ctnnd1 – katenina – białko zwiążane z kadheryną, δ1 (ang. catenin - cadherin associated protein, δ1) Emb – embigina (ang. embigin) Fbn1 – fibrylina 1 (ang. fibrillin 1) Fermt3 – homolog 3 białek z rodziny fermitin (ang. fermitin family homolog 3) Fga – fibrynogen łańcuch α (ang. fibrinogen α chain) Fgb – fibrynogen łańcuch β (ang. fibrinogen β chain) Fgg – fibrynogen łańcuch γ (ang. fibrinogen γ chain) Filip1 – białko oddziałujące z filaminą A (ang. filamin A interacting protein 1) Fn1 – fibronektyna 1 (ang. fibronectin 1) Ilkap – fosfataza serynowo/ treoninowa 2C związana z integrynami (ang. integrin-linked kinaseassociated serine/threonine phosphatase 2C) Itgal – integryna αL (ang. integrin αL) Itgam – integryna αM (ang. integrin αM) Itga2b – integryna α2b (ang. integrin α2b) Itga4 – integryna α4 (ang. integrin α4) Itga5 – integryna α5 (ang. integrin α5) Itgav – integryna αV (ang. integrin αV) Itga6 – integryna α6 (ang. integrin α6) Itga11 – integryna α11 (ang. integrin α11) Itgb1 – integryna β1, receptor β dla fibronektyny (ang. integrin beta 1, fibronectin receptor β) Msn – miozyna (ang. moesin) Myl12b – miozyna łańcuch lekki 12B, regulatorowy (ang. myosin light chain 12B, regulatory) Neo1 – neogenina (ang. neogenin) Ncam1 – cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych 1 (ang. neural cell adhesion molecule 1) Omd – osteomodulina (ang. osteomodulin) Pdlim1 – domena 1 PDZ and LIM - elfina (ang. PDZ and LIM domain 1 - elfin) Postn – periostyna, specyficzny czynnik osteoblastów (ang. periostin, osteoblast specific factor) Ptk2b – białkowa kinaza tyrozynowa PTK2 β (ang. PTK2 protein tyrosine kinase 2 beta) Reln – reelina (ang. reelin) Siglec 1 – lektyna Ig- podobna wiążąca kwas sialowy 1, tzw. sialoadhezyna (ang. sialic acid binding Ig-like lectin 1, sialoadhesin) Tinagl1 – antygen 1 rurkowo-śródmiąższowego zapalenia nerek (ang. tubulointerstitial nephritis antigen-like 1) Tnc – tenascyna C (ang. tenascin C) Vcl – winkulina (ang. vinculin) Rozwinięcie skrótów białek przedstawionych na interaktomie na Rycininie 24 (Sieć interakcji pomiędzy białkami zaagnażowanymi w adhezję komórek, rozwój naczyń krwionośnych oraz gojenie się ran zidentyfikowanymi w MSC-EVs). Białka wymienione na interaktomie: Ache – acetylocholinesteraza (ang. acetylcholinesterase) Actg1 – aktyna, γ, cytoplazmatyczna 1 (ang. actin, γ, cytoplasmic 1) Anxa1 – aneksyna A1 (ang. annexin A1) Anxa2 – aneksyna A2 (ang. annexin A2) Anxa5 – aneksyna A5 (ang. annexin A5) Ap2b1 – zależny od adaptera kompleks białek 2, podjednostka β1 (ang. adaptor-related protein complex 2, β1 subunit) Ap3b1 – zależny od adaptera kompleks białek 3, podjednostka β1 (ang. adaptor-related protein complex 3, β1 subunit) Atp5b – syntaza ATP, complex mitochondrialny F1 transportujący H+, podjednostka β (ang. ATP synthase, H+ transporting mitochondrial F1 complex, β subunit) Cd9 – antygen CD9 (ang. CD9 antigen) CD44 – receptor dla kwasu hialuronowego (ang. receptor for hyaluronic acid) Cd63 – antygen CD63 (ang. CD63 antigen) Cpb2 – karboksypeptydaza B2 (ang. carboxypeptidase B2) Cspg4 – proteoglikan siarczanu chondroityny 4 (ang. chondroitin sulfate proteoglycan 4) Csrp1 – białko wzbogacone w cysteinę oraz glicynę 1 (ang. cysteine and glycine-rich protein 1) Ctnnd1 – katenina – białko zwiążane z kadheryną, δ1 (ang. catenin - cadherin associated protein, δ1) Ctgf – czynnik wzrostu tkanki łącznej (ang. connective tissue growth factor) Ecm1 – białko macierzy zewnątrzkomórkowej 1 (ang. extracellular matrix protein 1) Emb – embigina (ang. embigin) ENSMUSG00000094526 – homolog oksydazy lizylowej (ang. lysyl oxidase homolog 2) Entpd1 – Difosfohydrolaza trifosforanu ektonukleozydu 1 (ang. ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1) Fbn1 – fibrylina (ang. fibrillin 1) Fermt3 – homolog 3 rodziny białek fermitin (ang. fermitin family homolog 3) Fga – fibrynogen łańcuch α (ang. fibrinogen α chain) Fgb – fibrynogen łańcuch β (ang. fibrinogen beta chain) Fgg – fibrynogen łańcuch γ (ang. fibrinogen γ chain) Fn1 – fibronektyna 1 (ang. fibronectin 1) F5 – czynnik krzepnięcia V (ang. coagulation factor V) F10 – czynnik krzepnięcia X (ang. coagulation factor X) Gpx1 – peroksydaza glutationowa 1 (ang. glutathione peroxidase 1) Ilkap – fosfataza serynowo/ treoninowa 2C związana z integrynami (ang. integrin-linked kinaseassociated serine/threonine phosphatase 2C) Itgal – integryna αL (ang. integrin αL) Itgam – integryna αM (ang. integrin αM) Itga2b – integryna α2b (ang. integrin α2b) Itga4 – integryna α4 (ang. integrin α4) Itga5 – integryna α5 (ang. integrin α5) Itga6 – integryna α6 (ang. integrin α6) Itga11 – integryna α11 (ang. integrin α11) Itgb1 – integryna β1, receptor β dla fibronektyny (ang. integrin β1, fibronectin receptor β) Mapk1 – kinaza białkowa aktywowana mitogenem Mapk1 (ang. mitogen-activated protein kinase 1) Map2k1 – kinaza białkowa aktywowana mitogenem Map2k1 (ang. mitogen-activated protein kinase kinase 1) Mapk14 – kinaza białkowa aktywowana mitogenem MAPK14 (ang. mitogen-activated protein kinase 14) Msn – miozyna (ang. moesin) Myl12b – miozyna łańcuch lekki 12B, regulatorowy (ang. myosin light chain 12B, regulatory) Ncam1 – cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych 1 (ang. neural cell adhesion molecule 1) Ncl – nukleolina (ang. nucleolin) Neo1 – neogenina (ang. neogenin) Nrp2 – neurofilina 2 (ang. neuropilin 2) Omd – osteomodulina (ang. osteomodulin) Pdcd6 – receptor programowanej śmierci komórek 6 (ang. programmed cell death 6) Pdlim1 – domena 1 PDZ and LIM - elfina (ang. PDZ and LIM domain 1 - elfin) Plek – plekstryna (ang. pleckstrin) Postn – periostyna, specyficzny czynnik osteoblastów (ang. periostin, osteoblast specific factor) Ptk2b – białkowa kinaza tyrozynowa PTK2 β (ang. PTK2 protein tyrosine kinase 2β) Reln – reelina (ang. reelin) Rpsa – białko rybosomalne SA (ang. ribosomal protein SA) Siglec 1 – lektyna Ig- podobna wiążąca kwas sialowy 1, tzw. sialoadhezyna (ang. sialic acid binding Ig-like lectin 1, sialoadhesin) Tinagl1 – antygen 1 rurkowo-śródmiąższowego zapalenia nerek (ang. tubulointerstitial nephritis antigen-like 1) Tnc – tenascyna C (ang. tenascin C) Vcl – winkulina (ang. vinculin)