Uniwersytet Jagielloński Instytut Zoologii Ewa Trębacz Rola sjalilacji integryny .5ß1 w oddziaływaniach komórek czerniaka z fibronektyną Praca doktorska Praca wykonana w Zakładzie Biochemii Glikokoniugatów Katedra Fizjologii Zwierząt Uniwersytetu Jagiellońskiego Pod kierunkiem Pani Prof. dr hab. Anny Lityńskiej Kraków 2011 Najserdeczniejsze podziękowania pragnę złożyć Pani prof. dr hab. Annie Lityńskiej za wskazanie właściwej drogi naukowej, cierpliwość, wyrozumiałość, wszechstronną pomoc i czas poświęcony mi podczas prowadzenia badań i pisania pracy Pozostaję niezmiernie wdzięczna Pani dr Dorocie Hoja-Łukowicz za profesjonalne wprowadzenie w tajniki biologii molekularnej i komórkowej a także całemu zespołowi Zakładu Biochemii Glikokoniugatów za cenne wskazówki i miłą współpracę Dziękuję również Pracowni Mikroskopii Skaningowej Konfokalnej UJ pod kierownictwem Pani prof. dr hab. Elżbiety Pyzy za pomoc w analizie preparatów barwionych fluorescencyjnie Serdeczne podziękowania składam również na ręce Moich Rodziców za wyrozumiałość, miłość, cierpliwość oraz za to, że zawsze przy mnie byli Spis treści WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW……..……………………………...………7 I. STRESZCZENIE……………………………………...……...…………………….11 I. SUMMARY…………………………………………………………………………13 II. WSTĘP……………………………………...……..……………………………….15 II.1. Czerniak skóry…………………………………………...………………………15 II.2. Glikozylacja……………………………………………...……………………….18 II.3. Biosynteza oraz funkcje kwasów sjalowych…………………………………....23 II.4. Budowa i funkcje sjalilotransferaz…………………………………………..…26 II.5. Struktura i funkcje integryn…………………………………………………….30 II.6. Integryna .5ß1 – specyficzny receptor fibronektyny…………………………..34 II.7. Rola glikozylacji integryny .5ß1………………………………………………...35 II.8. Fibronektyna – struktura i funkcja…………………………………………….38 II.9. Budowa i funkcje macierzy zewnątrzkomórkowej i błony podstawnej……...40 II.10. Biosynteza i funkcje metaloproteinaz (MMPs)……………………………….41 II.11. Transformacja nowotworowa…………………………………………………42 III. CELE PRACY…………………………………………………………………….47 IV. METODYKA BADAŃ……………………………………………………………48 IV.1. Linie komórkowe………………………………………………………………..49 IV.1.1. WM115…………………………………………………………………………49 IV.1.2. WM266-4……………………………………………………………………….49 IV.2. Hodowla komórkowa…………………………………………………………...49 IV.2.1. Rozmrażanie komórek…………………………………………………………49 IV.2.2. Prowadzenie hodowli komórkowej…………………………...………………..49 IV.2.3. Pasażowanie komórek………………………………………………………....50 IV.2.4. Bankowanie komórek………………………………………………………….50 IV.3. Izolacja RNA, synteza cDNA i reakcja RT-PCR……………………………..51 IV.3.1. Izolacja RNA…………………………………………………………………...51 IV.3.2. Synteza cDNA…………………………….…………………………………....51 IV.3.3. Reakcja RT – PCR……………………………………………………………..52 IV.3.4. Elektroforeza produktów reakcji RT- PCR oraz RNA………………………..53 IV.4. Przygotowanie homogenatów komórkowych…………………………………53 IV.5. Oznaczanie stężenia białka metodą Petersona GL (1977)……………………54 IV.6. Precypitacja lektyną MAL-II białek zawierających struktury sjalilowane SA.2-3Gal oraz lektyną SNA białek ze strukturami SA.2-6Gal/GalNAc.....55 IV.7. Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS (SDSPAGE), wg zmodyfikowanej metody Laemmli’ego (1970)……………..……55 IV.8 Zymografia – ocena aktywności proteolitycznej żelatynazy A (Pro-MMP-2, 72 kDa) i żelatynazy B (MMP-9, 92 kDa)………………………..……………….57 IV.9. Wybarwianie żeli poliakryloamidowych na obecność białka………………...57 IV.10. Suszenie żeli poliakrylamidowych……………………………………………57 IV.11. Elektrotoprzeniesienie białek na Immbilon TM - PVDF (Western Blotting).58 IV.12. Reakcja z lektynami………………………………………………...…………58 IV.13. Immunodetekcja podjednostek integrynowych .5 i ß1……………………...59 IV.14. Oczyszczanie integryny .5ß1 metodą chromatografii powinowactwa biologicznego do peptydu(Ac-Gly-Ala-c-(CysSS-Arg-Arg-Glu-Thr-Ala-Trp-AlaCysSS)- GlyAlaO (CH2CH2O) CH2CH2-NH2), wg Wobbe L i współ., (2006)…………………………………………………………………………...59 IV.14.1. Przygotowanie złoża…………………………………………………………..60 IV.14.2. Warunki oraz profil rozdziału………………………………………………..60 IV.15. Desjalilacja integryny .5ß1 specyficznymi neuraminidazami………………61 IV.16. Test ELISA - wiązanie oczyszczonej integryny .5 ß1 do fibronektyny……..62 IV.16.1. Przygotowanie płytki………………………………………………………….62 IV.16.2. Adhezja oczyszczonej integryny .5 ß1 do fibronektyny……………………...62 IV.16.3. Adhezja desjalilowanej integryny do FN…………………………………….63 IV.17. Cytometria przepływowa. Analiza ekspresji powierzchniowej podjednostki integrynowej .5 oraz kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc lub .23Gal……………………………………………………………….…………… 63 IV.18. Mikroskopia konfokalna……………………………………………………...64 IV.18.1. Barwienie struktur SNA oraz MAA pozytywnych…………………………...64 IV.18.2. Barwienie podjednostek integrynowych .5 lub ß1…………………………...65 IV.18.3. Podwójne barwienie podjednostek integrynowych .5 oraz ß1……………….65 IV.18.4. Podwójne barwienie podjednostki integrynowej .5 lub ß1 i struktur SNA lub MAA pozytywnych……………………………………………………………66 IV.18.5. Barwienie włókien wimentyny……………………………………………….66 IV.19. MTT – enzymatyczny test żywotności komórek…………………………….67 IV.20. Desjalilacja komórek………………………………………………………….68 IV.21. Test adhezji komórek do fibronektyny………………………………………68 IV.21.1. Adhezja komórek linii WM115 i WM266-4 do fibronektyny……………......69 IV.21.2. Adhezja komórek linii WM115 i WM266-4 do fibronektyny w obecności lektyn i po desjalilacji……………………………………………………….…...69 IV.22. Test gojenia ran po fibronektynie…………………………………………….70 IV.22.1. Test gojenia ran po fibronektynie……………………………………………70 IV.22.2. Test gojenia ran po fibronektynie w obecności przeciwciał skierowanych przeciwko podjednostce integrynowej .5 oraz lektyn………………………70 IV.23. Test inwazji komórek………………………………………………………….71 IV.23.1. Przygotowanie płytek…………………………………………………………71 IV.23.2. Badanie inwazji komórek linii WM115 i WM266-4 przez Matrigel………...71 IV.23.3. Badanie inwazji komórek linii WM115 i WM266-4 przez Matrigel po ich desjalilacji lub w obecności przeciwciał skierowanych przeciwko podjednostce integrynowej .5…………………………………………………………..…...72 IV.24. Statystyka………………………………………………………………………72 V. WYNIKI………………………………………………………………………..…..73 V.1. Ekspresja sjalilotransferaz w komórkach nowotworowych - RT – PCR…….73 V.2. Immunodetekcja podjednostek integrynowych .5 i ß1. Precypitacja lektynami SNA lub MAA specyficznie rozpoznającymi kwasy sjalowe wiązane do Nglikanów……………………………………………………………………….... 75 V.3. Chromatografia powinowactwa biologicznego z syntetycznym peptydem AcGly- Ala-c-(CysSS-Arg-Arg-Glu-Thr-Ala-Trp-Ala-CysSS)GlyAlaO (CH2CH2 O)2CH2CH2-NH2 selektywnie wiążącym podjednostkę integrynową .5……....77 V.4. Immunodetekcja oczyszczonych podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 po desjalilacji………………………………..……………………………...………80 V.5. Adhezja oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny. Test ELISA…………82 V.6. Badanie ekspresji podjednostki integrynowej .5, kwasów sjalowych SNA oraz MAA pozytywnych na powierzchni komórek metodą cytometrii przepływowej........................................................................................................83 V.7. Badanie ekspresji integryny .5ß1, kwasów sjalowych oraz włókien wimentyny. Kolokalizacja podjednostek integrynowych z kwasami sjalowymi na powierzchni komórek mikroskopia konfokalna……………………………....86 V.8. Test żywotności komórek – MTT. Ustalenie stężenia lektyn: SNA, MAA, barwnika Dil oraz warunków desjalilacji……………………………………..92 V.9. Desjalilacja komórek z wykorzystaniem specyficznych sjalidaz……………...94 V.10. Badanie poziomu metaloproteinaz w komórkach czerniaka – Zymografia...95 V.11. Udział kwasów sjalowych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc oraz integryny .5ß1 w migracji na fibronektynie – test gojenia ran……………………………...96 V.12. Adhezja komórek czerniaka linii WM115 oraz WM266-4 do fibronektyny; wpływ kwasów sjalowych oraz udział integryny .5ß1……………………….100 V.13. Badanie inwazji komórek…………………………………………………......101 VI. DYSKUSJA…………………………………………………………………...….105 VI.1. Zmiany ekspresji wybranych sjalilotransferaz zachodzące w komórkach podczas rozwoju czerniaka skóry…………………………………………….105 VI.2. Obecność integryny .5ß1 w pełnym homogenacie komórkowym, wstępne badanie profilu sjalilacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1………….108 VI.3. Profil sjalilacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1………………….....109 VI.4. Adhezja oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny……………………...112 VI.5. Ekspresja integryny .5ß1 na powierzchni komórek czerniaka skóry………114 VI.6. Ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc na powierzchni komórek czerniaka skóry………………………………………115 VI.7. Badanie powierzchni komórek czerniaka za pomocą mikroskopu konfokalnego………………………………………………………………………...… 117 VI.7.1. Ekspresja podjednostek integrynowych .5 lub ß1 na powierzchni komórek czerniaka……………………………………………………………………...117 VI.7.2. Ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .26Gal/ GalNAc………………………………………………………………117 VI.7.3. Kolokalizacja podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 z kwasami sjalowymi……………………………………………………………………………. 118 VI.8. Obecność włókien wimentyny w komórkach czerniaka skóry linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4……………………………………...119 VI.9. Oznaczenie aktywności metaloproteinaz metodą zymografii………………119 VI.10. Migracja komórek czerniaka skóry na fibronektynie……………………..120 IV.10.1. Rola integryny .5ß1 podczas migracji komórek czerniaka na fibronektynie………………………………………………………………..………… 122 VI.10.2. Udział kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc w migracji komórek czerniaka…………………………………………….123 VI.11. Adhezja komórek czerniaka skóry do fibronektyny……………………….125 VI.11.1. Wpływ integryny .5ß1 na adhezję komórek czerniaka skóry do fibronektyny…………………………………………………………………...…….... 126 VI.11.2. Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc oraz .2-3Gal na adhezję komórek czerniaka skóry do fibronektyny…………………….......128 VI.12. Inwazja komórek czerniaka przez Matrigel, wpływ integryny .5ß1……...130 VI.12.1. Udział integryny .5ß1 w inwazji komórek czerniaka przez Matrigel……....131 VI.12.2. Wpływ kwasów sjalowych na inwazję komórek przez Matrigel……………132 VII. PODSUMOWANIE…………………………………………………………….134 VIII. WNIOSKI……………………………………………………………………...136 LITERATURA……………………………………………………………………….138 Wykaz stosowanych skrótów Wykaz stosowanych skrótów AIDS – (ang. aquired immunodeficiency syndrome) - oznacza zespół nabytych niedoborów immunologicznych Akt – serynowo – treoninowa kinaza Akt AKT – gen kodujący kinazę Atk Alexa Fluor 488 – fluorochrom (wzbudzenie – 495nm, emisja- 519nm) Asn – asparagina BM – (ang. Basement membrane) błona podstawna BRAF – serynono/treoninowa kinaza RAF typu B RRAF – gen kodujący kinazę BRAF Caco-2 – linia komórek nabłonka jelita Capan-1 – linia komórkowa raka trzustki CMP – cytydynomonofosforan CMP-Neu5Ac – cytydynomonofosforan kwasu N-acetyloneuraminowego Cy3 – fluorochrom (wzbudzenie – 550nm, emisja- 570nm) DiI – fluorochrom DilC18(3) (wzbudzenie – 549nm, emisja- 565nm) G361 – linia komórek czerniaka skóry GA – aparat Golgiego Gal – galaktoza GalNAc – N-acetylogalaktozoamina GAPDH – (ang. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), gen dehydrogenazy aldehydu- 3-fosfoglicerynowego Glc – glukoza GlcNAc – N-acetyloglukozoamina GlcNAc-6-P – N-acetyloglukozoamino-6-fosforan GnT – N-acetyloglukozoaminylotransferaza GnT-III – N-acetyloglukozoaminylotransferaza-III GnT-V – N-acetyloglukozoaminylotransferaza-V Wykaz stosowanych skrótów ECM – (ang. extracellular matrix) macierz zewnątrzkomórkowa ELISA – (ang. enzyme-linked immunosorbent assay) test immuoenzymatyczny ERK – (ang. extracellular signal-regulated kinases) kinaza regulowana zewnątrzkomórkowo FBS – (ang. fetal bovine serum) płodowa surowica bydlęca FITC – fluorochrom izocyjanian fluoresceiny (wzbudzenie – 494 nm, emisja – 520nm) FN – fibronektyna Fuc – fukoza H – homogenat komórkowy HD3 – linia komórkowa nabłonka jelita ICAM-1 – (ang. intracellular cell adhesion molekule-1) międzykomórkowa molekuła adhezyjna IF – białko włókna pośredniego ITGA5 – gen kodujący podjednostkę integrynową .5 ITGB1 – gen kodujący podjednostkę integrynową ß1 Lewis – mysia linia komórkowa raka płuc z wyciszonym genem kodującym podjed nostkę integrynową .5 MAA (=MAL-II) – (ang. Maackia amurensis lectin) lektyna uzyskana z Maackia amurensis Man – mannoza MDAPanc-28 – linia komórkowa raka trzustki Mel-CAM – (ang. melanocytic cell adhesion molecule) białko adhezyjne, antygen obecny na powierzchni komórek czerniaka MiaPaCa-2 – linia komórkowa raka trzustki MIDAS – (ang. metal ion-dependent adhesion site) miejsce przylegania zależne od obecności jonów metali MMPs – metaloproteinazy MTT – sól bromku 3 - (4,5-dimetylthiazol-2-ylo) -2,5-difenylotetrazoliowego N-CAM – (ang. neural cell adhesion molecule) neuronalna cząsteczka adhezyjna NGS – normalna surowica kozia NeuNAc – kwas sjalowy Neu5Ac – kwas N-acetyloneuraminowy Neu5Ac9P – fosforan kwasu N-acetyloneuraminowego OV4 – linia komórkowa raka jajnika Wykaz stosowanych skrótów p53 – (ang. tumor protein p53) białko o masie 53 kDa, supresor nowotworów PBS – bufor fosforanowy o pH 7.4 PFA – paraformaldehyd PI3K – kinaza 3-fosfatydyloinozytolu PHSRN – sekwencja aminokwasów Pro-His-Ser-Arg-Asn występująca w fibronektynie w powtórzeniu III9, rozpoznawana przez niektóre białka adhezyjne z grupy integryn PST – gen kodujący ST8Sia-IV PTEN – fosfataza fosfatydyloinozytolo-3,4,5-trisfosforanu PTEN – gen kodujący fosfatazę PTEN RER – szorstka siateczka śródplazmatyczna RGD – sekwencja aminokwasów Arg-Gly-Asp białek macierzy zewnątrzkomórkowej rozpoznawana przez komórkowe białka adhezyjne z grupy integryn RGP – (ang. radial growth phase) radialna faza wzrostu RFU – (ang. relative fluorescence units) jednostka względnej fluorescencji SA – kwas sjalowy Ser – seryna SGC-7901 – linia komórek gruczolakoraka żołądka Sia – kwas sjalowy Sia-Lex – struktury sjalilowane typu Lewis SIAT1 – gen kodujący ST6Gal-I SIAT3 – gen kodujący ST3Gal-III SIAT4C – gen kodujący ST3Gal-IV Siglec – (ang. Sia-binding IgG superfamily lectins) nadrodzina lektyn IgG wiążących kwasy sjalowe SNA – (ang. Sambucus nigra lectin) lektyna z czarnego bzu SSM – (ang. superficial spreadnig melanoma) czerniak szerzący się powierzchniowo ST – sjalilotransferaza ST3Gal-III – sjalilotransferaza przenosząca kwas sjalowy w pozycję .2-3Gal ST3Gal-IV – sjalilotransferaza przenosząca kwas sjalowy w pozycję .2-3Gal ST6Gal-I – sjalilotransferaza przenosząca kwas sjalowy w pozycję .2-6Gal ST8Sia-II – sjalilotransferaza przenosząca kwas sjalowy w pozycję .2-8SA ST8Sia-IV – sjalilotransferaza przenosząca kwas sjalowy w pozycję .2-8SA STX – gen kodujący ST8Sia-II Wykaz stosowanych skrótów SW948 – linia komórkowa raka jelita U-373 MG – linia komórkowa glejaka TIMP – błonowy tkankowy inhibitor metaloproteinaz TGF-ß – transformujący czynnik wzrostu ß Thr – treonina uPA – urokinazowy aktywator plazminogenu VGP – (ang. vertical growth phase) wertykalna faza wzrost WM115 – linia pierwotnych komórek czerniaka skóry WM266-4 – linia metastatycznych komórek czerniaka skóry Streszczenie I. Streszczenie Podczas rozwoju choroby nowotworowej komórki budujące guz nabywają zdolności do migracji, adhezji oraz tworzenia nowych ognisk chorobowych w odległych od guza pierwotnego tkankach. Transformacja nowotworowa jest procesem złożonym, pociąga za sobą zmiany genotypu oraz fenotypu komórek transformowanych. Na powierzchni komórek nowotworowych pojawia się osobliwy zestaw białek adhezyjnych, molekuł odpowiedzialnych za utrzymanie spójności tkanki oraz prawidłową komunikację z macierzą zewnątrzkomórkową. Jednocześnie może dochodzić do nadekspresji terminalnie zlokalizowanych kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc oraz .2-8SA, co wpływa na rozwój choroby. Szczególnie interesujące z punktu tworzenia przerzutów są obserwacje, dotyczące wpływu oddziaływania integryny .5ß1 z fibronektyną na adhezję, migrację i inwazję komórek nowotworowych, jednocześnie obecność kwasów sjalowych na powierzchni receptora może modyfikować powyższe oddziaływania. Wyniki prezentowane w pracy dotyczą wpływu kwasów sjalowych na oddziaływania komórek czerniaka skóry pierwotnej linii WM115 oraz metastatycznej linii WM266-4 uzyskanych od tego samego pacjenta z fibronektyną. W pierwszej części rozprawy doktorskiej stosując metodę RT-PCR dokonano analizy ekspresji genów dla pięciu sjalilotransferaz przenoszących kwasy sjalowe na N-glikany. Wyniki potwierdzają, że transformacji czerniaka skóry towarzyszą zmiany w ekspresji genów kodujących sjalilotransferazy. W komórkach linii WM266-4 zwiększa się ekspresja SIAT1, zmniejsza ekspresja SIAT4c, jednocześnie ekspresja SIAT3 oraz PST nie uległa zmianie. W komórkach linii WM266-4 zaobserwowano również brak transkryptu dla STX, co może być wyznacznikiem komórek metastatycznych czerniaka skóry. W następnej kolejności badano obecność integryny .5ß1 stosując immunodetekcję, jak również podjęto próbę określenia sjalilacji podjednostek integrynowych metodami precypitacji lektynami oraz desjalilacji. Badania wykazują obecność integryny .5ß1 w komórkach obu linii czerniaka skóry jak również wzrost sjalilacji .2-6Gal/GalNAc oraz spadek sjalilacji .2-3Gal podjednostki integrynowej .5 towarzyszy rozwojowi czerniaka. Streszczenie Badanie powierzchni komórek za pomocą cytometrii przepływowej wykazały zwiększoną ekspresję integryny .5ß1 oraz kwasów sjalowych .2-3Gal i .26Gal/ GalNAc wiązanych do glikanów komórek linii WM266-4. Wyniki testu adhezji oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny wykazały, że sjalilacja .2-3Gal obniża adhezję badanego receptora w komórkach linii WM115 w odróżnieniu do komórek linii WM266-4, w których kwasy sjalowe nie mają wpływu na adhezję do fibronektyny. Dokonano również identyfikacji metaloproteinaz metodą zymografii. Transformacji nowotworowej towarzyszy zwiększone wydzielanie metaloproteinazy Pro-MMP-2 i pojawienie się MMP-9, co potwierdzają badania pożywki znad komórek WM266-4. W testach funkcjonalnych badano udział integryny .5ß1 oraz kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc oraz .2-8Sia testem (i) gojenia ran komórek po fibronektynie, (ii) podczas adhezji komórek do fibronektyny oraz (iii) inwazji przez Matrigel komórek linii WM115 oraz WM266-4. Otrzymane wyniki wykazały, że obecność integryny .5ß1 zwiększa tempo migracji tylko przez komórki pierwotnej linii czerniaka WM115. Kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc zwiększają tempo migracji komórek czerniaka skóry metastatycznej linii WM266-4. Komórki linii WM266-4 wykazują większą adhezję do fibronektyny niż komórki pierwotnej linii WM115. Integryna .5ß1 zwiększa adhezję komórek obu linii fibronektyny, jednocześnie ekspresja SA.2-3Gal oraz SA.2-6Gal/GalNAc jest niezbędna podczas adhezji komórek czerniaka linii WM266-4 do fibronektyny. Wyniki badania dotyczących inwazji wykazują, że komórki linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 wykazują podobną zdolność do inwazji przez Matrigel. Integryna .5ß1 zwiększa inwazję komórek obu badanych linii, jednocześnie podczas transformacji nowotworowej prawdopodobnie dochodzi do zmiany funkcji kwasów sjalowych. Badania wskazują, że kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal sprzyjają inwazji komórek pierwotnej linii WM115, natomiast ich ekspresja nie wpływa na inwazję komórek linii WM266-4. Dodatkowo obecność kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc utrudnia inwazję tych komórek przez Matrigel. Słowa kluczowe: czerniak skóry, integryna .5ß1, glikozylacja, sjalilotransferazy, adhezja komórek, migracja komórek, inwazja komórek. Summary Summary During the development of cancer, cells acquire the capacity for migration, adhesion, and forming of new metastasis in distant tissues. Malignant transformation is a complex process, which involves changes in genotype and phenotype of transformed cells. On the surface of tumor cells appears a singular set of adhesion molecules, like integrin .5ß1, responsible for maintaining the consistency of the tissue and proper communication between cancer cells and extracellular matrix. Sialic acids are most commonly added to N-linked glycans in an a2-3, a2-6 or a2-8 linkages and altered profile of cell surface sialylation is a well-accepted hallmark of malignant transformation. The interaction of cells expressing integrin .5ß1 and fibronectin results cancer cell adhesion, migration, and invasion. Presence of sialic acids may modify these interactions. The aim of this study was to determine the impact of sialic acids on interactions between primary WM115 and metastatic WM266-4 melanoma cell lines and fibronectin. The aim of the present study was to analyze gene expression for five sialyltransferases witch added sialic acids to the terminal positions of N-glycans, using RT-PCR method. The results confirmed that expression of sialyltransferase genes are changing during cancer transformation. Upregulation of SIAT1 gene, downregulation of SIAT4c gene in WM266-4 metastatic cell line were observed. In addition lack of transcript for the STX was observed, which may be the determinant of metastatic melanoma cells. Subsequently, the presence of the integrin .5ß1 has been studied using immunodetection. The integrin subunit sialylation was investigated using enzymes digestion as well as lectin precipitation. The results revealed the presence of integrin .5ß1 in cancer cell lysats of both melanoma cell lines. Studies have also shown an increase .26Gal/ GalNAc sialic acids and decrease of .2-3Gal sialic acids linked to .5 integrin subunit. The impact of sialic acid .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc and .2-8Sia linked to purified .5ß1 integrin receptor on protein adhesion to fibronectin was investigated using specific sialidases. The results have shown that sialic acid .2-3Gal have decreased integrin adhesion to fibronectin in WM115 cell line. Sialic acids linked to .5ß1 isolated from WM266-4 cell line had no effect on adhesion to fibronectin. Summary Densytometric analysis of gelatin zymography showed increase expression of Pro-MMP-2 and de novo synthesis of MMP-9 by WM266-4 cell line. Expression of Pro-MMP2 and MMP-9 were associated with melanoma progression. Finally the impact of .5ß1 integrin and sialic acids .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc and .2-8Sia linked to N-glycans was investigated during (i) wound healing on fibronectin, (ii) adhesion to fibronectin, and (iii) cell invasion by Matrigel in WM115 and WM266-4 cell lines. The results revealed that the presence of .5ß1 integrin increased wound healing of WM115 cell line, but sialic acids linked to N-glycans had similar effect on WM266-4 cell lines. The WM266-4 cells also showed increased adhesion to fibronectin in comparison with primary WM115 cell line. Increased cell adhesion to fibronectin is probably associated with cutaneous melanoma transformation. Integrin .5ß1 was also associated with increased cell adhesion in primary and metastatic cell lines. Sialic acids .2-3Gal and .2-6Gal/GalNAc expression were necessary during WM266-4 adhesion to fibronectin. Study of cell invasion indicated that primary and metastatic WM115 WM266-4 cell lines exhibited similar invasive ability threw Matrigel. Expression of .5ß1 integrin enhanced cell invasion in both tested cell lines. Moreover, presumably there is a change in the function of sialic acids during cell invasion. Sialic acids .2-3Gal promoted cell invasion of primary cell line WM115 but did not affect invasion of the in melanoma cell line WM266-4 through Matrigel. In addition sialic acids .2-6Gal/GalNAc reduced invasion of WM266-4 cells through Matrigel. Keywords: cutaneous melanoma; .5ß1 integrin, glycosylation, sialyltransferases, adhesion, migration, invasion Wstęp II. WSTĘP II.1. Czerniak skóry Czerniak skóry (Cutaneous Melanoma) jest jednym z najbardziej niebezpiecznych nowotworów złośliwych. Co roku zapadalność na tę chorobę wzrasta szczególnie u ludzi młodych, obecnie jest on przyczyną około 70% zgonów mimo, że stanowi jedynie 4% przypadków raka skóry (Purdue MP i współ., 2008; Kochhar R i współ., 2009). Pacjenci w III stadium choroby z przerzutami do węzłów chłonnych albo do skóry po wycięciu nowotworu mają jedynie 50% szans na wyleczenie. Osobom w IV stadium choroby często zostaje mniej niż jeden rok życia, a większość z nich umiera. Dotychczasowa terapia nowotworów opierająca się na wycięciu guza, chemioterapii i radioterapii wykazuje małą skuteczność leczenia pacjentów w III i IV stadium choroby (Sladden MJ i współ., 2009). Czerniak skóry to nowotwór wywodzący się z melanocytów. Melanocyty a właściwie melanoblasty powstają w drugim miesiącu życia embrionalnego z grzebienia nerwowego. Podczas kolejnych etapów rozwoju zarodkowego melanoblasty migrują do miejsc docelowych, takich jak: naskórek, skóra czy oko (tęczówka, ciało rzęskowe, naczyniówka), gdzie różnicują się w melanocyty. Melanocyty występujące w skórze zamierają jeszcze przed urodzeniem. Komórki barwnikowe mieszczące się w naskórku rozpoczynają podziały i zaczynają syntetyzować melaninę. Produkcja melaniny zachodzi w połączonych z błoną komórkową organellach zwanych melanosomami. Melanosomy, poprzez długie wypustki melanocytów, są transportowane do otaczających je keratynocytów, gdzie pełnią funkcję fotoprotektora. Każdy melanocyt kontaktuje się z około 40 keratynocytami tworząc tzw. „epidermal melanin unit” (Costin G. E., Hearing V. J., 2007). Dodatkowo kontakt ten zapobiega transformacji nowotworowej melanocytów, aczkolwiek mechanizm nie jest dokładnie poznany (Li G, Herlyn M, 2000, Haass NK i współ., 2005). Czerniak złośliwy może powstać z (i) prawidłowych melanocytów, (ii) zmian skórnych, takich jak nietypowe dysplastyczne znamiona, czy (iii) odziedziczone znamiona. Jest wiele czynników sprzyjających rozwojowi tej choroby: a) Jasna karnacja skóry (skłonność do piegów i oparzeń słonecznych); b) Sporadyczne opalanie się; Wstęp c) Oparzenia słoneczne w dzieciństwie; d) Szerokość geograficzna (intensywność nasłonecznienia); e) Uwarunkowania genetyczne (mutacje w genach, np. rodzinny zespół zmian dyspla stycznych); f) Immunosupresja (upośledzenie odpowiedzi układu immunologicznego obserwowana podczas immunoterapii, lub występujące w trakcie chorób, takich jak AIDS); g) Znamiona (czynnik stosunkowo mało istotny, ponieważ złośliwe nowotwory często powstają de novo) (Herlyn M., 1990; Chudnovsky Y, i współ., 2005). Czerniak skóry wcześnie wykryty jest w pełni uleczalny. Niestety trudno jest zdiagnozować czerniaka, ponieważ komórki nowotworowe często charakteryzują się bardzo zróżnicowaną morfologią. Trudny do przewidzenia jest zarówno przebieg choroby jak i prognostyka. Czerniak może występować w skórze, śluzówce gardła, naczyniówce oka, oponach mózgowych jak i oskrzelach. Nieleczony, często daje przerzuty do mózgu, płuc, węzłów chłonnych, wątroby czy kości (Damsky WE i współ, 2011; Kupas W i współ., 2011). Podczas rozwoju choroby można wyróżnić kilka postaci klinicznych czerniaka, najczęściej występuje postać powierzchowna (typ powierzchowny – SSM ang. superficial spreadnig melanoma). Czerniak skóry może powstać w miejscu, w którym nie występuje widoczna zmiana lub ze znamienia (około 20 – 30% tych nowotworów powstaje ze znamion). Jednocześnie od 4 do 12% przypadków czerniaka nie można zidentyfikować miejsca powstania nowotworu (rycina 1) (Damsky WE i współ., 2011). Na postawie badań klinicznych i patologicznych podczas rozwoju czerniaka można wyróżnić pięć etapów: a) Znamię (nevus) – zbudowane z prawidłowych melanocytów, nie wykazujących zmian cytogenetycznych; b) Znamię dysplastyczne – występują zmiany strukturalne i genetyczne; c) Radialna faza wzrostu (RGP) – występuje w nowotworze pierwotnym, charaktery zuje ją wzrost horyzontalny, komórki wykazują zdolność do inwazji otaczających guz komórek epidermy, jednocześnie nie są zdolne do tworzenia przerzutów; d) Wertykalna faza wzrostu (VGP) – subpopulacja komórek wywodząca się z fazy RGP, która charakteryzuje się szybkim wzrostem, zdolnością do trawienia błony podstawnej, naciekaniem do głębszych warstw tkanki oraz możliwością tworzenia przerzutów; Wstęp e) Faza metastatyczna – komórki nowotworowe migrują z guza pierwotnego, są zdolne do inwazji i kolonizacji odległych tkanek oraz do tworzenie przerzutów (Herlyn M., 1990). Rycina 1. Etapy rozwoju czerniaka skóry, wg Damsky WE i współ., (2011) – zmienione. Przedstawiony model jest jedynie uproszczonym opisem faz rozwoju czerniaka skóry, nie w każdym przypadku można jednoznacznie określić fazę wzrostu guza. Jednocześnie komórki z wcześniejszej fazy wzrostu mogą szybciej nabywać zdolności do tworzenia przerzutów. Podczas transformacji nowotworowej w komórkach dochodzi do akumulacji zmian genetycznych spowodowanych nagromadzeniem mutacji oraz wpływem otaczającego guz środowiska (Damsky WE i współ., 2011). Dodatkowo ekspresja wielu receptorów błonowych, które uczestniczą podczas komunikacji komórka – komórka oraz komórka – składniki macierzy zewnątrzkomórkowej jest związana z rozwojem czerniaka. Są to białka z rodziny immunoglobulin, takie jak Mel-CAM (melanocytic cell adhesion molecule) oraz ICAM-1 (intracellular cell adhesion molekule-1), kadheryny: E- kadheryna i N-kadheryna oraz integryny (Li G, Herlyn M, 2000). Wstęp II.2. Glikozylacja Glikoproteiny to molekuły składające się z łańcucha polipeptydowego oraz dołączonych do niego struktur cukrowych. Proces przyłączania glikanów w odpowiednie miejsca w łańcuchu polipeptydowym nosi nazwę glikozylacji. Glikozylację można podzielić na dwa rodzaje – O-glikozylację oraz N-glikozylację. Synteza O-glikoprotein to proces potranslacyjny, zachodzący w aparacie Golgiego (GA). Podczas O-glikozylacji glikany przyłączone są do białek wiązaniem O-glikozydowym - przez węgiel -1 N-acetylogalaktozoaminy (GalNAc) do grupy hydroksylowej bocznego łańcucha treoniny (Thr) lub seryny (Ser). O-glikany są z reguły nierozgałęzione i nie posiadają jednej, wspólnej struktury korowej (Patsos G i współ., 2005; Wopereis S i współ., 2006). N-glikozylacja to kotranslacyjna modyfikacja białek, w którą zaangażowane są dwie organelle komórkowe: szorstka siateczka śródplazmatyczna (RER) oraz aparat Golgiego (Gorelik E., i współ., 2001). Wszystkie glikoproteiny błonowe są syntetyzowane przez rybosomy związane z szorstką siateczką śródplazmatyczną, następnie zostają włączone do błony RER poprzez kanał wiążący białka (ang. translocon). N-glikany są dołączane do białka podczas procesów przeniesienia oraz wydłużania łańcucha polipeptydowego. Nośnikiem N-glikanów „prekursorowych” składających się z czternastu reszt cukrowych jest hydrofobowy alkohol fosforan dolicholu. Na fosforanie dolicholu tworzy się, drogą kolejnego dodawania monosacharydów, jednostka oligosacharydowa złożona z dwóch N-acetyloglukozoamin (GlcNAc), dziewięciu mannoz (Man) i trzech glukoz (Glc) [GlcNAc2Man9Glc3], która zostaje przyłączona do jego fosforanowej grupy. „Prekursorowe” N-glikany zostają przeniesione z fosforanu dolicholu w miejsce potencjalnej N-glikozylacji rosnącego łańcucha polipeptydowego (Stryer L, 2000). Miejsca potencjalnej N-glikozylacji tworzy Asparagina (Asn) występująca w specyficznej sekwencji (Asn-X-Ser/Thr), gdzie X może być dowolnym aminokwasem oprócz proliny. W procesie N-glikozylacji reszty cukrowe łączą się poprzez amidowy azot łańcucha bocznego asparaginy wiązaniem N-glikozydowym. Trzy reszty glukozy oraz jedna reszta mannozy są odcinane przez glukozydazy I i II oraz .- mannozydazę-I występujące w RER. N-glikoproteiny posiadające jedną resztę glukozy są wiązane przez kalneksynę lub kalretikulinę. Obie lektyny są związane z ERp57 (białko o aktywności izomerazy tiolowej 57), które odpowiada za utworzenie mostków dwusiarczkowych miedzy cyste Wstęp inami, co wpływa na fałdowanie się glikoproteiny. Odcięcie ostatniej reszty glukozy przez glukozydazę II świadczy o poprawnym sfałdowaniu się N-glikoproteiny i stanowi sygnał do wysłania jej z RER do aparatu Golgiego (Jones J i współ., 2005; Vagin O, 2008). Niektóre N-glikoproteiny występujące w błonie komórkowej, wędrują przez cysterny aparatu Golgiego bez dalszej przebudowy. Podczas tego procesu tworzą się Nglikany typu wielomannozowego. N-glikany typu wielomannozowego są najstarsze ewolucyjnie, między sobą mogą się różnić liczbą reszt mannozy w łańcuchu zewnętrznym (rycina 2a). Jednakże struktura większości N-glikanów podlega dalszej przebudowie w GA. Po usunięciu trzech reszt mannozy z N-glikanów przez mannozydazę I, wiele glikozylotransferaz może katalizować przebudowę powstałych N-glikanów. Podczas tych procesów powstają N-glikany typu hybrydowego lub N-glikany typu kompleksowego (rycina 2b i 2c). Proces przebudowy N-glikanów rozpoczyna dodanie N-acetyloglukozoaminy (GlcNAc) przez jedną z N-acetyloglukozoaminylotransferaz (GnTs) występujących w przedziale cis-aparatu Golgiego oraz środkowej aparatu Golgiego. GnT-I inicjuje forowanie N-glikanów typu hybrydowego poprzez wiązanie GlcNAc do reszty mannozy wiązanej .1-3 do struktury korowej z utworzeniem wiązania ß1-2. Następnie w przedziałach środkowych GA usuwane są dwie kolejne reszty mannozy wiązane do mannozy ramienia .1-6 sekwencji korowej. W następnej kolejności działa N-acetyloglukozoaminylotransferaza II (GnT-II), która katalizuje dodanie dwóch reszt GlcNAc w miejsce usuniętych uprzednio dwóch reszt mannozy, co daje początek tworzeniu N-glikanów typu kompleksowego. N-glikany typu kompleksowego nie posiadają innych reszt mannozylowych od tych, które występują w strukturze korowej. Ich zewnętrzne łańcuchy (anteny), z ß-N- acetyloglukozoaminą na redukującym końcu, mogą być przyłączone do dwóch reszt .- mannozylowych struktury korowej w ośmiu teoretycznych miejscach wiązania (są to atomy C2, C3, C4, C6, obu .-Mannoz struktury korowej). Liczba anten N-glikanów typu kompleksowego u ssaków waha się od dwóch do czterech (Chen HL i współ., 2009). Działania GnT –III, –IV, –V oraz –VI wpływają na różnorodność N-glikanów. Modyfikacje wprowadzone przez GnT –IV, –V i –VI prowadzą do zwiększenie liczby anten występujących na N-glikanach typu kompleksowego. Działanie GnT –III hamuje syntezę anten poprzez dodanie reszty GlcNAc przedzielającej do N-glikanów typu hybrydowego lub kompleksowego do reszty mannozylowej z utworzeniem wiązania ß1-4. Wstęp Wiele z pozostałych glikozylotransferaz występujących w części trans-GA odpowiedzialnych za wydłużanie anten współzawodniczy ze sobą o substrat. Rycina 2. Trzy typy N- glikanów. Anteny występujące na „dojrzałych” N-glikanach mogą różnić się długością oraz składem. Do najczęstszych modyfikacji należy dodawanie reszty galaktozy (Gal), kwasów Wstęp sjalowych (SA) oraz fukozy (Fuc), które są przenoszone przez specyficzne galaktozylotransferazy, sjalilotransferazy oraz fukozylotransferazy. Jednocześnie każda antena może być wydłużana na przykład poprzez dodanie wielu kwasów sjalowych (Gorelik E i współ., 2001; Butler M, 2006; Vagin O i współ., 2008). Z konkretnym miejscem potencjalnej glikozylacji w łańcuchu polipeptydowym może związać się jeden z trzech typów N-glikanów. W dodatku N-glikany typu hybrydowego i kompleksowego mogą zawierać inne modyfikacje, takie jak fukozę korową, czy terminalne kwasy sjalowe. Zjawisko to nosi nazwę mikroheterogenności N-glikanów. W pierwszorzędowej strukturze większości N-glikoprotein można wyróżnić wiele miejsc potencjalnej glikozylacji, co nie oznacza, że wszystkie będą glikozylowane. Zjawisko to nosi nazwę makroheterogenności N-glikanów (Butler M, 2006). Na różnorodność N-glikanów wpływa również (i) tkankowo specyficzna regulacja ekspresji genów dla glikozylotransferaz, (ii) dostępność nukleotydowych pochodnych monosacharydów oraz (iii) współzawodnictwo między enzymami o wspólny akceptor podczas ich syntezy (Dennis JW i współ., 1999). Po raz pierwszy zmiany glikozylacji zaobserwowali Hirsfeld oraz Thomsen, którzy wykazali, że przebudowa glikanów towarzyszy takim procesom jak embriogeneza, rozwój oraz różnicowanie się komórek (Dabelsteen E, 1996). Prawdopodobnie jest to spowodowane przez fakt, że glikany stanowią dobry materiał do „kumulowania” informacji, głównie ze względu na swoją budowę chemiczną. Ze stosunkowo niewielkiej liczby występujących monosacharydów można uzyskać potencjalnie nieskończenie wiele unikalnych struktur cukrowych. Cząsteczka heksozy posiada pięć potencjalnych miejsc wiązania, jednocześnie może ona występować w formie anomerów . lub ß co również zwiększa różnorodność tworzonych oligosacharydów. Porównując budowę kwasów nukleinowych czy białek, to trzy nukleotydy lub aminokwasy mogą utworzyć sześć możliwych sekwencji, w porównaniu trzy monosacharydy teoretycznie mogą utworzyć aż 1056 trisacharydów. Wprowadzenie kolejnych modyfikacji, takich jak metylacja czy acetylacja dodatkowo zwiększa różnorodność tworzonych glikanów (Varki A i współ., 2009). Doniesienia Hirsfelda oraz Thomsena zapoczątkowały ciąg intensywnych badań polegających na określeniu roli glikozylacji białek. Badania wykazały, że poprawna glikozylacja jest może odgrywać istotne role trzech poziomach organizacji: molekularnym, komórkowym oraz na poziomie organizmu. Na początkowych etapach syntezy N-glikany stanowią kontrolę poprawności fałdowania się glikoprotein syntetyzowanych w RER. Obecność reszty lub reszt glukozy wiązanej do struktury cukrowej jest znacz Wstęp nikiem nieprawidłowo lub niekompletnie sfałdowanych glikoprotein. Takie N-glikoproteiny ponownie wiążą się do kalneksyny lub kalretikuliny w celu powtórnego fałdowania. Proces dodawania i odłączania glukozy może zachodzić wielokrotnie. W przypadku, gdy N-glikoproteina nie uzyska prawidłowej struktury zostaje rozpoznana przez lektynę EDEM (białko wiążące Man8GlcNAc2 izomer B), następnie przetransportowana do cytoplazmy i zdegradowana w proteasomach. Mechanizm transportu nieprawidłowo sfałdowanych N-glikoprotein z RER do cytoplazmy odbywa się szlakiem ERAD (degradacja białek związana z ER) (Oda Y i współ., 2003). Pojedyncze reszty monosacharydowe budujące „dojrzałe” N-glikany mogą wpływać na właściwości N-glikoprotein, takie jak czas półtrwania w organizmie czy immunogenność, co jest wykorzystywano podczas produkcji leków. Obecność terminalnie zlokalizowanych kwasów sjalowych wydłuża czas półtrwania danej N-glikoproteiny w organizmie. Te właściwości kwasów sjalowych wykorzystuje się w celu wydłużenia ich czasu działania (np. w syntezie rekombinowanej erytropoetyny podczas leczenia niedokrwistości) (Jeong YT i współ., 2009). W celu dostarczenia leku do odpowiednich obszarów w organizmie do leków dołączane są wielomannozowe lub hybrydowe N-glikany. Tak zmodyfikowane molekuły są rozpoznane przez makrofagi dzięki receptorom mannozy występującym na ich powierzchni komórkowej. Tę własność wykorzystuje się podczas produkcji cerezytu, rekombinowanego leku stosowanego w leczeniu choroby Gauchera. W porównaniu leki nieposiadające tej modyfikacji są szybko usuwane z organizmu przez hepatocyty (Hossler P i współ., 2009). Glikozylacja odgrywa także role podczas oddziaływań komórka – komórka zależnych od receptorów adhezyjnych. Przykładem może być neuronalna cząsteczka adhezyjna (N-CAM), która jest najlepiej opisanym nośnikiem kwasów polisjalowych. W okresie embriogenezy terminalnie zlokalizowane kwasy polisjalowe wiązane do N-glikanów N-CAM mogą być zbudowane kilkudziesięciu reszt kwasów sjalowych, co zapobiega oddziaływaniom miedzy N-CAM ułatwiając migracje komórek. W późniejszym okresie rozwoju ich liczba zmniejsza się ułatwiając homotypowe oddziaływania miedzy cząsteczkami N-CAM, zwiększając adhezję a zmniejszając tempo migracji komórek (Suzuki M i współ., 2005). Glikozylacja może również wpływać na interakcje między komórkami a składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Zmiany glikozylacji białek powierzchniowych często występują podczas transformacji nowotworowej. Jedną z nich jest odmienna sjalilacja białek. Jedną z najlepiej opisywanych jest nadekspresja genu SIAT1 kodującego sjalilotransferazę ST6Gal-I. Powyższa sjalilo Wstęp transferaza przenosi reszty kwasów sjalowych na N-glikany tworząc połączenia SA.26Gal, nadekspresja tych kwasów sjalowych w komórkach nowotworowych ułatwia ich migrację a w konsekwencji tworzenie przerzutów, co będzie szerzej opisane w dalszych rozdziałach (Gorelik E i współ., 2001; Wang PH i współ., 2003; Bellis SL, 2004; Jones J i współ., 2005; Laidler P i współ., 2006; Wang PH, 2006). Poprawna glikozylacja jest niezbędna również do prawidłowego funkcjonowania organizmu. N-glikany mogą kontrolować transport niektórych białek do odpowiednich obszarów komórki. Mukolipidoza typu II, zwana również chorobą wtrętów komórkowych (ang. I - cell disease) to schorzenie z kręgu chorób spichrzeniowych. Istotą choroby jest brak aktywności N - acetyloglukozamino - 1 - fosfotransferazy, która odpowiada za fosforylację reszt mannozowych - grup składowych enzymów lizosomalnych. Grupy mannozowe są specyficznym markerem rozpoznawczym dla receptorów błon lizosomalnych i są niezbędne do sprawnego przenikania enzymów lizosomalnych z RER do wnętrza lizosomów. Skutkiem tego enzymy są wydzielane do przestrzeni pozakomórkowej, co prowadzi do gromadzenia zbędnego materiału w tych organellach. Mukolipidoza typu II to nieuleczalna choroba genetyczna, którą dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny. Chorzy umierają zazwyczaj w pierwszej dekadzie życia ze względu na liczne nieprawidłowości w rozwoju (Leroy J, 2006). II.3. Biosynteza oraz funkcje kwasów sjalowych Kwasy sjalowe (SA, Sia, NeuNAc) to monosacharydy zbudowane z dziewięciu atomów węgla, występujące w pozycji terminalnej glikanów glikoprotein bądź glikolipidów (rycina 3). W fizjologicznym pH grupa karboksylowa przy węglu . ulega jonizacji, w wyniku czego cząsteczka kwasu sjalowego nabiera ładunku ujemnego (Varki A, 1997). Biosynteza kwasów sjalowych jest procesem złożonym. Kwas sjalowy (Neu) jest syntetyzowany z de-N-acetylowanych produktów kwasu N-acetyloneuraminowego (Neu5Ac). Synteza Neu5Ac zachodzi w cytoplazmie poprzez kondensację fosfoenolopirogronianu z N-acetylomannozoamino-6-fosforanen do fosforanu kwasu Wstęp N-acetyloneuraminowego (Neu5Ac9P). W jądrze komórkowym wolne monosacharydy po defosforylacji są aktywowane do cytydynomonofosforanu kwasu Nacetyloneuraminowego (CMP-Neu5Ac). CMP-Neu5Ac jest transportowany do części trans aparatu Golgiego, w której sjalilotransferazy przenoszą reszty Nau5Ac na glikany wiązane do glikoprotein lub glikolipidów (Schwarzkopf M i współ., 2002; Schauer R, 2004). Rycina 3. Budowa cząsteczki kwasu sjalowego (wg. Varki A, 1997) Na różnorodność kwasów sjalowych wpływa (i) sposób ich wiązania do glikanu (R3) przez węgiel C2; (ii) modyfikacje naturalnie występujące w komórkach przy atomach: C4, C5, C7, C8 i C9, takie jak: R1- acetylowa, laktylowa, metylowa; R2- N- acetylowa, N- glikolilowa czy hydroksylowa . Rozkład sjalilowanych glikokoniugatów najczęściej rozpoczyna się od hydrolizy kwasów sjalowych przez zewnątrzkomórkowe lub wewnątrzkomórkowe sjalidazy. Niektóre glikokoniugaty są dostarczane do lizosomów, w których kwasy sjalowe są usuwane przez lizosomowe sjalidazy. Wolne kwasy sjalowe przechodzą do cytoplazmy, w której mogą ponownie zostać aktywowane i dodane do glikanów lub zostają degra Wstęp dowane przez cytoplazmatyczną aldolazę do pirogronianu i acylowanej mannozaminy (Schauer R, 2004). Kwasy sjalowe w fizjologicznym pH mają ładunek ujemny, są terminalnie zlokalizowane w glikanach wiązanych do glikokoniugatów błonowych. Ich ładunek oraz lokalizacja sprawiają, że mogą łatwo wchodzić w interakcje z cząsteczkami występującymi na innych komórkach lub w macierzy zewnątrzkomórkowej. Obecność kwasów sjalowych może zarówno ułatwiać jak i zapobiegać oddziaływaniu między molekułami. Kwasy sjalowe, zwarzywszy na ich ujemny ładunek, mogą również uczestniczyć w transporcie dodatnio naładowanych cząsteczek (np. leków) do komórek. Ich obecność wpływa na rozpoznawanie i wiązanie drobnoustrojów z powierzchnią komórek, takich jak: wirusy, bakterie czy pierwotniaki. Wirus ptasiej grypy H5N1 rozpoznaje i preferencyjnie wiąże się z kwasami sjalowymi wiązanymi .2-3Gal. U człowieka na powierzchni komórek nabłonka górnych dróg oddechowych dominują kwasy sjalowe wiązane .2-6Gal, dlatego też człowiek jest częściowo chroniony przed infekcją tego wirusa. Kwasy sjalowe wchodzą w skład ligandów dla selektyn, rodziny receptorów występujących na powierzchni leukocytów, płytek krwi oraz komórek śródbłonka. Selektyny rozpoznają kwasy sjalowe występujące w strukturach typu Lewis (Sia-Lex). Wiązanie się selektyn z Sia-Lex zachodzi podczas pierwszych etapów adhezji leukocytów do komórek śródbłonka, miedzy innymi podczas ich migracji do miejsca zranienia (Varki A, 2007). Siglec (ang. Sia-binding IgG superfamily lectins) występują na powierzchni komórek układu odpornościowego odpowiedzialnych za wrodzoną i nabytą odporność. Lektyny te różnią się specyfiką rozpoznawania różnych kwasów sjalowych oraz typem wiązań (Varki A i Angata T, 2006). Nadekspresja kwasów sjalowych często wiąże się z transformacją nowotworową. Zwiększona ilość kwasów sjalowych wiązanych .23Gal, .2-6Gal czy .2-8Sia wpływa na adhezję, migrację czy inwazję komórek wielu typów nowotworów (Ellies LG i współ., 2002; Seales EC i współ., 2003; Bellis SL, 2004; Mendiratta SS i współ., 2005). Kwasy sjalowe mogą również maskować miejsca receptorowe rozpoznawane przez makrofagi i komórki układu immunologicznego. Ujemny ładunek kwasów sjalowych może zapobiegać rozpoznawaniu sjalilowanych glikoprotein przez endoglikozydazy. Jak wykazały badania prowadzone na erytrocytach, powierzchnia „młodych” komórek jest bogata w reszty kwasów sjalowych. W miarę upływu czasu ich ilość zmniejsza się, czego konsekwencją jest usunięcie takich komórek z krwioobiegu. Powyższe obserwacje potwierdziły wyniki desjalilacji. Usunięcie kwasów sjalowych po Wstęp woduje odsłonięcie reszt galaktozy, które są rozpoznawane i wiązane przez makrofagi, co w konsekwencji prowadzi do eliminacji erytrocytów z krwi na drodze fagocytozy. Nie powinien dziwić wiec fakt, że w komórkach nowotworowych często może dochodzić do nadekspresji kwasów sjalowych, która prawdopodobnie ułatwia tym komórkom ucieczkę przed humoralną i komórkową odpowiedzią układu immunologicznego (Schauer R, 2004). II.4. Budowa i funkcje sjalilotransferaz Sjalilotransferazy (STs) to transbłonowe enzymy typu II występujące w części trans aparatu Golgiego. Zbudowane są z krótkiej N- terminalnej domeny zwróconej do cytoplazmy, domeny transbłonowej, rdzenia, w którym liczba aminokwasów waha się od 20 do 200 oraz dużej domeny katalitycznej zwróconej do światła aparatu Golgiego. Sjalilotransferazy to enzymy odpowiedzialne za wiązanie kwasów sjalowych do glikanów w pozycji terminalnej. Wszystkie enzymy korzystają z tego samego aktywowanego donora cukrowego, którym jest CMP-Neu5Ac, natomiast różnią się specyfiką substratową (Harduin-Lepers A i współ., 2005; Wang PH, 2005; Herudin-Lepers, 2010). W genomie człowieka i myszy do tej pory zidentyfikowano 20 różnych genów dla sjalilotransferaz. Mimo niskiego podobieństwa sekwencji (15% - 57%), w budowie molekularnej tych enzymów zawsze występują cztery konserwatywne domeny zwane sjalilmotywami (ang. sialylmotifs): 1. L (ang. large) duży; 2. S (ang. small) mały; 3. Motyw III; 4. Motyw VS (ang. very small) bardzo mały (rycina 4). Sialilmotywy występujące w domenie katalitycznej, uczestniczą między innymi w procesach rozpoznawania donora i akceptora oraz zapewniają enzymom zdolności katalityczne. Na podstawie ich obecności dokonuje się identyfikacji eukariotycznych genów dla sjalilotransferaz (Harduin-Leppers A i współ., 2001; Harduin- Leppers A i współ., 2005; Harduin-Leppers A, 2010). Wstęp Rycina 4. Schemat budowy sjalilotransferazy: a. konformacja natywna enzymu; b. budowa enzymu. Kolorem szarym zaznaczono występowanie sjalilmotywów: 1-dyży (L); 2-mały (S); 3-motyw III (III); 4-bardzo mały (VS), wg. Kitazume S i współ., (2001) oraz Jeanneau C i współ., (2004) – zmienione. Sjalilotrasferazy ze względu na rodzaj tworzonego wiązania zostały podzielone na cztery rodziny: (i) SA.2-3Gal, (ii) SA.2-6Gal, (iii) SA.2-6GalNAc oraz (iiii) SA.28SA (rycina 5). 1. Rodzina ST6Gal – są to enzymy tworzące wiązanie SA.2-6Gal; są najstarsze ewolucyjnie, prawdopodobnie powstały 830 milionów lat temu. W skład rodziny ST6Gal wchodzą dwie sjalilotransferazy: ST6Gal-I oraz ST6Gal-II specyficznie rozpoznające akceptor Galß1-4GlcNAc-R występujący na N-glikanach ([A] Taniguchi S, 2002). Mimo, że te dwa enzymy wykazują 48,9% podobieństwa w sekwencji aminokwasów, substratami dla ST6Gal-II są krótkie oligosacharydy w odróżnieniu do ST6Gal-I, która jest zaangażowana w sjalilację bardziej rozbudowanych glikanów. Ponadto obecność ST6Gal-I w komórce prawdopodobnie sprzyja transformacji nowotworowej, gdyż jej ekspresja wzrasta w komórkach nowotworowych (Takashima S i współ., 2002). Wzrost ekspresji ST6Gal-I, a w konsekwencji ilości kwasów sja Wstęp lowych wiązanych SA.2-6Gal, wpływa na zmianę zdolności adhezyjnych i migracyjnych komórek ([A] Taniguchi N i współ., 2002; Seales EC i współ., 2005). Rycina 5. Cztery typy wiązania reszty kwasu sjalowego do glikanu, specyfika substratowa sjalilotransferaz, wg. Wang PH, (2005) - zmienione. Czerwonym prostokątem zaznaczono cząsteczkę kwasu sjalowego, kolorem czerwonym zaznaczono atomy węgla, które tworzą wiązanie. 2. Rodzina ST6GalNAc - enzymy te ewolucyjnie pojawiły się, jako drugie – ok. 700 milionów lat temu; katalizują przeniesienie reszty kwasu sjalowego z utworzeniem wiązania SA.2-6GalNAc na akceptor N-acetylogalaktozoaminę (GalNAc) występu28 Wstęp jącą na O-glikoproteinach (ST6GalNAc-I, -II, -IV) oraz na glikolipidach (ST6GalNAc III, V, VI). 3. Rodzina ST3Gal – sjalilotransferazy te pojawiły się około 500 milionów lat temu u strunowców, przenoszą reszty kwasów sjalowych na terminalną galaktozę z utworzeniem wiązania SA.2-3Gal na oligosacharydach glikoprotein oraz glikolipidów. ST3Gal-I oraz -II preferencyjnie sjalilują struktury Galß1-3GalNAc-R (sekwencja I), natomiast ST3Gal-III, -IV, -V oraz -VI preferencyjnie sjalilują struktury Galß13/ 4GlcNAc-R (sekwencja II). ST3Gal-III oraz ST3Gal-IV to sjalilotransferazy przyłączające reszty kwasów sjalowych w terminalną pozycję N-glikanów; mimo, że ST3Gal-III preferuje typ I sekwencji a ST3Gal-IV typ II sekwencji, to ich powinowactwo substratowe częściowo pokrywa się ([B] Taniguchi N i współ., 2002). 4. Rodzina ST8SA – enzymy te wyewoluowały jako ostatnie, powstały około 430 milionów lat temu. Sjalilotransferazy należące do tej rodziny katalizują transfer reszty kwasów sjalowych na terminalnie zlokalizowaną resztę kwasu sjalowego z utworzeniem wiązania SA.2-8SA na glikoproteinach oraz glikolipidach. ST8SA-I, -III i -IV zaangażowane są w tworzenie liniowych struktur zbudowanych z pojedynczych reszt kwasów sjalowych tzw. struktur polisjalowych (PSA) występujących głównie na glikoproteinach, natomiast ST8SA-I, -V oraz -VI zaangażowane są głównie w sjalilację gangliozydów (Herudin-Lepper A i współ.,2005). ST8SA-II oraz ST8SA-IV uczestniczą podczas syntezy struktur polisjalowych N-glikanów, jako ich substrat mogą służyć N-glikany występujące na N-CAM, które są zakończone kwasem sjalowym wiązanym .2-3. Wiązanie kwasu sjalowego SA.2-8 do kwasu sjalowego SA.2-3 nazywa się reakcją inicjacji, natomiast dodawanie kolejnych kwasów sjalowych w pozycję .2-8 to etap elongacji. Tylko ST8SA-II oraz ST8SA-IV posiadają zdolność zarówno do inicjacji jak i elongacji w warunkach in vitro ([C] Taniguchi N i współ., 2002). Ekspresja STX ogranicza się do grasicy i serca, jednocześnie ekspresja PST występuje w komórkach śledziony, grasicy, leukocytów, jelita cienkiego, serca i łożyska (Cheung IY i współ., 2006). Poziom mRNA dla sjalilotransferaz ST8SA-II oraz ST8SA-IV koreluje z ilością kwasów polisjalowych na powierzchni komórek nowotworowych wywodzących się z grzebienia nerwowego, takich jak nerwiaka, wielkokomórkowego raka płuc, (Angata K, Fukuda M, 2003), drobnoko Wstęp mórkowego raka płuc (Krug LM i współ., 2004), czy guzy Wilmsa (Mahal LK i współ., 2001). II.5. Struktura i funkcje integryn Integryny stanowią najważniejszą grupę receptorów odpowiedzialnych za adhezję komórek do białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Integryny uczestniczą w przekazywaniu informacji miedzy cytoszkieletem a środowiskiem zewnętrznym poprzez aktywację wielu wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych (Hynes RO, 2002). Są to transbłonowe heterodimery, w których połączenie obu podjednostek determinuje specyfikę wiązania substratu (Seftor REB i współ., 1999; Hedlund M i współ., 2008). Ekspresja integryn zachodzi w komórkach organizmów wielokomórkowych, ale liczba tworzonych kompleksów jest bardzo zróżnicowana między gatunkami. U ssaków występuje 19 podjednostek . oraz 8 podjednostek ß, które mogą tworzyć 25 funkcjonalnych receptorów. Obie podjednostki integrynowe to białka typu I składające się z trzech domen: dużej domeny zewnątrzkomórkowej (około 700 – 1100 aminokwasów), domeny transbłonowej oraz krótkiej domeny cytoplazmatycznej (30 – 50 aminokwasów). Wyjątek od tej reguły stanowi podjednostka ß4, której domena cytoplazmatyczna składa się z około 1000 aminokwasów. Niektóre podjednostki . (.3, .5, .6, .7, .8, .v) są zbudowane z dwóch łańcuchów polipeptydowych połączonych mostkiem dwusiarczkowym. Obie podjednostki połączone są wiązaniem niekowalencyjnym. Ze względu na specyfikę substratową oraz kombinacje tworzenia dimeru różnych podjednostek integryny można podzielić na cztery podrodziny (rycina 6). 1. Podrodzina ß1 – do tej rodziny zalicza się najwięcej receptorów, podjednostka ß1 może tworzyć funkcjonalne heterodimery z 12 podjednostkami . (Humphies MJ, 2011) i dzięki temu uczestniczyć podczas adhezji komórek do różnych składników ECM, takich jak kolagen I i IV, lamininy, witronektyna oraz fibronektyna (Abraham S i współ., 2008). Wstęp Rycina 6. Rodziny receptorów integrynowych, wg Hynes RO, (2002) – zmienione. 2. Podrodzina ß2 i ß7 – receptory leukocytów, podrodzina integryn ß2 to grupa receptorów adhezyjnych, które uczestniczą podczas fizjologicznej oraz zapalnej odpowiedzi układu immunologicznego (Goodman T, i współ., 1998). Integryny z grupy ß7 odgrywają role podczas wczesnych etapów adhezji limfocytów do powierzchni komórek jelita oraz w adhezji tymocytów do komórek nabłonka grasicy (Waldman E i współ., 2006). 3. Podrodzina .v – ważna podczas organogenezy, odgrywa również istotne role podczas nowotworzenia. Podjednostka ta może tworzyć funkcjonalny receptor z jedną z czterech podjednostek ß (Hynes RO, 2002). Receptory tworzące tę rodzinę odgrywają znaczące role podczas angiogenezy (Kronenwett R i współ., 2002, Wiesner S i współ., 2005), czy migracji komórek (Kogelberg H i współ., 2010). 4. Podrodzina ß3 – integryna .IIbß3 jest receptorem płytek krwi i odgrywa rolę podczas krzepnięcia krwi. Jej ekspresja ułatwia również inwazję komórkom czerniaka (Wall CD i współ., 1997). Ekspresja integryny .vß3 jest charakterystyczna dla komórek czerniaka i jest jednym z markerów przejścia komórki z radialnej do wertykalnej fazy wzrostu (Li G, Herlyn M, 2000; Bachmann IM i współ., 2008). Wstęp Integryny uczestniczą w przekazywaniu sygnałów między komórkami a środowiskiem. Sygnały te mogą być przekazywane na dwa sposoby – z wewnątrz na zewnątrz komórki oraz z zewnątrz do wnętrza komórki. Podczas sygnalizacji z wewnątrz na zewnątrz komórki (ang. inside-out signaling) poprzez zmiany konformacji dochodzi do aktywacji receptorów integrynowych. Zmiany konformacji polegają na zwiększeniu powinowactwa, czego rezultatem jest wiązanie liganda. Sygnalizacja z zewnątrz do wnętrza komórki (ang. outside-in signaling) zachodzi podczas przekazywania sygnałów dotyczących proliferacji, polarności, wzrostu oraz migracji komórek. Natomiast sygnalizacja inside–out bezpośrednio uczestniczy w regulacji aktywności integryn. Badania sugerują, że niektóre integryny wykazują konstytutywną ekspresję w błonie komórkowej a jednocześnie nie są aktywne. Przykładem mogą być integryny z grupy ß2. Są one konstytutywnie obecne na powierzchni leukocytów, jednocześnie do ich aktywacji może dojść wyłącznie po odpowiedniej stymulacji. Stanowi to swego rodzaju zabezpieczenie przed utrzymującym się przewlekłym stanem zapalnym. Aktywacja tych integryn zachodzi poprzez sygnalizację inside-out, w której sygnał generowany jest przez cytoszkielet komórki a dokładnie poprzez domeny cytplazmatyczne obu podjednostek . i ß (Hynes RO, 2002; Humphries MJ, 2011). Prawdopodobnie prowadzi to do zmian konformacyjnych w domenach zewnątrzkomórkowych, które powodują zwiększenie powinowactwa receptora do liganda. Co ciekawe wykazano, że w komórkach czerniaka integryny z rodzin ß1, ß2, ß3 oraz ß7 mogą modyfikować powinowactwo wiązania się z ligandem w odpowiedzi na sygnały cytoplazmatyczne. Sygnalizacja outside-in natomiast określa zmiany w powinowactwie i sygnalizacji w odpowiedzi na sygnały generowane w ECM. O wiązaniu się integryn z ligandem decyduje struktura liganda jak również sposób jego prezentacji, co potwierdzają różnice w wiązaniu się integryn z ligandami komórek hodowanych w dwu lub trzy wymiarowych hodowlach. Badania wykazują, że wiązanie integryn z białkami ECM może zapobiegać wejściu komórek w apoptozę. Integryny uczestniczą w przekazywaniu informacji miedzy cytoszkieletem a środowiskiem zewnętrznym poprzez aktywację wielu wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych (Hynes RO, 2002). Powinowactwo receptora integrynowego do liganda jest warunkowane przez wiązanie obu podjednostek, za które odpowiadają ich N-terminalne regiony. Dodatkowo obie podjednostki . i ß połączone są ze sobą w sposób niekowalencyjny, co wyróżnia receptory integrynowe od innych receptorów błonowych. Niekowalencyjne wiązanie sprawia, że receptor wiąże ligand z niewielkim powinowactwem. Jednakże to niewielkie powinowactwo pozwala komórkom na szybkie Wstęp wiązanie i odłączanie od białek macierzy zewnątrzkomórkowej, co pozwala komórkom na ruch czy też inwazję (Hynes RO, 2002; Humphries MJ, 2011). Wiązanie się liganda z integryną zależy również od obecności jonów dwuwartościowych, z reguły jest stymulowane przez obecność jonów Mg2+ oraz Mn2+ a hamowane przez jony Ca2+ (Humphries MJ, 2011). Domena zewnątrzkomórkowa podjednostki integrynowej . zawiera siedem homologicznych powtórzeń, z których każde zbudowane jest z około 60 aminokwasów (rycina 7). Rycina 7. Schemat budowy receptora integrynowego z zaznaczeniem domen: (i) cytoplazmatycznej, (ii) transbłonowej oraz (iii) zewnątrzkomórkowej podjednostek integrynowych . oraz ß, wg Kuphal S i współ., (2005) – zmienione. W trzech – czterech z nich znajduje się miejsce potencjalnego wiązania jonów dwuwartościowych. Te domeny układają się w cykliczną strukturę, która nosi nazwę śmigła. Dziewięć podjednostek ., które występują u ssaków (.1, .2, .10, .11, .D, .E, .M, .X) Wstęp zawierają dodatkową domenę składającą się z około 200 aminokwasów, tzw. domena I/A (ang. insert domain), między drugim a trzecim powtórzeniem, która jest zaangażowana w formowanie miejsca wiążącego ligand. Dodatkowo występuje w niej motyw MIDAS (ang. metal ion dependent adhesion site), który również wchodzi w skład miejsca wiążącego ligand. Podjednostki integrynowe ., które nie zawierają domeny I/A są zdolne do wiązania się z ligandem poprzez interakcje z podjednostką ß. Podjednostki ß również zawierają konserwatywną domenę nazwaną I/A podobną oraz motyw MIDAS, które tworzą miejsce wiązania z ligandem (Honda S i współ., 2001; Kuphal S i współ., 2005). Ta domena wchodzi w interakcje z domeną śmigła podjednostki ., co tworzy miejsce wiążące ligand. C – końcowa domena podjednostki ß zawiera powtórzenia EGF, które oddziałują z licznymi białkami wewnątrzkomórkowymi. Domena cytoplazmatyczna podjednostek . i ß wiąże białka ECM z cytoszkieletem aktynowym, pośredniczy w przekazywaniu sygnałów przez skupianie wielu białek adaptorowych inicjujących wewnątrzkomórkową aktywację szlaków sygnalizacyjnych. Podjednostka cytoplazmatyczna determinuje również lokalizację integryn w ogniskach przylegania (Kuphal S i współ., 2005). Integryny mogą rozpoznawać wiele ligandów jak również różne ligandy mogą być rozpoznawane przez więcej niż jedną integrynę. Jednocześnie występują takie integryny, które specyficznie wiążą jeden ligand. Jednym z takich receptorów jest integryna .5ß1 (Geiger B i współ., 2001; Kuphal S i współ., 2005). II.6. Integryna .5ß1 – specyficzny receptor fibronektyny Rodzinę integryn może być podzielona na podgrupy ze względu na rodzaj podjednostki ß, jednakże o specyfice receptora integrynowego decyduje podjednostka .. Podrodzina ß1 zawiera sześć receptorów wiążących się z składnikami ECM. Integryna .5ß1 jest specyficznym receptorem fibronektyny (FN) zewnątrzkomórkowej glikoproteiny, która uczestniczy we wzroście, migracji oraz różnicowaniu komórek. Receptor integrynowy ma wielkość 28nm, zbudowany jest z globularnej „głowy” o wymia Wstęp rach 8 x 12nm oraz dwóch łańcuchów o szerokości 2nm i długości 18 – 20 nm (Humpries MJ, 2011). Gen kodujący podjednostkę integrynową .5 (ITGA5) znajduje się na chromosomie 12q1-13 (Krissansen GW i współ., 1992). Podjednostka integrynową .5 o masie około 150 kDa (O’Brien M i współ., 2007) jest zbudowana z 1049 aminokwasów (Isaji T i współ., 2006). Gen kodujący podjednostkę integrynową ß1 (ITGB1) znajduje się na chromosomie 10p11.2 (Rankinen T i współ., 2002; Scherman – Baust CA i współ., 2003). Podjednostkę ß1 buduje 798 aminokwasów (Romzek NC i współ., 1998) a całe białko ma masa ok. 130 kDa (Sterry W i współ., 1992). Doświadczenia z użyciem przeciwciał monoklonalnych pozwoliły ustalić, że integryna .5ß1 wiąże się z fibronektyną rozpoznając sekwencje zawierającą motyw RGD (Zhang Z i współ., 1995) oraz PHSRN (Li F i współ., 2003; Roca-Cusachs P i Gauthier N, 2009; Humphries MJ, 2011). Oddziaływania z fibronektyną są bardzo ważne podczas formowania włókien fibronektyny i tworzenia macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest potrzebna do prawidłowego funkcjonowania komórek w tkance. Oddziaływania pomiędzy integryną .5ß1 a fibronektyną są niezbędne podczas rozwoju kręgowców. Badania wykazują, że brak ekspresji jednej z tych glikoprotein powoduje zamieranie embrionu we wczesnych stadiach rozwoju. Wiązanie się integryny .5ß1 z fibronektyną odgrywa również ważną rolę w regulacji proliferacji, fenotypu komórek, adhezji oraz migracji komórek (Takagi J i współ., 2003; Wierzbicka-Patynowski I i Schwarzbauer JE, 2003). II.7. Rola glikozylacji integryny .5ß1 Zdolność integryn do wiązania ligandów może być kontrolowana przez czynniki występujące w cytoplazmie, które wywołują zmiany konformacji oraz przez utrzymanie konformacji aktywnej receptora integrynowego na powierzchni komórki (Clark K, i współ., 2005). Na siłę powinowactwa integryny do liganda może wpływać również glikozylacja obu podjednostek tym bardziej, że receptory te uważne są za główne nośniki N-glikanów (Isaji T i współ., 2006). Integryna .5ß1 ma 26 potencjalnych miejsc Wstęp N-glikozylacji, z których 14 występuje na łańcuchu .5 a 12 na podjednostce ß1 (ryc. 8) (Isaji T i współ., 2006, Isaji T i współ., 2009). Rycina 8. Potencjalne miejsca N-glikozylacji występujące na domenach zewnątrzkomórkowych podjednostek integrynowych .5 i ß1. Domena zewnątrzkomórkowa podjednostki integrynowej .5 zbudowana jest z trzech domen: (i) ß-śmigła (ang. ß-propeller), (ii) „uda” (ang. thigh) oraz (iii) „łydki” (ang. calf- 1, 2). Domena ß-śmigła posiada 5 miejsc potencjalnej N-glikozylacji, domena „uda” 4 miejsca potencjalnej N-glikozylacji a domena „łydki” od 1,2 do 5 miejsc potencjalnej N-glikozylacji. Tomoya Isaji z zespołem (2006) badali wpływ obecności poszczególnych N-glikanów na ekspresję i funkcje integryny .5ß1. W tym celu sekwencyjnie wprowadzali mutacje w miejscach potencjalnej N-glikozylacji. Badania wykazały, że prawidłowa glikozylacja regionu ß-śmigła jest wymagana do ekspresji podjednostki na powierzchni komórki, a obecność N-glikanów przy Asn-297, Asn- 307 oraz Asn-316 jest niezbędna do prawidłowego fałdowania się tej glikoproteiny, jak również ekspresji na powierzchni komórki. Podobne doświadczenia wykonał Tomoya Isaji z zespołem (2009) badając rolę glikozylacji podjednostki integrynowej ß1. Podjednostka ta składa się z czterech domen: (i) PSI (ang. plexin-semaphorin-integrin), (ii) I/A podobnej, (iii) hybrydowej oraz (iiii) Wstęp z powtórzeń domeny EGF. W domenie PSI występują 3 miejsca potencjalnej N-glikozylacji, podobnie jak w domenie I/A podobnej oraz w powtórzeniach EGF. Badania wykazały, że do poprawnego funkcjonowania ważna jest N-glikozylacja domeny I/A podobnej w miejscach Asn-212, Asn-307 oraz Asn-363. Prawidłowa N-glikozylacja domeny ß-śmigła podjednostki integrynowej .5 i domeny I/A podobnej podjednostki integrynowej ß1 jest niezbędna podczas tworzenia funkcjonalnego receptora .5ß1 na powierzchni komórki oraz wiązania z fibronektyną (Isaji T i współ., 2006; Stefanidakis M, Koivunen E, 2006; Isaji T i współ., 2009). Doświadczenia z zastosowaniem tunikamycyny (inhibitora glikozylacji) wykazały, że brak glikozylacji integryny .5ß1 powoduje utratę zdolności wiązania fibronektyny. Występują również nieprawidłowości podczas transportu receptora na powierzchnię komórek. Dodatkowo zastosowanie glikozydazy F (enzymu odcinającego N-glikany) blokuje tworzenie się funkcjonalnego receptora oraz jego oddziaływania z fibronektyną (Isaji T i współ., 2006). Te obserwacje są niezwykle istotne zważywszy na fakt, że podczas transformacji nowotworowej dochodzi do zmian w glikozylacji integryn, co może prowadzić do zmiany tempa rozprzestrzeniania się, adhezji oraz migracji komórek. Wiele grup badawczych sugeruje, że zmiany w N-glikanach integryny .5ß1 zależne od glikozylotransferaz takich jak: N-acetyloglukozoaminylotransferaza-V (GnT-V), N-acetyloglukozoaminylo-transferaza-III (GnT-III) oraz sjalilotransferaza .26 (ST6Gal-I), są często spotykane w komórkach nowotworowych. Dodatkowo zmiany te w znacznym stopniu wpływają na powinowactwo integryny .5ß1 do FN. Modyfikacja N-glikanów podjednostki integrynowej .5 polegająca na wprowadzeniu przedzielającego GlcNAc (produkt GnT-III) zmniejsza siłę wiązania tej integryny do FN, natomiast zmniejszona ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal zwiększa ją (Miyoshi E i współ., 1993; Taniguchi N i współ., 1999; Seales EC i współ., 2003; Seales EC i współ., 2005). Są również nieliczne doniesienia dotyczące roli kwasów sjalowych wiązanych .2-3 (Yamamoto H i współ., 2001, Pocheć E i współ., 2006) oraz .2-8SA (Nadanaka S i współ., 2001) w rozwoju nowotworów, lecz będą one dokładniej opisane w dalszej części rozprawy. Wstęp II.8. Fibronektyna – struktura i funkcja Fibronektyna (FN) to glikoproteina wchodząca w skład macierzy zewnątrzkomórkowej, która pośredniczy w oddziaływaniach między komórkami a składnikami ECM. Odgrywa ważne role podczas gastrulacji, wzroście oraz różnicowaniu komórek, organogenezie, sieciowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej, adhezji i migracji komórek, czy przy tworzeniu przerzutów przez komórki nowotworowe (Birkenmeier TM i współ. 1991). Fibronektyna jest produktem jednego genu (FN1), zlokalizowanego na chromosomie 2q34-36 (Avila JJ i współ., 1998). W wyniku alternatywnego składania powstaje około 20 form tej glikoproteiny. Powstałe warianty charakteryzują się różnymi właściwościami adhezyjnymi, siłą wiązania liganda oraz różną rozpuszczalnością, co pozostawia komórkom możliwość precyzyjnej zmiany składu ECM podczas ich rozwoju oraz tkankowo specyficznej ekspresji odpowiedniej formy tego białka (Pankov R, Yamada KM, 2002). Fibronektyna może być produkowana przez wiele typów komórek. W tkance występuje jako dimer zbudowany z niemal identycznych podjednostek o masie około 250 kDa każdy, połączonych kowalencyjnie parą mostków dwusiarczkowych blisko C-końcowej domeny. Każdy monomer składa się z trzech typów powtórzeń FN – 12 powtórzeń typu I, dwa powtórzenia typu II oraz 15 – 17 powtórzeń typu III (rycina 9). Rycina 9. Schemat budowy monomeru fibronektyny z zaznaczonymi miejscami wiązania komórek i białek ECM. Zaznaczono trzy typy powtórzeń: (i) typ I – czerwone kół Wstęp ka, (ii) typ II – zielone sześciokąty i (iii) typ III – niebieskie prostokąty; wg. Chabria M i współ., (2010) – zmienione. Powtórzenia typu I zbudowane są z około 40 aminokwasów i zawierają dwa mostki dwusiarczkowe. Powtórzenia typu II składają się z około 60 aminokwasów i dwóch mostków dwusiarczkowych, natomiast powtórzenia typu III zbudowane są z 90 aminokwasów, nie występuje w nich mostek dwusiarczkowy (Pankov R, Yamada KM, 2002). Fibronektyna stanowi ligand dla receptorów z rodziny integryn zawierających podjednostkę ß1, miedzy innymi: .5ß1, .3ß1, .4ß1 oraz .vß1 (Lefcort F i współ., 1992, Hynes RO, 2002). W sekwencji fibronektyny występuje kilka miejsc wiążących integryny. Najlepiej poznana jest jednak sekwencja Arg-Gly-Asp (RGD), która jest zlokalizowana w powtórzeniu III10. Sekwencja RGD stanowi główne miejsce wiązania integryn, jednocześnie wiązanie to jest procesem złożonym a siła wiązania zależy od sekwencji otaczającej, to jest Pro-His-Ser-Arg-Asn (PHSRN) występującej w powtórzeniu III9. Motyw PHSRN stanowi miejsce wiązania integryn, ułatwia rozpłaszczenie i adhezję komórek. Badania z użyciem przeciwciał blokujących wykazały, że motyw PHSRN jest rozpoznawany przez podjednostkę .5, podczas gdy podjednostka ß1 rozpoznaje i wiąże sekwencję RGD (Feng Y i Mrksich M, 2004). Wiązanie z integryną może być również zależne od N-terminalnego fragmentu zawierającego powtórzenia I1-9 oraz II1,2, które promują adhezję zależną od integryny .5ß1 (Moyano JV i współ., 2003). Fibronektyna może wiązać się z innymi ważnymi biologicznie białkami, miedzy innymi z heparyną, kolagenem, żelatyną, czy fibryną. Fibronektyna jest glikoproteiną zawierającą N- oraz O- glikany. Występuje w dwóch formach – nieaktywnej rozpuszczalnej oraz aktywnej nierozpuszczalnej. Większość fibronektyn syntetyzowanych w organizmie tworzy formy nierozpuszczalne, jako część budująca ECM. Proces tworzenia nierozpuszczalnych włókien fibronektyny nazywa się fibrylogenezą (Pankov R, Yamada KM, 2002). Wstęp II.9. Budowa i funkcje macierzy zewnątrzkomórkowej i błony podstawnej W organizmie wielokomórkowym komórki otoczone są przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM), która tworzy trójwymiarowe molekularne rusztowanie dla komórek tkanki. Składa się z fibrylarnych oraz niefibrylarnych składników takich jak: kolageny, elastyna, proteoglikany i glikoproteiny niekolagenowe. Do dzisiaj scharakteryzowano około 30 izoform kolagenów oraz proteoglikanów, 15 izoform lamininy oraz około 20 izoform fibronektyny. Białka budujące macierz zewnątrzkomórkową są aktywne biologicznie, dzięki czemu pośredniczą w przekazywaniu sygnałów w tkance. Komunikacja między białkami ECM a komórkami zachodzi przy udziale specyficznych receptorów występujących w błonie komórkowej. Wiązanie receptorów z białkami ECM determinuje organizację cytoszkieletu komórkowego jak również lokalizację i aktywację białek sygnałowych (Patel S i współ., 2006, Campbell NE i współ., 2010). Sygnały generowane przez składniki ECM precyzyjnie regulują adhezję, migrację, proliferację, różnicowanie i przeżycie komórek. Skład macierzy zewnątrzkomórkowej jest tkankowo i organo specyficzny. Dodatkowo jej kompozycja może zmieniać się zarówno czasowo jak i przestrzennie – w zależności od rodzaju, wieku tkanki jak również podczas stanów chorobowych, takich jak transformacja nowotworowa. Synteza składników ECM jest kontrolowana przez specyficzne czynniki wzrostu, wśród których jednym z najważniejszych wydaje się być transformujący czynnik wzrostu ß (TGF-ß) (Usui T i współ., 1998). Struktura macierzy zewnątrzkomórkowej może być modyfikowana przez proteazy, głównie metaloproteinazy (MMPs). Czynniki wzrostu oraz metaloproteinazy precyzyjnie kontrolują przebudowę ECM (Jarvelainen H i współ., 2009). Pomiędzy skórą właściwą a naskórkiem mieści się błona podstawna (ang. basement membrane). Ma postać wysoce zorganizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej. Ściśle łączy nabłonek ze skórę właściwą, stanowiąc barierę przed migracją. Składa się z trzech warstw: (i) - jednorodnej warstwy zbudowanej głównie z kolagenu IV (łac. lamina densa), (ii) warstwy zbudowanej głównie z lamininy 5 (łac. lamina lucida) oraz (iii) warstwy zbudowanej głównie z kolagenu VII (łac. lamina fibroreticularis). Macierz zewnątrzkomórkowa stanowi rezerwuar dla czynników wzrostu oraz białek wiążących komórki, tworzy sygnały wywołujące ruch komórek, co wpływa na Wstęp zachowanie komórek nowotworowych (Vihinen P, Kahari VM, 2002). Niektóre komórki nowotworowe mają zdolność wydzielania, jak i pobudzania komórek tkanki do wydzielania metaloproteinaz. Powoduje to rozkład składników budujących ECM i błonę podstawną tworząc przestrzeń, przez którą mogą przechodzić komórki nowotworowe (Rowe RG, Weiss SJ, 2008; Amano S, 2009). Rezultatem aktywności proteaz jest zmiana oddziaływań komórka – składniki ECM oraz komórka – komórka. Dochodzi do uwolnienia czynników chemotaktycznych oraz odsłonięcia miejsc receptorowych dla komórek (Bodreau NJ, Jones PL, 1999; DeClerck YA i współ., 2004). Integryny występujące na powierzchni komórek wiążą nowo powstałe ligandy, co generuje sygnały powodujące zmiany w adhezji i migracji komórek nowotworowych. W odpowiedzi na nie dochodzi do polimeryzacji cytoszkieletu aktynowego, powstania struktur takich jak filopodia i lamellipodia, a w konsekwencji do ruchu komórki (Parise LV i współ., 2000, Stefanidakis M i Koivunen E, 2006; Levental KR i współ., 2009). II.10. Biosynteza i funkcje metaloproteinaz (MMPs) Metaloproteinazy (MMPs) to endopeptydazy o konserwatywnej budowie, zdolne do niszczenia większości składników budujących macierz zewnątrzkomórkową i błonę podstawną (Stefanidakis M, Koivunen E, 2006). Rodzina metaloproteinaz składa się z 28 wydzielniczych i transbłonowych enzymów zaangażowanych w budowę i rozkład białek. Do tej pory wykazano ekspresję 24 MMPs w organizmie ludzkim (Hofmann UB i współ., 2000). Większość MMPs jest syntetyzowana z prekursorów zawierających sekwencję wiodącą, która stanowi sygnał do sekrecji. Metaloproteinazy te są wydzielane, jako nieaktywne zymogeny (wyj. MMP-11, MMP-28), a następnie proteolitycznie aktywowane w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. MMPs mogą być aktywowane przez proteazy serynowe takie jak plazmina, urokinazowy aktywator plazminogenu (uPA), lub przez inną MMP np. aktywacja pro-MMP-2 zachodzi na powierzchni komórek endotelium z udziałem metaloproteinazy błonowej (MT1-MMP) oraz błonowego inhibitora tkankowego metaloproteinaz (TIMP-2) (Lafleur MA i współ., 2003). Aktywne formy MMPs mogą Wstęp współdziałać z cząsteczkami powierzchniowymi, co ułatwia niszczenie ECM, np. aktywna MMP- 2 może łączyć się z integryną .vß3, a MMP- 9 z CD- 44 (Erdogan G i współ., 2008). Aktywowane MMPs są hamowane przez odpowiednie specyficzne inhibitory tkankowe oraz niespecyficzne białka plazmatyczne takie jak . –2 makroglobulina. Uważa się, że równowaga pomiędzy ilością MMPs i aktywacją ich inhibitorów reguluje stopień degradacji tkanki. Jest to bardzo znaczące, szczególnie w przypadku aktywacji MMPs w stanach patologicznych. Nie wszystkie metaloproteinazy biorą aktywny udział w inwazji nowotworów, do najlepiej zbadanych należą między innymi: MMP-2 i MMP-9 (Vihinen P i Kahari VM, 2002; Roomi ME i współ., 2009). MMP-2 oraz MMP-9 należą do rodziny żelatynaz. MMP-2 to białko o masie 72 kDa, które jest produkowane przez komórki prawidłowe oraz nowotworowe. ProMMP- 2 ma masę 70 - 72 kDa, natomiast forma aktywna 65 kDa i 62 kDa. Preferencyjnie tnie żelatynę i kolagen typu IV, ale również typy V i VII kolagenu, fibronektynę, proteoglikany chrząstki, czy elastynę. Pro- MMP-2 jest jedną z nielicznych metaloproteaz, która lokalizuje się na powierzchni komórki, w celu nabycia aktywności proteolitycznej (Vihinen P i Kahari VM, 2002; Manoury B i współ., 2005). MMP-9 to białko o masie 92 kDa, produkowane jest przez ludzkie makrofagi i limfocyty o polimorficznych jądrach, keratynocyty, monocyty oraz wiele komórek nowotworowych. MMP-9 jest syntetyzowana, jako propeptyd o masie 78.4 kDa. Po glikozylacji uzyskuje masę 92 kDa i jest wydzielana z komórki. Proteolityczna aktywacja MMP-9 czyni z niej aktywny enzym o masie 82 kDa. Występuje w formie monomerycznej, homodimeru bądź kompleksu. Forma aktywna hydrolizuje żelatynę, nieaktywna typ IV kolagenu, elastynę (Li DQ i współ, 2001; Vihinen P i Kahari VM, 2002). II.11. Transformacja nowotworowa Transformacja nowotworowa jest procesem złożonym, pociąga za sobą zmiany genotypu oraz fenotypu komórek transformowanych. Podczas rozwoju choroby nowotworowej dochodzi do akumulacji mutacji w genach kontrolujących proliferację, różnicowanie oraz śmierć komórki. Wstęp Białko p53 jest jednym z czynników transkrypcyjnych o właściwościach hamujących rozwój nowotworu. Odgrywa ważną rolę podczas aktywacji zaprogramowanej śmierci komórki w odpowiedzi na uszkodzenia DNA lub zatrzymania komórek w fazie G1. Mutacje w genie TP53 nie są charakterystyczne dla czerniaka, częstość mutacji jest niższa niż w nowotworach innych typów i wynosi 10 – 25%. Nieliczne publikacje potwierdzają jednak związek miedzy mutacją w genie TP53 i rozwojem czerniaka skóry, szczególnie w połączeniu z mutacjami występującymi w innych genach, np. genie BRAF (gen kodujący kinazę Raf typu B) (rycina 10) (Patton EE i współ., 2005). Rycina 10. Schemat szlaków sygnalizacyjnych białka Ras (Raf – MEK – ERK oraz PI3K – Akt), wg Chudnovsky Y i współ., (2005) – zmienione. Czerniak skóry często powstaje z melanocytów prawidłowych. Kinaza BRAF jest regulatorem szlaku kaskady sygnałowej Raf/MEK/ERK, który między innymi jest odpowiedzialny za aktywację cyklu komórkowego. Mutacja w genie BRAF powoduje konstytutywną aktywację tej kinazy, co prawdopodobnie inicjuje podziały melanocytów (Damsky WE i współ., 2011). Mutacja genu BRAF bardzo rzadko występuje w czernia Wstęp ku oka oraz czerniaku śluzówki, co sugeruje udział promieniowania UV podczas ich powstawania. Mutacja w genie BRAF występuje w około 50% przypadków czerniaka oraz w 70-80% znamion. Do tej mutacji dochodzi prawdopodobnie podczas pierwszych etapów rozwoju choroby nowotworowej, jednocześnie sama nie jest wystarczająca do zapoczątkowania transformacji (Chudnowsky Y i współ., 2005). W 10-20% przypadków czerniaka występuje mutacja genu Ras. W nielicznych przypadkach w komórkach guza dochodzi do konstytutywnej aktywacji tego onkogenu, lecz nie jest ona wynikiem mutacji. Onkogen Ras aktywuje kaskady sygnałowe Raf oraz kinazę 3-fosfatydyloinozytolu (PI3K). PI3K aktywuje kinazę Akt (serynowo-treoninowa kinaza Akt), proces ten jest regulowany przez fosfatazę fosfatydyloinozytolo-3,4,5trisfosforanu (PTEN). Ekspresja fosfatazy PTEN hamuje aktywację kinazy Akt poprzez kinazę PI3K. Podczas rozwoju czerniaka często nie dochodzi do ekspresji genu PTEN, jeżeli jednak w komórkach występuje gen PTEN, to w 30-50% przypadków czerniaka jest on zmutowany, wynikiem czego dochodzi do ciągłej aktywacji kinazy Akt. Aktywacja kinazy Akt może również zachodzić niezależnie od obecności fosfatazy PTEN, gdyż w 60% przypadków czerniaka dochodzi do mutacji w genie AKT, przez co kinaza staje się konstytutywnie aktywna (Chudnowsky Y i współ., 2005; Damsky WE i współ., 2010). Akumulacja mutacji w genach kontrolujących istotne dla komórek czerniaka procesy prowadzi do nabycia zdolność do angiogenezy, inwazji oraz tworzenia przerzutów. Na powierzchni komórek nowotworowych pojawia się nowy zestaw białek adhezyjnych (np. N-kadheryna, integryna .vß3), molekuł odpowiedzialnych za utrzymanie spójności tkanki oraz prawidłową komunikację z macierzą zewnątrzkomórkową (Li G, Herlyn M, 2000; Hsu MY i współ., 2002; Nguyen TH, 2004). Podczas transformacji nowotworowej dochodzić również może do nadekspresji kwasów sjalowych na powierzchni komórek. Sjalilowane struktury mogą być specyficznie wiązane przez receptory należące do rodziny białek adhezyjnych takich jak selektyny, czy lektyny typu Siglec, ułatwiając komórkom nowotworowym inwazję przez ściany naczyń. Na powierzchni komórek wielu typów nowotworów, takich jak: nowotwory jelita, pęcherza, sutka czy płuc występuje nadekspresja lub są syntetyzowane de novo sjalilowane antygeny typu Lewis (sLe). Antygeny typu Lewis: sjalilowany Lewisa (SA.2-3Galß1-3[Fuc.1-4]GlcNAc, sLea) oraz sjalilowany Lewisx (SA.2-3Galß14[ Fuc.1-3]GlcNAc, sLex) są rozpoznawane przez selektyny. W fizjologicznych warunkach białka adhezyjne z rodziny selektyn pełnią funkcje podczas adhezji leukocytów do Wstęp komórek śródbłonka (homing) w trakcie reakcji zapalnej. Ten sam mechanizm pomaga również komórkom nowotworowym przechodzić przez ściany naczyń do głębiej położonych tkanek. Wydaje się, że podczas syntezy sLea oraz sLex istotną rolę odgrywa ST3Gal-III katalizujące tworzenie wiązania SA.2-3Gal. Sjalilowane antygeny typu sLe mogą występować na N-glikanach oraz O-glikanach wiązanych do glikokoniugatów. Jednocześnie wydaje się, że sLea oraz sLex występujące na O-glikanach są istotne podczas przechodzenia komórek nowotworowych przez ściany naczyń, jak również tworzenia odległych przerzutów w węzłach chłonnych (Dall’Olio F i współ., 2000; Ellies LG i współ., 2002; Hsu MY i współ., 2002). Czynniki regulujące ekspresję genów dla sjalilotransferaz mogą być pomocne podczas badania zmian w szlakach przekazu sygnałów. Przykładem jest zwiększona ekspresja ST6Gal-I w komórkach nowotworowych (a tym samym sjalilacja SA.2-6Gal) spowodowana nadekspresją genu Ras (Seales EC i współ., 2003; Seales EC i współ., 2005). W wielu typach nowotworów włączając nowotwory jelita, sutka, szyjki macicy oraz niektóre typy nowotworów mózgu jest zwiększona aktywność tej sjalilotransferazy lub ilość mRNA ją kodującego. Jednak efekty fenotypowe spowodowane aktywnością ST6Gal-I nie są spójne i ściśle zależą od typu komórek, z których powstaje nowotwór (Yamamoto H i współ., 2001, Suzuki O i współ., 2005). Badanie rozwoju nowotworu jelita jednoznacznie potwierdzają jednak, że nadekspresja ST6Gal-I hamuje adhezję, co wykazano na komórkach linii SW948. W fibroblastach transfekowanych genem Ras obserwuje się wysoką ekspresję tej sjalilotransferazy, a komórki te wykazują fenotyp nowotworowy. Zahamowanie transkrypcji genu dla ST6Gal-I przez wprowadzenie antysensowego mRNA hamuje tempo wzrostu niezależnego od czynników wzrostu a tym samym rozwój choroby nowotworowej. ST6Gal-I może współzawodniczyć o substrat z innymi sjalilotransferazami, np. ST3Gal-III, co może powodować zmiany w szlakach biosyntezy sjalilowanych antygenów typu Lewisx. Glikoproteiny, które podlegają sjalilacji typu SA.2-6Gal pełnią różne funkcje w zależności od typu komórek, w których występują, więc w różny sposób wpływają na biologię komórek nowotworowych. Wydaje się, że precyzyjne określenie roli ST6Gal-I w różnych typach nowotworów, w tym czerniaka, może stanowić broń przeciw ich rozwojowi (Nadanaka SS i współ., 2001). Wyniki badań wskazują, że podczas oddziaływań między komórkami a białkami ECM ważny jest typ sjalilacji. Zespół Yamamoto H (2001) opublikował wyniki dotyczące wpływu kwasów sjalowych występujących na powierzchni komórek glejaka na adhezję do fibronektyny oraz inwazję przez Matrigel. Komórki linii U373 MG wykazu Wstęp ją naturalną nadekspresję kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal, co ułatwia im inwazję. W celu określenia wpływu kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal na ten proces, wyprowadzono dwie linie komórkowe stabilnie transfekowane genem kodującym ST6Gal-I oraz ST3Gal-III. Nadekspresja ST6Gal-I spowodowała brak sjalilacji .2-3Gal i jednoczesne pojawienie się terminalnie zlokalizowanych kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal, co zniosło adhezję oraz inwazję komórek. Jednocześnie nadekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal zwiększyła inwazję komórek przez Matrigel. Uzyskane wyniki sugerują, że typ wiązania kwasów sjalowych jak również ich ilość mogą wpływać na oddziaływania między komórkami a składnikami ECM a tym samym na ich zachowanie w tkance (Yamamoto H i współ., 2001). Badania roli kwasów sjalowych występujących na powierzchni integryny .5ß1 podczas interakcji z fibronektyną skupiają się głównie na udziale kwasów sjalowych wiązanych .2-6 do galaktozy. Znacznie mniej informacji dotyczy znaczenia sjalilacji .2-3Gal oraz .2-8SA integryny .5ß1 podczas oddziaływań z fibronektyną. Badania prowadzone na komórkach czerniaka linii G368 wykazały, że kwasy polisjalowe wiązane do N-glikanów podjednostki integrynowej .5 mogą ułatwiać adhezję integryny .5ß1 do fibronektyny. Jednocześnie sjalilacja .2-3 oraz .2-6 nie uczestniczy podczas tego procesu (Nadanaka SS i współ., 2001). Inne badania potwierdzają jednak, że terminalnie zlokalizowane kwasy sjalowe wiązane .2-6 zwiększają adhezję integryny .5ß1 do fibronektyny (Seales EC i współ., 2005). Przytoczone informacje dotyczące określenia roli sjalilacji integryny .5ß1 podczas rozwoju nowotworów są sprzeczne. Jednocześnie precyzyjne określenie roli poszczególnych typów sjalilacji podczas rozwoju czerniaka skóry jest szczególnie ważne, gdyż stwarza możliwość skonstruowania skutecznej terapii antynowotworowej. Dlatego celem niniejszej rozprawy doktorskiej było określenie roli sjalilacji integryny .5ß1 w oddziaływaniach z fibronektyną Cele pracy III. Cele pracy Celem pracy było określenie wpływu sjalilacji integryny .5ß1 występującej na powierzchni komórek czerniaka skóry pierwotnej linii WM115 oraz metastatyczne WM266-4. Materiał został uzyskany z tego samego pacjenta, co pozwoliło na bezpośrednie monitorowanie zmian towarzyszących transformacji komórek czerniaka skóry. W szczególności, przeprowadzone doświadczenia miały na celu: 1. Określenie roli integryny .5ß1 obecnej na powierzchni komórek czerniaka w oddziaływaniach z fibronektyną. 2. Określenie udziału kwasów sjalowych wiązanych (i) .2-3Gal, (ii) .2-6Gal, (iii) .2-8SA oraz integryny .5ß1 w adhezji do, migracji po fibronektynie oraz inwazji przez Matrigel komórek czerniaka. 3. Określenie typu sjalilacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1. 4. Określenie udziału kwasów sjalowych wiązanych (i) .2-3Gal, (ii) .2-6Gal oraz (iii) .2-8SA podczas adhezji oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny. 5. Określenie zmian molekularnych oraz funkcjonalnych towarzyszących transformacji nowotworowej czerniaka skóry. Metodyka badań IV. Metodyka badań Stosowane w prezentowanej pracy metody badawcze można podzielić na trzy grupy: (i) testy molekularne, (ii) badanie powierzchni komórkowej oraz (iii) testy funkcjonalne (rycina 11). Rycina 11. Uproszczony podział metod zastosowanych w pracy doktorskiej. Metodyka badań IV.1. Linie komórkowe Badania prowadzono na dwóch liniach komórkowych czerniaka skóry wyprowadzonych od 58 letniej kobiety. Są to komórki rosnące w postaci monowarstwy charakteryzujące się morfologią epitelialną: IV.1.1. WM115 - linia komórek pierwotnych wyizolowanych z guza umiejscowionego w pachwinie na prawej nodze, komórki pochodzące z pogranicza fazy wzrostu – horyzontalnej i wertykalnej (RGP/VGP). IV.1.2. WM266-4 - linia komórek z fazy metastatycznej, uzyskana z przerzutu do węzłów chłonnych (Westermark B i współ., 1986). IV.2. Hodowla komórkowa IV.2.1. ROZMRAŻANIE KOMÓREK Komórki po wyjęciu z banku z ciekłego azotu zostały szybko rozmrożone i przeniesione do 10 ml pożywki RPMI-1610 z dodatkiem Glutamax-I (Gibco) zawierającej 10 % FBS (Gibco), antybiotyki (100 U/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny) (Sigma). Komórki wirowano 5 min, 1 000 rpm, 40C (wirówka Mikro 22R, Hettich). Po zwirowaniu pipetą usunięto pożywkę, a osad komórek rozpuszczono w 1 ml nowej pożywki zawierającej 10 % FBS i wysiano na szalki. Hodowlę prowadzono w inkubatorze hodowlanym Lab-Line (5% CO2, 370C). Po 24 godz. zmieniono komórkom pożywkę. IV.2.2. PROWADZENIE HODOWLI KOMÓRKOWEJ Linie komórkowe czerniaka hodowano na szalkach (O - 10 cm, Corning) w pożywce zawierającej 10% FBS w inkubatorze z 5% CO2 w 370C. Komórki systematycznie Metodyka badań sprawdzano na obecność mykoplazmy za pomocą metody PCR. W zależności od potrzeb eksperymentu po osiągnięciu stanu 70 – 80% konfluencji komórki zbierano: 1. W Cell Dissiciation Solution (Sigma) – test adhezji, test gojenia ran, test inwazji komórkowej, cytometria przepływowa; 2. Sterylnym gumowym „policjantem” w buforze RTL (Rneasy Mini Kit, Qiagen) zawierającym ß – merkaptoetanol – izolacja RNA; 3. Sterylnym gumowym „policjantem” w zimnym PBS (Gibco) – izolacja DNA; 4. Innym sposobem w zależności od dalszej analizy. IV.2.3. PASAŻOWANIE KOMÓREK Po osiągnięciu stanu 70% - 80% konfluencji znad komórek usunięto pożywkę, szalkę płukano 3 ml PBS (Gibco) w celu usunięcia surowicy. Następnie dodano 1 ml 0.07% trypsyny. Trypsynizajcę prowadzono w 370C w inkubatorze CO2, 3 – 5 min w zależności od komórek. Proces odrywania się komórek od powierzchni szalki obserwowano pod mikroskopem (Inverted Microscope Carl Zeiss Jena Telaval 3). Następnie do komórek dodano pożywkę zawierającą 10% surowicę, komórki wirowano 5 min, 1 000 rpm, 40C (wirówka Mikro 22R, Hettich). Po zwirowaniu usunięto pożywkę, a komórki rozpipetowano w 1 ml pożywki i ponownie wysiano na szalki. IV.2.4. BANKOWANIE KOMÓREK Po osiągnięciu stanu pełnej konfluencji zebrano pożywkę za pomocą pipety, komórki płukano 3 ml PBS. Komórki odrywano od szalki za pomocą 0.07% trypsyny. Komórki trypsynizowano 3 – 5 min w 37°C. Po oderwaniu się komórek od szalki trypsynę neutralizowano pożywką zawierającą 10% FBS. Po zwirowaniu (wirówka Hettich Makro 22A) usunięto pożywkę a osad komórek zawieszono w 1,5 ml pożywki zawierającej 10% FBS oraz 10% DMSO (Sigma). Komórki przeniesiono do ampułek do mrożenia komórek (Nalgene Cryoware, Sybron International, Nalge Company). Ampułki umieszczano w pojemniku mrożeniowym (Mr. Frosty, Roth) zawierającym 100% izo Metodyka badań propanol. Po 4 godz. mrożenia w temperaturze -700C, ampułki przeniesiono do ciekłego azotu. IV.3. Izolacja RNA, synteza cDNA i reakcja RT-PCR IV.3.1. IZOLACJA RNA Izolacja całkowitego RNA została przeprowadzona na membranach sylikonowych zgodnie z zaleceniami producenta (RNeasy Mini Kit, Qiagen). Komórki zebrano (metodyka badań punkt IV.2.2.2) i dodano po 350 µl 70% etanolu. Mieszaninę rozpipetowano do uzyskania jednolitego roztworu. Otrzymaną mieszaninę nakładano na kolumny do izolacji RNA, próbki wirowano 8.000g (ultrawirówka MPV 350-R), 15 sek., następnie membranę płukano buforem RW1 i RPE. Kolumnę suszono poprzez wirowanie 15.000g, 2 min. Membranę płukano 2 x 30 µl wody, wirowano 15.000g, 2 min. W celu pomiaru koncentracji RNA sporządzono próbki o objętości 100 µl (99 µl wody, 1 µl badanej próbki). Pomiar stężenia RNA w próbce obliczono na podstawie wartości stosunku absorbancji przy . = 260 nm i . = 280 nm za pomocą spektrofotometru UV – VIS (Bio-Rad). Czystość uzyskanego RNA określono na podstawie wartości stosunku absorbancji (A260/A280) jak również elektroforetycznie rozdzielając 3 µg materiału w 2% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny (metodyka badań punk IV.3.4). IV.3.2. SYNTEZA CDNA Doświadczenie przeprowadzono według przepisu producenta (Omniscript RT Kit; Qiagen). Do syntezy cDNA użyto 1 µg RNA, próbkę dopełniono do objętości 5 µl wodą i inkubowano w termobloku (Eppendorf) w 650C, 5 min. Po szybkim schłodzeniu na lodzie do RNA dodano 15 µl mieszaniny reakcyjnej, która zawierała: bufor 10 razy stężony, oligonukleotydy (5 mM dNTP), startery Oligo(dT)23 (70 µM), wodę oraz od Metodyka badań wrotną transkryptazę. Próbki inkubowano 60 min. w 370C oraz 5 min. w 930C w celu przerwania reakcji. IV.3.3. REAKCJA RT – PCR Reakcja RT – PCR została przeprowadzona zgodnie z zaleceniami producenta (Taq PCR Master Mix Kit; Qiagen) w termocyklerze (Peltier Thermal Cycler, Syngen). Dwa mikrolitry cDNA dodano do mieszaniny reakcyjnej zawierającej: bufor 10 razy stężony, Q solution, oligonukleotydy (dNTP 10 mM), MgCl2, startery dla badanych sjalilotransferaz (po 0.5 µM). Reakcję prowadzono w warunkach standardowych: jednorazowa wstępna denaturacja – 940C, 3 min, denaturacja cDNA – 940C, 1 min, renaturacja – (temperatura zależy ściśle od danej pary starterów – tabela nr 1) – 1 min, amplifikacja – 720C, 2 min. Tabela 1. Zestawienie nazw badanych genów, sekwencje poszczególnych par starterów, ich temperatury topnienia (Tm) oraz długość produktu (bp). Nazwa genu Startery Tm Bp Literatura SIAT3 (ST3Gal-III) F: 5'-AACAAGTCTCTGGGGTCACG-3' R: 5'-TGAGGATTCGAATCTCAGGG-3' 59.80C 307 Peracaula R i współ., SIAT4C (2005) (ST3Gal-IV) F: 5'-CTTCTTCATGGAGATTGCAGC-3' R: 5'-CTACAGCTCTTGCCCAGGTC-3' 59.00C 320 SIATI (ST6Gal-I) F: 5'-CATCTTCATTATGATTCACACCAAC-3' R: 5'-ACCTCTACCATGGATACATTCACAT-3' 570C 473 Seales EC i współ., (2003) STX (ST8Sia-II) F: 5'-TCAAGCACAACATCCAGCCAG-3' R: 5'-AGGGGTTCATGGTTACCAGGTC-3' 600C 399 Tanaka F i współ., PST (2000) (ST8Sia-IV) F: 5'-ATGTGGAAAGGAGATTGACAG-3' R: 5'-AGTGTATACATGAGAAGACCTGT-3' 600C 436 GAPDH F: 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3' R: 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3' 590C 596 Przybyło M i współ., (2008) Metodyka badań Cykl denaturacja – renaturacja i amplifikacja powtórzono 35 razy. W końcowym etapie RT-PCR próbki inkubowano w temperaturze 720C, 10 min. Reakcja została zatrzymana poprzez obniżenie temperatury do 40C. IV.3.4. ELEKTROFOREZA PRODUKTÓW REAKCJI RT- PCR ORAZ RNA Produkty reakcji RT-PCR rozdzielono elektroforetycznie w 2% żelu agarozowym (Sigma) w obecności bromku etydyny w aparacie do elektroforezy kwasów nukleinowych (Bio-Rad). Przygotowanie żelu - do 40 ml buforu TAE o składzie: 40 mM Tris / kwas octowy, 1 mM EDTA, pH 7.4 dodano agarozę (0.6 g). Po rozpuszczeniu agarozy do żelu dodano bromek etydyny (0.25 µg/ml). W studzienki żelu naniesiono 7 µl markera pUC (Fermantas) i po 10 µl próbek produktów uzyskanych po reakcji PCR. W przypadku elektroforezy RNA do studzienek dodawano po 3 µg uzyskanego materiału. Rozdział prowadzono przy stałym napięciu – 120 V przez 70 min. Fotografie żeli wykonano przy pomocy komory ze stolikiem i kamerą UV (BTX-20.M; Uvitec). Analizę żeli wykonano przy pomocy programu komputerowego do zdjęć żeli po elektroforezie Scion Image, analizę zdjęć natomiast używając programu do analizy żeli po elektroforezie UVIMAP v. 99 Syngen Biotech. IV.4. PRZYGOTOWANIE HOMOGENATÓW KOMÓRKOWYCH Szalki z komórkami płukano 2 razy PBS (Gibco) w celu usunięcia pożywki, komórki zebrano za pomocą gumowego „policjanta”, następnie wirowano (1 500 rpm, 10min, 40C). Pelety tych samych linii komórkowych pulowano przenosząc je do jednej probówki. Do każdej dodano bufor do homogenizacji 150µl na 1 pelet o składzie: a. Do wykonania immunodetekcji i precypitacji lektynami - 10mM Tris/HCl, 150mM NaCl, pH 7.4, inhibitory proteaz (Sigma) (10 µl/ml), 0.3% siarczan protaminy (10 µl/ml) oraz 10% Triton X- 100 (100 µl/ml); Metodyka badań b. Do wykonania chromatografii powinowactwa - 50 mM Tris/HCl, pH 7.4 z dodatkiem jonów 15 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, inhibitory proteaz (10 µl/ml), 0.3% siarczanu protaminy (10 µl/ml) oraz 25 mM oktyl ß-Dglukopiranozyd (Sigma). Pelety sonifikowano trzykrotnie po 5sek. w lodzie (sonifikator Sonics, Vibra-Cell), po czym inkubowano na wytrząsarce (RM-2) w 40C przez 1 godz. Próbki wirowano przez godzinę w 40C przy obrotach 18 000 rpm (wirówka MLW, UP65). Zebrano supernatant, który po oznaczeniu w nim stężenia białka, używano do dalszych analiz. IV.5. Oznaczanie stężenia białka metodą Petersona GL, (1977) Stężenie białka w homogenatach oznaczano za pomocą zestawu Sigma Diagnosstics ®. Do próbek (1, 3, 5 µl homogenatów w 100 µl roztworu wodnego), ślepej odczynnikowej (woda dejonizowana) i krzywej kalibracyjnej dodano po 10 µl DOC (deoksycholan sodu – 1.5 mg/ml). Próbki mieszano na worteksie, po czym inkubowano 10 min, RT. Następnie dodano 10 µl TCA (kwasu trichlorooctowego – 72%), wirowano przez 10 min. przy 16 000 rpm (wirówka MLW, UP65). Za pomocą końcówki kapilarnej usunięto supernatant, a pelety zawieszono w 100 µl odczynnika Lowry’ego i przeniesiono do nowych probówek, poprzednie przepłukano 100 µl wody dejonizowanej. Całość inkubowano przez 20 min. Następnie dodano 50 µl odczynnika Folina i inkubowano w ciemności przez 30 min. Próbki oraz krzywą kalibracyjną (każda po 200 µl) przeniesiono do płytki 96 dołkowej (Corning). Absorbancję mierzono względem ślepej odczynnikowej przy . = 600 nm w czasie nie przekraczającym 30 min. od zakończenia inkubacji, za pomocą czytnika spektrofotometrycznego ELISA (Elx808 IU Ultra Microplate Reader, Boi-Tek Instruments Inc). Powyższą procedurę wykonywano w temperaturze pokojowej. Zawartość białka w próbkach oznaczono względem krzywej kalibracyjnej przygotowanej na podstawie pomiarów absorbancji wzorcowych roztworów BSA w zakresie stężeń 2- 30 µg/ 100 µl roztworu. Metodyka badań IV.6. Precypitacja lektyną MAL-II białek zawierających struktury sjalilowane SA.2-3Gal oraz lektyną SNA białek ze strukturami SA.2-6Gal/GalNAc Do 300 mikrogramów homogenatu komórkowego (na każde precypitowane białko) dodano bufor do precypitacji o składzie: 10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, pH 7.5 do objętości 600 µl oraz lektyny: SNA-agaroza – 16 µl lub MAL-II sprzęgniętą z biotyną (Vector) – 3,4 µl (tabela 2). Inkubację z lektynami prowadzono na rotatorze (RM-2) przez noc w 40C. Dwie godziny przed końcem inkubacji do lektyn MAL-II dodano 34 µl odczynnika Streptawidyna – agaroza (Sigma). Kompleksy lektyna SNA – glikoproteina lub lektyna MAL-II - glikoproteina zebrano przez wirowanie 500 rpm, 10min, 40C (wirówka MLW, UP65), a następnie płukano 3 razy buforem do precypitacji i raz buforem PBS (Gibco). Uzyskane precypitaty rozbito poprzez gotowanie (10 min) w termobloku (Bio-San) w buforze do próbek do elektroforezy SDS-PAGE bez ß-merkaptoetanolu. Tabela 2. Porównanie specyfiki substratowej używanych lektyn. Nazwa lektyny Źródło pochodzenia lektyny Specyfika działania SNA Sambucus nigra SA.2-6Gal/GalNAc MAA (MAL-II) Maackia amurensis SA.2-3Gal IV.7. Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS (SDS- PAGE), wg zmodyfikowanej metody Laemmli’ego, (1970) Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym SDS-PAGE umożliwia rozdział mieszaniny białek ze względu na ich masę cząsteczkową. Elektroforezę przeprowadzano w obecności 0.1% SDS w żelu poliakryloamidowym: zagęszczającym (4,5%) i rozdzie Metodyka badań lającym (8%) używając aparatu do elektroforezy (Bio-Rad), w warunkach nieredukujących (immunodetekcja) i redukujących (reakcja z lektynami). Do próbówki pobrano odpowiednią ilość białka z ekstraktów komórkowych (tabela 3), uzupełniono wodą Milli Q do objętości 5µl, następnie dodano bufor do próbek: a. Immunodetekcja, chromatografia powinowactwa – 5 µl buforu bez ßmerkaptoetanolu, warunki nieredukujące; b. Reakcja z lektynami - 5µl buforu z ß-merkaptoetanolem, warunki redukujące. Następnie próbki denaturowano w temperaturze 1000C przez 10 min w termobloku TB-941U (JW. Electronic), zagęszczono dodając 10% glicerol i barwiono błękitem bromofenolowym (0,5µl). Rozdział prowadzono 120 min w temperaturze pokojowej (i) przy stałym napięciu 60V, 20 min dla żelu zagęszczającego oraz (ii) przy stałym napięciu 120V, 100 min dla żelu rozdzielającego. Koniec elektroforezy ustalono za pomocą standardów Color Markers High Range (Fermentas) o składzie: miozyna (285 kDa; kolor niebieski), ß-galaktozydaza (123 kDa; kolor turkusowy), albumina (74 kDa; kolor różowy), owoalbumina (45 kDa; kolor żółty), anhydraza węglanowa (29 kDa; kolor pomarańczowy) w momencie, gdy marker o masie 29kDa osiągnął koniec żelu. Do wyznaczenia mas cząsteczkowych używano standardów masowych HMW (Sigma Standard Kit) o składzie: miozyna (205 kDa), ß-galaktozydaza (116 kDa), fosforylaza B (97.4 kDa), BSA (66 kDa), owoalbumina (45 kDa), anhydraza węglanowa (29 kDa). Tabela 3. Ilość rozdzielanego materiału w żelu SDS-PAGE w poszczególnych eksperymentach. Eksperyment Immunodetekcja Chromatografia powinowactwa Precypitacja Zymografia Ilość .5 10 µg Płukanie 20 µg SNA 100 µg Pożywka 25 µg białka ß1 10 µg Elucja 5 µg MAA 250 µg Metodyka badań IV.8 Zymografia – ocena aktywności proteolitycznej żelatynazy A (Pro-MMP-2, 72 kDa) i żelatynazy B (MMP-9, 92 kDa) Komórki linii WM115 oraz WM266-4 po osiągnięciu stanu konfluencji hodowano w pożywce bez surowicy przez 24 godz. w inkubatorze CO2. Pożywkę oraz komórki zebrano (metodyka badań punkt IV.2.3.), z komórek sporządzono homogenaty (metodyka badań punkt IV.4.). W zebranym materiale oznaczono stężenie białka (metodyka badań punkt IV.5), próbki do rozdziału przygotowano w buforze do próbek do elektroforezy bez dodatku ß-merkaptoetanolu. Uzyskany materiał rozdzielono w żelu poliakryloamidowym (metodyka badań punkt nr IV.7) 4.5% zagęszczającym i 10% rozdzielającym zawierającym wpolimeryzowaną żelatynę typu I (10 mg/ 5 ml). Po wykonanym rozdziale, żel moczono w 2,5% Triton X-100 dwa razy po 30 min (wytrząsarka WL972). Następnie inkubowano w 370C przez 48 godz. w buforze do inkubacji o składzie: 50 mM Tris, pH 7.6, 0,2 M NaCl, 5 mM CaCl2. Uzyskany żel barwiono (metodyka badań punkt IV.9) i wysuszono (metodyka badań punkt IV.10). IV.9. Wybarwianie żeli poliakryloamidowych na obecność białka Żele poliakryloamidowe z rozdzielonymi elektroforetycznie białkami (20 mg białka uzyskanego z rozdziału chromatograficznego, 10 mg białek homogenatu) po 30 min moczenia w 12% kwasie trójchlorooctowym (TCA) wybarwiono przez noc w roztworze zawierającym 0.1% błękit kumazyny R250 (Coomassie Brillant Blue, CBB), 25% metanol, 10% kwas octowy, a następnie odbarwiono w ww. roztworze nie zawierającym CBB R250. IV.10. Suszenie żeli poliakrylamidowych Żele wybarwione CBB R250 moczono przez 12 godz. w 200 ml wody dejonizowanej, trzykrotnie zmieniając wodę. Następnie żele umieszczano pomiędzy błonami celulozowymi w ramkach zestawu do suszenia (ICN). Żele suszono w 4°C przez 48 godz. Metodyka badań IV.11. Elektrotoprzeniesienie białek na Immbilon TM - PVDF (Western Blotting) Przygotowaną kasetę, składającą się z ramek z pleksi i kolejno ułożonych w nich warstw: gąbki, dwóch bibuł Whatmanna 3 mm, ImmobilonuTM- PVDF (Millipore), żelu poliakryloamidowego, dwóch bibuł Whatmanna 3 mm i gąbki, umieszczono w aparacie do elektroprzeniesienia (Mini Trans-Blot® , Bio-Rad) tak, aby żel znajdował się po stronie katody, natomiast ImmobilonTM- PVDF od strony anody. Elektroprzeniesienie prowadzono przy stałym natężeniu 100 mA przez noc w temperaturze 40C, w buforze o składzie: 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 20% metanol, pH 8.3. Białka przeniesione na Immobilon TM- PVDF nietrwale wybarwiono w 0.2% roztworze Ponceau S (Sigma) w 3% kwasie octowym, aby rozciąć ścieżki do dalszej analizy, a odbarwiono w wodzie dejonizowanej. Fragment z uwidocznionymi standardami HMW barwiono trwale w 0.1% roztworze czerni amidowej w 10% kwasie octowym i 45% metanolu, a odbarwiano w roztworze o takim samym składzie, nie zawierającym czerni. IV.12. Reakcja z lektynami Białka precypitatów lektynowych (metodyka badań punkt IV.6) z badanych linii komórkowych rozdzielono w żelu poliakrylamidowym i przeniesiono na membranę PVDF (metodyka badań punkt IV.7 i IV.8). Membrany inkubowano przez 1 godz. w buforze TBS (20mM Tris/HCl, 150mM NaCl, pH 7.5) zawierającym 1% albuminę surowicy wołowej (BSA) (Sigma) i 0.1% Tween-20 w celu zablokowania oddziaływań niespecyficznych. Następnie bloty inkubowano ze sprzężonymi z biotyną lektynami SNA lub MAL-II (rozcieńczenie lektyn 1 : 1 000, Vector) w buforze TBS z dodatkiem 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM CaCl2 na wytrząsarce kołyskowej (Omega), przez 1 godz. Membrany płukano 3 razy w buforze TBS z dodatkiem 0.1% Tween-20, a następnie inkubowane z ExtrAwidyną sprzęgniętą z alka liczną fosfatazą (AP) w TBS przez 1 godz. Wizualizacji białek SNA oraz MAL-II pozytywnych dokonano przy użyciu substratów dla alkalicznej fosfatazy błękit 4-nitrotetrazolowy (NTB) / fosforan Metodyka badań 5-bromo-4-chloro-3-indolilu (BCI) w buforze 0.1 M Tris/HCl, pH 9.5, zawierającym 0.05 M MgCl2 oraz 0.1 M NaCl. IV.13. Immunodetekcja podjednostek integrynowych .5 i ß1 Homogenaty komórkowe oraz białka precypitatów lektynowych (ilość rozdzielanego materiału - tabela 3) rozdzielono elektroforetycznie i przeniesiono na membranę PVDF. Membrany blokowano przez 1 godz. (wytrząsarka WL-972) w buforze TBS/Tween o składzie 20 mM Tris/ HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6, zawierającym 1% BSA i 0.1% Tween-20, następnie inkubowano przez 2 godz. z przeciwciałami skierowanymi przeciw podjednostkom integrynowym: a. Poliklonalnymi króliczymi anty-.5 (Chemicon) - rozcieńczenie 1 : 2 000 b. Monoklonalnymi mysimi anty-ß1 (Roche Biochemicals) – rozcieńczenie 1 : 2 000 Membrany płukano trzy razy buforem TBS / Tween, a następnie inkubowano przez 1godz. odpowiednio z poliklonalnymi antykróliczymi fragmentami Fab-AP (Chemicon) lub monoklonalnymi anty-mysimi fragmentami Fab-AP (Sigma) (rozcieńczenie przeciwciał 1 : 2 000). Wizualizację podjednostek integrynowych dokonano przy użyciu substratów dla alkalicznej fosfatazy NTB / BCI w buforze 0.1 M Tris/HCl, pH 9.5, zawierającym 0.05 M MgCl2 oraz 0.1 M NaCl. IV.14. Oczyszczanie integryny .5ß1 metodą chromatografii powinowactwa biologicznego do peptydu(Ac-Gly-Ala-c-(CysSS-Arg-Arg-Glu-Thr-Ala-Trp-AlaCysSS)- GlyAlaO (CH2CH2O) CH2CH2-NH2), wg Wobbe L i współ., (2006) Chromatografia powinowactwa to wysoce specyficzna metoda stosowana do oczyszczania białek, która opiera się na interakcjach między unieruchomionym ligan Metodyka badań dem a oczyszczaną molekułą (Lee WC i Lee KH, 2004). W chromatografii powinowactwa ligandem mogą być przeciwciała monoklonalne (Metha RJ i współ., 1998), białka receptorowe (Belkin VM i współ., 1990) lub peptydy (Nowlin DM i współ., 1993, Mogford JE i współ., 1997; Takagi J i współ., 2003). Syntezę specyficznego peptydu o sekwencji: Ac-Gly-Ala-c-(CysSS-Arg-Arg-GluThr- Ala-Trp-Ala-CysSS)-Gly-Ala-O(CH2CH2O)2CH2CH2-NH2 wykonała firma Lipopharm ze Zblewa wg Wobbe L i współ., (2006). Kolumnę CH-Sepharose-4B z peptydem wykonano według instrukcji (Affinity chromatography, Pharmacia Fine Chemicals, 1979). Peptyd wiąże specyficznie podjednostką integrynową .5 (Wobbe L i współ., 2006). IV.14.1. PRZYGOTOWANIE ZŁOŻA Do 2,6 g suchego podłoża CH – Sepharose 4B (Sigma) dodano 15 ml 1 mM HCl i inkubowano przez 15 min na rotatorze (RM-2). Uzyskany żel płukano 300 ml 1 mM HCl oraz buforem węglanowym o składzie 0.1 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, pH 8.0. Dwadzieścia mg peptydu rozpuszczonego w 6 ml buforu węglanowego dodano do CHSepharose- 4B, następnie inkubowano przez noc w 40C. Następnego dnia żel blokowano w buforze o składzie 0.1M Tris, 0.5 M NaCl, pH 8.0 przez 3godz. w 40C (rotator RM2), następnie złoże intensywnie płukano na zmianę buforami o wysokim pH (0.05 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 M NaCl) i niskim pH (0.05 M octan sodu, pH 4.0, 0.5 M NaCl). Otrzymany w ten sposób żel GD6-Sepharose przeniesiono w 0.1 M NaHCO3, pH 8.0 zawierającym 0.5 M NaCl do kolumny o wymiarach: wysokość kolumny – 10 cm, wysokość słupa żelu – 60 mm, średnica - 9 mm, szklany spiek G3. Przed rozdziałem żel równoważono 10 objętościami kolumny w buforze startowym: 50 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, pH 7.4, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2. IV.14.2. WARUNKI ORAZ PROFIL ROZDZIAŁU W pojedynczym eksperymencie na 5 ml gotowego złoża nakładano 2.5 mg homogenatu (metodyka badań punkt IV.4) w buforze startowym z dodatkiem 25 mM oktylu ß-D-glukopiranozydu. Inkubację z peptydem prowadzono przez noc w 40C. Następnie Metodyka badań niezwiązany materiał odpłukano buforem o składzie 50 mM Tris/HCl, pH 7.4 z dodatkiem 15 mM NaCl, 1mM MgCl2 oraz 1 mM MnCl2 zbierając frakcje po 2 ml. Prędkość przepływu ustalono na 1ml/min. Płukanie prowadzono do momentu, gdy absorbancja poszczególnych frakcji mierzona przy długości fali . = 280 nm wyniosła zero. Następnie peptyd inkubowano z eluentem o składzie 50 mM Tris/HCl, pH 7.4 z dodatkiem 15 mM NaCl, 20 mM EDTA oraz 25 mM oktylu ß-D-glukopiranozydu przez 1 godz., RT. Elucję prowadzono do momentu, gdy absorbancja zebranych 1ml frakcji mierzona przy . = 280nm wyniosła zero. Na koniec kolumnę płukano 1 M NaCl. Uzyskany w ten sposób materiał dializowano do wody przez 24 godz., 40C, następnie materiał zagęszczono na Speed Vac (Savant SVC 100H). Czystość otrzymanego materiału sprawdzono elektroforetycznie w warunkach nieredukujących (metodyka badań punkt IV.7). Oczyszczona integryna .5ß1 posłużyła do wykonania testu adhezji oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny za pomocą testu ELISA. IV.15. Desjalilacja integryny .5ß1 specyficznymi neuraminidazami Kwasy sjalowe (SA) wiązane terminalnie do N – glikanów usuwano za pomocą specyficznych neuraminidaz (tabela 4). Tabela 4. Ilości neuraminidaz oraz warunki desjalilacji białek Neuraminidaza Producent Specyfika Ilość enzymu Warunki desjalilacji .(2›3) Streptococcus pneumoniae Sigma SA.(2›3)Gal 0.01 U 1 godz., 370C .(2›3,6) Clostridium perfringens New England Biolabs SA.(2›3)Gal SA.(2›6)Gal/GalNAc 20 mU 16 godz., 370C .(2›3,6,8) Vibrio cholerae Calbiochem SA.(2›3)Gal SA.(2›6)Gal/GalNAc SA.(2›8)S.A. 6 mU 16 godz., 370C Metodyka badań Trzydzieści mikrogramów oczyszczonej integryny .5ß1 zagęszczono do sucha (Speed Vac Plus SC110 A, Savant), następnie rozpuszczono z dodatkiem jednego z wymienionych enzymów w 10µl buforu o składzie i pH zalecanym przez producenta. Inkubację prowadzono w 370C w termobloku (TDB 120). Po inkubacji próbki ponownie zagęszczono do sucha na Speed Vac. Uzyskany materiał podzielono: a. Część rozdzielono elektroforetycznie (metodyka badań punkt IV.7) w celu określenia procentowego udziału poszczególnych typów sjalilacji w N-glikanach obu podjednostkach integrynowych; b. Część po odpowiednim przygotowaniu posłużyła do wykonania testu ELISA. IV.16. Test ELISA - wiązanie oczyszczonej integryny .5 ß1 do fibronektyny Test wiązania integryny .5ß1 do fibronektyny wykonano w płytce 96 dołkowej pokrytej fibronektyną (BD, Fibronectin 96 Well Cell Adhesion Assay) wg Pocheć E i współ., (2003) z pewnymi modyfikacjami. IV.16.1. PRZYGOTOWANIE PŁYTKI Do każdego dołka w płytce 96 dołkowej dodano po 100 µl buforu do ELISA zawierającego 1 % BSA. Płytkę inkubowano w przez 1godz. w 370C w inkubatorze CO2. Bufor usunięto a płytka posłużyła do wykonania eksperymentu. IV.16.2. ADHEZJA OCZYSZCZONEJ INTEGRYNY .5 ß1 DO FIBRONEKTYNY Do każdego dołka dodano po 3 µg oczyszczonej integryny .5ß1 rozpuszczonej w 50 µl buforu do ELISA o składzie: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.1 mM CaCl2 i 25 mM oktyl ß-D-glukopiranozyd z dodatkiem 1 % BSA lub w buforze do ELISA o składzie 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 25 mM oktyl ß-D-glukopiranozyd, Metodyka badań 10 mM EDTA z dodatkiem 1 % BSA. Płytkę inkubowano przez 2 godz. w 370C w inkubatorze CO2, po czym płukano trzy razy 200 µl buforu do ELISA. Następnie do dołków dodano królicze poliklonalne przeciwciała skierowane przeciwko podjednostce integrynowej .5 (rozcieńczenie 1 : 1 000, Chemicon) w buforze do ELISA zawierającym 1 % BSA. Po godzinnej inkubacji w inkubatorze CO2, niezwiązane przeciwciała trzykrotnie odpłukano odpowiednim buforem do ELISA. Następnie dodano antykrólicze drugorzędowe przeciwciała sprzęgnięte z alkaliczną fosfatazą (rozcieńczenie 1 : 500, Chemicon), inkubację prowadzono przez 1 godz. w 370C. Płytkę płukano trzykrotnie odpowiednim buforem do ELISA, po czym dodano 50 µl 10 mM substratu (fosforanu paranitrofenylu, pNpp). Inkubację prowadzono przez noc w RT, absorbancję zmierzono przy długości fali: . = 405 nm. IV.16.3. ADHEZJA DESJALILOWANEJ INTEGRYNY DO FN Próbki zawierające oczyszczoną integrynę a5b1 (30 mg) desjalilowano (metodyka badań punkt IV.15), następnie zagęszczano do sucha (Speed Vac), rozpuszczano w odpowiedniej objętości buforu ELISA zawierającego 1% BSA i nałożono po 50 µl (po 3 µg białka) do płytki. Dalsza procedura, jak opisano w punkcie IV.16.2. IV.17. Cytometria przepływowa. Analiza ekspresji powierzchniowej podjednostki integrynowej .5 oraz kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc lub .2-3Gal Komórki zebrano (metodyka badań punkt IV.2.2.1), zawiesiny komórek każdej z badanych linii w ilości 5 x 105 w 50 µl PBS inkubowano przez 45 minut na lodzie (wytrząsarka WL-972) z: a. Przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko podjednostce integrynowej .5 (5 µl, klon SAM-1, Chemicon); b. Lektyną SNA-biotyna (Vector) 25 µg/ml; c. Lektyną MAL-II- biotyna (Vector) 25 µg/ml; Metodyka badań Komórki płukano trzy razy zimnym PBS. Zawiesiny komórek inkubowano z: a. Drugorzędowymi monoklonalnymi anty- mysimi fragmentami Fab2 (5 µl), sprzężonymi z FITC (Dako); b. Streptawidyną sprzężoną z FITC (Sigma). Inkubację prowadzono przez 45 minut w ciemności na lodzie (wytrząsarka WL972). W celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał lub lektyn, komórki płukano trzy razy zimnym PBS. Próbki rozpuszczono w 0.4 ml PBS i analizowano w cytofluorymetrze przepływowym FACSCalibur (Becton Dickinson). Uzyskane wyniki analizowano w programie CellQuest Pro, analiza 10.000 komórek znajdujących się w „bramce” polegała na porównaniu intensywności fluorescencji populacji komórek badanych z populacją komórek kontrolnych (odpowiednio z komórkami inkubowanymi z izotypowymi IgG1 (Dako) lub Streptawidyną – FITC (Sigma). IV.18. Mikroskopia konfokalna Barwienia wykonywano w płytkach 24 dołkowych. Na dno dołka nałożono sterylne szkiełko nakrywkowe pokryte fibronektyną (5 µg/ml, Sigma). Po osiągnięciu stanu konfluencji komórki pasażowano (metodyka badań punkt IV.2.2.1.), następnie liczono w komorze Bűrkera. Komórki wysiano na szkiełka w ilości 5 x 104 na ml pożywki, inkubowano przez noc, 370C w inkubatorze CO2. IV.18.1. BARWIENIE STRUKTUR SNA ORAZ MAA POZYTYWNYCH Do pożywki dodano po 4 µg/ml biotynylowanych lektyn SNA lub MAL-II (Vector), inkubację prowadzono przez noc w 370C. Następnego dnia komórki płukano 3 razy PBS w celu usunięcia niezwiązanych lektyn. Następnie komórki utrwalono 2% paraformaldehydem (PFA) przez 20 min w 370C. Po odpłukaniu utrwalacza do komórek dodano Streptawidyna–FITC w 2% BSA w PBS. Komórki inkubowano w ciemności Metodyka badań w komorze wilgotnej przez 2 godz., RT. Następnie szkiełka płukano 5 x 1ml PBS oraz 1ml MilliQ. Wybarwione preparaty zamknięto w Vectashield (Vector). IV.18.2. BARWIENIE PODJEDNOSTEK INTEGRYNOWYCH .5 LUB ß1 Komórki płukano 3 x PBS, następnie dodano I – rzędowe monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko podjednostce integrynowej .5 (rozcieńczenie 1 : 100, klon SAM-1) lub ß1 (rozcieńczenie 1 : 100) w 2% BSA/PBS. Po 24 godz. niezwiązane przeciwciała odpłukano PBS, preparaty utrwalono 2% PFA 10 min, 370C. Po tym czasie niezwiązane przeciwciała odpłukano PBS, a preparaty blokowano w 10% surowicy koziej (Normal Goat Serum (NGS), Sigma) w PBS, 30 min, RT. Komórki płukano 3 x PBS, do preparatów dodano II – rzędowych anty-mysich przeciwciał wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym Cy3 (1: 500) w 2% BSA/PBS i od tego momentu wszystkie czynności wykonywano w ciemności. Inkubację z przeciwciałami prowadzono przez 2 godz., RT. Po odpłukaniu niezwiązanego barwnika komórki płukano 5 x po 1ml PBS oraz 1 x 1ml MilliQ i zamknięto w Vectashield (Vector). IV.18.3. PODWÓJNE BARWIENIE PODJEDNOSTEK INTEGRYNOWYCH .5 ORAZ ß1 Do komórek bezpośrednio do pożywki dodano I – rzędowe monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko podjednostce integrynowej .5 (rozcieńczenie 1 : 100, klon SAM-1). Po 24 godz. niezwiązane przeciwciała odpłukano PBS, preparaty utrwalono 2% PFA. Do preparatów dodano II – rzędowe anty-mysie przeciwciała wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym Cy3 w rozcieńczeniu 1: 500 w 2% BSA/PBS i od tego momentu wszystkie czynności wykonywano w ciemności. Inkubację z przeciwciałami prowadzono przez 2 godz., RT. Po odpłukaniu niezwiązanego barwnika komórki blokowano w 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBS przez 30 min, RT. Następnie dodano I – rzędowe przeciwciała skierowane przeciwko podjednostce integrynowej ß1 w rozcieńczeniu 1: 100 w 2% BSA w PBS, inkubację prowadzono przez noc, RT. Po odpłukaniu niezwiązanych przeciwciał dodano II – rzędowe anty-mysie przeciwciała wyznakowane Alexa fluor488 (Invitrogen). Inkubację prowadzono przez 2 godz., RT; Metodyka badań po tym czasie preparaty płukano 5 x po 1ml PBS oraz 1 x 1ml MilliQ i zamknięto w Vectashield (Vector). IV.18.4. PODWÓJNE BARWIENIE PODJEDNOSTKI INTEGRYNOWEJ .5 LUB ß1 I STRUKTUR SNA LUB MAA POZYTYWNYCH Początek procedury – metodyka badań punkt IV.18.1; po odpłukaniu niezwiązanych do komórek lektyn dodano monoklonalne przeciwciała I - rzędowe skierowane przeciwko podjednostce integrynowej .5 (klon P1D6, Chemicon) lub monoklonalne przeciwciała rozpoznające podjednostkę integrynową ß1 (rozcieńczenie 1:100) w 2% BSA, inkubowano 2 godz., RT. Niezwiązane przeciwciała odpłukano PBS, komórki utrwalono w 2% PFA. Następnie komórki blokowano 30 min. 10% NGS, RT. Preparaty barwiono używając anty-mysich przeciwciał znakowanych Cy3 (rozcieńczenie 1 : 500, Jackson ImmunoResearch) w 2% BSA w PBS przez 3 godz., RT w komorze wilgotnej. Niezwiązane przeciwciała odpłukano 5 x 1 ml PBS oraz 1 x 1 ml MilliQ, preparaty zamknięto w Vectashield. IV.18.5. BARWIENIE WŁÓKIEN WIMENTYNY Komórki płukano 3 x PBS, następnie utrwalano 3% PFA, 10min, RT. Po trzykrotnym płukaniu PBS, permabilizowano błony komórkowe w 0.1% Tritonie X – 100 przez 3 min, RT. Preparaty płukano PBS, a następnie dodano I – rzędowe monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko wimentynie (rozcieńczenie 1 : 100, klon VIM13.2, Sigma) w 2% BSA/PBS, RT. Po 24 godz. niezwiązane przeciwciała odpłukano PBS, komórki blokowano 30 min. 10% surowicą kozią (Normal Goat Serum, Sigma), RT. Następnie dodano II – rzędowe anty-mysie przeciwciała wyznakowane barwnikiem fluorescencyjnym Cy3 (w rozcieńczeniu 1: 100) w 2% BSA/PBS. Inkubację z przeciwciałami prowadzono przez 2 godz., RT w ciemności. Po odpłukaniu niezwiązanego Metodyka badań barwnika komórki płukano 5 x po 1ml PBS oraz 1 x 1ml MilliQ i zamknięto w Vectashield. IV.19. MTT – enzymatyczny test żywotności komórek Profil wrażliwości komórek czerniaka na lektyny (SNA, MAA) oraz warunki desjalilacji określano testem cytotoksyczności z solami tetrazolowymi MTT. Zasada testu MTT opiera się na redukcji żółtego rozpuszczalnego bromku 3-(4,5dimetyloltiazolo- 2-ylo)-2,5-difenylo-tetrazolu (MTT) do nierozpuszczalnego w wodzie formazanu (Pieters R i współ., 1988). Reakcja ta przebiega jedynie w żywych komórkach dzięki aktywności oksydacyjno - redukcyjnej mitochondriów. Barwnik MTT ulega redukcji do barwnych, purpurowych kryształów formazanu. Oznaczanie aktywności cytotoksycznej z zastosowaniem barwnika MTT opiera się na założeniu, że tylko żywe komórki redukują barwnik MTT do kryształów formazanu, który wytrąca się na powierzchni komórek w postaci charakterystycznych „jeżyków”. Po rozpuszczeniu formazanu przy użyciu kwaśnego izopropanolu mierzona absorbancję, która odpowiada liczbie żywych komórek. Komórki zebrano przez trypsynizację, po odczepieniu się komórek od naczynia, trypsynę inaktywowano dodając pożywkę zawierającą 10% FBS. Następnie zawiesinę komórek wirowano (1 000 rpm, 40C, 5 min), 5 x 104 komórek wysiano do dołka w płytce 96-dołkowej, inkubację prowadzono w inkubatorze CO2, 24 godz. Wpływ poszczególnych czynników na żywotność komórek: lektyn (SNA lub MAA w stężeniu 10; 25; 50 oraz 100 µg/ml) lub neuraminidaz ([.-(2-3)-Neuraminiadase (Sigma), .-(2-3,6)- Neuraminidase (New England Biolabs) oraz .-(2- 3,6,8) Neuraminidaza (Calbiochem)] w buforze o pH 5.0, pH 6.0 lub pH 7.0) badano w 5-ciu powtórzeniach, uzyskane wyniki porównano z komórkami kontrolnymi. Komórki inkubowano z lektynami przez 24 godz. lub neuraminidazami – 1 godz., 4 godz. lub 6 godz. w inkubatorze CO2. Następnie do komórek dodano barwnik MTT (Sigma) w stężeniu 0.5 mg/ml PBS, po około 3 godz. inkubacji w inkubatorze CO2 na powierzchni komórek wytrąciły się kryształy formazanu. Wtedy do komórek dodano po 100 µl kwaśnego izopropanolu i inkubowano w ciemności przez 16 godz., RT (wytrząsarka WL-972). Absorbancję Metodyka badań zmierzono przy . = 570 nm za pomocą czytnika ELISA (ELX808IU, Bio-Tek). Na podstawie porównania wyników ustalono optymalne dawki lektyn jak również warunki desjalilacji. IV.20. Desjalilacja komórek Eksperyment wykonano wg Markwell MAK i Paulson JC, (1980) z pewnymi modyfikacjami. Po osiągnięciu stanu 70 – 80% konfluencji komórki zbierano za pomocą Cell Disociation Solution (Sigma) i wirowano (1 000 rpm, 40C, 5 min). Pelet komórek rozpipetowano w 1 ml pożywki, 20 µl komórek barwiono błękitem trypanu (Sigma) i policzono w komorze Bűrkera. 8,75 x 104 komórek zawieszono w 0.5 ml pożywki zawierającej 10% FBS i dodano odpowiednią sjalidazę. Ilości enzymu oraz warunki desjalilacji zebrano w tabeli 5. Tabela 5. Ilości neuraminidaz oraz warunki desjalilacji komórek Neuraminidaza Ilość enzymu Warunki desjalilacji .(2›3) z S. pneumoniae 3Mu 370C, 4 godz. .(2›3,6) z C. perfringens 12U 370C, 1 godz. .(2›3,6,8) z V. cholerae 27mU 370C, 6 godz. Po skończonej desjalilacji komórki wirowano, płukano pożywką i ponownie wirowano w celu usunięcia enzymu. Osad komórek rozpuszczono w nowej pożywce i wykonano dalsze eksperymenty. IV.21. Test adhezji komórek do fibronektyny Przed wykonaniem eksperymentów komórki głodzono w pożywce bez dodatku surowicy 30 min w 370C w inkubatorze CO2. Komórki zebrano stosując Cell Dissiciation Solution (Sigma), wirowano i rozpuszczono w pożywce w stężeniu 5 x 104 komórek/ml. Metodyka badań Komórki dodano w objętości 100 µl/dołek do płytek 96-dołkowych (BD Biochemicals) pokrytych fibronektyną uprzednio blokowanych termicznie zdenaturowaną 1% BSA. IV.21.1. ADHEZJA KOMÓREK LINII WM115 I WM266-4 DO FIBRONEKTYNY Adhezję prowadzono przez 1 godzinę w inkubatorze CO2. Komórki, które nie adherowały odpłukano, natomiast pozostałe utrwalono 96 % etanolem przez 10 min, RT. Po tym czasie płytkę płukano trzy razy PBS, następnie dodano 0.1% fiolet krystaliczny, inkubację prowadzono przez 25 min, RT. W kolejnym etapie płytkę płukano trzy razy w wodzie po czym pozostawiono do wyschnięcia. W celu permabilizacji błony komórkowej do płytki dodano 0.5 % Triton X – 100, płytkę inkubowano przez noc, RT (wytrząsarka WL-972). Absorbancję zmierzono przy . = 595nm za pomocą czytnika ELISA (ELX808IU, Bio-Tek) (względem próby ślepej – BSA i płytki na której komórki były wirowane). Niespecyficzną adhezję mierzono względem dołków pokrytych BSA. Jako 100% adhezji przyjęto wartość uzyskaną dla komórek po wirowaniu. IV.21.2. ADHEZJA KOMÓREK LINII WM115 I WM266-4 DO FIBRONEKTYNY W OBECNOŚCI LEKTYN I PO DESJALILACJI W eksperymentach kompetycyjnych przed wysianiem komórki inkubowano z monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko podjednostce integrynowej .5 (Chemicon) w rozcieńczeniu 2 µl/ml lub z lektynami: SNA (100 µg/ml) oraz MAA (25, 50 µg/ml) (Sigma), RT przez 30 minut (wytrząsarka RM-2). Dodatkowo wykonano test adhezji do fibronektyny komórek po desjalilacji (metodyka badań punkt IV.20). Zmiany siły adhezji komórek z eksperymentów kompetycyjnych oszacowano przez porównanie z adhezją komórek po wirowaniu (traktowanych jako 100% adhezji). Wszystkie wyniki podawano jako % adhezji w porównaniu do kontroli. Metodyka badań IV.22. Test gojenia ran po fibronektynie Po osiągnięciu konfluencji komórki pasażowano używając Cell Dissociation Solution, policzono w komorze Bűrkera i wysiano w ilości 5 x 105 na każdy dołek w płytce 6-dołkowej pokrytej fibronektyną (Becton Dickinson). IV.22.1. TEST GOJENIA RAN PO FIBRONEKTYNIE Po 24 godz. usunięto pożywkę, a na warstwie komórek wykonano rany przy użyciu 200 µl końcówki. Komórki płukano raz PBS i dwukrotnie pożywką zawierającą 10% płodową surowicę cielęcą. Następnie zostawiono przez 24 godziny w temperaturze 370C w inkubatorze CO2. IV.22.2. TEST GOJENIA RAN PO FIBRONEKTYNIE W OBECNOŚCI PRZECIWCIAŁ SKIEROWANYCH PRZECIWKO PODJEDNOSTCE INTEGRYNOWEJ . a5 ORAZ LEKTYN Przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko podjednostce integrynowej .5 w ilości 15 µg/dołek (klon SAM-1, Millipore) dodano do komórek, aby określić rolę integryny .5ß1 podczas zamykania ran. Lektyny SNA lub MAA (Sigma) w ilości – 10 µg, 25 µg, 50 µg i 100 µg/dołek dodano, aby określić rolę poszczególnych typów kwasów sjalowych podczas gojenia ran. Ocenę migracji komórek do wnętrza rany dokonano w mikroskopie odwróconym (Inverted Microscope Carl Zeiss Jena Telaval 3), a obszar każdej rany sfotografowano (aparat PowerShot A630, Canon). Średnią wartość zamknięcia rany oszacowano poprzez wielokrotne pomiary szerokości niezamkniętej przestrzeni w każdym eksperymencie. Zmiany stopnia migracji w eksperymentach kompetycyjnych określono przez porównanie uzyskanych wyników z migracją komórek kontrolnych (traktowanych jako 100% migracji). Wszystkie wyniki podano jako stopień zamknięcia rany. Metodyka badań IV.23. Test inwazji komórek Test inwazji komórek przez Matrigel wykonywano w płytkach 96 - dołkowych BD BioCoat™ Tumor Invasion System (Becton Dickinson). IV.23.1. PRZYGOTOWANIE PŁYTEK Płytkę FluoroBlock z Matrigel pozostawiono w RT przez 1godz., następnie do górnych komór dodano po 75 µl ciepłej pożywki, płytkę inkubowano przez 2 godz. w 370C. Po tym czasie pożywkę usunięto, a płytka była gotowa do wykonania eksperymentu. Jako kontroli do eksperymentu użyto płytki do badania migracji komórek nie pokrytej Matrigel (BD FluoroBlok). Przed eksperymentem do górnych komór dodano po 25 µl pożywki. IV.23.2. BADANIE INWAZJI KOMÓREK LINII WM115 I WM266-4 PRZEZ MATRIGEL Komórki, które osiągnęły stan 70 – 80% konfluencji głodzono przez 24 godz., barwiono DilC12 (Biotium) w stężeniu 1 µg/ml (BD Biosciences) przez 1godz. w inkubatorze CO2, następnie zebrano stosując Cell Disociation Solution. Komórki policzono w komorze Bűrkera. Do górnej części płytki wysiano po 12 500 komórek w pożywce zawierającej 10% FBS, a do dolnej dodano 200 µl pożywki zawierającą fibronektynę w stężeniu 25 µg/ml (Sigma) jako chemoatraktant. Komórki inkubowano przez 24 godz. w inkubatorze CO2, następnie mierzono absorbancję przy dł. fali 549/565nm (Ex/Em). Metodyka badań IV.23.3. BADANIE INWAZJI KOMÓREK LINII WM115 I WM266-4 PRZEZ MATRIGEL PO ICH DESJALILACJI LUB W OBECNOŚCI PRZECIWCIAŁ SKIEROWANYCH PRZECIWKO PODJEDNOSTCE INTEGRYNOWEJ .5 Podczas wykonywania eksperymentów kompetycyjnych, do dołków dodano monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko podjednostce integrynowej .5 (2 µl/ml) lub komórki po desjalilacji (metodyka badań punkt IV.20). Zmiany stopnia inwazji komórek w eksperymentach kompetycyjnych szacowano przez porównanie z wynikami uzyskanymi dla komórek nie traktowanych, które przyjęto jako 100% inwazji. Wszystkie wyniki podano jako % inwazji w porównaniu do komórek kontrolnych. Pomiar fluorescencji przy emisji . = 515nm dokonano w czytniku do fluorescencji (Bio-Tek). IV.24. Statystyka Ustalenie poziomu istotności pomiędzy wartościami średnimi wykonywano przy użyciu testu Duncan’s new multiple range. Wartości istotne przyjęto dla P<0.05. Wyniki V. Wyniki V.1. Ekspresja sjalilotransferaz w komórkach nowotworowych RT – PCR W komórkach nowotworowych często dochodzi do nadekspresji sjalilowanych glikanów na powierzchni komórkowej, co koreluje z nabywaniem zdolności inwazyjnych przez te komórki. Wiele badań potwierdza, że w komórkach nowotworowych ulega zmianom ekspresja specyficznie sjalilowanych struktur takich, jak sjalilowane antygeny Lewis, .2-6 sjalilowane struktury laktozaminylowe oraz kwasy polisjalowe, które mogą brać udział w oddziaływaniach międzykomórkowych (Dall’Olio F i współ., 2001). Rycina 12. Hodowla linii komórkowych czerniaka ludzkiego – pierwotnej WM115 oraz metastatycznej – WM266-4; skala w prawym dolnym rogu – 50µm; mikroskop odwrócony Axiovert 40 CFL Zeiss; aparat cyfrowy Canon PowerShot G10. Badanie ekspresji genów dla sjalilotransferaz wykonano stosując metodę RT-PCR. RT-PCR polega na użyciu mRNA jako matrycy, a synteza DNA zachodzi przy użyciu odwrotnej transkryptazy (RT). Test ten pozwala wykazać jedynie obecność badanego 73 Wyniki mRNA w komórce, dlatego ekspresja każdego z enzymów była porównywana z ekspresją genu referencyjnego dla GAPDH. Celem doświadczenia było zbadanie i porównanie ekspresji mRNA dla pięciu sjalilotransferaz, w dwóch liniach komórkowych czerniaka – pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 (rycina 12). Wyniki RT-PCR ilustruje rycina 13. Rycina 13. Ekspresja mRNA w komórkach pierwotnej linii WM115 (lewy) oraz metastatycznej WM266-4 (prawy) dla sjalilotransferaz. Produkty amplifikacji mają wielkość: SIAT3 (ST3Gal-III) – 307 pz, SIAT4C (ST3Gal-IV) – 320 pz, SIAT1 (ST6Gal-I) – 473 pz, STX (ST8Sia-II) – 399 pz, PST (ST8Sia-IV) – 436 pz, GAPDH (kontrola endogenna) – 596 pz; O – ślepa odczynnikowa; standardy pUC Mix Marker 8 składające się z prążków: 1118, 881, 692, 501, 489, 404, 331, 242, 190, 147, 111, 110, 67 pz. Wyniki testu RT-PCR dla komórek pierwotnej linii WM115 wykazały ekspresję mRNA dla wszystkich badanych sjalilotransferaz. Dodatkowo okazało się, że w tych komórkach ilość mRNA dla SIAT4C jest większa w porównaniu z komórkami linii metastatycznej WM266-4. W komórkach linii WM266-4 zwiększyła się ilość mRNA dla SIAT1, jak również zanikła ekspresja STX w porównaniu do linii pierwotnej (rycina 14). Produkty reakcji RT-PCR zostały rozdzielone w 2% żelu agarozowym. Względna ekspresja została obliczona, jako stosunek ilości produktów reakcji PCR do kontroli, którą stanowiło mRNA dla genu konstytutywnego GAPDH. Każda kolumna przedstawia średnie wartości uzyskane z trzech niezależnych eksperymentów. Wartości statystycznie istotne to: w obrębie linii WM115 – najwyższą względną ekspresję wykazuje gen SIAT4C a najmniejszą gen PST; w linii WM266-4 największą ekspresję wykazuje gen SIAT1 natomiast brak jest mRNA dla genu STX. 74 Wyniki Rycina 14. Densytometryczna analiza ekspresji mRNA dla pięciu sjalilotransferaz: SIAT3 (ST3Gal-III), SIAT4C (ST3Gal-IV), SIAT1 (ST6Gal-I), STX (ST8Sia-II) oraz PST (ST8Sia-IV). Istotności statystyczne (*) obliczono na poziomie P. 0.05 testem Duncana. Dodatkowo prezentowane wyniki wskazują na różnice w ekspresji genów dla sjalilotransferaz w komórkach pierwotnych i metastatycznych. W komórkach linii WM115 jest zwiększona ekspresja genów SIAT4C oraz STX przy zmniejszonej ekspresji genu SIAT1, w porównaniu z komórkami linii WM266-4. V.2. Immunodetekcja podjednostek integrynowych .5 i ß1. Precypitacja lektynami SNA lub MAA specyficznie rozpoznającymi kwasy sjalowe wiązane do N-glikanów Wiązanie się integryn ze składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej jest niezbędne podczas podstawowych procesów komórkowych takich jak różnicowanie, ruchliwość czy zdolność do podziałów komórkowych. Integryny uczestniczą również w procesach charakterystycznych dla komórek nowotworowych, takich jak inwazja, czy tworzenie przerzutów. Integryna .5ß1 jest głównym receptorem fibronektyny – glikoproteiny będącej elementem ECM. Uważa się, że jej ekspresja koreluje z transformacją nowotworową w wielu typach nowotworów (Bartik P i współ., 2008). Wyniki Celem przeprowadzonych doświadczeń było sprawdzenie ekspresji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 z użyciem specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko podjednostkom .5 lub ß1. Wyniki potwierdziły obecność badanych podjednostek w homogenatach komórkowych uzyskanych z komórek WM115 oraz WM266-4. Kolejnym etapem było więc sprawdzenie czy badane podjednostki integrynowe są sjalilowane .2-3Gal lub .2-6Gal/GalNAc. Ekspresję tych struktur badano za pomocą specyficznych lektyn z: Mackia amurensis (MAA) lub Sambucus nigra (SNA), wykonując precypitację tymi lektynami. Do rozdziału elektroforetycznego użyto następujących ilości białka: 10µg homogenatu komórkowego, 100µg precypitatu SNA oraz 250µg precypitatu MAA. Wyniki przedstawia rycina 15. Uzyskane wyniki sugerują, że badane podjednostki integrynowe uzyskane z obu linii komórkowych są sjalilowane .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc. Rycina 15. Wyniki immunodetekcji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 z homogenatów linii komórkowych WM115 oraz WM266-4; precypitacja lektynami SNA lub MAA; H – pełny homogenat komórkowy (10µg białka); SNA – materiał po precypitacji lektyną Sambucus nigra (100µg białka); MAA – materiał po precypitacji lektyną Mackia amurensis (250µg białka); SM – standardy masowe. Wyniki V.3. Chromatografia powinowactwa biologicznego z syntetycznym peptydem Ac-Gly-Ala-c-(CysSS-Arg-Arg-Glu-Thr-Ala-Trp-AlaCysSS)- Gly-Ala O(CH2CH2O)2CH2CH2-NH2 selektywnie wiążącym podjednostkę integrynową .5 Wiązanie się integryny .5ß1 z fibronektyną ułatwia komórce komunikację z ECM, w przypadku komórek nowotworowych kontakt ten może sprzyjać transformacji nowotworowej. Z uwagi na fakt, że integryna .5ß1 nie jest jedynym białkiem w błonie komórkowej wiążącym się do fibronektyny (Johansson S i współ., 1997), aby wykazać udział sjalilacji w interakcjach między integryną .5ß1 a fibronektyną konieczne było oczyszczenie tego receptora z homogenatów białkowych obu linii komórkowych metodą chromatografii powinowactwa biologicznego. Jako ligandu użyto syntetycznego cyklicznego peptydu o sekwencji: Ac-Gly -Ala-c-(CysSS-Arg-Arg-Glu-Thr-Ala-Trp-AlaCysSS)- Gly-Ala –O (CH2CH2O)2CH2CH2-NH2. Był to peptyd, który selektywnie i specyficznie wiązał się z podjednostką .5 integryny .5ß1 (Wobe L i współ., 2006). We wcześniej podejmowanych próbach izolacji, jako ligandy stosowano fibronektynę lub peptydy zawierające sekwencję RGD. Analizy wykazały jednak, iż uzyskiwany w ten sposób materiał był zanieczyszczony innymi integrynami wiążącymi się do FN lub rozpoznającymi tę sekwencję, takimi jak: .3ß1, .vß1 czy .vß3, co wymagało dalszego oczyszczania. Zastosowanie syntetycznego peptydu pomogło ominąć etap dalszego oczyszczania a jednocześnie częściowej utraty uzyskanego materiału. Miejsce wiążące zastosowanego do oczyszczania peptydu [c-(CSSRRETAWACSS)] i RGD na integrynie .5ß1 nakładają się, ale w przeciwieństwie do RGD, peptyd RRETAWAC wiąże się selektywnie tylko z podjednostką integrynową .5. Podjednostka integrynową .5 była oczyszczana z homogenatów komórkowych uzyskanych z dwóch linii komórkowych. Na kolumnę jednorazowo nakładano 2.5 mg homogenatu komórkowego. Na podstawie wartości absorbancji (. = 280 nm) dla zebranych frakcji ustalono profil rozdziału chromatograficznego (rycina 16). Stosując chromatografię powinowactwa biologicznego z około 50 mg homogenatów komórkowych uzyskanych z komórek linii WM115 oraz WM266-4 oczyszczono około 300 µg integryny .5ß1. Wyniki Profil rozdziału chromatograficznego podjednostki integrynowej .5 z homogenatu uzyskanego z komórek linii WM266-4 Absorbancja (.=280nm) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Płukanie Elucja 1 M NaCl * numer frakcji Rycina 16. Profil rozdziału chromatograficznego uzyskany na przykładnie podjednostki integrynowej .5 z linii WM266-4. Podobny profil rozdziału uzyskano dla podjednostki integrynowej oczyszczanej z linii WM115; płukanie – frakcje (2ml) 1 – 8, elucja – frakcje (1ml) 9 – 21, 1M NaCl – frakcje (2ml) 22 – 28. Frakcje z elucji o największej absorbancji zbierano i pulowano (*) – objętość około 8ml. W celu identyfikacji podjednostki integrynowej .5 w materiale uzyskanym z komórek linii WM266-4 uzyskanym po rozdziale chromatograficznym, uzyskany materiał zagęszczono i wykonano rozdział elektroforetyczny frakcji uzyskanych po płukaniu (P) i elucji (E). Jako kontroli pozytywnej użyto homogenatu komórkowego (rycina 17). Rycina 17. Immunodetekcja podjednostki integrynowej .5 w homogenacie komórkowym linii WM266-4 (H), frakcji po płukaniu (P) i frakcji po elucji (E). Masa podjednostki integrynowej – 160 kDa, SM – standardy masowe. Identyczne wyniki otrzymano Wyniki badając frakcje po płukaniu i elucji uzyskane z linii WM115; masa podjednostki integrynowej .5 wyniosła 159 kDa. Uzyskane wyniki potwierdziły obecność podjednostki .5 we frakcji po elucji, natomiast jej brak we frakcji po płukaniu, co świadczy o tym, że warunki oczyszczania receptor zostały dobrane optymalnie. W celu sprawdzenia czystości uzyskany materiał został rozdzielony stosując metodę SDS-PAGE w warunkach nieredukujących. Dziesięć mikrogramów homogenatu (H) komórek linii WM115 lub WM266-4 oraz 20µg materiału uzyskanego po elucji (E) rozdzielono w 8% żelu poliakryloamidowym. W celu wizualizacji rozdzielonych białek żel został wybarwiony błękitem kumazyny R250 (rycina 18). Rycina 18. Integryna .5ß1 uzyskana z homogenatu linii czerniaka skóry WM266-4 oczyszczona metodą chromatografii powinowactwa z peptydem; obraz białkowy homogenatu komórkowego (H) oraz eluatu (E) po wybarwieniu żelu po wykonaniu rozdziału SDS-PAGE, SM – standardy masowe. Identyczne wyniki otrzymano badając frakcje po elucji uzyskane z komórek linii WM115. Uzyskane wyniki sugerują, że w oczyszczonym materiale występuje integryna .5ß1, co potwierdza obecność białek o masie ok. 160 kDa i 140 kDa. Przeprowadzony eksperyment ujawnił jednak obecność innych białek o masie ok. 57 kDa oraz 37 kDa. Wyniki Prawdopodobnie są to produkty degradacji uzyskanego materiału, co zostanie szerzej omówione w rozdziale pt. dyskusja. V.4. Immunodetekcja oczyszczonych podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 po desjalilacji Na oddziaływania między integryną .5ß1 a fibronektyną w istotny sposób wpływa obecność kwasów sjalowych terminalnie wiązanych do N-glikanów podjednostek .5 i ß1. W celu wykazania udziału kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc oraz .2-8SA w adhezji oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny użyto trzech egzoglikozydaz, które specyficznie odcinają kwasy sjalowe. Uzyskany materiał rozdzielono elektroforetycznie, rozdzielone białka identyfikowano za pomocą specyficznych przeciwciał. Wyniki immunodetekcji podjednostek integrynowych .5 i ß1 przed oraz po desjalilacji przedstawia rycina 19. Rycina 19. Wyniki desjalilacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1; 1 – sjalidaza .2-3; 2 – sjalidaza .2-3,6; 3 – sjalidaza .2-3,6,8; H – (homogenat komórkowy) jako kontroli użyto podjednostek nie-desjalilowanych; SM – standardy masowe. Wyniki Na podstawie uzyskanych wyników obliczono masy podjednostek przed i po przeprowadzonej desjalilacji za pomocą programu UviMap (tabela 6). Tabela 6. Masy podjednostek integrynowych (masy w kDa), sjalidazy: .2-3 – odcinająca SA.2-3Gal; .2-3,6 – odcinająca SA.2-3Gal oraz SA.2-6Gal/GalNAc; .2-3,6,8 – odcinająca SA.2-3Gal, SA.2-6Gal/GalNAc oraz SA.2-8SA. Linia komórkowa / podjednostka bez desjalilacji .2-3 .2-3,6 .2-3,6,8 WM115 .5 159,0 148,6 136,7 130,2 ß1 140,0 135,7 131,0 124,5 WM266-4 .5 160,6 158,8 139,3 140,9 ß1 148,3 145,0 141,7 141,7 Na podstanie różnic w masie cząsteczkowej podjednostek obliczono szacunkową ilość reszt kwasów sjalowych wiązanych do N-glikanów występujących na poszczególnych podjednostkach integrynowych, przy czym jedna cząsteczka kwasu sjalowego ma masę 309,273 g. Uzyskane wyniki zebrano w tabeli 7. Tabela 7. Szacunkowa liczba reszt kwasów sjalowych występujących na poszczególnych podjednostkach integrynowych Linia komórkowa / podjednostka SA.2-3Gal SA.2-6Gal/GalNAc SA.2-8SA WM115 .5 34 38 21 ß1 14 15 20 WM266-4 .5 8 63 - ß1 11 11 - Uzyskane wyniki sugerują, że wyizolowana z komórek linii WM115 każda z podjednostek .5 oraz ß1 posiada podobną ilość reszt wszystkich badanych typów kwasów sjalowych. Jednocześnie podjednostka .5 posiada średnio dwa razy większą sjalilację .2-3Gal i .2-6Gal/GalNAc w porównaniu z podjednostką ß1. Dodatkowo do obu podjednostek wiązane są kwasy polisjalowe. Natomiast w komórkach linii WM266-4 wyizolowane podjednostki nie posiadają kwasów polisjalowych. Dodatkowo na podjednostce .5 występuje do ośmiu razy więcej reszt kwasów sjalowych wiązanych Wyniki .2-6Gal/GalNAc niż wiązanych .2-3Gal. Liczba kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal zmniejsza się w komórkach metastatycznych o 50%, w porównaniu z komórkami linii WM115. Nie ma natomiast różnic w ilości reszt kwasów sjalowych wiązanych w obrębie podjednostki ß1. Uzyskane wyniki korelują z wynikami uzyskanymi w reakcji RT-PCR. V.5. Adhezja oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny. Test ELISA Integryna .5ß1 jest głównym receptorem fibronektyny i odgrywa bardzo ważne funkcje podczas transformacji nowotworowej. Adhezja komórek do fibronektyny uwarunkowana jest tworzeniem funkcjonalnego receptora przez połączenie podjednostek integrynowych .5 i ß1. Jednocześnie siła tego wiązania jest modyfikowana przez wiele czynników, między innymi glikozylację (Isaji T i współ., 2004). Celem doświadczenia było sprawdzenie roli kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc oraz .2-8Sia integryny .5ß1 podczas adhezji do fibronektyny. Oczyszczoną z dwóch linii komórkowych integrynę desjalilowano używając trzech specyficznych egzoglikozydaz (metodyka badań punkt 14). Uzyskane wyniki przedstawiono na rycinie 20. 0 1 2 3 4 5 WM115 WM266-4 Absorbancja (. = 405 nm) Udział kwasów sjalowych w adhezji integryny .5ß1 do fibronektyny kontrola .2-3 .2-3,6 .2-3,6,8 * * Rycina 20. Adhezja oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny badana za pomocą testu ELISA. Kontrola – adhezja integryny .5ß1 nie poddanej działaniu enzymów do fibronektyny. Istotności statystyczne (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. Wyniki Uzyskane wyniki sugerują, że obecność kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal obniża adhezję receptora integrynowego izolowanego z linii WM115 do FN o 29%. Ta różnica jest istotna statystycznie. W komórkach metastatycznych linii WM266-4 sjalilacja nie odgrywała roli podczas adhezji oczyszczonej integryny .5ß1 do FN. V.6. Badanie ekspresji podjednostki integrynowej .5, kwasów sjalowych SNA oraz MAA pozytywnych na powierzchni komórek metodą cytometrii przepływowej Badania powierzchni komórek sugerują, że ekspresja integryny .5ß1 zwiększa się w różnych typach nowotworów, takich jak: wielkokomórkowy nowotwór płuc (Dingemans AMC i współ., 2010), nowotwór jelita grubego (Gong J i współ., 1997), co pozytywnie koreluje z transformacją nowotworową. Celem powyższego doświadczenia było zbadanie ekspresji podjednostki integrynowej .5 na powierzchni pierwotnych WM115 i metastatycznych WM266-4 komórek czerniaka ludzkiego. Dodatkowo określono, czy ekspresja badanej integryny zmienia się wraz z rozwojem choroby nowotworowej. Wynik przeprowadzonej analizy cytometrycznej ilustruje rycina 21. Rycina 21. Ekspresja podjednostki integrynowej .5 na powierzchni komórek linii WM115 oraz WM266-4; cytometr przepływowy FACSCalibur (BD Bioscience Sp. z o. o.) Wyniki Ekspresja badanej podjednostki integrynowej na powierzchni komórek pierwotnych różni się w porównaniu z komórkami metastatycznymi (rycina 22). Ekspresja podjednostki integrynowej .5 na powierzchni komórek czerniaka % komórek 100 80 60 40 20 0 * WM115 WM266-4 Rycina 22. Ekspresja podjednostki integrynowej .5 na powierzchni komórek linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 (wyrażona w % komórek). Istotności statystyczne (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że podczas transformacji nowotworowej wzrasta ekspresja podjednostki integrynowej .5 na powierzchni komórek linii metastatycznej WM266-4 aż o 43,3%. Badania prowadzone na mysich oraz na ludzkich komórkach nowotworowych potwierdzają, że występowanie kwasów sjalowych na powierzchni komórek koreluje z transformacją nowotworową (Seales EC i współ., 2005). Dlatego kolejnym etapem było zbadanie ekspresji kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal i .2-6Gal/GalNAc za pomocą lektyn MAA lub SNA. Eksperymenty rozpoczęto od użycia trzech różnych stężeń lektyny (10µg/ml, 25µg/ml oraz 30µg/ml) w celu określenia stężenia, które pozwoli wybarwić wszystkie reszty kwasów sjalowych występujące na powierzchni komórek (rycina 23). Wyniki Rycina 23. Ekspresja kwasów sjalowych wiazanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc na powierzchni komórek linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4; cytometr przepływowy FACSCalibur (BD Bioscience Sp. z o. o.) Wyniki Na podstawie uzyskanych wyników ustalono optymalne stężenie lektyn używane do kolejnych eksperymentów na 25µg/ml. Okazuje się, że wraz z rozwojem nowotworu wzrasta sjalilacja .2-6Gal/GalNAc N-glikanów o 26% natomiast sjalilacja .2-3Gal o 69%. W obu badanych liniach komórkowych wykazano większą ilość struktur MAA pozytywnych. Ekspresję kwasów sjalowych na powierzchni komórek przedstawia rycina 24. Ekspresja kwasów sjalowych na powierzchni komórek czerniaka Intensywność fluorescencji 700 600 500 400 * * WM115 300 WM266-4 200 100 SA.2-6Gal/GalNAc SA.2-3Gal Rycina 24. Ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc oraz .2-3Gal na powierzchni komórek czerniaka. Wartości istotne statystycznie (*) P. 0.05 obliczono stosując test Duncana. Z przeprowadzonych doświadczeń wynika, że integryna .5ß1 nie podlega ogólnej tendencji sjalilacji (wyniki IV.5, tabela 7). V.7. Badanie ekspresji integryny .5ß1, kwasów sjalowych oraz włókien wimentyny. Kolokalizacja podjednostek integrynowych z kwasami sjalowymi na powierzchni komórek - mikroskopia konfokalna Celem przeprowadzonych doświadczeń było zbadanie lokalizacji podjednostek integrynowych oraz kwasów sjalowych (rycina 25) oraz kolokalizacji podjednostek integryny .5, ß1 (używając specyficznych przeciwciał) oraz kwasów sjalowych wiąza Wyniki nych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc (używając specyficznych lektyn SNA lub MAA) na powierzchni badanych komórek (ryciny 26, 27 i 28). Rycina 25. Identyfikacja podjednostek integrynowych przeciwciałami anty-.5 lub antyß1 (Cy3) oraz kwasów sjalowych wiązanych SA.2-6Gal/GalNAc lub SA.2-3Gal (Alexa488) za pomocą lektyn SNA lub MAA w komórkach linii WM115 oraz WM2664; mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 META. Wyniki Rycina 26. Identyfikacja podjednostek integrynowych .5 lub ß1 (przeciwciałami anty.5, anty-ß1 – Cy3) na powierzchni komórek linii WM115 oraz kwasów sjalowych lektynami SNA (rozpoznającymi SA.2-6Gal/GalNAc) lub MAA (rozpoznającymi SA.23Gal) – Alexa488). Kolokalizacja kwasów sjalowych oraz podjednostek integrynowych (kolor biały); skala w prawym dolnym rogu – 50 µm; mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 META. Wyniki Rycina 27. Identyfikacja podjednostek integrynowych .5 lub ß1 (przeciwciałami anty.5, anty-ß1 – Cy3) na powierzchni komórek linii WM266-4 oraz kwasów sjalowych lektynami SNA (rozpoznającymi SA.2-6Gal/GalNAc) lub MAA (rozpoznającymi SA.2-3Gal) – Alexa488. Kolokalizacja kwasów sjalowych oraz podjednostek integrynowych (kolor biały); skala w prawym dolnym rogu – 50 µm; mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 META. Wyniki Rycina 28. Podwójne barwienie, komórki linii WM115 oraz WM266-4 znakowane przeciwciałami skierowanymi przeciwko podjednostkom integrynowym .5 (Cy3) lub ß1 (Alexa488). Kolokalizację obu podjednostek integrynowych zaznaczona kolorem białym; skala w prawym dolnym rogu – 50 µm; mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 META. Z przeprowadzonych doświadczeń wynika, że wszystkie badane struktury występują na powierzchni komórek czerniaka. Uzyskane zdjęcia poddano analizie w programie ImageJ, aby określić zależność współczynnika Pearsona (Rr) (rycina 29). Rycina 29. Wzór na obliczenie zależność współczynnika Pearsora (Rr). S1, S2 oznacza intensywność sygnału pikseli w kanałach 1 i 2; S1aver, S2aver oznacza średnią intensywność kanałów. Rr = 1 – pełna korelacja, Rr = 0 – przypadkowa korelacja, Rr = -1 – brak korelacji. (Zinchuk V i współ., 2007). Wyniki Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, iż w obu badanych liniach komórkowych obserwuje się kolokalizację podjednostek integrynowych .5 i ß1 z kwasami sjalowymi (rycina 30). 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 WM115 WM266-4 Wartość współczynnika Rr Mikroskpia konfokalna - kolokalizacja .5/SNA .5/MAA ß1/SNA ß1/MAA .5/ß1 Rycina 30. Kolokalizacja obliczona na podstawie zależności współczynnika Pearsona (Rr). Wimentyna jest białkiem włókna pośredniego (IF) o masie 57 kDa, biorącym udział w adhezji, migracji, przeżywalności oraz sygnalizacji komórkowej poprzez dynamiczną asocjacie/dysocjacje. Jej ekspresja w komórkach jest jednym z markerów ich zdolności do adhezji i migracji (Boudreau NL i Jones PL, 1999; Lahat G i współ., 2010). Celem kolejnego doświadczenia było sprawdzenie zdolności komórek czerniaka do tworzenia włókien wimentyny. Wynik przeprowadzonego eksperymentu ilustruje rycina 31. W obu badanych liniach komórkowych tworzą się włókna wimentyny, czyli komórki obu badanych linii wykazują zdolności do adhezji i migracji. Wyniki Rycina 31. Włókna wimentyny obecne w komórkach linii WM115 oraz WM266-4; mikroskop konfokalny Zeiss LSM 510 META. V.8. Test żywotności komórek – MTT. Ustalenie stężenia lektyn: SNA, MAA, barwnika Dil oraz warunków desjalilacji Ocenę przeżywalności komórek w obecności lektyn SNA, MAA, barwnika Dil oraz ustalenie warunków desjalilacji przeprowadzono stosując test żywotności komórkowej Cele przeprowadzonych eksperymentów to: a. Ustalenie odpowiednich stężeń lektyn SNA lub MAA, b. Ustalenie stężenia barwnika Dil, c. Ustalenie optymalnych warunków desjalilacji komórek. Z przeprowadzonych doświadczeń wynikało, że obecność lektyny SNA (25µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml) nie wpływała na żywotność komórek czerniaka (rycina 32). Wyniki 0 20 40 60 80 100 120 140 WM115 WM266-4 % komórek Wpływ stężenia lektyny SNA na żywotność komórek czerniaka kontrola 25µg 50µg 100µg Rycina 32. Wpływ stężenia lektyny SNA (µg/ml) na żywotnosć komórek czerniaka. Obecność lektyny MAA już w niższych stężeniach – 25µg/ml, 50µg/ml istotnie statystycznie obniżała żywotność komórek pierwotnej linii WM115, a w wyższej dawce (100µg/ml) również komórek linii WM266-4 (rycina 33). Wpływ stężenia lektyny MAA na żywotność komórek czerniaka 140 120 * * * * kontrola 10µg 25µg 50µg % komórek 100 80 60 40 20 100µg 0 WM115 WM266-4 Rycina 33. Wpływ stężenia lektyny MAA (µg/ml) na żywotność komórek czerniaka. Różnice istotne statystycznie (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. W zależności od dawki żywotność komórek linii WM115zmniejszyła się odpowiednio o 13%, 31% i 49%, a komórek linii WM266-4 o 22% w obecności lektyny w stężeniu 100µg/ml. Na podstawie uzyskanych wyników wybrano optymalne stężenia lektyn SNA oraz MAA do testów migracji oraz adhezji komórek. Wyniki Przed wykonaniem testu inwazji komórek sprawdzono również, czy barwnik Dil w istotny statystycznie sposób wpływa na żywotność komórek czerniaka. Do pożywki dodano barwnik Dil w stężeniach 1µg/ml, 5µg/ml oraz 10µg/ml. W komórkach pierwotnej linii WM115 zaobserwowano spadek żywotności przy dawce 5µg/ml - 23%, 10µg/ml - 31% natomiast w komórkach metastatycznej linii WM266-4 w dawce 5µg/ml - 46% a 10µg/ml aż o 50%. Na podstawie tych wyników ustalono optymalne stężenie barwnika Dil na 1µg/ml (rycina 34). Za pomocą testu MTT wykazano również, iż warunki desjalilacji nie wpływają istotnie na żywotność komórek obu badanych linii (rycina 34). Wpływ stężenia Dil oraz warunków desjalilacji na żywotność komórek czerniaka % komórek 140 120 100 * * * * kontrola 80 1µg 60 5µg 40 10µg 20 desjalilacja 0 WM115 WM266-4 Rycina 34. Wpływ stężenia barwnika Dil oraz warunków desjalilacji na żywotność komórek. Różnice istotne statystycznie (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. V.9. Desjalilacja komórek z wykorzystaniem specyficznych sjalidaz W celu określenia udziału kwasów sjalowych podczas inwazji komórek przez Matrigel, z powierzchni komórkowej usunięto specyficznie reszty kwasów sjalowych używając następujących sjalidaz hydrolizujących wiązania: .2-3 – SA.2-3Gal, .2-3,6 – SA.2-3Gal i SA.2-6Gal/GalNAc oraz .2-3,6,8 - SA.2-3Gal, SA.2-6Gal/GalNAc oraz Wyniki SA.2-8SA. Rezultat przeprowadzonej desjalilacji sprawdzono cytometrycznie wykonując barwienie powierzchni komórkowej za pomocą lektyn SNA oraz MAA (rycina 35). W wyniku przeprowadzonej desjalilacji wartość średniej intensywności fluorescencji spadła w stosunku do kontroli o około 60% dla komórek linii WM115 oraz o około 80% dla komórek linii WM266-4. Niestety nie udało się usunąć wszystkich reszt kwasów sjalowych z powierzchni komórkowej. Rycina 35. Znakowanie powierzchni komórek za pomocą lektyn: SNA oraz MAA po desjalilacji. Wyniki desjalilacji przedstawiono w postaci procentu średniej intensywności fluorescencji. V.10. Badanie poziomu metaloproteinaz w komórkach czerniaka – Zymografia Wyniki badania ekspresji metaloproteinaz MMP-2 oraz MMP-9 sugerują, iż ich poziom zwiększa się w komórkach guza, np. w nowotworze złośliwym piersi. Ilość MMP9 zwiększa się w nowotworze jelita grubego w porównaniu ze zdrową tkanką. Badania wykazują również większą ilość tej metaloproteinazy w liniach komórkowych czerniaka złośliwego w porównaniu z komórkami linii nieinwazyjnych. Podobnie wzrasta ekspre Wyniki sja MMP-2 w komórkach czerniaka co pozytywnie koreluje ze zdolnościami do tworzenia przerzutów (Hofman UB i współ., 2000; Cotignola J i współ.,2007). Celem tego doświadczenia była identyfikacja metaloproteinaz wydzielanych do pożywki przez komórki pierwotnej linii WM115 oraz metastatycznej linii WM266-4. Eksperyment wykonano wg opisu zamieszczonego w materiałach i metodach punkt 7. Wyniki przedstawia rycina 36. Rycina 36. Ekspresja metaloproteinaz wydzielanych do pożywki przez komórki linii pierwotnej WM115 i metastatycznej WM266-4 czerniaka. SM – standardy masowe. Okazuje się, że komórki linii pierwotnej czerniaka wydzielają jedynie Pro-MMP-2. Wraz z rozwojem choroby nowotworowej w komórkach linii metastatycznej dochodzi do zwiększonego wydzielania Pro-MMP-2 (68 kDa), jak również pojawia się MMP-9 (92 kDa). V.11. Udział kwasów sjalowych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc oraz integryny .5ß1 w migracji na fibronektynie – test gojenia ran Celem badań było określenie tempa gojenia ran na fibronektynie przez komórki pierwotnej linii czerniaka ludzkiego WM115 oraz metastatycznej linii WM266-4. Eksperyment przeprowadzono zgodnie z opisem umieszczonym w materiałach i metodach punkt 20. Komórki obu linii zostały wysiane do płytek pokrytych fibronektyną. Następ Wyniki nego dnia za pomocą żółtej końcówki wykonano po trzy rany (rycina 37). Każdą ranę mierzono w czasie T = 0 godz. oraz T = 24 godz. w dziesięciu miejscach i na tej podstawie określono średnią szerokość każdej z wykonanych ran. Celem doświadczeń było również określenie udziału integryny .5ß1 oraz kwasów sjalowych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc podczas gojenia ran na fibronektynie. Rycina 37. Wpływ integryny .5ß1 na tempo gojenia ran na fibronektynie komórek linii WM115 oraz WM266-6; skala w prawym dolnym rogu - 300µm; mikroskop odwrócony Axiovert 40 CFL Zeiss; aparat cyfrowy Canon PowerShot G10. Otrzymane wyniki wskazują, że komórki linii WM266-4 migrują dwa razy szybciej niż komórki linii pierwotnej. Z uwagi na fakt, iż integryna .5ß1 jest głównym receptorem fibronektyny postanowiono zbadać jej udział podczas gojenia ran na fibronektynie. W tym celu zastosowano przeciwciała monoklonalne, które specyficznie blokowały podjednostkę .5. Uzyskane wyniki sugerują, że integryna .5ß1 odgrywa rolę podczas migracji komórek linii pierwotnej WM115, gdyż po zablokowaniu badanej integryny tempo migracji spada o 30%. W odróżnieniu do komórek linii pierwotnej w komórkach metastatycznych, zablokowanie integryny .5ß1 nie wpływa na tempo gojenia ran (rycina 38). Wyniki Migracja komórek na fibronektynie, rola integryny .5ß1 * 70 60 50 40 kontrola 30 .5 * % zarośnięcia rany 20 10 0 Rycina 38. Tempo gojenia ran przez komórki linii pierwotnej i metastatycznej czerniaka ludzkiego. Istotności statystyczne (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. Następnie sprawdzono, jaki jest wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc na tempo gojenia ran na fibronektynie przez komórki badanych linii używając lektyny SNA (rycina 39). Wpływ sjalilacji .2-6 na migrację komórek na fibronektynie 120 * * * 100 80 % zarośniecia rany kontrola 60 25µg SNA 50µg SNA 40 20 100µg SNA 0 WM115 WM266-4 Rycina 39. Rola kwasów sjalowych wiązanych .2-6 Gal/GalNAc podczas gojenia ran na fibronektynie. Różnice istotne statystycznie (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. Wyniki Obecność lektyny reagującej z kwasami sjalowymi wiązanymi .2-6Gal/GalNAc zmniejsza tempo gojenia ran przez komórki linii WM266-4. Dodatkowo efekt ten jest zależny od dawki: w stężeniach 25 – 50µg SNA, tempo migracji spadło odpowiednio o 10% i 22%. Natomiast kwasy sjalowe SNA pozytywne nie uczestniczą podczas migracji komórek linii WM115. Analogiczne zbadano udział kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal na tempo gojenia ran przez obie linie komórkowe używając lektyny MAA. Okazało się, że sjalilacja .2-3Gal istotnie statystycznie zwiększa tempo gojenia ran przez komórki linii WM115 i WM266-4. Po zastosowaniu lektyny MAA tempo migracji komórek spadło w linii pierwotnej odpowiednio o 32% i 46% a metastatycznej o 23% i 39% w zależności od zastosowanej dawki (rycina 40). Wpływ sjalilacji .2-3 na migrację komórek na fibronektynie % zarośnięcia rany 120 100 80 * * * * kontrola 60 10µg MAA 40 25µg MAA 20 0 WM115 WM266-4 Rycina 40. Rola kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal podczas gojenia ran na fibronektynie. Różnice istotne statystycznie (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. Podsumowując, komórki metastatycznej linii WM266-4 charakteryzują się większą migracją na fibronektynie niż komórki WM115. W przeciwieństwie do komórek linii pierwotnej integryna .5ß1 nie bierze udziału w procesie gojenia ran przez komórki linii metastatycznej. W tej linii kwasy sjalowe wiązane .2-6Gal/GalNAc zwiększają tempo gojenia ran na fibronektynie, w odróżnieniu do komórek pierwotnej linii Wyniki WM115, gdzie nie uczestniczą w tym procesie. Natomiast ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal zwiększa tempo migracji komórek obu badanych linii czerniaka. V.12. Adhezja komórek czerniaka linii WM115 oraz WM266-4 do fibronektyny; wpływ kwasów sjalowych oraz udział integryny .5ß1 Celem było określenie różnic w adhezji pomiędzy komórkami linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 do fibronektyny, jak również określenie udziału integryny .5ß1 podczas tego procesu. Rycina 41 przedstawia otrzymane wyniki. Rycina 41. Adhezja komórek czerniaka do fibronektyny, udział integryny .5ß1. Różnice istotne statystycznie (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana Zablokowanie podjednostki integrynowej .5 obniża o 49% adhezję komórek pierwotnej linii WM115, natomiast o 52% metastatycznej linii WM266-4. Co ciekawe, transformacji nowotworowej towarzyszy wzrost adhezji komórek do fibronektyny. Komórki linii metastatycznej WM266-4 adherują o 23% mocniej niż komórki linii WM115. Wyniki Następnie sprawdzono wpływ kwasów sjalowych .2-6Gal/GalNAc oraz .23Gal na adhezję komórek linii pierwotnej i metastatycznej do fibronektyny (rycina 42). Rycina 42. Rola kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc oraz .2-3Gal podczas adhezji komórek do fibronektyny. Różnice istotne statystycznie (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. Wyniki wykazały, że wraz ze wzrostem stężenia lektyn spada adhezja komórek obu badanych linii. W przypadku lektyny SNA adhezja komórek linii WM115 obniża się odpowiednio o 57%, 84% oraz 76% w stosunku do kontroli, natomiast adhezja komórek linii WM266-4 odpowiednio o 58% a już przy stężeniu 25µg/ml o 100%. Podobnie lektyna MAA działa hamująco na adhezję komórek obu linii komórkowych, gdyż stężenie 10µg/ml hamuje adhezję komórek pierwotnej linii WM115 o 74%, natomiast komórek linii metastatycznej WM266-4 o 92%, stężenie 25µg/ml hamuję adhezję o 100%. Z tego doświadczenia wynika więc, że obecność kwasów sjalowych .26Gal/ GalNAc oraz .2-3Gal jest istotna podczas adhezji komórek czerniaka do fibronektyny. V.13. Badanie inwazji komórek Celem doświadczenia było określenie zdolności badanych komórek linii WM115 oraz linii WM266-4 do inwazji przez Matrigel oraz okreśenie roli kwasów Wyniki sjalowych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc i .2-8SA jak również integryny .5ß1 podczas tego procesu. Doświadczenie wykonywano w komorze Boydena, w której filtr był pokryty lub nie był pokryty przez Matrigel (kontrola), zgodnie z opisem zawartym w metodyce badań punkt IV.22. Procent komórek inwazyjnych został obliczony wg wzoru (rycina 43). Rycina 43. Wzór na obliczenie % komórek przechodzących przez Martigel; RFU – jednostka względnej fluorescencji (ang. relative fluorescence units) Otrzymane wyniki wykazały, że komórki obu badanych linii wykazują zdolność do inwazji. Jednocześnie badania wykazały, że nie ma różnic w tempie inwazji między komórkami linii pierwotnej WM115 i metastatycznej WM266-4. Aby wykazać udział poszczególnych kwasów sjalowych komórki obu linii komórkowych desjalilowano za pomocą specyficznych sjalidaz. Okazało się, że w komórkach pierwotnych tylko sjalilacja .2-3Gal odgrywa rolę podczas inwazji, gdyż brak tych struktur obniża inwazję o 21% (rycina 44). Wraz z transformacją nowotworową zmienia się również rola sjalilacji podczas inwazji, w komórkach linii metastatycznej WM266-4, inwazja komórek zwiększa się o 16% po usunięciu SA.2-6Gal/GalNAc. Usunięcie struktur SA.2-3Gal nie ma wpływu na inwazję. Więc z przeprowadzonego doświadczenia wynika, że w komórkach linii pierwotnej ekspresja kwasów sjalowych .2-3Gal sprzyja inwazji. Wraz z transformacją nowotworową zmienia się jednak rola sjalilacji podczas tego procesu. Sjalilacja .2-3Gal nie ma wpływu na inwazję, natomiast ekspresja struktur .26Gal/ GalNAc może w istotny statystycznie sposób obniżać inwazję. Zarówno w komórkach pierwotnych jak i metastatycznych sjalilacja .2-8SA nie odgrywa roli. W obu liniach komórkowych zaobserwowano zmniejszenie tempa inwazji komórek po zablokowaniu integryny .5. W komórkach linii pierwotnej zablokowanie tej podjednostki obniża inwazje o ok. 20% a w komórkach linii metastatyczne aż o 35%. Z tego wynika, Wyniki że integryna .5ß1 bierze udział w inwazji komórek czerniaka przez Matrigel, a jej udział zwiększa się wraz z transformacją nowotworową 0 20 40 60 80 100 120 140 WM115 WM266-4 % komórek Inwazja komórek - rola kwasów sjalowych oraz podjednostki integrynowej .5 kontrola .2-3 .2-3,6 .2-3,6,8 .5 * * * * * * * Rycina 44. Inwazja komórek obu badanych linii. Rola kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc, .2-8SA oraz integryny .5ß1 podczas inwazji komórek przez Matrigel. Różnice istotne statystycznie (*) obliczono na poziomie istotności P. 0.05 testem Duncana. Dyskusja VI. Dyskusja Prezentowane badania zostały przeprowadzone na dwóch liniach komórkowych czerniaka skóry. Pierwotna linia komórkowa WM115 oraz metastatyczna WM266-4 zostały wyprowadzone od tego samego pacjenta, co pozwoliło na bezpośrednie śledzenie zmian towarzyszących transformacji nowotworowej czerniaka. Opisane w poprzednich rozdziałach eksperymenty miały na celu wykazanie zmian na poziomie molekularnym i funkcjonalnym występującym podczas rozwoju skóry. VI.1. Zmiany ekspresji wybranych sjalilotransferaz zachodzące w komórkach podczas rozwoju czerniaka skóry W prezentowanej pracy zbadano ekspresję genów dla wybranych sjalilotransferaz: SIAT3 (ST3Gal-III), SIAT4C (ST3Gal-IV), SIAT1 (ST6Gal-I), STX (ST8Sia-II) oraz PST (ST8Sia-IV). Badane sjalilotransferazy odpowiadają za przeniesienie reszty kwasów sjalowych w pozycję terminalną N-glikanów. W komórkach pierwotnej linii WM115 występuje ekspresja mRNA dla wszystkich badanych sjalilotransferaz. W komórkach metastatycznej linii WM266-4 obecne są produkty genów SIAT3, SIAT4C,SIAT1oraz PST, a ekspresja genu STX zanika (wyniki, ryciny 13 i 14). W badanych komórkach wykazano brak istotnych różnic w ekspresji genów: SIAT3 oraz PST. Jednocześnie dochodzi do spadku ilości transkryptu SIAT4C, w porównaniu z komórkami pierwotnymi linii WM115. Otrzymane wyniki wykazały również, że przechodzeniu komórek czerniaka z pierwotnej do metastatycznej fazy wzrostu towarzyszy niewielki wzrost ekspresji genu SIAT1 w komórkach linii WM266-4. Powstanie i rozwój nowotworów złośliwych to procesy złożone, wieloetapowe, którym towarzyszy zmiana ekspresji różnych genów. Ilość i aktywność sjalilotransferaz może być regulowana na trzech poziomach: (i) transkrypcji (przez onkogen Ras), (ii) biosyntezy białka (glikozylacja enzymu), (iii) aktywności enzymu (właściwa lokalizacja, obecność jonów dwuwartościowych oraz (iiii) współzawodnictwo z innymi sjalilo Dyskusja transferazami o akceptor (Tsuji S 1996; Georgopoulou N i Breen KC, 1999; Seales EC i współ., 2003; Bellis SL, 2004). Kwasy sjalowe mogą być przyłączone do N- glikanów wiązaniami: .2- 3Gal, .2- 6Gal oraz .2- 8SA. Wiele sjalilotransferaz odpowiada za przeniesienie reszty SA w pozycję .2- 3Gal, struktury te odgrywają ważne role, szczególnie w komórkach układu odpornościowego oraz w nowotworach pochodzenia nerwowego (Yamamoto H i współ., 1997; Ellies LG i współ., 2002). Sjalilotransferazy ST3Gal-III oraz ST3Gal-IV to enzymy przenoszące reszty kwas sjalowego na N-glikany z utworzeniem wiązania .2-3Gal. (Petretti T i współ., 2000). Ekspresję genów SIAT3 i SIAT4C badano również w tkance nowotworu jajnika (Wang PH i współ., 2005) czy nowotworu szyjki macicy (Wang PH i współ., 2001). Uzyskane wyniki wykazały, że ekspresja mRNA dla ST3Gal-IV zmniejsza się w komórkach nowotworowych w porównaniu z komórkami zdrowej tkanki, co sugerowało, że zmniejszenie ekspresji mRNA dla sjalilotransferazy ST3Gal-IV w tkance nowotworowej jest związane z transformacją nowotworu jajnika oraz raka szyjki macicy, a jej badanie może być pomocne w celach prognostycznych. Jednocześnie inne doniesienia wykazały, że ekspresja SIAT4C wzrasta podczas transformacji nowotworowej żołądka (Jun L i współ., 2010). Przytoczone wyniki badań sugerują, że w trackie transformacji różnych typów nowotworów dochodzi do zmiany ekspresji genu SIAT4C, lecz ściśle zależą one od rodzaju tkanki. Wyniki przedstawione w tej pracy sugerują, że ekspresja genu SIAT3 w komórkach czerniaka skóry nie ulega zmianie podczas transformacji nowotworowej. Badania publikowane przez innych naukowców prezentują jednak odmienne rezultaty. Petretti T i współ., (2000) badał ekspresję genu SIAT3 w komórkach nowotworu jelita. Wyniki badań wykazują wzrost ekspresji genu SIAT3 w tkance nowotworowej w porównaniu ze śluzówką jelita. Jednocześnie ekspresja ST3Gal-III w komórkach nowotworu jajnika zwiększa się w porównaniu z ekspresja tej sjalilotransferazy w prawidłowej tkance (Wang PH i współ., 2005). Na podstawie przytoczonych badań można wnioskować, że poziom ekspresji genu SIAT3 w komórkach nowotworowych ściśle zależy od rodzaju tkanki, z jakiej wywodzi się nowotwór (Wang PH, 2006). Trudno porównać wyniki prezentowane w niniejszej pracy z doświadczeniami innych badaczy, ponieważ autorzy porównywali ekspresję genów w tkance zmienionej nowotworowo z ekspresją tych genów w tkance prawidłowej. Można wiec przypuszczać, że różnica w ekspresji genów w komórkach dwóch linii nowotworowych wywodzących się z następujących po sobie faz wzrostu może być znacznie mniejsza. Dyskusja W wiązaniu kwasów sjalowych .2- 6Gal uczestniczą dwa enzymy: ST6Gal-I, ST6Gal-II, aczkolwiek za sjalilację N-glikoprotein odpowiada sjalilotransferaza ST6Gal-I. Ten typ sjalilacji obserwuje się głównie w białkach komórek wątroby i nerek (Bellis SL, 2004). Wiele badań sugeruje, że ekspresja genu SIAT1 zwiększa się podczas transformacji różnych typów nowotworów, między innymi w raku jelita (Petretti T i współ., 2000), raku jajnika (Wang PH i współ., 2005; Christie DR i współ., 2008), czy raku szyjki macicy (Wang PH i współ., 2003). Przytoczone rezultaty są spójne z wynikami prezentowanymi w niniejszej pracy. Niestety nie ma informacji na temat ekspresji genów STX i PST oraz roli kwasów polisjalowych podczas rozwoju czerniaka skóry, dlatego interesującym wydawało się być zbadanie zmian ekspresji mRNA dla ST8Sia-II jak również ST8Sia-IV podczas tego procesu. W komórkach człowieka występuje pięć polisjalilotransferaz odpowiedzialnych za tworzenie kwasów polisjalowych (PSA), w których poszczególne reszty kwasu sjalowego wiązane są .2-8SA. W zależności od liczby cząsteczek kwasów sjalowych budujących dany homopolimer wyróżnia się (i) kwasy oligosjalowe, które są zbudowane z dwóch do sześciu cząsteczek kwasów sjalowych oraz (ii) kwasy polisjalowe, które są zbudowane z większej niż sześć cząsteczek kwasów sjalowych. ST8SiaII oraz ST8Sia-IV to dwie polisjalilotransferazy, których głównym substratem są N-glikany występujące na cząsteczce N-CAM. Ekspresja genu STX jest ściśle związana ze stadium rozwoju komórek, w odróżnieniu od ekspresji genu PST (Angata K i współ., 2002; Gabri MR i współ., 2002; Luchansky SJ i Bertozzi CB, 2004). Największa ekspresja kwasów sjalowych występuje na N-CAM w tkance embrionalnej, ale również ich ekspresja zwiększa się wraz z rozwojem nowotworów (Angata K i współ., 2002; Mendiratta SS i współ., 2005). Podsumowując, wyniki przedstawione w pracy jak i przytoczone doniesienia literaturowe wskazują, że spadek ekspresji genu SIAT4C oraz wzrost ekspresji genu SIAT1 może towarzyszyć rozwojowi czerniaka skóry. Jednocześnie różnice w ekspresji tych genów są na tyle niewielkie, że nie można je traktować, jako marker rozwoju tej choroby. Uzyskanie jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, czy ekspresja tych genów może być markerem czerniaka skóry wymaga dalszych badań. W komórkach metastatycznych linii WM266-4 w wyniku braku transkryptu dla STX nie występuje sjalilotransferaza ST8Sia-II, co może być wyznacznikiem komórek metastatycznych czerniaka skóry, jak również stanowić podstawę do złych rokowań dla pacjentów. W przypadku sjalilotransferaz ST3Gal-III oraz ST8Sia-IV ekspresja mRNA nie ulega zmianie Dyskusja podczas przechodzenia komórek czerniaka skóry z wertykalnej do metastatycznej fazy wzrostu. W świetle przytoczonych badań zmiana ekspresji tych genów wydaje się być zależna od typu komórki. Należy jednak pamiętać, że obecność mRNA w komórkach nie świadczy o aktywności poszczególnych enzymów. Ich aktywność pośrednio została zbadana za pomocą cystometrii przepływowej poprzez określenie ilości kwasów sjalowych na powierzchni komórek nowotworowych, co zostało opisane w podrozdziale VI.6. VI.2. Obecność integryny .5ß1 w pełnym homogenacie komórkowym, wstępne badanie profilu sjalilacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 Podczas transformacji nowotworowej zmienia ulega sjalilacja białek powierzchniowych, szczególnie w komórkach nowotworów złośliwych. Badania sugerują, że głównymi nośnikami N-glikanów są integryny, a integryna .5ß1 wydaje się odgrywać jedną z ważniejszych ról podczas rozwoju czerniaka skóry (Mortarini R i współ., 1992; Béliveau A i współ, 2000, Kuphal S i współ., 2005), dlatego zbadanie poziomu tej integryny stało się jednym z celów doświadczeń prezentowanych w pracy. Wstępne badania pozwoliły określić ekspresję podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 na poziomie białka w homogenatach komórkowych linii WM115 oraz WM266-4. Wynik immunodetekcji potwierdził obecność badanych podjednostek integrynowych w homogenatach komórkowych obu linii czerniaka skóry (wyniki, rycina 15). Masy podjednostek różniły się w zależności od linii, z której zostały wyizolowane, podjednostka integrynowa .5 posiada masę 159 kDa z linii pierwotnej WM115 oraz 160,6 kDa z linii metastatycznej WM266-4. Podjednostka integrynowa ß1 posiada masę 140,0 kDa z linii pierwotnej oraz 148,3 kDa z linii metastatycznej WM266-4. Zaobserwowane zmiany w ruchliwości elektroforetycznej podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 są prawdopodobnie wynikiem zmiany profilu N-glikozylacji obu podjednostek, która często towarzyszy transformacji nowotworowej (Bartik P i współ., 2008). Rozwojowi nowotworów często towarzyszy modyfikacja profilu sjalilacji białek obecnych w błonie komórkowej. Wydaje się, że jedną z najlepiej opisanych zmian to Dyskusja warzyszących transformacji nowotworowej jest nadekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal do N-glikanów podjednostek integrynowych (Kremser M i współ., 2008; Zhuo Y i współ., 2008; Lee M i współ., 2010). Jednocześnie ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal do N-glikanów podjednostek integrynowych w komórkach nowotworowych jest stosunkowo słabo poznana. Wstępne badanie występowania kwasów sjalowych na N-glikanach podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 wykonane zostało metodą precypitacji lektynami. Obecność kwasów sjalowych badano lektyną SNA (Sambucus nigra lectin), która specyficznie rozpoznaje kwasy sjalowe wiązane .2-6Gal/GalNAc oraz lektyną MAA (Maackia amurensis lectin), która specyficznie rozpoznaje kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal. Wyniki prezentowane w pracy potwierdzają obecność kwasów sjalowych wiązanych .26Gal/ GalNAc do N-glikanów występujących na powierzchni obu podjednostek integrynowych (wyniki, rycina 15). Podobne wyniki uzyskano po precypitacji lektyną MAA, aczkolwiek sygnał po wykonaniu immunodetekcji podjednostek integrynowych był słabszy (wyniki, rycina 15). Prawdopodobną przyczyną mniejszego sygnału mogły być warunki precypitacji lektyną MAA, gdyż w odróżnieniu od precypitacji lektyną SNA, wymagały zwiększenia ilości rozdzielanego materiału do 250µg, (ilość 100µg rozdzielanego materiału nie dała pozytywnej reakcji). Taki rezultat mógł być spowodowany tym, że precypitacja kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal lektyną MAA jest procesem dwuetapowym i być może pomimo zastosowania się do protokołu nie wszystkie podjednostki integrynowe jej uległy. Inną prawdopodobną przyczyną mogła być niska ekspresja badanych kwasów sjalowych na powierzchni podjednostek integrynowych. Podsumowując, obie badane podjednostki integrynowe są obecne w homogenatach linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 czerniaka skóry. N-glikany występujące na ich powierzchni posiadają kwasy sjalowe wiązane .2-6Gal/GalNAc oraz .2-3Gal. Wyniki precypitacji potwierdzono stosując sjalidazy, co zostało opisane w podrozdziałach VI.3. i VI.6. VI.3. Profil sjalilacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 Precypitacja lektynami SNA i MAA potwierdziła obecność kwasów sjalowych na N-glikanach podjednostek integrynowych .5 oraz ß1. Technika ta jednak nie pozwala na Dyskusja określenie ilości kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc. Jednocześnie nie można było wykazać obecności kwasów oligo- i polisjalowych na powierzchni podjednostek integrynowych, ponieważ nie dysponowano lektynami ani przeciwciałami, które specyficznie rozpoznają te struktury. Powyższe problemy sprawiły, że badanie profilu sjalilacji podjednostek integrynowych wykonano stosując desjalilację białka za pomocą specyficznych sjalidaz. Podjednostki integrynowe zostały oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa biologicznego. Do oczyszczenia integryny .5ß1, jako ligand stosowano cząsteczki fibronektyny, jej fragmenty lub syntetyczne peptydy zawierające sekwencję RGD. Ligandy zawierające sekwencję RGD są rozpoznawane i wiązane przez integrynę .5ß1 jak również inne podjednostki integrynowe. Dlatego izolacja podjednostki integrynowej .5 na ligandzie zawierającym sekwencję RGD wymagało zastosowania dodatkowych etapów, co wiązało się z utratą materiału (Tomselli KJ i współ., 1988; Forsberg E i współ., 1990; Argraves W, Tran H, 1994). W związku z tym integrynę .5ß1 oczyszczono stosując metodę jednostopniowej izolacji z zastosowaniem selektywnego, syntetycznego peptydu nie zawierającego sekwencji RGD (Wobbe LD i współ., 2006). Obecność i czystość integryny .5ß1 w oczyszczonym materiale badano wizualizując białka po rozdziale SDS-PAGE wykonując immunodetekcję podjednostki integrynowej .5. Jako kontroli pozytywnej użyto pełny homogenat komórkowy (wyniki, rycina 17 i 18). Wykonana immunodetekcja potwierdziła obecność podjednostki integrynowej w homogenacie oraz w materiale po elucji (rycina 15). Obraz białkowy homogenatu komórkowego oraz oczyszczonej podjednostki integrynowej potwierdził obecność badanych podjednostek w oczyszczonym materiale, jak również innych białek o masie ok. 57kDa oraz 33kDa. Jednocześnie porównując oba obrazy można wnioskować, że są to produkty degradacji, gdyż białka o tych masach nie występują w homogenacie komórkowym. Częściową degradację materiału mogła wynikać z tego, że jego czystość została sprawdzona po upływie długiego okresu czasu (około 18 miesięcy). Dlatego mimo, że zastosowana metoda zapewnia otrzymanie czystej podjednostki integrynowej .5 (Wobbe L i współ., 2006) jakość otrzymywanego materiału należałoby zbadać ponownie na świeżo oczyszczonym materiale. Integryna .5ß1 znajdująca się w oczyszczonym materiale występowała w konformacji natywnej, co było niezbędne do wykonania testu adhezji integryny do fibronektyny, o czym będzie mowa w rozdziale VI.4). Oczyszczona integryna .5ß1 posłużyła również do zbadania profilu sjalilacji pojedynczych podjednostek integrynowych z użyciem specyficznych sjalidaz. Do badania Dyskusja profilu sjalilacji oczyszczonej integryny .5ß1 stosowano trzy sjalidazy – sjalidazę .(2›3) uzyskaną z S. pneumoniae, sjalidazę .(2›3,6) uzyskaną z C. perfringens oraz sjalidazę .(2›3,6,8) uzyskaną z V. cholerae. Ilość kwasów sjalowych występujących na powierzchni podjednostek integrynowych określono na podstawie różnicy w ruchliwości elektroforetycznej podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 przed i po desjalilacji (wyniki, rycina 19, tabela 5). Prezentowane w niniejszej pracy wyniki sugerują, że transformacji nowotworowej czerniaka skóry towarzyszą zmiany profilu sjalilacji badanych podjednostek integrynowych. Podczas procesu nowotworzenia około pięciokrotnie zmniejsza się ilość reszt kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal, jednocześnie około dwukrotnie zwiększa się ilość reszt kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal do podjednostki integrynowej .5, w porównaniu z komórkami linii WM115. Ilość kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal do N-glikanów podjednostki ß1 nie ulega zmianie podczas transformacji nowotworowej czerniaka skóry. W odróżnieniu od podjednostek integrynowych wyizolowanych z pierwotnej linii komórkowej WM115 na podjednostkach z linii metastatycznej nie występują reszty kwasów polisjalowych. Ich brak może być spowodowany nieobecnością genu kodującego sjalilotransferazę ST8Sia-II w komórkach metastatycznej linii WM266-4 w wyniku braku ekspresji genu STX, opisanym w podrozdziale VI.1. Uzyskane wyniki sugerują również, że N-glikany występujące na podjednostkach .5 oraz ß1 prawdopodobnie nie są substratem dla sjalilotransferazy ST8Sia–IV. Przedstawione w niniejszej pracy wyniki dotyczące zmiany sjalilacji podjednostek integrynowych .5ß1 nie pokrywają się z wynikami publikowanymi przez innych autorów. Podczas transformacji nowotworowej obserwowano zmianę sjalilacji .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc integryn w wielu typach nowotworów, miedzy innymi w raku jelita grubego (Seales EC i współ., 2005; Lee M i współ., 2010), raku jajnika (Christie DR i współ., 2008), czy w białaczce (Semel AC i współ., 2002). Tylko nieliczne informacje na temat sjalilacji podjednostek integrynowych dotyczyły rozwoju czerniaka skóry (Nadanaka S i współ., 2001; Pocheć E i współ., 2003). Zespół Nakagava H (1996) dokonał analizy jakościowej N-glikanów podjednostki integrynowej .5 uzyskanej z ludzkiego łożyska. Badania wykazały obecność wielomannozowych oraz kompleksowych N-glikanów, jednocześnie N-glikany wielomannozowe stanowiły jedynie 1,5% wszystkich glikanów a około jedna piąta wszystkich N-glikanów nie była sjalilowane, w badanej puli wykazano obecność oligosacharydów z jedną, dwoma, trzema oraz czterema resztami kwasów sjalowych. Większość, gdyż ponad 80% reszt kwasów sjalo Dyskusja wych wiązana była .2-3Gal do N-glikanów (Nakagava H i współ., 1996). Jednocześnie wyniki uzyskane przez innych autorów wskazują, że podczas transformacji czerniaka skóry na powierzchni podjednostki integrynowej .5 mogą występować krótkie kwasy oligosjalowe składające się z reszt kwasów sjalowych wiązanych .2-8SA. Obecność kwasów oligosjalowych wykazano na N-glikanach podjednostki wyizolowanej z komórek ludzkiego czerniaka skóry linii G361. Obecność kwasów oligosjalowych podjednostki integrynowej .5 spowodowała zwiększenie adhezji integryny .5ß1 do fibronektyny (Nadanaka S i współ.,2001). Profil sjalilacji podjednostki integrynowej ß1 jest znacznie lepiej poznany. Wielu autorów wykazało zmiany sjalilacji .2-3Gal oraz .26Gal tej podjednostki podczas transformacji nowotworowej, np. wzrost sjalilacji .26Gal podjednostki integrynowej ß1 w nowotworze jelita grubego (Seales EC i współ., 2005) i komórkach gwiaździaka linii A172 i U87MG (Bartik P i współ., 2008). Jednocześnie w komórkach glejaka złośliwego opisano wzrost sjalilacji .2-3Gal (Yamamoto H i współ., 1997). Stosunkowo mało informacji dotyczy obecności kwasów oligoi polisjalowych wiązanych do N-glikanów podjednostek integrynowych. Najlepiej opisanym substratem dla sjalilotransferaz ST8Sia-II oraz ST8Sia-IV są N-glinany występujące na cząsteczkach N-CAM (Brocco M i współ., 2003; Hildebrandt H i współ., 2010). Natomiast Nadanaka S i współ. (2001) po raz pierwszy wykazali obecność kwasów oligosjalowych na N-glikanach podjednostki integrynowej .5. Analiza profilu sjalilacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 potwierdza wcześniej przedyskutowane wyniki sugerując, że sjalilacja podjednostek integrynowych ściśle zależy od typu komórek, z których powstaje nowotwór. Podsumowując, dzięki zastosowanej metodzie oczyszczania integryny .5ß1 udało się uzyskać czysty receptor występujący w konformacji natywnej, co było warunkiem koniecznym, aby zbadać funkcje kwasów sjalowych podczas adhezji integryny .5ß1 do fibronektyny. Prezentowane wyniki potwierdzają, że N-glikany występujące na powierzchni podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 mogą stanowić substrat dla ST3Gal-III, ST3Gal-IV, ST6Gal-I, ST8Sia-II oraz ST8Sia-IV. Jednocześnie transformacji nowotworowej towarzyszy wzrost sjalilacji .2-6Gal oraz spadek sjalilacji .23Gal podjednostki integrynowej .5 wyizolowanej z komórek metastatycznej linii WM266-4 w porównaniu z integryną wyizolowaną z komórek linii WM115, co jest zgodne z wynikami RT-PCR. Prezentowane w pracy wyniki sugerują również, że profil sjalilacji podjednostki integrynowej ß1 nie ulega zmianie. W komórkach metastatycznych obie podjednostki integrynowe nie posiadają kwasów polisjalowych, co być może Dyskusja wynika z braku transferazy ST8Sia-II. Tym nie mniej potwierdzenie tej hipotezy wymagałoby dalszych badań. Znaczenie funkcjonalne kwasów sjalowych wiązanych do N-glikanów podjednostek integrynowych .5 i ß1 zostało opisane w podrozdziale VI.4. VI.4. Adhezja oczyszczonej integryny .5ß1 do fibronektyny Integryna .5ß1 może być aktywowana przez czynniki fizjologiczne lub niefizjologiczne. Sygnały płynące z cytoszkieletu aktynowego utrzymują w konformacji aktywnej receptory integrynowe występujące na powierzchni komórek. Wyizolowana integryna .5ß1 może być aktywowana przez czynniki niefizjologiczne, takie jak przeciwciała, czy wysokie stężenie dwuwartościowych jonów Mg2+ oraz Mn2+ w cytoplazmie (Li F i współ., 2003). Integryna .5ß1 to specyficzny receptor fibronektyny, na jego siłę wiązania wpływa wiele czynników, jednym z nich jest obecność kwasów sjalowych. Kwasy sjalowe wiązane do N-glikanów występujących na powierzchni glikoprotein mogą wpływać na oddziaływania międzycząsteczkowe, między innymi na adhezję receptora do białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Wpływ kwasów sjalowych na adhezję oczyszczonej integryny .5ß1 badano wykonując test adhezji do FN techniką ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent assay). Uzyskane wyniki pokazują, że kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal mogą zmniejszać adhezję integryny .5ß1 wyizolowanej z komórek pierwotnych WM115 do fibronektyny (wyniki, rycina 20). Prezentowane w pracy dane pokazują również, że kwasy sjalowe występujące na N-glikanach integryny .5ß1 oczyszczonej z komórek metastatycznych linii WM266-4 nie mają wpływu na adhezje do FN. Otrzymane wyniki są o tyle interesujące, że w przeszłości niewiele badań dotyczyło roli kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-8Sia w adhezji integryny .5ß1 do fibronektyny. Wpływ kwasów sjalowych na siłę wiązania integryn z białkami ECM był wcześniej badany miedzy innymi w naszym zespole. Pocheć E i wsp. (2003) wykazała wpływ kwasów sjalowych występujących na N-glikanach integryny .3ß1 izolowanych z komórek czerniaka skóry na adhezję do fibronektyny. Usunięcie kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal, .2-6GalGalNAc oraz .2-8Sia zwiększyło adhezję oczyszczonej integryny .3ß1 do badanego podłoża. W późniejszych badaniach autorzy wykazali, że zmniejszona sjalilacja .2-6Gal/GalNAc inte Dyskusja gryny .5ß1 powodowała zmniejszenie adhezji do fibronektyny (Seales EC i współ., 2005). Prawdopodobną przyczyną uzyskania odrębnych wyników było badanie dwóch różnych receptorów integrynowych. Mimo, że integryny .5ß1 oraz .3ß1 były wyizolowane z komórek czerniaka skóry, prawdopodobnie wpływ kwasów sjalowych wiązanych do N-glikanów na adhezję zależy od receptora, na którym występują. Przyczyną rozbieżności w wynikach uzyskanych przez Seales EC i współ., (2005) i prezentowanych w pracy mogą wynikać z różnego źródła uzyskania receptora integrynowego. Podsumowując, prezentowane wyniki sugerują, że w komórkach metastatycznej linii WM266-4 kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal, .2-6Gal/GalNAc i .2-8SA do N-glikanów integryny .5ß1 nie mają wpływu na adhezję do fibronektyny. Natomiast kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal do N-glikanów integryny .5ß1 linii WM115 obniżają adhezję do tego podłoża, co sugeruje, że ich obecność może maskować miejsca wiązania się z FN. Mimo, że ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc zwiększa się na powierzchni podjednostki integrynowej .5 komórek linii metastatycznej WM266-4, nie odgrywa ona roli podczas adhezji do FN. VI.5. Ekspresja integryny .5ß1 na powierzchni komórek czerniaka skóry W komórkach nowotworowych często dochodzi do zmiany ekspresji białek adhezyjnych odpowiadających za ich oddziaływania ze składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej. Integryna .5ß1 należy do grupy niezbędnych receptorów uczestniczących podczas wielu potrzebnych do prawidłowego funkcjonowania procesów, np. wpływa na tempo proliferacji komórek, co wykazały badania prowadzone na komórkach nabłonka jelita. Nadekspresja podjednostki .5 wywołana w komórkach linii Caco-2 zwiększyła tempo ich proliferacji (Kuwada S i Li X, 2000). Doświadczenia prowadzone przez innych badaczy potwierdzają związek między ekspresją integryny .5ß1 a apoptozą komórek, co wykazano np. na komórkach mysiego czerniaka linii B16F10. Funkcję integryny blokowano przeciwciałami skierowanymi przeciwko podjednostce .5, co spowodowało brak adhezji tych komórek do fibronektyny. Badania wykazały, że utrata oddziaływań Dyskusja komórek z fibronektyną powoduje apoptozę komórek nowotworowych (Qian F i współ., 2005). W wielu typach nowotworów dochodzi do nadekspresji wspomnianego receptora na powierzchni komórek. Uważa się, że ekspresja integryny .5ß1 zwiększa się, gdyż w tych komórkach wydaje się odgrywać niezbędna rolę miedzy innymi podczas migracji i inwazji komórek nowotworowych a jej ekspresja decyduje o możliwości tworzenia przerzutów (Tani N i współ., 2003; Maschler S i współ., 2005). W prezentowanej pracy ekspresję integryny .5ß1 na powierzchni komórek czerniaka zbadano metodą cytometrii przepływowej stosując przeciwciała monoklonalne specyficznie rozpoznające podjednostkę integrynową .5. Uzyskane wyniki potwierdzają, że w badanych liniach komórkowych występuje ekspresja powierzchniowa integryny .5ß1 (wyniki, ryciny 21 i 22). Jednocześnie ekspresja integryny .5ß1 na powierzchni komórek czerniaka skóry zwiększa się wraz z przechodzeniem komórek z pierwotnej do metastatycznej fazy wzrostu. Otrzymane wyniki są zgodne z rezultatami uzyskiwanymi przez innych badaczy. Dingemans AMC i współ., (2010) wykazali nasiloną ekspresję integryny .5ß1 na powierzchni wielkokomórkowego nowotworu płuc. Podobne wyniki uzyskano badając nowotwór prostaty (Engl T i współ., 2005), czy czerniaka skóry (Przybyło M i współ.,2008). Podsumowując, prezentowane w pracy wyniki oraz cytowane doniesienia potwierdzają, że transformacji nowotworowej czerniaka skóry towarzyszy zwiększona ekspresja integryny .5ß1, co można uważać za czynnik będący podstawą do złych rokowań dla pacjentów chorych na czerniaka skóry. VI.6. Ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc na powierzchni komórek czerniaka skóry Badania ekspresji kwasów sjalowych występujących na powierzchni komórek czerniaka skóry wykonano stosując biotynylowane lektyny SNA i MAA znakowane barwnikiem fluorescencyjnym FITC metodą cytometrii przepływowej. Otrzymane wyniki potwierdzają, że na powierzchni obu badanych linii komórkowych dochodzi do Dyskusja ekspresji kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal i .2-6Gal/GalNAc do N-glikanów. Wyniki sugerują również, że wraz z transformacją nowotworową zwiększa się ekspresja badanych kwasów sjalowych na powierzchni metastatycznych komórek czerniaka skóry. Komórki linii WM266-4 posiadają o 26% więcej kwasów sjalowych wiązanych .26Gal/ GalNAc oraz o 69% kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal (wyniki, ryciny 23 i 24). Sugeruje to, że zwiększona ekspresja kwasów sjalowych towarzyszy transformacji nowotworowej czerniaka skóry, co jednocześnie może stanowić przesłankę złych rokowań dla pacjentów. Kwasy sjalowe poprzez ich ujemny ładunek oraz terminalną lokalizację na N-glikanach odgrywają istotne role podczas oddziaływań typu komórka – komórka, komórka – macierz ECM. Ich podwójna rola może polegać na ułatwianiu lub maskowaniu miejsc receptorowych (Batisse C i współ., 2004). Rozwojowi nowotworów oraz procesowi tworzenia przerzutów może towarzyszyć zmiana struktury a nawet ekspresji oligosacharydów występujących na powierzchni komórek (Przybyło M i współ., 2002). Lin S z zespołem (2002) opisał, że wzrost ekspresji kwasów sjalowych wiązanych .26Ga/ GalNAc w komórkach raka piersi towarzyszy transformacji nowotworowej. Hedlund M i współ., (2008) uzyskali podobne wyniki badając sjalilację indukowanych u myszy guzów, jak również Shaikh FM i współ., (2008) w komórkach nowotworu jelita grubego. Hsu CC i współ., (2005) wykazali natomiast zwiększoną sjalilację .2-3Gal N-glikanów występujących na glikoproteinach i glikolipidach komórek raka piersi. Podsumowując, otrzymane w pracy wyniki pozostają w zgodzie z rezultatami prezentowanymi przez innych badaczy. Komórki linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 wykazywały ekspresję kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc wiązanych do N-glikanów, jednocześnie transformacji nowotworowej czerniaka skóry towarzyszy wzrost ekspresji badanych kwasów na powierzchni komórek. W komórkach metastatycznej linii WM266-4 obserwuje się wzrost ilości kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal do N-glikanów pomimo, że poziom ekspresji genu SIAT3 nie zmienił się a ekspresja genu SIAT4C spadała, w porównaniu z komórkami WM115. Jednocześnie wzrost ekspresji mRNA dla ST6Gal-I wiązał się ze zwiększoną ilością kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc do N-glikanów. Otrzymane wyniki świadczą o tym, że ekspresja poszczególnych genów kodujących sjalilotransferazy na poziomie mRNA nie zawsze jest skorelowana z aktywnością białka w komórce. Dyskusja VI.7. Badanie powierzchni komórek czerniaka za pomocą mikroskopu konfokalnego Kolokalizację badanych podjednostek integrynowych .5 i ß1 z kwasami sjalowymi .2-3Gal oraz .2-6Gal wykonano z zastosowaniem mikroskopii konfokalnej. Ustalono optymalne warunki utrwalania oraz barwienia komórek czerniaka skóry stosując przeciwciała i lektyny jednocześnie. Początkowe doświadczenia opierały się na wykonaniu barwienia pojedynczej molekuły i wykazaniu jej ekspresji na powierzchni błony komórkowej. VI.7.1. EKSPRESJA PODJEDNOSTEK INTEGRYNOWYCH .5 LUB ß1 NA POWIERZCHNI KOMÓREK CZERNIAKA Obecność obu podjednostek integrynowych wykazano stosując metodę immunocytochemii z użyciem specyficznych I-rzędowych przeciwciał skierowanych przeciwko podjednostkom integrynowym .5 lub ß1 a następnie przeciwciał II-rzędowych znakowanych fluorochromem Cy3. Przy użyciu mikroskopu konfokalnego potwierdzono ekspresję obu badanych podjednostek na powierzchni błony komórek linii WM115 oraz WM266-4 (wyniki, rycina 25). Otrzymane wyniki są również zgodne z rezultatami uzyskanymi z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Podsumowując, wykazano ekspresję obu podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 na powierzchni błony komórkowej. Jednocześnie udało się dobrać optymalne warunki reakcji z przeciwciałami w celu uzyskania dobrej jakości zdjęć. VI.7.2. EKSPRESJA KWASÓW SJALOWYCH WIĄZANYCH .2-3GAL ORAZ .26GAL/ GALNAC Celem przeprowadzonych doświadczeń było ustalenie optymalnych warunków stosowanych podczas barwienia komórek za pomocą lektyn oraz wykazanie obecności kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc do N-glikanów występu Dyskusja jących na glikokoniugatach w błonie komórkowej. Obecność kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc zbadano stosując specyficzne biotynylowane lektyny SNA lub MAA oraz znakowaną fluorochromem Alexa488 awidynę. Obie badane linie komórkowe wykazują ekspresję kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal oraz .26Gal/ GalNAc wiązanych do glikoprotein i glikolipidów występujących na powierzchni komórek czerniaka skóry (wyniki, rycina 25). Podsumowując, zastosowana procedura barwienia zapewniła uzyskanie dobrej jakości zdjęć. Jednocześnie uzyskane wyniki ekspresji kwasów sjalowych potwierdziły rezultaty uzyskane stosując cytometrię przepływową. VI.7.3. KOLOKALIZACJA PODJEDNOSTEK INTEGRYNOWYCH .5 ORAZ ß1 Z KWASAMI SJALOWYMI Wyniki poprzednich eksperymentów potwierdziły ekspresję badanych struktur na powierzchni komórek. Celem kolejnych doświadczeń było wykazanie kolokalizacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 oraz kwasów sjalowych .2-3Gal oraz .26Gal/ GalNAc na powierzchni komórek czerniaka skóry. W pierwszym etapie przeprowadzono reakcję z lektyną, a następnie reakcję z przeciwciałami, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu glikanów występujących na powierzchni przeciwciał (metodyka, punkt 17.4). Podjęto próbę wykazania kolokalizacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 z kwasami sjalowymi .2-3Gal, oraz .2-6Gal/GalNAc wiązanymi do N-glikanów powyższych podjednostek integrynowych w komórkach linii pierwotnej WM115 (rycina 26) oraz metastatycznej WM266-4 (rycina 27). Jednocześnie wykazano kolokalizację podjednostek integrynowych .5 oraz ß1 (rycina 28). Kolokalizację dwóch cząsteczek obliczono stosując współczynnik Pearsona (Rr) (rycina 29). Szczególne trudności pojawiły się podczas wykonania zdjęć po jednoczesnym barwieniu komórek lektynami oraz przeciwciałami. Podczas wykonywania podwójnego barwienia reakcja z przeciwciałami była znacznie słabsza, niż w przypadku, gdy stosowane były tylko przeciwciała. Być może lektyny używane, jako pierwsze sterycznie blokują dostęp przeciwciałom do epitopów występujących na łańcuchu podjednostki .5 lub ß1. Trudno jednoznacznie stwierdzić, czym to zjawisko było spowodowane, gdyż tego typu problemy nie występowały w przypadku barwienia tylko lektyną lub tylko przeciwciałem oraz podczas podwójnego barwienia przy użyciu dwóch przeciwciał. Wytłumaczenie Dyskusja powyższego problemu utrudnia fakt, że w literaturze nie ma doniesień dotyczących kolokalizacji podjednostki integrynowej z N-glikanami. Na podstawie otrzymanych wyników nie można jednoznacznie stwierdzić, czy badane cząsteczki występują razem. Jednocześnie prezentowane wyniki są bardzo obiecujące i wymagają dalszej optymalizacji, gdyż nikt do tej pory nie podjął się próby pokazania kolokalizacji podjednostek integrynowych z kwasami sjalowymi stosując mikroskopię konfokalną. Podsumowując, prezentowane w pracy wyniki wykazują obecność podjednostek integrynowych .5 i ß1 oraz ekspresję kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .26Gal/ GalNAc na powierzchni komórek linii WM115 oraz WM266-4. VI.8. Obecność włókien wimentyny w komórkach czerniaka skóry linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 Wimentyna to białko budujące filamenty pośrednie typu III, które występuje w komórkach charakteryzujących się zdolnością do migracji i adhezji (McInroy L i Maatta A, 2007; Zhang X i współ., 2009). Komórki czerniaka linii WM115 oraz WM266-4 barwiono na obecność włókien wimentyny aby sprawdzić, czy mogą wykazywać zdolność do adhezji do fibronektyny i migracji po fibronektynie. Prezentowane rezultaty wykazały obecność włókien wimentyny w komórkach obu badanych linii czerniaka skóry. Na tej podstawie można było założyć, że obie te linie komórkowe są zdolne do adhezji oraz migracji. VI.9. Oznaczenie aktywności metaloproteinaz metodą zymografii Das S i współ., (2008) wykazał, że obecność integryny .5ß1 może powodować zwiększoną ekspresję oraz aktywację metaloproteinaz MMP-2 oraz MMP-9. Ponieważ w prezentowanej pracy wykazano ekspresję integryny .5ß1 w obu badanych liniach oraz wzrost jej ekspresji w linii metastatycznej WM266-4, zbadano ekspresję metaloprotei Dyskusja naz metodą zymografii. Na podstawie masy cząsteczkowej można było założyć, że w uzyskanym materiale są obecne dwie metaloproteinazy: Pro-MMP-2 uwalnianą przez komórki linii WM115 oraz Pro-MMP-2 i MMP-9, które są uwalniane do pożywki przez komórki nowotworowe linii WM266-4 (rycina 36). Jednocześnie ekspresja metaloproteinazy Pro-MMP-2 zwiększa się w komórkach linii metastatycznej WM266-4. Ekspresja MMP-2 i MMP-9 była intensywnie badana wielu badaczy, ich aktywność jest istotna podczas tworzenia nowych naczyń, adhezji, migracji oraz inwazji komórek wielu typów nowotworów, miedzy innymi jelita grubego (Zeng H i Briske-Andersen B, 2005; Luo Y i współ., 2009), czy komórek nowotworu piersi (Shen Q i współ., 2010). Ekspresja MMP-2 oraz MMP-9 badano w tkance czerniaków uzyskanych ze spojówki. Jak wykazały badania ekspresja tych metaloproteinaz towarzyszy transformacji nowotworowej, gdyż ich ilość zwiększa się w porównaniu ze zdrową tkanką (Kim HK i współ., 2010). Podobne wyniki uzyskali również Kondratiev S i współ., (2008) i Saladi S i współ., (2010). Podsumowując, prezentowane wyniki jak i przytoczone doniesienia literaturowe sugerują, że transformacji nowotworowej czerniaka skóry towarzyszy wzrost ekspresji metaloproteinazy Pro-MMP-2 oraz ekspresja de-novo metaloproteinazy MMP-9. Wydaje się, że pojawienie się MMP-9 w komórkach nowotworowych czerniaka skóry może być pośrednio związana ze zwiększoną ekspresją integryny .5ß1 w tych komórkach (Kuphal S i współ., 2005). Dodatkowo pojawienie się metaloproteinazy MMP-9 prawdopodobnie może być markerem komórek nowotworowych czerniaka skóry. Aczkolwiek potwierdzenie tych wniosków należałoby poprzeć wykonując dalsze badania. Metaloproteinazy niszczą białka macierzy zewnątrzkomórkowej oraz błony podstawnej ułatwiając komórkom migrację i inwazję. Wpływ zwiększonej ekspresji badanych metaloproteinaz został pośrednio określony podczas wykonywania funkcjonalnych testów migracji i inwazji komórek. Wyniki tych testów zostały opisane w podrozdziałach VI.10 i VI.12. VI.10. Migracja komórek czerniaka skóry na fibronektynie Proces migracji komórek jest opisywany, jako wieloetapowy, powtarzający się cyklicznie ciąg zdarzeń. Podczas ruchu komórki dochodzi do polaryzacji, rozciągnięcia Dyskusja błony komórkowej, utworzenia wiązania miedzy receptorami komórkowymi a białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, przesuwania się ciała komórkowego oraz odczepienia krawędzi komórki. Ruch ten jest generowany miedzy innymi poprzez polimeryzację aktyny. Uważa się, że proces odczepienia się komórek limituje tempo migracji komórkowej (Geho DH, i współ., 2005). Test gojenia ran stanowi model, który pozwala badać polaryzację komórek, etapy generowania sił, przyczepność podczas poruszania się komórek rosnących w hodowli konfluentnej. Podczas procesu gojenia ran komórek na fibronektynie jedną z głównych ról odgrywa integryna .5ß1 (Friedl P i Gilmour D, 2009). Proces transformacji nowotworowej był wielokrotnie badany, lecz jego mechanizm do tej pory nie jest do końca wyjaśniony. Istnieją dwie podstawowe teorie próbujące przybliżyć to zagadnienie. Paget S (1898) stworzył model ziarna i gleby (ang. seed and soil), który zakłada, że przerzuty są tworzone na skutek interakcji komórek z otaczającą tkanką. Inna teoria mówi, że metastazy tworzą się zgodnie z kierunkiem przepływy krwi. Teoria mechaniczna opisana została przez Ewing J, (1928). Wiele publikowanych badań potwierdza zasadność obu przytoczonych teorii. Proces tworzenia przerzutów można podzielić na kilka etapów: początkowo komórki oddzielają się od guza pierwotnego, migrują aktywnie po okolicznej tkance, przechodzą przez naczynia krwionośne bądź limfatyczne i poruszają się wraz z krwią lub limfą. Podczas morfogenezy, migracji komórek układu immunologicznego przy okazji odpowiedzi immunologicznej, czy tworzenia przerzutów dochodzi do migracji pojedynczych komórek. Migracja pojedynczych komórek umożliwia wzajemne pozycjonowanie w tkankach. Komórki mogą również poruszać się w grupach, jest to proces zwany migracją zbiorową. Podczas migracji zbiorowej komórki pozostają ze sobą połączone, co wpływa na stopień organizacji tkanki. Taki typ migracji spotyka się podczas embriogenezy, formowania organów, jak również podczas inwazji. Komórki połączone są połączeniami przylegającymi i poruszają się w sposób synchronizowany (Friedl P i Gilmour D, 2009). Badania prowadzone przez innych badaczy opisują występowanie migracji grup komórek w przypadku komórek czerniaka skóry linii WM-115 (Klein RM i Aplin AE, 2009) jak i WM266-4 (Elson-Schwab I i współ., 2010). Gojenie ran po urazie to proces złożony, zależy od skoordynowanego udziału wielu typów tkanek, komórek oraz mediatorów (Han YP i współ., 2001). Migracja komórek nowotworowych jest regulowana przez działanie enzymów niszczących macierz zewnątrzkomórkową np. metaloproteinazy, kontakty typu komórka – komórka oraz komórka – macierz zewnątrzkomórkowa (Yamada KM i współ., 2003). Badania wykazują, że podczas proce Dyskusja su gojenia ran komórek po fibronektynie jedną z głównych ról odgrywa integryna .5ß1 (Friedl P i Gilmour D, 2009). IV.10.1. ROLA INTEGRYNY .5ß1 PODCZAS MIGRACJI KOMÓREK CZERNIAKA NA FIBRONEKTYNIE Celem przeprowadzonych doświadczeń było określenie i porównanie tempa migracji komórek linii WM115 oraz WM266-4 po fibronektynie z równoczesną próbą określenia roli integryny .5ß1 stosując test gojenia ran. Uzyskane wyniki sugerują, że komórki z fazy metastatycznej WM266-4 wykazują dwa razy szybsze tempo gojenia ran po fibronektynie niż komórki z fazy pierwotnej WM115. Metaloproteinazy uczestniczą w migracji komórek, a ponieważ komórki linii WM266-4 wykazały zwiększoną ekspresje Pro-MMP-2 oraz MMP-9, być może zwiększona produkcja tych metaloproteinaz ułatwia komórkom linii metastatycznej migrację po fibronektynie. Integryna .5ß1 jest uważana za główny receptor fibronektyny. Udział integryny .5ß1 zbadano stosując test gojenia ran z zastosowaniem monoklonalnych przeciwciał specyficznie blokujących podjednostkę .5. Wyniki pokazały, że integryna .5ß1 uczestniczy podczas migracji komórek linii WM115, gdyż tempo gojenia ran spada o 30% w stosunku do kontroli (wyniki, rycina 37). Po zablokowaniu tej podjednostki w komórkach metastatycznej linii WM266-4 nie obserwuje się zmiany tempa gojenia ran. Sugeruje to, że integryna .5ß1 nie uczestniczy w procesie gojenia ran komórek z metastatycznej fazy wzrostu po fibronektynie. Prawdopodobnie podczas transformacji nowotworowej komórki zmieniają mechanizm poruszania się po podłożu, jedną prawdopodobnych przyczyn są zmiany sjalilacji. Badania Roman J i współ. (2010) polegały na analizie tempa migracji komórek mysiej linii Lewis raka płuc z wyciszonym genem kodującym podjednostkę integrynową .5. Komórki z wyciszoną podjednostką wykazały zmniejszone tempo migracji po fibronektynie. Podobne rezultaty otrzymano badając tempo migracji fibroblastów błony maziowej po wyciszeniu genów podjednostki integrynowej .5. Brak integryny .5ß1 powodował zwiększenie tempa migracji komórek (Lowin T i współ., 2009). Odmienne wyniki otrzymano prowadząc badania na komórkach nowotworu trzustki linii MiaPaCa Dyskusja 2. Po wyłączeniu genu dla podjednostki integrynowej .5 zwiększyło się tempo migracji badanych komórek (Walsh N i współ., 2009). Wyniki uzyskane przez innych badaczy nie doprowadziły do jednoznacznych wniosków. Prawdopodobnie udział integryny .5ß1 podczas gojenia ran po fibronektynie jest komórkowo specyficzny. Podsumowując wyniki prezentowane w pracy wykazują, że komórki z fazy metastatycznej WM266-4 wykazują dwa razy szybsze tempo migracji po fibronektynie niż komórki z fazy pierwotnej WM115, co może mieć związek ze zwiększoną ekspresją MMPs. Integryna .5ß1 bierze udział podczas gojenia ran po fibronektynie komórek pierwotnej linii WM115 gdyż jej zablokowanie zmniejsza tempo migracji o 30%, lecz widać również, że w tym procesie mogą również uczestniczyć inne białka, jednocześnie badana integryna nie ma wpływu na tempo migracji komórek metastatycznej linii WM266-4. VI.10.2. UDZIAŁ KWASÓW SJALOWYCH WIĄZANYCH .2-3GAL ORAZ .2-6GAL/GALNAC W MIGRACJI KOMÓREK CZERNIAKA Celem prezentowanych doświadczeń było określenie roli kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc do glikokoniugatów w błonie komórkowej podczas migracji komórek po fibronektynie. Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .26Gal/ GalNAc do N-glikanów na migrację komórek po fibronektynie badano stosując lektynę SNA. Optymalne dawki lektyny zostały ustalone stosując test żywotności komórek MTT (wyniki, rycina 32). Otrzymane wyniki pokazały brak wpływu tych kwasów sjalowych na tempo migracji komórek pierwotnej linii WM115 po fibronektynie (wyniki, rycina 39). Natomiast w komórkach linii metastatycznej WM266-4 ich związanie obniża tempo migracji komórek w zależnym od dawki odpowiednio o 10% i 22%. Przy dawce 50 µg/ml lektyna SNA prawdopodobnie wiąże wszystkie reszty kwasów sjalowych. Uzyskane wyniki wskazują na zależny od dawki hamujący wpływ lektyny SNA na migrację komórek linii WM266-4. Prezentowane wcześniej wyniki badań wykazały zwiększoną ekspresję kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc na powierzchni komórek linii WM266-4. Terminalnie zlokalizowane kwasy sjalowe posiadają ładunek ujemny, który może znosić oddziaływania miedzy molekułami. Zwiększona Dyskusja sjalilacja pozytywnie koreluje ze wzmożoną migracją na fibronektynie komórek linii WM266-4. Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal na tempo migracji komórek badano używając lektyny MAA, specyficznej dla tego typu wiązań. Wyniki sugerują, że obecność kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal zwiększa tempo migracji komórek obu badanych linii czerniaka skóry na fibronektynie (wyniki, rycina 40). Zwiększenie ekspresji kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal prawdopodobnie wiąże się ze złymi diagnozami dla pacjentów poprzez zwiększenie tempa migracji komórek a tym samym ułatwienie tworzenia przerzutów. Wyniki wpływu lektyny MAA wskazują na zależny od dawki hamujący wpływ lektyny na tempo gojenia ran przez komórki linii WM266-4. W przypadku komórek linii WM115 zastosowanie lektyny w dawce 10µg/ml obniża tempo migracji komórek. Lektyna w stężeniu 25µg/ml obniża tempo gojenia ran po fibronektynie, jednocześnie ta dawka obniża żywotność komórek linii WM115. Hamowanie migracji jest widoczne już przy dawce 10µg/ml, więc efekt ten nie jest wynikiem obniżenia żywotności komórek. Reasumując, obniżenie tempa migracji komórek WM115 po fibronektynie jest spowodowane związaniem kwasów sjalowych a nie toksycznym działaniem lektyny MAA. Otrzymane wyniki sugerujące, że ekspresja kwasów sjalowych zwiększa tempo migracji komórek na fibronektynie są w zgodzie z obserwacjami innych autorów. Christie DR i współ., (2008) badał wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc na migrację komórek raka jajnika linii OV4 po kolagenie typu I. Komórki linii OV4 charakteryzowały się brakiem ekspresji genów dla ST6Gal-I. Aby wykazać wpływ kwasów sjalowych na migrację, komórki linii OV4 były transferowane wektorem lentiwirusowym zawierającym gen ST6Gal-I. Zwiększona ekspresja ST6Gal-I w komórkach linii OV4 spowodowała zwiększenie sjalilacji a w rezultacie wzrost migracji komórek po kolagenie typu I (Christie DR i współ., 2008). Zespół Chiricolo M i współ., (2006) badał wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc na tempo gojenia ran komórek nowotworu jelita. Badania polegały na określeniu wpływu nadekspresji genu ST6Gal-I wywołanej w komórkach linii SW948 na tempo gojenia ran. Komórki posiadające zwiększoną ilość kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc migrowały szybciej w porównaniu z komórkami kontrolnymi nie wykazującymi nadekspresji (Chiricolo M i współ., 2006). Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal na migrację badano na komórkach raka trzustki. W komórkach dwóch linii nowotworu trzustki Capan- 1 oraz MDAPanc-28 wywołano nadekspresję ST3Gal-III, co pozytywnie korelowa Dyskusja ło z ilością reszt kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal na powierzchni komórek. Zwiększona sjalilacja powodowała zwiększenie tempa migracji komórek nowotworowych po kolagenie typu I (Pérez-Garay M i współ., 2010). Podsumowując, obecność kwasów sjalowych sprzyja migracji po fibronektynie. Kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal zwiększają tempo gojenia ran przez komórki pierwotnej linii WM115 oraz metastatycznej linii WM266-4. Jednocześnie podczas gojenia ran przez komórki linii metastatycznej czerniaka skóry uczestniczą również kwasy sjalowe wiązane .2-6Gal/GalNAc, których obecność sprzyja migracji. Zwiększenie tempa migracji komórek może być wynikiem zniesienia oddziaływań międzycząsteczkowych przez ładunek ujemny nadawany cząsteczkom przez kwasy sjalowe. VI.11. Adhezja komórek czerniaka skóry do fibronektyny W procesie inwazji komórek można wyróżnić trzy etapy: (i) adhezję komórek nowotworowych do składników ECM poprzez receptory adhezyjne występujące na powierzchni komórek, (ii) wydzielanie enzymów proteolitycznych, które trawią otaczającą macierz oraz (iii) migrację komórek poprzez zniszczoną macierz (Bozzuto G i współ., 2010). Oddziaływania między komórkami a białkami macierzy zewnątrzkomórkowej odgrywają ważne role podczas regulacji wielu procesów, włączając adhezję komórek. Integryny to glikoproteiny, które wiążą komórki a dokładniej cytoszkielet aktynowy ze składnikami ECM. Podczas adhezji komórek do białek ECM następuje przekazywane informacji generowanych przez macierz zewnątrzkomórkową (sygnalizacja outside-in). Podczas tego procesu przekazywane są sygnały niezbędne do rozpłaszczania czy migracji komórek. W odróżnieniu od sygnalizacji outside-in podczas sygnalizacji inside-out sygnały są generowane we wnętrzu komórki, które mogą wpływać miedzy innymi na konformację receptorów komórkowych a tym samym ich aktywność (Niu G i Chen X, 2011). Integryny nie wykazują aktywności enzymatycznej, dlatego też wiążą się z innymi białkami, które są zdolne kontrolować adhezję komórek. Z integrynami mogą wiązać się białka wiążące integryny (np. talina), białka adaptorowe nie posiadające właściwości enzymatycznej (winkulina, paksylina, .-aktynina) oraz enzymy, takie jak kinaza płytek przylegania (FAK - ang. focal adhesion kinase) oraz kinazy z rodziny SRC Dyskusja (Berrier AL i Yamada KM, 2007). Struktury, przez które komórki wiążą się z białkami ECM można podzielić na ogniska przylegania (ang. focal complex), łatki przylegania (ang. focal adhesions) oraz włókna przylegania (ang. fibrillar adhesions). Ich klasyfikacja opiera się na wielkości, kształcie, lokalizacji na powierzchni komórki, składzie oraz dynamice. Ogniska przylegania to struktury dynamiczne, powstają w pierwszych etapach adhezji komórek. Ich asocjacja i dysocjacja występuje na krawędzi wiodącej komórki podczas wysunięcia błony komórkowej, w procesie zwanym płynnością adhezji. Łatki przylegania powstają, jako małe struktury (około 1µm2) na obwodzie rozpłaszczonych komórek lub na krawędzi wiodącej komórek migrujących. Ich pojawienie się świadczy o rozluźnieniu się siateczki aktynowej. Występują w komórkach, które poruszają się wolno, są bardziej stabilne niż ogniska przylegania i przejawiają wolniejsze tempo przebudowy. Znajdują się głównie na obwodzie komórki, ale mogą występować również w jej centralnej części. Włókna przylegania powstają z łatek przylegania. Są to wydłużone struktury związane z włókienkami fibronektyny, które są zlokalizowane centralnie w komórce. W odróżnieniu od łatek przylegania nie łączą się z włóknami naprężeniowymi, tylko z włóknami aktynowymi, są zbudowane głównie z tensyny oraz integryny .5ß1 (Le Clainche C i Carlier MF, 2008). VI.11.1. WPŁYW INTEGRYNY .5ß1 NA ADHEZJĘ KOMÓREK CZERNIAKA SKÓRY DO FIBRONEKTYNY Celem doświadczeń było zbadanie adhezji komórek czerniaka skóry do fibronektyny oraz określenie roli integryny .5ß. Integryna .5ß1 uczestniczy podczas tworzenia włókien naprężeniowych, ponadto indukuje tworzenie włókien fibronektyny (Pae SH i współ., 2008). Włókna przylegania tworzą się poprzez wiązanie tensyny oraz integryny .5ß1 z utworzeniem włókien fibronektyny, co reguluje siłę adhezji komórek do fibronektyny (Yamada KM i współ., 2003, Roca-Cusachs P i Gauthier N, 2009). Otrzymane wyniki wykazały, że komórki linii pierwotnej WM115 adherują o 23% słabiej do fibronektyny niż komórki linii metastatycznej, co być może jest związane z większą ekspresją integryny .5ß1 na powierzchni komórek linii WM266-4. Dodatkowo w komórkach linii metastatycznej zwiększa się ilość metaloproteinaz wydzielanych do pożywki, co być może ma wpływ na adhezję komórek do fibronektyny, acz Dyskusja kolwiek te hipotezy wymagają dalszych badań. Uzyskane wyniki sugerują, że zwiększenie adhezji komórek czerniaka do fibronektyny towarzyszy transformacji nowotworowej czerniaka skóry. Wpływ integryny .5ß1 na adhezję komórek czerniaka skóry do fibronektyny badano stosując monoklonalne przeciwciała, które specyficznie blokują podjednostkę .5. Przedstawione wyniki wykazują, że integryna .5ß1 uczestniczy podczas adhezji komórek obu linii czerniaka do fibronektyny (wyniki, rycina 41). Zablokowanie podjednostki integrynowej .5 zmniejsza adhezję komórek obu linii w podobnym procencie, ale nie całkowicie, co wskazuje na udział innych białek, np. .vß3 (van der Flier A i współ., 2010). Prezentowane w pracy wyniki potwierdzają wcześniejsze obserwacje, że ekspresja integryny .5ß1 zwiększa się na powierzchni komórek metastatycznej linii WM266-4. Integryna .5ß1 jest opisywana, jako główny receptor fibronektyny. Badania innych autorów sugerują, że zwiększenie adhezji komórek do fibronektyny może być związane z większą ekspresję integryny .5ß1 na powierzchni komórek nowotworowych. Udział integryny .5ß1 w adhezji komórek przewlekłej białaczki szpikowej wykazał zespół Li F, (2003). Komórki linii K562 rosną w zawiesinie, integryna .5ß1 jest jedynym obecnym receptorem fibronektyny, lecz występuje on w formie nieaktywnej. Po jego aktywacji z użyciem specyficznych aktywujących przeciwciał komórki wykazują adhezje do tego podłoża (Li F i współ., 2003). Podobne rezultaty uzyskał zespół van der Flier A (2010), które wykazały zmniejszoną adhezję komórek z wyciszonym genem kodującym podjednostkę .5. Badania Lowin T i współ., (2009) dotyczyły wpływu hormonów sterydowych na ekspresję i funkcje integryny .5ß1 występującej na powierzchni fibroblastów błony maziowej. Po zastosowaniu kortyzolu wykazano wzrost ekspresji integryny .5ß1 w badanych komórkach. Jednocześnie komórki ze zwiększoną ekspresją integryny .5ß1 wykazywały mocniejszą adhezje do fibronektyny niż komórki kontrolne (Lowin T i współ., 2009). Udział integryny .5ß1 w adhezji do fibronektyny wykazał również zespół Walsh N i współ., (2009). Po wyciszeniu genu kodującego podjednostkę integrynową .5 obniżyła się adhezja komórek raka trzustki linii MiaPaCa-2 do fibronektyny. Podsumowując, prezentowane wyniki wykazują, że wraz z transformacją nowotworową czerniaka skóry wzrasta adhezja komórek do fibronektyny, co być może jest związane ze zwiększoną ekspresją integryny .5ß1. Jednocześnie powyższe obserwacje potwierdzają wyniki uzyskane przez innych badaczy. Dyskusja VI.11.2. WPŁYW KWASÓW SJALOWYCH WIĄZANYCH .2-6GAL/GALNAC ORAZ .23GAL NA ADHEZJĘ KOMÓREK CZERNIAKA SKÓRY DO FIBRONEKTYNY Adhezja komórek do białek ECM stanowi główny mechanizm regulujący wiele parametrów komórkowych zachodzących podczas inwazji, takich jak ruchliwość, chemotaksja czy degradacja składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Reddy BVVG i Kalraiya RD (2006) sugerują, że zmniejszenie adhezji komórek powoduje zmniejszenie tempa migracji po fibronektynie, jednocześnie zwiększa się tempo inwazji przez Matrigel. Za interakcje komórek z białkami ECM odpowiadają integryny, szczególnie te receptory, które są zbudowane z podjednostki ß1. Za specyfikę receptora odpowiada sposób wiązania się podjednostek . i ß, natomiast N-glikany wiązane do łańcucha polipeptydowego integryn regulują siłę tego wiązania. N-glikany prawdopodobnie mogą modyfikować siłę przylegania komórek do białek ECM w taki sposób, że umożliwiają komórkom inwazję (Reddy BVVG i Kalraiya RD, 2006). Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc badano stosując lektynę SNA. Uzyskane wyniki wskazują na zależny od dawki hamujący wpływ lektyny SNA na adhezję pierwotnych i metastatycznych komórek czerniaka skóry (wyniki, rycina 42), co sugeruje, że kwasy sjalowe wiązane .2-6Gal ułatwiają adhezję komórek linii WM115 do fibronektyny. Jednocześnie ich rola zwiększa się wraz z transformacją nowotworową, gdyż ich zablokowanie w komórkach metastatycznych linii WM266-4 spowodował brak przylegania tych komórek do fibronektyny. Uzyskane wyniki sugerują, że obecność kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc sprzyja adhezji komórek pierwotnych linii WM115 do fibronektyny, a ich obecność w komórkach metastatycznej linii WM266-4 jest niezbędna podczas tego procesu. Zwiększoną ekspresję sjalilotransferazy ST6Gal-I oraz kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc obserwowano w wielu typach nowotworów. Christie DR i współ., (2008) opisali rolę kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc podczas adhezji komórek raka jajnika do kolagenu typu I. W tym celu komórki linii OV4 były transfekowane genem SIAT1 kodującym ST6Gal-I, co spowodowało zwiększenie ilości kwasów sjalowych .2-6Gal na powierzchni błony komórkowej. Zwiększona ekspresja kwasów sjalowych SNA pozytywnych korelowała ze zwiększoną adhezją tych komórek do kolagenu typu I (Christie DR i współ., 2008). Inne badania polegające na usunięciu kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc z powierzchni komórek nabłonka jelita Dyskusja linii HD3 dowiodły, że adhezja komórek nie posiadających kwasów sjalowych SNA pozytywnych do kolagenu typu I obniża się (Seales EC i współ., 2003; Shaikh FM i współ., 2008). Podobne wyniki uzyskano badając komórki nowotworu jelita linii SW984 transfekowanej genem SIAT1. Wzmożona sjalilacja tych komórek zwiększa ich adhezję do fibronektyny (Chiricolo M i współ., 2006). Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal na adhezję komórek do fibronektyny badano używając lektyny MAA. Optymalne dawki lektyny MAA (10µg/ml, 25µg/ml i 50µg/ml) ustalono stosując test żywotności komórek MTT (wyniki, rycina 33). Jak sugerują wyniki lektyna MAA w wybranych dawkach nie wpływa na żywotność komórek linii WM266-4, natomiast już dawka 25µg/ml obniża żywotność komórek pierwotnej linii WM115. Należy jednak podkreślić, że w teście żywotności MTT inkubacja komórek z lektyną MAA wynosiła 24 godz., natomiast komórki przygotowywane do testu adhezji inkubowano z lektynami przez 1 godz. Dlatego prawdopodobnie toksyczny efekt lektyny MAA był mniejszy lub w ogóle nie występował. Nie mniej jednak tę hipotezę należałby poprzeć innymi badaniami. Lektyna MAA specyficznie rozpoznaje i wiąże kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal. Jak wykazały doświadczenia, związanie kwasów sjalowych przez lektynę MAA powoduje zależny od dawki spadek adhezji komórek linii WM115 odpowiednio o 74% (10µg/ml), natomiast komórek metastatycznych aż o 92% (wyniki, rycina 42). Stężenie lektyny 25µg/ml całkowicie hamuje adhezję komórek obu linii czerniaka. Otrzymane wyniki sugerują, że obecność kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal jest niezbędna podczas adhezji komórek do fibronektyny, a ich ekspresja sprzyja przyleganiu komórek obu badanych linii. Podobną zależność opisał zespół Wang FL, (2009). Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal był określony na przykładzie komórek metastatycznego gruczolakoraka żołądka linii SGC-7901, w których wywołano nadekspresję kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal. Badania wykazały, że zwiększona ekspresja tych kwasów powoduje wzmocnioną adhezję komórek rakowych do składników ECM (Wang FL i współ., 2009). Podobne wyniki uzyskał zespół Perez-Garay M, (2010), który badał wpływ obecności kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal na adhezję komórek nowotworu trzustki. W komórkach linii Capan-1 oraz MDAPanc-28 wywołano nadekspresję genu kodującego ST3Gal-III, której rezultatem było zwiększenie ilości sjalilowanych struktur typu Lewisx na powierzchni komórek. Nadekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2 Dyskusja 3Gal prowadziła do zwiększenia adhezji badanych komórek do rekombinowanej ludzkiej E-selektyny (Perez-Garay M i współ., 2010). Podsumowując, prezentowane w pracy wyniki wykazują, że kwasy sjalowe wiązane 2-3Gal oraz .2-6Gal sprzyjają adhezji komórek obu badanych linii do fibronektyny. Jednocześnie rola sjalilacji .2-6Gal podczas tego procesu zwiększa się wraz z transformacją nowotworową czerniaka skóry. VI.12. Inwazja komórek czerniaka przez Matrigel, wpływ integryny .5ß1 Proces tworzenia przerzutów obejmuje szereg etapów, których przebieg zależy zarówno od typu komórek nowotworowych jak również od środowiska, w którym występują (Park HJ i współ., 2011; Li G i współ., 2001). Inwazja komórek nowotworowych przez błonę podstawną stanowi bardzo ważny etap podczas procesu tworzenia przerzutów. Ponieważ w przypadku komórek ludzkich nie jest możliwym oznaczenie ich ruchliwości w organizmie in vivo, dlatego też opracowano metody badania ich zdolności migracyjnych in vitro. W tym celu stosuje się specjalne układy symulujące naturalne warunki, które pozwalają na obserwację wybranych aspektów zachowania komórek w odpowiedzi na zdefiniowane bodźce z otoczenia. Taki układ stanowi komora Boydena. W komorze Boydena znajduje się filtr z porami, który do badań chaptotakcji może być pokryty przez wybrane białko macierzy zewnątrzkomórkowej lub na potrzeby badania inwazji komórek przez Matrigel. Stosowany w doświadczeniu Matrigel został wytworzony przez komórki mysiego nowotworu linii EHS i składał się z lamininy, kolagenu typu I, enaktyny, siarczanu heparanu oraz proeoglikanów. Matrigel stanowi rekonstrukcję błony podstawnej, która jest niszczona przez komórki wykazujące zdolność do inwazji (np. komórki nowotworowe) (Yoh H i współ., 2002). Dyskusja VI.12.1. UDZIAŁ INTEGRYNY .5ß1 W INWAZJI KOMÓREK CZERNIAKA PRZEZ MATRIGEL Badanie inwazji komórek linii pierwotnej WM115 i metastatycznej WM266-4 wykonano stosując komory Boydena pokryte Matrigelem. Komórki nowotworowe barwiono barwnikiem Dil w dawce nie wpływającej na żywotność komórek (wyniki, rycina 34). Jako czynnik chemotaktyczny zastosowano fibronektynę. Otrzymane wyniki dowodzą, że komórki obu badanych linii czerniaka skóry wykazują zdolność do inwazji przez Matrigel. Jednocześnie nie ma istotnych różnic pomiędzy komórkami pierwotnymi i metastatycznymi czerniaka skóry w zdolności do inwazji (wyniki rycina 44). Rolę integryny .5ß1 podczas inwazji komórek przez Matrigel określono stosując specyficzne przeciwciała monoklonalne, które blokowały podjednostkę integrynową .5. Otrzymane wyniki sugerują, że integryna .5ß1 uczestniczy podczas inwazji komórek linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4. Zablokowanie integryny .5ß1 powodowało zmniejszenie inwazji komórek odpowiednio o 20% w linii pierwotnych oraz o 35% w komórkach linii metastatycznej. Ekspresja podjednostki integrynowej zwiększa się w komórkach linii WM266-4, co być może wpływa jej większą rolę podczas inwazji komórek przez Matrigel. Prezentowane obserwacje znalazły potwierdzenie w badaniach innych autorów. Wyniki uzyskane przez Herlyn M (1990) potwierdzają, że linie komórkowe WM115 oraz WM266-4 czerniaka skóry są zdolne do inwazji przez Matrigel, jednocześnie inwazja komórek obu linii jest taka sama (Truzzi F i współ., 2008). Wiele badań podkreśla, że zwiększona ekspresja integryny .5ß1 towarzyszy nabywaniu zdolności do inwazji przez komórki nowotworowe, np. w komórkach nowotworu piersi (Morozevich G i współ., 2009; Mierke CT i współ., 2011), czy wielkokomórkowego nowotworu płuc (Dingemans AMC i współ., 2010). Podsumowując, prezentowane wyniki są zgodne z przytoczonymi danymi literaturowymi. Komórki linii pierwotnej WM115 oraz linii metastatycznej WM266-4 wykazują zdolność do inwazji przez Matrigel, aczkolwiek nie ma różnic miedzy badanymi liniami komórkowymi w procencie komórek zdolnych w inwazji. Integryna .5ß1 uczestniczy podczas inwazji komórek obu badanych linii, jednocześnie jej rola zwiększa się, wraz ze zwiększeniem jej ekspresji na powierzchni. Zwiększenie udziału inte Dyskusja gryny .5ß1 podczas inwazji komórek czerniaka skóry może być związane z transformacją nowotworową czerniaka skóry i złymi rokowaniami dla pacjentów. VI.12.2. WPŁYW KWASÓW SJALOWYCH NA INWAZJĘ KOMÓREK PRZEZ MATRIGEL Wpływ kwasów sjalowych na inwazję przez Matrigel badano stosując specyficzne sjalidazy. Skuteczność desjalilacji sprawdzono przy użyciu specyficznych lektyn SNA i MAA metodą cytometrii przepływowej (wyniki, rycina 35). Uzyskane rezultaty wskazują, że nie udało się usunąć wszystkich reszt kwasów sjalowych z powierzchni komórek czerniaka, co być może miało wpływ na uzyskane wyniki. Usuniecie kwasów sjalowych wiązanych .2,3Gal obniża inwazję komórek pierwotnej linii WM115 przez Matrigel o 21%. Kwasy sjalowe wiązane .2-6Gal/GalNAc oraz .2-8Sia nie uczestniczą podczas inwazji komórek tej linii. W komórkach metastatycznej linii czerniaka WM266-4 sjalilacja .2-3Gal oraz .2-8Sia nie uczestniczy podczas badanego procesu. Jednocześnie ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .26Gal/ GalNAc obniża inwazję komórek przez Matrigel. Obserwację innych naukowców również wykazują udział kwasów sjalowych podczas inwazji. Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal na inwazję komórek raka żołądka opisał zespół Wang FL (2009). Zwiększona ekspresja kwasów sjalowych sprzyjała inwazji badanych komórek oraz tworzeniu przerzutów (Wang FL i współ., 2009). Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc badano na komórkach ludzkiego glejaka. W tym celu w komórkach linii U-373 MG wywołano (i) nadekspresję genu kodującego sjalilotransferazę ST3Gal-III, której wynikiem była zwiększona ilość kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz (ii) nadekspresję genu kodującego sjalilotransferazę ST6Gal-I, której wynikiem było zwiększenie ilości kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal. Badania wykazały, że zwiększona ilość kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal wzmacnia inwazję komórek glejaka przez Martigel. Jednocześnie zwiększona ekspresja .2-6Gal obniża inwazję tych komórek (Yamamoto H i współ., 2001). Wpływ kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal badano również na komórkach raka jelita. Po wyciszeniu genu SIAT1 zmniejszyła się inwazja komórek linii HT29 przez Matrigel (Zhu Y i współ., 2001). Reasumując, ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal sprzyja inwazji komórek przez Matrigel. Jednocześnie udział kwa Dyskusja sów sjalowych wiązanych .2-6Gal podczas inwazji komórek wydaje się być komórkowo specyficzny. Suzuki M i współ., (2005) opisał wpływ kwasów polisjalowych na inwazję glejaka. Komórki linii C6 z wywołaną nadekspresją genów ST8Sia-II lub ST8Sia-IV wykazywały zdolność do inwazji w eksperymentach in vivo. Własność ta zniknęła całkowicie po zastosowaniu sjalidazy endo-N, która specyficznie odcina kwasy PSA (Suzuki M i współ, 2005). Podobne wyniki uzyskano badając wpływ kwasów polisjalowych na inwazję komórek różnych linii raka przysadki (Wierinkx A, 2007). Podsumowując, wyniki prezentowane w pracy oraz przytoczone doniesienia literaturowe odnośnie roli kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal podczas inwazji komórek wskazują, że ich ekspresja sprzyja inwazji, co potwierdziły wyniki uzyskane dla komórek pierwotnej linii czerniaka skóry WM115. Jednocześnie w komórkach czerniaka skóry linii WM266-4 ich ekspresja nie wpływa na inwazję przez Matrigel. Ekspresja kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc na powierzchni badanych komórek obniża inwazję komórek linii WM266-4. Kwasy polisjalowe nie wpływają na inwazję komórek obu badanych linii czerniaka, efekt ten w świetle przytoczonych badań wydaje się być komórkowo specyficzny. Podsumowanie VII. Podsumowanie W prezentowanej pracy wykazano, że podczas rozwoju czerniaka skóry zmianie ulega ekspresja integryny .5ß1. Znaczny wzrost ilości tego receptora na powierzchni komórek metastatycznej linii WM266-4 wpływa na ich oddziaływania z fibronektyną. Prawdopodobnie, podwyższona ekspresja badanej integryny pozytywnie koreluje z ilością wydzielanych metaloproteinaz Pro-MMP-2 oraz MMP-9. Umożliwia to komórkom efektywne niszczenie składników macierzy zewnątrzkomórkowej oraz błony podstawnej usprawniając inwazję. Stwierdzono też, że integryna .5ß1 nie uczestniczy podczas migracji komórek linii WM266-4 na fibronektynie, jednocześnie udowodniono udział kwasów sjalowych w tym procesie. Wykazano, że rola kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc zwiększa się wraz z rozwojem czerniaka skóry, co zostało potwierdzone w testach migracji oraz adhezji komórek do fibronektyny. Udowodniono, iż transformacji nowotworowej towarzyszy znaczny wzrost obu typów sjalilacji, co powoduje wzrost migracji komórek na fibronektynie. Ponadto wykazano, że podczas rozwoju czerniaka skóry może dochodzić do „przełączenia funkcji” kwasów sjalowych. Test inwazji komórek przez Matrigel wykazał, że kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal ułatwiają inwazję komórek pierwotnej linii WM115, natomiast w komórkach metastatycznych nie biorą udziału podczas tego procesu. Jednocześnie w komórkach linii WM2664 role odgrywa sjalilacja .2-6Gal/GalNAc, która utrudnia inwazję przez Matrigel. Wykazano również, że transformacji czerniaka skóry towarzyszy zmiana profilu sjalilacji podjednostki integrynowej .5. Ilość kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal spada, natomiast znacznie wzrasta ilość kwasów sjalowych wiązanych .2-6Gal/GalNAc do Nglikanów. Jednocześnie kwasy polisjalowe obecne na obu podjednostkach integryny .5ß1 komórek linii pierwotnej nie są obecne na receptorze uzyskanym z komórek metastatycznych. Profil sjalilacji podjednostki integrynowej .5 pokrywa się z rezultatami uzyskanymi w reakcji RT-PCR, jednocześnie nie jest zgodny z profilem sjalilacji komórek. Jest to prawdopodobnie spowodowane tym, że ilość mRNA nie świadczy o aktywności danej sjalilotransferazy. Dodatkowo badanie powierzchni komórek prezentuje ogólną tendencję zmian ekspresji kwasów sjalowych towarzyszącą transformacji czerniaka skóry. Wykazano, iż zmiany profilu sjalilacji w istotny sposób mogą wpłynąć na oddziaływania badanego receptora z fibronektyną. Podczas tego procesu rolę odgrywa sjalilacja .2-3Gal, która zmniejsza adhezję integryny .5ß1 oczyszczonej z komórek Podsumowanie pierwotnych do fibronektyny, natomiast efekt ten zanika w komórkach metastatycznych. Stwierdzono również, że uzyskane wyniki nie pokrywają się z wynikami uzyskanymi w teście adhezji komórek do fibronektyny, w którym sjalilacja .2-3Gal oraz .26Gal/ GalNAc wydają się odgrywać istotną rolę podczas tego procesu. Jest to prawdopodobnie związane z tym, że na powierzchni błony komórkowej występuje wiele reszt kwasów sjalowych, które mogą wpływać na wiązanie z ligandem. Wnioski VIII. Wnioski W przedstawionej pracy zbadano i porównano ekspresję sjalilotransferaz w komórkach czerniaka skóry pierwotnej linii WM115 i metastatycznej linii WM266-4 oraz profil sjalilacji podjednostek integrynowych .5 oraz ß1, określono ekspresję integryny .5ß1 oraz kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc na powierzchni komórek. Jednocześnie określono wpływ integryny .5ß1 oraz kwasów sjalowych na aktywność migracyjną, adhezyjną oraz inwazyjną komórek czerniaka skóry. W szczególności, przeprowadzone doświadczenia wykazały, że: 1. Zmiany w ekspresji genów kodujących sjalilotransferazy towarzyszą transformacji czerniaka skóry. W komórkach linii WM266-4 zwiększa się ekspresja genu SIAT1, zmniejsza ekspresja genu SIAT4C. W komórkach linii WM266-4 zaobserwowano również brak ekspresji genu STX, co może mieć bezpośredni związek z rozwojem czerniaka skóry. 2. Integryna .5ß1 jest obecna w komórkach linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 czerniaka skóry. Jednocześnie transformacji nowotworowej towarzyszy wzrost sjalilacji .2-6Gal/GalNAc oraz spadek sjalilacji .2-3Gal podjednostki integrynowej .5. 3. Obecność kwasów sjalowych .2-3Gal obniża adhezję oczyszczonej integryny .5ß1 w komórkach linii WM115. W komórkach linii WM266-4 kwasy sjalowe nie mają wpływu na adhezję do fibronektyny. 4. Komórki linii WM266-4 wydzielają większą ilość metaloproteinazy Pro-MMP-2, jednocześnie pojawia się MMP-9. Wyniki sugerują, że ekspresja metaloproteinazy MMP-9 może być markerem metastatycznych komórek czerniaka skóry. 5. Większe tempo migracji wykazują komórki WM266-4, ale w odróżnieniu od komórek linii WM115 integryna .5ß1 nie odgrywa roli podczas ich migracji. Kwasy Wnioski sjalowe wiązane .2-3Gal oraz .2-6Gal/Gal/NAc zwiększają tempo migracji komórek czerniaka skóry metastatycznej linii WM266-4. 6. Transformacji nowotworowej czerniaka skóry towarzyszy zwiększona ekspresja integryny .5ß1 oraz kwasów sjalowych wiązanych .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc, co może być wiązane z udziałem tych struktur podczas adhezji do fibronektyny. Komórki linii WM266-4 wykazują większą adhezję do fibronektyny, integryna .5ß1 uczestniczy podczas adhezji komórek linii WM115 oraz WM266-4, natomiast kwasy sjalowe wiązane .2-3Gal oraz .2-6Gal/GalNAc są niezbędne podczas adhezji komórek czerniaka linii WM266-4 do fibronektyny. 7. Komórki linii pierwotnej WM115 oraz metastatycznej WM266-4 wykazują podobną zdolność do inwazji przez Matrigel, jednocześnie integryna .5ß1 zwiększa inwazję komórek obu badanych linii. Podczas transformacji nowotworowej prawdopodobnie dochodzi do zmiany funkcji kwasów sjalowych, gdyż sjalilacja .2-3Gal sprzyja tylko inwazji komórek pierwotnych linii WM115. Natomiast w komórkach czerniaka skóry WM266-4 sjalilacja .2-6Gal/GalNAc obniżają ich inwazję przez Matrigel. Literatura IX. Literatura 1. Abraham S, Kogata N, Fässler R, Adams RH (2008) Integrin beta1 subunit controls mural cell adhesion, spreading, and blood vessel wall stability. Circulation research 102:562-70. 2. Affinity chromatography, Pharmacia Fine Chemicals, (1979), Uppsala, Szwecja. 3. Amano S (2009) Possible involvement of basement membrane damage in skin photoaging. The journal of investigative dermatology. Symposium proceedings 14:2-7. 4. Angata K, Fukuda M (2003) Polysialyltransferases: major players in polysialic acid synthesis on the neural cell adhesion molecule. Biochimie 85:195-206. 5. Angata K, Suzuki M, Fukuda M (2002) ST8Sia II and ST8Sia IV polysialyltransferases exhibit marked differences in utilizing various acceptors containing oligosialic acid and short polysialic acid. The basis for cooperative polysialylation by two enzymes. The Journal of biological chemistry 277:36808-17. 6. Argraves W, Scott TH (1994) Purification of alpha 5 beta 1 integrin by ligand affinity chromatography. 243-248. 7. Avila JJ i współ., (1999) Fibronectin gene polymorphisms associated with fibrosing alveolitis in systemic sclerosis. American journal of respiratory cell and molecular biology 20:106-12. 8. Bachmann IM, Ladstein RG, Straume O, Naumov GN, Akslen L a (2008) Tumor necrosis is associated with increased alphavbeta3 integrin expression and poor prognosis in nodular cutaneous melanomas. BMC cancer 8:362. 9. Bartik P i współ., (2008) Detection of a hypersialylated beta1 integrin endogenously expressed in the human astrocytoma cell line A172. International journal of oncology 32:1021-31. 10. Batisse C i Marquet J, Greffard A i współ., (2004) Lectin-based three-color flow cytometric approach for studying cell surface glycosylation changes that occur during apoptosis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 62:81-8. 11. Belkin VM, Belkin M, Koteliansky VE (1990) Human smooth muscle VLA-1 integrin: purification, substrate specificity, localization in aorta, and expression during development. The Journal of cell biology 111:2159-70. 12. Bellis SL (2004) Variant glycosylation: an underappreciated regulatory mechanism for beta1 integrins. Biochimica et biophysica acta 1663:52-60. 13. Berrier AL, Yamada KM (2007) Cell–matrix adhesion. Journal of cellular physiology 213:565–573. 14. Béliveau A, Bérubé M, Rousseau A, Pelletier G, Guérin SL (2000) Expression of integrin alpha 5 beta 1 and MMPs associated with epithelioid morphology and Literatura malignancy of uveal melanoma. Investigative ophthalmology & visual science 41:2363-72. 15. Birkenmeiers TM, Mcquillans J, Boedekers ED i współ., (1991) The alpha 5 beta 1 Fibronectin Receptor. The Journal of biological chemistry 206:20544-20549. 16. Boudreau NJ, Jones PL (1999) Extracellular matrix and integrin signalling: the shape of things to come. The Biochemical journal 339:481-8. 17. Bozzuto G, Ruggieri P, Molinari A (2010) Molecular aspects of tumor cell migration and invasion. Annali dell Istituto superiore di sanita 46:66–80. 18. Brocco M, Pollevick GD, Frasch ACC (2003) Differential regulation of polysialyltransferase expression during hippocampus development: implications for neuronal survival. Journal of neuroscience research 74:744–753. 19. Butler M (2006) Optimisation of the Cellular Metabolism of Glycosylation for Recombinant Proteins Produced by Mammalian Cell Systems. Cytotechnology 50:57-76. 20. Campbell NE, Kellenberger L, Greenaway J i współ., (2010) Extracellular matrix proteins and tumor angiogenesis. Journal of oncology:1-13. 21. Chabria M, Hertig S, Smith ML, Vogel V (2010) Stretching fibronectin fibres disrupts binding of bacterial adhesins by physically destroying an epitope. Nature communications 1:135. 22. Chen H-L, Li CF, Grigorian A, Tian W, Demetriou M (2009) T cell receptor signaling co-regulates multiple Golgi genes to enhance N-glycan branching. The Journal of biological chemistry 284:32454-61. 23. Cheung IY, Vickers A, Cheung N-KV (2006) Sialyltransferase STX (ST8SiaII): a novel molecular marker of metastatic neuroblastoma. International journal of cancer. 119:152-6. 24. Chiricolo M, Malagolini N, Bonfiglioli S, Dall Olio F (2006) Phenotypic changes induced by expression of beta-galactoside alpha2,6 sialyltransferase I in the human colon cancer cell line SW948. Glycobiology 16:146-54. 25. Christie DR, Shaikh FM, Lucas J, Bellis SL (2008) ST6Gal-I expression in ovarian cancer cells promotes an invasive phenotype by altering integrin glycosylation and function. Journal of Ovarian Research 1:3. 26. Chudnovsky Y, Khavari PA, Adams AE (2005) Science in medicine Melanoma genetics and the development of rational therapeutics. Journal of Clinical Investigation 115:813-824. 27. Clark K, Pankov R, Travis M i współ., (2005) A specific alpha 5 beta 1 -integrin conformation promotes directional integrin translocation and fibronectin matrix formation. Journal of cell science 118:291-300. 28. Costin GE, Hearing VJ (2007) Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 21:976-94. 29. Cotignola J, Pampa R, Patel A i współ., (2007) Functional polymorphisms in the promoter regions of MMP2 and MMP3 are not associated with melanoma progression. Journal of negative results in biomedicine 6:9. Literatura 30. Dabelsteen E (1996) Cell surface carbohydrates as prognostic markers in human carcinomas. Journal of pathology:179(4):358-69. 31. Dall Olio F, Chiricolo M, Ceccarelli C i współ., (2000) Beta-galactoside alpha2,6 sialyltransferase in human colon cancer: contribution of multiple transcripts to regulation of enzyme activity and reactivity with Sambucus nigra agglutinin. International journal of cancer 88:58-65. 32. Dall Olio F, Chiricolo M, Mariani E, Facchini A (2001) Biosynthesis of the cancer- related sialyl-alpha 2,6-lactosaminyl epitope in colon cancer cell lines expressing beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase under a constitutive promoter. European Journal of biochemistry 268:5876-84. 33. Damsky WE, Rosenbaum LE, Bosenberg M (2011) Decoding Melanoma Metastasis. Cancers 3:126-163. 34. Das S, Banerji A, Frei E, Chatterjee A (2008) Rapid expression and activation of MMP-2 and MMP-9 upon exposure of human breast cancer cells (MCF-7) to fibronectin in serum free medium. Life Sciences 82:467-76 35. DeClerck YA, Mercurio AM, Stack MS i współ., (2004) Proteases, Extracellular Matrix, and Cancer. American Journal of Pathology 164:23-34. 36. Dennis JW, Granovsky M, Warren CE (1999) Glycoprotein glycosylation and cancer progression. Biochimica et biophysica acta 1473:21-34. 37. Dingemans AMC, van den Boogaart V, Vosse B i współ., (2010) Integrin expression profiling identifies integrin alpha5 and beta1 as prognostic factors in early stage non-small cell lung cancer. Molecular cancer 9:152. 38. Ellies LG, Sperandio M, Underhill GH i współ., (2002) Sialyltransferase specificity in selectin ligand formation. Blood 100:3618-3625. 39. Elson-Schwab I, Lorentzen A, Marshall CJ (2010) MicroRNA-200 family members differentially regulate morphological plasticity and mode of melanoma cell invasion. Plosone 5:13176-85. 40. Engl T, Makarević J, Relja B i współ., (2005) Mycophenolate mofetil modulates adhesion receptors of the beta1 integrin family on tumor cells: impact on tumor recurrence and malignancy. BMC cancer 5:1-11. 41. Erdogan G, Kücükosmanoglu I, Akkaya B (2008) CD44 and MMP-2 expression in urothelial carcinoma. Turkish Journal of Pathology 24:147-152. 42. Ewing J (1922) Neoplastic diseases. A treatise on tumors. The American Journal of the Medical Sciences 164:284. 43. Feng Y i Mrksich M (2004) The synergy peptide PHSRN and the adhesion peptide RGD mediate cell adhesion through a common mechanism. Biochemistry, 43(50): 15811-21. 44. Forsberg E, Paulsson M, Timpl R, Johansson S (1990) Characterization of a laminin receptor on rat hepatocytes. The Journal of biological chemistry 265:6376-81. 45. Reichardt (1992) Regulation of expression of fibronectin and its receptor, alpha 5 beta 1, during development and regeneration of peripheral nerve. Development 116:767-782. Literatura 46. van der Flier A, Badu-Nkansah K, Whittaker CA i współ., (2010) Endothelial alpha5 and alphav integrins cooperate in remodeling of the vasculature during development. Development 137:2439-49. 47. Friedl P, Gilmour D (2009) Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology 10:445-57. 48. Gabri MR, Ripoll GV, Alonso DF, Gomez DE (2002) Role of cell surface GM3 ganglioside and sialic acid in the antitumor activity of a GM3-based vaccine in the murine B16 melanoma model. Journal of cancer research and clinical oncology 128:669-77. 49. Geho DH, Bandle RW, Clair T, Liotta L (2005) Physiological mechanisms of tumor-cell invasion and migration. Physiology 20:194-200. 50. Geiger B, Bershadsky A, Pankov R, Yamada KM, G CB (2001) Transmembrane extracellular matrix– cytoskeleton crosstalk. Nature Reviews Molecular Cell Biology 2:793-805. 51. Georgopoulou N, Breen KC (1999) Overexpression of alpha 2, 3 sialyltransferase in neuroblastoma cells results in an upset in the glycosylation process. Glycoconjugate Journal 16:649–657. 52. Gong J, Wang D, Sun L i współ., (1997) Role of alpha 5 beta 1 integrin in determining malignant properties of colon carcinoma cells. Cell growth & differentiation 8:83. 53. Goodman TG, Degraaf ME, Fischer HD, Bajt ML (1998) Expression of a structural domain of the beta 2 subunit essential for alpha M beta 2 ligand recognition. Journal of Leukocyte Biology 64:767-773. 54. Gorelik E, Galili U, Raz A (2001) On the role of cell surface carbohydrates and their binding proteins (lectins) in tumor metastasis. Cancer metastasis reviews 20:245-77. 55. Haass NK, Smalley KSM, Li L, Herlyn M (2005) Adhesion, migration and communication in melanocytes and melanoma. Pigment cell research 18:150-9. 56. Harduin-Lepers A, Vallejo-Ruiz V, Krzewinski-Recchi MA i współ., (2001) The human sialyltransferase family. Biochimie 83:727-37. 57. Han YP, Tuan TL, Wu H, Hughes M (2001) TNF-. stimulates activation of proMMP2 in human skin through NF-.B mediated induction of MT1-MMP. Journal of Cell Science 114:131-139. 58. Harduin-Lepers A (2010) Comprehensive Analysis of sialyltransferases in Vertebrate Genomes. Glycobiology Insights 2:29-61. 59. Harduin-Lepers A, Mollicone R, Delannoy P, Oriol R (2005) The animal sialyltransferases and sialyltransferase-related genes: a phylogenetic approach. Glycobiology 15:805-17. 60. Hedlund M, Ng E, Varki A, Varki NM (2008) alpha 2-6-Linked sialic acids on Nglycans modulate carcinoma differentiation in vivo. Cancer research 68:388-94. 61. Herlyn M (1990) Human melanoma: development and progression. Cancer metastasis reviews 9:101-12. 62. Hildebrandt H, Muhlenhoff M, Gerardy-Schahn R (2010) Polysialylation of NCAM. Advances in experimental medicine and biology 663:95–109. Literatura 63. Hofmann UB, Westphal JR, Van Muijen GN, Ruiter DJ (2000) Matrix metalloproteinases in human melanoma. The Journal of investigative dermatology 115:337-44. 64. Honda S (2001) Ligand binding to integrin alphavbeta3 requires tyrosine 178 in the alphav subunit. Blood 97:175-182. 65. Hossler P, Khattak SF, Li ZJ (2009). Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology, 19(9): 936-49. 66. Hsu CC, Lin TW, Chang WW i współ., (2005) Soyasaponin-I-modified invasive behavior of cancer by changing cell surface sialic acids. Gynecologic oncology 96:415–422. 67. Hsu M-Y, Meier F, Herlyn M (2002) Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host. Differentiation 70:522-36. 68. Humphries MJ (2011) Integrin structure, activation, and interactions. Biochemical Society transactions 3:311-339. 69. Hynes RO (2002) Integrins: Bidirectional, Allosteric Signaling Machines. Cell 110:673–687. 70. Isaji T i współ., (2004) Introduction of bisecting GlcNAc into integrin alpha5beta1 reduces ligand binding and down-regulates cell adhesion and cell migration. The Journal of biological chemistry 279:19747-54. 71. Isaji T, Sato Y, Fukuda T, Gu J (2009) N-glycosylation of the I-like domain of beta1 integrin is essential for beta1 integrin expression and biological function: identification of the minimal N-glycosylation requirement for alpha5beta1. The Journal of biological chemistry 284:12207-16. 72. Isaji T ,Sato Y, Zhao Y i współ., (2006) N-glycosylation of the beta-propeller domain of the integrin alpha5 subunit is essential for alpha5beta1 heterodimerization, expression on the cell surface, and its biological function. The Journal of biological chemistry 281:33258-67. 73. Jarvelainen H, Sainio A, Koulu M, Wight TN, Penttinen R (2009) Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological reviews 61:198-215. 74. Jeanneau C, Chazalet V, Augé C i współ., (2004) Structure-function analysis of the human sialyltransferase ST3Gal I: role of n-glycosylation and a novel conserved sialylmotif. The Journal of biological chemistry 279:13461-8. 75. Jeong YT, Choi O, Son YD, Park SY, K.J., 2009. Enhanced sialylation of recombinant erythropoietin in genetically engineered Chinese-hamster ovary cells. Biotechnology and applied biochemistry, 52(4), 283 - 91. 76. Johansson S, Svineng G, Wennerberg K, Armulik a, Lohikangas L (1997) Fibronectin- integrin interactions. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library 2:d126-46. 77. Jones J, Krag SS, Betenbaugh MJ (2005) Controlling N-linked glycan site occupancy. Biochimica et biophysica acta 1726:121-37. 78. Jun L, Yuanshu W, Yanying X, Zhongfa X, Jian Y, Fengling W, Xianjun Q, Kokudo N, Wei T, Weixia Z, Shuxiang C (2010) Altered mRNA expressions of sialyltransferases in human gastric cancer tissues. Medical Oncology:1–7. Literatura 79. Kondratiev S, Gneoo DR, Sabo E, i współ, (2008) Expression and prognostic role of MMP2, MMP9, MMP13, and MMP14 matrix metalloproteinases in sinonasal and oral malignant melanomas. Human pathology, 39(3):337-343. 80. Kim HK, Chae SW, Woo KI, Kim YD (2010) Expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2, MMP-9, and tissue inhibitor of MMP (TIMP)-1 in conjunctival melanomas and clinical implications. Japanese journal of ophthalmology, 54(3): 221-226. 81. Kitazume S, Tachida Y, Oka R i współ., (2001) Alzheimer’s -secretase, -site amyloid precursor protein-cleaving enzyme, is responsible for cleavage secretion of a Golgi-resident sialyltransferase. PNAS 98:13554-13559. 82. Klein RM, Aplin AE (2009) Rnd3 regulation of the actin cytoskeleton promotes melanoma migration and invasive outgrowth in three dimensions. Cancer research 69:2224-33. 83. Kochhar R, Ali H, Mak S, Manoharan P (2009) Metastatic cutaneous malignant melanoma: spectrum of imaging findings and the role of multimodality imaging. Journal of Medical Imaging and Radiation Oncology 53:467–479. 84. Kogelberg H, Tolner B, Thomas GJ i współ., (2010) Engineering a Single Chain Fv Antibody to .vß6 Integrin using the Specificity-Determining Loop of a Footand- Mouth Disease Virus. Journal of Molecular Biology 382:385-401. 85. Kremser ME, Przybyło M, Hoja – Łukowicz D i współ., (2008) Characterisation of alpha 3 beta 1 and alpha v beta 3 integrin N-oligosaccharides in metastatic melanoma WM9 and WM239 cell lines. Biochimica et Biophysica Acta 1780:1421– 1431. 86. Krissansen GW, Yuan Q, Jenkins D, Jiang WM, Rooke L, Eccles M, Leung E (1992) Chromosomal locations of the genes coding for the integrin beta 6 and beta 7 subunits. Immunogenetics 35:58-61. 87. Kronenwett R, Graf T, Nedbal W i współ., (2002) Inhibition of angiogenesis in vitro by alphav integrin-directed antisense oligonucleotides. Cancer gene therapy 9:587-96. 88. Krug LM, Ragupathi G, Ng KK i współ., (2004) Vaccination of small cell lung cancer patients with polysialic acid or N-propionylated polysialic acid conjugated to keyhole limpet hemocyanin. Clinical cancer research 10:916-23. 89. Kupas V, Weishaupt C, Siepmann D i współ., (2011) RANK Is Expressed in Metastatic Melanoma and Highly Upregulated on Melanoma-Initiating Cells. The Journal of investigative dermatology 131:944-55. 90. Kuphal S, Bauer R, Bosserhoff A-K (2005) Integrin signaling in malignant melanoma. Cancer and Metastasis Reviews 24:195-222. 91. Kuwada SK i Li X (2000) Epithelial Cell Proliferation through Epidermal Growth Factor Receptor Activation. Molecular Biology of the Cell, 11(July), pp.24852496. 92. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680–685. Literatura 93. Lafleur M, Tester AM, Thompson EW (2003). Selective involvement of TIMP-2 in the second activational cleavage of pro-MMP-2: refinement of the pro-MMP-2 activation mechanism. FEBS Letters, 553(3):457-463. 94. Lahat G, Zhu QS, Huang KL i współ., (2010) Vimentin is a novel anti-cancer therapeutic target; insights from in vitro and in vivo mice xenograft studies. Plosone 5:10105-10124. 95. Laidler P, Lityńska A, Hoja-Łukowicz D i współ., (2006) Characterization of glycosylation and adherent properties of melanoma cell lines. Cancer immunology, immunotherapy 55:112-8. 96. Le Clainche C, Carlier MF (2008) Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiological reviews 88:489. 97. Lee M, Lee H, Seo W, Park K (2010) Sialylation of Integrin beta1 is Involved in Radiation-Induced Adhesion and Migration in Human Colon Cancer Cells. International Journal of radiation oncology 76:1528-1536. 98. Lee WC i Lee KH (2004) Applications of affinity chromatography in proteomics. Analytical Biochemistry 324:1-10. 99. Lefcorf F, Venstrom K, Reichardt LF (1992) Regulation of expression of fibronectin and its receptor, alpha 5 beta 1, during development and regeneration of peripheral nerve. Development, 116(3):767-782. 100. Leroy JG (2006) Congenital disorders of N-glycosylation including diseases associated with O- as well as N-glycosylation defects. Pediatric research 60:643-56. 101. Leventa KR, Yu H, Kass L, Lakins JN, Egeblad M, Erler JT, Fong SFT, Csiszar K, Giaccia A, Weninger W, Yamauchi M, Gasser DL, Weaver VM (2009) Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell 139:891–906. 102. Li DQ, Lokeshwar BL, Solomon A i współ., (2001) Regulation of MMP-9 production by human corneal epithelial cells. Experimental eye research 73:449–459. 103. Li F, Redick SD, Erickson HP, Moy VT (2003) Force Measurements of the alpha 5 beta 1 Integrin – Fibronectin Interaction. Biophysical Journal 84:1252-1262. 104. Li G, Herlyn M (2000) Dynamics of intercellular communication during melanoma development. Molecular medicine today 6:163-9. 105. Lin S, Kemmner W, Grigull S, Schlag PM (2002) Cell Surface [alpha] 2, 6Sialylation Affects Adhesion of Breast Carcinoma Cells. Experimental cell research 276:101–110. 106. Lowin T, Straub RH, Neumann E i współ., (2009) Glucocorticoids increase alpha5 integrin expression and adhesion of synovial fibroblasts but inhibit ERK signaling, migration, and cartilage invasion. Arthritis and rheumatism 60:3623-32. 107. Luchansky SJ, Bertozzi CR (2004) Azido Sialic Acids Can Modulate Cell-Surface Interactions. ChemBioChem 5:1706–1709. 108. Luo Y, Liang F, Zhang ZY (2009) PRL1 Promotes Cell Migration and Invasion by Increasing MMP2 and MMP9 Expression through Src and ERK1/2 Pathways†. Biochemistry 48:1838–1846. Literatura 109. Mahal LK Charter NW, Angata K i współ., (2001) A small-molecule modulator of poly-alpha 2,8-sialic acid expression on cultured neurons and tumor cells. Science 294:380-1. 110. Manoury B, Nenan S, Leclerc O i współ., (2005) The absence of reactive oxygen species production protects mice against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Respiratory research 6:11. 111. Markwell MAK, Paulson JC (1980) Sendai virus utilizes specific sialyloligosaccharides as host cell receptor determinants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77(10):5693-7. 112. Maschler S, Wirl G, Spring H i współ., (2005) Tumor cell invasiveness correlates with changes in integrin expression and localization. Oncogene 24:2032-41. 113. McInroy L, Maatta A (2007) Down-regulation of vimentin expression inhibits carcinoma cell migration and adhesion. Biochemical and biophysical research communications 360:109–114. 114. Mehta RJ, Diefenbach B, Brown A i współ., (1998) Transmembrane-truncated alphavbeta3 integrin retains high affinity for ligand binding: evidence for an'inside-out'suppressor? Biochemical Journal 330:861. 115. Mendiratta SS, Sekulic N, Lavie A, Colley KJ (2005) Specific amino acids in the first fibronectin type III repeat of the neural cell adhesion molecule play a role in its recognition and polysialylation by the polysialyltransferase ST8Sia IV/PST. The Journal of biological chemistry 280:32340-8. 116. Mierke CT, Frey B, Fellner M, Herrmann M, Fabry B (2011) Integrin alpha 5 beta 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science 124:369–383. 117. Miyoshi E, Nishikawa A, Ihara Y współ., (1993) N - Acetylglucosaminyltransferase III and V Messenger RNA Levels in LEC Rats during Hepatocarcinogenesis N-Acetylglucosaminyltransferase during Hepatocarcinogenesis III and V Messenger RNA Levels in LEC Rats. Cancer Research 53:3899-3902. 118. Mogford JE, Davis GE, Meininger G a (1997) RGDN peptide interaction with endothelial alpha5beta1 integrin causes sustained endothelin-dependent vasoconstriction of rat skeletal muscle arterioles. The Journal of clinical investigation 100:1647-53. 119. Morozevich G, Kozlova N, Cheglakov I, Ushakova N, Berman A (2009) Integrin alpha 5 beta 1 controls invasion of human breast carcinoma cells by direct and indirect modulation of MMP-2 collagenase activity. Cell cycle 8:2219-25. 120. Mortarini R, Gismondi A, Santoni A, Parmiani G, Anichini A (1992) Role of the alpha 5 beta 1 integrin receptor in the proliferative response of quiescent human melanoma cells to fibronectin. Cancer research 52:4499. 121. Moyano JV, Maqueda A, Albar JP, Garcia-Pardo A (2003) A synthetic peptide from the heparin-binding domain III (repeats III4-5) of fibronectin promotes stress-fibre and focal-adhesion formation in melanoma cells. The Biochemical journal 371:565-71. Literatura 122. Nadanaka S, Sato C, Kitajima K i współ., (2001) Occurrence of oligosialic acids on integrin alpha 5 subunit and their involvement in cell adhesion to fibronectin. The Journal of biological chemistry 276:33657-64. 123. Nakagawa H, Zheng M, Hakomori S i współ., (1996). Detailed oligosaccharide structures of human integrin aSpl analyzed by a three-dimensional mapping technique. European Journal of biochemistry, 85, pp.76-85. 124. Nguyen TH (2004) Mechanisms of metastasis. Clinics in dermatology 22:209-16. 125. Niu G, Chen X (2011) Why integrin as a primary target for imaging and therapy. Theranostics 1:30-47. 126. Nowlin DM Gorcsan F, Moscinski M i współ., (1993) A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits a401 and a501 Integrin-mediated Cell Adhesion. The Journal of biological chemistry 268:20352-20359. 127. O'Brien M, O'Shaughnessy D, Ahamide E, Morrison JJ, Smith TJ (2007) Differential expression of the metalloproteinase MMP3 and the alpha5 integrin subunit in human myometrium at labour. Molecular human reproduction 13:655-61. 128. Oda, Y, Hosokawa N, Wada I, Nagata K (2003) EDEM as an acceptor of terminally misfolded glycoproteins released from calnexin. Science, 299(5611), p.1394. 129. Pae SH, Dokic D, Dettman RW (2008) Communication between integrin receptors facilitates epicardial cell adhesion and matrix organization. Developmental dynamics 237:962-78. 130. Paget S (1889) The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Lancet 1:99–101. 131. Pankov R, Yamada KM (2002) Fibronectin at a glance. Journal of Cell Science 115:3861-3863. 132. Parise LV, Lee JW, Juliano R (2000) in Seminars in cancer biology (Elsevier), p 407–414. 133. Park HJ, Galina G, Wang Z współ., (2011) Deregulation of FoxM1b leads to tumour metastasis. EMBO molecular medicine 3:21-34. 134. Patel S, Chaffotte AF, Amana B, Goubard F, Pauthe E (2006) In vitro denaturation- renaturation of fibronectin. Formation of multimers disulfide-linked and shuffling of intramolecular disulfide bonds. The international journal of biochemistry & cell biology 38:1547-60. 135. Patsos G, Hebbe-Viton V, San Martin R i współ., (2005) Action of a library of Oglycosylation inhibitors on the growth of human colorectal cancer cells in culture. Biochemical Society transactions 33:721-3. 136. Patton EE, Widlund HR, Kutok JL, Kopani KR i współ., (2005) BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology 15:249–254. 137. Peracaula R, Tabarés G, López-Ferrer A i współ., (2005) Role of sialyltransferases involved in the biosynthesis of Lewis antigens in human pancreatic tumour cells. Glycoconjugate journal 22:135-44. 138. Pérez-Garay M, Arteta MB, Pages L, Llorens R i współ.,, (2010) alpha2,3sialyltransferase ST3Gal III modulates pancreatic cancer cell motility and adhesion in vitro and enhances its metastatic potential in vivo. Plosone, 5(9), pp.1-11. Literatura 139. Peterson GL (1977) A simplification of the protein assay metod of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytycal Biochemistry 83: 346- 356 140. Petretti T, Kemmner W, Schulze B, Schlag PM (2000) Altered mRNA expression of glycosyltransferases in human colorectal carcinomas and liver metastases. Gut 46:359-66. 141. Pocheć E, Lityńska A, Amoresano A (2003) Glycosylation profile of integrin .3ß1 changes with melanoma progression. Biochimica et Biophysica Acta 1643:113-123. 142. Pocheć E, Lityńska A, Bubka M, Amoresano A, Casbarra A (2006) Characterization of the oligosaccharide component of alpha 3 beta 1 integrin from human bladder carcinoma cell line T24 and its role in adhesion and migration. European journal of cell biology 85:47-57. 143. Przybylo M, Hoja-Lukowicz D, Litynska A, Laidler P (2002) Different glycosylation of cadherins from human bladder non-malignant and cancer cell lines. Cancer cell international 2:6. 144. Przybyło M, Lityńska a, Pocheć E (2005) Different adhesion and migration properties of human HCV29 non-malignant urothelial and T24 bladder cancer cells: role of glycosylation. Biochimie 87:133-42. 145. Przybyło M, Pocheć E, Link-Lenczowski P, Lityńska A (2008) Beta1-6 branching of cell surface glycoproteins may contribute to uveal melanoma progression by up-regulating cell motility. Molecular vision 14:625-36. 146. Purdue MP, Freeman LEB, Anderson WF, Tucker M a (2008) Recent trends in incidence of cutaneous melanoma among US Caucasian young adults. The Journal of investigative dermatology 128:2905-8. 147. Qian F, Zhang ZC, Wu XF i współ., (2005) Interaction between integrin alpha(5) and fibronectin is required for metastasis of B16F10 melanoma cells. Biochemical and biophysical research communications, 333(4), pp.1269-75. 148. Rankinen T, An P, Pérusse L i współ., (2002) Genome-wide linkage scan for exercise stroke volume and cardiac output in the HERITAGE Family Study. Physiological genomics 10:57-62. 149. Reddy BVVG, Kalraiya RD (2006) Sialilated beta1,6 branched Noligosaccharides modulate adhesion, chemotaxis and motility of melanoma cells: Effect on invasion and spontaneous metastasis properties. Biochimica et biophysica acta 1760:1393-402. 150. Roca-Cusachs P i Gauthier N (2009) Clustering of alpha5 beta1 integrins determines adhesion strength whereas alphav beta3 and talin enable mechanotransduction. Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(38). 151. Roman J, Ritzenthaler JD, Roser-Page S, Sun XSH (2010) Alpha 5 beta 1 Integrin Expression Is Essential for Tumor Progression in Experimental Lung Cancer. American journal of respiratory cell and molecular biology 43:684-691. 152. Romzek NC, Harris ES, Dell CL i współ., (1998) Use of a beta1 integrin-deficient human T cell to identify beta 1 integrin cytoplasmic domain sequences critical for integrin function. Molecular biology of the cell 9:2715-27. Literatura 153. Roomi M, Monterrey J, Kalinovsky T, Rath M, Niedzwiecki A (2009) Patterns of MMP-2 and MMP-9 expression in human cancer cell lines. Oncology Report 21:1323–1333. 154. Rowe RG, Weiss SJ (2008) Breaching the basement membrane: who, when and how? Trends in cell biology 18:560–574. 155. Saladi SV, Keenen B, Marathe HG, Huiling Q I współ., (2010) Modulation of extracellular matrix/adhesion molecule expression by BRG1 is associated with increased melanoma invasiveness. Molecular cancer, 9(1):1 - 17 156. Schauer R (2004) Sialic acids: fascinating sugars in higher animals and man. Zoology 107:49-64. 157. Schwarzkopf M, Knobeloch KP, Rohde E i współ., (2002) Sialylation is essential for early development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences 99:5267-5270. 158. Schwetz T, Norring S, Ednie AR, Bennett ES (2011) Sialic acids attached to Oglycans modulate voltage-gated potassium channel gating. The Journal of biological chemistry 286:4123-32. 159. Seales EC, Shaikh FM, Woodard-Grice AV i współ., (2005) A protein kinase C/Ras/ERK signaling pathway activates myeloid fibronectin receptors by altering beta1 integrin sialylation. The Journal of biological chemistry 280:37610-5. 160. Seales EC, Jurado GA, Singhal A, Bellis SL (2003) Ras oncogene directs expression of a differentially sialylated, functionally altered beta1 integrin. Oncogene 22:7137-45. 161. Seftor RE, Seftor E, Hendrix MJ (1999) Molecular role(s) for integrins in human melanoma invasion. Cancer metastasis reviews 18:359-75. 162. Semel AC, Seales EC, Singhal A i współ., (2002) Hyposialylation of integrins stimulates the activity of myeloid fibronectin receptors. The Journal of biological chemistry 277:32830-6. 163. Shaikh FM, Seales EC, Clem WC i współ., (2008) Tumor cell migration and invasion are regulated by expression of variant integrin glycoforms. Experimental cell research 314:2941–2950. 164. Shen Q, Lee ES, Pitts RL, Wu MH, Yuan SY (2010) Tissue inhibitor of metalloproteinase- 2 regulates matrix metalloproteinase-2-mediated endothelial barrier dysfunction and breast cancer cell transmigration through lung microvascular endothelial cells. Molecular cancer research 8:939-51. 165. Sherman-Baust C, Weeraratna AT, Rangel LBA i współ., (2003) Remodeling of the extracellular matrix through overexpression of collagen VI contributes to cisplatin resistance in ovarian cancer cells. Cancer cell 3:377-86. 166. Sladden MJ, Balch C, Barzilai DA i współ., (2009) Surgical excision margins for primary cutaneous melanoma. Cochrane database of systematic reviews (Online):CD004835. 167. Stefanidakis M, Koivunen E (2006) Cell-surface association between matrix metalloproteinases and integrins: role of the complexes in leukocyte migration and cancer progression. Blood 108:1441-50. Literatura 168. Sterry W, Mielke V, Konter U, Kellner I, Boehncke WH (1992) Role of beta 1lntegrins in Epidermotropism of Malignant T Cells. American Journal of Pathology 141:855-860. 169. Stryer L, (2000) Biochemia, rozdział 18 pt. Węglowodany, str. 494 – 514, rozdział 35 pt. Kierowanie białek, str. 968 – 1006. 170. Suzuki M, Suzuki M, Nakayama J i współ., (2005) Polysialic acid facilitates tumor invasion by glioma cells. Glycobiology 15:887-94. 171. Takagi J, Strokovich K, Springer TA, Walz T (2003) Structure of integrin alpha 5 beta 1 in complex with fibronectin. EMBO Journal 22:4607-4615. 172. Takashima S, Tsuji S, Tsujimoto M (2002) Characterization of the second type of human beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase (ST6Gal II), which sialylates Galbeta 1,4GlcNAc structures on oligosaccharides preferentially. The Journal of biological chemistry 277:45719-28. 173. Tanaka F, Otake Y, Nakagawa T i współ., (2000) Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non-small cell lung cancer. Cancer research 60:3072-80. 174. Tani N, Higashiyama S, Kawaguchi N i współ., (2003) Expression level of integrin alpha 5 on tumour cells affects the rate of metastasis to the kidney. British journal of cancer 88:327-33. 175. (A) Taniguchi N, Honke K, Fukuda M (2002) Handbook of glycosyltransferases and related genes (Springer Verlag), rozdział ST6Gal-I, Hamamoto T, Tsuji S str 295 – 299. 176. (B) Taniguchi N, Honke K, Fukuda M (2002) Handbook of glycosyltransferases and related genes (Springer Verlag), rozdział ST3Gal, Kitazume – Kawaguchi S, Tsuji S, 279 – 288 177. (C) Taniguchi N, Honke K, Fukuda M (2002) Handbook of glycosyltransferases and related genes (Springer Verlag), rozdział ST8Sia-II: Kojima N, Tsuji S, 329 – 334, rozdział ST8Sia-IV: Nakayama J, Angata K, Suzuki M, Fukuda M, 340 – 346. 178. Taniguchi N, Jain SK, Takahashi M i współ., (1999) Glycosyltransferases: cell surface remodeling and regulation of receptor tyrosine kinases-induced signaling. Pure and Applied Chemistry 71:719-728. 179. Tomaselli KJ, Damsky CH, Reichardt LF (1988) Purification and characterization of mammalian integrins expressed by a rat neuronal cell line (PC12): evidence that they function as alpha/beta heterodimeric receptors for laminin and type IV collagen. The Journal of cell biology 107:1241-52. 180. Truzzi F, Marconi A, Lotti R i współ., (2008) Neurotrophins and their receptors stimulate melanoma cell proliferation and migration. Journal of Investigative Dermatology 128:2031–2040. 181. Tsuji S (1996) Molecular cloning and functional analysis of sialyltransferases. Journal of biochemistry 120:1. 182. Usui T, Takase M, Kaji Y i współ., (1998) Extracellular matrix production regulation by TGF-beta in corneal endothelial cells. Investigative ophthalmology & visual science 39:1981-9. Literatura 183. Vagin O, Kraut J, Sachs G (2009) Role of N-glycosylation in trafficking of apical membrane proteins in epithelia. American journal of physiology. Renal physiology 296:F459-69. 184. Varki A (1997) Sialic acids as ligands in recognition phenomena. The FASEB journal 11:248. 185. Varki A, Angata T (2006) Siglecs--the major subfamily of I-type lectins. Glycobiology 16:1R-27R. 186. Varki NM, Varki A (2007) Diversity in cell surface sialic acid presentations: implications for biology and disease. Laboratory investigation 87:851-7. 187. Varki A, Freeze HH i Manzi AE (2009) Preparation and analysis of glycoconjugates. Current protocols in molecular biology, 17, 1–17. 188. Vihinen P, Kahari V-M (2002) Matrix metalloproteinases in cancer: prognostic markers and therapeutic targets. International journal of cancer. 99:157-66. 189. Waldman E, Lu SX, Hubbard VM, i współ., (2006) Absence of beta7 integrin results in less graft-versus-host disease because of decreased homing of alloreactive T cells to intestine. Blood 107:1703-11. 190. Wall C, Conley P, Armendariz-Borunda J (1997) Expression of IIb 3 Integrin (GPIIb-IIIa) in Myeloid Cell Lines and Normal CD34+/CD33+ Bone Marrow Cells* 1. Blood Cells, Molecules, and Diseases 23:361-376. 191. Walsh N, Clynes M, Crown J, O'Donovan N (2009) Alterations in integrin expression modulates invasion of pancreatic cancer cells. Journal of experimental & clinical cancer research 28:140. 192. Wang FL, Cui SX, Sun LP i współ., (2009) High expression of [alpha] 2, 3-linked sialic acid residues is associated with the metastatic potential of human gastric cancer. Cancer detection and prevention 32:437–443. 193. Wang PH (2005) Altered glycosylation in cancer: sialic acids and sialyltransferases. J Cancer Mol 1:73–81. 194. Wang PH, Feng LY, Juang CM i współ., (2001) Altered mRNA Expression of Sialyltransferase in Squamous Cell Carcinomas of the Cervix. Gynecologic oncology 83:121–127. 195. Wang PH, Lee WL, Lee YR i współ., (2003) Enhanced expression of [alpha] 2, 6sialyltransferase ST6Gal I in cervical squamous cell carcinoma. Gynecologic oncology 89:395–401. 196. Wang PH (2006) Altered Sialylation and Its Roles in Gynecologic Cancers. Journal of Cancer Molecules 2:107-116. 197. Westermark B, Johnsson A, Betsholtz C, Heldin CH i współ., (1986) Human melanoma cell lines of primary and metastatic origin express the genes encoding the chains of platelet-derived growth factor (PDGF) and produce a PDGF-like growth factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 83:7197-200. 198. Wierinckx A, Auger C, Devauchelle O, Reynaud A i współ., (2007) A diagnostic marker set for invasion, proliferation, and aggressiveness of prolactin pituitary tumors. Endocrine-related cancer, 14(3):887-900. Literatura 199. Wierzbicka-Patynowski I, Schwarzbauer JE (2003) The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of cell science 116:3269-76. 200. Wiesner S, Legate KR, Fässler R (2005) Integrin-actin interactions. Cellular and molecular life sciences : CMLS 62:1081-99. 201. Wobbe L, Zimmermann D, Wißbrock M, Urman S, Sewald K, Malesevic M, Sewald N (2006) Integrin alpha 5 beta 1 : a new purification strategy based on immobilized peptides. Journal of peptide research 66:22-29. 202. Wopereis S, Lefeber DJ, Morava E, Wevers R a (2006) Mechanisms in protein Oglycan biosynthesis and clinical and molecular aspects of protein O-glycan biosynthesis defects: a review. Clinical chemistry 52:574-600. 203. Yamada KM, Pankov R, Cukierman E (2003) Dimensions and dynamics in integrin function. Brazilian journal of medical and biological research 36:959-66. 204. Yamamoto H, Saito, T, Kaneko, Y, Kersey D, Yong VW, Bremer EG, Mkrdichian E, Cerullo L, Leestma J, (1997) Alpha 2, 3-Sialyltransferase mRNA and alpha 2, 3-linked glycoprotein sialylation are increased in malignant gliomas. Brain research 755:175–179. 205. Yamamoto H, Oviedo A, Sweeley C, Saito T, Moskal JR (2001) Alpha2,6sialylation of cell-surface N-glycans inhibits glioma formation in vivo. Cancer research 61:6822-9. 206. Yoh H, Takao S, Aikou T (2002) A novel fluorometric invasion assay for quantitative determination of tumor cell invasion. Laboratory investigation 118:A769. 207. Zeng H, Briske-Anderson M (2005) Prolonged butyrate treatment inhibits the migration and invasion potential of HT1080 tumor cells. The Journal of nutrition 135:291. 208. Zhang X, Fournier MV, Ware JL, Bissell MJ, Zehner ZE (2009) Inhibiting Vimentin or beta 1-integrin Reverts Prostate Tumor Cells in IrECM and Reduces Tumor Growth. Molecular cancer therapies:1-30. 209. Zhang Z, Vuori K, Reed JC (1995) The alpha 5 beta 1 Integrin Supports Survival of Cells on Fibronectin and Up-Regulates Bcl-2 Expression. Proceedings of the National Academy of Sciences 92:6161-6165. 210. Zhao Q, Guo X, Nash GB, Stone PC i współ., (2009) Circulating Galectin-3 Promotes Metastasis by Modifying MUC1 Localization on Cancer Cell Surface. Cancer Research 69: 6799-6806 211. Zhu Y, Srivatana U, Ullah A i współ., (2001) Suppression of a sialyltransferase by antisense DNA reduces invasiveness of human colon cancer cells in vitro. Biochimica et Biophysica Acta 1536:148–160. 212. Zhuo Y, Chammas R, Bellis SL (2008) Sialylation of beta1 integrins blocks cell adhesion to galectin-3 and protects cells against galectin-3-induced apoptosis. The Journal of biological chemistry 283:22177-85. 213. Zinchuk V, Zinchuk O, Okada T (2007) Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta histochemica et cytochemica 40:101-11.