UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI W KRAKOWIE Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Zakład Biofizyki Komórki Rozprawa Doktorska Dynamika białek XRCC1 I HP1ß W OGNISKACH NAPRAWY DNA -BADANIA METODĄ FCS Krzysztof Berniak Promotor Pracy prof. dr hab. Jerzy Dobrucki Kraków 2019 Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Panu prof. dr. hab. Jerzemu Dobruckiemu za nieocenioną pomoc udzieloną w trakcie przygotowywania rozprawy doktorskiej, anielską cierpliwość i wyrozumiałość oraz motywację do krytycznego spojrzenia na problematykę badawczą. Szczególne podziękowania pragnę złożyć Panu Profesorowi za pomoc w jasnym formułowaniu myśli naukowej oraz inspirujące dyskusje. W celu zdobycia niezbędnego doświadczenia w samodzielnym prowadzeniu doświadczeń z użyciem techniki FCS odwiedziłem lub odbyłem staże naukowe w ośrodkach badawczych, gdzie ta technika jest często stosowana. W szczególności chciałbym serdecznie podziękować grupie prof. dr. hab. Marka Langnera z Politechniki Wrocławskiej, grupie dr. Tytusa Bernasia, Pracowni Obrazowania Struktury i Funkcji Tkankowej Instytutu Biologii Doświadczalnej z Warszawy oraz grupie prof. Martina Hofa z Instytutu Chemii Fizycznej im. Heyrovsky’ego Czeskiej Akademii Nauk w Pradze. Dzięki życzliwości i otwartości poznanych tam osób mogłem nabyć pierwsze praktyczne umiejętności w prowadzeniu pomiarów FCS w żywych komórkach oraz w analizie i interpretacji uzyskanych danych. Pozwoliło mi to wypracować na bazie zdobytych doświadczeń własny sposób prowadzenia eksperymentów metodą FCS. Dziękuję Pani dr Magdalenie Kordon za udostępnienie plazmidów do doświadczeń, liczne dyskusje oraz za przekazaną wiedzę. Serdecznie dziękuję dr Agnieszce Waligórskiej, dr. Mirosławowi Zarębskiemu oraz wszystkim Koleżankom i Kolegom z Zakładu Biofizyki Komórki, z Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ za życzliwość, pomoc oraz prawdziwą naukową atmosferę pracy. Pragnę podziękować mgr Agnieszce Hoang-Bujnowicz oraz Przyjaciołom za liczne i wielogodzinne dyskusje naukowe oraz wsparcie w czasie przygotowywania niniejszej pracy. Szczególne wyrazy wdzięczności składam Rodzicom oraz Bratu, których codzienne wsparcie, słowa otuchy, nieustająca wiara we mnie pomagały mi przezwyciężać wszelkie trudności i dodawały sił w realizacji wyznaczonych celów. ii Spis treści Rozdział 1. Lista skrótów........................................................1 Rozdział 2. Kluczowe definicje...................................................4 Rozdział 3. Streszczenie.........................................................6 Rozdział 4. Summary.............................................................10 Rozdział 5. Wstęp...............................................................14 5.1. Uszkodzenia DNA i ich konsekwencje.......................................14 5.2. Mechanizmy i ścieżki naprawy uszkodzeń DNA...............................15 5.2.1. Mechanizmy naprawy jednoniciowych pęknięć nici DNA...................16 5.2.2. Ścieżki naprawy dwuniciowych pęknięć nici DNA........................17 5.3. XRCC1....................................................................20 5.3.1. Rola XRCC1 w komórce.................................................20 5.3.2. Budowa cząsteczki XRCC1..............................................21 5.3.3. Dynamika XRRCC1......................................................22 5.4. HP1 .................................................................... 24 5.4.1. Rola białka HP1 w komórce............................................24 5.4.2. Budowa cząsteczki HP1................................................26 5.4.3. Dynamika HP1.........................................................26 5.4.4. HP1 w procesie naprawy DNA...........................................27 5.4.5. HP1 w replikacji DNA.................................................29 5.5. Dynamika cząsteczek w jądrze komórkowym..................................30 5.5.1. Dynamika cząsteczek na poziomie molekularnym w jądrze komórkowym 30 5.5.2. Dyfuzja prosta.......................................................31 5.5.3. Dyfuzja anomalna.....................................................32 5.5.4. Dyfuzja ograniczona..................................................32 5.5.5. Dyfuzja ułatwiona....................................................33 5.6. Metody pomiaru dynamiki i oddziaływań międzycząsteczkowych w jądrze komórkowym.........................................................34 5.6.1. Ogólne rozważania - skala czasowa i rozdzielczość metod..............35 5.6.2. Śledzenie pojedynczych cząstek.......................................35 5.6.3. Odzyskanie fluorescencji po fotoblaknięciu (FRAP)....................36 5.6.4. Utrata fluorescencji w wyniku fotoblaknięcia (FLIP)..................37 iii 5.6.5. Spektroskopia Korelacji Fluorescencji (FCS)..............................37 5.6.6. Bezpromienisty Rezonansowy Transfer Energii (FRET).......................39 5.7. Spektroskopia Korelacji Fluorescencji (FCS) - rozwinięcie.....................40 5.7.1. Wprowadzenie.............................................................40 5.7.2. Uproszczony formalizm matematyczny.......................................41 5.7.3. Zastosowanie metody FCS w badaniach układów biologicznych................44 5.7.3.1. Trudności w pomiarach FCS w komórkach................................44 Rozdział 6. Hipoteza i Cele badań....................................................47 Rozdział 7. Materiały i Metody.......................................................50 7.1. Materiały.....................................................................50 7.1.1. Linie komórkowe..........................................................50 7.1.2. Plazmidy kodujące wybrane białka naprawcze z przyłączonymi białkami fluorescencyjnymi..........................................................50 7.1.3. Płyny hodowlane, bufory, roztwory........................................51 7.1.4. Roztwory kalibracyjne do pomiarów FCS....................................51 7.1.5. Programy komputerowe.....................................................52 7.2. Metody........................................................................53 7.2.1. Hodowle komórkowe........................................................53 7.2.2. Transfekcja..............................................................53 7.2.3. Metoda wywoływania pęknięć nici DNA......................................53 7.2.4. Pomiar intensywności światła wzbudzającego...............................55 7.2.5. Mikroskopia i rejestracja obrazów........................................55 7.2.6. Pomiar ruchliwości XRCC1 w jądrze komórkowym metodą FLIP.................56 7.2.7. Analiza pomiarów FLIP....................................................57 7.2.8. Pomiar FCS...............................................................60 7.2.8.1. Konfiguracja układu mikroskopu do pomiarów FCS.......................61 7.2.8.2. Kalibracja mikroskopu do pomiarów FCS................................62 7.2.8.3. Przeprowadzenie pomiaru FCS w żywych komórkach.......................67 7.2.8.4. Pomiar mobilności HP1 w komórce metodą FCS...........................71 7.2.8.4.1. Pomiar mobilności eGFP -HP1ß w ognisku naprawczym metodą FCS 71 7.2.8.5. Pomiar mobilności XRCC1 metodą FCS...................................72 7.2.9. Analiza danych z pomiarów FCS............................................75 7.2.9.1. Testy statystyczne w analizie porównawczej modeli FCS................78 iv Rozdział 8. Wyniki..........................................................79 8.1. Program do półautomatycznej zbiorczej analizy pomiarów FCS . 79 8.2. Pomiary ruchliwości białka mRFP-XRCC1wt w komórce przy użyciu techniki FLIP....................................................83 8.2.1. Ruchliwość metki fluorescencyjnej mRFP w jądrze komórkowym.......84 8.2.2. Ruchliwość mRFP-XRCC1wt w jądrze komórkowym badana metodą FLIP ... 87 8.2.3. Ruchliwość mRFP-XRCC1wt w ognisku naprawy DNA....................90 8.3. Pomiary mobilności wolnych metek fluorescencyjnych w jądrze komórkowym metodą FCS...................................................92 8.3.1. Mobilność wolnego monomeru eGFP w nukleoplazmie..................92 8.3.2. Mobilność wolnego monomeru RFP w nukleoplazmie...................96 8.4. Mobilność mRFP-XRCC1wt w jądrze komórkowym metodą FCS 97 8.4.1. Mobilność znakowanego białka XRCC1 typu dzikiego.................98 8.4.1.1. Mobilność mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie.........................98 8.4.1.1.1. Mobilność mRFP-XRCC1 (znakowanego białka typu dzikiego) w nukleoplazmie.......................................................98 8.4.1.1.2. Mobilność eGFP-XRCC1 (znakowanego białka typu dzikiego) w nukleoplazmie......................................................102 8.4.1.2. Mobilność mRFP-XRRC1 (znakowanego białka typu dzikiego) w ognisku naprawy..............................................................104 8.4.2. Mobilność mRFP-XRCC1P537STOP w nukleoplazmie....................108 8.4.3. Mobilność mRFP-XRCC1L360R w nukleoplazmie.......................110 8.4.4. Mobilność mRFP-XRCC1S371A.......................................112 8.4.4.1. Mobilność mRFP-XRCC1S371A w nukleoplazmie...................112 8.4.4.2. Mobilność mRFP-XRCC1S371A w ognisku naprawczym..............114 8.4.5. Mobilność mRFP-XRCC1T284A.......................................116 8.4.5.1. Mobilność mRFP-XRCC1T284A w nukleoplazmie...................116 8.4.5.2. Mobilność mRFP-XRCC1T284A w ognisku naprawczym..............118 8.4.6. Mobilność mRFP-XRCC1S421A,T488A,S518A’T523A (XRCC1-4P)..........120 8.4.6.1. Mobilność mRPF-XRCC1S421A’T488A,S518A,T523A (XRCC1-4P) w nukleoplazmie..................................................121 8.4.6.2. Mobilność mRFP-XRCC1S421A’T488A,S518A,T523A (XRCC1-4P) w ognisku naprawczym.....................................................123 8.5. Mobilność HP1 w jądrze komórkowym............................125 8.5.1. Mobilność eGFP-HP1a w nukleoplazmie.............................125 8.5.2. Mobilność eGFP-HP1y w nukleoplazmie.............................128 v 8.5.3. Mobilność eGFP-HP1ß w nukleoplazmie............................130 8.5.3.I. Mobilność eGFP-HP1ß w ognisku naprawy......................131 8.6. Mobilność histonu H2B-eGFP.........................................135 Rozdział 9. Dyskusja......................................................137 9.1. Wpływ metki fluorescencyjnej na dynamikę białka fuzyjnego ... 140 9.2. Zbliżona mobilność wszystkich znakowanych paralogów białka HP1 w komórce.........................................................147 9.2.1. Mobilność znakowanych paralogów HP1 w cytoplazmie jako kontrola mobilności HP1....................................................148 9.2.2. Mobilność znakowanych paralogów HP1 w nukleoplazmie............151 9.3. Zmniejszenie mobilności eGFP-HP1ß w ognisku naprawy DNA 159 9.4. Mobilność znakowanego XRCC1 w nukleoplazmie........................168 9.4.1. Rodzaj metki fluorescencyjnej nie wpływa na mobilność XRCC1 w nukleoplazmie.......................................................168 9.4.2. Dwie subpopulacje białka XRCC1 w nukleoplazmie.................170 9.4.3. Dezaktywacja domen BRCT1 i BRCT2 zmienia mobilność znakowanego białka XRCC1 w nukleoplazmie......................................173 9.4.4. Dezaktywacja miejsc fosforylacji nie wpływa na mobilność znakowanego XRCC1 w nukleoplazmie.............................................175 9.5. XRCC1 w ognisku naprawy DNA dyfunduje wolniej niż w nukleoplazmie.........................................................176 ........................................................................179 9.5.1 Dezaktywacja miejsc fosforylacji XRCC1 nie wpływa na jego mobilność w miejscu uszkodzenia DNA.........................................179 9.6. Czy nietypowe oscylacje krzywej korelacyjnej mogą być śladem dyfuzji kierunkowej?..................................................182 Rozdział 10. Streszczenie wyników......................................186 Rozdział 11. Najważniejsze wnioski.....................................188 Rozdział 12. Perspektywy dalszych badań................................190 Rozdział 13. Spis tabel i rycin........................................193 Rozdział 14. Literatura ...............................................199 Rozdział 15. Dodatki...................................................210 Rozdział 16. Spis własnych publikacji..................................212 vi Rozdział 1. Lista skrótów Rozdział 1. Lista skrótów APD ang. Avalanche Photodiode; Fotodioda Lawinowa; BER ang. Base Excision Repair; mechanizm naprawy uszkodzeń DNA przez wycinanie zasady; BiFC ang. Bimolecular Fluorescence Complementation Assay; Metoda dwucząsteczkowego fluorescencyjnego uzupełnienia służąca do wykrywania oddziaływań między białkami; BRCT1 ang. BRCA1 C-Terminus 1; C-końcowa domena 1 białka BRCA1; BRCT2 ang. BRCA1 C-Terminus 2; C-końcowa domena 2 białka BRCA1; CD ang. Chromodomain; jedna z domen białka HP1 zlokalizowana bliżej N- końca; CSD ang. Chromoshadow domain; jedna z domen białka HP1 zlokalizowana bliżej C-końca; DMEM ang. Dulbecco’s Modified Eagle Medium; pożywka (podłoże) hodowlane stosowane w hodowlach komórek eukariotycznych; DMSO dimetylosulfotlenek; DNA kwas deoksyrybonukleinowy; DNA- ang. DNA-dependent Protein Kinase, catalytic subunit; katalityczna PKcs podjednostka kinazy białkowej zależnej od DNA; DSB ang. Double Strand Break; dwuniciowe pęknięcie cząsteczki DNA; eGFP ang. enhanced Green Fluorescent Protein; wzmocnione zielone białko fluorescencyjne, pochodna GFP zawierająca mutacje poprawiające jego stabilność i wydajność kwantową fluorescencji; FAD ang. Flavin Adenine Dinucleotide; dinukleotyd flawinoadeninowy; FBS ang. Fetal Bovine Serum; płodowa surowica bydlęca; FCCS ang. Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy; Spektroskopia Krzyżowej Korelacji Fluorescencji; FCS ang. Fluorescence Correlation Spectroscopy; Spektroskopia Korelacji Fluorescencji; FLCS ang. Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy; Spektroskopia Korelacji Czasu Życia Fluorescencji; 1 Lista skrótów Rozdział 1. FLIP FRAP FRET GFP HeLa HP1 HR mRFP MSD msFCCS NER NHEJ NLS NTD PAR PARP1 PARP2 PBS PEV RFP 2 ang. Fluorescence Loss In Photobleaching; technika pomiarowa w mikroskopii konfokalnej oparta o pomiar utraty sygnału fluorescencji w obszarze, który sąsiaduje z obszarem poddanym fotoblaknięciu; ang. Fluorescence Recovery After Photobleaching; odzyskiwanie fluorescencji po fotoblaknięciu; ang. Förster Resonance Energy Transfer; bezpromienisty rezonansowy transfer energii między dwoma chromoforami; ang. Green Fluorescent Protein; zielone białko fluorescencyjne, pochodzące z Aequorea victoria; linia komórkowa wyprowadzona w 1951 roku, wywodząca się z komórek raka szyjki macicy, pobranych od 31-letniej Henrietty Lacks, Afroamerykanki ; ang. Heterochromatin Protein 1; Heterochromatynowe białko 1; ang. Homologous Recombination; mechanizm naprawy uszkodzeń DNA poprzez rekombinację homologiczną; ang. Monomeric Red Fluorescent Protein; monomeryczne czerwone białko fluorescencyjne, pochodna RFP zawierająca punktową mutację zapobiegającą tworzeniu dimerów przez cząsteczki tego białka; ang. Mean Square Displacement; średni kwadrat przemieszczenia; ang. multi-scale Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy; wieloskalowa Spektroskopia Krzyżowej Korelacji Fluorescencji; ang. Nucleotide Excision Repair; mechanizm naprawy uszkodzeń DNA przez wycinanie nukleotydu; ang. Non-Homologous End Joining; mechanizm naprawy uszkodzeń DNA przez niehomologiczne łączenie końców; ang. Nuclear Localisation Sequence; sekwencja lokalizacji jądrowej; obszar białka warunkujący lokalizację jądrową białka w wyniku oddziaływania z czynnikami transportu; ang. N-Terminus Domain; domena N-końcowa białka; poli(ADP-ryboza); polimeraza poli(ADP-rybozy) typu 1; polimeraza poli(ADP-rybozy) typu 2; ang. Phosphate Buffered Saline; roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami; ang. Position-Effect Variegation; zjawisko wyciszania aktywności genu poprzez ulokowanie go w obszarze heterochromatyny; ang. Red Fluorescent Protein; czerwone białko fluorescencyjne, będące mutantem białka GFP; Rozdział 1. SPAD SSB SSBR TCSPC XRCC1 XRCC1-4P Lista skrótów ang. Single-Photon Avalanche Diode; jednofotonowa dioda lawinowa; ang. Single Strand Break; jednoniciowe pęknięcie cząsteczki DNA; ang. Single-Strand Break Repair; mechanizm naprawy jednoniciowych pęknięć DNA; ang. Time-Correlated Single Photon Counting; metoda zliczeń pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo; ang. X-ray Repair Cross Complementing Protein 1; białko typu 1 usuwające uszkodzenia DNA indukowane promieniami X; Mutant białka XRCC1, zawierający cztery mutacje punktowe dezaktywujące miejsca fosforylacji. Kolejno były nimi S421A - seryna na pozycji 421 zastąpiona alaniną, T488A - treonina na pozycji 488 zastąpiona alaniną, S518A - seryna z pozycji 518 zastąpiona alaniną oraz T523A - treonina zastąpiona alaniną; 3 Kluczowe definicje Rozdział 2. Rozdział 2. Kluczowe definicje Afterpulsing Czas retencji Dynamika Funkcja auto - cross korelacyjna Właściwość detektorów zliczających fotony (APD, SPAD) w czasie pomiarów. Detekcja fotonu związana jest z generowaniem pojedynczego sygnału przez detektor. Zdarza się jednak, że detektor może wygenerować także dodatkowy sygnał z opóźnieniem w zakresie nanosekund do mikrosekund względem pierwszego sygnału. Jest to zjawisko rzadkie (około 1% zliczeń), jednak w pomiarach FCS powoduje zwiększenie korelacji w zakresie od nanosekund do mikrosekund, która może istotnie wpłynąć na przebieg oraz amplitudę funkcji korelacyjnej. Średni czas przebywania cząsteczki w objętości detekcji. Opis ruchu cząsteczek pod wpływem działania czynników w zadanym otoczeniu. Pojęcie to rozszerza definicję mobilności o dodatkowy opis jej przyczyn takich jak występowanie miejsc wiązania, oddziaływanie międzycząsteczkowe lub oddziaływanie z innymi rodzajami cząsteczek. Dynamika nadaje charakter mobilności, jest miarą potencjalnego wpływu oddziaływań na ruchliwość cząsteczek w zadanym środowisku. Funkcja uzyskana w wyniku skorelowania ze sobą sygnału fluktuacji fluorescencji zarejestrowanej z użyciem dwóch detektorów w czasie pomiaru FCS. Rejestrowany sygnał pochodzi od tego samego fluoroforu, a został rozdzielony w celu zniwelowania wpływu szumów na końcowy kształt krzywej korelacyjnej. Wszystkie pomiary FCS zostały przeprowadzone tą metodą, dlatego wyrażenia funkcja autokorelacyjna i krzywa autokorelacyjna odnoszą się do pomiarów, w wyniku których wyznaczono funkcj ę auto-cross korelacyjną. 4 Rozdział 2. Kluczowe definicje Mobilność Ognisko DDR Ruchliwość Szybka i wolna subpopulacja Zagęszczenie molekularne (tłok molekularny) Sposób opisu ruchu cząsteczek w danym otoczeniu. Może dotyczyć zarówno ruchu cząsteczek swobodnych, jak i ruchu cząsteczek będących składnikami kompleksów. Mobilność nie opisuje wydajności procesu wiązania ani czasu trwania danego kompleksu. W tej pracy określa się ją na podstawie zbioru parametrów wyznaczonych z dopasowania wybranego modelu do krzywej FCS. Struktura cechująca się lokalnie wysokim stężeniem zgromadzonych białek uczestniczących w naprawie uszkodzenia DNA. Szacuje się, że pojedyncze ognisko może się składać z setek albo nawet tysięcy cząsteczek różnych białek. Miara opisująca zmianę położenia cząsteczki w czasie. W analizie pomiarów FCS korzystano najczęściej z dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem istnienia subpopulacji trypletowej. Parametry pierwszej składowej modelu (np. czas retencji, współczynnik dyfuzji) opisują subpopulację nazwaną w pracy skrótowo ”szybką”, a parametry drugiej składowej opisują subpopulację nazwaną w pracy skrótowo ”wolną”. Z ang. molecular crowding; własność środowiska komórki, polegająca na tym, iż makrocząsteczki, związki niskocząsteczkowe i elektrolity zajmują znaczną część jego objętości (Minton, 2001). 5 Streszczenie Rozdział 3. Rozdział 3. Streszczenie Jedno- i dwuniciowe pęknięcia DNA (odpowiednio z ang Single Strand Break, SSB i z ang Double Strand Break, DSB) powstają w jądrze komórkowym na skutek działania zarówno czynników endogennych (jak np. topoizomeraz, reaktywnych form tlenu powstałych podczas procesów metabolicznych), jak i egzogennych (np. promieniowania UV, promieniowania jonizującego). Nagromadzenie obu rodzajów pęknięć DNA może doprowadzić do zahamowania replikacji, transkrypcji lub śmierci komórki. Mechanizmy procesów naprawy zarówno SSB, jaki i DSB, nie są w pełni poznane. W przeprowadzonych doświadczeniach badałem dwa białka jądrowe, które zaangażowane są w proces naprawy SSB (XRCC1) oraz DSB (HP1) i gromadzą się w rejonach wokół uszkodzonego DNA. Wysoka intensywność fluorescencji ogniska świadczy o lokalnym wysokim stężeniu tych białek. Nie wiadomo jaka jest rola tak dużej liczby zgromadzonych w ognisku naprawy cząsteczek. Zastosowanie metody Spektroskopii Korelacji Fluorescencji (z ang. Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS) pozwoliło na wykazanie istnienia subpopulacji tych białek różniących się mobilnością, co pośrednio dostarcza informacji na temat mechanizmu wiązania oraz ich roli w naprawie DNA. Białko jądrowe XRCC1 (z ang. X-ray Repair Cross-Complementing Protein 1) jest to nieenzymatyczny czynnik uczestniczący w procesie naprawy jednoniciowych pęknięć nici DNA. Pełni ono rolę platformy dla innych białek zaangażowanych w ten proces takich jak ligaza DNA III, polimerazy PARP1, PARP2, polimerazy ß czy glikozydazy OGG1. Heterochromatynowe białko 1 (z ang. Heterochromatin Protein 1, HP1) jest jednym z głównych składników heterochromatyny oraz istotnym czynnikiem zaangażowanym w proces wyciszania genów ulokowanych w obrębie heterochromatyny (Position-Effect Variegation, PEV). Różne potranslacyjnie zmodyfikowane formy HP1 są zaangażowane w wiele procesów jądrowych, w tym tzw. 'remodeling chromatyny', replikację i naprawę DNA. Białko HP1 ulega rekrutacji w obszar jądra, w którym zostały indukowane 6 Rozdział 3. Streszczenie fotouczulane uszkodzenia oksydacyjne (Zarebski, Wiernasz, & Dobrucki, 2009). Bezpośrednio w proces naprawy zaangażowanych jest niewiele cząsteczek HP1. Tworzą one kompleks z PCNA. Ich wykrycie było możliwe metodą dwucząsteczkowego fluorescencyjnego dopełnienia (z ang. Bimolecular Fluorescence Complementation Assay, BiFCj (Trembecka-Lucas, 2013). Rola pozostałych cząsteczek gromadzących się w obszarze okalającym miejsce uszkodzenia DNA pozostaje niejasna. Dynamika białek jądrowych i włókien chromatyny może być badana z zastosowaniem zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej, takich jak FCS i utraty fluorescencji w wyniku fotoblaknięcia (z ang. Fluorescence Loss In Photobleaching, FLIP). Metoda FLIP opiera się na monitorowaniu spadku intensywności fluorescencji z obszaru poza fotoindukowanym blaknięciem przy równoczesnym prowadzeniu tegoż procesu blaknięcia. Z kolei bardziej wyrafinowana metoda FCS pozwala oszacować współczynnik dyfuzji, stężenie czy stan agregacji danego białka fuzyjnego. W pomiarze FCS rejestrowane są fluktuacje fluorescencji z subfemtolitrowej objętości pomiarowej utworzonej poprzez ogniskowanie wiązki lasera w wybranym miejscu w komórce. Krzywa FCS tworzona jest poprzez analizę korelacyjną zarejestrowanej fluktuacji fluorescencji. Z dopasowania modeli do krzywej można uzyskać informacje na temat stężenia i możliwych subpopulacji różniących się mobilnością. Modele takie uwzględniają fluktuacje fluorescencji wywołane przechodzeniem cząsteczek w trypletowy stan ciemny oraz dyfuzję normalną lub anomalną wieloskładową. Głównymi celami pracy było zbadanie mobilności wybranych białek zaangażowanych w proces naprawy jedno- i dwuniciowych pęknięć cząsteczki DNA w rejonie lokalnego uszkodzenia chromatyny. Dodatkowo porównałem mobilność znakowanego fluorescencyjnie białka XRCC1 formy dzikiej z jego wybranymi znakowanymi mutantami zarówno w nukleoplazmie, jak i w miejscu prowadzonej aktywnie naprawy DNA. Pomiary FCS wykonywałem na komórkach HeLa z przejściową ekspresją białek jądrowych z metką fluorescencyjną. W celu oszacowania wpływu metki fluorescencyjnej na mobilność takiego białka fuzyjnego dokonałem także pomiaru mobilności samego białka fluorescencyjnego w jądrze komórkowym. Zarówno wzmocnione zielone białko fluorescencyjne (z ang. enhanced green fluorescent protein, eGFP), jak i monomeryczne czerwone białko fluorescencyjne (z ang. monomeric red fluorescent protein, mRFP) 7 Streszczenie Rozdział 3. wykazują wysoką mobilność w jądrze komórkowym (w obu przypadkach współczynnik dyfuzji D > 30 ^m2/s). Analiza statystyczna dopasowania modeli do krzywych autokorelacji dla wolnych metek wskazuje w obu przypadkach, że model dyfuzji prostej z jedną składową jest wystarczający do opisu ich mobilności w jądrze komórkowym. Pomiary FCS białka fuzyjnego mRFP-XRCC1 wykazały istnienie co najmniej dwóch subpopulacji XRCC1 różniących się mobilnością w nukleoplazmie. Mobilność postulowanych subpopulacji różni się około dwudziestokrotnie. Uzyskane wyniki mogą wskazywać, że część cząsteczek XRCC1 oddziałuje z chromatyną. Dla jednego ze zbadanych mutantów XRCC1P537STOP, w którym brakuje domeny BRCT2, uzyskane wyniki wskazują na wzrost mobilności w obszarze nukleoplazmy, ale także na spadek ilości białka poruszającego się wolniej. W ogniskach naprawy DNA XRCC1 wykazuje dynamiczny charakter. Zgromadzone XRCC1 znajdują się w równowadze dynamicznej z otoczeniem. W sposób ciągły następuje wymiana cząsteczek XRCC1 zakumulowanych w ogniskach. Mobilność cząsteczek XRCC1 w obszarze naprawy jest mniejsza niż mobilność białka XRCC1 w nukleoplazmie. Natomiast dezaktywacja wybranych miejsc fosforylacji nie wpłynęła na zdolność do gromadzenia się XRCC1 w obszarze prowadzonej naprawy, a jego mobilność nie różni się od znakowanego białka XRCC1 formy dzikiej. Wyniki doświadczeń FCS dla wszystkich znakowanych paralogów HP1 wskazują na istnienie dwóch subpopulacji w nukleoplazmie. Pierwszą, szybszą można utożsamiać ze swobodnie poruszającymi się cząsteczkami HP1, natomiast drugą z subpopulacją związaną z chromatyną. Interpretacja tak jest zasadna także na podstawie uzyskanych wyników dla znakowanego histonu H2B, które wskazują na bardzo podobną wartość współczynnika dyfuzji subpopulacji tego histonu oraz HP1. Mobilność cząsteczek eGFP- HP1 jest mniejsza niż mRFP-XRCC1 m.in. z powodu większego stopnia oddziaływania HP1 z chromatyną. HP1 w odpowiedzi na lokalnie powstałe uszkodzenie DNA tworzy ogniska, które także wykazują się wewnętrzną dynamiką. Cały czas podczas prowadzonej naprawy następuje wymiana cząsteczek HP1 pomiędzy utworzonym ogniskiem a pulą znajdującą się w nukleoplazmie. Na podstawie analizy pomiarów FCS postulować można także istnienie co najmniej trzech subpopulacji HP1 w ognisku naprawy. Pierwsza opisuje cząsteczki HP1 nie wiążące się do chromatyny, jednak ze względu na lokalne zagęszczenie molekularne (Minton, 2001) ma utrudnioną możliwość poruszania się w porównaniu do analogicznej niezwiązanej subpopulacji HP1 w nukleoplazmie. Dwie 8 Rozdział 3. Streszczenie pozostałe subpopulacje znajdujące się w ognisku naprawy DNA, o współczynnikach dyfuzji D2HP1ß(ognisko) = 1,13±0,78 p,m2/s i D3HP1ß(ognisko) = 0,17±0,05 p,m2/s, zapewne oddziałują z chromatyną. Jedna z postulowanych subpopulacji porusza się z tempem domniemanej mobilności chromatyny w miejscu uszkodzenia. Możliwe, że obie subpopulacje uczestniczą w tworzeniu mostków między włóknami chromatyny i w jej lokalnej stabilizacji. Podsumowując, w niniejszej pracy doktorskiej wykorzystano zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do pomiaru mobilności wybranych białek naprawczych w nukleoplazmie, a także w obszarze ich gromadzenia powstałego na skutek lokalnego uszkodzenia DNA wywołanego światłem widzialnym. Tworzone ogniska składają się z cząsteczek będących w równowadze dynamicznej z otoczeniem, a ich lokalna mobilność w obszarze ogniska naprawy jest znacząco mniejsza od ich mobilności w nukleoplazmie. Prawdopodobnie w obszarze naprawy następuje wzrost liczby miejsc wiązania na chromatynie dla cząsteczek XRCC1 i HP1, co może oznaczać, że zgromadzone białka mogą także uczestniczyć w procesie przywoływania pozostałych czynników lub w lokalnym stabilizowaniu chromatyny. 9 Summary Rozdział 4. Rozdział 4. Summary Single and Double-Strand DNA breaks (SSB and DSB respectively) arise in the cell nucleus due to the action of endogenous (e.g. topoisomerases, reactive oxygen species resulting from metabolic processes) as well as exogenous factors (eg. UV, ionizing radiation). Accumulation of both types of DNA breaks can inhibit DNA replication, transcription or can even lead to cell death. The mechanisms of SSB and DSB repair are not fully understood. In my doctoral thesis I studied two nuclear proteins which are involved in the SSB and DSB repair processes. In microscopic images, the labeled repair proteins form high fluorescence intensity foci containing a high local concentration of these proteins. The role of such a large number of recruited molecules is unknown. Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) demonstrated the existence of subpopulations of these proteins differing in mobility, thus indirectly providing information about the mechanism of binding and their role in DNA repair. The X-ray Repair Cross-Complementing Protein 1 (also known as XRCC1) is a non- enzymatic factor engaged in the SSB repair process. It acts as a platform for other proteins involved in the repair process e.g. for DNA ligase III, polimerase PARP1, polimerase PARP2, polymerase ß or glycosidase OGG1. Heterochromatin protein 1 (HP1) is one of the major components of heterochromatin and an important factor involved in the process of gene silencing located within heterochromatin (position-effect variegation, PEV). Various post-translationally modified forms of HP1 are involved in many nuclear processes, including so-called 'chromatin remodeling', DNA replication and repair. HP1 protein is recruited into the area of the nucleus in which photosensitive oxidative damage was induced (Zarebski et al., 2009). There are only a few HP1 molecules involved in the repair process. That form a complex with PCNA (their detection was possible using the Bimolecular Fluorescence Complementation Assay technique (BiFC) (Trembecka-Lucas, 2013). The role of other HP1 molecules accumulating in the area surrounding the site of DNA damage remains unknown. 10 Rozdział 4. Summary The dynamics of nuclear proteins and chromatin fibers can be studied using advanced fluorescence microscopy techniques, including Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) and FCS. FLIP method is based on monitoring the decrease of fluorescence intensity in the area outside of a continuously photobleached region. In turn, the more sophisticated FCS method allows to estimate the diffusion coefficient, concentration or aggregation state of a given fusion protein. In the FCS measurement, fluorescence fluctuations from the subfemtoliter volume formed by focusing the laser beam in a selected spot in a cell are monitored. The FCS curve is created by correlation analysis of the registered fluorescence fluctuations. The fit parameters of the models to the curves provide information on the concentration and possible subpopulations that differ in mobility. Such models take into account fluorescence fluctuations caused by exciting the molecules into a triplet dark state, and the normal or anomalous multicomponent diffusion. The main goals of the study were to analyze the mobility of selected proteins involved in the repair process of SSB and DSB in repair foci. In addition, the mobility of fluorescently tagged wild type XRCC1 protein was compared with its selected labeled mutants in nucleoplasm as well as in the site of actively conducted DNA repair. I performed FCS measurements on HeLa cells with a transient expression of nuclear proteins with a fluorescent tag. In order to assess the effect of a fluorescent label on the mobility of such a fusion protein, the mobility of the fluorescent protein itself was measured in the cell nucleus. Both eGFP (enhanced green fluorescent protein) and mRFP (monomeric red fluorescent protein) show high mobility in the cell nucleus (in both cases, diffusion coefficient D > 30 p,m2/s). In both cases statistical analysis of model fitting to autocorrelation curves for free tags indicates that the simple diffusion model with one component is sufficient to describe their mobility in the cell nucleus. FCS measurements of the mRFP-XRCC1 fusion protein revealed the existence of at least two XRCC1 subpopulations differing in nucleoplasmic mobility approximately twenty times. The obtained results may indicate that some of the XRCC1 molecules interact with chromatin. For the mutant XRCC1P537STOP which lacks BRCT2 domain, the results indicate an increased XRCC1P537STOP mobility in the nucleoplasm area but also a decreased amount of protein moving more slowly. In the sites where DNA repair is carried out XRCC1 foci show a dynamic nature. The XRCC1 molecules accumulated in 11 Summary Rozdział 4. repair foci are in dynamic equilibrium with the surrounding environment, and they are continuously exchanged. Mobility of XRCC1 molecules in the repair region is lower than the mobility of XRCC1 protein in nucleoplasm. Furthermore, deactivation of selected phosphorylation sites did not affect the ability of XRCC1 to accumulate in the area of repair, and its mobility does not differ from the labeled XRCC1 protein of the wild form. The results of FCS experiments for all labeled HP1 paralogs indicate the existence of two subpopulations in nucleoplasm. On one hand, I postulate that the faster one corresponds to the free moving molecules of HP1. On the other hand, the slower one is related to the subpopulation associated with chromatin. This interpretation is valid also on the basis of the results obtained for the fluorescently tagged H2B histone, which indicate a very similar value of the diffusion coefficient of the histone and HP1 subpopulations. The mobility of eGFP-HP1 molecules is smaller than this of mRFP-XRCC1, most likely due to a greater degree of interaction of HP1 with chromatin. In response to locally induced DNA damage HP1 forms foci that also show internal dynamics. All the time during the repair, the HP1 molecules are exchanged between the repair focus and the pool located in nucleoplasm. Based on the analysis of FCS measurements, It is postulated the existence of at least three HP1 subpopulations in the area of the repair. The first one describes HP1 molecules that do not bind to chromatin, nonetheless, due to its potential concentration it has an impaired ability to move in comparison to the analogous unbound HP1 subpopulation in nucleoplasm. The other two subpopulations located in the area of DNA repair with diffusion coefficients D2HP1ß (focus) = 1.13 ± 0.78 p,m2/s and D3HP1ß (f°cus) = 0.17 ± 0.05 p,m2/s probably interact with chromatin. One of the postulated subpopulations moves with the rate of a presumed chromatin mobility at the site of damage. It is possible that both subpopulations participate in the formation of bridges between chromatin fibers and in local chromatin stabilization. In conclusion, in this dissertation advanced confocal microscopy techniques were used to measure the mobility of selected repair proteins in nucleoplasm, as well as in the area of their accumulation in the site of local DNA damage caused by visible light. The emerged foci consist of molecules which are in dynamic equilibrium with the environment. Moreover, their local mobility in the area of the repair focus is significantly smaller than their mobility in nucleoplasm. Probably the number of binding sites for XRCC1 and HP1 in the repair foci is increased in comparison with the surrounding chromatin. This implies 12 Rozdział 4. Summary that the accumulated proteins may also participate in the recruitment of other factors or in local chromatin stabilization. 13 Wstęp Rozdział 5. Rozdział 5. Wstęp 5.1. Uszkodzenia DNA i ich konsekwencje Każdego dnia w komórce somatycznej dochodzi średnio nawet do siedemdziesięciu tysięcy różnego rodzaju zmian oraz uszkodzeń DNA (Tubbs & Nussenzweig, 2017). Jest to niewielka liczba w stosunku do rozmiarów całego genomu komórki, jednak nienaprawione mogą w krytycznych miejscach zaburzyć jej funkcjonowanie. Utrzymujące się pęknięcia nici DNA mogą powodować śmierć komórki lub transformację nowotworową poprzez inaktywację genów supresorowych nowotworów lub poprzez aktywację onkogenów (Khanna & Jackson, 2001; Jackson, 2002). Duża część uszkodzeń DNA wiąże się z chemicznymi modyfikacjami zasad azotowych, które mogą spowodować występowanie wiązań chemicznych nie występujących w nieuszkodzonej strukturze DNA (np. dimery pirymidynowe). Uszkodzenia DNA można sklasyfikować jako endogenne oraz egzogenne. Pierwsze z nich są najczęściej wywoływane poprzez działanie reaktywnych form tlenu, które powstają w procesach metabolicznych komórki (głównie w łańcuchu oddechowym, ale także w wyniku działania niektórych oksydaz). Pod wpływem wewnętrznych czynników zasady azotowe mogą ulec utlenieniu, alkilowaniu bądź depurynacji. Egzogenne uszkodzenia są wywoływane czynnikami zewnętrznymi np. promieniowaniem ultrafioletowym lub jonizującym, wysoką temperaturą, związkami chemicznymi (np. nadtlenkiem wodoru) lub lekami przeciwnowotworowymi. Do takich leków zalicza się środki alkilujące DNA (np. metanosulfonian metylu), czynniki sieciujące (np. cisplatynę) lub inhibitory topoizomeraz typu I (np. kamptotecynę) oraz typu II (np. etopozyd), które indukują tworzenie SSB i DSB. Kamptotecyna poprzez interkalację pomiędzy zasady azotowe DNA w miejscu kowalencyjnego wiązania topoizomerazy typu I do DNA uniemożliwia odtworzenie wiązania fosfodiestrowego w zrelaksowanej nici. Wysoka temperatura zwiększa tempo depurynacja i powstawania SSB. Promieniowanie UV może spowodować powstanie pęknięć jedno- i dwuniciowych DNA. Uszkodzenia indukowane przez UV-B mogą także obejmować wytworzenie dimerów pirymidynowych, w których 14 Rozdział 5. Wstęp występuje wiązanie krzyżowe między resztami cytozyny i tyminy. Dimery pirymidynowe mogą zakłócać działanie polimeraz i zaburzać replikację DNA. Powszechnie występujące w dymie papierosowym lub spalinach samochodowych wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (z ang. polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs) mogą prowadzić do uszkodzenia DNA. Głównym znacznikiem uszkodzeń indukowanych przez PAHs jest Epoksyd benzo(A) piren-diolowy (z ang. Benzo(a)pyrene diol epoxide - BPDE). BPDE jest bardzo reaktywny i wiąże się kowalencyjnie z białkami, lipidami oraz resztami guaniny tworząc addukty BPDE. Nienaprawione, mogą prowadzić do transformacji nowotworowej komórek. 5.2. Mechanizmy i ścieżki naprawy uszkodzeń DNA W celu utrzymania integralności i funkcjonalności genomu komórka eukariotyczna dysponuje kilkoma wyspecjalizowanymi ścieżkami naprawy. Na podstawie klasycznego podręcznika Genomy autorstwa T.A. Browna (Brown, 2009) wszystkie mechanizmy naprawy DNA w komórkach eukariotycznych można podzielić na cztery kategorie: • naprawa bezpośrednia, polegająca na prostym odwróceniu reakcji z udziałem odpowiednich enzymów; • naprawa przez wycięcie fragmentu polinukleotydowego i ponowna synteza z udziałem polimerazy DNA; • naprawa błędnie sparowanych nukleotydów; • łączenie niehomologicznych końców nici DNA. Jest to podział w pewnym sensie subiektywny. Brakuje w nim bowiem mechanizmu rekombinacji homologicznej, który jest głównym źródłem zmienności dziedzicznej, ale także pełni rolę szlaku naprawy dwuniciowych pęknięć DNA. Tylko niewielka część uszkodzeń DNA jest naprawiana w sposób bezpośredni. Przerwanie wiązania fosfodiestrowego powstałego na skutek działania promieniowania jonizującego może być naprawiane na drodze ligacji przez ligazę DNA i wymaga energii w postaci ATP. Uszkodzenia alkilacyjne (metylacja, etylacja zasad fosforanowych) naprawiane są poprzez przeniesienie grupy alkilowej na łańcuch polipeptydowy transferazy (np. reszta metylowa przenoszona jest przez metylotrasferazę na jej własną cysteinę). Jest to reakcja dezaktywująca enzym i nieodwracalna. Jednak wspomniane wyżej mechanizmy naprawy bezpośredniej stanowią jedynie niewielką część wszystkich mechanizmów naprawy DNA. Ważną kategorię stanowi naprawa przez wycinanie. Obejmuje ona dwa rodzaje ścieżek naprawy: naprawę przez wycinanie zasad (z ang. base 15 Wstęp Rozdział 5. excision repair, BER) oraz naprawę przez wycinanie nukleotydów (z ang. nucleotide excision repair, NER). Naprawa szlakiem BER inicjowana jest poprzez glikozylazę DNA. W procesie tym przecinane jest wiązanie ß-N-glikozydowe między uszkodzoną zasadą, a cukrowym składnikiem nukleotydu. Powstałe miejsce pozbawione zasady zamieniane jest w jednonukleotydową lukę przez endonukleazę AP, wraz z możliwym udziałem fosfodiesterazy, której zadaniem jest usunięcie reszty cukrowej. Powstała luka jest wypełniana przez polimerazę DNA, która dobudowuje zasadę komplementarną do zasady na nieuszkodzonej nici komplementarnej (u E.coli wykorzystywana jest polimeraza DNA I, a u ssaków polimeraza DNA ß). Na koniec ligaza DNA tworzy wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy oboma końcami nici DNA (Kim & Wilson Iii, 2013; Krokan & Rjoras, 2013). Do naprawy poważnych uszkodzeń, takich jak połączenia wewnątrz nici (np. dimery pirymidynowe) czy zasady z przyłączonymi dużymi grupami chemicznymi, wykorzystywany jest szlak NER. Jest to proces podobny do naprawy BER, lecz nie poprzedza go selektywne wycinanie zasad. W ścieżce NER usuwany jest nie tyko uszkodzony (zmodyfikowany) nukleotyd, ale cały otaczający go fragment łańcucha polinukleotydowego, który może sięgać nawet 30 nukleotydów. Białka XPA i XPC rozpoznają fragment zawierający uszkodzony nukleotyd, następnie endonukleazy XPG oraz XPF nacinają nić DNA po obu stronach wadliwego nukleotydu. Podwójna helisa jest rozplatana poprzez helikazy XPD i XPB umożliwiając w ten sposób uwolnienie fragmentu zawierającego wadliwy nukleotyd. Następnie brakujący fragment jest syntetyzowany przez polimerazę DNA, a wiązanie fosfodiestrowe pomiędzy końcami jest odtwarzane przez ligazę DNA (Goosen, 2013; Spivak, 2015). 5.2.1. Mechanizmy naprawy jednoniciowych pęknięć nici DNA Pęknięcie pojedynczej nici DNA (z ang. Single Strand Break, SSD) nie jest tak niebezpieczne dla komórki jak pęknięcie dwuniciowe, ponieważ integralność chromosomu nie jest naruszona. Jednak, SSB to najczęściej występujące uszkodzenia DNA w komórce rzędu kilkudziesięciu tysięcy na komórkę na dzień (Caldecott, 2008; Tubbs & Nussenzweig, 2017). Powstawanie jednoniciowych pęknięć jest także stanem przejściowym w procesach naprawy NER i BER wspomnianych wcześniej. W celu zapewnienia stabilności genetycznej komórka dysponuje licznymi mechanizmami 16 Rozdział 5. Wstęp zdolnymi szybko i efektywnie naprawiać jednoniciowe pęknięcia DNA. Za ich naprawę głównie odpowiada szlak zwany SSBR (z ang. single-strand break repair). W początkowym etapie fragment uszkodzonego DNA pokrywany jest przez cząsteczki polimerazy poli(ADP-rybozy)-1 (PARP1) i możliwe, że także przez polimerazę poli(ADP-rybozy)-2 (PARP2) (Lindahl et al., 1995; Matsumoto & Kim, 1995). Ich zadaniem jest chronienie nieuszkodzonej komplementarnej nici DNA przed możliwymi zdarzeniami rekombinacyjnymi lub pęknięciem, co doprowadziłoby do powstania dwuniciowego pęknięcia nici DNA. Jednak przyłączenie się polimerazy PARP-1 do nici DNA, jak i jej aktywność, są przejściowe, a jej rola nie jest do końca poznana. Część prac sugeruje, że PARP-1 jest wymagane do gromadzenia się w miejscu naprawy białka XRCC1, pełniącego funkcję molekularnego rusztowania dla kolejnych gromadzących się białek (El-Khamisy et al., 2003; Lan et al., 2004). Przyłączenie PARP-1 do nici DNA oraz nowo syntetyzowanego łańcucha poli(ADP-rybozy) (PAR) może powodować lokalne zmiany w strukturze chromatyny. Kolejnym krokiem, po rozpoznaniu uszkodzenia jest przygotowanie wolnych końców 3’ i 5’ pękniętej nici DNA do ligacji (Caldecott, 2008). Celem tego kroku jest odtworzenie końców 3’ z przyłączoną grupą hydroksylową oraz 5’ z przyłączoną resztą fosforanową niezbędnych w dalszych etapach naprawy. Do tej pory wskazano wiele enzymów zaangażowanych w ten krok, jak polinukleotydowa kinaza 3’-fosfataza PNKP (Jilani et al., 1999; Karimi-Busheri et al., 1999), fosfodiesteraza TDP1 (Pouliot et al., 1999), czy polimeraza ß (Wilson et al., 2000). Należy odnotować, że białko XRCC1 odgrywa istotną funkcję na tym etapie naprawy. Wykazano, że XRCC1 oddziałuje z wieloma enzymami zaangażowanymi w proces naprawy jak PNKP, polimeraza ß, APTX oraz stymuluje ich gromadzenie w miejscu uszkodzenia (Lan et al., 2004; Hirano et al., 2007). Zrekonstruowanie końców DNA umożliwia rozpoczęcie procesu przyłączenia brakujących nukleotydów a następnie ligacji obu końców DNA. Za uzupełnienie sekwencji może odpowiadać wiele polimeraz. Doniesienia literaturowe wskazują na obecność polimeraz ß, X, 5, i, s (Caldecott, 2008). 5.2.2. Ścieżki naprawy dwuniciowych pęknięć nici DNA Bardzo niebezpiecznym zagrożeniem dla komórki są dwuniciowe pęknięcia DNA, gdyż następuje wtedy utrata ciągłości chromosomu. U większości organizmów eukariotycznych występują dwa odrębne szlaki naprawy tych pęknięć. Są to naprawa poprzez rekombinację homologiczną (z ang. homology recombination, HR) oraz naprawa 17 Wstęp Rozdział 5. poprzez scalanie niehomologicznych końców (z ang. non-homologous end joining, NHEJ). Rekombinacja homologiczna jest skutecznym szlakiem naprawy dwuniciowych pęknięć DNA wyróżniającym się dużą wiernością w odtwarzaniu uszkodzonego fragmentu nici DNA. Kluczowym elementem tej ścieżki naprawy jest wykorzystanie sekwencji chromosomu homologicznego jako matrycy w celu zrekonstruowania pękniętych nici DNA. Ponieważ w tej ścieżce naprawy niezbędne jest istnienie chromosomu homologicznego szlak naprawy HR dominuje w fazie S i G2 cyklu komórkowego. Obecnie uważa się, że główną funkcją homologicznej rekombinacji jest poreplikacyjna naprawa DNA, natomiast udział w procesie crossing-over ma drugorzędne znaczenie (Li & Heyer, 2008). Uogólniając, proces naprawy składa się z następujących kroków: wytworzenie jednoniciowego DNA, formowania presynaptycznego kompleksu nukleoproteinowego, wymiany nici z utworzeniem heterodupleksu, uformowanie struktury Hollidaya, przemieszczenie się rozgałęzienia oraz rozdzielenie cząsteczek DNA. Pierwszym etapem naprawy jest wykrycie miejsca uszkodzenia przez białko RAD52 oraz kompleks MRE11/RAD50. Kolejnym krokiem jest wytworzenie jednoniciowych końców DNA zakończonych wolną grupą 3’-OH. Białko RAD51 razem z innym białkami tworzą kompleks presynaptyczny z pojedynczą nicią DNA, a następnie rozpoznają homologiczną sekwencję DNA i przeprowadzają wymianę nici. Pod koniec rekombinacji następuje rozdzielenie łańcuchów DNA matrycy i kopii oraz naprawa błędnie sparowanych zasad azotowych w przypadku, gdy dwie nici stanowiące produkt rekombinacji nie są w pełni komplementarne. Naprawa uszkodzeń DNA na drodze homologicznej rekombinacji składa się z serii powiązanych ze sobą szlaków. Ich niuanse zostały szczegółowo opisane w przeglądowych pracach (Li & Heyer, 2008; San Filippo, Sung, & Klein, 2008; Krejci et al., 2012; Jasin & Rothstein, 2013). Naprawa poprzez scalanie niehomologicznych końców (NHEJ) jest bardziej narażona na możliwość wystąpienia błędu w jej toku. Komórka nie wykorzystuje drugiej, nienaruszonej cząsteczki DNA jako matrycy do odtworzenia sekwencji. Ścieżka NHEJ jest wykorzystywana przez komórkę częściej niż HR, głównie w fazie G1 cyklu komórkowego, kiedy jeszcze jej materiał genetyczny nie uległ podwojeniu. DSB rozpoznawane jest w tej ścieżce naprawy przez cząsteczki białka Ku, które mogą się wiązać jedynie z końcami nici DNA. Na każdym z obu końców dwie podjednostki białka Ku tworzą heterodimer (Ku70-Ku80) otaczający fragment DNA. Dzięki wzajemnemu 18 Rozdział 5. Wstęp powinowactwu heterodimerów do siebie zbliżają one końce pękniętej nici (Downs & Jackson, 2004). Białko Ku wiąże się z DNA razem z kinazą serynowo-treoninową DNA- PKcs. (Spagnolo et al., 2006). Kinaza tworzy kompleks z białkiem Artemis, mającym aktywność egzonukleazy 5’^3’. Ufosforylowane przez kinazę DNA-PKcs białko Artemis wykazuje zarówno właściwości egzo- jak i endonukleazy (Goodarzi et al., 2006; Lieber, 2011). Aktywuje ono białko XRCC4, które tworzy kompleks z ligazą DNA IV, kierując je do miejsca pęknięcia (Grawunder et al., 1997). O wyborze ścieżki naprawy może decydować faza cyklu komórkowego, aczkolwiek nie można wykluczyć także innych czynników. Wpływ na wybór ścieżki naprawy może mieć także współzawodnictwo o wolne końce DNA pomiędzy kluczowymi czynnikami obu szlaków - białka Ku i RAD52 (Van Dyck et al., 1999). Białko 53BP1 może pełnić także rolę w wyborze ścieżki naprawy. Według doniesień literaturowych 53BP1 zapobiega wycinaniu nukleotydów z końca 5’ nici DNA powstrzymując w ten sposób naprawę na drodze HR, a promując ścieżkę NHEJ (Chapman et al., 2012; Zimmermann et al., 2013; Chang et al., 2017). 19 Wstęp Rozdział 5. 5.3. XRCC1 5.3.1. Rola XRCC1 w komórce Białko XRCC1 (z ang. X-ray Repair Cross-Complementing Protein 1) jest istotnym elementem zaangażowanym w proces naprawy jednoniciowych pęknięć nici DNA, zarówno w ramach szlaku BER (z ang. base excision repair), jak i SSBR (z ang. single strand break repair). Pierwszy raz białko to zostało zidentyfikowane w zmutowanej linii komórek jajnika chomika chińskiego (Thompson et al., 1982). Pomimo, że odgrywa kluczową rolę w procesach naprawczych, nie wykazuje właściwości enzymatycznych. W procesie naprawy pełni przede wszystkim funkcję strukturalną i stabilizacyjną pełniąc rolę rusztowania dla innych białek rekrutowanych do miejsca naprawy. Do tej pory wykazano oddziaływanie XRCC1 z wieloma białkami, w tym z: • polinukleotydową kinazą 3’-fosfataza PNKP (Whitehouse et al., 2001); • polimerazą ß (Caldecott et al., 1996) (Kubota et al., 1996); • ligazą III-a (Caldecott et al., 1994, 1996); • glikozylazą OGG1 (Marsin et al., 2003); • polimerazą poli(ADP-rybozy) typu 1, PARP1 (Gueven et al., 2004); • polimerazą poli(ADP-rybozy) typu 2, PARP2 (Schreiber et al., 2002); Wykazano również, że białko XRCC1, poprzez obszar zawierający sekwencję NLS, tworzy z cząsteczką PCNA kompleks (Fan et al., 2004). Prawdopodobnie podczas naprawy DNA wpływa ono na aktywność ADP-rybotransferazy PARP1, co przyczynia się do tworzenia poli(ADP)rybozy. Opisane mutacje XRCC1 powodują powstanie podwyższonego poziomu poli(ADP-rybozylacji) (Hoch et al., 2017). Obecnie wykazano kilka różnic w angażowaniu się XRCC1 w proces naprawy DNA pomiędzy ścieżkami BER i SSBR. W ścieżce BER gromadzenie XRCC1 w miejscu naprawy jest niezależne od polimerazy PARP1. W ścieżce SSBR XRCC1 akumulacja XRCC1 następuje bardzo szybko, z kolei w ramach śnieżki BER XRCC1 pojawia się znacznie później, razem z innymi białkami naprawczymi. Dodatkowo zauważono, że w ramach SSBR białko XRCC1 gromadzi się zarówno w obszarach hetero- jak i euchromatyny, podczas gdy na drodze naprawy ścieżką BER XRCC1 gromadzi się wyłączenie w obszarach niezawierających heterochromatyny (Campalans et al., 2005). 20 Rozdział 5. Wstęp 5.3.2. Budowa cząsteczki XRCC1 Cząsteczka XRCC1 składa się z 633 aminokwasów (69,49 kDa). W jej strukturze wyróżnia się cztery obszary: domenę N-końcową NTD (aminokwasy 1 do 183), za którą znajduje się obszar zawierający sekwencję sygnałową (NLS) odpowiedzialny za lokalizację białka w jądrze komórkowym, następnie, domenę BRCT1 (aminokwasy 315 do 403; 10,37kDa) oraz domenę BRCT2 (538 - 629, 92 reszty, 10,97 kDa)1 (Rycina 5.1.). Rycina 5.1. Struktura białka XRCC1. A - Schemat struktury cząsteczki XRCC1; B - budowa domeny NTD (pdb: 1XNA); C- budowa domeny BRCT1 (pdb: 2D8M); D - budowa domeny BRCT2 (pdb: 1CDZ). Domena NTD wykazuje powinowactwo do polimerazy DNA ß. Sekwencja sygnałowa NLS, która znajduje się w części łączącej pomiędzy domenami NTD i BRCA1, wiąże się z DNA oraz odpowiedzialna jest za interakcję z białkami naprawczymi m.in. REV1. Funkcją domeny BRCT2 jest wiązanie się białka XRCC1 z ligazą DNA III, natomiast domena BRCT1 zawiera motyw oddziałujący z polimerazą poli(ADP-rybozy) PARP. Doświadczenia wykazały, że białko to może rozpoznawać pęknięcia w nici DNA, a następnie stabilizować miejsce uszkodzenia oraz staje się platformą dla kolejnych gromadzących się białek (Marintchev et al., 1999; Mani et al., 2004). 1 Dane przedstawione na podstawie https://www.uniprot.org/uniprot/P18887 21 Wstęp Rozdział 5. 5.3.3. Dynamika XRRCC1 Białko XRCC1 jest jednym z pierwszych czynników, które gromadzą się w miejscu uszkodzenia DNA. Jedną z prac poruszającą dynamikę białka XRCC1 w tym obszarze jest praca (Mortusewicz & Leonhardt, 2007). W opisanych doświadczeniach wywoływano lokalne uszkodzenia DNA poprzez naświetlanie jądra komórkowego wiązką światła o długości fali 405 nm, po wcześniejszej inkubacji z BrdU. Taka metoda uszkadzania DNA prowadzi do powstania mieszaniny różnych uszkodzeń DNA, do których naprawy wykorzystywane są różne ścieżki naprawy, w tym angażujące białko XRCC1 lub PCNA. W tym przypadku akumulacja XRCC1 była już widoczna po około dwóch minutach (Mortusewicz & Leonhardt, 2007) (Rycina 5.2.A). Stała wiązania XRCC1 do chromatyny w miejscu uszkodzenia DNA różni się od stałej dla PCNA. W doświadczeniach, w których wysalano białka, PCNA utrzymywało się w miejscu uszkodzenia dłużej niż XRCC1 (Mortusewicz & Leonhardt, 2007). XRCC1 można całkowicie usunąć, podczas gdy PCNA jest dalej widoczne po wysalaniu. Autorzy pracy porównali także tempo gromadzenia się XRCC1 oraz PCNA w miejscu uszkodzenia. XRCC1 gromadziło się prawie natychmiast po napromieniowaniu i sygnał fluorescencji osiągał maksimum już po upływie około 2 min. W opisanym przez tych autorów doświadczeniu FRAP, po wyblaknięciu fluoroforu w tymże ognisku naprawczym, sygnał od XRCC1 powrócił po upływie 24 sekund (Rycina 5.2.B). Świadczy to o wysokim tempie wymiany białka pomiędzy miejscem prowadzonej naprawy a otoczeniem. Doświadczenia z wykorzystaniem metody FLIP wykazały wysoką mobilność XRCC1 w ognisku naprawy. Po upływie dwóch minut średni poziom intensywności sygnału białka GFP-XRCC1 spadał do 10% wartości początkowej (Rycina 5.2.C). Wyniki opisane w pracy (Mortusewicz & Leonhardt, 2007) wskazują na wysokie tempo rekrutacji oraz oddysocjowania białka XRCC1 w rejonie uszkodzenia DNA. 22 Rozdział 5. Wstęp Rycina 5.2. Pojmanie mobilności GFP-XRCC1 i RFP-PCNA w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA po inkubacji z BrdU i lokalnym naświetlaniu światłem o długości fali 405 nm. A - rejestracja powstawania ognisk XRCC1 i PCNA. Po około dwóch minutach sygnał GFP-XRCC1 osiąga maksimum; B - Powrót fluorescencji w miejscu gromadzenia się obu białek po wcześniejszym wyblaknięciu; C - Pomiary FLIP pokazujące tempo dysocjacji obu białek z obszaru ich gromadzenia. Szybki zanik fluorescencji dla GFP-XRCC1 wskazuje, że białko to nie wiąże się długotrwale w obszarze naprawy, ale wymienia się dość szybko z otoczeniem. Rycina zawiera obrazy i wykresy z pracy (Mortusewicz & Leonhardt, 2007). 23 Wstęp Rozdział 5. 5.4. HP1 5.4.1. Rola białka HP1 w komórce Heterochromatynowe białko 1 zostało po raz pierwszy opisane w 1986 roku jako główny składnik heterochromatyny i czynnik zaangażowany w wyciszanie genów (James & Elgin, 1986). Białko HP1 wiąże włókna heterochromatyny do błony wewnętrznej otoczki jądrowej poprzez wiązanie się do receptora laminy B. Bierze także udział w utrzymaniu gęstego upakowania heterochromatyny oddziałując poprzez domenę CD (z ang chromodomain) z metylowaną lizyną 9 w histonie H3 (H3K9) (Ye et al., 1997). Wykazano, że białko HP1 jest istotnym epigenetycznym regulatorem w zjawisku PEV (Festenstein et al., 1999). Dalsze badania wykazały, że białko HP1 należy do rodziny białek Polycomb i powszechnie występuje w organizmach żywych, a jego sekwencja jest bardzo konserwatywna. U ludzi i myszy zidentyfikowano trzy paralogi białka HP1. Cząsteczki białka HP1 mogą tworzyć homo- i heterodimery. Z innymi białkami jądrowymi HP1 oddziałuje głównie poprzez domenę CSD (z ang. Chromoshadow Domain) znajdującą się na C-końcu. W komórkach ssaków zbiór partnerów oddziaływujących z białkiem HP1 obejmuje przedstawicieli regulatorów epigenetycznych, czynników remodelujących i wpływających na organizację jądra i chromatyny (SUV39H1 (Loyola et al., 2009), LBR (Ye et al., 1997)), regulatory transkrypcji (np. TIF1 (Douarin et al., 1996; Brasher, 2000)), białka zaangażowane w naprawę DNA ((Nielsen et al., 2002; Maison & Almouzni, 2004; Eskeland, Eberharter, & Imhof, 2007; Chu et al., 2014a; Stixova et al., 2014; Kalousi et al., 2015; Wu et al., 2015), CAF1p150 (Murzina et al., 1999), białko Ku70 (Shibahara & Stillman, 1999) i PCNA (Trembecka-Lucas & Dobrucki, 2012; Trembecka-Lucas, Szczurek, & Dobrucki, 2013). Złożona trzeciorzędowa struktura dimeru HP1 odpowiada za integrację z peptydami zawierającymi motyw PxVxL (Thiru et al., 2004). Oddziaływanie HP1 z innymi białkami zostało potwierdzone metodami biochemicznymi w izolowanych układach (Nielsen et al., 1999; Ryan et al., 1999; Brasher, 2000) oraz in vivo w komórkach poprzez wykorzystanie technik mikroskopowych takich jak FCS, FRET, BiFC (Trembecka-Lucas & Dobrucki, 2012; Siegel et al., 2013; Trembecka-Lucas et al., 2013). Obecnie powszechnie uznaje się, że białko HP1 pełni w jądrze komórkowym wiele funkcji takich jak: 24 Rozdział 5. Wstęp 1. Składnik strukturalny heterochromatyny, wiążący sąsiednie włókna chromatyny i czynnik zaangażowany w wyciszanie genów (McGinnis et al., 1984; Scott & Weinert, 1984; James & Elgin, 1986). W obszarze heterochromatyny cząsteczki HP1 wiążą się z di- i tri-metylowaną lizyną dziewiątą w histonie H3 (H3K9me2/3). Wysokie lokalnie stężenie białka HP1 występuje w skondensowanej chromatynie i jest uważane za marker nieaktywnej transkrypcyjnie chromatyny (Bannister et al., 2001). Wykazano, że degradacja białka HPla ułatwia rozluźnienie struktury chromatyny, a także promuje naprawę DNA na drodze homologicznej rekombinacji (Chen et al., 2015). 2. Element odpowiedzi DDR komórki na uszkodzenie DNA (z ang. DNA damage response), który jest rekrutowany w miejsce różnego typu uszkodzeń DNA - w tym do pęknięć jedno- i dwuniciowych DNA, uszkodzeń oksydacyjnych (Zarebski et al., 2009; Kalousi et al., 2015) oraz uszkodzeń generowanych przez UV (Luijsterburg et al., 2009). HP1 gromadzi się w miejscu uszkodzenia, jednak jego rola w procesie naprawy nie jest do końca wyjaśniona. HP1 może stanowić element ścieżki sygnalizacyjnej uszkodzenia lub uczestniczyć w regulacji samej naprawy (Lemaître & Soutoglou, 2014) lub być zaangażowane w proces naprawy DNA jako rusztowanie molekularne dla innych białek (Trembecka-Lucas & Dobrucki, 2012), a także odgrywać rolę w przebudowie struktur chromatyny wyższego rzędu (Zarebski et al., 2009; Nishibuchi et al., 2014). 3. Czynnik zaangażowany w replikację DNA, jako składnik kompleksu z trymerem PCNA (Cseresnyes, Schwarz, & Green, 2009; Schwaiger et al., 2010; Trembecka- Lucas & Dobrucki, 2012) - tworzącego swoisty zacisk, który odgrywa rolę czynnika procesującego. Rodzina białek HP1 zawiera trzy paralogi: HP1a, HP1ß, HP1y (Zeng, Ball, & Yokomori, 2010). Ich role nie są jedynie ograniczone do utrzymywania struktur wyższego rzędu i wyciszania genów (Fanti & Pimpinelli, 2008). Białka te mogą być także zaangażowane w proces aktywacji genów (Piacentini et al., 2003). 25 Wstęp Rozdział 5. 5.4.2. Budowa cząsteczki HP1 Cząsteczka HP1 składa się z dwóch domen połączonych elastycznym zawiasem - domeną CD (z ang. chromodomain) na N-końcu i domeną CSD (z ang. chromoshadow domain) na C-końcu (Rycina 5.3.). Są one podobne pod względem sekwencji, ale pełnią różne funkcje (Paro & Hogness, 1991; Aasland & Stewart, 1995). Domeny CSD mogą ze sobą oddziaływać poprzez cysteiny tworząc homo- i heterodimery HP1 oraz wchodzić w interakcje z wieloma niehistonowymi białkami. CD odpowiada za oddziaływanie z ogonami histonów. Rycina 5.3. Struktura cząsteczki HP1. A - Schemat struktury cząsteczki HP1; B - budowa domeny CD z przyłączonym ogonem zawierającym trimetylolizynę 9 histonu H3 (zielony) (pdb:1KNE); C - budowa domeny CSD (pdb: 3P7J). 5.4.3. Dynamika HP1 Białko HP1 stanowi istotny element strukturalny heterochromatyny i uznawane jest za jeden z kluczowych czynników odpowiedzialnych za utrzymanie skondensowanej postaci chromatyny pod otoczką jądrową i w rejonach okołojąderkowych. Nie jest ono jednak wyłącznie ich statycznym składnikiem. Udowodniono, że cząsteczki HP1 związane z chromatyną pozostają w równowadze z pulą cząsteczek swobodnie poruszających się i łatwo oddysocjowują od chromatyny, zwalniając miejsce wiązania (Cheutin, Mcnairn, & Jenuwein, 2003). Pod tym względem HP1 jest bardzo podobne do innych białek jądrowych (Hemmerich, Schmiedeberg, & Diekmann, 2011) w tym w szczególności do histonu łącznikowego H1, który także jest kluczowym czynnikiem zaangażowanym w utrzymanie struktur chromatyny wyższego rzędu, ale wiąże się z chromatyną w sposób dynamiczny, pozostając w stanie równowagi z pulą niezwiązaną (Phair & Misteli, 2000). 26 Rozdział 5. Wstęp 5.4.4. HP1 w procesie naprawy DNA Wykazano, że miejscowa indukcja uszkodzenia oksydacyjnego (8-okso-G) w komórkach HeLa prowadzi do rekrutacji HPla i HP1ß (Wiernasz, 2004; Zarebski, 2008; Zarebski et al., 2009). Inne typy uszkodzeń, jak pęknięcia nici DNA indukowane światłem UV mogą również prowadzić do akumulacji HP1 (Luijsterburg et al., 2009; Zarebski et al., 2009). Eksperymenty z wykorzystaniem mutantów z delecją wykazały, że domena CSD, która jest odpowiedzialna za oddziaływanie z innymi białkami, jest wymagana do rekrutacji białka HP1 do miejsca uszkodzenia (Luijsterburg et al., 2009). Zarówno HPla, jaki i HPlß są rekrutowane do miejsc uszkodzenia w euchromatynie, jak i w heterochromatynie (Zarebski et al., 2009). Ta obserwacja zgadza się z poglądem, że mechanizm wiązania się HP1 do uszkodzonego rejonu chromatyny różni się od mechanizmu wiązania HP1 w heterochromatynie. Można postulować, że oderwanie i oddysocjowanie HP1 od chromatyny może być pierwszym krokiem po indukcji uszkodzenia, jak sugeruje praca (Ayoub et al., 2008), a kolejnym krokiem jest rekrutacja potranslacyjnie zmodyfikowanego HP1. Była to błędna interpretacja, ponieważ już w następnym roku w pracach (Luijsterburg et al., 2009; Zarebski et al., 2009) autorzy wykazali, że HP1 gromadzi się w obszarze uszkodzenia DNA. Obecność HP1 jest wymagana w procesie naprawy dwuniciowych pęknięć DNA (Luijsterburg et al., 2009). Brak HP1 skutkuje wydłużeniem czasu naprawy DNA, co wykazano poprzez detekcję ognisk yH2AX z wykorzystaniem immunofluorescencji (Luijsterburg et al., 2009) lub hamowaniem naprawy DNA (Baldeyron et al., 2011). Chociaż pełny obraz mechanizmu rekrutacji HP1 (prawdopodobnie w formie zmodyfikowanej potranslacyjnie) nie został do końca opisany (Ayoub, Jeyasekharan, & Venkitaraman, 2009; Bolderson et al., 2012), niektóre istotne etapy tego procesu zostały już poznane. P150CAF-1 - największa podjednostka czynnika montażowego chromatyny 1 (CAF-1) jest wymagana w rekrutacji HPla do uszkodzenia DNA indukowanego przez światło oddziałujące z barwnikiem związanym z DNA (Baldeyron et al., 2011) i do ukończenia naprawy uszkodzeń, które są naprawiane na drodze homologicznej rekombinacji (HR). Niektóre badania sugerują, że HP1 może reagować preferencyjnie na pęknięcia nici DNA w heterochromatynie (Ayoub et al., 2008; Goodarzi et al., 2008) jak omówiono w pracy przeglądowej (Lemaître & Soutoglou, 2014). W pracy (Chiolo et al., 2011) wykazano, że białko RAD51, jako kluczowy czynnik w ścieżce naprawy HR, może być zrekrutowane tylko wtedy, kiedy miejsce naprawy zostanie przeniesione poza obszar heterochromatyny. 27 Wstęp Rozdział 5. Wykazano również wykluczenie przestrzenne RAD51 z białkiem HP1a. Ostatnie badania pokazują, że HP1 promuje rekrutację BRCA1 do miejsca uszkodzenia. Lee sugeruje, że w napromieniowanych komórkach z ograniczonym poziomem białka HP1 liczba ognisk 53BP1 oraz yH2AX oraz ich wielkość zwiększa się (Lee et al., 2013). Co więcej, według Lee i wsp., HP1 może regulować rekrutację kompleksu BRCA1 i RAD51 do miejsca DSB i każdy podtyp HP1 ma podobny wpływ na regulację procesu naprawy DNA. Wykazano jednak, że jeden z paralogów HP1 wywiera przeciwny efekt niż dwa pozostałe, HP1y nie promuje bowiem resekcji końców DNA, tak jak HP1a i HP1ß. Obniżenie ekspresji genu HP1y prowadzi do znacznego wzrostu wydajności HR, podczas gdy HP1a i HP1ß przyczyniają się do spadku wydajności naprawy HR (Soria & Almouzni, 2013). Obecnie wiadomo, że HP1, a także dwa inne białka zaangażowane w proces upakowania chromatyny, SUB39H1 oraz KAP1, odgrywają istotną rolę w HR. Te represyjne czynniki sprzyjają wydłużeniu tego procesu i są wymagane do translokacji 53BP1 na obrzeża miejsca naprawy i tworzenia rdzenia charakteryzującego się niskim stężeniem 53BP1w rejonie centralnym (Chapman et al., 2012). Obserwacje te są zgodne z wstępnymi badaniami uzyskanymi w naszym laboratorium (dr A. Waligórska, dane nieopublikowane). Istniejące dane oraz wstępne badania nad obecnością i dynamiką HP1w rejonie naprawy DNA wskazują, że mogą istnieć tam dwie subpopulacje tego białka (Rycina 5.4). Wykazano, że niewielka liczba cząsteczek HP1 wiąże się z trimerem PCNA przesuwającym się wzdłuż nici DNA. W tym przypadku HP1 jest prawdopodobnie składnikiem kompleksu naprawczego, który jest związany z DNA bezpośrednio (Trembecka-Lucas et al., 2013). Ta niewielka subpopulacja HP1 jest trudna do wykrycia w komórkach z białkiem fuzyjnym HP1-eGFP ponieważ zdecydowana większość białka HP1 nie tworzy kompleksu z PCNA. Zaobserwowanie puli HP1 oddziaływującej z trymerem PCNA było możliwe dzięki zastosowaniu techniki BiFC. Postuluje się, że druga, znacznie większa liczbowo subpopulacja HP1 jest rekrutowana i wiąże się do chromatyny otaczając uszkodzone miejsce. To jest subpopulacja, która jest widoczna na obrazach w pracach wykazujących rekrutację HP1 do miejsca uszkodzenia DNA (Wiernasz, 2004; Zarebski, 2008; Luijsterburg et al., 2009; Trembecka-Lucas et al., 2013). Cząsteczki HP1 należące do tej subpopulacji nie wiążą się z PCNA, ale mogą oddziaływać z włóknami chromatyny wokół miejsca uszkodzenia, stabilizując lokalnie 28 Rozdział 5. Wstęp strukturę chromatyny, a ich obecność może być niezbędna do ukończenia procesu naprawy. Rycina 5.4. Dynamika HP1ß, PCNA i kompleksu HP1-PCNA w miejscu naprawy DNA. Gromadzenie HP1 w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA wywołanego przez wiązkę światła niebieskiego. GFP w wybrany rejonie jądra zostało wyblaknięte, aby zarejestrować zjawisko FRAP. Krzywe powrotu fluorescencji potwierdzają niski współczynnik wymiany kompleksu HP1-PCNA nagromadzonego w miejscu uszkodzenia (Trembecka-Lucas i wsp., 2013). Większość zrekrutowanych cząsteczek HP1 wymienia się z pulą mobilną, ale w znacznie niższym tempie. 5.4.5. HP1 w replikacji DNA Wyniki prac opisane w (Schwaiger et al., 2010) oraz rezultaty doświadczeń przeprowadzonych w Zakładzie Biofizyki Komórki UJ z wykorzystaniem techniki BiFC wskazują, że HP1 wchodzi w interakcję z trymerem PCNA w regionach replikacji DNA (Rycina 5.4). Można zatem założyć, że HP1 wchodzi w skład kompleksu wielobiałkowego prowadzącego proces replikacji DNA. Jak wspomniano wcześniej, HP1 tworzy kompleks z trimerem PCNA w miejscu naprawy DNA (Trembecka-Lucas & Dobrucki, 2012), a obecność HP1 w kompleksie z PCNA wskazuje, że HP1 może odgrywać nieznaną funkcję w przesuwaniu się widełek replikacyjnych. Doświadczenia opisane w pracy (Trembecka-Lucas & Dobrucki, 2012) wykazały, że większość, jak nie wszystkie cząsteczki PCNA dostępne w komórce tworzą kompleks z HP1. Z kolei tylko niewielka część HP1 (najprawdopodobniej zmodyfikowana potranslacyjnie) tworzy kompleks z PCNA (Trembecka-Lucas et al., 2013). Wykazano, że HP1, które wiąże się do PCNA występuje w postaci dimeru. Mutant HP1, który nie tworzy dimerów nie gromadzi się w obszarach prowadzonej replikacji. 29 Wstęp Rozdział 5. 5.5. Dynamika cząsteczek w jądrze komórkowym 5.5.1. Dynamika cząsteczek na poziomie molekularnym w jądrze komórkowym Poszczególne poziomy organizacji wewnątrz jądra komórkowego wykazują mobilność w różnych skalach czasowych. Jedne z najszybszych zjawisk to dyfuzja niezwiązanych cząsteczek jak nukleotydy, czy białka (angażowane w replikację, transkrypcję itp.), natomiast ruchy wybranego fragmentu chromosomu interfazowego zawierającego wyznakowany locus lub ruch całego chromosomu metafazowego charakteryzuj ą się dużo mniejszą szybkością. Kompleksy białek jądrowych oddziałujące z chromatyną z ciągłą wymianą oddziałujących partnerów będą się natomiast charakteryzowały dynamiką w różnych skalach czasowych. W celu uchwycenia natury badanego procesu, oszacowania jego tempa lub dynamiki poszczególnych składników w niego zaangażowanych niezbędne jest użycie szeregu technik badawczych umożliwiających ich pośrednie lub bezpośrednie zarejestrowanie. Współczesna mikroskopia fluorescencyjna posiada szereg metod umożliwiających pomiar dynamiki białek w jądrze komórkowym. Techniki te charakteryzują się różną rozdzielczością czasową, przez co można podjąć próbę opisu danego procesu w różnych skalach czasowych. Podstawowy i najczęściej spotykany ruch cząsteczek w jądrze komórkowym to dyfuzja - czyli termicznie indukowane stochastyczne ruchy cząsteczek w ośrodku. Dyfuzja często równoważy pojawiający się w komórce gradient stężeń, który może wynikać z aktywnego transportu. Współczynnik dyfuzji charakteryzuje związek między gradientem stężeń, a powstającym w jego wyniku przepływem molekuł. W skali mikroskopowej pojedyncze cząsteczki poruszają się losowo w ośrodku implikując lokalne fluktuacje ich stężenia. W celu oszacowania ogólnego trendu w mobilności wyznacza się średni kwadrat przemieszczenia (z ang. mean square displacement, MSD) w funkcji czasu. Współczynnik proporcjonalności jest wtedy współczynnikiem dyfuzji D [^m2/sj. Szereg procesów wpływa na dyfuzję i może ją efektywnie zmieniać. Łączenie się w większe, ale wciąż mobilne kompleksy spowalnia dyfuzję składników. Bardzo złożone otoczenie, jak niektóre obszary jądra komórkowego, czy obecność błon, także mogą powodować drastyczny spadek mobilności cząsteczek. Odstępstwa od dyfuzji prostej w dynamice mogą być opisywane jako dyfuzja anomalna, utrudniona (z ang. obstructed 30 Rozdział 5. Wstęp diffusion) albo ograniczona (z ang. confined diffusion). Swoiste łączenie się molekuł do struktur wewnątrzkomórkowych (wiązanie się białek do chromatyny) powoduje unieruchomienie i drastyczny spadek ich ruchliwości. W przypadku wiązania białek do chromatyny można rozważyć dwa możliwe scenariusze. W pierwszym, duża liczba niezwiązanych cząsteczek ulega szybkiej redystrybucji w jądrze komórkowym. Większość potencjalnych miejsc wiązania jest zajęta, a ogólna kinetyka układu zdominowana jest przez proces dysocjacji. W drugim przypadku sumaryczna liczba cząsteczek jest nieduża. W znacznej większości wiążą się one do miejsc (grup chemicznych), do których wykazują powinowactwo. Ich całkowita liczba jest niewystarczająca, aby obsadzić większość miejsc wiązania. Molekuła, która oddysocjuje od miejsca wiązania jest szybko przechwytywana przez następne miejsce. W takim przypadku mamy do czynienia z jedną subpopulacją ze zmniejszonym efektywnym współczynnikiem dyfuzji. 5.5.2. Dyfuzja prosta Dyfuzja prosta jest to proces, w którym translacyjny ruch dyfuzyjny cząsteczek to losowy ruch termicznie indukowany ciągłymi zderzeniami z cząsteczkami rozpuszczalnika * / ^2 ) ^ a 1 w wyniku czego przenoszona jest energia kinetyczna —-—= -y- dla cząsteczki o szybkości v i masie m, w temperaturze 7[K], gdzie kB to stała Boltzmanna. Ze względu na przypadkowy ruch cząsteczek, średnia prędkość (wielkość wektorowa) oraz średnie przemieszczenie (także wielkość wektorowa) są zerowe. Do opisu ruchu stosuje się średni kwadrat przemieszczenia MSD -d2\. Definiuje się go jako kwadrat odległości pomiędzy położeniem molekuły w czasie t1, a położeniem jej w czasie t1+x. Wielkość ta jest uśredniana po wszystkich możliwych ruchach cząsteczki z zadanym interwałem x oraz po wszystkich możliwych molekułach. Rozwiązanie równań dyfuzji (prawo Ficka) prowadzi do wyrażenia opisującego średni kwadrat przemieszczenia cząstki w czasie dla cząsteczek rozpuszczonych w ośrodku ciągłym. -d2( t)) = ([f(t + t) — r(t)]2) = 2nD0T gdzie: n - liczba wymiarów układu Dc - współczynnik dyfuzji [^m2/s] 31 Wstęp Rozdział 5. Makroskopowo współczynnik dyfuzji opisuje zależność pomiędzy gradientem stężeń, a wynikającym z niego strumieniem cząsteczek. Mikroskopowo ruch ten zależy od temperatury, współczynnika tarcia, który z kolei zależy od rozmiaru cząsteczki (jego estymatorem jest promień hydrodynamiczny) oraz lepkości rozpuszczalnika (wielkość ta także zależy od temperatury). Zależność tę opisuje równanie Stokesa-Einsteina: D0 = 0 6wnRh Jednak powyższe prawo dotyczy jedynie układów w cieczach izotropowych. W układach fizycznych, bardziej złożonych, powyższy opis jest niewystarczający lub nawet niewłaściwy. W takim przypadku należy stosować opis matematyczny typów dyfuzji opisanych poniżej. 5.5.3. Dyfuzja anomalna Dyfuzja anomalna jest charakterystyczna dla środowisk bardziej złożonych, wypełnionych nieruchliwymi strukturami lub relatywnie dużymi cząsteczkami o bardzo niskiej ruchliwości, które znacząco zmniejszają przemieszczanie badanych molekuł. Fenomenologicznie opis takiego zjawiska można przedstawić następująco: {d2(r)) = 2nYx2 = 2nD(j)r , gdzie D(r) = Tt“-1 gdzie parametr anomalności a określa odchylenie dynamiki od swobodnej dyfuzji, dla której a =1. W przypadku ruchu ograniczonego, zahamowanego a < 1, dla ruchu kierunkowego a > 1. W takim opisie stała dyfuzji nie istnieje, ponieważ dyfuzja zależy od czasu D(t). 5.5.4. Dyfuzja ograniczona Dyfuzja ograniczona (z ang. confined diffusion), jest to ruch cząsteczek, w którym średni kwadrat przemieszczenia {MSD) nie zależy liniowo od czasu, co ma miejsce w przypadku swobodnej dyfuzji, ani także nie zależy potęgowo, co jest charakterystyczne dla dyfuzji anomalnej. Na przykład dla cząsteczki poruszającej się ze współczynnikiem dyfuzji D, gdzie jej możliwość ruchu ograniczona jest do jej promienia bezwładności, który definiuje efektywną wielkość cząsteczki, średni kwadrat przemieszczenia można opisać następująco: T n / 2nDr\ {d2(j)) = {rc2) 1 - exp ( 32 Rozdział 5. Wstęp Rycina 5.5. Wykres średniego kwadratu przemieszczenia cząsteczek w czasie w zależności od rodzaju dyfuzji. Rycina przygotowana na podstawie (Wachsmuth et al. 2008). 5.5.5. Dyfuzja ułatwiona Model dyfuzji ułatwionej wprowadzono jako opis możliwych nieelastycznych zderzeń cząsteczek białka z DNA. Powodem takiego zachowania może być niespecyficzne oddziaływanie powodujące, że białko przesuwa się wzdłuż nici DNA lub przeskakuje pomiędzy nićmi (szybka kombinacja dysocjacji i ponownej asocjacji). Model dyfuzji ułatwionej stosuje się m.in. w wyznaczaniu stałych asocjacji cząsteczek białka do DNA (Halford & Marko, 2004; Merlitz et al., 2015). 33 Wstęp Rozdział 5. 5.6. Metody pomiaru dynamiki i oddziaływań międzycząsteczkowych w jądrze komórkowym Dynamika białek, kwasów nukleinowych, ich kompleksów, oraz ciałek jądrowych wewnątrz jądra w żywych komórkach może być badana z zastosowaniem metod mikroskopii fluorescencyjnej. W tej rodzinie metod wyróżnia się m.in. techniki FRAP (z ang. fluorescence revovery after photobleaching) oraz FLIP (z ang. fluorescence loss in photobleaching). Wykorzystują one zjawisko fotoindukowanego wyblaknięcia fluoroforu będącego markerem składnika komórki i obserwacji (po wyblaknięciu lub w jego trakcie) powrotu układu do stanu równowagi. Kolejną z technik jest spektroskopia korelacji fluorescencji FCS (z ang. Fluorescence Correlation Spectrocopy). Jest to rodzina metod, w których rejestrowana jest fluktuacja fluorescencji barwnika spowodowana wchodzeniem i wychodzeniem cząsteczek barwnika z objętości detekcji. Pozostałe techniki, które także umożliwiają oszacowanie mobilności molekuł w jądrze komórkowym to SPT (z ang. single particle tracking) oparta na śledzeniu ruchu pojedynczych cząsteczek na serii zarejestrowanych obrazów. Interakcje miedzy cząsteczkami można badać technikami FRET (z ang. Förster Resonance Energy Transfer), lub BiFC (z ang. Bimolecular Fluorescence Complementation), które wykrywają bliskie położenie cząsteczek. Powyżej przedstawione techniki pomiarowe zostały wykorzystane w mikroskopach konfokalnych lub szerokiego pola. Niektóre z tych technik zastosowane zostały również w niniejszej pracy. Typowe zastosowanie metod w badaniach nad strukturą jądra komórkowego i dynamiki w jego wnętrzu obejmuje badanie dyfuzji białek (FCS), ich interakcji między sobą lub z włóknami chromatyny (FCS, FRAP) poprzez obserwowanie ruchów wybranych loci lub ciałek jądrowych. Procesy wewnątrz jądra komórkowego zachodzą w bardzo różnych przedziałach czasowych, od mikrosekund do godzin, odzwierciedlających nie tylko wielkość badanych elementów, ale też ich otoczenie (na przykład lokalne zagęszczenie chromatyny). Poniżej przedstawiono schematycznie zestawienie procesów określające mobilność cząsteczek w komórce, które odbywają się w różnych skalach czasowych (od mikrosekund do godzin) z wybranymi zaawansowanymi metodami fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Różny zakres rozdzielczości czasowej, przy wartej zapamiętania ograniczonej rozdzielczości przestrzennej każdej, z nich umożliwia dostarczenie informacji wzajemnie się uzupełniających (Rycina 5.6). 34 Rozdział 5. Wstęp Rycina 5.6. Porównanie skal czasowych wybranych metod mikroskopowych oraz typów procesów biologicznych. Rycina przygotowana na podstawie publikacji (Wachsmuth et al. 2008). 5.6.1. Ogólne rozważania - skala czasowa i rozdzielczość metod Mobilność kwasów nukleinowych, białek jądrowych, ich kompleksów można badać w żywych komórkach, wewnątrz jądra komórkowego za pomocą wielu technik opartych na mikroskopii fluorescencyjnej. W niniejszym rozdziale przedstawiono krótki opis wybranych technik, obecnie stosowanych w badaniach nad dynamiką składników oraz strukturą jądra komórkowego. 5.6.2. Śledzenie pojedynczych cząstek Śledzenie pojedynczych cząstek (z ang. single particle tracking) jest to technika wymagająca zarejestrowania szeregu zdjęć (z widocznym sygnałem reprezentującym jedną cząsteczkę) z zadanym krokiem czasowym (rzędu milisekund). Zbiór obrazów następnie poddawany jest szeregowi zaawansowanych operacji jak segmentacja, detekcja położenia obiektu na kolejnych zdjęciach oraz uwzględnienie poprawek na ruch całego jądra i komórki. Działania te umożliwiają wyznaczenie zmiany położenia obiektu w czasie, co pozwala oszacować jego średnie przemieszczenie. 35 Wstęp Rozdział 5. Na podstawie modelu matematycznego opisującego dany proces biofizyczny, można z pewnym przybliżeniem oszacować współczynnik dyfuzji, a poprzez wykres zależności MSD od czasu można określić rodzaj dyfuzji badanego układu (dyfuzja prosta, kierunkowa (superdyfuzja) lub anomalna). 5.6.3. Odzyskanie fluorescencji po fotoblaknięciu (FRAP) W eksperymencie wykorzystującym technikę FRAP, wyróżnia się trzy główne etapy. Pierwszy to seria obrazów przedstawiająca rozkład przestrzenny sygnału fluorescencji znakowanych cząsteczek w komórce w jednym wybranym położeniu (przekroju optycznym). W drugim etapie, w zdefiniowanym obszarze komórki, w sposób gwałtowny poddawany jest fotoblaknięciu znacznik fluorescencyjny. Fotoblaknięcie dokonywane jest tak szybko i wydajnie jak to tylko możliwe z zastosowaniem oświetlenia o wysokiej intensywności. Trzeci etap to rejestracja zdefiniowanego wcześniej rejonu jądra (z zachowaniem parametrów obrazowania z pierwszego etapu). W czasie tego kroku obserwowana jest redystrybucja cząsteczek połączonych z niewyblakniętą sondą fluorescencyjną (Rycina 5.7.). Powrót fluorescencji w obszarze wcześniej wyblakniętym może być odzwierciedleniem szeregu procesów powodujących obserwowaną redystrybucję wyznakowanych cząsteczek. W celu oszacowania parametrów dynamiki jak współczynnik dyfuzji i tempo dysocjacji niezbędne jest wykorzystanie modeli matematycznych opisujących zjawiska biofizyczne uwzględniających dyfuzję prostą, anomalną czy wiązanie się do struktur niemobilnych. Rycina 5.7. Przykładowe krzywe FRAP i FLIP. Krzywa FRAP przedstawia powrót sygnału fluorescencji mierzony w obszarze, w którym wcześniej przeprowadzono gwałtowne blaknięcie. Krzywa FLIP pokazuje spadek intensywności fluorescencji z obszaru poza regionem blakniętym przy równoczesnym prowadzeniu tegoż procesu blaknięcia. 36 Rozdział 5. Wstęp 5.6.4. Utrata fluorescencji w wyniku fotoblaknięcia (FLIP) W metodzie FLIP obserwowany jest spadek fluorescencji wyznakowaych sondą fluorescencyjną składników komórki z danego obszaru na skutek ich wymiany z cząsteczkami, które zostały pozbawione fluorescencji w innym obszarze jądra w wyniku fotoindukowanego blaknięcia. Proces obserwacji blaknięcia barwnika, jak i spadek jego fluorescencji w innym obszarze jądra, prowadzi się równolegle w czasie. W czasie eksperymentu ustala się równowaga dynamiczna pomiędzy asocjacją i dysocjacją molekuł od struktur nieruchomych z prowadzonym ciągle procesem blaknięcia. Na krzywej zaniku fluorescencji często rozróżnić można dwie fazy. Początkowy szybki spadek fluorescencji związany jest z natychmiastową wymianą molekuł z puli niezwiązanej charakteryzującej się wysoką mobilnością. Druga faza to powolny, o asymptotycznym przebiegu, spadek sygnału (Rycina 5.7.). Reprezentuje on subpopulację podlegającą wolnej wymianie z pulą cząsteczek związanych z daną strukturą lub poruszających się bardzo wolno. W połączeniu z techniką FRAP, FLIP pozwala rozróżnić populację wolną, przejściowo związaną, oraz unieruchomioną, ponadto FLIP może pokazać subkomórkową lokalizację populacji związanej. 5.6.5. Spektroskopia Korelacji Fluorescencji (FCS) W technice FCS powszechnie wykorzystywany jest mikroskop konfokalny. Głównym celem użycia układu optycznego mikroskopu jest uzyskanie dostatecznie małej objętości detekcji. FCS nie jest techniką obrazowania. Pomiar polega na rejestracji fluktuacji fluorescencji w zdefiniowanej objętości detekcji na skutek wchodzenia i wychodzenia z niej wyznakowanych fluorescencyjnie cząsteczek. Długość jak i amplituda fluktuacji poddawane są analizie czasowej autokorelacji. Zastosowanie odpowiednich modeli biofizycznych pozwala na wyznaczenie współczynników dyfuzji i relacji ilościowej pomiędzy subpopulacjami różniącymi się wielkością lub siłą oddziaływania z innymi składnikami. Wykorzystanie techniki FCS do pomiaru dyfuzji w połączeniu z technikami FRAP lub FLIP mogącymi opisać potencjalny proces wiązania umożliwia przedstawienie dynamiki badanego układu w szerokiej skali czasowej. FLCS (z ang. Fluorescence Lifetime-Correlation Spectroscopy) jest istotnym rozszerzeniem możliwości standardowego pomiaru FCS. Metoda ta łączy w sobie FCS 37 Wstęp Rozdział 5. z TCSPC (z ang. Time-Correlated Single Photon Counting) (Enderlein et al., 2005). Dzięki zarejestrowanemu rozkładowi czasów życia fluorescencji badanego znacznika fluorescencyjnego tworzone są filtry matematyczne oparte o statystykę, pozwalające usunąć szumy z krzywej autokorelacji (Kapusta et al., 2007). W standardowym podejściu FCS, każdy zarejestrowany foton wchodzi do procesu autokorelacji z wagą równą jedności, natomiast przy użyciu filtru FLCS jego waga jest wyznaczana na podstawie zmierzonego czasu wykrycia przez detektor od momentu wzbudzenia. Innym przedstawicielem z rodziny technik FCS jest FCCS (z ang. Fluorescence Cross- Correlation Spectroscopy). Umożliwia ona badanie zjawiska oddziaływania pomiędzy dwoma rodzajami molekuł. Cząsteczki obu rodzajów są innymi sondami fluorescencyjnymi. Fluktuacja fluorescencji każdej z nich rejestrowana jest w osobnym detektorze. Kiedy molekuły stworzą kompleks i poruszają się razem fluktuacja fluorescencji rejestrowana w obu detektorach będzie miała podobny wzór. Analiza korelacji pomiędzy zarejestrowanymi fluktuacjami w obu detektorach umożliwia ilościowe oszacowanie stopnia wiązania się molekuł i tworzenia kompleksu, ich wolnego niezwiązanego ruchu, wyznaczenie stałej asocjacji lub dysocjacji. Ograniczeniem powyższej metody jest dobranie sond fluorescencyjnych o wyraźnie różniących się widmach emisji - potrzebne jest duże przesunięcie Stoke’sa jednej z nich, gdyż obie sondy są wzbudzane tą samą linią lasera (Weidemann et al., 2002) (Heinze, Koltermann, & Schwille, 2000). Często w pracach, gdzie stosuje się FCCS do badania oddziaływań cząsteczkowych korzysta się z filtrów FLCS, aby zniwelować pojawienie się zjawiska „przeciekania fotonów” pomiędzy detektorami (sygnał obu znaczników (sond) rejestrowany jest równocześnie w obu detektorach, przez co jest możliwy nieznaczny tzw. „przeciek fotonów” między kanałami detekcji). W doświadczeniu, w którym dwa znaczniki fluorescencyjne o podobnej masie, dynamice czy właściwościach spektralnych są źródłem fluorescencji w trakcie pomiaru, można wygenerować niezależne krzywe autokorelacji dla obu znaczników dzięki różnym czasom życia fluorescencji (Chen & Irudayaraj, 2010). Warunkiem koniecznym w technikach z rodziny metod FCS jest wystarczająca mobilność wyznakowanych molekuł, która umożliwia zarejestrowanie odpowiedniej fluktuacji sygnału i ogranicza wpływ fotoblaknięcia w czasie pomiaru. Możliwe jest połączenie metody FCS z obrazowaniem, przez co powstaje narzędzie do ilościowego oznaczenia średniej wielkości badanych struktur i ich rozkładu na danym obszarze. Połączenie tych dwóch technik zastosowano do pomiaru wielkości 38 Rozdział 5. Wstęp subchromosomalnych obszarów o dużej gęstości i ich rozkładu po dekondensacji chromatyny (Toth, 2004) oraz dostępność chromatyny dla makrocząsteczek o różnych rozmiarach (Gorisch, 2005). Metody FCS i FRAP uznawane są za metody komplementarne (Michelman-Ribeiro et al., 2009). FCS jest bardziej użyteczny przy pomiarach próbek o niskim stężeniu cząsteczek wyznakowanych fluorescencyjnie. Pomiary FRAP są prowadzone przy relatywnie wysokich stężeniach takich cząsteczek. Metody te pozwalają badać procesy biologiczne w różnych, ale nakładających się skalach czasowych (FCS: 1 ^s - 1 s; FRAP: >100 |is). W ten sposób dostarczają uzupełniających się informacji na temat badanego zjawiska. Dwufotonowy FCS (ang. two-photon FCS) ma wyższą rozdzielczość czasową niż FRAP używający wzbudzenia jedno-fotonowego. FCS znalazł zastosowanie w monitorowaniu agregacji i rotacji cząsteczek (Berland, So, & Gratton, 1995). 5.6.6. Bezpromienisty Rezonansowy Transfer Energii (FRET) FRET (Förster Resonance Energy Transfer) - jest to technika wykorzystująca mechanizm przeniesienia energii między wzbudzonym fluoroforem donora, a fluoroforem akceptorowym na zasadzie rezonansu, poprzez sprzężenie dipol - dipol w zakresie odległości od 1 do 10 nm (Forster, 1946). Aby zaszło to zjawisko, oprócz bliskości przestrzennej, potrzebne jest, aby widmo emisji donora pokrywało się w dostatecznym stopniu z widmem absorbcji akceptora. Wydajność transferu energii zależy także od wzajemnej orientacji przejściowych momentów dipolowych donora i akceptora (Khrenova et al., 2015). Zjawisko FRET służy jako narzędzie do badania struktury kompleksów, zmian konformacyjnych oraz asocjacji zarówno w układach cząsteczek izolowanych z komórek, jak i w obrazowaniu żywych komórek (Jares- Erijman & Jovin, 2003). Proces ten nie obejmuje dyfuzji, dlatego też przy jego użyciu można badać interakcje między cząsteczkami (występuje tu zatem koncepcyjna komplementarność do omawianej wcześniej techniki FCCS). 39 Wstęp Rozdział 5. 5.7. Spektroskopia Korelacji Fluorescencji (FCS) - rozwinięcie 5.7.1. Wprowadzenie Jedną z wielu metod pozwalających na analizę dyfuzji znakowanych cząsteczek w wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej jest wspomniana powyżej Spektroskopia Korelacji Fluorescencji - FCS (z ang. Fluorescnce Correlation Spectroscopy). Jest to metoda polegająca na rejestracji i analizie fluktuacji fluorescencji w czasie, z bardzo małej objętości (rzędu kilkudziesiątych części femtolitra). Analiza korelacyjna pozwala oszacować dyfuzję rotacyjną i translacyjną fluoroforu, oraz dynamikę przejścia singlet - tryplet. W przeciwieństwie do innych technik fluorescencyjnych FCS wymaga niskiego stężenia fluoroforu (0,1 - 100 nM). Jest to bardzo korzystne, ponieważ można prowadzić pomiary w komórkach kiedy stężenie badanych białek jest utrzymane na poziomie podobnym do występującego naturalnie. Koncepcja techniki FCS została opracowana na początku lat siedemdziesiątych dwudziestego wieku przez Magde i współpracowników, którzy wykorzystali tę technikę do badania tempa interkalacji bromku etydyny do DNA (Magde, Elson, & Webb, 1972). Fluktuacja intensywności fluorescencji była wykrywalna dzięki różnej wydajności kwantowej barwnika związanego i niezwiązanego z DNA. Pierwszą pracą opisującą zastosowanie dyfuzji barwnika do uzyskania potrzebnej fluktuacji w pomiarze FCS opublikowano w 1974 roku (Koppel, 1974). Początkowo była to metoda rzadko stosowana. Dopiero rozwój mikroskopii konfokalnej (Eigen & Rigler, 1994), Rycina 5.8. Zasada metody FCS. Cząsteczki barwnika ulegają wzbudzeniu i emitują fluorescencję w czasie przebywania w objętości detekcji (w obszarze, w którym skupione jest światło wzbudzające). W ten sposób rejestrowana jest fluktuacja fluorescencji z obszaru detekcji w czasie. Na jego podstawie przy użyciu równania autokorelacji sporządzana jest funkcja autokorelacji, w analizie której stosuje się modele opisujące mobilność cząsteczek w układzie. 40 Rozdział 5. Wstęp zwiększenie czułości urządzeń pomiarowych (detekcja pojedynczych fotonów), a także szersze zastosowanie komputerów w obliczeniach pozwoliły częściej i śmielej stosować tę technikę w badaniach z dziedziny biologii na poziomie molekularnym. 5.7.2. Uproszczony formalizm matematyczny Istotą pomiaru FCS jest rejestracja fluktuacji fluorescencji w czasie. Fluktuację fluorescencji generują znaczniki fluorescencyjne poprzez wchodzenie i wychodzenie z obszaru detekcji, który jest tworzony przez skupioną wiązkę lasera o długości fali mogącej wzbudzić fluorescencję w poruszających się cząsteczkach. Liczba molekuł przebywających w objętości detekcji w czasie pomiaru opisywana jest rozkładem Poissona (Qian, 1990). Średnia kwadratowa fluktuacji liczby molekuł N jest następująca: ypwF) v((w — w)2) i w w Tw Relatywny poziom fluktuacji maleje wraz ze wzrostem liczby molekuł w objętości detekcji. Stąd ważne jest, aby ograniczać całkowitą liczbę molekuł występujących w danej chwili w objętości detekcji. Średnia liczba molekuł występująca w objętości detekcji umożliwiająca pomiar i późniejszą analizę leży w przedziale od 0.1 do 1000. Biorąc pod uwagę, że objętość detekcji jest rzędu 0,1 - 1 fl można szacować, że zakres lokalnego stężenia przydatnego do pomiaru FCS leży w przedziale od 10-9 M do 10-6 M. Wyższe stężenie implikuje szereg trudności w analizie FCS. Rozkład fotonów rejestrowanych przez detektor już nie może być opisywany rozkładem Poissona. Zwiększa się też wpływ oddziaływań pomiędzy badanymi cząsteczkami. Zakładając, że intensywność światła wzbudzającego jest stała w czasie, fluktuacje fluorescencji w czasie można opisać jak odchylenie od średniej intensywności w czasie: 1 T <5F(t) = F(t) — (F(t)\, gdzie: (F(t)\ = ± JQ F(t)dt Można założyć, że fluktuacja intensywności fluorescencji jest wynikiem zmiany lokalnego stężenia (liczby molekuł w objętości detekcji). Wtedy wartość fluktuacji w danym momencie można opisać: 41 Wstęp Rozdział 5. ÖF(t) = ß I Iex(r) * S(r) * 8(0 * q * C(r,t))dV gdzie: ß - całkowita skuteczność wykrywania fluorescencji - wydajność układu detektora Iex(r) - rozkład przestrzenny intensywności światła wzbudzającego wzbudzającego w objętości detekcji, przy maksymalnej intensywność I0, S(r) - funkcja transferu optycznego układu obiektyw - przysłona. Decyduje o skuteczności gromadzenia przestrzennego i jest bezwymiarowa, S(a * ą * C(f, t)) - opisuje dynamikę fluoroforu na poziomie molekularnym, gdzie: Sa - fluktuacja absorbcji molekularnej; 5ą - fluktuacja wydajności kwantowej fluoroforu, SC(r, t) - fluktuacja liczby molekuł w objętości detekcji z powodu m.in. ruchów Browna. Kolejne elementy w powyższym równaniu są często bardzo trudne do wyznaczenia, a czasem nawet niemożliwe. W celu uproszczenia równania stosuje się szereg przekształceń. W(r) łączy w sobie Iex(r)/ I0 * S(r) i charakteryzuje rozkład przestrzenny światła emitowanego z próbki. W przybliżeniu szacowany jest jako trójwymiarowa funkcja 9 9 9 ^x2+y2 -2— Gaussa (ang. three-dimensional Gaussian function): W(r) = e ro * e z° Pozostałe parametry ß, g oraz q można połączyć z amplitudą intensywności światła wzbudzającego, aby uzyskać parametr określający szybkość zliczania fotonów na cząsteczkę i na sekundę - ^0 Vo= lo^ß^vq Po zastosowaniu powyższych założeń funkcja 5F(t) przyjmuje postać: SF(t) = jv W(r) * 0(qC(f,t))dV gdzie: Sygnał fluorescencji rejestrowany przez detektor zależy od cech instrumentu pomiarowego i właściwości barwnika fluorescencyjnego. F(t) = I W(r)qc(r)dV gdzie: c(r) - lokalne stężenie sondy fluorescencyjnej 42 Rozdział 5. Wstęp q - jasność molekularna. Zależy ona liniowo od wydajności kwantowej fluoroforu i maksymalnej intensywności światła wzbudzającego I0, W(r) = S(r)I(r)/I0 - opisuje efektywny kształt objętości połączonej z profilem natężenia światła wzbudzającego w objętości I(r)/I0 Znormalizowana funkcja autokorelacji używana w analizie FCS ma postać: {SF(t)*SF(t + T)) C(T) = —mp— gdzie: {F(t)) - oznacza średnią wartość intensywności fluorescencji w czasie pomiaru; 5F(t) = F(t) — {F(t)) - oznacza odchylenie intensywności fluorescencji w danym punkcie czasu od średniej wartości; T - czasowa skala korelacji. Amplituda autokorelacji G(0) jest znormalizowaną wariancją fluktuacji fluorescencji SF(t) {SF(t)2) G(0) = (jr(t))2 (wyrażenie w liczniku to wariancja, mianownik pełni funkcję normalizacyjną). Dla cząsteczki barwnika poruszającego się w roztworze (w przestrzeni trójwymiarowej) opisanej izotropową dyfuzją Browna równanie funkcji autokorelacji ma postać: y.2 _ '0 Tdiff = 4D a(z)=(i+^y h gdzie: K - parametr opisujący kształt objętości detekcji pomiarowej przy uproszczeniu zakładającym, że jest ona elipsoidą. Jest to stosunek długości półosi równoległej do osi optycznej i półosi prostopadłej do osi optycznej. Obie półosie w kierunku prostopadłym do osi optycznej są sobie równe - k = —. Wówczas objętość detekcji z0 pomiarowej wyrażona jest wzorem: 43 Wstęp Rozdział 5. Veff = n3/2 * Kœl T - czas dyfuzji, średni czas lateralnego przejścia molekuły przez objętość detekcji (w płaszczyźnie XY). Odnosi się on bezpośrednio do współczynnika dyfuzji n = "2/ / 4Tdiff 5.7.3. Zastosowanie metody FCS w badaniach układów biologicznych Podstawowe informacje dostarczane przez spektroskopię korelacji fluorescencji na temat wyznakowanych fluorescencyjnie molekuł to ich mobilność i stężenie. Umożliwiają one opis biochemicznych procesów w żywych komórkach. Jednym z wyzwań współczesnej proteomiki było oszacowanie poziomu ekspresji białek w komórce, oraz ich oddziaływań. Z tego też powodu metody z rodziny FCS znalazły szereg zastosowań w badaniach komórkowych. Z powodzeniem wyznaczono szereg współczynników dyfuzji w takich ośrodkach jak cytoplazma, jądro komórkowe czy błona (Brock, Hink, & Jovin, 1998; Schwille et al., 1999; Wachsmuth, Waldeck, & Langowski, 2000). Rozwój i zoptymalizowanie techniki FCCS umożliwiły po raz pierwszy zmierzenie oddziaływania międzycząsteczkowego pomiędzy dwoma rodzajami molekuł z czułością na poziomie pojedynczej pary cząsteczek (Schwille, Meyer-Almes, & Rigler, 1997). Analiza FCCS skupia się na amplitudzie krzywej korelacji wzajemnej (z ang. cross- correlation) pomiędzy fluktuacjami sygnałów pochodzących od dwóch fluoroforów. Jej wartość odzwierciedla obecność cząstek dwukolorowych, które są wynikiem oddziaływania dwóch różnych cząsteczek lub podjednostek jednej cząsteczki, każda z innym znacznikiem fluorescencyjnym. Możliwości FCCS wykazano mierząc aktywność endonukleaz i proteaz na podwójnie znakowanych niciach DNA lub białkach (Kettling et al., 1998; Kohl, Haustein, & Schwille, 2005). 5.7.3.1. Trudności w pomiarach FCS w komórkach Zagęszczenie molekularne występujące w komórce wpływa na mobilność molekuł. Struktury takie jak błony, chromatyna, cytoszkielet i organelle w cytoplazmie tworzą swoisty labirynt, w którym poruszają się białka. Do opisu dynamiki w cytoplazmie wystarczający jest opis bazujący na prostej dyfuzji. Niemniej w wielu pracach zaobserwowano i udowodniono anomalną dyfuzję badanych 44 Rozdział 5. Wstęp białek (Weiss et al., 2004; Banks & Fradin, 2005). Mobilność białek błonowych można dobrze opisać stosując anomalną dyfuzję dwuwymiarową. Anomalność może wynikać z oddziaływania białek błonowych między sobą, a także oddziaływania z innymi białkami przy błonie. Z powodu dużej ruchliwości białek w komórce trudne jest uchwycenie ich anomalnej dyfuzji (Banks & Fradin, 2005). Pojedynczy pomiar FCS trwa od sekundy nawet do minut, z kolei jego analiza umożliwia dynamikę procesów molekularnych na poziomie od nanosekund do milisekund (Bag & Wohland, 2014). W pomiarze FCS, aby uzyskać informację o zachowaniu pojedynczych cząsteczek, uśrednia się dużą liczbę pomiarów osiągając w ten sposób wysoką precyzję. O wysokiej rozdzielczości czasowej tej techniki stanowi analiza statystyczna zmienności intensywności fluorescencji przez cząsteczki znajdujące się w objętości detekcji (w teorii im dłuższy pomiar, tym z większą rozdzielczością czasową można badać procesy, ale także o coraz dłuższej skali czasowej). Analizując dane z metod eksperymentalnych, należy wziąć pod uwagę liczne artefakty wpływające na wynik, jak migotanie fluoroforu (Wachsmuth et al., 2000) (Haupts et al., 1998) i odwracalne fotoblaknięcie (Swaminathan, Hoang, & Verkman, 1997), które prawie zawsze występują przy wysokiej intensywności światła wzbudzającego. Jest to efekt bardzo uciążliwy dla obrazowania konfokalnego, ale szczególnie może wywrzeć istotny wpływ na pomiar FCS, ponieważ wprowadza dodatkowe zaburzenie dla analizy dynamicznej. Kolejne wyzwanie w pomiarach komórkowych z wykorzystaniem FCS ma wymiar fundamentalny. W teorii podstawą FCS jest pomiar fluktuacji fluorescencji z układu będącego w równowadze termodynamicznej. Wiadomo jednak, że stan komórki jest daleki od takiej równowagi. Ultrastruktury komórkowe o rozmiarach poniżej granicy rozdzielczości mogą hamować bądź zatrzymywać ruch cząsteczek. Z tego powodu staranna kalibracja i przygotowanie układu biologicznego, a także zastosowanie przemyślanej metody analizy są kluczowe. Wybrane ciekawe modyfikacje metody FCS Technika sw-FCCS (single wavelength - FCCS) została opracowana i opisana przez Wohlanda (Hwang & Wohland, 2004). W metodzie tej wykorzystuje się jedną linię laserową do wzbudzenia dwóch fluoroforów. Fluorescencja rejestrowana jest osobno w dwóch detektorach. W tym celu jeden z fluoroforów musi się charakteryzować dużym 45 Wstęp Rozdział 5. przesunięciem Stokes’a. Układ, na którym zademonstrowano działanie tej metody to znakowana fluoresceiną biotyna oraz streptawidyna znakowana kropkami kwantowymi (QD655). W pomiarach zmierzono stechiometrię, a także wyznaczono stałą równowagi reakcji wiązania biotyny przez streptawidynę. FRET-FCS (z ang. Förster resonance energy transfer and Fluorescence Correlation Spectroscopy) umożliwia detekcj ę bardzo małej subpopulacji cząsteczek, w których może zajść zjawisko FRET (Wennmalm et al., 2015). W tradycyjnych technikach FCS, aby subpopulacja cząsteczek była rozróżnialna musi ona stanowić minimum 10% całkowitej liczby badanych cząsteczek. W przypadku FRET-FCS można już rozpoznać subpopulacje, które stanowią tylko 2% całkowitej puli cząsteczek. 46 Rozdział 6. Hipoteza i Cele badań Rozdział 6. Hipoteza i Cele badań Białko XRCC1 jest zaangażowane w naprawę jednoniciowych pęknięć DNA. Nie ma ono funkcji enzymatycznej lecz pełni rolę molekularnego „rusztowania” oddziałując z innymi czynnikami naprawczymi, jak np. polimerazy PARP1, PARP2, ligaza III-a. XRCC1 szybko gromadzi się oraz tworzy intensywne ogniska o wyraźnie zaznaczonych krawędziach. Ogniska takie tworzone są przez setki, jak nie tysiące cząsteczek tego białka. Z powodu pełnionych przez siebie funkcji jest często uważane za marker jednoniciowych uszkodzeń DNA. Możliwą rolą pełnioną przez tak dużą liczbę zgromadzonych cząsteczek XRCC1 jest aktywny wpływ na gromadzenie się pozostałych białek naprawczych poprzez zwiększenie dostępnych dla nich miejsc wiązania. Moja hipoteza robocza dotycząca roli tego białka pełnionej w ognisku naprawy DNA zakłada, że poza wspomnianą powyżej rolą silnego sygnału gromadzenia pozostałych czynników naprawczych może ono pełnić inne funkcje, w tym działać jak lokalny czynnik stabilizujący chromatynę poprzez oddziaływanie z fragmentami poli(ADP-rybozy) lub Rysunek 6.1. Lokalizacja białka XRCC1 w rejonie prowadzonej naprawy DNA. Białko XRCC1 wiąże się z łańcuchami poli(ADP-rybozy). W ten sposób może brać udział w lokalnym stabilizowaniu sieci chromatyny. Gromadzące się cząsteczki XRCC1 mogą także wzmocnić sygnał przywołujący inne białka angażowane w proces naprawy. Przedstawiony schemat stanowi część ilustracji pokazującej mnogość białek zaangażowanych w proces naprawy DNA na podstawie publikacji (Aleksandrov i współpracownicy 2018). Źródło: http://dnarepair.bas.bg/ 47 Hipoteza i Cele badań Rozdział 6. jako składnik formowanych przy uszkodzeniu tzw. ciałek PML (Kordon, 2017; Kordon et al., 2018). W tych przypadkach należy spodziewać się zmniejszenia mobilności cząsteczek XRCC1 po rekrutacji do rejonu, w którym zachodzi naprawa DNA. Białko HP1 także ulega gromadzeniu w miejscu uszkodzenia DNA. Reguluje ono rekrutację czynników naprawczych jak BRCA1 oraz RAD51 do miejsca uszkodzenia, przez co wpływa na proces naprawy dwuniciowych pęknięć DNA na drodze HR. Stawiana przez mnie hipoteza robocza zakłada istnienie dwóch subpopulacji HP1 w obszarze jego akumulacji. Pierwsza z nich łączy się z funkcją pełnioną przez białko HP1 w rejonie uszkodzenia, którą jest uczestniczenie bezpośrednio w naprawie DNA poprzez utworzenie kompleksu z PCNA (Trembecka-Lucas et al., 2013). Taki kompleks tworzy zapewne tylko niewielka liczba cząsteczek HP1. Możliwe, że dimery HP1 wiążą się z trymerami PCNA zlokalizowanymi przy końcach przerwanej nici DNA. Może to sugerować zaangażowanie tylko kilku cząsteczek HP1 w to zjawisko, podczas gdy obserwuje się rekrutację dużej liczby cząsteczek tego białka w rejony naprawy DNA. Rola pozostałych licznych cząsteczek w otoczeniu uszkodzenia jest nieznana. Postuluję zatem, że drugą możliwą funkcją białka HP1 może być lokalne sieciowane chromatyny w celu uniemożliwienia odsunięcia od siebie końców przerwanej nici DNA w przypadku powstania DSB. Również i tu, podobnie jak w przypadku białka XRCC1, można spodziewać się zmniejszenia mobilności cząsteczek białka HP1 po zgromadzeniu w rejonie naprawy DNA. Dalekosiężnym celem moich badań jest ustalenie roli pełnionej przez białka XRCC1 oraz HP1 zgromadzone w rejonie uszkodzenia DNA. Możliwe, że mogą pełnić funkcję przywołującą pozostałe czynniki naprawcze (XRCC1) lub aktywnie uczestniczyć w lokalnym stabilizowaniu struktury chromatyny wokół uszkodzenia (HP1). Pomiar ich Rycina 6.2. Lokalizacja HP1 w rejonie uszkodzenia DNA. Zgromadzone HP1 wokół miejsca DSB. W samym obszarze uszkodzenia HP1 występuje w niskim stężeniu. Dwie subpopulacje HP1. Niewielka liczba HP1 przy udziale PCNA zaangażowana jest bezpośrednio w proces naprawy DNA. Większość populacji HP1 tworząc dimery wiąże chromatynę w bliskim sąsiedztwie DSB, tym samym ją stabilizując. 48 Rozdział 6. Hipoteza i Cele badań mobilności jest pierwszym etapem na drodze znalezienia odpowiedzi. Postulowane zwiększenie liczby miejsc wiązania dla obu białek powinno spowodować zmniejszenie tempa dyfuzji oraz zwiększenie czasu przebywania XRCC1 i HP1 w obszarach prowadzonej aktywnie naprawy DNA. Taka zmiana dynamiki obu białek powinna być wykrywalna techniką FCS. Aby zweryfikować postawione powyżej hipotezy, wyznaczyłem następujące cele cząstkowe skupiające się na opisie mobilności białek będących markerami procesów naprawy, zarówno jednoniciowych, jak i dwuniciowych pęknięć DNA: • Oszacowanie mobilności białka XRCC1 w nukleoplazmie; • Oszacowanie mobilności białka XRCC1 w jego ognisku, w miejscu lokalnie uszkodzonej chromatyny; • Zbadanie wpływu domen BRCT1, BRCT2 oraz wybranych miejsc fosforylacji białka XRCC1 na jego mobilność w nukleoplazmie oraz w ognisku naprawy DNA; • Oszacowanie mobilności białka HP1 w nukleoplazmie; • Oszacowanie mobilności białka HP1 w ognisku naprawy DNA. Dokładny opis mobilności obu białek w miejscu uszkodzenia DNA pozwoli na ustalenie, czy ich dyfuzja i wiązanie w miejscu uszkodzenia są zgodne z hipotezą, iż białka te mogą sieciować lub stabilizować chromatynę w sąsiedztwie tego uszkodzenia. 49 Materiały i Metody Rozdział 7. Rozdział 7. Materiały i Metody 7.1. Materiały 7.1.1. Linie komórkowe Doświadczenia przeprowadzono na linii komórkowej HeLa oraz na komórkach HeLa z stabilną ekspresją histonu H2B z przyłączoną metką fluorescencyjną eGFP. Komórki HeLa otrzymano, dzięki uprzejmości profesora Petera R. Cooka z Uniwersytetu w Oksfordzie, natomiast komórki HeLa z stabilną ekspresją znakowanego histonu otrzymano od prof. Hiroshi Kimury z Instytutu Technologii w Tokio. Linie komórkowe zostały wyprowadzone z ludzkiego nabłonka szyjki macicy (Rahbari et al., 2009). 7.1.2. Plazmidy kodujące wybrane białka naprawcze z przyłączonymi białkami fluorescencyjnymi Komórki linii HeLa były transfekowane następującymi plazmidami: XRCC1 (białko typu dzikiego): pmRFP-C1-XRCC1, pEGFP-C2-XRCC1, XRCC1 (mutanty): pmRFP-C1-XRCC1-T284A - mutacja: treonina w pozycji 284 podstawiona alaniną (miejsce fosforylacji kiazy Chk2); pmRFP-C1-XRCC1-S371A - mutacja: seryna w pozycji 371 podstawiona alaniną (miejsce fosforyacji kinazy DNA-PKcs); pmRFP-C1-XRCC1-L360R - mutacja: leucyna w pozycji 360 podstawiona argininą (dezaktywacja domeny BRCT1); pmRFP-XRCC1-p537STOP (XRCC1 A538-633) - mutacja: proliny w pozycji 537 podstawiona kodonem terminalnym stop TAA (delecja domeny BRCT2); pmRFP-XRCC1-S421A,T488A,S518A,T523A - mutacje: seryna na pozycji 421 zastąpiona alaniną, treonina na pozycji 488 zastąpiona alaniną, seryna z pozycji 518 zastąpiona alaniną oraz treonina w pozycji 523 zastąpiona alaniną. 50 Rozdział 7. Materiały i Metody Wszystkie plazmidy kodujące mutanty białka XRCC1 zostały otrzymane dzięki uprzejmości dr Magdaleny Kordon (Zakład Biofizyki Komórki, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii, Uniwersytet Jagielloński) Plazmidy kodujące izoformy białka HP1 : Mono-pEGFP-C1-HP1a; mono-pEGFP-C1-HP1ß; mono-pEGFP-C1-HP1y; mCherry-C1-HP1ß, H2B-eGFP. Plazmidy zostały opracowane przez dr Dominikę Trembecką-Lucas i opisane w jej pracy doktorskiej (Trembecka-Lucas, 2013). 7.1.3. Płyny hodowlane, bufory, roztwory DMEM (Dulbecco"s Modified Eagle"s Medium) - (BE12-614F, Sigma-Aldrich) z dodatkiem czerwieni fenolowej oraz 10% FBS (surowica pobrana z płodu bydlęcego) oraz 100U/ml penicyliny i 50 |ig/ml streptomycyny (Gibco). W procesie transfekcji komórki przetrzymywano w pożywce Opti-MEM® (Life Technologies) z 10% zawartością FBS. Do pasażowania komórek użyto 0.25% roztworu trypsyny z EDTA (25200-056, Lifetechnologies,UK). PBS (bez jonów dwuwartościowych): pH=7,4; NaCl=8,015g/l; KCl=0,201g/l; Na2HPO4*12H20=3,630g/l; KH2PO4=0,204g/l. FuGene HD Transfection Reagent (Promega) - odczynnik używany w procesie transfekcji. 7.1.4. Roztwory kalibracyjne do pomiarów FCS Atto 488 - Modification: carboxy; Product No.:488-21 (Atto-Tec) Atto565 - Modification: carboxy; Product No.:AD 565-21 (Atto-Tec) Alexa 594 - Alexa Fluor™ 594 Carboxylic Acid, tris(triethylammonium) salt (Thermofisher) Barwniki kalibracyjne rozpuszczano w wodzie aptecznej (przy pierwszych pomiarach FCS), a w późniejszych eksperymentach stosowano wodę - Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen™ 10977035). 51 Materiały i Metody Rozdział 7. 7.1.5. Programy komputerowe • Leica LAS AF (Leica) - program do obsługi mikroskopu konfokalnego Leica SP5. Wykorzystywany również do analizy doświadczeń FLIM. • SymPhoTime (PicoQuant) - program do kontroli trybu FCS na mikroskopie. Używany do rejestracji pomiarów oraz do analizy pomiarów kalibracyjnych. • Microsoft Office 365 (Microsoft) - pakiet aplikacji biurowych. Używany w przygotowaniu maszynopisu niniejszej rozprawy, zestawienia danych, podstawowych przeliczeń. • OriginPro (OriginLab) - analiza doświadczeń FLIP, w tym dopasowanie modeli, oraz wykonanie testów statystycznych w celu porównania dopasowania modeli do krzywych FCS. • Fluctuation Analyzer 4G v15.02.23 - program autorstwa Malte Wachsmuth (EMBL, Heidelberg, Niemcy). Używany do korelowania sygnału pomiędzy detektorami w doświadczeniach z auto-korelacją oraz do dopasowywania modeli bazujących na anomalnej dyfuzji (Wachsmuth et al., 2015). • PyCharm Community Edition (JetBrains) & Python 2.7 - zintegrowane środowisko programistyczne dla jezyka programowania Python (Python 2.7), przy pomocy którego napisano wszystkie programy używane w analizie FCS. • Graph - tworzenie wykresów widm wzbudzenia i emisji poszczególnych białek fluorescencyjnych oraz barwników kalibracyjnych, z nałożeniem dodatkowo linii wzbudzenia użytych w doświadczeniach i zakresu przepuszczalności wybranych filtrów. Używany na etapie projektowania doświadczeń. • Corel Draw Graphics Suite 2017 - tworzenie zbiorczych rycin i wykresów niniejszej pracy. • ImageJ - obróbka graficzna obrazów mikroskopowych (Brown, 2009; Schneider, Rasband, & Eliceiri, 2012). 52 Rozdział 7. Materiały i Metody 7.2. Metody 7.2.1. Hodowle komórkowe Komórki hodowano w polistyrenowych szalkach hodowlanych. Hodowle prowadzono w temperaturze 370C i w atmosferze o zawartości 5% CO2. Pożywka hodowlana składała się z DMEM i z FBS (10% całkowitej objętości) z dodatkiem antybiotyków penicyliny (100U/ml) oraz streptomycyny (50 |ig/ml). 7.2.2. Transfekcja Komórki przed doświadczeniami hodowane były na nakrywkowych szkiełkach mikroskopowych, które znajdowały się w dwunastodołkowych płytkach hodowlanych. Kiedy powierzchnia szkła została pokryta w 60-80% komórkami przeprowadzano transfekcję. Co najmniej godzinę przed transfekcją zmieniano komórkom pożywkę hodowlaną na Opti-MEM® (Life Technologies) z 10% zawartością FBS. W skład mieszaniny transfekcyjnej wchodziły Opti-MEM® (Life Technologies) bez dodatku FBS, plazmid oraz czynnik transfekcyjny FuGENE® HD Transfection Reagent (Promega). Całkowita masa plazmidu w pojedynczej transfekcji wynosiła od 200 ng do 400 ng. Ilość potrzebnego odczynnika FuGene wynosiła 3,5 |il na 1000 ng plazmidu. Całkowita objętość mieszaniny była proporcjonalna do ilości wykorzystanego plazmidu (50 |il mieszaniny na 1000 ng plazmidu). Roztwór przygotowywano w Opti-MEM® (Life Technologies). Kolejność dodawania odczynników była następująca: do wyznaczonej objętości Opti- MEM® dodawano kolejno plazmid, a następnie FuGene. Następnie mieszaninę inkubowano przez 15 min w temperaturze pokojowej, po czym dodawano ją do komórek na szkiełku. Po okresie 24-48 h komórki wykazywały wystarczający poziom ekspresji białka fuzyjnego do pomiarów FCS. 7.2.3. Metoda wywoływania pęknięć nici DNA Lokalne uszkodzenie DNA w komórkach było wywoływane poprzez zogniskowanie wiązki lasera (470 nm - laser impulsowy i 488 nm laser argonowy, fali ciągłej) w wybranym miejscu w jądrze komórkowym. W komórce w czasie naświetlania nie było zewnętrznego fotouczulacza. Metoda ta została opracowana w Zakładzie Biofizyki Komórki Uniwersytetu Jagiellońskiego (Solarczyk, Zarębski, & Dobrucki, 2012). 53 Materiały i Metody Rozdział 7. Do generowania uszkodzeń DNA, w odpowiedzi na które obserwowana była akumulacja białka HPlß z metką fluorescencyjną, używano światła lasera o długości fali 470nm. Natomiast do wywołania akumulacji białka XRCC1 wykorzystano naświetlanie linią 488 nm. Dla uszkodzeń DNA z widoczną akumulacją XRCC1 przyjęto dawkę energii 90 ^J natomiast w przypadku doświadczeń z białkiem HPlß z metką fluorescencyjną dawka wynosiła 1 mJ. Dawki zostały dobrane na podstawie doświadczeń mgr Julity Wesołowskiej z Zakładu Biofizyki Komórki UJ. W przypadku XRCC1 jest to dawka minimalna jaką trzeba dostarczyć, aby z prawdopodobieństwem około 90% widoczna była akumulacja XRCC1 z metką fluorescencyjną. Gromadzenie białka było widoczne już po upływie kilku sekund od zakończenia naświetlania. W przypadku białka HP1 dobrano dawkę, powodującą akumulację białka z około 100% prawdopodobieństwem. Akumulacja białka była widoczna po upływie około 5 min. Przykładowe przeliczenia (pomiar z 04.10.2017): dla linii 470 nm (40 Hz) zmierzono intensywność światła lasera na wyjściu z obiektywu: 176 |iW. Zatem czas użyty do naświetlania w pomiarach wynosił _ dawka [ßj] _ 1000 ß] _ ^ moc lasera [ßW] 176 ßW ’ Dla każdej serii doświadczeń (kilku dni pod rząd, podczas których prowadzono doświadczenia) wykonywano pomiar natężenia światła linii laserowych ze szczególnym uwzględnieniem linii wykorzystywanych do uszkodzenia DNA. Zabieg ten był niezbędny do wyznaczenia czasu naświetlania w celu wywołania uszkodzenia. W przeciągu kilku miesięcy mierzone natężenie światła laserów ulegało istotnej zmianie, przez co konieczne było wyznaczanie wymaganego czasu naświetlania za każdym razem na nowo (przykładowe odczyty w tabeli 6.1.). W obliczeniach wykorzystywano zawsze pomiar intensywności światła lasera na wyjściu z obiektywu w trybie, w którym prowadzono lokalne naświetlanie. Tabela 7.1. Odczyty pomiarów intensywności światła o długości 470 nm i 488 nm przy wyjściu z obiektywu. Linia laserowa 22.03.2017 06.07.2017 12.10.2017 488 nm 150 |ÏW 189 |ÏW 177 |ÏW 470 nm 18,71 |ÏW 15,40 |ÏW 17.76 |ÏW 54 Rozdział 7. Materiały i Metody 7.2.4. Pomiar intensywności światła wzbudzającego Każdorazowo, przed przystąpieniem do eksperymentów sprawdzano intensywność światła wzbudzającego, kształt wiązki i jej stabilność. Pomiary mocy laserów dokonywano na wyjściu wiązki światła z obiektywu - w miejscu umieszczania próbki pomiarowej. Do pomiarów używano miernika Vega z głowicą fotodiodową PD300 (Ophir). Obiektyw ustawiano jak najbliżej, aby cały stożek światła oświetlał centralną część czujnika. Parametry rejestracji były ustawione następująco: prędkość przemiatania: 400Hz, obiektyw HCX PL APO CS 63.0x1.20 WATER UV; powiększenie: 64x. Intensywność światła lasera była mierzona w dwóch trybach jego pracy: „live” - gdy wiązka przemiata pole widzenia, oraz w trybie zaparkowania wiązki w jednym punkcie. Znacząco niższe natężenie światła wzbudzającego od wcześniejszych pomiarów mogło wskazywać na niezauważoną wcześniej zmianę w układzie optycznym (dodatkowy filtr, przesunięcie się światłowodu), co rzutowałoby na dokładność pomiarów. 7.2.5. Mikroskopia i rejestracja obrazów W obrazowaniu oraz w pomiarach FCS używano mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP5 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Niemcy) z obiektywem: HCX PL APO CS 63.0x1.20 WATER UV. Pomiarach FLIP wykonywano przy użyciu mikroskopu konfokalnego TCS SP5 SMD z obiektywem HCX PL APO CS 63.0x1.40 OIL UV. Oba mikroskopy wyposażone są w mikroinkubatory umożliwiające utrzymanie temperatury próbki na poziomie 37 oC. Zakresy długości fali rejestrowane przez fotopowielacze: dla eGFP: 500-550 nm; dla mRFP: 560-640 nm; dla mCherry: 600-780 nm. Szkiełka mikroskopowe umieszczano na stoliku mikroskopowym w metalowym pierścieniu umożliwiającym dodanie pożywki hodowlanej - 10% FBS w DMEM (bez czerwieni fenolowej). Rejestracja obrazu, jak i pomiary FCS oraz FLIP, wykonywano w temperaturze 37 0C. 55 Materiały i Metody Rozdział 7. 7.2.6. Pomiar ruchliwości XRCC1 w jądrze komórkowym metodą FLIP W celu oszacowania ruchliwości białka mRFP-XRCC1 w jądrze komórkowym przeprowadzono pomiary utraty fluorescencji w czasie fotoblaknięcia FLIP. Komórki linii HeLa zostały poddane przejściowej transfekcji odpowiednim plazmidowym DNA. Pomiary przeprowadzono między drugą a trzecią dobą po transfekcji. W tym czasie komórki wykazywały wystarczający poziom ekspresji białka fuzyjnego do pomiarów FLIP. Celem pomiaru FLIP jest obserwacja spadku fluorescencji barwnika fluorescencyjnego z danego obszaru na skutek jego wymiany z cząsteczkami, które zostały wyblaknięte w innym obszarze poprzez foindukowane blaknięcie. Wymaga to obrazowania całego pola widzenia oraz równoczesnego prowadzenia naświetlania o dużym natężeniu wybranego obszaru w celu prowadzenia ciągłego blaknięcia fluoroforu. Pole widzenia zawierało dwa jądra komórkowe. W pierwszym jądrze prowadzony był pomiar FLIP, a drugie jądro potrzebne było do uwzględnienia korekty na blaknięcie spowodowane samym obrazowaniem. Obrazy były rejestrowane przez około 800 sekund. Parametry rejestracji: wzbudzenie - linia laserowa o długości fali 561 nm; obiektyw - HCX PL APO CS 63.0x1.40 OIL UV; zakres rejestracji na fotopowielaczu - 570 - 700 nm; częstotliwość przemiatania wiązką laserową - 400 Hz. 56 Rozdział 7. Materiały i Metody 7.2.7. Analiza pomiarów FLIP Analizie poddawana była sekwencja obrazów zarejestrowana wyłącznie w trybie obrazowania. Każdy obraz zawierał jądro komórkowe, w którym wywołano wcześniej lokalne uszkodzenie (czego efektem było powstanie ogniska XRCC1) oraz co najmniej jedno dodatkowe jądro komórkowe jako punkt odniesienia (do detekcji fotoblakniecia spowodowanego rejestracją obrazów). Średnia intensywność z obszarów jądra komórkowego poza rejonem prowadzonego równolegle blaknięcia, oraz z jądra referencyjnego, były odczytywane z każdego obrazu przy użyciu wbudowanego modułu programu LAS AF obsługującego mikroskop konfokalny Leica SP5. Na potrzeby analizy zdefiniowano dla każdego obrazu pięć obszarów (Rycina 7.1): ROI1 - zawierający w sobie ognisko XRCC1 powstałe na skutek indukcji uszkodzenia DNA naświetlania światłem widzialnym, ROI2 - zgromadzone XRCC1 tworzące wyraźne ogniska, ROI3 - w nukleoplazmie, zlokalizowany bliżej obszaru ciągłego naświetlania. Jest to kontrola dla ROI2. Podejrzewano, że zmierzona ruchliwość cząsteczek XRCC1 może zależeć od odległości miejsca pomiaru od obszaru poddanego blaknięciu, ROI4 - obejmujący nukleoplazmę w sąsiednim jądrze komórkowym. Zarejestrowany spadek fluorescencji z tego obszaru jest spowodowany naświetlaniem światłem żółtym (561nm) emitowanym przez laser diodowy w celu rejestracji obrazów. Ten spadek powinien być uwzględniony jako korekta na mierzony spadek fluorescencji z obszarów ROI1, ROI2 i ROI3 ROI5 - wyznaczana jest tu średnia jasność piksela reprezentująca szum (tło). 57 Materiały i Metody Rozdział 7. Rycina 7.1. Badanie dynamiki XRCC1 - schemat doświadczenia FLIP na komórkach z ekspresją mRFP-XRCC1. Przykładowe lokalizacje wybranych obszarów uwzględnianych w analizie. ROI1 - obszar zawierający ognisko XRCC1 (ognisko naprawy DNA); ROI2,3 - obszary w komórce poza obszarem akumulacji XRCC1; ROI4 - obszar w komórce referencyjnej; ROI5 - tło, oraz obszar naświetlania. Z definiowanych obszarów dla każdego punktu w czasie wyliczano średnią intensywność fluorescencji obszaru dla kolejnych kroków czasowych: NBt - dla obszarów, gdzie nie było prowadzone ciągłe fotoblaknięcie - ROI1 lub ROI2 lub ROI3; Rt - dla obszaru referencyjnego - ROI4; Bgt - dla obszaru poza komórką. Opisująca zmianę średniego poziomu tła i szumów podczas doświadczeń - ROI5. Dla każdego obrazu (punktu czasowego) wyznaczono wartość relatywnej intensywności. W celu uwzględnienia korekty na spadek intensywności sygnału spowodowany światłem używanym do rejestracji obrazów, poziom szumu oraz znormalizowania danych, aby można je było między sobą porównywać, użyto poniżej zależności: _ NBt — Bgt R0 — Bg0 ref = Rt - Bgt * NB0 - Bg0 58 Rozdział 7. Materiały i Metody Pierwszy czynnik powyższego iloczynu uwzględnia poprawkę na poziom tła w czasie pomiaru oraz spadek fluorescencji z powodu obrazowania. Drugi czynnik jest wprowadzony w celu normalizacji. W analizie krzywych FLIP użyto dwóch modeli: -X ExpDec1: y = ^1 * + y0 -X -X ExpDec2: y = ^1 * + ^2 * ef2 + y0 59 Materiały i Metody Rozdział 7. 7.2.8. Pomiar FCS W ramach pracy eksperymentalnej opracowano protokoły postępowania dla kolejnych etapów doświadczeń z wykorzystaniem techniki FCS. Wszystkie pomiary wykonano na mikroskopie konfokalnym Leica SP5 TCS SMD z przystawką do pomiarów FCS/FLIM. W doświadczeniach wykorzystywano obiektyw (HCX PL APO CS 63.0x1.20 WATER UV). Doświadczenia wykonywano seriami po kilka dni. Przed przystąpieniem do pomiarów FCS niezbędne było sprawdzenie szeregu ustawień mikroskopu, takich jak moce laserów, ich stabilność, kształt wiązki, odczyty na jednofotonowych fotodiodach lawinowych przy różnych ustawieniach pracy mikroskopu (w trybie przemiatania oraz zaparkowania wiązki), wycentrowanie światłowodów oraz zmiana kostki filtrowej, której pozycję także należało zoptymalizować. Same pomiary FCS ze względu na swoją naturę, a także potrzebę zarejestrowania odpowiedniej liczby krzywych, były bardzo pracochłonne. Z tego względu pomiary FCS planowano jako ciąg trwający kilka dni. Sprawdzenie działaniu mikroskopu i kalibracje ustawień przeprowadzano pierwszego dnia. W wieczór poprzedzający pierwszy dzień pomiaru włączano ogrzewanie komory, wewnątrz której znajdował się mikroskop. Ogrzewanie działało nieprzerwalnie do ostatniego dnia pomiarów w celu utrzymania stałej temperatury całego mikroskopu, w tym obiektywu. Miało to na celu zapobiegnięciu kurczeniu się i rozszerzaniu elementów metalowych na skutek wahań temperatury, co w konsekwencji mogło negatywnie wpłynąć na położenie elementów optycznych (soczewek w obiektywie) i rozkalibrowanie całego układu. W kolejnych dniach pomiarów dokonywano tylko pomiarów FCS na roztworach kalibracyjnych w celu doprecyzowania efektywnej objętości detekcji w danym dniu. Do rejestracji sygnału od Atto488 i GFP używano filtru: ET525/50M (Chroma); Alexa594, mRFP: ET585/40m (Chroma), mCherry: HQ645/75m (Chroma). 60 Rozdział 7. Materiały i Metody 7.2.8.I. Konfiguracja układu mikroskopu do pomiarów FCS Wszystkie pomiary FCS zostały przeprowadzone przy użyciu mikroskopu Leica SP5 TCS SMD z przystawką do pomiarów FCS/FLIM. Poniżej zamieszczono schemat rozłożenia najważniejszych elementów mikroskopu. Jako źródło światła można wykorzystać lasery impulsowe do zastosowania w technice FLCS, bądź lasery fali ciągłej (diodowe lub argonowy). W rejestrowaniu sygnału można wybierać pomiędzy fotopowielaczami, a układem dwóch fotodiod lawinowych (SPAD). Funkcja X1-Port polega na przełączaniu wiązki emisyjnej pomiędzy detektorami. Fotopowielacze wykorzystywane były do obrazowania, z kolei detektory SPAD do rejestracji fluktuacji fluorescencji. Kluczowym elementem umożliwiającym pomiar FCS było zastosowanie kostki do równego rozdzielenia wiązki emisji (podział 50/50). Rejestrowanie tego samego sygnału na obu detektorach umożliwiło w analizie przeprowadzenie badania Rycina 7.2. Schemat blokowy układu mikro- skopowego użytego w doświadczeniach FCS. Schemat zawiera wybrane elementy z mikroskopu Leica TCS SP5, istotne w doświadczeniach FCS. AOBS - filtr akusto-optyczny (z ang. Acousto-Optical Beam Splitter) służący do rozdzielenia wiązki wzbudzenia od wiązki emisji. X1 Port - układ zwierciadeł, którego położenie decyduje o wyborze ścieżki emisji. MFP - element optyczny rozdzielający światło wzbudzenia laserów impulsowych od światła emisji. SPAD - fotodioda lawinowa. 61 Materiały i Metody Rozdział 7. ”cross korelacji” pomiędzy detektorami. Zabieg ten miał na celu usuniecie artefaktów, jak na przykład afterpulsingu, który wzmaga korelację przy bardzo krótkich czasach. 7.2.8.2. Kalibracja mikroskopu do pomiarów FCS Każdą serię doświadczeń rozpoczynano od sprawdzenia stanu mikroskopu, a następnie wykalibrowaniu układu optycznego. Celem kalibracji było wyznaczenie jak najmniejszej objętości detekcji (tzw. Veff), z której rejestrowany jest sygnał. Im mniejsza jest objętość detekcji, tym wyższe może być stężenie fluoroforu, w którym można prowadzić pomiary FCS. Protokół sprawdzenia i kalibracji obejmował następujące elementy: 1. Dokonanie pomiaru intensywności światła lasera i jego stabilności na wyjściu z obiektywu. Do tego celu wykorzystano miernik Vega z głowicą fotodiodową PD300 (Ophir). Uzyskane intensywności światła porównywano pomiędzy kolejnymi seriami doświadczeń w celu zabezpieczenia się przed możliwą dużą różnicą w odczycie, która mogła by być spowodowana dodatkowym elementem na ścieżce wiązki wzbudzającej (filtry neutralne, polaryzacyjne, kurz na soczewce obiektywu) lub zmianą położenia światłowodu, przez które przechodzi światło lasera. 2. Sprawdzenie kształtu obrazu kulki fluorescencyjnej o średnicy 0,5 |im w płaszczyźnie XY oraz XZ. W pomiarach wykorzystano testową próbkę FocalCheck™ Fluorescence Microscope Test Slide #1 (Thermofisher). Symetria obrazu kulki w płaszczyźnie XY oraz kształt podobny do PSF w płaszczyźnie XZ wskazywały na poprawne ułożenie elementów optycznych. Duże odstępstwo kształtu obrazu kulki w płaszczyźnie ZX wymagało przerwania doświadczeń i ponownej próby kalibracji kształtu wiązki lasera (Rycina 7.3.D), do czego potrzebny był przyjazd autoryzowanego serwisu. 3. Wymiana kostki filtrowej, która znajduje się przed dwoma fotodiodami lawinowymi (SPAD). Kostka, która w standardowej konfiguracji znajduje się na drodze optycznej w mikroskopie zawiera zwierciadło dichroiczne (BS560), natomiast kostka potrzebna do pomiarów zawierała w sobie zwierciadło do rozdzielenia wiązki (podział 50/50). Kostka ta rozdziela fotony z tego samego zakresu spektralnego do dwóch detektorów. Użycie tej kostki pozwoliło na badanie ”auto-cross korelacji” dla tego samego zakresu rejestrowanego sygnału, przez co możliwe było usunięcie 62 Rozdział 7. Materiały i Metody artefaktów. Artefakty te byłyby widoczne przy rejestracji sygnału za pomocą tylko jednego detektora. Włożenie nowej kostki wymagało regulacji położenia obu światłowodów pomiędzy kostką a detektorami. 4. Sprawdzenie odczytu na obu detektorach przy różnych ustawieniach rejestracji sygnału. a. Przy wyłączonym laserze i braku próbki na mikroskopie; b. Przy włączonym laserze, bez imersji wodnej na obiektywie i próbki na mikroskopie; c. Przy włączonym laserze i nałożonej kropli wody na obiektyw; d. Przy włączonym laserze, imersji i próbce na mikroskopie. Wiązka lasera była skupiona poza komórkami. 5. Kalibracja obiektywu na grubość szkiełka. Obiektyw posiada pierścień korekcyjny umożliwiający dostosowanie wysokości niektórych elementów w obiektywie w celu kompensacji grubości szkiełka i zminimalizowania abberacji sferycznej wynikającej z użycia szkiełek nakrywkowych o różnej grubości (Rycina 7.3.C). Zabieg ten umożliwia uzyskanie maksymalnej wydajności detekcji fotonów z próbki (roztwór wodny barwnika kalibracyjnego) - maksymalnej jasności (”molecular brightness”). Wysoka fotostabilność barwników pozwala na używanie wysokiej intensywności światła wzbudzającego w czasie kalibracji. 63 Materiały i Metody Rozdział 7. Rycina 7.3. Kluczowe etapy kalibracji mikroskopu przed doświadczeniem FCS. A - przykład obiektywu używanego w pomiarach FCS z zaznaczonym pierścieniem korekcyjnym do kalibracji na grubość szkiełka (źródło: leica.com); B - przekrój poprzeczny przez układ - kolejno imersja wodna, powierzchnia pomiędzy wodą a szkłem, następnie szkło i powierzchnia pomiędzy szkłem, a przestrzenią z próbką; C - granica pomiędzy ośrodkami - szkłem i próbką. Pierwszy obraz przedstawia granicę ośrodków dla niewykalibrowanego obiektywu na grubość szkiełka, a drugi obraz już po dokonanej korekcji. Po korekcji prosta (odbicie od powierzchni) jest wyraźna, węższa, o większym kontraście w stosunku do otoczenia; D - obraz w płaszczyźnie XZ kulki fluorescencyjnej przy użyciu nieuliniowionej wiązki laserowej (pierwszy obraz) i uliniowonej, czyli takiej przy której optymalnie można prowadzić pomiary FCS; E - wykresy funkcji autokorelacji dla odczytów z pojedynczych detektorów (czarny i czerwony) oraz wykres krzywej autokorelacji, gdzie skorelowano krzyżowo sygnał z obu detektorów (niebieski). W tym przypadku nie ma charakterystycznego wzrostu krzywej przy krótkich czasach korelacji ponieważ ”afterpulsing”, który go powodował został usunięty dzięki skorelowaniu ze sobą sygnału z obu detektorów. 64 Rozdział 7. Materiały i Metody 6. Dobór stężenia barwika kalibracyjnego i stabilizacja układu. W zależności od metki fluorescencyjne użytej do wyznakowania białka XRCC1 lub HP1 korzystano z wybranego barwnika kalibracyjnego (Tabela 6.2.). Wybrane barwniki, w swojej strukturze posiadają końcowe grupy karboksylowe (wykazujące właściwości hydrofilowe), które ułatwiają rozpuszczanie w polarnych rozpuszczalnikach (np. w wodzie). Procesowi temu towarzyszy powstawanie otoczki solwatacyjnej, która ogranicza dostępność grup karboksylowych, tym samym minimalizuje efekt agregacji cząsteczek barwnika. Stężenie dobierano tak, aby stosunek średniej liczby fotonów docierających do detektora na sekundę do średniej liczby fotonów docierających na sekundę z pojedynczej cząsteczki wynosił od 1 do 0.2. Stosunek ten także określa się jako wartość funkcji autokorelacji dla t=0 i jest to tzw. amplituda funkcji autokorelacji. Zabieg ten ma na celu, aby przy jak najwyższej maksymalnej jasności z pojedynczej cząsteczki rejestrować w objętości detekcji kilka cząsteczek. Pozwala to uzyskać najlepszy poziom fluktuacji fluorescencji w czasie pomiaru przez co z większą dokładnością i powtarzalnością można oszacować objętość i rozmiar objętości detekcji (opisany parametrem k). Dobrany układ należy stabilizować około 20-30 min, aby zminimalizować wpływ zewnętrznych czynników (np. pipetowania roztworu kalibracyjnego) na ruch molekuł w próbce. Tabela 7.2 Wartości współczynników dyfuzji dla barwników kalibracyjnych w temperaturach 25oC oraz 37oC. Barwnik Kalibracyjny Współczynnik dyfuzji w 25oC [nm2/s] Współczynnik dyfuzji w 37oC [^m2/s] Użyta długość fali światła laserowego [nm] Metka fluorescencyjna Atto488 400,0 (Kapusta, 2010) 535* 488 eGFP Atto565 259,0 (Pan et al., 2006) 344* 564 mCherry Alexa594 370,0 (Nitsche et al., 2004) 492,16* 594 RFP * - współczynniki dyfuzji barwników dla temperatury 37oC zostały wyznaczone na podstawie poniższej relacji (Kapusta, 2010) D(T) = D(25°C) • T • s’9'w~\Pa's = D(250C) • t+27r3’15 • 2,985 • 10-6Pa • s • v y v y 298,15K V(T) V(T) K-1 D(25oC) - współczynnik dyfuzji w temperaturze pokojowej - 25oC T - temperatura bezwzględna [K] t - temperatura w stopniach Celsjusza [oC] n(T) - lepkość wody w temperaturze T 65 Materiały i Metody Rozdział 7. 7. Przeprowadzenie pomiaru kalibracyjnego. Po dobraniu odpowiedniego stężenia barwnika kalibracyjnego, zoptymalizowaniu układu w celu uzyskania maksymalnej możliwej wartości jasności rejestrowanej fluorescencji pojedynczej cząsteczki i odczekaniu około 30 minut przeprowadzono pomiar fluktuacji fluorescencji z kilku - kilkunastu miejsc wewnątrz roztworu, na wysokości 20 ^m od powierzchni szkiełka. W każdym miejscu pomiar wykonywano kilka razy. Pojedynczy pomiar trwał od 30 s do 1 min. 8. Wyznaczenie objętości detekcji i parametru k. Zarejestrowane dane pomiarowe następnie poddawane były analizie z wykorzystaniem programu SymPhoTime (PicoQuant). Program korzystając z równania autokorelacji (gdzie korelowany był sygnał pomiędzy detektorami) oraz na podstawie zarejestrowanej fluktuacji fluorescencji na detektorach, tworzył funkcję autokorelacji. Do uzyskanej krzywej dopasowywany był model prostej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej w populacji. Z parametrów dopasowania wyznaczono wartość k. Natomiast dzięki znanemu współczynnikowi dyfuzji barwnika kalibracyjnego było możliwe wyznaczenie objętości detekcji. GM = [i— r + Te^} '£Pl[1+Ly(1+-L.yl/2 i=l ? n z0 „ 3/2 2/^i {N) „ W0 V 1 K = v*rr = - / Dt = gdzie: Veff [fl] - efektywna objętość wzbudzania. Wyznaczana na podstawie uzyskanego z dopasowania czasu dyfuzji oraz znanego z literatury współczynnika dyfuzji barwnika kalibracyjnego; zo [^m] - efektywny promień elipsoidy wzdłóż osi optycznej. Wyznaczany na podstawie Veff i parametru k; w0 [^m] - efektywny promień elipsoidy w płaszczyźnie prostopadłej do osi optycznej. Wyznaczany na podstawie Veff i parametru k; pi - udział wybranej subpopulacji; Ti [ms] - czas dyfuzji wybranej subpopulacji; Di [^m2/s] - stała dyfuzji dla wybranej subpopulacji, na etapie kalibracji jest wielkością o zadanej wartości znanej z literatury; 66 Rozdział 7. Materiały i Metody - średnia liczba cząsteczek w objętości detekcji. Wyznaczana na podstawie G(0); [nM] - stężenie cząsteczek w objętości detekcji. Wyznaczane na podstawie Veff; k - stosunek długiej półosi do małej półosi objętoście detekcji; T - subpopulacja cząsteczek będących w stanie trypletowym; TT - czas życia trypletu. Na podstawie uzyskanych dopasowań wyznaczano objętość detekcji i parametr k jako średnią populacyjną w zbiorze krzywych. Parametry te następnie wykorzystywano w analizie danych zarejestrowanych tego samego dnia. Kolejnego dnia, pomimo braku wprowadzania zmian w układzie, proces kalibracji ze świeżo przygotowanego roztworu kalibracyjnego przeprowadzano ponownie. Miało to na celu sprawdzenie czy z upływem czasu elementy układu optycznego nie uległy rozkalibrowaniu (temperatura w pomieszczeniu w nocy jest niższa - tak działa system wentylacji budynku, w którym znajduje się laboratorium) i czy wymagana jest ponowna optymalizacja. 7.2.8.3. Przeprowadzenie pomiaru FCS w żywych komórkach Przeprowadzenie pomiarów FCS w komórkach było jedną z największych trudności, z jaką się zmierzono podczas pracy. Dobór odpowiednich wartości parametrów jest kluczowy. Poniżej opisano w skrócie, które parametry odgrywały kluczową rolę w prowadzeniu pomiarów FCS. W pierwszej kolejności istotny jest proces kalibracji mikroskopu przed pomiarami FCS. Z powodu spodziewanego relatywnie wysokiego stężenia białka z metką fluorescencyjną należy dążyć do osiągnięcia jak najmniejszej objętości detekcji. Zabieg ten pozwoli na obserwowanie w danym momencie mniejszej liczby cząsteczek, niż w przypadku kiedy objętość detekcji byłaby większa. Intensywność fluorescencji - poziom ekspresji białka z metką fluorescencyjną. Spośród komórek na szkiełku wybierano te, w których intensywność sygnału rejestrowana przy użyciu fotopowielacza było ledwo dostrzegalna. Przy przejściowej transfekcji pozwalało to na upewnienie się, że w wybranej komórce zaszła ekspresja białka z metką fluorescencyjną. Zabieg ten miał także na celu ograniczenie liczby cząsteczek w objętości detekcji. Pozwalało to na zarejestrowanie większych fluktuacji fluorescencji, co w konsekwencji przekładało się na dokładniej wyznaczoną krzywą autokorelacji. Mniejsza liczba cząsteczek w objętości rzutuje także na amplitudę krzywej 67 Materiały i Metody Rozdział 7. (jest to zależność odwrotnie proporcjonalna). Do krzywej autokorelacji z wyższą amplitudą łatwiej dopasować model. Rycina 7.4. Intensywności fluorescencji sygnału białka eGFP-HP1ß w różnych komórkach (w przejściowej ekspresji). Strzałką zaznaczono komórki, w których poziom ekspresji białka z metką był odpowiedni do przeprowadzenia pomiarów FCS. Skala: 30 fim. Intensywność światła wzbudzenia do pomiaru dobierano bardzo starannie. Z jednej strony wskazane było używanie wysokiego natężenia światła wzbudzającego. Skutkuje to uzyskaniem większej liczby fotonów z pojedynczej cząsteczki (wyższy poziom odczytów na sekundę i na cząsteczkę). Wysoka intensywność światła niestety może także powodować lokalne uszkodzenie chromatyny oraz, jeśli stężenie białka z metką będzie wysokie (wysoka intensywność sygnału z jądra), uniemożliwi pomiar. Wówczas liczba fotonów dochodzących do fotodiod lawinowych może przerosnąć zdolność detektorów i uszkodzić je. Z tego powodu dobrą praktyką przy ustalaniu intensywności światła wzbudzającego jest rozpoczynanie od najmniejszej wartości i potem sukcesywne jej podnoszenie, aż do momentu kiedy poziom zliczeń fotonów na sekundę będzie wysoki, ale nie za wysoki. Należy też sprawdzić czy sam pomiar FCS nie wywołuje widocznej akumulacji białek, wówczas sam pomiar jest przyczyną uszkadzania DNA. Intensywność światła o długości fali 488 nm, 594 nm (mierzona w miejscu preparatu) w czasie pomiarów FCS wynosiła od 120 nW do 200 nW. Do każdej komórki intensywność światła wzbudzenia była dobierana indywidualnie. 68 Rozdział 7. Materiały i Metody Czas pomiaru jest bardzo newralgicznym elementem w całym pomiarze. Patrząc z jednej strony na problem należałoby prowadzić pomiar długo, aby zarejestrować na tyle długi pomiar fluktuacji fluorescencji, aby krzywa autokorelacji zawierała jak najmniejsze szumy. Z drugiej strony komórka w czasie pomiaru może na tyle się przesunąć, że miejsce, w którym dokonywano pierwotnie pomiar przesunie się poza objętość detekcji. Jednym z takich newralgicznych wyzwań był pomiar FCS w ognisku XRCC1. Wywołane ogniska białka XRCC1 charakteryzowały się bardzo małymi rozmiarami i często obserwowane były zmiany w ich położeniu. Stąd bardzo często wymykały się z objętości detekcji w czasie pomiaru. Rozwiązaniem było zastosowanie krótkich pomiarów - około 10 sekundowych. W przypadku pomiarów w nieuszkodzonej chromatynie można było pozwolić sobie na dłuższe pomiary - około 20s do nawet 30 s. Pomiary mobilności białek naprawczych tworzących ogniska pomiary FCS przeprowadzano krótko - około 10s. Obawiano się, że w trakcie dłuższego pomiaru ognisko mogłoby się przesunąć poza obszar detekcji. Ograniczenie czasu pomiaru spowodowane było możliwym ruchem całej komórki, a także całkowitą dawką energii, jaka przez taki czas była dostarczana do komórki. W trakcie ustalania parametrów rejestracji zwracano uwagę na stan komórek przed jak i po doświadczeniu tzn. czy morfologia nie wskazuje na uszkodzenia lub stres (np. przez pojawienie się blebów). Blaknięcie. Nieuniknionym zjawiskiem towarzyszącym obrazowaniu mikroskopowemu, a tym bardziej pomiarom FCS, jest fotoblaknięcie sygnału fluorescencji. Starano się jak najbardziej ograniczyć jego wpływ na pomiar. W przypadku kiedy w zarejestrowanym pomiarze fluktuacji średni poziom fluorescencji spadał o więcej niż 15 - 20% wartości początkowej, pomiar odrzucano. W najlepszym przypadku wykres wartości intensywności fluorescencji uśredniony po całym pomiarze powinien być linią prostą równoległą do osi czasu. W doświadczeniach z użyciem białka eGFP-XRCC1 i w pomiarach FCS w nukleoplazmie można było zaobserwować także wzrost intensywności w czasie pomiaru. Było to skutkiem zachodzącej już w trakcie pomiaru odpowiedzi komórki na ekspozycję na światło wzbudzające - akumulacji białka XRCC1 z metką eGFP w miejscu jednoniciowego uszkodzenia DNA. Dlatego w tym celu konieczne było zastosowanie innej metki fluorescencyjnej - mRFP i zachowanie linii 488nm jako czynnika wywołującego uszkodzenie DNA, ale już nie powodującego blaknięcia fluoroforu. 69 Materiały i Metody Rozdział 7. Rycina 7.5. Weryfikacja generowania widocznej akumulacji białka HP1 wywołanej pomiarem FCS. Dla każdej izoformy białka HP1 diagram przedstawia obrazy dwóch przykładowych jąder komórkowych zarejestrowane przed i zaraz po pomiarze FCS. Strzałka pokazuje miejsce prowadzenia pomiaru. Po pomiarze FCS nie widać znaczącego wzrostu fluorescencji. Skala: 5 fim. Nie prowadzono długotrwałych obserwacji stanu komórek po pomiarach FCS. W każdej komórce przeprowadzono jeden pomiar FCS składający się z kilku powtórzeń w jednym miejscu. Dla pomiarów w cytoplazmie było to dziesięć powtórzeń po trzydzieści sekund, wewnątrz jądra od sześciu do dziesięciu powtórzeń po dwadzieścia sekund, a w miejscu gdzie nastąpiło nagromadzenie się białka naprawczego - od 6 do 8 powtórzeń po dziesięć sekund. W przypadku pomiarów w jądrze komórkowym odrzucano z góry pierwsze pomiary z serii, bo najczęściej tu pojawiał się efekt fotoblaknięcia. Średni poziom fluorescencji pomiędzy pomiarami spadał. 70 Rozdział 7. Materiały i Metody 7.2.8.4. Pomiar mobilności HP1 w komórce metodą FCS Do pomiarów wybierano komórki z jak najmniejszym poziomem ekspresji białka fuzyjnego. Zabieg ten miał na celu ograniczenie średniej liczby cząsteczek przebywających w objętości detekcji. Z tego powodu niemożliwe było rozpoznanie, czy pomiar wykonywano w obszarze hetero- lub euchromatyny. Dzięki zastosowaniu światła przechodzącego można było rozpoznać jedynie lokalizację jąderek wewnątrz jądra komórkowego. W pomiarach mobilności białek eGFP-HP1a oraz eGFP-HP1ß w nukleoplazmie rejestrowano obraz rozkładu białka z wybranej płaszczyzny jądra, a następnie prowadzono pomiar FCS w jednym miej scu w cyklu sześciu powtórzeń po 30 s dla HP1a lub 40 s dla HP1ß. W pomiarach mobilności eGFP-HPly procedura była identyczna jak w pomiarach dla eGFP -HP1a z tym wyjątkiem, że w jednej komórce wykonywano analogiczny pomiar w trzech różnych miejscach. 7.2.8.4.I. Pomiar mobilności eGFP -HP1ß w ognisku naprawczym metodą FCS Do lokalnego uszkodzenia DNA poprzez naświetlanie używano linii 470nm (linia lasera impulsowego - 40 MHz). Przed pomiarami dokonywano pomiaru intensywności światła na wyjściu z obiektywu, a następnie wyliczano czas naświetlania potrzebny, aby dostarczyć 1mJ energii. Po upływie około 5 min pojawiało się wyraźne ognisko eGFP- HP1ß w miejscu, gdzie wcześniej zaparkowano wiązkę lasera. W tym miejscu prowadzono pomiar FCS według następującego schematu: rejestracja obrazu z płaszczyzny zawierającej ognisko białka HP1ß, pomiar FCS w miejscu ogniska - 6 powtórzeń w tym samym miejscu po 40 sekund każde. Rozmiar ogniska był na tyle duży, że nie obawiano się, że w trakcie pomiaru ognisko przesunie się poza obszar objętości pomiarowej FCS. 71 Materiały i Metody Rozdział 7. Rycina 7.6. Obrazy rozmieszczenia eGFP-HP1 w kolejnych etapach doświadczenia z pomiarem FCS w miejscu jego gromadzenia. Obraz z wybranej komórki z ekspresją eGFP-HP1 ß przed zogniskowaniem wiązki w celu wywołania uszkodzenia, następnie po około 5 min widać akumulację białka w miejscu uszkodzenia. Ostatni rząd to obraz jądra po pomiarze FCS. Skala: 5 fim. 7.2.8.5. Pomiar mobilności XRCC1 metodą FCS W pomiarach wybierano komórki, w których poziom ekspresji białka fuzyjnego był ledwo dostrzegalny przy pomocy fotopowielaczy z ustawionym maksymalnie dostępnym napięciem. Wybór taki był podyktowany ograniczeniem średniej liczby cząsteczek białka fuzyjnego występujących w objętości detekcji. Do pomiarów mobilności białka XRCC1 typu dzikiego wykorzystano dwa dostępne w laboratorium białka fuzyjne - GFP-XRCC1 oraz mRFP-XRCC1. Powtórzenie pomiarów z wykorzystaniem dwóch różnych fluoroforów miało na celu sprawdzenie wpływu rodzaju metki na uzyskane wyniki analizy mobilności białka XRCC1 w komórce. Z kolei w pomiarach FCS białka XRCC1 z wprowadzonymi mutacjami korzystano z konstruktów zawierających metkę mRFP. 72 Rozdział 7. Materiały i Metody Pomiary mobilności w nukleoplazmie przeprowadzono według następującej procedury. Do pomiarów wybierano komórki z odpowiednio niskim poziomem ekspresji białka fuzyjnego. W pierwszej kolejności rejestrowano obraz z wybranej płaszczyzny konfokalnej jądra komórkowego. Następnie wykonywano właściwy pomiar FCS. W wybranym punkcie w jądrze parkowano wiązkę lasera na okres 20 s, gdy korzystano z układu zawierającego mRFP, lub 10 s gdy badany układ zawierał eGFP. Skrócenie czasu pomiaru w przypadku eGFP było podyktowane możliwym blaknięciem metki fluorecencyjnej w czasie pomiaru FCS, co bezpośrednio wpłynęłoby na analizę. Z tego też powodu zdecydowano się skrócić czas pomiaru, ale także zmniejszyć intensywność światła wzbudzenia na tyle, aby ograniczyć efekt fotoblaknięcia. Na końcu rejestrowano obraz po pomiarze z tej samej płaszczyzny. Porównanie obrazu przed i po pomiarze FCS umożliwiało sprawdzenie dwóch kwestii: czy sam pomiar FCS powoduje na tyle liczne uszkodzenia DNA, że jego efektem byłaby widoczna akumulacja białka XRCC1, oraz czy zaparkowanie wiązki lasera spowodowało fotoblaknięcie fluoroforu (Rycina 7.8). W miejscu akumulacji XRCC1 (tu ognisko naprawy DNA) w jądrze komórkowym procedura przeprowadzania pomiaru wyglądała analogicznie jak w przypadku z kilkoma modyfikacjami. Gromadzące się białko XRCC1 tworzy małe ognisko (średnica pojedynczego ogniska wynosi do około 1 |im), które wykazuje się relatywnie dużą ruchliwością. Mając te dwa czynniki na uwadze uznano, że prowadzenie pomiarów FCS w cyklu 6 powtórzeń po 10 sekund będzie wówczas optymalne. Oczywiście w czasie jednego cyklu ognisko bardzo często przemieszczało się poza obszar detekcji, a także czasem do niego wracało. W takim przypadku pomiar fluktuacji fluorescencji był odrzucany i nie był włączany do dalszej analizy. 73 Materiały i Metody Rozdział 7. Rycina 7.7. Przykładowe pomiary średnicy ognisk XRCC1 w układach z obiema metkami fluorescencyjnymi (eGFP i mRFP). Dokonano je z przybliżeniem przy użyciu wbudowanego narzędzia w programie LAS AF. Obrazy przedstawione obok, są danymi oryginalnymi, w żaden sposób nie modyfikowano ich na potrzeby tej ryciny. Zwraca uwagę niski poziom „tła” - czyli białka fuzyjnego w nukleoplazmie. 74 Rozdział 7. Materiały i Metody Rycina 7.8. Wpływ światła wzbudzającego używanego w czasie pomiaru FCS na fluorofor i chromatynę. Obrazy znakowanego białka XRCC1 przy użyciu dwóch różnych metek fluorescencyjnych (eGFP lub mRFP) w nukleoplazmie oraz w ognisku naprawy przed i po pomiarze FCS. Białe strzałki wskazują miejsce prowadzenia pomiaru FCS. W pomiarach w nukleoplazmie w obu przypadkach (eGFP -XRCC1 oraz mRFP-XRCC1) ledwo dostrzegalny jest obszar wyblaknięty przez światło wzbudzające oraz nie obserwowano gromadzenia się znakowanego białka XRCC1, które świadczyłoby o wywołaniu uszkodzeń DNA. Pomiar FCS powoduje także nieznacznie zmniejszenie intensywności fluorescencji z obszaru ogniska naprawy. Należy zauważyć, że na zmianę kształtu i intensywności fluorescencji ogniska może także wpłynąć jego ruch w osi OZ, jakkolwiek wpływ ten może być niewielki ze względu na wydłużony w kierunku osi OZ kształt obszaru detekcji. Skala: 5 fim. 75 Materiały i Metody Rozdział 7. 7.2.9. Analiza danych z pomiarów FCS Dane uzyskane z przeprowadzonych pomiarów były analizowane niezależnie od siebie. Powodem takiego postepowania było to, że każda seria pomiarowa miała własny zestaw pomiarów kalibracyjnych wykonywanych zaraz po kalibracji mikroskopu. Analiza danych składała się z następujących punktów. 1. Analiza wykresów przedstawiających fluktuację fluorescencji w czasie. Jeśli średni poziom fluorescencji w czasie pomiaru znacząco wzrósł lub spadł (o około 15-20%), dany pomiar był odrzucany z dalszej analizy. Ponadto zawsze usuwano pierwszy pomiar z serii powtórzeń jakie wykonywano w jednym miejscu (efekt fotoblaknięcia najczęściej tu był widoczny). 2. Dla każdego pomiaru fluktuacji fluorescencji przeprowadzono analizę korelacji wedle równania: (SFi(t)*SF2(t + r)) (T) (Fi(t))- (F2(t)) gdzie: (F1(t)) - oznacza średnią wartość intensywności fluorescencji w czasie pomiaru rejestrowaną przez pierwszy detektor, (F2(t)) - oznacza średnią wartość intensywności fluorescencji w czasie pomiaru rejestrowaną przez drugi detektor. Ogólnie: 5F(t) = F(t) — (F(t)) - oznacza fluktuację intensywności fluorescencji w danym czasie od średniej wartości. 3. Do uzyskanych krzywych autokorelacji dopasowano model anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem dwóch składowych. Podczas dopasowywania modelu do krzywej jedynie parametr k (parametr charakteryzujący kształt objętości detekcji) był już znany z wcześniejszej kalibracji. Analizę przeprowadzano przy użyciu programu Fluctuation Analyzer 4G (Wachsmuth et al., 2015). .< 2 r / \ an-1 „ / \a.\-\-1/2 Gkl()= ^[1 — 0T + 8reXp{—-^)}'^f,^1 + (^^^j ^ ^ gdzie: N - liczba cząsteczek; 0T - populacja cząsteczek w stanie trypletowym, 76 Rozdział 7. Materiały i Metody tt - czas życia fluorescencji cząsteczek tej populacji; f - pierwsza, szybsza populacja; td,1 — korelacyjny czas dyfuzji pierwszej populacji; a1 - anomalność pierwszej populacji; f2 = 1 - f1 - druga, wolniejsza subpopulacja; td,1 korelacyjny czas dyfuzji dla drugiej subpopulacji; a1 - anomalność drugiej populacji; k - parametr opisujący kształt objętości detekcji. 4. Stopień dopasowania modelu do funkcji autokorelacji determinował czy uzyskany zestaw parametrów modelu będzie uwzględniany w kolejnym etapie analizy. Miarą dopasowania był współczynnik R2. Próg wartości dopasowania, poniżej którego dane były odrzucane był różny. Dla zestawu danych, gdzie funkcje autokorelacji nie wykazywały dużych szumów, próg dla R2 wynosił 0.9 lub 0.97. Gdy zarys przejścia funkcji autokorelacji był dalej widoczny, ale w zakresie krótkich czasów korelacji funkcja wykazywała większe szumy, próg zadawalającego dopasowania obniżono do 0.7 lub 0.8. Szum występujący na krzywej auto-cross korelacyjnej w zakresie krótkich czasów korelacyjnych pociągał za sobą spadek dopasowania modelu do krzywej. Nie miało to istotnego wpływu na prowadzoną analizę ponieważ istotny fragment dopasowania znajdował się w zakresie dłuższych czasów, gdzie spodziewano się obserwować przegięcie krzywej, a model dość dobrze dopasowywał się do krzywej. 5. Dla każdego pomiaru, który spełnił wcześniejsze kryteria (stabilny w czasie średni poziom fluorescencji sygnału, dobra jakość dopasowania modelu do krzywej) wyznaczano współczynniki dyfuzji na podstawie kolejnych korelacyjnych czasów dyfuzji wedle równania: o^^—.ńkLf3 4 • n • Ti V k ) Następnie każdą z wybranych funkcji autokorelacji normalizowano i w takim zbiorze przeprowadzono uśrednienie w celu otrzymania reprezentatywnej funkcji autokorelacji. Dokładny opis analizy danych został przedstawiony w rozdziale Wyniki 8.1. 77 Materiały i Metody Rozdział 7. 7.2.9.1. Testy statystyczne w analizie porównawczej modeli FCS Przy dopasowywaniu modeli do krzywych FCS należy wiedzieć lub mieć uzasadnione przypuszczenie co do rodzaju ruchu będącego przedmiotem badań. Jest to kluczowa decyzja rzutująca na wybór modelu, którego parametry zostaną użyte w opisie badanego zjawiska. Często spotykane pytanie na tym etapie analizy, to czy bardziej skomplikowany model, z większą liczbą parametrów może lepiej reprezentować charakter badanej krzywej. Aby odpowiedzieć na to pytanie stosuje się testy statystyczne porównujące modele. Zazwyczaj bardziej skomplikowane modele lepiej są dopasowywane do danych eksperymentalnych jednak dzięki testom można sprawdzić czy wykorzystanie mniej rozbudowanego modelu jest wystarczające w opisie. W prowadzonej analizie porównawczej pomiędzy użytymi modelami anomalnej dyfuzji użyłem F-Testu, kryterium informacyjnego Akaikego (AIC - od ang. Akaike Information Criterion) oraz Bayesowskiego kryterium informacyjnego Schwartza (BIC - od ang. Bayesian Information Criterion). F-Test - służy do porównywania modeli o różnej liczbie predyktorów (stopni swobody). Zakłada się tu porównywanie modeli zagnieżdżonych (”nested”) tzn. jeden z nich jest uproszczoną wersją drugiego). Podstawowe pytanie zadawane w analizie to czy dodanie parametrów do modelu statystycznie poprawia jego dopasowanie2. AIC oraz BIC są to najpowszechniej wykorzystywane metody porównywania modeli dla zmiennej zależnej. AIC nie wymaga zagnieżdżenia dwóch modeli, a BIC jest jego zmodyfikowaną wersją. Na ogół model o większej liczbie predyktorów daje dokładniejsze przewidywania. Do przeprowadzenia powyższych testów posłużyłem się programem OriginPro, gdzie są one wbudowanymi narzędziami3. 2 źródło: http://www.fcsxpert.com/classroom/analysis/choose_model.html 3 źródło: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/PostFit-CompareFitFunc 78 Rozdział 8. Wyniki Rozdział 8. Wyniki 8.1. Program do półautomatycznej zbiorczej analizy pomiarów FCS Analiza danych jest jednym z kluczowych, ale również najbardziej czasochłonnych etapów w doświadczeniach z wykorzystaniem techniki FCS. Aby uzyskać wartości parametrów odzwierciedlające rzeczywistą mobilność znakowanego białka należy pomiary FCS powtórzyć w jak największej liczbie komórek. Przeprowadzenie pomiarów w wielu komórkach, a następnie ich analizy statystycznej, pozwala lepiej oszacować parametry dynamiki cząsteczek w komórce przy równoczesnym ograniczeniu wpływu skrajnych odczytów. Program SymPhoTime (program obsługujący rejestrację sygnału) pozwala na interaktywną analizę pojedynczych pomiarów - tworzenie krzywej autokorelacji, wybór modeli, zakresów dopasowania i zapisywanie wyników. Niestety posiada on kilka niedoskonałości, które spowodowały, że nie korzystano z niego w czasie analizy danych z pomiarów w komórkach. Przede wszystkim, nie jest on przystosowany do zbiorczej, automatycznej analizy grup pomiarów, w trakcie tworzenie funkcji autokorelacji nie można uwzględnić poprawek na blaknięcie fluoroforu czy spadek poziomu intensywności sygnału, a także nie jest możliwe użycie w nim modelu anomalnej dyfuzji, którego implementacja w analizie była w tej pracy kluczowa. W związku z tym konieczne było opracowanie własnego sposobu analizy, w którym można byłoby w sposób zautomatyzowany wyznaczać współczynniki dyfuzji postulowanych subpopulacji nie tylko z pojedynczej krzywej, ale także z całego ich zestawu. W ramach opisanych w tej rozprawie badań napisano program specjalnie przeznaczony do analizowania dużej liczby krzywych autokorelacyjnych. Opracowany przez autora tej rozprawy sposób analizy danych wykorzystuje program Fluctuation Analyzer 4G, rozwijany przez grupę prof. Rippe z Heidelbergu (Wachsmuth et al., 2015). Umożliwia on uwzględnienie korekty na blaknięcie fluoroforu w czasie pomiaru, wyznaczanie krzywej autokorelacji dla każdego pomiaru z zadanego zbioru oraz dopasowania wybranego modelu anomalnej dyfuzji. Zapisywane pliki wynikowe są następnie 79 Wyniki Rozdział 8. wykorzystywane przez autorskie skrypty (napisane w języku Python 2.7) do przeprowadzenia analizy statystycznej. Wybranymi możliwościami programu napisanego na potrzeby tego projektu badawczego jest tworzenie średniej krzywej autokorelacji będącej reprezentantem danej puli pomiarów oraz automatyczne przeliczanie czasów korelacyjnych na współczynniki dyfuzji. W analizie zastosowano szereg filtrów, które sprawdzają jakość pomiaru oraz późniejszego dopasowania. W przypadku niespełnienia choćby jednego z postawionych warunków wybrany pomiar jest odrzucany i nie jest uwzględniany w dalszej analizie. W pierwszej kolejności pomiary sprawdzane są pod kątem stabilności fluktuacji fluorescencji w czasie pomiaru, co zostanie dokładnie omówione poniżej. Zasada działania algorytmu W pierwszej kolejności analizowane są dane z pomiarów kalibracyjnych. Dokonywano w nich rejestracji fluktuacji fluorescencji odpowiedniego barwnika kalibracyjnego (np. Atto488) w wodzie. Dobór barwnika kalibracyjnego uzależniony był od rodzaju metki fluorescencyjnej wykorzystywanej w doświadczeniach, tak aby widma wzbudzenia jak i emisji w jak największym zakresie się pokrywały. Przykładowo, dla pomiarów mobilności białka fuzyjnego eGFP-HP1ß w kalibracji użyto wodnego roztworu barwnika Atto488. Każdy pomiar analizowany był indywidualnie. Uzyskanie krzywej, a następnie dopasowanie modelu prowadzono krok po kroku, cały czas monitorując kolejne kroki analizy. W ten sposób zwracano szczególną uwagę na to, czy nie występują niespodziewane anomalie zaburzające pomiar, które na etapie kalibracji są widoczne i łatwe do wychwycenia. W analizie wykorzystano program SymPhoTime (PicoQuant) - domyślny program zarządzający mikroskopem podczas pomiarów. Do uzyskanej krzywej autokorelacji dopasowywano model opisujący dyfuzję prostą z uwzględnieniem istnienia subpopulacji trypletowej ponieważ cząsteczki barwnika Atto po wzbudzeniu mogą poprzez przejście interkombinacyjne (konwersja międzysystemowa) przejść w stan trypletowy. Na podstawie uzyskanych wyników z dopasowania modelu oceniano jakość i poprawność ustawienia mikroskopu (ten fragment bardziej szczegółowo opisano w rozdziale Metody: Pomiar FCS). Kluczową informacją jaką uzyskiwano na tym etapie to wartość parametru k - opisującego stosunek efektywnego promienia ogniskowania wiązki wzbudzającej fluorescencję wzdłuż osi optycznej przy natężeniu światła 1/e2 do promienia lateralnego, prostopadłego do osi optycznej, także na wysokości 1/e2. Powyższe wartości charakteryzują obszar detekcji sygnału. Parametr ten zostaje zapisany 80 Rozdział 8. Wyniki 81 w wewnętrznej bazie danych opracowanego programu. Kluczem w późniejszym wyszukiwaniu jest nazwa barwnika oraz data przeprowadzenia pomiaru. Jest to zabieg ułatwiający i przyśpieszający analizę. Pozwala w trakcie analizy puli danych z różnych dni oraz dla różnych białek fluorescencyjnych zawsze korzystać z właściwych wyników pomiarów kalibracyjnych. 1. Kolejnym etapem jest analiza „właściwego” zbioru danych - czyli rodziny zarejestrowanych fluktuacji fluorescencji danego białka fluorescencyjnego, dla którego oszacowanie dynamiki jest celem doświadczenia. W pierwszej kolejności ocenie były poddawane zarejestrowane fluktuacje fluorescencji. Jeśli obserwowany był wyraźny spadek (blaknięcie fluoroforu) lub znaczący wzrost (gwałtowne napłynięcie wielu molekuł barwnika) lokalnego średniego poziomu fluorescencji, taki pomiar nie był uwzględniany w dalszej analizie. Stosowane kryterium miało postać: F* — F 2 — — <0.2 gdzie: F1- początkowy średni odczyt poziomu fluorescencji (pierwsze Fi dwie sekundy pomiaru), F2 - końcowy średni odczyt poziomu fluorescencji (ostatnie dwie sekundy pomiaru). Pomiary nie spełniające powyższego kryterium były odrzucane z dalszej analizy. Kryterium to zostało zoptymalizowane metodą prób i błędów. 2. Zbiór wyselekcjonowanych pomiarów następnie był importowany do programu Fluctuation Analyzer 4G (Wachsmuth et al., 2015). Na tym etapie ponownie sprawdzano jakość pomiarów fluktuacji fluorescencji w czasie. Zdarzało się, że w czasie trwania pomiaru na chwilę średni poziom fluorescencji gwałtownie wzrastał po czym spadał do wcześniejszego poziomu. Takie krzywe także były odrzucane ze zbioru przeznaczonego do analizy. Wahania zmierzonego poziomu sygnału mogły być spowodowane nagłym wahaniem napięcia w sieci elektrycznej. 3. Przy użyciu programu w pierwszej kolejności tworzone były krzywe autokorelacji. W tym kroku przy użyciu programu uwzględniano korekcje na średni poziom sygnału rejestrowanego przez detektory z obszarów poza komórką (odczyty na detektorach - SPAD1: ~1000 zliczeń na sekundę; SPAD2: ~1200 zliczeń na sekundę) oraz na potencjalne fotoblaknięcie fluoroforu w czasie pomiaru. Autokorelacji poddawany był sygnał zarejestrowany przez oba detektory (sygnał fluorescencji był rozdzielany do detektorów w stosunku 1:1). Zabieg skorelowania sygnału pomiędzy detektorami pozwalał w bardzo prosty sposób usunąć z krzywej autokorelacji wpływ tzw. Wyniki Rozdział 8. „afterpulsingu”, a także szumu detektorów. Stochastyczny charakter sygnału szumu powoduje, że w trakcie korelowania sygnału pomiędzy detektorami szumy nie dają przyczynku do otrzymanej krzywej autokorelacji. 4. Przy tworzeniu krzywej autokorelacji program uwzględnia poprawki na średni poziom szumu oraz możliwe niewielkie fotoblaknięcie w czasie pomiaru. 5. Następnie do każdej krzywej autokorelacji zostaje dopasowane równanie opisujące dynamikę układu dla anomalnej dwuskładowej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Jedyny parametr z równania modelu, który na tym etapie jest już znany i nie podlega dopasowaniu to k, którego wartość jest znana z pomiarów kalibracyjnych. Zakłada się tutaj, że jego wartość nie uległa zmianie pomimo użycia innego szkiełka nakrywkowego (pomiar kalibracyjny prowadzony jest na jednym szkiełku, a pomiar właściwy jest prowadzony na innym szkiełku, na którym rosną komórki). Z tego powodu istotny jest dokładny pomiar grubości szkiełek, aby w procesie kalibracji, a także w pomiarach na komórkach, używać szkiełek o jak najbardziej zbliżonej grubości. 6. Dane wyjściowe z programu Fluctuation Analyzer 4G obejmowały zbiór plików, w którym każdy zawierał komplet wyników analizy dla pojedynczego pomiaru (krzywą autokorelacji, dopasowanie modelu do tej krzywej, a także zestaw wartości tego dopasowania). Uzyskany zestaw danych stanowił pliki wsadowe do kolejnego programu stworzonego w języku Python 2.7. w ramach tego projektu badawczego. 7. Dane wczytywane przez ten program były wykorzystywane do stworzenia listy obiektów. Każdy obiekt zawiera w sobie informacje na temat jednego pomiaru FCS. Są to serie punktów opisujące relacje G od r oraz G(fit) uzyskane w czasie dopasowania modelu od r. Każdy obiekt zawierał w sobie także komplet parametrów uzyskanych z dopasowania, a także miary dopasowania w teście R kwadrat oraz Chi kwadrat. 8. Lista obiektów następnie była poddawana pierwszemu filtrowi oceniającemu miarę dopasowania modelu do krzywej. Próg był ustawiany na poziomie 0.8, 0.9 a czasem 0.95. Dla obiektów nie spełniających warunku ustawiana była flaga na wartość False (flaga jest to wewnętrzny parametr obiektu, który w tym przypadku może przyjmować jedną z dwóch możliwych wartości logicznych: True albo False. Tylko wartość równa True pozwala uwzględnić daną krzywą w dalszej analizie). 82 Rozdział 8. Wyniki 9. Dla wyznaczonych z wcześniejszego dopasowania czasów korelacyjnych (t1 oraz T2) obliczane były automatycznie wartości współczynników dyfuzji. W tym celu program pobierał dane kalibracyjne z wewnętrznej bazy danych odpowiednie dla danego dnia pomiarowego i dla danego barwnika fluorescencyjnego. 10. Po wyznaczeniu współczynników dyfuzji dla wszystkich możliwych na tym etapie krzywych odrzucano 10% skrajnych wyników. Miało to na celu zmniejszenie wpływu jednego lub kilku pomiarów, w których uzyskane wartości parametrów dynamiki mogą znacząco różnić się od pozostałych (np. ze względu na przejściowe szumy elektroniczne), przez co mogą znacząco wpłynąć na średnia wartość, a także zwiększyć wartość szacowanej niepewności. 11. W ostatnim etapie z pozostałych obiektów wyznaczana była średnia krzywa autokorelacji, a także wyznaczane były średnie wartości kolejnych parametrów dopasowania, jak również ich przedziały niepewności wyznaczone jako odchylenie standardowe z populacji. 8.2. Pomiary ruchliwości białka mRFP-XRCC1wt w komórce przy użyciu techniki FLIP Aby wstępnie zbadać dynamikę białka XRCC1 w komórce wykorzystano technikę FLIP. W doświadczeniach użyto białka XRCC1 z metką fluorescencyjną mRFP. Wybór techniki oraz tej metki nie był przypadkowy. W pomiarach dynamiki białek z metkami fluorescencyjnymi z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej bardziej popularna jest metoda FRAP. Jest ona dokładniejsza, a także pozwala z większą precyzją oszacować współczynnik dyfuzji badanego fluoroforu. Niestety, w doświadczeniach FRAP użycie dużej dawki światła w celu gwałtownego wyblaknięcia sondy fluorescencyjnej w wybranym obszarze jądra mogłoby spowodować także powstanie wielu uszkodzeń DNA - SSB oraz DSB. Natychmiast wywołałoby to odpowiedź komórki poprzez uruchomienie procesu gromadzenia białek naprawczych, włączając XRCC1, w tym regionie. W związku z tym w pomiarze FRAP obserwowany byłby powrót fluorescencji nie tylko z powodu swobodnego ruchu cząsteczek białka XRCC1 wewnątrz komórki, ale także z powodu gromadzenia się białka w odpowiedzi na wywołane uszkodzenie. W metodzie FLIP obserwacji podlega obszar jądra, w którym nie jest indukowane blaknięcie. Pozwala to założyć, że spadek fluorescencji z tego obszaru spowodowany jest tylko poprzez swobodne odpływanie białka z aktywną metką fluorescencyjną 83 Wyniki Rozdział 8. (niewyblakniętą) na drodze dyfuzji. W każdej analizie danych z pomiarów FLIP uwzględniono poprawki na tło (obszar poza komórką), a także na spadek fluorescencji wynikający z fotoblaknięcia towarzyszącego rejestrowaniu kolejnych obrazów. Jako metkę fluorescencyj ną dla białka XRCC1 wybrano mRFP, jednak wcześniej podjęto także próby z wykorzystaniem układu eGFP-XRCC1. Powodował on problemy w analizie i interpretacji zaburzając istotnie układ (dane nie pokazane). Zastosowanie intensywnego światła o długości fali 488nm do wywołania gromadzenia się znakowanego XRCC1 w miejscu naświetlania powodowało znaczące blakniecie znakowanego białka eGFP-XRCC1 w tym obszarze jądra. Aby zminimalizować wpływ procesu lokalnego uszkadzania na blaknięcie znakowanego białka zdecydowano się na zastosowanie innej metki fluorescencyjnej - w tym wypadku mRFP. Przy intensywnym naświetlaniu światłem lasera o długości fali 488 nm w procesie generowania uszkodzenia DNA prawie niedostrzegalny był proces fotoblaknięcia fluoroforu (światło o długości fali 488nm bardzo niewydajnie wzbudza białko mRFP). 8.2.1. Ruchliwość metki fluorescencyjnej mRFP w jądrze komórkowym Pomiar dynamiki białka XRCC1 w żywej komórce, przy użyciu technik mikroskopii konfokalnej, wymaga przyłączenia do niego metki fluorescencyjnej. Aby oszacować czy przyłączenie metki fluorescencyjnej istotnie wpływa na dynamikę znakowanego białka XRCC1 w jądrze komórkowym przeprowadzono najpierw pomiary ruchliwości samej metki fluorescencyjnej (mRFP), a następnie białka fuzyjnego, metodą FLIP. Komórki HeLa zostały poddane transfekcji przejściowej. Doświadczenia przeprowadzono po upływie 36 godzin od transfekcji. Dane przeanalizowano wedle protokołu omówionego w rozdziale 7.2. Metody. Na krzywej widoczny jest gwałtowny spadek fluorescencji w trakcie pierwszych sekund od momentu rozpoczęcia doświadczenia. Obserwacja ta jest zgodna z założeniem, że białko mRFP nie oddziałuje ze składnikami jądra komórkowego i porusza się szybko. Po upływie 100 sekund sygnał fluktuuje na poziomie 5 - 7% wartości początkowej. Oznacza to, że prawie cała mobilna pula cząsteczek mRFP została wyblaknięta. W celu dokładniejszej interpretacji zarejestrowanej krzywej przeprowadzono analizę mającą na celu dopasowanie prostego modelu zaniku eksponencjalnego. Funkcja była dopasowywana do krzywej zaniku uśrednionej po całym zbiorze znormalizowanych 84 Rozdział 8. Wyniki krzywych. W analizie uwzględniono początkowe 200 s pomiaru. Po upływie tego czasu odczyt fluorescencji fluktuował na poziomie 5% co traktowano jako błąd systematyczny. Połowiczny czas zaniku dla modelu 1ExpDec (zanik jednoeksponencjalny) wynosił 25 s, gdy dla modelu 2ExpDec (zanik dwueksponencjalny) czasy wynosiły kolejno 6,85 s oraz 56,68 s, przy czym stosunek wagowy między nimi to 0,54 do 0,46. Dla porządku przeprowadzono weryfikację istotności statystycznej poprawności dopasowania modelu 2ExpDec w stosunku do modelu 1ExpDec. Przy użyciu testu dla wariancji (F-test) dla poziomu ufności 0.05 model ExpDec2 istotnie lepiej opisuje badaną zależność. Pomimo, że założono brak specyficznego oddziaływania mRFP z otoczeniem, dopasowanie modelu matematycznego sugeruje istnienie dwóch subpopulacji. Możliwym wyjaśnieniem jest występowanie w jądrze komórkowym przedziałów o różnym stopniu gęstości chromatyny. Według zaproponowanego modelu (Cremer et al., 2015) w jądrze występują dwa rodzaje obszarów sprzężonych ze sobą różniących się gęstością DNA - aktywnej i nieaktywnej transkrypcyjnie chromatyny. Nieaktywna chromatyna wchodzi w skład rdzeni domen chromatyny (z ang. chromatin domain clusters), natomiast aktywna transkrypcyjnie chromatyna zlokalizowana jest w przestrzeniach miedzy domenami (z ang. interchromatin compartment) oraz na powierzchni domen chromatyny (z ang. perichromatin region). W skali czasowej pomiaru FLIP takie przedziały w dystrybucji chromatyny mogą powodować różnice w ruchliwości nie oddziałujących z chromatyną cząsteczek białka fluorescencyjnego. 85 Wyniki Rozdział 8. Rycina 8.1. Pomiar FLIP swobodnej metki mRFP w jądrze komórkowym. A - Obraz przedstawia różnorodność w poziomach ekspresji białka fluorescencyjnego w komórkach prowadzonej hodowli. Białe strzałki wskazują przykłady komórek, w których prowadzono pomiary FLIP; B - To samo pole widzenia w świetle przechodzącym; C - krzywa zaniku fluorescencji (krzywa FLIP) 86 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.2. Krzywa FLIP dla swobodnej metki mRFP w jądrze komórkowym wraz z dopasowaniem modeli. A - Dopasowanie obu modeli do danych pomiarowych: Model ExpDecl - zanik jedno- eksponencjalny (czerwony), Model ExpDec2 - zanik dwueksponencjalny (niebieski). W celu lepszego pokazania dopasowania modeli do krzywej zaniku wykres ograniczono tylko do pierwszych 200s; B - tabela przedstawiająca wartości parametrów odnoszących się do obu modeli. 8.2.2. Ruchliwość mRFP-XRCC1wt w jądrze komórkowym badana metodą FLIP W celu oszacowania dynamiki białka XRCC1 w nukleoplazmie wykonano pomiary FLIP. Pomiary oraz analizę przeprowadzono wedle opisu zamieszczonego w rozdziale Metody 7.2.7. Ilustracja A z Ryciny 8.3 poglądowo pokazuje liczbę i lokalizację obszarów jakie zostały uwzględnione w analizie. Obszary, które poddano analizie to kolejno: ROI1 - miejsce gromadzenia się białka XRCC1 w odpowiedzi na uszkodzenie, oraz obszary ROI2 i ROI3 zlokalizowane w nukleoplazmie, w różnej odległości od miejsca akumulacji XRCC1. ROI4 i ROI5 to obszary, na podstawie których została uwzględniona poprawka kolejno na blaknięcie spowodowane rejestrowaniem obrazów oraz sygnał tła. Aby przekonać się, czy na kształt krzywej zaniku fluorescencji wpływ ma także odległość badanego miejsca od obszaru blaknięcia sporządzono krzywe zaniku fluorescencji kolejno dla obszarów ROI2 i ROI3 (Rycina 8.3.B). Przedstawione wykresy są średnimi z 15 pomiarów. Po uwzględnieniu poprawek nie zauważono istotnych różnic w tempie spadku fluorescencji. Kolejnym krokiem było porównanie wyników pomiarów dla białka fluorescencyjnego mRFP oraz znakowanego XRCC1 z metką mRFP (Rycina 8.3.C). Oba wykresy zostały znormalizowane osobno. W przypadku mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie 87 Wyniki Rozdział 8. także zaobserwowano początkowy szybki spadek fluorescencji. Był on gwałtowny, ale powodował jedynie spadek fluorescencji o około 30%. Potem następował bardzo powolny spadek intensywności fluorescencji. Istotne jest, że nawet po upływie około 13 minut od rozpoczęcia doświadczenia dalej zauważalny był wciąż powolny spadek fluorescencji. W doświadczeniach obserwowano spadek do 30% początkowej wartości intensywności, co wskazuje, że proces wymiany XRCC1 w nukleoplazmie zachodził powoli. Możliwy jest scenariusz, w którym białko to krótko oddziałuje z chromatyną, po czym oddysocjowuje. Do krzywej zaniku fluorescencji dla obszaru ROI2 dopasowano proste równanie zaniku eksponencjalnego zawierającego dwie składowe. Czas połowicznego zaniku dla pierwszej składowej to 33 s, dla drugiej wolniejszej subpopulacji czas ten wynosi 12431 s. Do krzywej dopasowano także model zawierający trzy składowe, jednak nie polepszył on znacząco dopasowania. W analizie wariancji (F- test) przy poziomie ufności 0,05 model dwueksponencjalny wystarczająco dobrze opisuje omawianą zależność. Uzyskane wyniki wskazują na istnienie dwóch subpopulacji białka XRCC1 w nukleoplazmie. Pierwszą z nich z krótkim czasem połowicznego zaniku można utożsamiać z pulą cząsteczek swobodnie poruszającą się w obrębie jądra komórkowego. Druga subpopulacja, której charakterystyczny czas zaniku jest o wiele dłuższy, może opisywać te cząsteczki, które poprzez miejsca wiązania wiążą się do chromatyny. 88 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.3. Badanie ruchliwości białka mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie metodą FLIP. A - zaznaczone obszary jądra uwzględnione w analizie. ROI1-obszar ogniska naprawy DNA z wyznakowanym XRCC1; ROI2 i ROI3 obszary w jądrze poza ogniskiem XRCC1 lub obszarem naświetlania. ROI4 - obszar w jądrze sąsiednim - uwzględniany w poprawce na blaknięcie spowodowane rejestracją obrazów. ROI5 - tło; B - wykresy spadku fluorescencji dla ROI2 i ROI3 - obszarów w nukleoplazmie w różnej odległości od obszaru blaknięcia; C - porównanie spadku fluorescencji dla mRFP-XRCC1 i niezwiązanego RFP w nukleoplazmie. Wykresy osobno znormalizowane; D - spadek fluorescencji dla obszaru ROI3 z dopasowanym modelem dwueksponencjalnego zaniku. 89 Wyniki Rozdział 8. 8.2.3. Ruchliwość mRFP-XRCC1wt w ognisku naprawy DNA Kolejnym etapem opisu dynamiki XRCC1 w nukleoplazmie było oszacowanie jego ruchliwości w ognisku naprawy. Akumulację taką można wywołać poprzez zogniskowanie wiązki lasera w wybranym miejscu w jądrze komórkowym na odpowiedni czas (punktowe wywoływania uszkodzeń zostało szczegółowo opisane w rozdziale Metody). W tym przypadku wykorzystano światło laserowe o długości fali 488 nm, a czas naświetlania był dostosowany tak, aby dostarczyć 90 |iJ energii w wybrane miejsce. Procedura przeprowadzenia pomiaru FLIP i jego analiza zostały szczegółowo omówione w rozdziałach Metod 7.2.6. i 7.2.7. niniejszej pracy. Z powodu możliwego przemieszczania się ogniska mRFP-XRCC1 w czasie pomiaru FLIP obszar analizy obejmował ognisko oraz nieduży obszar wokół niego. Dzięki temu zabiegowi ograniczono możliwość przesunięcia się ogniska naprawy poza obszar detekcji w płaszczyźnie obrazowania. Nie przeprowadzono korekcji na możliwy ruch ogniska w płaszczyźnie XZ. Do krzywej zaniku fluorescencji dla obszaru z ogniskiem XRCC1 dopasowano model dwueksponencjalnego zaniku fluorescencji. Czas połowicznego zaniku dla pierwszej postulowanej w modelu subpopulacji wynosił 61 s, a dla drugiej wolniejszej ten czas wynosił 442 s. Wyniki wskazują na istnienie co najmniej dwóch subpopulacji. Pierwszą utożsamiać można z cząsteczkami swobodnie poruszającymi się w obszarze jądra, natomiast druga, której czas charakterystyczny jest kilkakrotnie dłuższy, z subpopulacją wiążącą się do chromatyny. 90 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.4. Krzywa FLIP dla mRFP-XRCC1 w ognisku naprawy. A: Zaznaczone obszary uwzględnione w analizie. ROI1-obszar ogniska XRCC1; ROI2 i ROI3 obszary w jądrze poza ogniskiem XRCC1 lub obszarem naświetlania. ROI4 - obszar w jądrze sąsiednim - uwzględniany w poprawce na blaknięcie spowodowane rejestrowaniem kolejnych obrazów. ROI5 - tło; B - uśredniona krzywa zaniku fluorescencji dla obszaru zawierającego ognisko mRFP-XRCC1. Krzywe z pojedynczych pomiarów najpierw zostały znormalizowane, a potem uśrednione. Słupki błędu na wykresie to odchylenie standardowe; C - zestawienie krzywych zaniku fluorescencji dla wolnej metki fluorescencyjnej mRFP w nukleoplazmie i białka mRFP - XRCC1 w obszarze zawierającym ognisko naprawcze XRCC1; D - dopasowanie modelu zaniku dwueksponencjalnego do krzywej zaniku fluorescencji dla obszaru zawierającego ognisko mRFP-XRCC1. 91 Wyniki Rozdział 8. 8.3. Pomiary mobilności wolnych metek fluorescencyjnych w jądrze komórkowym metodą FCS W przeprowadzonych doświadczeniach użyto białek fuzyjnych, w których białko, którego dynamika była przedmiotem badań, było połączone z odpowiednią metką fluorescencyjną. Jest to zabieg powszechnie stosowany w pomiarach FCS w żywych komórkach. W celu określenia wpływu metki fluorescencyjnej na dynamikę białka fuzyjnego niezbędne było sprawdzenie mobilności samego białka fluorescencyjnego w komórce. Założono, że samo białko fluorescencyjne znacząco nie oddziałuje z organellami, innymi strukturami i składnikami komórki i taką samą metką na innych cząsteczkach białek fuzyjnych, a jedynymi czynnikami wpływającymi na jego dyfuzję są jego wielkość oraz zagęszczenie molekularne otoczenia (Minton, 1992). 8.3.1. Mobilność wolnego monomeru eGFP w nukleoplazmie W pomiarach dynamiki białek HP1 wykorzystano białko eGFP jako metkę fluorescencyjną. Aby sprawdzić czy dynamika białka fuzyjnego eGFP-HP1 będzie się znacząco różniła od dynamiki samego HP1 przeprowadzono pomiar FCS samej metki fluorescencyjnej wewnątrz jądra komórkowego. W tym celu wykorzystano linię komórkową Hela z przejściową ekspresją wolnego białka eGFP. Oprócz pomiarów w nukleoplazmie przeprowadzono także pomiary w cytoplazmie w celu kontrolnego porównania mobilności badanej metki fluorescencyjnej (Rycina 8.5.B). Do uzyskanych krzywych autokorelacyjnych dopasowano model anomalnej dyfuzji. W pierwszej kolejności model zakładał istnienie tylko jednej populacji eGFP, a następnie użyto modelu postulującego istnienie dwóch subpopulacji. Tabela z Ryciny 8.5 przedstawia wartości średnie wybranych parametrów z modeli ze zbioru krzywych, które były przedmiotem analizy. Dla wybranych pojedynczych krzywych FCS z obszaru nukleoplazmy i cytoplazmy na Rycinie 8.6.C przedstawiono porównanie dopasowania obu modeli. W celu sprawdzenia czy jednoskładowy model jest wystarczający do opisu mobilności białka eGFP w obu częściach protoplazmy przeprowadzono test statystyczny dla wybranych pojedynczych krzywych FCS (Rycina 8.5.D). Wyniki wskazują, że zarówno w cytoplazmie, jak i w nukleoplazmie, zastosowanie modelu dwuskładowego nie wpływa istotnie statystycznie na jakość dopasowania. Uzyskane średnie krzywe FCS dla obu pomiarów przedstawia Rycina 8.5.E. Kształt krzywych w całym zakresie jest podobny, co oznacza, że nie występują wyraźne różnice w dyfuzji wolnej metki 92 Rozdział 8. Wyniki fluorescencyjnej eGFP w obrębie całej komórki (cytoplazmy i nukleoplazmy). Można zatem wnioskować, że (zgodnie z przypuszczeniem) w cytoplazmie nie ma miejsc wiązania dla eGFP, które mogły by znacząco wpłynąć na jego mobilność w obszarze jądra komórkowego bądź cytoplazmy. 93 Wyniki Rozdział 8. 94 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.5. Mobilność swobodnej metki eGFP w jądrze komórkowym mierzona metodą FCS. A - Obraz komórek z przejściową ekspresją białka eGFP, spośród których wybierano komórki do pomiarów FCS. Komórki charakteryzują się różnymi poziomami ekspresji wolnego białka fluorescencyjnego; B - Wybrane komórki, w których prowadzone były pomiary FCS (białe strzałki wskazują miejsce, gdzie zogniskowana była wiązka lasera w nukleoplazmie i cytoplazmie); C - Wyniki dopasowania modeli do krzywych FCS z pomiarów w cytoplazmie i nukleoplazmie. Pierwszy model to anomalna dyfuzja zakładająca istnienie jednej populacji, drugi model jest analogiczny do pierwszego, ale postuluje dwie subpopulacje. Oba modele uwzględniają istnienie subpopulacji trypletowej metki fluorescencyjnej; D - Zestawienie dopasowania modeli jedno- i dwuskładowych do wybranych, pojedynczych krzywych w cytoplazmie i w nukleoplazmie; E - Znormalizowane krzywe FCS swobodnego eGFP w nukleoplazmie i cytoplazmie uśrednione po wcześniej wyselekcjonowanym zbiorze pomiarów. 95 Wyniki Rozdział 8. 8.3.2. Mobilność wolnego monomeru RFP w nukleoplazmie W celu oszacowania dynamiki wolnej metki fluorescencyjnej mRFP w jądrze komórkowym przeprowadzono przejściową transfekcję plazmidem kodującym to białko. Po upływie około 36 h zarejestrowano obrazy mikroskopowe i przeprowadzono pomiary FCS. Sposób obrazowania, prowadzenia pomiaru FCS, a także analiza danych zostały szczegółowo omówione w rozdziale Metody (rozdziały 7.2.6., 7.2.7.). Przejściowa ekspresja doprowadziła do różnych poziomów w ekspresji białka z metką fluorescencyjną wśród całej populacji komórek na szkiełku. Do pomiarów FCS wybierano komórki, w których poziom fluorescencji pochodzącej od białka z metką był ledwo dostrzegalny na obrazach zarejestrowanych przy użyciu fotopowielaczy, z wykorzystaniem największego wzmocnienia. Zabieg ten powodował, że w objętości detekcji w pomiarach FCS znajdowała się równocześnie mała liczba cząsteczek (74±27) co było niezbędne dla przeprowadzenie poprawnego pomiaru. Wyniki modelu dla mRFP w jądrze komórkowym Di [^m2 /s] 31,73 ± 2,98 °i 1,10 ± 0,08 fi 0,93 ± 0,08 D2 [^m2 /s] 1,20 ± 0,19 a2 0,83 ± 0,01 f2 0,07 ± 0,08 89,56 ± 16,96 R2 0,82 ± 0,05 Rycina 8.6. Mobilność swobodnej metki mRFP w jądrze komórkowym zmierzona metodą FCS. A - Rozkład intensywności fluorescencji pomiędzy komórkami (przejściowa ekspresja). Do pomiarów wybierano komórki z bardzo niskim poziomem ekspresji białka fuzyjnego (białe strzałki); B,C,D - przykładowe obrazy jąder komórkowych, w których prowadzono pomiary FCS. Skala: 5 jum; E - krzywa FCS dla swobodnego mRFP; F - wyniki dopasowania modelu do krzywej FCS w nukleoplazmie. 96 Rozdział 8. Wyniki Pomimo, że w analizie użyto dwuskładowego modelu, parametr f wskazuje, że znacząca większość cząsteczek należy do subpopulacji, której cząsteczki dyfundują szybciej. Współczynnik dyfuzji dla tej subpopulacji wynosi 31,7 ± 3.0 |im2/s. Wartość współczynnika f2 drugiej subpopulacji wraz z oszacowaną dla niej niepewnością jest na tyle niska, że pod względem mobilności można uznać populację cząsteczek znakowanego białka za jednorodną. Wysoka wartość współczynnika a może wskazywać, że ruch omawianego białka jest swobodny. Nieznacznie wyższą wartość od 1 tego współczynnika można traktować jako błąd dopasowania. Wartość wyraźnie wyższa od 1 wskazywałaby na ruch wspomagany lub kierunkowy, rodzaj superdyfuzji, który w komórce dla wolnej metki fluorescencyjnej nie powinien być obserwowany. Uzyskany wynik zgodny jest z wartością współczynnika dyfuzji uzyskanego dla monomeru białka RFP przy użyciu techniki FRAP przez grupę profesora Rippe (D = 31 ± 7 |im2/s) (Baum et al., 2014). Uzyskane w opisanych tu badaniach wyniki wskazują, że wolne białko mRFP porusza się szybko w obrębie jądra komórkowego, a jego ruch można nawet opisać równaniem dyfuzji prostej z jedną składową. Uzyskane wyniki wskazują zatem na brak miejsc wiązania dla metki mRFP w jądrze komórkowym. 8.4. Mobilność mRFP-XRCC1wt w jądrze komórkowym metodą FCS Białko XRCC1 jest zaangażowane w szlaki naprawy BER i SSB. Między innymi w naszym laboratorium wykazano bardzo gwałtowną rekrutację XRCC1 do miejsca uszkodzenia DNA, gdzie tworzy wyraźne ognisko o wysokiej intensywności (Solarczyk et al., 2016). Oznacza to, że w miejscu naprawy DNA gromadzi się wiele cząsteczek XRCC1. Nie wiemy czy wszystkie cząsteczki białka XRRC1 w ognisku są bezpośrednio zaangażowane w proces naprawy. W tym celu dokonano pomiarów FCS zarówno w nukleoplazmie, jak i w ognisku naprawy DNA. Aby sprawdzić, czy posiadane miejsca fosforylacji białka XRCC1 oraz jego domeny BRCT1 oraz BRCT2 wpływają na mobilność skorzystano z wybranych wariantów białka, które zawierały odpowiednią mutację. Dla XRRC1 typu dzikiego (bez mutacji) oraz wybranych jego mutantów wykonano pomiary FCS zarówno w nukleoplazmie, jak i w miejscu akumulacji XRCC1 po indukcji pęknięcia nici DNA. 97 Wyniki Rozdział 8. 8.4.1. Mobilność znakowanego białka XRCC1 typu dzikiego 8.4.1.1. Mobilność mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie W pomiarach mobilności białka XRCC1 typu dzikiego wykorzystano dwa białka fuzyjne XRCC1. Zawierały one jako metkę fluorescencyjną eGFP lub mRFP. Podobnie jak w przypadku HP1 w pierwszym eksperymencie zastosowano konstrukty z różnymi metkami, aby przekonać się czy czynniki takie jak wydajność wzbudzenia fluorochromu, zoptymalizowanie ustawienia optyki mikroskopu pod różne znaczniki fluorescencyjne, inna wydajność fluorescencji przy różnej długości fali światła wzbudzenia, oraz zakres widma światła rejestrowanego przez detektor mogą wpłynąć na uzyskane wyniki. 8.4.1.1.1. Mobilność mRFP-XRCC1 (znakowanego białka typu dzikiego) w nukleoplazmie Pomiary mobilności białka XRCC1 z metką fluorescencyjną zostały wykonane w komórkach linii HeLa z przejściową ekspresją białka fuzyjnego. Zabieg ten umożliwił uzyskanie szerokiej różnorodności w ilości znakowanego białka w komórkach, w tym komórek wykazujących niski poziom ekspresji białka fuzyjnego (Rycina 8.8. A). Do pomiarów mobilności wybierano komórki z relatywnie niskim poziomem ekspresji białka (Rycina 8.8.A, czerwone strzałki) co umożliwiało i ułatwiało przeprowadzenie doświadczenia (wyjaśnienie w rozdziale Metody 7.2.9.10.). Ze względu na kluczowe znaczenie wyników dla mRFP-XRCC1 (znakowanego białka typu dzikiego) eksperymenty na nim wykonano podczas każdej sesji pomiarowej. Był to rodzaj wewnętrznej kontroli w kolejnych doświadczeniach. Do przeprowadzenia doświadczeń FCS, w ramach kalibracji mikroskopu, konieczna była tymczasowa zmiana konfiguracji filtrów i ustawienia światłowodów. Proces ten, jak i przywrócenie ustawień po wcześniejszych pomiarach FCS, zajmowały kilka godzin. Konieczne było zatem przeprowadzenie właściwych doświadczeń w seriach trwających po 4-5 dni. Pomiary mobilności mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie prowadzono podczas trzech niezależnych serii pomiarowych. Rycina poniżej przedstawia uśrednione krzywe dla każdego z pomiarów, a w tabeli znajduje się zestawienie wybranych parametrów dopasowania modelu do każdej krzywej z osobna (Rycina 8.8.C). Ponadto w celu porównania przeprowadzono także pomiary mobilności białka mRFP-XRCC1 w cytoplazmie. Krzywe autokorelacji dla nukleoplazmy mają podobny kształt oraz czasy retencji (średni czas przebywania cząsteczki w objętości detekcji). Powtarzalność 98 Rozdział 8. Wyniki uzyskanych wyników podczas różnych sesji pomiarowych świadczy o ich istotności. Krzywe na wykresie mogą się nieznacznie różnić miedzy sobą. Jest to spowodowane tym, że za każdym razem wyznaczona była inna objętość detekcji z pomiarów kalibracyjnych, przez co średni czas przebywania molekuły w objętości detekcji mógł się różnić. Ostatnia kolumna tabeli przedstawia wartości średnie kolejnych parametrów z dwuskładowego modelu anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Wyznaczone one zostały jako średnie ważone, gdzie wagami były odwrotności kwadratów niepewności (błędów) w kolejnych dniach. Stosunek pomiędzy postulowanymi subpopulacjami we wszystkich pomiarach jest bardzo podobny i wynosi średnio 3:2. Średni współczynnik dyfuzji szybkiej subpopulacji wyniósł D1nukleo = 6,10±0,69 |im2/s , a dla wolnej subpopulacji D2nukleo = 0,35±0,04 ^m2/s. Możliwe, że wolniejsza subpopulacja odpowiada tej puli cząsteczek, które poruszając się w obrębie jądra komórkowego oddziałują z innymi składnikami znajdującymi się w otoczeniu, przez co poruszają się wolniej. Wysoka wartości pierwszego współczynnika dyfuzji D1cytop = 31,87±5,96 |im2/s świadczy o braku oddziaływania tego białka ze składnikami cytoplazmy. Natomiast stosunek między populacjami 3:2 świadczy jednak o istnieniu dwóch subpopulacji. Może to oznaczać, że w obszarze cytoplazmy można wyróżnić obszary o różnym stopniu zagęszczenia molekularnego i przeszkód hamujących dyfuzję, w tym rejony zawierające retikulum śródplazmatyczne, w którym białko XRCC1 mogłoby poruszać się wolniej, co odpowiadałoby wyznaczonemu współczynnikowi dyfuzji dla drugiej subpopulacji - D2cytop = 0,95±0,31 |im2/s. Ponadto przeprowadzono dopasowanie analogicznego modelu jak wcześniej, lecz rozbudowanego do trzech składowych. W celu zmniejszenia liczby parametrów, które należy dopasować założono, że parametry charakteryzujące tryplet są stałe, a ich wartości można zaczerpnąć z wyników dopasowania modelu dwuskładowego. Zatem liczba cząsteczek w stanie trypletowym, jak i jego czas trwania w wynikach dopasowania obu modeli, powinny być takie same. Dla wybranych losowo krzywych przeprowadzono test mający na celu sprawdzenie, czy zastosowanie trzech składowych w modelu polepszy znacząco dopasowanie do krzywej autokorelacji. Rycina poniżej przedstawia przykładowe zestawienie obu modeli do wybranej krzywej oraz tabele przedstawiające wyniki porównania modeli według trzech niezależnych kryteriów (T-Test, Bayesowskie kryterium informacyjne oraz Akaike’a kryterium informacyjne). Uzyskane rezultaty są 99 Wyniki Rozdział 8. zgodne. Zastosowanie trójskładowego modelu nie poprawia znacząco dopasowania modelu do krzywej FCS (Rycina 8.7). Rycina 8.7. Porównanie dopasowania modelu dwu- i trójskładowego do krzywej FCS dla mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie. Wykres A pokazuje dopasowanie obu modeli do przykładowej krzywej FCS dla mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie. Tabela B przedstawia wyniki z przeprowadzonych trzech analiz porównujących miarę dopasowania. Według każdego kryterium (Bayesa, Akaike i F-testu) modelem wystarczającym do opisu mobilności znakowanego białka XRCC1 w nukleoplazmie jest model dwuskładowy. 100 Rozdział 8. Wyniki 101 Wyniki Rozdział 8. Rycina 8.8. Mobilność mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie oraz w cytoplazmie badana metodą FCS. A - Obraz pokazujący różne poziomy ekspresji po przejściowej transfekcji w komórkach HeLa (kanał fluorescencyjny oraz światła przechodzącego). Czerwone strzałki wskazują jądra, które zostały wybrane do pomiarów; B - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP-XRCC1 - obrazy zostały zarejestrowane przed i po pomiarze FCS. Strzałki pokazują miejsce prowadzenia pomiaru. Po pomiarze FCS nie zaobserwowano widocznej akumulacji białka, co wskazuje, że sam pomiar FCS nie powoduje uszkodzenia DNA; C - Diagram przestawia krzywe autokorelacji dla białka mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie oraz w cytoplazmie. Przedstawione krzywe to średnie ze wszystkich pomiarów, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości jeden; D - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie oraz, dla porównania, także w cytoplazmie. Pomiary w nukleoplazmie przeprowadzono trzykrotnie. Zakresy niepewności zostały wyznaczone jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Ostatnia kolumna przedstawia średnie ważone kolejnych parametrów, gdzie wagami była odwrotność kwadratów odpowiednich niepewności. Skala: 5 fim. 8. 4.1.1.2. Mobilność eGFP-XRCC1 (znakowanego białka typu dzikiego) w nukleoplazmie W celu sprawdzenia, czy pomiar dynamiki białka XRCC1 połączonego z metką fluorescencyjną zależy od rodzaju tejże metki, wykonano pomiary nie tylko z metką mRFP (opisane powyżej), ale i z metką eGFP. Jest to układ o wiele trudniejszy technicznie do przeprowadzania doświadczeń FCS niż mRFP-XRCC1. W tym przypadku do wzbudzania metki fluorescencyjnej należy używać światła o zdecydowanie mniejszej intensywności, przede wszystkim dlatego, aby sam pomiar nie generował uszkodzenia DNA ani nie powodował widocznego fotoblaknięcia fluoroforu, co zaburzyłoby układ, który jest obiektem badań (Rycina 8.9.A). W pomiarach eGFP-XRCC1 użyto światła laserowego o długości fali 488 nm, które także wykorzystywane było do generowania uszkodzenia DNA. Gdyby do uszkodzenia DNA doszło, to wpływ na krzywą FCS miałby nie tylko stochastyczny ruch znakowanych cząsteczek XRCC1, ale także ruch wywołany na skutek ich gromadzenia w miejscu prowadzenia pomiaru FCS. Ciekawe jest, że pod koniec przebiegu krzywej autokorelacji (od 10 ms do 100 ms) widać nieduże zaburzenie (Rycina 8.9.B). Może ono sugerować, że ruch w obszarze pomiaru nie zawsze był losowy jeśli chodzi o kierunek, lub że był to ruch obiektu większego niż białko XRCC1. Gdyby zarejestrowane fluktuacje fluorescencji pochodziły wyłącznie od cząsteczek znakowanego białka poruszającego się stochastycznie, uzyskana krzywa autokorelacji nie powinna zawierać takich zaburzeń w przedziale czasu t od 10 ms do 100 ms. Nie zaobserwowano ich w pomiarach w nukleoplazmie dla układu mRFP-XRCC1. Innym możliwym wyjaśnieniem powstałego efektu jest zarejestrowanie pewnego periodycznego 102 Rozdział 8. Wyniki szumu, aczkolwiek na przebiegach fluktuacji fluorescencji nie zaobserwowano niczego co by wskazywało na poparcie tej hipotezy. Uzyskane parametry z dopasowania tego samego modelu dają bardzo podobne wartości. Parametr f1 wynosi 0,67±0,17. Także oba współczynniki dyfuzji dla subpopulacji szybszej i wolniejszej są bardzo podobne do wyników uzyskanych dla pomiarów układu mRFP-XRCC1 (D1 = 6,11±1,55 ^m2/s i D2 = 0,32±0,13 ^m2/s) (Rycina 8.9.C). Uzyskane wyniki dowodzą, że rodzaj metki fluorescencyjnej (eGFP lub mRFP) nie wpływa znacząco na mierzoną mobilność znakowanego białka XRCC1 w jądrze komórkowym. Pierwszą postulowaną subpopulację utożsamić można ze swobodnie poruszającą się subpopulacją cząsteczek XRCC1, natomiast drugą z subpopulacją cząsteczek oddziałujących z chromatyną. Przed pomiarem FCS Po pomiarze FCS eGFP-XRCCl w nukleoplazmie Dj [urn2 /s] 6,11 ± 1,55 Ol 1,02 ± 0,13 fi 0,67 ± 0,17 D2[nm2 /s] 0,32 ± 0,13 “2 0,88 ± 0,03 f2 0,33 ± 0,17 132 ± 48 R2 0,74 ± 0,11 Rycina 8.9. Mobilność eGFP-XRCC1 w nukleoplazmie oraz w cytoplazmie badana metodą FCS. A - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją eGFP-XRCC1 zarejestrowane przed i po pomiarze FCS. Strzałki pokazują miejsce prowadzenia pomiaru; B - Diagram przestawia krzywe autokorelacji dla białka eGFP-XRCC1 w nukleoplazmie. Przedstawiona krzywa to średnia po wszystkich pomiarach, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości jeden; C - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskane na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie. Niepewności zostały wyznaczone jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Skala: 5 fim. 103 Wyniki Rozdział 8. 8.4.1.2. Mobilność mRFP-XRRC1 (znakowanego białka typu dzikiego) w ognisku naprawy Ognisko mRFP-XRCC1 pojawiało się przeważnie bezpośrednio po skończeniu naświetlania światłem o długości fali 488 nm (około 5-6 sekund naświetlania w celu dostarczenia 90 |iJ energii). Stosunkowo mały rozmiar ogniska i jego przemieszczania powodowały trudności z przeprowadzeniem pomiarów. W pomiarach zastosowano 6 powtórzeń po 10 sekund każde. Często podczas pierwszego pomiaru widoczne było wyraźne blaknięcie powodujące, że pomiar był odrzucany z analizy. Z kolei losowo zdarzało się, że dla ostatniego pomiaru następował gwałtowny spadek fluorescencji, co wskazywało, że ognisko przesunęło się poza obszar detekcji. Aby sprawdzić przesunięcie ogniska naprawy w stosunku do centrum obszaru pomiaru FCS, po jego zakończeniu rejestrowano obraz konfokalny jądra badanej komórki. W przypadku kiedy ognisko naprawy przesunęło się poza obszar detekcji pomiar taki był odrzucany z dalszej analizy. W trakcie analizy krzywych autokorelacji dla ogniska XRCC1 zauważono, że w części krzywych pod koniec ich przebiegu pojawia się dziwna struktura (niespodziewana oscylacja, sinusoida). Ponieważ do takiej krzywej jest bardzo trudno uzyskać dobre dopasowanie (parametr R2 jest bardzo niski) odrzucano je i nie były uwzględniane w dalszej analizie. Uznano je jednak za interesującą obserwację, zwłaszcza że w rejestracji fluktuacji fluorescencji nie obserwowano periodycznego szumu. Ich występowanie oraz możliwe znaczenie omówiono w ostatnim rozdziale Wyników. Wykres zamieszczony na poniższym rysunku pokazuje jak bardzo krzywe z oscylacjami mogą wpłynąć na tworzenie uśrednionej krzywej. W tabeli poniżej (Tabela 8.11.C) zamieszczono wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji z dwiema składowymi z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej wyłącznie dla krzywych nie zawierających tej anomalii na krzywej autokorelacji. Krzywe z widoczną anomalią stanowiły około od 10% do 30% rejestrowanych krzywych i odnotowywano je w każdym powtórzeniu doświadczenia. Z puli danych obu doświadczeń odrzucano krzywe zawierające ww. oscylacje. Według modelu w ognisku postulowane jest istnienie dwóch subpopulacji, które różnią się mobilnością prawie dwudziestokrotnie (D1nukleo/ D2nukleo -19,18). Stosunek ilości cząsteczek przynależnych do pierwszej, szybszej subpopulacji względem drugiej, wolniejszej wynosi 2,6:1 (f1/f2). Współczynnik a wskazuje pewną anomalność w mobilności (subdyfuzją) co może wskazywać, w połączeniu z niską wartością współczynnika dyfuzji (D2 = 0,17±0,03 ^m2/s), że subpopulacja ta jest związana z DNA, 104 Rozdział 8. Wyniki zatem może być zaangażowana w proces naprawy DNA. Uzyskana wartość współczynnika dyfuzji jest mniejsza od wartości współczynnika dyfuzji wyznaczonego dla histonu H2B-eGFP, który związany jest z chromatyną (D2H2B'eGFP = 0,34±0,09 |im2/s). Pomiar FCS znakowanego H2B pełniącego rolę potencjalnego markera chromatyny zostanie przedyskutowany szerzej w rozdziale Wyniki 8.6., ale teraz w celu porównania mobilności drugiej subpopulacji XRCC1 z dynamiką chromatyną przytoczono wybraną wartość. W celu sprawdzenia czy możliwe jest występowanie trzech subpopulacji badanego białka w nukleoplazmie przeprowadzono dopasowanie trójskładowego modelu do uzyskanych krzywych. Dla wybranych losowo krzywych, wykonano analizę porównawczą dopasowania obu modeli: dwu- i trójskładowego. Uzyskane wyniki F-testu, Bayesowskie kryterium informacyjnego oraz kryterium informacyjnego Akaikego nie wskazują jednomyślnie na istotne polepszenie dopasowania modelu trójskładowego. Preferowany model według F-testu wskazuje na trójskładowy model, jednak dwa pozostałe kryteria rekomendują jako wystarczający model dwuskładowy. Z tego powodu uznano, że dwuskładowy model jest wystarczający do opisu mobilności białka XRCC1 w miejscu jego akumulacji. Rycina 8.10. Porównanie dopasowania modelu dwu- i trójskładowego do krzywej FCS dla mRFP-XRCC1 w ognisku naprawy DNA. Wykres A pokazuje dopasowanie obu modeli do przykładowej krzywej FCS dla mRFP-XRCC1 w ognisku naprawy DNA. Tabela B przedstawia wyniki z przeprowadzonych trzech analiz porównujących stopień dopasowania. Według dwóch z trzech kryteriów modelem wystarczającym do opisu mobilności znakowanego białka XRCC1 w nukleoplazmie jest model dwuskładowy. 105 Wyniki Rozdział 8. ü mRFP-XRCClwt w ognisku naprawczym Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 średnia Di[|im2/s] 3,34 ± 0,40 2,90 ± 0,82 3,26 ± 0,36 Oil 1,02 ± 0,11 1,03 ± 0,16 1,02 ± 0,09 fi 0,65 ± 0,16 0,77 ± 0,14 0,72 i ± 0,10 Dz [pim2 /s] 0,17 ± 0,04 0,17 ± 0,05 0,17 ± 0,03 «2 0,85 ± 0,04 0,86 ± 0,47 0,85 ± 0,04 h 0,35 ± 0,16 0,23 ± 0,14 0,28| ± 0,11 135 ± 51 165 ± 105 141 ± 46 R2 0,88 ± 0,05 0,78 ± 0,09 0,86 ± 0,04 106 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.11. Mobilność mRFP-XRCC1 w ognisku naprawy DNA badana metodą FCS. A - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP-XRCC1 zarejestrowane przed oraz po naświetleniu światłem o długości fali 488 nm, czego skutkiem jest uszkodzenie DNA oraz akumulacja białka w tym miejscu. Ostatni obraz w rzędzie pokazuje stan ogniska po wykonanym pomiarze FCS. Strzałki pokazują miejsce prowadzenia pomiaru; B - krzywe autokorelacji dla białka mRFP-XRCC1 w ognisku naprawczym z oraz bez uwzględnienia części krzywych zawierających oscylacje. Przedstawione krzywe to średnie po wszystkich pomiarach, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1; C - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie dla dwóch niezależnych doświadczeń. Przedziały niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Ostatnia kolumna przedstawia średnie ważone kolejnych parametrów, gdzie wagami były odwrotności kwadratów odpowiednich niepewności. Skala:5 fim. 107 Wyniki Rozdział 8. 8.4.2. Mobilność mRFP-XRCC1P537STOP w nukleoplazmie Badanie wpływu domeny BRCT2 zlokalizowanej na C-końcu na mobilność białka XRCC1 w nukleoplazmie było możliwe dzięki stworzeniu plazmidu kodującego mutant delecyjny nie zawierający tej domeny. Jest to białko mniejsze o 96 aminokwasów i znacznie lżejsze od natywnego białka XRCC1 (Mczwt = 69,48 kDa, MczP537Stop = 58,18 kDa). Brak tej domeny zaburza funkcjonalność białka, czego objawem jest brak jego gromadzenia w miejscu uszkodzenia DNA, co wykazała w swojej pracy doktorskiej Magdalena Kordon (Kordon, 2017) oraz opisała w publikacji (Kordon et al., 2018). W prowadzonych doświadczeniach nie obserwowano akumulacji tego białka w miejscu naświetlania wiązką lasera o długości fali 488 nm. Pomiary mobilności tego mutanta przeprowadzono podczas dwóch niezależnych sesji doświadczeń (wykonane w dwóch różnych miesiącach). Średnie krzywe autokorelacji (znormalizowane), a także średnie wyniki dopasowania zestawiono na Rycinie 8.12 F i G. Krzywa uzyskana na podstawie pomiarów z pierwszego doświadczenia charakteryzuje się dużymi szumami, co odzwierciedlone jest w rozmiarze niepewności uzyskanych parametrów z dopasowania modelu. Może to sugerować, że jednak pomiary rejestracji fluktuacji fluorescencji mogły być dobrane nieoptymalnie lub kalibracja mikroskopu nie była optymalna. Parametr N reprezentujący średnią liczbę cząsteczek białka XRCC1 z metką w obrębie objętości detekcji dla pomiarów z doświadczenia 1 jest ponad dwukrotnie wyższy niż dla pomiarów z doświadczenia 2. Większa liczba cząsteczek powoduje zmniejszenie amplitudy krzywej oraz, poprzez mniejsze fluktuacje fluorescencji od średniego jej poziomu, pogarsza jakość uzyskanej krzywej autokorelacji. Współczynniki dyfuzji dla pierwszej subpopulacji bardzo dobrze pokrywają się ze sobą (D1 = 11,1 ± 4,5 |im2/s oraz D1 = 11,8 ± 1,8 |im2/s). Rozważając dalej tylko wyniki z drugiego doświadczenia, gdzie uzyskana krzywa jest lepszej jakości, stosunek ilościowy subpopulacji szybszej do subpopulacji wolnej wynosi 3,54:1. Współczynnik subpopulacji szybkiej wynosi D2 = 11,8 ± 1,8 |im2/s , a z kolei subpopulacji wolnej D2 = 0,7 ± 0,1^m2/s. Ruch pierwszej subpopulacji można opisać jak ruch podobny do dyfuzji prostej, z kolei druga jest pewnego rodzaju subdyfuzją (a2<1). Uzyskane wartości współczynników dyfuzji dla znakowanego mutanta XRCC1P537STOP są około dwa razy wyższe niż w przypadku znakowanego białka XRCC1 typu dzikiego. Może to wskazywać, na zaburzenie oddziaływania zmutowanego XRCC1 z innymi składnikami jądra komórkowego, przez co mierzona mobilność znakowanego białka jest większa. 108 Rozdział 8. Wyniki mRFP-XRCCl P537STOP Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Średnia Di [nm2/s] 11,10 ± 4,53 11,78 ± 1,80 11,69 ± 1,68 Oti 0,92 ± 0,02 1,03 ± 0,09 0,93 + 0,02 fi 0,53 ± 0,25 0,78 ± 0,08 0,76 + 0,08 D2[nm2/s] 0,35 ± 0,11 0,71 ± 0,11 0,54 ± 0,08 a2 0,91 ± 0,08 0,88 ± 0,06 0,89 ± 0,05 f2 0,47 ± 0,25 0,22 ± 0,08 0,24 ± 0,08 268 ± 138 114 ± 21 117 ± 21 R2 0,46 ± 0,06 0,86 ± 0,03 0,78 ± 0,03 Rycina 8.12. Mobilność mRFP-XRCC1P537STOP w nukleoplazmie. A - Różne poziomy ekspresji białka fuzyjnego w komórkach; B,C,D,E - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP-XRCC1P537STOP. Strzałki pokazują miejsca prowadzenia pomiaru; F - Średnie krzywe autokorelacji dla mRFP-XRCC1537STOP w nukleoplazmie dla dwóch niezależnych doświadczeń. Przedstawione krzywe to średnie po wszystkich pomiarach, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1; G - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowań do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie dla każdej z serii doświadczeń (przedziały niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji) oraz średnią ważoną, gdzie wagami była odwrotność kwadratów odpowiednich niepewności. Skala:5 um. 109 Wyniki Rozdział 8. 8.4.3. Mobilność mRFP-XRCC1L360R w nukleoplazmie W celu sprawdzenia wpływu domeny BRCT1 białka XRCC1 na jego mobilność w nukleoplazmie przeprowadzono pomiary FCS z wykorzystaniem mutanta tego białka, w którym lizyna w pozycji 360 została zastąpiona argininą. Podmiana aminokwasu w tym miejscu prowadzi do nieprawidłowego zwinięcia domeny i przez to do jej dezaktywacji (Kubota & Horiuchi, 2003). Dysfunkcja tej domeny powoduje zaburzenie gromadzenia się białka XRCC1 w miejscu uszkodzenia DNA. Zjawisko to zostało już opisane przez panią dr M. Kordon (Kordon, 2017). Rycina 8.13.A pokazuje przykładowe przekroje przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją białka mRFP-XRCC1L360R w hodowli komórkowej po około 36 h od transfekcji. Pomiary dynamiki tego białka wykonano trzykrotnie podczas niezależnych sesji doświadczeń. Tabela, jak i diagram, przedstawiają średnie funkcje autokorelacji po normalizacji oraz wyniki dopasowania modelu do poszczególnych zestawów danych. Średnie krzywe FCS nieznaczenie się między sobą różnią. Potencjalny wpływ na tę różnicę mogła mieć inna kalibracja mikroskopu (inna objętość detekcji) albo inny stosunek odczytów sygnału w obu detektorach (poprzez zastosowanie filtra neutralnego powinien wynosić 1:1). Na podstawie dopasowania modelu także tu można stwierdzić istnienie dwóch subpopulacji mutanta białka XRCC1L360R. Średni współczynnik dyfuzji dla szybszej subpopulacji wynosi D1 = 4,38 ± 0,45 |im2/s, a dla wolniejszej D2 = 0,27 ± 0,03 |im2/s. Oznacza to, że białko to dyfunduje wolniej od znakowanego białka typu dzikiego. Współczynniki a powyżej 0,9 i poniżej 1 sugerują, że najprawdopodobniej występuje tu dyfuzja normalna, a jej anomalność, o ile istnieje, jest szczątkowa. Odnotować należy, że w pomiarach z drugiego doświadczenia zaobserwowano pojawienie się oscylacji na krzywych FCS, które w pomiarach z doświadczenia pierwszego i trzeciego nie były widoczne. Niska wartość uzyskanych współczynników dyfuzji dla zmutowanego białka w porównaniu do znakowanego XRCC1 typu dzikiego jest zaskakująca. Podejrzewano, że zaburzenie oddziaływania białka XRCC1 poprzez domenę BRCT1 spowoduje wzrost jego mobilności, a nie spadek. Uzyskane wyniki mogą sugerować, że dezaktywacja domeny BRCT1 mogła wpłynąć na zwiększenie niespecyficznego wiązania się białka XRCC1 do innych składników jądra komórkowego lub tworzenie trwałych kompleksów bądź niepoprawne jego sfałdowanie, które wpłynęłoby na znaczący wzrost promienia hydrodynamicznego XRCC1L360R 110 Rozdział 8. Wyniki mRFP-XRCClL360R w nukleoplazmie Doświadczenie 1 Doświadczenie 2 Doświadczenie 3 Średnia Dł [nm2 /s] 4,43 ± 0,69 4,29 ± 0,70 4,48 ± 1,06 4,38 ± 10,45 a-i 0,97 ± 0,04 1,03 ± 0,12 1,01 ± 0,15 0,98 ± (o,03 fi 0,64 ± 0,10 0,77 + 0,18 0,90 + 0,10 0,77 ± 0,07 D2 [nm2/s] 0,28 ± 0,04 0,27 ± 0,04 0,27 ± 0,06 0,27 ± 0,03 «2 0,90 ± 0,05 0,84 ± 0,04 0,93 ± 0,14 0,87 ± 0,03 f2 0,36 ± 0,10 0,23 ± 0,18 0,10 + 0,10 0,23 + 0,07 94 ± 11 157 ± 94 107 ± 67 95 ±11 R2 0,86 ± 0,08 0,81 ± 0,03 0,78 ± 0,04 0,80 ± 10,02 Rycina 8.13. Mobilność mRFP-XRCC1L360R w nukleoplazmie. A - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP-XRCC1L360R; B - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie dla każdej z serii doświadczeń (niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji) oraz średnią ważoną, gdzie wagami była odwrotność kwadratów odpowiednich niepewności; C - Średnie krzywe autokorelacji dla mRFP-XRCC1L360R w nukleoplazmie dla trzech niezależnych doświadczeń. Skala:5 fim. 111 Wyniki Rozdział 8. 8.4.4. Mobilność mRFP-XRCC1S371A W celu sprawdzenia czy zdolność do fosforylacji w wybranych miejscach białka XRCC1 może wpłynąć na mobilność białka w miejscu prowadzonej naprawy DNA posłużono się szeregiem mutantów, w których wybrane miejsca fosforylacji zostały zdezaktywowane. Pierwszy mutant białka XRCC1 poddany analizie zawierał wprowadzoną mutację S371A (XRCC1S371A), gdzie w pozycji 371 seryna została zastąpiona alaniną, w ten sposób pozbawiając białko miejsca fosforylacji przez kinazę DNA-PKcs (Lévy et al., 2006). W doświadczeniach FCS podjęto próbę oszacowania jego mobilności zarówno w nukleoplazmie, jak i w obszarze jego gromadzenia w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA indukowanego wiązką laserową o długości fali 488 nm. 8.4.4.I. Mobilność mRFP-XRCC1S371A w nukleoplazmie Tak jak we wcześniejszych doświadczeniach, zarówno przed jak i po pomiarze FCS rejestrowano obraz wybranego przekroju przez jądro. Po pomiarze FCS nie zaobserwowano widocznej akumulacji białka, co świadczyło o braku wykrywalnego uszkodzenia DNA. Do uzyskanych krzywych autokorelacji dopasowano model anomalnej dyfuzji z dwiema składowymi oraz z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Wyniki analizy świadczą o istnieniu dwóch subpopulacji białka w jądrze komórkowym. Stosunek ilościowy pomiędzy nimi wynosi 7:3 (f1 = 0,7 ±0,2 oraz f2 = 0,3±0,2). Ta sama niepewność jest skutkiem związku f1 i f2. Wartość f2 jest różnicą 1-f1, przez co zakresy niepewności dla obu parametrów są takie same. Dla pierwszej, szybszej subpopulacji współczynnik dyfuzji wynosi D1 = 7,1 ± 1,3 |im2/s, a dla drugiej D2 = 0,40 ± 0,10 |im2/s. Współczynniki anomalności świadczą o tym, że mobilność białka ma naturę dyfuzji prostej, choć dla drugiej subpopulacji a2 = 0,89±0,08 może świadczyć, że występowała niewielka anomalność. Uzyskane wyniki mogą oznaczać, że fosforylacja białka XRCC1 w miejscu S371 nie wpływa na jego oddziaływanie z pozostałymi składnikami jądra komórkowego przez co mobilność pierwszej, swobodnej subpopulacji, jak i drugiej, przypuszczalnie oddziałującej z chromatyną, nie ulega zmianie. 112 Rozdział 8. Wyniki Q mRFP-XRCClS371A w nukleoplazmie Di [kim2 /s] 7,20 ± 1,30 “i 0,96 ± 0,10 fi 0,70 ± 0,18 D2 [urn2 /s] 0,40 ± 0,10 t*2 0,89 ± 0,08 h 0,30 ± 0,18 99 ± 37 R2 0,851 ± 0,02 Rycina 8.14. Mobilność mRFP-XRCC1S371A w nukleoplazmie mierzona metodą FCS. A - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP-XRCC1 zarejestrowane przed i po pomiarze FCS. Strzałki pokazują miejsce prowadzenie pomiaru. Po pomiarze FCS nie zaobserwowano widocznej akumulacji białka co wskazuje, że pomiar FCS nie wywołał dodatkowych uszkodzeń DNA; B - Średnia krzywa autokorelacji dla białka mRFP- XRCC1S37IA w nukleoplazmie wraz z naniesionym średnim dopasowaniem. Przedstawiona krzywa to średnia po wszystkich pomiarach, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1; C - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskane na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie. Przedziały niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Skala: 5 fim. 113 Wyniki Rozdział 8. 8.4.4.2. Mobilność mRFP-XRCC1S371A w ognisku naprawczym Wprowadzenie mutacji dezaktywującej miejsce fosforylacji białka XRCC1S371A nie wpłynęło na jego akumulację w miejscu uszkodzenia DNA. Ognisko pojawiało się przeważnie zaraz po lokalnym naświetleniu wiązką lasera przez około 5-6 sekund (w celu dostarczenia 90 |iJ energii). Mały rozmiar ogniska, a także jego mobilność powodowały trudności w przeprowadzeniu pomiarów. Zdarzało się, że w czasie rejestracji fluorescencji ognisko przemieszczało się poza obszar detekcji. W związku z tym tylko część pomiarów mogła być poddana dalszej analizie. Należy także dodać, że sam pomiar FCS trwający minutę (6x10 sekund) nie wpływał znacząco na intensywność sygnału z ogniska, zatem można wnioskować, iż nie nastąpiło dodatkowe uszkodzenie DNA. Nieznaczne fotoblaknięcie będące skutkiem działania światła wzbudzającego podczas prowadzenia pomiaru było obserwowane podczas pierwszego pomiaru z sześciu powtórzeń. W trakcie analizy krzywych autokorelacji dla ogniska XRCC1 zwrócono uwagę, że w zdecydowanej większości uzyskanych krzywych autokorelacyjnych pod koniec ich przebiegu pojawia się wspomniana wcześniej nietypowa struktura (oscylacje na krzywych autokorelacyjnych). Zdecydowano, aby część krzywych, w których efekt nie był na tyle widoczny, by istotnie zaburzyć przebieg krzywej autokorelacji, pozostawić i włączyć je do analizy. W tabeli poniżej zamieszczono wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji z dwiema składowymi z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Według dopasowania modelu, w którym zakładamy istnienie dwóch subpopulacji cząsteczek w ognisku mutanta białka XRCC1S371A uzyskany wynik wskazuje na stosunek między nimi na ~3:2 (f1 = 0,61±0,27 oraz £2 = 0,9±0,27). Współczynnik dyfuzji dla pierwszej, szybszej subpopulacji wynosi D1 = 3,08±0,05 ^m2/s, a uśredniona wartość współczynnika dyfuzji dla drugiej, wolniejszej subpopulacji wynosi D2 = 0,18±0,02 ^m2/s. Oba uzyskane współczynniki anomalności przyjmują wartości nieznacznie mniejsze od 1: a1 = 0,94±0,16 oraz a2 = 0,90±0,08. Pierwszą, szybszą subpopulację można utożsamić z cząsteczkami XRCC1S371A swobodnie poruszającymi się w obszarze ogniska naprawy DNA. Druga wolniejsza subpopulacja opisuje cząsteczki gromadzące się i potencjalnie wiążące się do chromatyny. Co interesujące, uzyskane wartości współczynników dyfuzji, anomalności oraz oszacowany stosunek ilościowy pomiędzy postulowanymi subpopulacjami są bardzo podobne do analogicznych wartości uzyskanych dla znakowanego białka typu dzikiego w ognisku naprawczym DNA. Może 114 Rozdział 8. Wyniki to oznaczać, że zaburzenie fosforylacji białka XRCC1 w pozycji S371 nie wpływa znacząco na jego mobilność w procesie naprawy. mRFP-XRCClS371A w ognisku naprawczym Di [nm2 /s] 3,08 ± 0,05 Ol 0,94 ± 0,16 fi 0,61 + 0,27 D2 Inm2 /s] 0,18 ± 0,02 C*2 0,90 ± 0,08 f2 0,39 ± 0,27 125 ± 16 R2 0,75 ± 0,08 Rycina 8.15. Mobilność mRFP-XRCC1S371A w ognisku naprawczym badana metodą FCS. A - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP-XRCC1S371A zarejestrowane przed oraz po naświetleniu światłem o długości fali 488 nm (niebieskie strzałki) czego efektem jest akumulacja białka w tym miejscu. Ostatni obraz w rzędzie pokazuje stan ogniska naprawczego po wykonanym pomiarze FCS. Białe strzałki pokazują miejsce prowadzenia pomiaru FCS; B - Zestawienie uśrednionych krzywych FCS z lub bez uwzględnienia krzywych z tzw. „oscylacjami” dla białka mRFP-XRCC1S371A w ognisku naprawczym. Przedstawione krzywe to średnie po wybranych pomiarach, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1. Dopasowanie modelu zawiera wyraźnie widoczne dwa przegięcia świadczące o możliwym istnieniu dwóch subpopulacji; C - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie. Przedziały niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Skala:5 um. 115 Wyniki Rozdział 8. 8.4.5. Mobilność mRFP-XRCC1T284A Kolejnym badanym miejscem fosforylacji, które było obiektem zainteresowania pod kątem jego wpływu na mobilność białka XRCC1 w miejscu prowadzonej naprawy DNA była treonina na pozycji 284. W tym celu użyto mutanta z wprowadzoną mutacją punktową T284A, w której treonina w pozycji 284 została podstawiona alaniną (XRCC1T284A). Jest to miejsce fosforylacji dla kinazy Chk2 (Chou et al., 2008). Ponownie, stosując przejściową ekspresję znakowanego białka oraz technikę FCS podjęto próbę oszacowania mobilności mutanta białka XRCC1 z metką RFP zarówno w nukleoplazmie, jak i w miejscu jego akumulacji, będącej częścią odpowiedzi komórkowej na powstałe uszkodzenie DNA. 8.4.5.I. Mobilność mRFP-XRCC1T284A w nukleoplazmie W toku prowadzonych doświadczeń wybierano komórki, w których poziom ekspresji zmutowanego białka fuzyjnego był stosunkowo niski (Rycina 8.16.A). Tak jak we wcześniejszych doświadczeniach, zarówno przed, jak i po pomiarze FCS wykonywano rejestrację obrazu wybranego przekroju przez jądro. Po pomiarze FCS nie zaobserwowano widocznej akumulacji białka świadczącej o potencjalnym uszkodzeniu DNA. Do uzyskanych krzywych autokorelacji dopasowano dwuskładowy model dyfuzji anomalnej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Wyniki analizy świadczą o istnieniu dwóch subpopulacji białka w jądrze komórkowym. Stosunek ilościowy pomiędzy nimi wynosi w przybliżeniu 7:3 (f1 = 0,67 ±0,10 oraz f2 = 0,33±0,1 (ten sam zakres niepewności jest skutkiem przepisania niepewności z f1 na f2 co wynika z faktu, że f2 jest wynikiem różnicy 1-f1). Dla pierwszej, szybszej subpopulacji współczynnik dyfuzji wynosi D1 = 6,8 ± 0,6 |im2/s, a dla drugiej D2 = 0,35 ± 0,08 ^m2/s. Współczynniki anomalności świadczą, że mobilność białka ma naturę dyfuzji prostej, choć dla drugiej subpopulacji a2 = 0,86±0,02 może świadczyć, że występuje niewielka anomalność. Uzyskane wyniki dla zmutowanego białka XRCC1 nie różnią się znacząco od analogicznych wartości uzyskanych dla znakowanego białka typu dzikiego w nukleoplazmie. Może to oznaczać, że fosforylacja białka XRCC1 w pozycji T284A nie jest konieczna do jego potencjalnego oddziaływania z innymi składnikami jądra komórkowego, co w przypadku jej dezaktywacji, skutkowałoby zmianą obserwowanej mobilności. 116 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.16. Mobilność mRFP-XRCC1T284A w nukleoplazmie badana metodą FCS. A - różne poziomy ekspresji biała fuzyjnego w komórkach; białe strzałki wskazują jądra, w który prowadzone były pomiary; B - przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP- XRCC1T284A zarejestrowane przed i po pomiarze FCS. Białe strzałki pokazują miejsce prowadzenie pomiaru. Po pomiarze FCS nie zaobserwowano widocznej akumulacji białka co wskazuje, że pomiar FCS nie wywołał dodatkowych uszkodzeń DNA; C - Średnia krzywa autokorelacji dla białka mRFP-XRCC1T284A w nukleoplazmie wraz z naniesionym średnim dopasowaniem. Przedstawiona krzywa to średnia z wszystkich pomiarów, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1; D - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie. Przedziały niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Ostatnia kolumna przedstawia średnie ważone kolejnych parametrów, gdzie kolejne wagi wyznaczone były jako odwrotności kwadratów odpowiednich niepewności. Skala:5 fim. 117 Wyniki Rozdział 8. 8.4.5.2. Mobilność mRFP-XRCC1T284A w ognisku naprawczym Podobnie jak w pomiarach dynamiki mRFP-XRCC1wt w ognisku pomiary dla mutanta wykonano według porządku sześć powtórzeń po 10 sekund każde. W czasie powtórzeń odnotowano nieznaczny spadek sygnału. Powodem takiego zjawiska mogło być nieznaczne blaknięcie sygnału w ognisku, choć z drugiej strony na obrazach wykonanych po pomiarze nie zauważono istotnego spadku fluorescencji z obrębu ogniska. W analizie krzywych autokorelacji wykorzystano model anomalnej dyfuzji z dwiema składowymi oraz z członem uwzględniającym istnienie subpopulacji trypletowej. Stosunek postulowanych dwóch subpopulacji wynosił prawie 1:1 (f1 = 0,55±0,10, natomiast ich współczynniki dyfuzji wynosiły kolejno D1 = 3,59±0,75 |im2/s oraz D2 = 0,17±0,05 |im2/s. Wśród uśrednianych krzywych zdecydowana większość zawierała oscylacje w długich czasach t. Możliwe, że reprezentują one słabo dostrzegalne efekty jednokierunkowego ruchu cząsteczek do miejsca gromadzenia. Zagadnienie zostanie szerzej opisane w rozdziale Dyskusji 9.6. 118 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.17. Mobilność mRFP-XRCC1T284A w ognisku naprawczym badana metodą FCS. A - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP- XRCC1T284A zarejestrowane przed oraz po naświetleniu światłem o długości fali 488nm (niebieska strzałka) czego efektem jest akumulacja białka w tym miejscu. Ostatni obraz w rzędzie pokazuje stan ogniska po wykonanym pomiarze FCS. Białe strzałki pokazują miejsce prowadzenia pomiaru; B - Diagram przestawia średnią krzywą autokorelacji dla białka RFP-XRCC1T284A w ognisku naprawczym z uwzględnieniem niektórych krzywych zawierających oscylacje. Przedstawiona krzywa to średnia ze wszystkich pomiarów, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1; C - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie. Podane zakresy niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Skala:5 fim. 119 Wyniki Rozdział 8. 8.4.6. Mobilność mRFP-XRCC1S421AT488AS518AT523A (XRCC1-4P) Ostatni mutant białka XRCC1, który był obiektem prowadzonych badań, zawierał cztery mutacje punktowe dezaktywujące miejsca fosforylacji. Seryna w pozycji 421, treonina w pozycji 488, seryna w pozycji 518 oraz treonina w pozycji 523 zostały zastąpione alaniną (S412A, T488A, S518A oraz T523A). Są to miejsca pomiędzy domeną BRCT1 a BRCT2 fosforylowane przez kinazę kazeinową 2 (Ck2, z ang. Casein kinase 2) (Loizou et al., 2004; Parsons et al., 2010). W populacji komórek poddanych przejściowej transfekcji plazmidem kodującym to białko dało się zauważyć dwie klasy jąder komórkowych. Pierwsza z nich charakteryzowała się równomiernym rozmieszczeniem znakowanego białka w obszarze całego jądra komórkowego (Rycina 8.18, A,B,C). W drugiej w nukleoplazmie były widoczne wyraźne skupiska białka XRCC1 (Rycina 8.18, D,E,F). Całość doświadczeń przeprowadzono wyłącznie w komórkach nie zawierających ognisk XRCC1 powstałych na skutek działania zewnętrznych czynników (Solarczyk et al., 2016). Na potrzeby dalszego omawiania wyników dla tego mutanta w jego nazewnictwie i odwołaniach w tekście posłużono się skrótem XRCC1-4P (ponieważ zawiera 4 dezaktywowane miejsca fosforylacji). 120 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.18. Dwie subpopulację komórek różniące się rozkładem białka mRFP-XRCC1-4P w jądrze komórkowym. Obrazy A,B,C przedstawiają rozkład białka podobny do rozkładu dla znakowanego białka typu dzikiego, natomiast na obrazach D, E, F znajdują się jądra, w których występowało po kilka ognisk naprawczych (zapewne endogenne uszkodzenia DNA). Skala:5 fim. 8.4.6.I. Mobilność mRPF-XRCC1S421A T488A’S518A T523A (XRCC1-4P) w nukleoplazmie Tabela w Rycinie 8.19. poniżej przedstawia uśrednione parametry z dopasowania modelu do krzywych, a wykres przedstawia uśrednioną krzywą wraz z uśrednionym dopasowaniem. Wyznaczone średnie współczynniki dyfuzji wynoszą kolejno dla pierwszej, szybszej subpopulacji Di = 6,98 ± 0,80 |im2/s oraz dla drugiej, wolniejszej D2 = 0,41 ± 0,07 |im2/s. Współczynnik fi wskazuje, że około 68% cząsteczek należy do pierwszej subpopulacji. Współczynniki anomalności świadczą, że mobilność białka ma naturę dyfuzji prostej, choć dla drugiej subpopulacji parametr a2 = 0,86±0,03 może świadczyć o zachowaniu charakterystycznym dla subdyfuzji. Uzyskane wartości parametrów opisujących mobilność zmutowanego białka w nukleoplazmie dość dobrze pokrywają się z uzyskanymi analogicznymi parametrami dla znakowanego białka XRCC1 typu dzikiego. Oznacza to, że równoczesna dezaktywacja nawet czterech miejsc fosforylacji na białku XRCC1 nie wpływa znacząco na jego mobilność w nukleoplazmie. 121 Wyniki Rozdział 8. Rycina 8.19. Mobilność mRFP-XRCC1'4P w nukleoplazmie badana metodą FCS. A - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórek z przejściową ekspresją mRFP- XRCC1~4P zarejestrowane przed i po pomiarze FCS. Białe strzałki pokazują miejsce prowadzenie pomiaru. Po pomiarze FCS nie zaobserwowano widocznej akumulacji białka; B - Średnia krzywa autokorelacji dla białka mRFP-XRCC1~4P w nukleoplazmie wraz z naniesionym średnim dopasowaniem. Przedstawiona krzywa to średnia po wszystkich pomiarach, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1; C - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie. Przedziały niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Ostatnia kolumna przedstawia średnie ważone kolejnych parametrów, gdzie wagami była odwrotność kwadratów odpowiednich niepewności. Skala: 5 fim. 122 Rozdział 8. Wyniki 8.4.6.2. Mobilność mRFP-XRCC1S421A’T488A S518A T523A (XRCC1-4P) w ognisku naprawczym Do uzyskanych poszczególnych krzywych dopasowano dwuskładowy model dyfuzji anomalnej z uwzględnieniem istnienia subpopulacji trypletowej. Tabela poniżej przedstawia wartości wybranych parametrów. Są to wartości średnie uzyskane z dopasowania modelu do każdej krzywej ze zbioru. Stosunek ilościowy między postulowanymi populacjami wynosi 1,4:1 (fi=0,58±0,09 oraz £2 = 0,42±0,09). Współczynnik dyfuzji dla pierwszej, szybszej subpopulacji wynosi Di = 3,48 ± 0,42 |im2/s, natomiast współczynnik dyfuzji dla drugiej, wolniejszej subpopulacji wynosi D2 = 0,18 ± 0,05 ^m2/s. Uzyskane wartości współczynników dyfuzji, anomalności oraz stosunek ilościowy pomiędzy postulowanymi populacjami dla zmutowanego białka są bardzo zbliżone do analogicznych wartości uzyskanych dla znakowanego białka XRCC1 typu dzikiego. Jest interesujące, że nawet pomimo dezaktywacji czterech miejsc fosforylacji mobilność białka XRCC1 w ognisku naprawy DNA nie uległa zmianie. 123 Wyniki Rozdział 8. mRFP-XRCCl'4P w ognisku naprawczym Djinns/s] 3,48 ± 0,42 ai 0,97 ± 0,10 fi 0,58 ± 0,09 D2[nm2/s] 0,18 ± 0,05 “2 0,92 ± 0,11 f 2 0,42 ± 0,09 N 145 ± 36 R2 0,87 ± 0,06 Rycina 8.20. Mobilność RFP-XRCC1'4F w ognisku naprawczym badana metodą FCS. A - Przykładowe obrazy środkowych przekrojów przez jądra komórkowe z przejściową ekspresją mRFP-XRCC1~4P zarejestrowane przed oraz po naświetleniu światłem o długości fali 488nm (niebieskie strzałki) czego efektem jest akumulacja białka w tym miejscu. Ostatni obraz w rzędzie pokazuje stan ogniska po wykonanym pomiarze FCS. Białe strzałki pokazują miejsce prowadzenia pomiaru; B - Diagram przestawia średnią krzywą autokorelacji dla białka RFP- XRCC1'4F w ognisku naprawczym z uwzględnieniem części krzywych zawierających oscylacje. Przedstawiona krzywa to średnia ze wszystkich pomiarów, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1; C - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskane na podstawie dopasowań do wszystkich krzywych z pomiarów w nukleoplazmie. Przedziały niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Skala: 5 fim. 124 Rozdział 8. Wyniki 8.5. Mobilność HP1 w jądrze komórkowym HP1 jest głównym czynnikiem stabilizującym chromatynę (Ye et al., 1997) oraz pełni istotną rolę w wyciszaniu genów (James & Elgin, 1986). W celu opisania w wysokiej rozdzielczości czasowej dynamiki tego białka w miejscu jego akumulacji w obszarze uszkodzonego DNA konieczne jest oszacowanie jego mobilności także w nukleoplazmie. Przeprowadzenie takich pomiarów umożliwi zilustrowanie potencjalnej zmiany w zachowaniu cząsteczek HP1 w miejscu gdzie jest prowadzona naprawa DNA. Wysoka mobilność białka HP1w jądrze komórkowym nasuwa również pytanie o to, w jaki sposób angażuje się ono w stabilizację heterochromatyny. 8.5.1. Mobilność eGFP-HP1a w nukleoplazmie Doświadczenia FCS przeprowadzono na komórkach linii HeLa z przejściową eskpresją. Pomiary prowadzono w jądrze komórkowym, ale również jako kontrolę w cytoplazmie. Wybierano komórki, w których intensywność fluorescencji była jak najniższa, ale wciąż ponad poziomem detekcji z zastosowaniem fotopowielaczy. Do uzyskanych krzywych dopasowano model anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem dwóch populacji oraz subpopulacji trypletowej. Poddanie komórek działaniu światła potrzebnego do przeprowadzenia pomiaru FCS nie wpłynęło w widoczny sposób na intensywność fluorescencji, tzn. nie obserwowano wyraźnego blaknięcia metki. Rycina 8.21. przedstawia wybrane przekroje przez jądro komórkowe przed i po pomiarze FCS. Strzałką oznaczono miejsce, gdzie prowadzono pomiar. Pomiary były wykonywane według schematu 6 powtórzeń w jednym miejscu, po 30 sekund każde. Panel D Ryciny 8.21 przedstawia zestawienie krzywych autokorelacji wraz dopasowanymi modelami dla białka eGFP-HP1a w cytoplazmie oraz w nukleoplazmie. Przedstawione krzywe to wynik uśrednienia znormalizowanych krzywych z pojedynczych pomiarów (dla cytoplazmy z 36 krzywych, a dla nukleoplazmy z 35). Bardzo wyraźnie widać znaczące przesunięcie w kierunku dłuższych czasów krzywej autokorelacji dla pomiaru w nukleoplazmie względem pomiaru w cytoplazmie (ncytop =633±191 |is, T1nukleo = 2571±475 |is; przyjęta objętość detekcji w obu pomiarach była taka sama). Dla pomiarów w cytoplazmie pomimo użycia modelu, w którym postuluje się istnienie dwóch subpopulacji, z dopasowania modelu wynika, że w zdecydowanej większości cząsteczki należą tylko do pierwszej, szybszej subpopulacji (f1cytopl = 0,95±0,21). Liczba cząsteczek przyporządkowana do drugiej subpopulacji jest tak niewielka, że istnienie tej subpopulacji można zaniedbać. W nukleoplazmie ten stosunek jest inny. Do pierwszej, 125 Wyniki Rozdział 8. szybszej (szybko dyfundującej) subpopulacji należy około 79% cząsteczek, z kolei do drugiej, wolniejszej, około 21% cząsteczek. Parametr N (średnia liczba molekuł w objętości detekcji) pokazuje, że stężenie białka eGFP-HP1a w cytoplazmie jest ponad sześciokrotnie mniejsze niż w nukleoplazmie (jest to ciągle poziom wystarczający do przeprowadzenia pomiaru FCS). Współczynnik dyfuzji dla eGFP-HP1a w cytoplazmie wynosi Dcyto=22,7±5,0 |im2/s oraz w nukleoplazmie Dnukle=5,3±0,7 |im2/s. Współczynniki a dla pierwszej subpopulacji w obu dopasowaniach wynoszą kolejno 0,80±0,18 oraz 0,85±0,11. Z powodu niskiej intensywności fluorescencji w komórkach, w których prowadzono pomiar FCS, bardzo kłopotliwe było rozróżnienie hetero- i euchromatyny (Rycina 8.21 A,B,C). 126 Rozdział 8. Wyniki Wyniki z modelu opisującego dynamikę eGFP-HPla w cytoplazmie w nukleoplazmie Di [urn2 /s] 22,70 ± 5,03 5,27 ± 0,65 cti 0,80 ± 0,18 0,85 ± 0,11 fi 0,95 ± 0,21 0,79 ± 0,10 D2 [urn2 /s] 1,25 ± 0,44 0,33 ± 0,09 «2 0,92 ± 0,19 1,09 ± 0,24 f2 0,05 ± 0,21 0,21 ± 0,10 6 ± 2 29 ± 12 R2 0,94 ± 0,21 0,99 ± 0,00 Rycina 8.21. Mobilność eGFP- HP1a w jądrze komórkowym, w pomiarach FCS. Panele A,B,C - przekroje wybranych jąder komórkowych z przejściową ekspresją eGFP-HP1a wykonane przed i po pomiarze FCS. Na obrazach po pomiarze nie widać istotnego wyblaknięcia sygnału w miejscu zaparkowania wiązki światła lasera, ani też akumulacji białka świadczącego o wywołaniu odpowiedzi komórki na powstałe uszkodzenia w tym miejscu. Wydaje się mało prawdopodobne, aby te dwa procesy się kompensowały przez co nie byłoby widać różnicy w intensywności sygnału fluorescencji; D - Diagram przestawia krzywe autokorelacji dla białka eGFP-HP1a w cytoplazmie (czarny) oraz w nukleoplazmie (niebieski). Dodatkowo zostały naniesione dopasowania modelu anomalnej dyfuzji z dwiema składowymi. Przedstawione krzywe to średnie ze wszystkich pomiarów, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości jeden; E - Tabela przedstawia średnie wartości parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowań do wszystkich krzywych z pomiarów. Zaznaczona wartość błędu to pierwiastek kwadratowy z wariancji. Skala:5 fim. 127 Wyniki Rozdział 8. 8.5.2. Mobilność eGFP-HP1y w nukleoplazmie Do pomiarów użyto plazmidu kodującego białko fuzyjne eGFP-HP1y. Do pomiarów wybierano komórki z niskim poziomem ekspresji białka fuzyjnego. Uzyskany niski poziom intensywności fluorescencji uniemożliwiał zarejestrowanie obrazów rozkładu przestrzennego białka wewnątrz jądra w tych komórkach. Powodowało to, że wybierając miejsce przeprowadzenia pomiaru w jądrze komórkowym sugerowano się jedynie lokalizacją jąderka, aby uniknąć pomiarów w tym rejonie. Na rycinie 8.22. zestawiono obrazy rozkładu eGFP-HP1y wewnątrz przykładowych jąder komórkowych przed, oraz po pomiarze FCS (Rycina 8.22.A,B,C). Po zakończeniu doświadczenia nie zaobserwowano znaczącego blaknięcia metki fluorescencyjnej w miejscu prowadzenia pomiaru. Pojedynczy pomiar FCS składał się z sześciu następujących po sobie powtórzeń trwających po 30 s każde. Krzywa autokorelacji dla pomiaru w nukleoplazmie jest znacząco przesunięta względem pomiaru w cytoplazmie (ncytop =495±88 |is, T1nukleo = 2640±414 jus). Już samo porównanie kształtu krzywych informuje, że w nukleoplazmie białko eGFP-HP1y porusza się o wiele wolniej niż w cytoplazmie. Na podstawie wyników uzyskanych z dopasowania modelu widać, że pomimo użycia modelu zawierającego dwie składowe w cytoplazmie zdecydowana większość molekuł została przyporządkowana do pierwszej subpopulacji (f1cyto = 1,00±0,01). W nukleoplazmie stosunek obu subpopulacji wynosi 2,84:1 (f1nukleo = 0,74±0,06 oraz f2nukleo=0,26). Parametry a1 w obu przypadkach są mniejsze od 1, nawet z uwzględnieniem przedziału niepewności, co sugeruje, że ruch molekuł można opisywać jako dyfuzję anomalną (acyto = 0,85±0,11 oraz anukleo = 0,78±0,13). Wyznaczone współczynniki dyfuzji pokazują rozmiary różnicy mobilności białka eGFP-HP1y w cytoplazmie i nukleoplazmie (D1cyto = 27,5±4,7 um2/s oraz D1nukleo = 5,1±0,4 um2/s oraz D2nukleo = 0,27±0,07 |im2/s). Przedstawione krzywe to wynik uśrednienia znormalizowanych krzywych z pojedynczych pomiarów (dla cytoplazmy z 50 krzywych, a dla nukleoplazmy z 35). Średnia wartości testu R2 wynosiła prawie 1 co świadczy o prawie idealnym dopasowaniu modelu do krzywych. 128 Rozdział 8. Wyniki Wyniki modeli opisujących mobilność eGFP-HPly w cytoplazmie w nukleoplazmie Di [nm2 /s] 27,48 ± 4,75 5,08 ± 0,42 dl 0,85 ± 0,11 0,78 ± 0,13 fi 1,00 ± 0,01 0,74 ± 0,06 D2 [nm2 /s] 1,47 ± 0,39 0,27 ± 0,07 <*2 1,00 ± 0,15 0,99 ± 0,16 fz 0,00 ± 0,01 0,26 ± 0,06 5 ± 2 51 ± 14 R2 1,00 ± 0,01 0,96 ± 0,00 Rycina 8.22. Mobilność eGFP-HPy w jądrze komórkowym w pomiarach FCS. Panele A,B,C - przekroje wybranych jąder komórkowym z przejściową ekspresją eGFP-HP1y wykonane przed i po pomiarze FCS. Na obrazach po pomiarze nie widać istotnego wyblaknięcia sygnału w miejscu skupienia wiązki lasera, ani też akumulacji białka, która świadczyłaby o wywołaniu odpowiedzi komórki na powstałe w tym miejscu uszkodzenia DNA. D - Diagram przestawia krzywe autokorelacji dla białka eGFP-HP1y w cytoplazmie (czarny) oraz w nukleoplazmie (niebieski). Dodatkowo zostały naniesione dopasowania modelu anomalnej dyfuzji z dwiema składowymi. Przedstawione krzywe to średnie ze wszystkich pomiarów, które wcześniej zostały znormalizowane do wartości 1. E - Tabela przedstawia średnie wartości wybranych parametrów modelu uzyskanych na podstawie dopasowania do wszystkich krzywych z pomiarów. Niepewności zostały oszacowane jako pierwiastek kwadratowy z wariancji. Skala:5 um. 129 Wyniki Rozdział 8. 8.5.3. Mobilność eGFP-HP1ß w nukleoplazmie Tak jak dla wcześniej opisanych izoform białka HP1, w pomiarach mobilności HPlß użyto przejściowej transfekcji plazmidem kodującym białko z metką fluorescencyjną - białkiem eGFP na N-końcu. Sposób prowadzenia doświadczenia także i tu nie wpłynął zauważalnie na poziom intensywności fluorescencji w miejscu zaparkowania wiązki lasera. Po dokonaniu pomiaru nie zauważono zauważalnego spadku intensywności fluoroforu w wyniku fotoblaknięcia. Nie zaobserwowano także oznak sugerujących pojawienie się śladowej akumulacji białka eGFP-HP1ß, co mogłoby wskazywać na niepożądane zjawisko - powstanie uszkodzeń DNA i wywołanie odpowiedzi komórki. W ramach kontroli i porównania przeprowadzono także pomiary w cytoplazmie. Do krzywych autokorelacyjnych dopasowano model anomalnej dyfuzji zawierający dwie składowe oraz uwzgledniający istnienie subpopulacji trypletowej. Pomimo wstępnego założenia istnienia dwóch subpopoulacji (dwie składowe w modelu, dowodzenie przez zaprzeczenie) wynik dopasowania dla pomiarów cytoplazmie wskazuje, że istnieje tylko jedna subpopulacja białka HPlß (f1cyto = 0,99±0,01). W nukleoplazmie stosunek liczby cząsteczek przynależnych do pierwszej, szybszej subpopulacji względem drugiej, wolniejszej subpopulacji wynosi 4,55:1 (f1nukleo = 0,82±0,07 oraz f2nukleo = 0,18±0,07). Parametr a określający stopień anomalności dynamiki białka w obu przypadkach jest mniejszy od 1 z dokładnością do wyznaczonej wartości jego niepewności (a1cyto = 0,84±0,08 oraz a1nukleo = 0,81±0,11). Wyznaczone współczynniki dyfuzji dla białka eGFP-HP1ß znacząco się różnią w zależności od jego lokalizacji. Białko to jest Tabela 8.1. Porównanie mobilności białek eGFP-HP1ß oraz mCherry-HP1ß w jądrze komórkowym na podstawie pomiarów FCS i dopasowania modelu. Przedstawione wartości uzyskano na podstawie uśrednienie wyników analizy dopasowania modelu do każdej krzywej ze zbioru (dla mCherry-HP1 ß - 15 krzywych, dla eGFP-HP1ß - 44 krzywe). Mobilność HPlß z różnymi metkami w nukleoplaźmie eGFP-HPlß mCherry-HPlß D1 [^m2 /sec] 4,77 ± 0,64 4,86 ± 1,2 ai 0,81 ± 0,11 0,91 ± 0,05 fi 0,82 ± 0,07 0,55 ± 0,09 D2 [^m2 /sec] 0,256 ± 0,06 0,34 ± 0,1 a2 1 ± 0,19 0,89 ± 0,02 f2 0,18 ± 0,07 0,45 ± 0,09 N 76,58 ± 42,4 532 ± 168 R2 0,98 ± 0,01 0,71 ± 0,12 130 Rozdział 8. Wyniki bardzo mobilne w cytoplazmie (Dicyto = 26,0±3,6 |im2/s), z kolei w nukleoplazmie jego mobilność dla pierwszej subpopulacji jest ponad 5 razy mniejsza (D1nukleo = 4,8±0,6 |im2/s). Ponadto przeprowadzono analogiczne pomiary mobilności białka HPß z metką mCherry w jądrze komórkowym. Wyniki dla obu białek fuzyjnych zestawiono na rycinie 8.9. Poszczególne współczynniki dyfuzji D1 oraz D2 są zgodne w granicach błędu. Rozbieżność pojawia się w wartościach parametrów f1 oraz f2. Stosunek ilościowy dla eGFP-HP1ß - 4,55:1, a dla mCherry-HP1ß - 1,22:1. 8.5.3.I. Mobilność eGFP-HP1ß w ognisku naprawy Kolejnym krokiem w pomiarach dynamiki białka HP1 w nukleoplazmie było przyjrzenie się zachowaniu tego białka w miejscu jego gromadzenia w jądrze komórkowym w procesie odpowiedzi komórki na powstanie lokalnego uszkodzenia nici DNA. Do wywołania takiej odpowiedzi posłużono się skupieniem wiązki laserowej w wybranym punkcie w obszarze jądra komórkowego. W procedurze uszkodzenia korzystano wyłącznie z światła laserowego, bez udziału egzogennych fotouczulaczy. Po upływie około 5 minut w obszarze naświetlania widoczne było wyraźne ognisko białka eGFP- HP1ß (Rycina 8.23.B). Pomiar FCS w ognisku eGFP-HP1ß nie powodował widocznego wyblaknięcia fluoroforu w miejscu zaparkowania wiązki lasera. Doświadczenie wykonano po upływie około 5 minut, kiedy wielkość jak i intensywność ogniska nie ulegały widocznym zmianom. Z dopasowania modelu do krzywych autokorelacji wynika, że w miejscu akumulacji eGFP-HP1ß występują dwie subpopulacje - szybsza (D1 = 3,3±0,7 |im2/s) oraz wolniejsza (D2 = 0,16 ±0,07 |im2/s). Ich stosunek ilościowy wynosi 1,33:1 (f1nukleo = 0,57±0,09 oraz f2nukleo = 0,43±0,09). Więcej cząsteczek należy do szybszej subpopulacji. Parametr a wskazuje, że jest to mobilność charakterystyczna dla dyfuzji anomalnej (a1nukleo = 0,85±0,17) . Do uzyskanych krzywych FCS dopasowano także trójskładowy model dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Wyniki dopasowania modelu do krzywych przedstawia ostatnia kolumna w tabeli na rycinie 9,11.D. Zastosowanie trójskładowego modelu ujawniło istnienie trzeciej subpopulacji białka HP1. Współczynnik pierwszej, szybkiej subpopulacji wynosi D13sub = 3,74±0,47 |im2/s, a współczynnik a13sub = 0,87±0,12. Druga subpopulacja charakteryzuje się współczynnikiem dyfuzji 131 Wyniki Rozdział 8. wynoszącym D23exp = 1,33±0,78 |im2/s oraz współczynnikiem anomalności a23exp = 0,75±0,12. Trzecia, najwolniejsza subpopulacja ma wartość współczynnika dyfuzji porównywalną do analogicznych wartości uzyskanej z modelu dwuskładowego. D33exp = 0,17±0,05 |im2/s, a współczynniki anomalności wynosi a23exp = 0,81±0,12. Przeprowadzenie F-testu potwierdziło, że trójskładowy model istotnie statystycznie lepiej opisuje krzywe FCS. Dodatkowo, aby utwierdzić się w przekonaniu o słuszności tej tezy przeprowadzono dwa dodatkowe testy (Rycina 8.24). 132 Rozdział 8. Wyniki Wyniki na podstawie modelu opisującego dynamikę eGFP-HPlß w cytoplazmie w nukleoplazmie w ognisku Dj [nm2 /s] 26,04 ± 3,58 4,77 ± 0,64 3,31 ± 0,71 cii 0,84 ± 0,08 0,81 ± 0,11 0,85 ± 0,17 fi 0,99 ± 0,01 0,82 ± 0,07 0,57 ± 0,09 D2 [nm2 /s] 1,42 ± 0,20 0,26 ± 0,06 0,16 ± 0,07 a2 0,96 ± 0,01 1,00 ± 0,19 0,99 ± 0,21 f2 0,01 ± 0,01 0,18 ± 0,07 0,43 ± 0,09 5 ± 4 77 ± 42 95 ± 39 R2 0,99 ± 0,02 0,98 ± 0,01 0,92 ± 0,04 133 Wyniki Rozdział 8. Rycina 8.23. Pomiary FCS białka eGFP-HP1ß w nukleoplazmie oraz w miejscu jego akumulacji jako odpowiedzi na lokalne uszkodzenie DNA. A - obrazy fluorescencyjne eGFP-HP1ß z środkowego przekroju jądra komórkowego zarejestrowane przed oraz po wykonaniu pomiaru FCS. Kontrast na obrazach nie był poprawiany. W miejscu gdzie była zogniskowana wiązka w czasie pomiaru nie zaobserwowano akumulacji białka eGFP-HP1ß, która świadczyłaby o istotnym uszkodzeniu chromatyny w tym miejscu; B - Analogicznie jak w części A przedstawiono tutaj obrazy fluorescencyjne ze środkowego przekroju przed wywołaniem uszkodzenia, następnie obraz przedstawiający zgromadzone białko oraz obraz po wykonanym pomiarze FCS. Podobnie jak to miało miejsce w pomiarach w nukleoplazmie, nie zaobserwowano znaczącego blaknięcia fluoroforu w miejscu prowadzonego pomiaru FCS; C - zestawienie krzywych autokorelacji fluorescencji dla białka eGFP-HP1ß kolejno w cytoplazmie, w nukleoplazmie oraz miejscu akumulacji tego białka; D - wyniki analizy dopasowania modelu do krzywych FCS kolejno dla cytoplazmy, nukleoplazmy i miejsca akumulacji białka. Przedstawione wartości parametrów w tabeli są średnimi ze zbioru dopasowań modelu do pojedynczych krzywych. Niepewności zostały oszacowane jako odchylenia standardowe z populacji. Część cząsteczek przypisana do subpopulacji f2 (wolniejszej) - została wyznaczona z różnicy 1-f1. Skala:5 fim. B Kryterium Preferowany Model Kryterium informacyjne Akaikego (AIC) Trojkomponentowy Bayesowskiekryterium ... . , . . , Trojkomponentowy informacyjne Schwarza F-Test Trojkomponentowy Rycina 8.24. Porównanie dopasowania modelu dwu- i trójskładowego do krzywej FCS dla eGFP-HP1ß w ognisku naprawy DNA. Wykres A pokazuje dopasowanie obu modeli do przykładowej krzywej FCS dla eGFP-HP1ß w rejonie jego akumulacji. Tabela B przedstawia wyniki z przeprowadzonych trzech analiz porównujących miarę dopasowania. Według każdego kryterium (Bayesa, Akaike i F-testu) modelem istotnie lepiej opisującym mobilności znakowanego białka HPlß w jego ognisku jest model trójskładowy. 134 Rozdział 8. Wyniki 8.6. Mobilność histonu H2B-eGFP Omawiane w niniejszej pracy białka XRCC1 oraz HP1 oddziałują z chromatyną. Pierwsze z nich, XRCC1, wiąże się poprzez swoją centralną część (zawierającą sekwencję sygnałową - NLS) do poli(ADP-rybozy). Drugie z nich, HP1, wiąże się z chromatyną (w obszarach heterochromatynowych) głównie poprzez oddziaływanie domeny CD białka z metylowaną lizyną dziewiątą histonu trzeciego (H3K9me3). Mechanizm gromadzenie się HP1 w obszarze uszkodzenia nie został do końca poznany. Obecnie postuluje się, że zarówno domena CSD (Luijsterburg et al., 2009) jak i także domena CD (Ayrapetov et al., 2014) aktywnie uczestniczą w procesie akumulacji HP1. W poprzednich rozdziałach, gdzie przedmiotem badań była mobilność obu białek w nukleoplazmie, oraz w ognisku naprawy, postulowano, że druga lub trzecia, wolniejsza subpopulacja może reprezentować tę pulę białka, która wiąże się do nici DNA. Zatem, kolejnym krokiem prowadzonych badań była próba uchwycenia za pomocą metody FCS ruchliwości włókien chromatyny. W tym celu, wykorzystano jako znacznik chromatyny histon H2B połączony z metką fluorescencyjną eGFP. Czas wymiany cząsteczek histonu pomiędzy nicią chromatyny a otoczeniem jest rzędu kilku- kilkunastu minut (Kimura & Cook, 2001). Długi czas przebywania histonu na nici DNA powinien umożliwić uchwycenie dynamiki włókien chromatyny poprzez pomiar FCS histonu H2B-eGFP. W nukleoplazmie występuje także pula histonu swobodnego, w postaci monomerów lub dimerów. W celu zweryfikowania hipotezy, że możliwe jest uchwycenie ruchu włókien chromatyny poprzez zastosowanie jako markera histonu H2B-eGFP w pomiarach FCS przeprowadzono takie pomiary (Rycina 8.25.A). Uzyskane wyniki przedstawiono na Rycinie 8.25 panel C i D. W analizie zastosowano dwuskładowy model anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Uzyskane wyniki wskazują, że współczynnik dyfuzji pierwszej postulowanej subpopulacji wynosi 8,6±1,1 ^m2/s, natomiast drugiej subpopulacji wynosi 0,37±0,13 |im2/s. Stosunek ilościowy pomiędzy obiema subpopulacjami wynosi 2:1. W pracy z 2017 roku grupa z Heildebergu (Taheri et al., 2018) przedstawiła wyniki pomiaru dynamiki chromatyny metodą SPIM-FCS, gdzie zastosowała histon H2A-eGFP jako marker chromatyny. W analizie badacze ci zastosowali model anomalnej dyfuzji z dwiema składowymi. Założyli, że druga wolniejsza składowa odzwierciedla ruch włókien chromatyny z wbudowanym histonem z metką. Współczynnik dyfuzji jaki zmierzyli 135 Wyniki Rozdział 8. wynosił 0,28±0,05 |im2/s. Wartość współczynnika dyfuzji jest nieco niższa od wartości analogicznego współczynnika wyznaczonego z opisanej tu analizy. Możliwym wyjaśnieniem różnicy w wynikach jest wykorzystanie innej linii komórkowej, a także inna temperatura pomiaru. Badania tu opisane prowadzono w temperaturze 370C, natomiast grupa z Heidelbergu prowadziła badania w temperaturze pokojowej (250C). Fakt, że w doświadczeniach opisanych w pracy (Taheri et al., 2018) użyto znakowanego histonu H2A, natomiast w opisanych tu eksperymentach wykorzystano histon H2B nie powinien być przyczyną dyskredytującą możliwość porównywania obu wyników. Oba histony mają zbliżone rozmiary, a ich dynamika, w tym czas przebywania w chromatynie oraz częstotliwość wymiany z pulą niezwiązaną, są bardzo do siebie podobne (Kimura & Cook, 2001). Rysunek 8.25. Mobilność eGFP-H2B w nukleoplazmie badana metodą FCS. A,B - przykładowe obrazy jądra komórkowego z stabilną ekspresją histonu-eGFP. Białe strzałki wskazują miejsce prowadzenia pomiaru FCS; C - krzywa autokorelacji dla histonu H2B z metką fluorescencyjną eGFP w nukleoplazmie wraz z dopasowanym dwuskładowym modelem anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej; D - tabela przedstawiająca wybrane wyznaczone średnie parametry z dopasowania modelu do krzywych FCS. Skala:5 jum. 136 Rozdział 9. Dyskusja Rozdział 9. Dyskusja Przedłożona praca doktorska skupia się na opisie wybranych zjawisk związanych z utrzymaniem integralności genomu ludzkiego. Głównymi obiektami przedstawionych badań są białka XRCC1 i HP1 oraz zjawisko gromadzenia się tych białek naprawczych jako odpowiedzi komórki na uszkodzenia DNA. Komórka dysponuje licznymi mechanizmami naprawy uszkodzeń nici DNA, które odgrywają kluczowe role w procesie zachowania niezmiennej sekwencji i ciągłości cząsteczek DNA w czasie życia komórki. Obserwacje mikroskopowe wskazują, iż w procesie odpowiedzi komórkowej na uszkodzenia DNA wybrane białka naprawcze biorące aktywny udział w ich naprawie tworzą wyraźne ogniska w takich obszarach. Czas od uszkodzenia DNA do momentu zgromadzenia się poszczególnych białek, jak i czas trwania takich ognisk, były przedmiotem badań opisanych w wielu pracach (Polo & Jackson, 2011; Tobias et al., 2013; Chu et al., 2014b; Aleksandrov et al., 2018). W skład takich ognisk wchodzą setki lub nawet tysiące cząsteczek białka. Można przypuszczać, że funkcje pełnione przez białka zgromadzone w ogniskach naprawczych znajdują odbicie w zmianie ich dynamiki w porównaniu do obszarów jądra komórkowego poza tymi ogniskami. Przeprowadzone doświadczenia skupione były na poznaniu dynamiki dwóch wybranych białek naprawczych, XRCC1 oraz HP1, gromadzących się w rejonie aktywnie prowadzonej naprawy jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Najważniejsze wyniki doświadczeń przedstawionych w rozdziale 7 zestawiłem na następnej stronie (Tabela 9.1). Poniższe tabele przedstawiają w zwięzły sposób najważniejsze wartości parametrów opisujące mobilność badanych białek w ogniskach naprawy DNA, w tym wartości współczynników dyfuzji, współczynników a (które informują o stopniu anomalności ruchu cząsteczek), oraz parametry f, opisujące stosunek ilościowy pomiędzy postulowanymi przez model subpopulacjami. W poprzednim rozdziale najpierw zostały przedstawione wyniki doświadczeń, gdzie przedmiotem badań było białko XRCC1 i jego mutanty, a następnie rezultaty doświadczeń, w których badano HP1. W niniejszym rozdziale postanowiłem zmienić tę kolejność. Decyzja ta była podyktowana potrzebą 137 Dyskusja Rozdział 9. omówienia najpierw potencjalnego wpływu metki fluorescencyjnej na pomiar mobilności znakowanego białka na przykładzie białka HP1. Jest to mniejsze białko niż XRCC1 dlatego dla niego rozważany efekt powinien być bardziej widoczny. Ostatnie omawiane w tym rozdziale zagadnienie to nietypowe oscylacje w długich czasach t na krzywej auto - cross korelacji, które ściśle łączą się z pomiarami FCS w ogniskach naprawy XRCC1. 138 Rozdział 9. Dyskusja Tabela 9.1. Syntetyczne ujęcie wyników pomiarów mobilności HP1 i XRCC1 oraz ich metek. metka eGFP metka mRFP w nukleoplazmie W cytoplazmie W nukleoplazmie 1 populacja 2 populacje 1 populacja 2 populacje Di [^m2/s] 27,12±2,21 32,00±3,63 26,94±4,53 32,75±4,01 31,73±2,98 ai 1,19±0,03 1,11±0,09 1,19±0,10 1,14±0,07 1,10±0,08 f1 1,00 0,96±0,04 1,00 0,97±0,02 0,93±0,08 D2 [^m2/s] 1,98±0,31 2,05±0,37 1,20±0,19 a2 0,94±0,10 0,92±0,08 0,83±0,01 f2 0,04±0,04 0,03±0,02 0,07±0,08 eGFP-HP1 w nukleoplazmie eGFP-HPlß HP1a HPlß HPly w cytoplazmie w ognisku DDR D1 [^m2/s] 5,27±0,65 4,77±0,64 5,08±0,42 26,04±3,58 3,74±0,47 a1 0,85±0,11 0,81±0,11 0,78±0,13 0,84±0,08 0,87±0,12 f1 0,79±0,1 0,82±0,07 0,74±0,06 0,99±0,01 0,46±0,17 D2 [^m2/s] 0,33±0,09 0,26±0,06 0,27±0,07 1,42±0,2 1,13±078 a2 1,09±0,24 1,00±0,19 0,99±0,16 0,96±0,01 0,75±0,12 f2 0,21±0,1 0,18±0,07 0,26±0,06 0,01±0,01 0,15±0,05 D3 [^m2/s] 0,17±0,05 as 0,81±0,21 fs 0,39±0,06 mRFP-XRCC1 (typu dzikiego - wt) Mutanty XRCC1 nie tworzące ogniska DDR w nukleoplazmie w w w ognisku L360R P537STOP cytoplazmie nukleoplazmie DDR w nukleoplazmie D1 [^m2/s] 31,87±5,96 6,10±0,69 3,26±0,36 4,38±0,45 11,69±1,68 a1 0,92±0,01 0,93±0,03 1,02±0,09 0,98±0,03 0,93±0,02 f1 0,61±0,03 0,65±0,05 0,72±0,1 0,77±0,07 0,76±0,02 D2 [^m2/s] 0,94±0,31 0,35±0,04 0,17±0,03 0,27±0,03 0,54±0,08 a2 0,87±0,01 0,87±0,01 0,85±0,04 0,87±0,03 0,89±0,05 f2 0,39±0,03 0,35±0,05 0,28±0,11 0,23±0,07 0,24±0,02 Mutanty XRCC1 tworzące ogniska DDR Wt (kontrola) S371A T284A -4P w nukleoplazmie D1 [^m2/s] 6,10±0,69 7,2±1,3 6,79±0,6 6,98±0,8 a1 0,93±0,03 0,96±0,01 0,94±0,04 0,95±0,06 f1 0,65±0,05 0,7±0,18 0,67±0,1 0,68±0,1 D2 [^m2/s] 0,35±0,04 0,4±0,1 0,35±0,08 0,41±0,07 a2 0,87±0,01 0,89±0,08 0,86±0,02 0,86±0,03 f2 0,35±0,05 0,3±0,18 0,33±0,1 0,32±0,12 w ognisku DDR D1 [^m2/s] 3,26±0,36 3,08±0,05 3,59±0,75 3,48±0,42 a1 1,02±0,09 0,94±0,16 0,94±0,09 0,97±0,10 f1 0,72±0,10 0,61±0,27 0,55±0,1 0,58±0,09 D2 [^m2/s] 0,17±0,03 0,18±0,02 0,17±0,05 0,18±0,05 a2 0,85±0,04 0,90±0,08 0,98±0,28 0,92±0,11 f2 0,28±0,11 0,39±0,27 0,45±0,1 0,42±0,09 139 Dyskusja Rozdział 9. 9.1. Wpływ metki fluorescencyjnej na dynamikę białka fuzyjnego W mikroskopowych badaniach mobilności wybranego białka, bądź struktury w żywych komórkach, stosuje się białka fuzyjne. Składają się one z białka będącego obiektem badań, oraz połączonej z nim białkowej metki fluorescencyjnej. Dzięki temu zabiegowi możliwa jest detekcja in vivo lokalizacji wybranego białka, ale także monitorowanie jego lokalizacji w czasie. Zazwyczaj w tym celu stosuje się techniki monitorujące zmianę intensywności fluorescencji metki fluorescencyjnej z wybranego obszaru (jak w technikach FLIP czy FRAP), co pozwala mierzyć mobilność białka fuzyjnego. Dyskusji wymaga jednak wpływ użytej metki fluorescencyjnej na dyfuzję badanego białka. Bardzo często w pracach podejmujących próbę opisu mobilności wybranych białek stosuje się jedynie porównanie jakościowe, jak na przykład w publikacji (Mortusewicz & Leonhardt, 2007). We wspomnianej pracy autorzy porównują mobilność dwóch znakowanych białek, GFP-XRCC1 oraz RFP-PCNA, stosując porównanie wykresów z doświadczeń FRAP i FLIP. Na podstawie uzyskanych krzywych wskazują, że znakowane białko XRCC1 szybciej gromadzi się w miejscu uszkodzenia niż znakowane białko PCNA, a także szybciej oddysocjowuje od miejsca gromadzenia. Poza analizą porównawczą autorzy nie podejmują się zadania oszacowania tempa dyfuzji tych białek w nukleoplazmie. Białka fuzyjne często zawierają metkę fluorescencyjną, która wielkością przewyższa badane białko. Można zatem przypuszczać, że białko fuzyjne dyfunduje wolniej niż białko, które nie jest zaopatrzone w metkę. Tabela 9.2. przedstawia zestawienie długości łańcuchów aminokwasowych i masę wybranych białek naprawczych, które były Tabela 9.2. Długość łańcucha aminokwasowego i masa użytych metek fluorescencyjnych oraz badanych białek. Mutanty XRCC1(oprócz XRCC1P537STOP) mają podobną masę do XRCC1 typu dzikiego. białko długość łańcucha masa [kDa] GFP 238 26,89 eGFP 239 26,95 RFP 225 25,93 mCherry 236 26,73 XRCC1 633 69,48 XRCC1P537STOP 537 58,18 HP1ß 185 21,42 HP1a 191 22,23 HP1y 183 20,81 140 Rozdział 9. Dyskusja przedmiotem badań opisanych w niniejszej pracy, a także wykorzystywanych białek fluorescencyjnych. W porównaniu tym skupiłem się na długości łańcucha aminokwasowego oraz masy cząsteczkowej (masę wyznaczono przy użyciu programu dostępnego pod adresem: https://www.bioinformatics.org/sms/prot_mw.html). HP1 jest mniejszym białkiem niż zastosowane w połączeniu z nim metki fluorescencyjne, natomiast XRCC1 przewyższa wielkością i masą ponad dwukrotnie białko GFP lub RFP. W przypadku rozważań mobilności badanego układu w roztworze, gdzie zaniedbywane jest oddziaływanie z rozpuszczalnikiem, wielkość cząsteczki odgrywa decydujące znaczenie. W przybliżeniu można uznać za równaniem Stockesa-Einsteina, że dwukrotne zwiększenie wielkości cząsteczki spowoduje dwukrotne zmniejszenie wartości współczynnika dyfuzji. W komórce jednak na ruchliwość białka wpływ ma szereg czynników. Przede wszystkim białka mają szereg partnerów, z którymi oddziałują. Zagęszczenie molekularne w komórce także wpływa na to, że niektóre rejony nie będą całkowicie dostępne dla białka. Zatem otoczenie molekularne oraz oddziaływanie z innymi składnikami komórki mogą mieć dodatkowy wpływ na mobilność białka połączonego z metką fluorescencyjną. Aby oszacować wpływ metki fluorescencyjnej na dynamikę badanego białka przeprowadziłem pomiary FCS w dwóch obszarach komórki - w nukleoplazmie i cytoplazmie. Tu pojawił się kolejny problem techniczny - możliwość modyfikacji mierzonych parametrów fluorescencji GFP przez obecność pochodnych flawin w komórce (w cytoplazmie, jak i w jądrze komórkowym) (Giancaspero et al., 2013; Croce & Bottiroli, 2015). Prowadząc pomiary, czy to w cytoplazmie czy w nukleoplazmie, należało pamiętać o zjawisku autofluorescencji pochodnych flawin występujących w tych obszarach komórki. Niestety widma absorbcji oraz emisji pochodnych flawin Rycina 9.1. Widma emisji GFP i pochodnych flawin przy linii wzbudzenia 488 nm. Pionowy pas reprezentuje zakres widma zbierany w czasie pomiaru. Wykres emisji GFP przygotowany na podstawie danych z chroma.com; widmo emisji pochodnych flawin na podstawie Benson et all. 1979. 141 Dyskusja Rozdział 9. i nukleotydów flawinowych (w formie utlenionej) mają zakres podobny do widm GFP (Benson, Meyer, & G.M., 1979). Nieuwzględnienie tego zjawiska w analizie pomiarów FCS z pewnością generowałoby błędy. Średni współczynnik wzbudzenia pochodnych flawin wynosi 11300 M'1cm'1, a wydajność kwantowa wynosi 30%, co w porównaniu do właściwości eGFP przekłada się na 10 krotnie mniejszą jasność pojedynczej cząsteczki pochodnej flawiny od cząsteczki GFP. Zatem, jeśli liczba cząsteczek eGFP i pochodnych flawin byłaby porównywalna to można by wnioskować, że w pomiarach FCS białka GFP prowadzonych w cytoplazmie, wpływ fluorescencji flawin byłby zaniedbywalny. Dodatkowo w celu rozróżnienia sygnałów pochodnych flawin i GFP w pomiarach zwróciłem uwagę na trzy kwestie. Po pierwsze, w przypadku rozważania dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD) jego masa cząsteczkowa jest około sześćdziesiąt razy mniejsza od białka fuzyjnego eGFP - HPlß (masa cząsteczkowa FAD - 785 Da, a masa cząsteczkowa eGFP-HPlß - 48,4 kDa (eGFP - 26,95 kDa + HP1 - 21.42 kDa)). W komórce FAD może dyfundować samodzielnie lub jako część białka. Rozważając wyłącznie swobodny ruch cząsteczek FAD należałoby się spodziewać w analizie FCS dodatkowej subpopulacji w okolicy czasu t = 100 |is. FAD (tylko forma utleniona) dyfundujący jako grupa prostetyczna białka dawałby też wkład do krzywych przy dłuższych czasach korelacyjnych. Możliwe, że lokalne stężenie pochodnych flawin jest na tyle niskie, że w połączeniu z mniejszą intensywnością ich fluorescencji od GFP może nie być wystarczające, aby sygnał tych cząsteczek miał znaczący wpływ na kształt krzywej FCS (autofluorescencja flawin nie jest wykrywalna w jądrach komórkowych przy typowych pomiarach). Dodatkowo, aby wykluczyć możliwy wpływ pochodnych flawin przeprowadziłem pomiary FCS w cytoplazmie w komórkach nietransfekowanych. Średnia wartość fluktuacji z takich pomiarów była następnie traktowana jako poziom odcięcia („offset”) już we właściwych doświadczeniach. W ten sposób, nawet szczątkowy przyczynek sygnału od pochodnych flawin był usuwany. Podsumowując, można wnioskować, iż głównym czynnikiem wpływającym na wynik pomiaru fluktuacji sygnału z komórki w zakresie spektralnym od 500 - 540 nm jest fluorescencja metek fluorescencyjnych w znakowanych białkach eGFP-HP1 i eGFP-XRCC1, a wpływ pochodnych flawin jest zaniedbywalny. Pomiary mobilności wolnej metki fluorescencyjnej były prowadzone w komórkach HeLa, z przejściową ekspresją białka. W związku z tym, że swobodna metka eGFP nie powinna oddziaływać ze składnikami komórki, w analizie założyłem istnienie jednej 142 Rozdział 9. Dyskusja populacji cząsteczek białka. Do krzywych autokorelacji z pomiarów w cytoplazmie i nukleoplazmie dopasowałem model anomalnej dyfuzji dla jednej populacji z uwzględnieniem subpopulaccji trypletowej. Uzyskany współczynnik dyfuzji (D1) oraz współczynnik anomalności (a1) wskazują na bardzo zbliżoną mobilność białka eGFP w obu obszarach komórki (D1cytop. = 27,12 ± 2,21 p,m2/s oraz D1nukleop = 26,9±4,53 p,m2/s). Zbadałem również możliwość istnienia dwóch subpopulacji białka fluorescencyjnego w cytoplazmie. Do obu zbiorów krzywych dopasowałem model anomalnej dyfuzji zawierający dwie składowe. Uzyskane wartości parametrów dopasowania także wskazują na istnienie jednej populacji cząsteczek eGFP (f1cytopl(2) = 0,96±0,04 oraz f1nukleop(2) = 0,97±0,02), pomimo użycia bardziej rozbudowanego modelu. Wartości współczynników dyfuzji dla pierwszej, przeważającej subpopulacji wynoszą kolejno: w cytoplazmie: D1cyto = 32,00±3,63 p,m2/s oraz w nukleoplazmie: D1nukleo = 32,75±4,01 p,m2/s. Współczynniki anomalności dyfuzji a (wszystkie powyżej 1) wskazują, że GFP nie ma miejsc wiązania w cytoplazmie ani w jądrze (takie oddziaływania hamowałoby dyfuzję), a jego mobilność sprowadza się w przybliżeniu do dyfuzji prostej. Tabela 9.3. Zestawienie wybranych parametrów dopasowania modelu jedno- i dwuskładowej anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej dla swobodnego białka eGFP w cytoplazmie i nukleoplazmie komórek HeLa. Dopasowania modelów do pomiarów FCS metki eGFP w komórce w cytoplazmie w nukleoplazmie 1 subpopulacja 2 subpopulacje 1 subpopulacja 2 subpopulacje Di [^m2 /s] 27,12 ± 2,21 32,00 ± 3,63 26,94 ± 4,53 32,75 ± 4,01 ai 1,19 ± 0,03 1,11 ± 0,09 1,19 ± 0,10 1,14 ± 0,07 fi 1,00 ± 0,00 0,96 ± 0,04 1,00 ± 0,00 0,97 ± 0,02 D2 [^m2 /s] 1,98 ± 0,31 2,05 ± 0,37 a2 0,94 ± 0,10 0,92 ± 0,08 f2 0,04 ± 0,04 0,03 ± 0,02 22 ± 8 22 ± 7 29 ± 8 26 ± 7 R2 0,98 ± 0,00 0,99 ± 0,00 0,98 ± 0,00 0,99 ± 0,00 Uzyskane wyniki świadczą o wysokiej mobilności białka w obu obszarach. Wyniki podobnych pomiarów współczynników dyfuzji swobodnego eGFP w jądrze komórkowym były także opublikowane przez kilka grup badawczych. W publikacji przygotowanej przez grupę Prof. Jörg’a Langowskiego (Dross et al., 2009) autorzy 143 Dyskusja Rozdział 9. oszacowali współczynnik dyfuzji dla mono-, di- , tri- i tetrameru eGFP w jądrach różnych typów komórek, w tym w komórkach linii HeLa. Zgodnie z przewidywaniami wraz ze wzrostem wielkości oligomeru eGFP mobilność maleje, natomiast między różnymi liniami komórkowymi w granicach niepewności uzyskane wartości są podobne. Dla komórek linii HeLa współczynnik dyfuzji dla monomeru wynosi około 51 ^m2/s. W późniejszej pracy (Baum et al., 2014) autorzy przy użyciu techniki msFCCS dla GFP wyznaczyli współczynnik dyfuzji D = 32 ± 3 ^m2/s (Tabela 9.6). Podobne wyniki uzyskali autorzy pracy (Pack et al., 2006). Pomiary FCS prowadzili w komórkach HeLa w 25oC. W analizie użyli modelu prostej dyfuzji jedno- i dwu składowej. Uzyskane przez nich wyniki wskazują, że ponad 95% cząsteczek należy do pierwszej, szybkiej subpopulacji, a jej stała dyfuzji wynosi 24,2±1,3 ^m2/s. Przedstawione przez mnie wyniki są bardzo zbliżone do rezultatów uzyskanych przez wymienionych powyżej autorów. Niższa stała dyfuzji podana przez (Pack et al., 2006) w porównaniu do uzyskanego przez mnie współczynnika dyfuzji może być tłumaczona inną temperaturą układu w czasie pomiaru. Ja prowadziłem pomiary w 37oC, natomiast autorzy pracy (Baum et al., 2014) swoje doświadczenia prowadzili w temperaturze pokojowej (25 oC). Oprócz pomiarów mobilności samej metki fluorescencyjnej dokonałem analogicznych kontrolnych pomiarów dla układu eGFP-HPlß w cytoplazmie. Zakładałem, że HP1 nie wykazuje znaczącego powinowactwa do innych składników występujących w cytoplazmie, które wpłynęłyby na jego mobilność. Uzyskany wynik, D1eGFP HP1 cyto = 26 ^m2/s (Tabela 9.7), wskazuje, że białko z metką w porównaniu do samej metki wykazuje tylko nieznacznie mniejszą mobilność. Pozornie jest to zaskakująca obserwacja. Wydawać by się mogło, że dwukrotnie większa masa badanego znakowanego białka eGFP-HPlß w porównaniu do wielkości samej metki eGFP spowoduje znacznie mniejszą jego mobilność w cytoplazmie. Jedyne czynniki, które mogą tu wpływać na dyfuzję takiego białka to zagęszczenie molekularne i ograniczone błonami przedziały wewnątrzkomórkowe. Powodują one, że wielkość białka nie musi być głównym czynnikiem determinującym jego mobilność w środowisku komórkowym. W nukleoplazmie współczynnik dyfuzji pierwszej, szybkiej subpopulacji z pomiarów dla eGFP-HPlß wyniósł D1eGFP HP1 nukleo = 4,77 |im2/s (Tabela 9.8). Ponad sześciokrotnie niższa wartość stałej dyfuzji białka fuzyjnego w porównaniu z samą metką w nukleoplazmie świadczyć może o większym zagęszczeniu molekularnym, albo o większym wpływie oddziaływania białka z otoczeniem na jego mobilność. Wpływ metki 144 Rozdział 9. Dyskusja fluorescencyjnej został bardzo dokładnie przeanalizowany w obliczeniach w pracy (Müller et al., 2009). Autorzy przedstawili w materiałach dodatkowych do publikacji wyniki obliczeń dla białka GFP oraz HP1 w wodzie, w komórce oraz ich współczynniki dyfuzji, gdy występują w różnych wariantach (Tabela 9.4). Wartości parametrów z tabeli wskazują, że pomimo podobnej wielkości białka GFP i HP1 poruszają się z różnymi współczynnikami dyfuzji w wodzie, jak i w cytoplazmie. GFP pomimo, że jest większe, porusza się szybciej. Białko HP1 z metką porusza się tylko nieznacznie wolniej w cytoplazmie niż to samo białko z przyłączoną metką GFP. W wynikach obliczeń symulacyjnych w komórce różnica jest bardzo niewielka (Dhp1= 24,4 |im2/s, a Dhp1- gfp = 22,3 ^m2/s). Efekt ten może wynikać z częstych oddziaływań białka HP1 z chromatyną, tworzenia dimerów lub oddziaływań z innymi białkami przez co wpływ metki fluorescencyjnej na mobilność białka HP1 staje się znikomy. Oszacowane przez mnie współczynniki dyfuzji na podstawie pomiarów FCS dla wolnej metki fluorescencyjnej oraz znakowanego białka HP1 są zgodne z wynikami opublikowanymi przez (Müller et al., 2009) i potwierdzają tezę, że nie jest obserwowany wyraźny wpływ przyłączonego białka fluorescencyjnego na mobilność HP1. Analogiczne, kontrolne doświadczenie przeprowadziłem dla białka mRFP. Wartość współczynnika f1nukleo wynosi 0,93±0,08 (Tabela 9.5) co oznacza, że zdecydowana większość cząsteczek białka należy do pierwszej, szybciej dyfundującej subpopulacji. Biorąc pod uwagę niską wartość współczynnika f2 (Tabela 9.5) opisującego udział cząsteczek należących do drugiej, wolniejszej subpopulacji oraz zakres niepewności tego współczynnika można uznać, że takich cząsteczek w układzie jest marginalna liczba. Parametr a wskazuje, że zapewne jest to dyfuzja prosta - czyli nie obserwujemy zwolnienia tempa dyfuzji, która byłaby objawem potencjalnego oddziaływania białka z otoczeniem. Oszacowanie mobilności monomeru RFP podjęli się autorzy pracy (Baum et al., 2014) z grupy profesora Rippe z Heidelbergu. Otrzymana przez mnie wartość współczynnika dyfuzji dla mRFP jest zgodna z oszacowaną przez nich wielkością (31,7±7 |im2/s) uzyskaną przez tych autorów przy użyciu metody FRAP (Tabela 9.6.). Ponadto współczynniki dyfuzji dla monomerów białek GFP i RFP, które zostały wyznaczone przez grupę profesora Rippe przy użyciu różnych technik, są bardzo do siebie zbliżone. Znalezione w literaturze współczynniki dyfuzji dla obu białek fluorescencyjnych w nukleoplazmie potwierdzają poprawność przeprowadzonych przez mnie doświadczeń 145 Dyskusja Rozdział 9. i obliczeń. Jednak, co jest istotne, obie uzyskane stałe dyfuzji są kilkukrotnie wyższe niż wartości współczynników dyfuzji dla badanych białek fuzyjnych w jądrze komórkowym co świadczy o licznych oddziaływaniach HP1 z innymi białkami w jądrze. Można również zakładać, że z kolei wpływ podobnego wielkością białka fluorescencyjnego (mRFP) na dynamikę XRCC1, które jest około 3,5 razy większe od HP1, będzie również zaniedbywalny, a istotne są oddziaływania z różnymi partnerami białkowymi. Jedną z przesłanek sugerujących możliwe oddziaływanie XRCC1 z chromatyną, poza czasem kiedy uczestniczy w procesie naprawy DNA, są wyniki moich doświadczeń FCS. Wskazują one, że istnieje w jądrze subpopulacja białka XRCC1, która może wiązać się z chromatyną. Rozwinięcie tego zagadnienia przedstawię w rozdziale dyskusji 9.4.2. 146 Rozdział 9. Dyskusja 9 Ą. Hydrodynamic calculations for HP1 and GFP-tagged HP1. GFP HP1 (HPI)i GFP-HP1 GFP- HP1HP1 (GFP- HP1); M (kDa) 25.6 21.4 42.8 48.5 71.3 99.8 V (kDa) 0.736 0.726 0.726 0.729 0.73 0.73 /W s ‘) 4.810" 6.110" 7.5 ■ 10 11 6.610" 7.6-10" 8.5-10'“ On20 ((im* s ') 103.0 76.1 61,2 69.8 61.4 54.6 «o.'ii (Mm2 s1) 33.1 24.4 19.6 22.3 19.6 17.5 9.5 Wyniki modelu dla mRFP w jądrze komórkowym Di[nm2 /s] 31,73 + 2,98 «i 1,10 + 0,08 fi 0,93 + 0,08 D2 [|im2 /s] 1,20 + 0,19 »2 0,83 + 0,01 h 0,07 ± 0,08 90 + 17 R2 0,82 + 0,05 9.0 Table 1 | Mobility parameters obtained for different tracer molecules in vitro and in the nucleus of living cells. Tabela 9.4. Zestawienie wybranych parametrów dla białek GFP oraz HP1. (M-masa cząsteczkowa, v - częściowa objętość właściwa, f - współczynnik tarcia, D - współczynnik dyfuzji w 250C.). Wartości zostały wyznaczone na podstawie obliczeń hydrodynamicznych w programie VMD. Tabela zaczerpnięta z pracy Muller et al. 2009. Tabela 9.5. Zestawienie wybranych parametrów z dopasowania modelu do krzywej dla swobodnego mRFP w nukleoplazmie na podstawie pomiarów opisanych w tej rozprawie. Tabela 9.6. Wartości współczynników dyfuzji dla mono-, di- i pentamerów białka GFP i RFP wyznaczone przy użyciu technik msFCCS i FRAP. Tabela zaczerpnięta z pracy Baum i inni. 2014. 147 D(|im2s ’) msFCCS in living cells (nucleus) GFP, 32 ± 3+ GFP3 14±2+ GFPS V±f FRAP in living cells (nucleus) RFP, 31 ± 71'5 gfp3 15±4t'$ GFPS 10 ± 1*'11 Dyskusja Rozdział 9. 9.2. Zbliżona mobilność wszystkich znakowanych paralogów białka HP1 w komórce Oszacowanie mobilności białka HP1 w nukleoplazmie komórek nie podanych działaniu czynników uszkadzających DNA jest pierwszym krokiem na drodze do opisu jego zachowania w miejscu akumulacji w obszarze prowadzonej naprawy DNA. Jest to swego rodzaju punkt odniesienia, z którym można porównać kolejne doświadczenia obserwując czy zmierzone wartości parametrów opisujących mobilność białka HP1 ulegają zmianie. Rozważając mobilność białka HP1 w jądrze komórkowym należy przede wszystkim wziąć pod rozwagę czynniki wpływające na jego dyfuzję. Najważniejsze z nich to zagęszczenie molekularne ośrodka oraz liczne miejsca wiązania dla HP1 jakie występują w jądrze (zwłaszcza w heterochromatynie). Aby oszacować jak bardzo sam ośrodek, jakim jest wnętrze komórki, wpływa na mobilność białka przy ograniczonej możliwości jego potencjalnego wiązania się z innymi składnikami przeprowadziłem pomiary w cytoplazmie, które opisuję w pierwszym podrozdziale. W drugim podrozdziale omawiam już właściwe pomiary wszystkich paralogów w nukleoplazmie i ogniskach naprawczych. 9.2.1. Mobilność znakowanych paralogów HP1 w cytoplazmie jako kontrola mobilności HP1 Przeprowadzenie pomiarów mobilności paralogów HP1 w cytoplazmie miało na celu sprawdzenie wpływu zagęszczenia molekularnego na mobilność białka fuzyjnego. Białko HP1 jest białkiem jądrowym o niewielkiej masie i fałduje się już w cytoplazmie (Cooper, 2000; Zhang & Ignatova, 2011). Według doniesień literaturowych gęstość molekularna cytoplazmy może być porównywalna do nukleoplazmy (Guigas, Kalla, & Weiss, 2007). Jeżeli przyjmiemy takie założenie to wpływ na mobilność białka fuzyjnego w cytoplazmie będzie miało jedynie otoczenie (zagęszczenie molekularne, błony wewnętrzne) natomiast ewentualne oddziaływanie z innymi składnikami cytoplazmy będzie marginalne. Główny partner, z którym oddziałuje HP1 (ogony histonowe; H3K9me3), występuje tylko w jądrze komórkowym, zatem w jądrze komórkowym można spodziewać się mniejszej mobilności HP1 niż w cytoplazmie. Tabela (Tabela 9.7) przedstawia syntetyczne zestawienie uzyskanych przez mnie wyników mobilności paralogów białka HP1 z metką fluorescencyjną eGFP 148 Rozdział 9. Dyskusja Tabela 9.7. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywej autokorelacyjnej dla pomiarów FCS wszystkich paralogów białka HP1 (HP1a, HPlß, HP1y) w cytoplazmie. Wyniki analizy dla białka eGFP-HPi w cytoplazmie HPia HPIy HPiß Di [pm2 /s] 22,7 ± 5,03 27,5 ± 4,75 26,04 ± 3,58 ai 0,8 ± 0,18 0,85 ± 0,11 0,84 ± 0,08 fi 0,95 ± 0,21 1 ± 0,01 0,99 ± 0,01 D2 [pm2 /s] 1,25 ± 0,44 1,47 ± 0,39 1,42 ± 0,2 a2 0,92 ± 0,19 1 ± 0,15 0,96 ± 0,01 f2 0,05 ± 0,21 0 ± 0,01 0,01 ± 0,01 2 ± «XI 2 ± 5 5±4 R2 0,94 ± 0,21 1 ± 0,01 0,99 ± 0,02 w cytoplazmie. W analizie danych użyłem modelu dwuskładowej anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Zdecydowałem się na wybór tak rozbudowanego modelu na podstawie kilku założeń. Przede wszystkim z dostępnej literatury wiadomo, że HP1 oddziałuje z chromatyną w jądrze komórkowym, ale nie ma danych mówiących o specyficznych oddziaływaniach z innymi białkami w cytoplazmie. Zatem wydaje się, że właściwym posunięciem byłby zastosowanie modelu zakładającego jedną subpopulację. Niemniej nie można wykluczyć, że HP1 oddziałuje w cytoplazmie z innymi dostępnymi elementami komórkowymi. Potencjalny przyczynek do rejestrowanego sygnału od pochodnych flawin został ograniczony, o czym wspomniałem powyżej (Dyskusja 9.1). Rozważając te kwestie zdecydowałem się użyć bardziej rozbudowanego modelu. Założyłem, że jeśli z dopasowania takiego modelu otrzymałbym dwie subpopulacje, których stosunek ilościowy byłby porównywalny, oznaczałoby to pojawienie się drugiej niespodziewanej puli cząsteczek HP1, lub innego źródła fluorescencji, którego emisja była rejestrowana. W przeciwnym wypadku, kiedy na podstawie dopasowania otrzymałbym wyniki sugerujące istnienie tylko jednej puli z wysokim współczynnikiem dyfuzji, potwierdziłoby to moje przypuszczenia. W analizie krzywych posłużyłem się programem Fluctuation Analyzer 4G. O wyborze zdecydowały jego liczne zalety, w tym możliwość użycia poprawki na fotoblaknięcie oraz poziom sygnału tła, jak również możliwość korelowania danych oraz dopasowania wybranego modelu do krzywych w sposób zbiorczy. 149 Dyskusja Rozdział 9. Tak jak przypuszczałem, pomimo wykorzystania dwuskładowego modelu wyniki świadczą o tym, że w cytoplazmie liczba molekuł należących do drugiej wolniejszej subpopulacji HP1 jest znikoma. Współczynniki dyfuzji uzyskane dla przeważającej pierwszej, tzn. szybkiej subpopulacji dla kolejnych paralogów HP1 wynoszą: DeGFP-HPia = 22,7±5,0 ^m2/s, DeGFP-HPiy = 27,5±4,8 |im2/s, DeGFP-HPiß = 26,0±3,6 |im2/s. Wskazują one na dużą mobilność HP1 oraz brak oddziaływania z innymi składnikami cytoplazmy. Wartości współczynników określających stopień anomalności dyfuzji - aeGFP- HPla = 0,80±0,18; aeGFP-HPly = 0,85±0,11; aeGFP -HPlß = 0,84±0,08 - wskazują, że wysokie zagęszczenie molekularne oraz błony wewnętrzne wpływają na mobilność wszystkich paralogów HP1. Badania mobilności HP1 w cytoplazmie były opisywane już wcześniej. W pierwszej pracy (Schmiedeberg et al., 2004) autorzy przy użyciu FCS zmierzyli mobilność białka eGFP-HPla w cytoplazmie komórek C59r. W analizie użyli jednoskładowego modelu prostej dyfuzji w trzech wymiarach, a wartość współczynnika dyfuzji wyniosła DeGFP-HPla = 26±2 ^m2/s. W drugiej pracy (Müller et al., 2009) autorzy uzyskali następujące współczynniki dyfuzji dla HP1 w jądrze komórkowym: DeGFP-HPla = 23,4±2,4 |im2/s, DeGFP HPlß = 24,3±5,6 |im2/s. Pomiary wykonali w komórkach linii 3T3. W analizie użyli modelu anomalnej dyfuzji z jedną składową. Współczynniki anomalności wyniosły kolejno: aeGFP HPla = 0,83±0,05; aeGFP- HPlß = 0,74±0,05. Pomimo korzystania z różnych modeli matematycznych, oraz prowadzenia doświadczeń na innych komórkach, wyniki uzyskane przeze mnie są zgodne z rezultatami uzyskanymi we wcześniejszych pracach, w szczególności z wynikami w pracy (Müller et al., 2009), gdzie wartości współczynników dyfuzji zgadzają się z dokładnością do wyznaczonych zakresów niepewności. Ponadto w materiałach dodatkowych powyższej pracy autorzy zamieścili wyniki obliczeń hydrodynamicznych dla eGFP-HPl w cytoplazmie, w których wartość współczynnika dyfuzji dla białka z metką wynosi 22,3 |im2/s. Średnia liczba cząsteczek białka fuzyjnego zarejestrowana przeze mnie w czasie pomiarów była niska - we wszystkich przypadkach średnia liczba cząsteczek przebywających w objętości detekcji w czasie pomiaru FCS była zbliżona do 5. Niskie stężenie białka z metką (tak niskie, iż eGFP-HP1 na standardowych obrazach konfokalnych nie było w ogóle widoczne) umożliwiło bardzo dokładne przeprowadzenie pomiarów FCS. Jakość uzyskanych krzywych FCS pozwoliła bardzo dokładnie dopasować modele do krzywych. 150 Rozdział 9. Dyskusja 9.2.2. Mobilność znakowanych paralogów HP1 w nukleoplazmie Jedną z najważniejszych funkcji białka HP1 jest tworzenie i stabilizacja heterochromatyny - rejonów chromatyny o wysokim zagęszczeniu włókien. Proces ten odbywa się poprzez specyficzne wiązanie się białka (przez domenę ‘chromo’) z podwójnie lub potrójnie metylowaną lizyną 9 w histonie trzecim (H3K9me2/3). Dodatkowo wykazano, że białko to oddziałuje z wieloma składnikami jądra komórkowego. Białko HP1 posiada trzy paralogi (a, ß, y), które są konserwatywne dla większości eukariontów i choć wykazują podobną strukturę, ich lokalizacja w obrębie jądra komórkowego nie jest taka sama (Kwon & Workman, 2008). Paralogi a i ß głównie znajdują się w obszarze heterochromatyny, podczas gdy HPly lokalizuje się głównie w euchromatynie. HP1 bierze także aktywny udział w naprawie uszkodzeń DNA. Pierwsze komunikaty opisujące gromadzenie się tego białka w miejscu uszkodzenia fotooksydacyjnego nici DNA pochodzą z mojego macierzystego laboratorium (Wiernasz, 2004; Zarebski, 2008; Zarebski et al., 2009). W kolejnych pracach wykazano, że wszystkie paralogi HP1 są rekrutowane do miejsca uszkodzeń DNA - oksydacyjnych, jak i indukowanych światłem UV (Luijsterburg et al., 2009). Ruchliwość tego białka oraz zmiany jego rozkładu przestrzennego w obrębie jądra komórkowego bezpośrednio wpływają na wiele procesów jądrowych. Z tego też powodu jego mobilność i preferencje oddziaływania są od kilkunastu lat obiektem ciągłych badań. Niniejsza praca wpisuje się w ten nurt. Głównym celem prowadzonych doświadczeń nad białkiem HP1 było podjęcie próby oszacowania jego mobilności w ogniskach naprawy DNA, w których HP1 gromadzi się w odpowiedzi na lokalne uszkodzenie DNA (w tym na skutek naświetlenia światłem widzialnym (Solarczyk et al., 2012). Zamieszczona poniżej tabela (Tabela 9.8) przedstawia zestawienie wyników dopasowania dwuskładowego modelu dyfuzji anomalnej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej dla wszystkich paralogów białka HP1 w nukleoplazmie. Przedstawione wartości to średnie ze zbioru poszczególnych parametrów z dopasowania dla wszystkich krzywych uwzględnionych w analizie. Stosunek ilościowy pomiędzy obiema postulowanym subpopulacjami we wszystkich przypadkach jest bardzo podobny i wynosi około 3,76:1 dla HPla, 2,85:1 dla HPly oraz 4,56:1 dla HPlß. Współczynniki dyfuzji dla pierwszej szybszej subpopulacji wynoszą 151 Dyskusja Rozdział 9. kolejno DiHP1a = 5,27±0,65 ^m2/s; Dihp1y = 5,08±0,42 ^m2/s; DiHP1ß = 4,77±0,64 ^m2/s. Współczynniki dyfuzji dla drugiej, wolniejszej subpopulacji są ponad rząd wielkości mniejsze i wynoszą: D2HP1a = 0,33±0,09 |im2/s; D2HP1y = 0,27±0,07 |im2/s; D2HP1ß = 0,26±0,06^m2/s. Pierwszą, szybszą subpopulację występującą w mojej analizie utożsamiam z pulą białka HP1, która swobodnie dyfunduje w obszarze jądra komórkowego. Jej ruch ograniczony jest zapewne tylko przez zagęszczenie molekularne występujące w jądrze komórkowym. Druga subpopulacja wyznaczona na podstawie modelu opisuje najprawdopodobniej tę subpopulację cząsteczek HP1, która wiąże się z chromatyną. HP1 wiąże się z chromatyną poprzez oddziaływanie chromodomeny z H3K9me3. Tabela 9.8. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacyjnych dla pomiarów FCS wszystkich paralogów białka HP1 (HPla, HPlß, HPly) w nukleoplazmie. Wyniki analizy dla eGFP-HPi w jądrze komorkowym HPia HPIy HPiß Di [^m2 /s] 5,27 ± 0,65 5,08 ± 0,42 4,77 ± 0,64 ai 0,85 ± 0,11 0,78 ± 0,13 0,81 ± 0,11 fi 0,79 ± 0,10 0,74 ± 0,06 0,82 ± 0,07 D2 [^m2 /s] 0,33 ± 0,09 0,27 ± 0,07 0,26 ± 0,06 a2 1,09 ± 0,24 0,99 ± 0,16 1,00 ± 0,19 f2 0,21 ± 0,10 0,26 ± 0,06 0,18 ± 0,07 29 ± 12 51 ± 14 77 ± 42 R2 0,99 ± 0,00 0,96 ± 0,00 0,98 ± 0,01 Ponadto zbadałem dopasowanie bardziej rozbudowanego modelu zakładającego istnienie trzech subpopulacji. Analiza ta była podyktowana możliwym różnym mechanizmem wiązania HP1 do chromatyny w zależności od obszaru jądra komórkowego (hetero- i euchromatyna). Możliwym jest scenariusz, w którym HP1 w obszarze heterochromatyny jest mniej ruchliwy niż w euchromatynie. Zatem istnieją przesłanki, że rozważając całe jądro można się spodziewać trzech subpopulacji: jednej swobodnie poruszającej się w obrębie jądra i dwóch o różnej mobilności w zależności od stopnia zagęszczenia chromatyny. Niestety, w moich doświadczeniach z powodu wyboru do doświadczeń jedynie komórek o niskim poziomie ekspresji białka fuzyjnego rozróżnianie obszarów o różnym stopniu zagęszczenia chromatyny było niemożliwe (standardowe 152 Rozdział 9. Dyskusja obrazy konfokalne rozkładu białka HP1 nie wskazywały wyraźnie obszarów eu- i heterochromatyny). Warto też nadmienić, iż obszary eu- i heterochromatyny w komórkach ludzkich nie są tak wyraźnie oddzielone od siebie i rozróżnialne jak np. w komórkach gryzoni, w których często bada się zjawiska zachodzące w heterochromatynie. Zatem jest bardzo prawdopodobne, że obszar detekcji pomiarowej w opisanych w niniejszej pracy pomiarach obejmował zarówno małe obszary eu- jak i heterochromatyny. Wyniki dopasowania trójskładowego modelu w porównaniu do modelu dwuskładowego przedstawia tabela 9.9. Tabela 9.9. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwu lub trzyskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywej autokorelacyjnej dla pomiarów FCS białka HP1 w nukleoplazmie. eGFP-HPlß w nukleoplazmie Model 2 subpopulacje 3 subpopulacje Di [^m2 /s] 4,77 ± 0,64 4,90 ± 0,74 ai 0,81 ± 0,11 0,87 ± 0,12 fi 0,82 ± 0,07 0,71 ± 0,10 D2 [^m2 /s] 0,26 ± 0,06 1,07 ± 0,36 “2 1,00 ± 0,19 0,76 ± 0,12 f2 0,18 ± 0,07 0,04 ± 0,05 D3 [^m2 /s] 0,23 ± 0,06 “3 0,93 ± 0,23 f3 0,25 ± 0,15 77 ± 42 100 ± 52 R2 0,98 ± 0,01 0,98 ± 0,01 Wyniki dopasowania modelu z trzema składnikami sugerują istnienie trzeciej subpopulacji. Jej wkład ilościowy jest jednak znikomy (około 4%). W obu przypadkach największy wkład ma pierwsza, najszybsza subpopulacja f1model1 = 0,82 oraz f1model2 = 0,71, a uzyskane współczynniki dyfuzji wynoszą: D1Model1 = 4,77±0,64 ^m2/s oraz D1Model2 = 4,90±0,74 |im2/s. Zastosowanie modelu 2 (trzy subpopulacje) nie poprawiło istotnie statystycznie dopasowania. Można zatem przyjąć, że nie ma istotnych przesłanek wskazujących na istnienie znaczącej trzeciej subpopulacji. Należy jednak pamiętać, że FCS nie rozróżni dwóch subpopulacji, których dyfuzja jest bardzo do siebie zbliżona. W sytuacji, kiedy takie subpopulacje istnieją w układzie, w pomiarze FCS uzyskamy jeden współczynnik dyfuzji, będący średnią ważoną ich obu. Uzyskane przez mnie wyniki zatem nie wykluczają całkowicie występowania różnic w mobilności HP1 153 Dyskusja Rozdział 9. w różnych obszarach chromatyny, jednak można uważać, że ewentualna różnica między ich mobilnością jest relatywnie niewielka. Zagadnienie mobilności HP1 w nukleoplazmie było przedmiotem badań w kilku wcześniejszych pracach. W pierwszej kolejności warto przedstawić wyniki z jednej najstarszych prac, gdzie autorzy kompleksowo podeszli do zagadnienia mobilności białka HP1 w jądrze komórkowym (Festenstein et al., 2003). Autorzy tej pracy wykazali, że białko HP1 wykazuje dużą mobilność zarówno w obszarach hetero- jak i euchromatyny w mysich limfocytach T. Na podstawie pomiarów FRAP porównali mobilność tego białka w rejonach różniących się stopniem upakowania chromatyny. Zauważyli, że białko to porusza się nieznacznie szybciej w obszarze euchromatyny, natomiast w aktywowanych limfocytach T jego ogólna mobilność wzrastała. Ponadto ich wyniki sugerowały, że wiązanie się HP1 do chromatyny jest bardzo dynamicznym procesem, a także wskazali potencjalne istnienie dwóch subpopulacji białka - mobilną i niemobilną. Porównując krzywe FRAP pokazali, że w komórkach aktywowanych ilość mobilnego HP1 wzrasta w porównaniu do komórek nieaktywowanych. Wykazali także, że w obszarach heterochromatyny ilość białka niemobilnego jest zdecydowanie większa - co było zgodne z poglądem, że białko HP1 uczestniczy w przebudowie chromatyny i wpływa na dostęp regulatorów epigenetycznych. Późniejszą pracą, która podjęła się charakterystyki mobilności białka HP1 w komórkach, była publikacja (Schmiedeberg et al., 2004). Autorzy wykorzystali nie tylko technikę FRAP, lecz także skorzystali z techniki FCS umożliwiającej im dokładny pomiar mobilności białka i wyznaczenie współczynników dyfuzji (w komórkach HEp-2). Na podstawie doświadczeń wykazali istnienie trzech subpopulacji białka HP1 w nukleoplazmie komórek linii HEp-2. W pomiarach FCS w obszarach euchromatyny zaobserwowali pojawiające się co jakiś czas w sposób stochastyczny wysokie, krótko trwające wzrosty rejestrowanej intensywności fluorescencji, co według nich miało świadczyć o przepływaniu przez objętość detekcji wielobiałkowego kompleksu zawierającego oligomery eGFP-HPl, którego istnienie już wcześniej postulowano (Huang et al., 1998). Z analizy pomiarów FCS, gdzie zastosowano model anomalnej dyfuzji z jedną składową dla wszystkich paralogów, autorzy otrzymali następujące wartości współczynników dyfuzji dla HP1 w euchromatynie DeGFP- HP1a = 0,6±0,03 |im2/s, DeOFP-HP1y = 0,7±0,1 |im2/s, DeGFP HP1ß = 0,6±0,02 w ^m2/s. Natomiast z pomiarów FRAP prowadzonych w obszarach zarówno euchromatyny i heterochromatyny autorzy uzyskali wyniki świadczące 154 Rozdział 9. Dyskusja o istnieniu dwóch subpopulacji, szybkiej i wolnej, ale o innym stosunku ilościowym. Dla euchromatyny uzyskali relację 4:1 na korzyść szybkich cząsteczek, dla heterochromatyny 5:4 dla szybszej subpopulacji. Wyniki te świadczą o wysokiej wymianie cząsteczek pomiędzy obiema subpopulacjami w obu rejonach chromatyny, natomiast wyższa liczba cząsteczek wolnych w obszarze heterochromatyny świadczy o większej liczbie miejsc wiązania HP1. Autorzy utożsamiają szybką subpopulację z pomiarów FRAP z pulą cząsteczek HP1, której mobilność zmierzyli przy użyciu techniki FCS. Rycina 9.2. Zestawienie zarejestrowanej przeze mnie fluktuacji intensywności fluorescencji w pomiarach FCS dla znakowanego HP1ß w cytoplazmie (A,D,G) i w nukleoplazmie (B,E,H) wraz z pomiarami przedstawionymi w pracy Schmiedeberg 2004. C - Wyraźne skoki w odczycie odpowiadają dużym jaskrawo zabarwionym strukturom zawierającym HP1 o niskiej ruchliwości oznaczone strzałkami). F -pomiar w tej samej pozycji co Cpo 5 sekundowym blaknięciu. Uzyskane przeze mnie wyniki doświadczeń FCS wskazują na pewne podobieństwa z rezultatami uzyskanymi przez Schmiedeberga i współpracowników (Rycina 9.2). Jednak w zarejestrowanych przez mnie fluktuacjach intensywności fluorescencji białka 155 Dyskusja Rozdział 9. fuzyjnego eGFP-HP1 w jądrze komórkowym nie zaobserwowałem znaczących, chwilowych skoków odczytu sygnału świadczących o pojawieniu się w objętości detekcji wielobiałkowego kompleksu zawierającego HP1 z metką fluorescencyjną. W odczytach z cytoplazmy można się takich stochastycznych chwilowych wzrostów odczytów intensywności fluorescencji doszukiwać, jednak ich relatywna wysokość względem średniego odczytu nie jest tak duża jak w pracy Schmiedeberg’a. Jedną z przyczyn mógł być wybór komórek do pomiarów. Schmiedeberg używał komórek ze stabilną ekspresją białka fuzyjnego, przez co swoje pomiary przeprowadzał na komórkach o wyższm poziomie ekspresji (około 60 tysięcy odczytów na sekundę, podczas gdy w moich doświadczeniach odczyty fluorescencji wahały się w okolicach 20 tysięcy zliczeń na sekundę). Wyższe stężenie HP1 mogło spowodować zaobserowanie takich chwilowych skoków w odczycie sygnału fluorescencji świadczących o powstaniu agregatów eGFP- HP1. Wyższy średni poziom zliczeń skutkuje niższą amplitudą krzywej FCS, co może powodować gorsze dopasowanie modelu do krzywej. Analizując moje pomiary z cytoplazmy dość często obserwowałem pojawiające się gwałtowne wzrosty intensywności fluorescencji w czasie pomiaru (wyższe średnio o około 80-90%). W pomiarach mobilności HP1 w cytoplazmie z powodu bardzo niskiego stężenia, każdy większy agregat białka byłby w ten sposób widoczny. W analizie pomiarów FCS wszystkich paralogów białka HP1 autorzy pracy wykorzystali jednoskładowy model. Uzyskane przez nich współczynniki dyfuzji są około dwukrotnie wyższe od wartości współczynników dla drugiej składowej z moich wyliczeń. Dodatkowo badaną pulę HP1 przy pomocy FCS utożsamiają ze swobodnie poruszającymi się cząsteczkami HP1. Zaskoczeniem dla mnie jest brak analizy zakładającej istnienie dwóch subpopulacji. Schmiedeberg nie uwzględnił, że na wyniki ich obserwacji wpływ ma także pula cząsteczek HP1 związana z wykonującą ruchy chromatyną. Ruch włókien chromatyny jest widoczny w pomiarach FCS, a co za tym idzie także pula cząsteczek białka z nią oddziałującą także jest możliwa do zaobserwowania (szerzej możliwość pomiaru dynamiki włókien chromatyny opisuję w rozdziale Wyniki 6.6). Ostatnią pracą podejmującą próbę scharakteryzowania mobilności białka HP1 w komórce, którą chcę szerzej omówić i porównać z moimi wynikami jest publikacja grupy profesora Rippe z Heidelbergu (Müller et al., 2009). Autorzy nie tylko dokonali pomiarów mobilności wszystkich paralogów HP1 w eu- i heterochromatynie metodą FCS 156 Rozdział 9. Dyskusja w komórkach 3T3 (fibroblasty), ale także spróbowali oszacować lokalne stężenie białka oraz wyznaczyć stałą wiązania białka w różnych obszarach. W mojej ocenie jest to jedna z najbardziej kompleksowych prac wzbogacona wyliczeniami hydrodynamicznymi oraz bogatym aparatem matematycznym wykorzystanym w analizie doświadczeń. Na potrzeby dyskusji jednak skupię się tylko na części uzyskanych przez nich wyników. Tabela 9.10. poniżej przedstawia zestawienie wyników pomiarów FCS dla HPla oraz HPlß w cytoplazmie oraz w eu- i heterochromatynie. Tabela 9.10. Wyniki pomiarów dyfuzji metodą FCS dla HPla oraz HPlß w komórkach linii 3T3 (tabela zaczerpnięta z pracy K.Muller 2009). Podsumowując uzyskane pomiary FCS, ale także doświadczenia z wykorzystaniem techniki FRAP autorzy wskazali na możliwość istnienia trzech różnych miejsc wiązania HP1 w jądrze komórkowym. Pierwsze - jest to wszechobecnie występujące w chromatynie miejsce wiązania, dla którego charakterystyczny jest czas rezydencji tres < 0,2 s, drugie silniejsze miejsce wiązania występuje przede wszystkim w obszarach heterochromatyny (tres = 7 s) i ostatnie, najsilniejsze miejsce wiązania, które występuje tylko w heterochromatynie (tres = 2 min). W obszarach heterochromatyny, z racji występowania większej liczby silniejszych miejsc wiązania, stężenie cząsteczek HP1 jest wyższe. Parametry mobilności dla paralogów HP1 uzyskane przeze mnie nieznacznie różnią się od wyników uzyskanych przez grupę prof. Rippe. Główną przyczyną różnic jest wybór obszarów jądra, w których były prowadzone pomiary. Korzystając z tego, że obszary heterochromatyny (chromocentra) silnie się wyróżniają w jądrach mysich fibroblastów autorzy mogli rozróżnić pomiary prowadzone w obu typach chromatyny. W przypadku HPla uzyskany przeze mnie współczynnik dyfuzji dla pierwszej subpopulacji D1HP1a = 5,27±0,65 |im2/s jest mniejszy od wartości dla euchromatyny (D1HP1 a(euchromatyna) = 7,7 ^m2/s) oraz wyższy niż dla heterochromatyny 157 FCS measurements of HP1« and HP^lß in NIH 3T3 cells Cytoplasm* EuchromatiiV Heterochromatin+ HPla HPlß HPla HPlß HPla HPlß D, (nm2 s l) 23.4 ± 2.4 24.3 ± 5.6 7.7 ± 0.8 3.2 ± 0.8 3.9 ± 0.9 3.7 ± 0.6 a i 0.83 ± 0.05 0.74 ± 0.05 0.81 ± 0.04 0.79 ± 0.06 0.88 ±0.12 0.83 ± 0.08 d2 Gum2 s- l) — 0.21 ± 0.04 0.07 ± 0.02 0.05 ± 0.02 0.04 ± 0.01 a2 — — >1 >1 >1 >1 Dyskusja Rozdział 9. (D1HP1a(heterochromatyna) = 3,9 ^m2/s). Co więcej, gdybym założył, że mój wynik to średnia ważona współczynników dyfuzji z pracy Rippe uzyskałbym następującą średnią 7,7 ^m2/s * 0,35 + 3,9 |im2/s*0,65 = 5,23 |im2/s. W tak liczonej średniej wyższa waga dla drugiego składnika świadczyłaby, że częściej wykonywałem pomiary w heterochromatynie. Współczynniki dyfuzji dla drugiej składowej w obu przypadkach (dla eu- i heterochromatyny kolejno: D2HP1a(euchromatyna) = 0,21±0,04 |im2/s, D2HP1a(heterochr°matyna) = 0,04±0,01 ^m2/s) są niższe niż wynik uzyskany przez mnie, D2HP1a = 0,33±0,09 |im2/s). Współczynniki a dla pierwszej subpopulacji dla obu paralogów zarówno w eu- jak i w heterochromatynie są mniejsze od 1: a1HP1a(euchrom) = 0,81±0,04, a1HP1a(heterochrom) = 0,88±0,12, a1HP1ß(euchrom) = 0,79±0,06, a 1HP1 ß(heterochrom.) = o,83±0,08. Podobne wyniki uzyskałem także w analizie swoich doświadczeń: a1HP1a (nukleoplazma) = 0,79±0,10 oraz a1HP1ß(nukleoplazma) = 0,81±0,04 (Tabela 9.8). Uzyskane wyniki potwierdzają, że białko HP1 nie dyfunduje w jądrze swobodnie, a pojawienie się anomalności w jego dyfuzji może świadczyć o dużym wpływie zagęszczenia molekularnego na jego mobilność i potwierdza możliwe oddziaływanie z innymi składnikami jądra. Współczynniki a dla drugiej subpopulacji także się pokrywają. Autorzy pracy uzyskali wartości przekraczające 1, z kolei z moich wyliczeń współczynniki a dla drugiej subpopulacji we wszystkich przypadkach wynoszą 1 lub są bardzo bliskie tej wartości. Wartość a powyżej 1 sugeruje pojawienie się superdyfuzji, dyfuzji wspomaganej, co w tym przypadku należy uznać za artefakt dopasowania. Można też założyć, że druga składowa w modelu dotyczącym HP1 opisuje mobilność białka oddziałującego z chromatyną, co wskazywałoby, że obserwujemy wspomagany ruch chromatyny w wybranym kierunku. Nie wydaje się uzasadnione, aby światło wzbudzające użyte w pomiarach FCS mogło mieć znaczący wpływ na uzyskane wyniki (np. przez indukcję uszkodzeń DNA), ponieważ wartości parametrów mobilności HP1 w cytoplazmie uzyskane przeze mnie i autorów pracy bardzo dobrze się ze sobą pokrywają. Podsumowując, nieznaczne różnice między opisem mobilności HP1 podanym przez grupę Rippe i przeze mnie mogą świadczyć o różnej architekturze upakowania chromatyny w jądrach komórek 3T3 oraz HeLa. Takich różnic można się spodziewać wiedząc, iż heterochromatyna jest zorganizowana w chromocentra w komórkach mysich (3T3), ale rozproszona w licznych małych obszarach w komórkach ludzkich (HeLa). Przedstawione powyżej prace dzięki wykorzystaniu technik FRAP oraz FCS dowodzą 158 Rozdział 9. Dyskusja różnicy w mobilności HP1 w obszarach eu- i heterochromatyny, między innymi z powodu różnego powinowactwa poszczególnych paralogów HP1 do hetero- jak i euchromatyny (Festenstein et al., 2003; Schmiedeberg et al., 2004; Müller et al., 2009). Tempo wymiany pomiędzy związanym, a niezwiązanym HP1 może zależeć od stężenia lokalnego chromatyny, a także metylotransferazy histonowej Suv39h. Obie domeny HP1, zarówno CD jak i CSD są wymagane do wiązania się HP1 z chromatyną, ale ich udział, albo stopień zaangażowania jest różny w zależności od tego, czy HP1 wiąże się do eu- czy heterochromatyny (Cheutin et al., 2003). Badania wskazują, że białko HP1 pełni kluczową rolę w tworzeniu i zmianie stopnia upakowania chromatyny w przestrzeni całego jądra komórkowego. Powoduje to, że nieaktywne transkrypcyjnie rejony chromatyny są gęsto upakowane, przez co są niedostępne dla maszynerii transkrypcyjnej. 9.3. Zmniejszenie mobilności eGFP-HP1ß w ognisku naprawy DNA Do tej pory wiele prac wskazywało na ważną rolę jaką pełni białko HP1 w procesie odpowiedzi komórkowej na uszkodzenia nici DNA. Między innymi wskazywały one, że w proces naprawy zaangażowane są wszystkie paralogi HP1, a ich akumulacja jest obserwowana dla wielu rodzajów uszkodzeń w tym uszkodzeń fotooksydacyjnych i podwójnych pęknięć nici DNA wywoływanych światłem UV (Luijsterburg et al., 2009) oraz światłem widzialnym w obecności fotouczulacza (bromku etydyny) (Zarebski et al., 2009). Wszystkie badania wskazują, że lokalny wzrost stężenia HP1 w miejscu uszkodzenia DNA jest powolny, poziom zgromadzonego HP1 niski, a białko to pełni jedną z kluczowych ról w ścieżkach naprawy DNA. Pomimo wielu prac opisujących rolę białka HP1 w procesie naprawy, jak i zidentyfikowanych jego parterów, do tej pory mobilność tego białka w miejscu uszkodzenia nie była przedmiotem szczegółowych badań. Jedną z prób scharakteryzowania mobilności białka HP1 w miejscu uszkodzenia DNA była praca (Trembecka-Lucas et al., 2013). Wykazała ona, że HPlß tworzy kompleks z białkiem PCNA zarówno w miejscach prowadzonej replikacji DNA, jak i w ogniskach naprawczych. Lokalne uszkodzenie było wywoływane poprzez naświetlanie światłem o długości fali 405 nm. Niestety, te informacje są niewystarczające do oszacowania całkowitej dawki energii dostarczonej do komórki. Na podstawie doświadczeń FRAP prowadzonych w miejscu uszkodzenia autorka publikacji postuluje istnienie co najmniej 159 Dyskusja Rozdział 9. dwóch subpopulacji białka HP1 w ognisku naprawczym różniących się mobilnością. Można się zastanawiać, czy prowadzenie pomiaru FRAP w miejscu gromadzenia HP1 nie wpływa dodatkowo na lokalną mobilność białka. Użycie dużej dawki światła do wyblaknięcia fluoroforu w niewielkim obszarze jądra może także bezpośrednio wywołać uszkodzenie nici DNA lub zaburzyć sam proces naprawy. Sama technika FRAP nie pozwala, aby w sposób dokładny opisać lokalną dynamikę białka. W swoich doświadczeniach uszkodzenia wywoływałem poprzez skupienie wiązki lasera linii 470 nm na czas odpowiadający dostarczeniu do próbki 1 mJ energii. Po upływie około 1 min od naświetlania widoczne były pierwsze oznaki gromadzenia się eGFP-HP1. Po upływie około 5 min ognisko nie zwiększało swojej objętości, co świadczyło o osiągnięciu równowagi dynamicznej między pulą białka zgromadzoną w ognisku, a swobodnymi cząsteczkami na zewnątrz. Pomiary FCS prowadziłem w punkcie, gdzie wcześniej wywoływałem uszkodzenie. Uszkodzenia DNA były generowane bez udziału fotosensybilizatora. W pierwszej kolejności w analizie danych posłużyłem się moim głównym modelem, czyli dwuskładową dyfuzją anomalną z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Aby sprawdzić czy możliwe jest istnienie trzech subpopulacji w ognisku naprawczym postanowiłem dodatkowo przeprowadzić analizę zarejestrowanych danych, tym razem wykorzystując model opisujący dyfuzję anomalną z trzema subpopulacjami oraz uwzględniający populację trypletową. W analizie mobilności eGFP-HP1ß w miejscu prowadzonej naprawy uwzględniłem 16 krzywych dla dwuskładowego modelu oraz 20 krzywych dla trójskładowego modelu. Dane uzyskane z dopasowania dwuskładowego modelu wskazują, że stosunek ilościowy pomiędzy obiema postulowanymi subpopulacjami wynosi prawie 1 : 1 (f1HP1ß(ognisko) = 0,57 oraz f2HP1ß(ognisko) = 0,43. Współczynniki dyfuzji dla pierwszej subpopulacji wynosi D1HP1ß(ognisko)=3,31±0,71, z kolei dla drugiej, wolniejszej subpopulacji D2HP1ß(ognisko) = 0,16±0,07. Ich wartości są mniejsze od analogicznych parametrów uzyskanych dla eGFP-HP1ß w nukleoplazmie. Z kolei pomiędzy współczynnikami a nie ma wyraźnych różnic, co oznacza, że charakter dyfuzji jest podobny. Dla uzyskanych krzywych FCS przeprowadziłem dodatkową analizę, w której dopasowałem trójskładowy model. Możliwym wydawało mi się istnienie trzech subpopulacji w obrębie obszaru zajmowanego przez zgromadzone białko przywołane do naprawy DNA. Zakładałem, że oprócz występowania dwóch subpopulacji, które występują w nukleoplazmie w rejonie uszkodzenia może pojawić się trzecia nowa subpopulacja różniąca się mobilnością od 160 Rozdział 9. Dyskusja pozostałych, która odzwierciedlałaby zaangażowanie się cząsteczek HP1 w proces naprawy DNA. Tabela 9.11. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywej autokorelacyjnej dla pomiarów FCS białka HP1 w cytoplazmie, nukleoplazmie (dwie subpopulacje) oraz w ognisku naprawczym (dwie i trzy subpopulacje). Wyniki na podstawie modelu opisującego mobilność eGFP-HP1ß w cytoplazmie w nukleoplazmie w ognisku (2 subpopulacje) w ognisku (3 subpopulacje) D1 [^m2 /s] 26,04 ± 3,58 4,77 ± 0,64 3,31 ± 0,71 3,74 ± 0,47 «1 0,84 ± 0,08 0,81 ± 0,11 0,85 ± 0,17 0,87 ± 0,12 f1 0,99 ± 0,01 0,82 ± 0,07 0,57 ± 0,086 0,46 ± 0,17 D2 [^m2 /s] 1,42 ± 0,20 0,26 ± 0,06 0,16 ± 0,07 1,13 ± 0,78 “2 0,96 ± 0,01 1,00 ± 0,19 0,99 ± 0,21 0,75 ± 0,12 f2 0,01 ± 0,01 0,18 ± 0,07 0,43 ± 0,09 0,15 ± 0,05 D3 [^m2 /s] 0,17 ± 0,05 “3 0,81 ± 0,21 f3 0,39 ± 0,06 5 ± 4 2 4 ± 7 7 9 3 ± 5 9 130 ± 63 R2 0,99 ± 0,02 0,98 ± 0,01 0,92 ± 0,04 0,97 ± 0,05 Przeprowadzone testy omówione w rozdziale Wyniki wskazują na istnienie w rejonie gromadzenia się HP1 trzeciej subpopulacji. Liczba cząsteczek o podobnie niskiej mobilności w nukleoplazmie jest zaniedbywalna. Interesujący jest spadek wartości współczynnika dyfuzji dla pierwszej subpopulacji. Pierwszą subpopulację w obu modelach utożsamiam z cząsteczkami, które swobodnie poruszają się w obszarze nukleoplazmy, a zatem również w rejonie prowadzonej naprawy uszkodzeń DNA. Możliwym wytłumaczeniem spadku tempa dyfuzji pierwszej subpopulacji jest wzrost usieciowania chromatyny oraz zagęszczenia molekularnego w rejonie prowadzonej naprawy DNA, przez co niezwiązanym cząsteczkom jest trudniej się poruszać. Analizując wyłącznie profile intensywności fluorescencji poprowadzone przez utworzone ogniska naprawy można stwierdzić, że średnio intensywność fluorescencji eGFP-HP1 w centrum ogniska jest ponad dwukrotnie wyższa niż dla eGFP-HP1 znajdującego się w nukleoplazmie (Rycina 9.3). Zakładając, że wartość intensywności fluorescencji może być proporcjonalna do liczby cząsteczek białka fuzyjnego, można stwierdzić, że w rejonie naprawy występuje ponad dwukrotnie wyższe stężenie eGFP- 161 Dyskusja Rozdział 9. HPlß niż w otoczeniu. Widoczny nadmiar cząsteczek HP1 może sugerować pojawienie się nowych miejsc wiązania dla nich w tym regionie. Profile intensywności fluorescencji przez ogniska eGFP-HP1ß Rycina 9.3. Wykresy profili intensywności sygnału fluorescencji z obszarów akumulacji białka HPlß. Profile zostały sporządzone na podstawie oryginalnych, nieprzetworzonych obrazów. Skala: 5 jum. Z dopasowanego do krzywych FCS modelu wynika, że w ognisku naprawy 46% cząsteczek należy do pierwszej swobodnej subpopulacji, a do najwolniejszej subpopulacji (D3Ognisko = 0,17±0,05^m2/s) należy 39% cząsteczek. Utożsamiam je z pulą HP1, które wiążą się z chromatyną. Spadek współczynnika dyfuzji w porównaniu do wolnej subpopulacji HP1 w nukleoplazmie (D2nukleoplazma = 0,26±0,06^m2/s) może wskazywać, że następuje lokalne usztywnienie całej struktury chromatyny. Niestety brak w tej chwili pomiarów mobilności włókien chromatyny w miejscu uszkodzenia DNA, które mogłyby mnie utwierdzić w przekonaniu, że chromatyna zwalnia swoje ruchy w trakcie naprawy DNA. W pomiarze mobilności histonu konieczne także byłoby wzięcie pod uwagę upływu czasu od skończenia naświetlania (wyindukowania uszkodzenia DNA), tak aby zarówno pomiar mobilności białka HP1, jak i znakowanego histonu H2B (informującego 162 Rozdział 9. Dyskusja o ruchach chromatyny) prowadzić po tym samym czasie. Możliwe, że tempo lokalnych ruchów chromatyny w rejonie uszkodzenia z czasem ulega zmianie. Zaraz po uszkodzeniu zwiększenie ruchliwości włókien chromatyny świadczyłoby o dynamicznej rearanżacji prowadzącej do jak najlepszego udostępnienia miejsca uszkodzenia gromadzącym się białkom naprawczym. Następnie lokalne usieciowanie chromatyny w celu jej stabilizacji byłoby widoczne poprzez spadek wartości współczynników dyfuzji dla znakowanego histonu H2B w kolejnych odstępach czasowych. Zmiany w upakowaniu chromatyny w rejonie uszkodzenia opisywali (Kruhlak et al., 2006; Burgess et al., 2014). Pierwsza z prac dowodzi, że lokalne rozluźnienie chromatyny pozwala dotrzeć czynnikom naprawczym do miejsca uszkodzenia, natomiast druga z nich wskazuje także na istotną rolę kondensacji chromatyny w procesie sygnalizacyjnym uszkodzenia. Można przypuszczać, iż zmianom upakowania mogą towarzyszyć zmiany ruchów włókien chromatyny. Rozważania te są moją hipotezą wyjściową w doświadczeniach, które aktualnie prowadzę we współpracy z panią mgr Agnieszką Hoang-Bujnowicz w Zakładzie Biofizyki Komórki UJ. Interesujące jest pojawienie się trzeciej subpopulacji (środkowej) HP1 w ogniskach naprawy DNA. Około 17% cząsteczek przynależy do tej subpopulacji, której średni współczynnik dyfuzji wynosi D2Ognisko = 1,1±0,8^m2/s. Wartość tego współczynnika wskazuje, że cząsteczki te poruszają się o wiele wolniej od subpopulacji swobodnej, są jednak szybsze od subpopulacji, która wedle hipotezy łączy się z chromatyną. Możliwe, że jest to subpopulacja, która pośrednio angażuje się w proces naprawy DNA, której wiązanie nie zależy tylko od chromodomeny HP1, jak to ma miejsce w przypadku wiązania do heterochromatyny, ale że to jest zupełnie inny sposób wiązania, w którym uczestniczy domena chromoshadow oraz fragment zawiasowy. O możliwym innym mechanizmie wiązania się HP1 w rejonie uszkodzenia DNA niż ma to miejsce w heterochromatynie donosiła już praca (Feng et al., 2016). Stosunek ilościowy subpopulacji 1 do sumy subpopulacji 2 i 3 wynosi 1:1,17 czyli oznacza to, że mobilność ponad połowy cząsteczek spada. Pośrednim potwierdzeniem mogą być wykresy profili fluorescencji, gdzie także w miejscach akumulacji obserwuje się dwukrotny wzrost intensywności sygnału. Uzyskane wyniki wskazują, że ognisko HP1 w miejscu prowadzonej naprawy DNA jest strukturą wysoce dynamiczną. Istnienie ogniska HP1 jest efektem równowagi dynamicznej między nim, a otoczeniem. Białko HP1 w ognisku zwalnia w porównaniu 163 Dyskusja Rozdział 9. do jego mobilności nukleoplazmie. Liczba cząsteczek przynależnych do pierwszej subpopulacji (f1HP1ß(ognisko) = 0,46) jest dwukrotnie mniejsza niż liczba cząsteczek reprezentujących pierwszą subpopulację w nukleoplazmie (f1HP1ß(nukleo) = 0,82). W doświadczeniach z wykorzystaniem przejściowej ekspresji w komórkach można spodziewać się, że całkowita ilość białka jest wyższa niż w normalnych komórkach. W pomiarach FCS badaniu podlega jedynie ta pula białka, która posiada metkę fluorescencyjną i porusza się w tempie, który jest wykrywany przez tę metodę. Można zakładać, że wpływ metki na mobilność jest zaniedbywalny, jednak zwiększenie populacji białka może wpływać na równowagę ilościową w procesach biologicznych. Na podstawie prawa działania mas można założyć, że zwiększenie puli niezwiązanej może spowodować wzrost liczby wiążących się do chromatyny cząsteczek białka. Wysycenie miejsc wiązania z równoczesnym zwiększaniem liczby cząsteczek wpłynie za zaburzenie proporcji między pulą związaną a niezwiązaną. Jedną z podstawowych i popularnych metod służących do pomiaru ilościowego białka w komórkach jest western blot. Pozwala ona oszacować m.in. stosunek ilościowy w komórkach pomiędzy populacją białka z metką do populacji białka bez metki. Wykonanie analizy western blot na komórkach poddanych przejściowej ekspresji jednak mija się z celem, gdyż jego wynik mówi jedynie o średnim stosunku między obiema populacjami białka w całej badanej populacji białka. Z tej racji nie wykonałem takich analiz i skupiłem się wyłącznie na pomiarach w wyselekcjonowanych komórkach o niskim poziomie ekspresji białka fuzyjnego. W swoich doświadczeniach wybierałem wyłącznie te komórki, w których poziom ekspresji białka był niewielki, a intensywność fluorescencji przy najwyższym wzmocnieniu na fotopowielaczu była lepiej dostrzegalna. Dzięki temu mogę zakładać, że w komórkach, w których wykonywałem pomiary istniał tylko niewielki nadmiar cząsteczek białka HP1 (w stosunku do komórek nietransfekowanych), który zapewne nie wpłynął na dynamikę procesów w jądrze komórkowym. 164 Rozdział 9. Dyskusja Tabela 9.12. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywej autokorelacyjnej dla pomiarów FCS białka eGFP-HP1ß w nukleoplazmie oraz analogicznie modelu z trzema składowymi dla eGFP-HP1ß w ognisku naprawczym. Mobilność eGFP-HP1ß w nukleoplazmie w ognisku Di [^m2 /s] 4,77 ± 0,64 3,74 ± 0,47 ai 0,81 ± 0,11 0,87 ± 0,12 fi 0,82 ± 0,07 0,46 ± 0,17 D2 [^m2 /s] 0,26 ± 0,06 1,13 ± 0,78 a-2 1,00 ± 0,19 0,75 ± 0,12 f2 0,18 ± 0,07 0,15 ± 0,05 D3 [^m2 /s] 0,17 ± 0,05 a-3 0,81 ± 0,21 f3 0,39 ± 0,06 76,6 ± 42,35 130 ± 63,14 R2 0,98 ± 0,01 0,97 ± 0,05 Podsumowując, na podstawie uzyskanych wyników doświadczeń można wnioskować, że: • Cząsteczki HP1 puli swobodnie dyfundującej w rejonie uszkodzenia DNA poruszają się wolniej niż w nukleoplazmie. • Cząsteczki HP1 puli związanej z chromatyną w rejonie uszkodzenia DNA poruszają się wolniej niż cząsteczki puli związanej z chromatyną w rejonach nieuszkodzonych. • W ognisku naprawy DNA istnieją dwie subpopulacje HP1, 0 współczynnikach dyfuzji D2HP1ß(ognisko)=1,13±0,78 ^m2/s 1 D3HP1ß(ognisko)=0,17±0,05 ^m2/s, które zapewne oddziałują z chromatyną. Wolniejsza z postulowanych subpopulacji porusza się z tempem domniemanej mobilności chromatyny w miejscu uszkodzenia. Możliwe, że obie subpopulacje uczestniczą w tworzeniu mostków oraz w stabilizowaniu lokalnej struktury chromatyny poprzez współtworzenie węzłów jej sieci. 165 Dyskusja Rozdział 9. Hipotetyczny rozkład wszystkich subpopulacji HP1 przestawia Rycina 9.4. Rycina 9.4. Schemat ilustrujący mobilność postulowanych subpopulacji HP1 w rejonie prowadzonej naprawy DNA. Czarne strzałki pokazują skalę mobilności cząsteczek HP1. Im dłuższa strzałka tym cząsteczka porusza się szybciej. W bliskim otoczeniu DSB cząsteczki HP1 poruszają się wolniej, a także więcej z nich wiąże się do chromatyny niż w innych obszarach jądra. Uzyskane wyniki wskazują na interesujące zachowanie białka HP1 w obszarze jego akumulacji w odpowiedzi na powstałe uszkodzenie DNA. Bardzo ciekawym byłoby rozwinięcie badań na tym polu poprzez przeprowadzanie kolejnych, bardziej szczegółowych doświadczeń. W celu rozróżnienia obszarów jądra komórkowego o różnym stopniu upakowania chromatyny należałoby powtórzyć omawiane w niniejszej pracy doświadczenia, zapisując współrzędne miejsca prowadzenia pomiaru FCS. Następnym krokiem byłoby wybarwienie chromatyny przy użyciu barwnika drobnocząsteczkowego jak np. DAPI. Obraz lokalnego stężenia dystrybucji DAPI w jądrze wskazałby, czy wcześniejszy pomiar prowadzony był w eu- czy heterochromatynie. Taka kolejność barwienia pozwoliłaby uniknąć potencjalnego wpływu barwnika jako fotouczulacza. W celu określenia stosunku ilościowego pomiędzy liczbą cząsteczek HP1 z metką i bez należałoby wyprowadzić stabilną linię, a następnie 166 Rozdział 9. Dyskusja wykonać analizę western blot. Jednym z pierwszych doświadczeń byłoby przeprowadzenie analogicznego pomiaru FCS w obszarze uszkodzenia, jednak z wykorzystaniem mutanta białka HP1 z dysfunkcją w tworzeniu dimerów. Możliwe, że ta mutacja spowodowałaby ograniczenie potencjalnego sieciowania chromatyny w bezpośrednim sąsiedztwie uszkodzenia przez co intensywność ogniska mogłaby być niższa, a szacowana mobilność wyższa. Kolejnym ciekawym doświadczeniem byłby pomiar mobilności histonu z metką fluorescencyjną w miejscu uszkodzenia w różnych odstępach czasu od momentu punktowego naświetlania światłem o wysokiej intensywności. Możliwe, że zaraz po uszkodzeniu następuje dekondensacja chromatyny, co umożliwia dostęp białkom naprawczym, a następnie włókna zwalniają ruchy oscylacyjne gdy struktury chromatyny są stabilizowane. Przeprowadzenie powyższych doświadczeń z sukcesem dałoby impuls do podjęcia próby doświadczeń z wykorzystaniem techniki FCCS pomiędzy białkiem HP1 a histonem w miejscu uszkodzenia, a także kontrolnie w nieuszkodzonym obszarze nukleoplazmy. Aby zbadać wpływ białka HP1 na potencjalną lokalną ruchliwość włókien chromatyny w obszarze uszkodzenia, można byłoby przeprowadzić analogiczne pomiary FCS dla histonu z metką w komórkach z wyciszeniem ekspresji białka HP1. Dodatkowo pomiar FCS w różnych odstępach czasu od momentu wywołania uszkodzenia pozwoliłby sprawdzić czy w czasie trwania ogniska naprawy mobilność HP1 w jego wnętrzu ulega zmianie. W ten sposób można byłoby zweryfikować hipotezę mówiącą, że aktywowana kinaza ATM fosforyluje białko kap-1 powodując oddysocjowanie kompleksu kap-1/HP1/Suv39h1 od chromatyny (Ayrapetov et al., 2014). Również interesujące byłoby przeprowadzenie tego typu doświadczeń na liniach komórkowych gryzoni. Zastosowanie takich komórek pozwoliłoby na wyraźniejsze rozróżnienie obszarów w jądrze o różnym stopniu upakowania DNA (chromocentra i euchromatyna). 167 Dyskusja Rozdział 9. 9.4. Mobilność znakowanego XRCC1 w nukleoplazmie Niniejszy podrozdział Dyskusji dotyczy rozważań mobilności XRCC1 w nukleoplazmie oraz miejscu jego gromadzenia w ramach odpowiedzi na uszkodzenie DNA powstałe na skutek naświetlania światłem widzialnym. Najpierw skupię się na potencjalnym wpływie rodzaju metki fluorescencyjnej na dyfuzję białka fuzyjnego. Następnie omówię uzyskane wyniki dla znakowanego białka XRCC1 formy dzikiej. W kolejnej części rozpatrzę mobilność dwóch mutantów białka ze zdezaktywowaną domeną BRCT1 (mRFP- XRCC1L360R) oraz pozbawionym domeny BRCT2 (mRFP-XRCC1P537STOP). Są to mutanty, które nie akumulują się w miejscu uszkodzenia, zatem pomiary ich mobilności prowadziłem jedynie w nukleopklazmie. Kolejne mutanty zawierają zdezaktywowane wybrane miejsca fosforylacji białka XRCC1. Mutacje te, jak opiszę poniżej, nie wpłynęły na zdolność do tworzenia ognisk naprawczych przez te warianty białka. W związku z tym dla nich przeprowadziłem pomiary FCS zarówno w ogniskach naprawczych jak i w nukleoplazmie. Omówienie tych wyników znajduje się w ostatniej części niniejszego rozdziału. 9.4.1. Rodzaj metki fluorescencyjnej nie wpływa na mobilność XRCC1 w nukleoplazmie Rodzaj metki fluorescencyjnej nie wpłynął na wyniki pomiarów FCS w nukleoplazmie dla białka XRCC1. Tabela 9.13. przedstawia zestawienie wybranych parametrów z modelu dwuskładowej anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej uzyskanych na podstawie dopasowania do krzywych autokorelacyjnych wykonanych zarówno dla mRFP- XRCC1 oraz eGFP-XRCC1. Współczynniki dyfuzji pierwszej jak i drugiej subpopulacji są bardzo zbliżone do siebie (D1mRFP-XRCC1 = 6,1 ± 0,69 ^m2/s, D1eGFP'XRCCi = 6,11 ± 1,55 ^m2/s). Stosunek pomiędzy postulowanymi subpopulacjami także jest bardzo podobny w obu przypadkach: dla mRFP-XRCC1: ff = 1,86:1, a dla eGFP-XRCC1: ff = 2,03:1. Odpowiednie współczynniki a także się pokrywają. Uzyskanie tak bardzo podobnych wyników było przewidywalne m. in. ze względu na zbliżoną wielkość obu zastosowanych metek fluorescecyjnych (Tabela 9.2). Z drugiej strony istniały obawy, że kalibracja mikroskopu do wykorzystanie innego fluoroforu, zastosowanie innej długości fali światła wzbudzającego lub różnice w wydajności rejestrowania fotonów o różnej energii (długości fali) przez detektory mogłyby powodować różnice w rejestracji fluktuacji fluorescencji, co rzutowałoby na wyznaczone potem parametry dynamiki białka fuzyjnego. Podsumowując, przy zastosowaniu obu 168 Rozdział 9. Dyskusja metek fluorescencyjnych uzyskałem zbliżone wartości parametrów opisu mobilności fuzyjnego białka XRCC1 w jądrze komórkowym. Ze względu na doświadczenia, w których generowane było lokalne uszkodzenie DNA poprzez punktowe naświetlania światłem lasera o długości fali 488 nm, zdecydowałem się na wybór białka mRFP jako metki fluorescencyjnej. Zabieg ten pozwolił ograniczyć lokalne fotoblaknięcie fluoroforu podczas pomiaru FCS (mRFP jest wzbudzane światłem o długości 488nm jedynie na poziomie około 10% - Rycina 9. 5). Tabela 9.13. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacyjnych dla pomiarów FCS białka XRCC1 z metką mRFP lub z metką eGFP. mRFP-XRCC1wt w nukleoplazmie eGFP-XRCC1wt w nukleoplazmie D1 [^m2 /s] 6,10 ± 0,69 6,11 ± 1,55 «1 0,93 ± 0,03 1,02 ± 0,13 f1 0,65 ± 0,05 0,67 ± 0,17 D2 [^m2 /s] 0,35 ± 0,04 0,32 ± 0,13 “2 0,87 ± 0,01 0,88 ± 0,03 f2 0,35 ± 0,05 0,33 ± 0,17 103 ± 1 132 ± 48 R2 0,88 ± 0,02 0,74 ± 0,11 Rycina 9.5. Widmo wzbudzenia i emisji białka mRFP. 169 Dyskusja Rozdział 9. 9.4.2. Dwie subpopulacje białka XRCC1 w nukleoplazmie Liczne obrazy konfokalne jąder z ekspresją białka XRCC1 z metką fluorescencyjną przedstawione w niniejszej pracy (przykładowo Ryciny 8.8.B, 8.9.A, 8.11) pokazują możliwy rozkład przestrzenny tego białka w jądrze komórkowym. Przedstawione obrazy równomiernego rozkładu sygnału z jądra komórkowego (poza jąderkami) sugerują podobną dystrybucję tego białka w nukleoplazmie. Ogniska o wysokiej intensywności są tworzone przez to białko w ramach odpowiedzi na endogenne lub indukowane poprzez czynniki zewnętrzne uszkodzenia DNA. Może to oznaczać, że cząsteczki białka swobodnie poruszają się w obrębie jądra komórkowego, będąc cały czas w gotowości, aby zgromadzić się w razie potrzeby zaangażowania się w proces naprawy. W celu zweryfikowania, czy białko XRCC1 mogłoby swobodnie poruszać się w jądrze w czasie kiedy nie angażuje się w procesy naprawcze przeprowadziłem pomiary FLIP i FCS. Z doświadczeń z wykorzystaniem techniki FLIP uzyskałem krzywą zaniku fluorescencji dla białka XRCC1 w nukleoplazmie wskazującą na istnienie więcej niż jednej subpopulacji różniącej się mobilnością. Pierwszy, szybki zanik odnosi się zapewne do białka swobodnie poruszającego się w jądrze. Jako kontrolne, analogiczne doświadczenia przeprowadziłem także w komórkach wykazujących jedynie ekspresję swobodnej metki fluorescencyjnej mRFP. Krzywa zaniku przedstawia bardzo gwałtowny spadek sygnału prawie do zera. Oznacza to, że swobodnie poruszające się białko, jak na przykład metka fluorescencyjna, charakteryzuje się w jądrze wysoką mobilnością. Druga składowa na krzywej FLIP dla mRFP-XRCC1 wskazuje, że białko to jednak potencjalnie może oddziaływać z chromatyną nawet w czasie, kiedy nie jest zaangażowane w proces naprawy. Rezultat ten, pomimo dostarczenia tylko informacji jakościowej, zachęcił mnie do przeprowadzenia bardziej dokładnych pomiarów ilościowych mobilności badanego białka z wykorzystaniem techniki FCS. Uzyskane wyniki z analizy pomiarów FCS potwierdzają wcześniejsze obserwacje wykonane metodą FLIP. W nukleoplazmie zapewne istnieją co najmniej dwie subpopulacje tego białka różniące się mobilnością. W pierwszej kolejności zastosowałem model dwuskładowy, którego wyniki przedstawia pierwsza kolumna z tabeli 9.14. Stosunek ilościowy pomiędzy obiema subpopulacjami wynosi 1,9:1 (f1 = 0,65±0,05, a f2 = 0,35±0,05). Współczynnik dyfuzji dla pierwszej, swobodnej subpopulacji jest ponad 17 razy większy niż dla drugiej, wolniejszej subpopulacji (D1 = 6,10±0,69 |im2/s, a D2 = 0,35±0,04 |im2/s). Aby sprawdzić, czy możliwe byłoby istnienie dodatkowej 170 Rozdział 9. Dyskusja subpopulacji użyłem na wybranych krzywych FCS analogicznego modelu trójskładowego. Przeprowadzone testy (kryterium Bayesa, F-Test) wskazują jednoznacznie, że model dwuskładowy jest wystarczający do opisu ruchliwości XRCC1 w nukleoplazmie. Możliwe, że druga, wolniejsza subpopulacja oddziałuje z potencjalnymi miejscami wiązania występującymi w chromatynie. Współczynnik dyfuzji drugiej subpopulacji zbliżony jest do wartości współczynnika dyfuzji związanej z DNA subpopulacji dla histonu H2B-eGFP. Subpopulacja ta reprezentuje tę pulę histonu, która wchodzi w skład chromatyny, zatem pośrednio wskazuje na dynamikę jej włókien. Zatem zasadne wydaje się postulowanie istnienia dwóch subpopulacji białka XRCC1 w nukleoplazmie, jednej swobodnie poruszające się w przestrzeni jądra i drugiej wiążącej się do chromatyny. 171 Dyskusja Rozdział 9. Profile intensywności fluorescencji przez ogniska mRFP-XRCC1 Rycina 9.6. Profile intensywności sygnału fluorescencji z obszarów akumulacji białka XRCC1. Profile zostały sporządzone na podstawie oryginalnych, nieprzetworzonych obrazów. Kontrast na obrazach mRFP- XRCC1 z jądra komórkowego został zwiększony w celu uwidocznienia rozkładu białka w jądrze. Skala: 5^m. 172 Rozdział 9. Dyskusja 9.4.3. Dezaktywacja domen BRCT1 i BRCT2 zmienia mobilność znakowanego białka XRCC1 w nukleoplazmie Dezaktywacja domeny BRCT1 lub BRCT2 doprowadziła do zaburzenia gromadzenia się białka XRCC1 w miejscu uszkodzenia wywołanego na skutek naświetlania światłem widzialnym. Użycie wyższych dawek niż 90 ^J także nie powodowało jego gromadzenia (dane nie pokazane). Z tego powodu pomiary FCS dla obu mutantów XRCC1 przeprowadziłem wyłącznie w nukleoplazmie. Tabela 9.14. przedstawia zestawienie kolejnych parametrów z modelu dwuskładowej anomalnej dyfuzji uzyskanych w analizie pomiarów w nukleoplazmie zarówno dla mRFP-XRCC1, jak i obu jego mutantów mRFP- XRCC1L360R oraz mRFP-XRCC1P537STOP. Mobilność białka XRCC1L360R wyraźnie zmniejsza się w nukleoplazmie. Zarówno wartości współczynników dyfuzji dla pierwszej, jak i drugiej subpopulacji są niższe w porównaniu do analogicznych parametrów dla znakowanego XRCC1 typu dzikiego (D1XRCC1(wt) = 6,10 ± 0,69 |im2/s, a D1XRCC1(L360R) = 4,38 ± 0,45 ^m2/s). Wolniejsze poruszanie się cząsteczek tej subpopulacji XRCC1 może być spowodowane zaburzeniem oddziaływania z innymi białkami - zwłaszcza procesu dysocjacji. Błędne zwinięcie domeny BRCT1 może powodować także zwiększenie promienia hydrodynamicznego białka, przez co rozpatrując tylko mobilność jako następstwo dyfuzji, białko może nieznacznie wolniej dyfundować. Jednak tak znaczące zmniejszenie mobilności nie powinno być efektem wyłącznie błędnego zwinięcia jednej domeny. Możliwe, że wolniejsza dyfuzja może być skutkiem niespecyficznego oddziaływania białka XRCC1 przez domenę BRCT1 z innymi składnikami jądra komórkowego. W pomiarach mobilności XRCC1P537STOP spodziewałem się uzyskać wartości parametrów świadczące o wzroście mobilności. Rozważając jedynie wpływ samej wielkości badanego białka spodziewałem się, że jego mutant pozbawiony końcowej domeny BRCT2 powinien poruszać się nieznacznie szybciej w porównaniu do znakowanego białka typu dzikiego. Uzyskane wyniki świadczą jednak o prawie dwukrotnym wzroście mobilności mutanta XRCC1P537STOP w nukleoplazmie. Współczynnik dyfuzji dla pierwszej subpopulacji jest prawie dwukrotnie wyższy - D1XRCC1(wt) = 6,1 ± 0,7 |im2/s, a D1XRCC1(P537STOP) = 11,7 ± 1,7 ^m2/s). W celu zweryfikowania, czy uzyskana niespodziewana wysoka wartość współczynnika dyfuzji dla mutanta jest poprawna przeprowadziłem dodatkowo dwukrotnie pomiary jego dyfuzji w nukleoplazmie (w obu przypadkach pomiary przeprowadziłem na około 20 173 Dyskusja Rozdział 9. Tabela 9.14. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacyjnych dla pomiarów FCS białka mRFP-XRCC1 oraz jego znakowanych mutantów XRCC1L360R oraz XRCC1P537STOP w nukleoplazmie. Mobilność mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie wt L360R P537STOP D1 [^m2 /s] 6,10 ± 0,69 4,38 ± 0,45 11,69 ± 1,68 «1 0,93 ± 0,03 0,98 ± 0,03 0,93 ± 0,02 f1 0,65 ± 0,05 0,77 ± 0,07 0,76 ± 0,08 D2 [^m2 /s] 0,35 ± 0,04 0,27 ± 0,03 0,54 ± 0,08 a-2 0,87 ± 0,01 0,87 ± 0,03 0,89 ± 0,05 f2 0,35 ± 0,05 0,23 ± 0,07 0,24 ± 0,08 103 ± 1 95 ± 11 117 ± 21 R2 0,88 ± 0,02 0,80 ± 0,02 0,83 ± 0,03 komórkach) - tabela w rozdziale wyniki (Rycina 8.12). Za każdym razem uzyskiwałem podobne wartości. W tych samych sesjach doświadczeń prowadziłem analogiczne pomiary także dla znakowanego XRCC1 typu dzikiego dzięki temu wartości parametrów z kalibracji, uwzględniane następnie w analizie, były dla obu pomiarów identyczne. Możliwe, że brak domeny BRCT2 mógł spowodować zaburzenie oddziaływania tego białka z innymi składnikami jądra komórkowego. Poprzez tę domenę białko to oddziałuje z licznymi partnerami, jak na przykład z domeną BRCT ligazy IIIa (Nash et al., 1997). Ograniczenie lub nawet brak oddziaływania z innymi białkami mogło spowodować, że XRCC1P537STOP porusza się szybciej. Część oddziaływań XRCC1P537STOP została zachowana, ponieważ w porównaniu do wyników mobilności znakowanego białka XRCC1 typu dzikiego w cytoplazmie (D1XRCC1(wt) cytop = 32 ± 6 ^m2/s) mutant porusza się wolniej. W celu sprawdzenia, czy jednak XRCC1 nie gromadzi się w sposób szczątkowy w miejscu uszkodzenia, można byłoby przeprowadzić w tym miejscu pomiary FCS dla obu mutantów. Jakakolwiek próba gromadzenia się białka, jednak bez możliwości akumulacji, mogłaby być widoczna w takich pomiarach zwłaszcza dla XRCC1P537STOP, w którym możliwość oddziaływania z PARP1 oraz PARP2, jak i również wiązanie się do łańcucha poli(ADP-rybozy) byłaby zachowana. 174 Rozdział 9. Dyskusja 9.4.4. Dezaktywacja miejsc fosforylacji nie wpływa na mobilność znakowanego XRCC1 w nukleoplazmie Dezaktywacja miejsc fosforylacji nie wpłynęła znacząco na zmianę mobilności białka XRCC1 w nukleoplazmie. Uzyskane wartości parametrów opisujących mobilność dla mutantów zawierających dezaktywowane miejsca fosforylacji są tylko nieznacznie wyższe w porównaniu do analogicznych wartości dla znakowanego XRCC1 typu dzikiego. Stosunek pomiędzy populacją szybszą i wolniejszą w każdym omawianym przypadku jest bardzo zbliżony i wynosi około 2:1. Kolejne współczynniki anomalności uzyskane dla każdego z omawianych przypadków także dość dobrze pokrywają się z wartościami dla znakowanego białka typu dzikiego. Można założyć, że wprowadzone mutacje nie wpłynęły na funkcje białka odpowiedzialne za zachowanie w nukleoplazmie, m.in. przejściowe wiązanie do chromatyny. Wartości współczynników dyfuzji dla drugiej subpopulacji w każdym omawianym przypadku (znakowane XRCC1 typu dzikiego oraz mutanty) wynoszą niewiele ponad 0,3 ^m2/s (D2XRCC1(wt) = 0,35 ± 0,04 |im2/s; D2XRCC1(S371A) = 0,4 ± 0,1 |im2/s; D2XRCC1(T284A) = 0,35 ± 0,08 ^m2/s oraz D2XRCC1(-4P) = 0,41 ± 0,07^m2/s). Tabela 9.15. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacyjnych dla pomiarów FCS białka XRCC1 oraz jego mutantów XRCC1S371A, XRCC1T284A oraz XRCC1-4P w nukleoplazmie. Porównanie mobilność mRFP-XRCC1 typu dzikiego (wt) z jego wybranymi mutantami w nukleoplazmie wt S371A T284A -4P D1 [^m2 /s] 6,10 ± 0,69 7,204 ± 1,3 6,79 ± 0,6 6,98 ± 0,8 «1 0,93 ± 0,03 0,96 ± 0,1 0,94 ± 0,04 0,95 ± 0,06 f1 0,65 ± 0,05 0,697 ± 0,18 0,67 ± 0,1 0,68 ± 0,1 D2 [^m2 /s] 0,35 ± 0,04 ,1 o° ± 0, 0,35 ± 0,08 0,41 ± 0,07 “2 0,87 ± 0,01 0,89 ± 0,08 0,86 ± 0,02 0,86 ± 0,03 f2 0,35 ± 0,05 0,303 ± 0,18 0,33 ± 0,1 0,32 ± 0,1 103 ± 1 99 ± 37 114 ± 56 103 ± 23 R2 0,88 ± 0,02 0,85 ± 0,02 0,88 ± 0,04 0,86 ± 0,04 175 Dyskusja Rozdział 9. 9.5. XRCC1 w ognisku naprawy DNA dyfunduje wolniej niż w nukleoplazmie Punktowe oświetlenie fragmentu jądra światłem widzialnym, co jest równoznaczne z równoczesnym dostarczeniem odpowiedniej ilości energii i uszkodzeniem DNA, powoduje widoczną akumulację białka XRCC1. Jest to dowód wywołania odpowiedzi komórki na powstałe w ten sposób uszkodzenia DNA. Wedle badań prowadzonych przez współpracowników w Zakładzie Biofizyki Komórki, przy użyciu światła o długości 488 nm, dostarczenie dawki energii 90 |iJ jest wystarczające do wywołania na obszarze naświetlania jednoniciowych pęknięć DNA. Gromadzenie się XRCC1 przebiega bardzo gwałtownie. Po paru sekundach w miejscu naświetlania widoczne jest ognisko o kilkukrotnie wyższej intensywności fluorescencji eGFP-XRCC1 niż otoczenie. Tak wysoki wzrost intensywności sygnału świadczy o zgromadzeniu się licznych cząsteczek białka XRCC1 w obszarze wokół wywołanego uszkodzenia. Szacuje się, że takie ognisko tworzone jest przez setki lub nawet tysiące cząsteczek XRCC1. Tak liczna grupa cząsteczek białka w małym rejonie rodzi pytanie o możliwe funkcje, jakie to białko może tam pełnić. Wiadomo, że XRCC1 pomimo braku właściwości enzymatycznych czynnie uczestniczy w naprawie DNA. Pełni ono funkcję platformy molekularnej, do której wiążą się kolejne białka uczestniczące w procesie naprawy. W pracy doktorskiej dr Magdalena Kordon wykazała silną korelację przestrzenną między ogniskiem XRCC1 a białkiem SP100 będącym markerem ciałek PML (w przypadku uszkodzeń powstałych w rejonach replikacji). Ta relacja została potwierdzona przy użyciu wysokorozdzielczych technik mikroskopowych, co utwierdza mnie w przekonaniu słuszności tezy zawartej w mojej rozprawie doktorskiej, że cząsteczki XRCC1 mogą wchodzić w skład ciałek PML, które pełnią funkcję rezerwuaru białek dla prowadzonej w pobliżu naprawy DNA. Proces akumulacji białka XRCC1 w obszarze uszkodzenia może też być niezbędny w celu zwiększenia lokalnego stężenia pozostałych kluczowych białek zaangażowanych wproces naprawy. Każda cząsteczka XRCC1 rekrutuje tylko niewielką liczbę cząsteczek innych białek, zatem do licznego zgromadzenia kolejnych białek do procesu naprawy wymagane jest wiele cząsteczek XRCC1. Uzyskany wzrost liczby białek naprawczych w miejscu uszkodzenia zapewnie zabezpiecza proces naprawy przed jego zaburzeniem lub przerwaniem na skutek przypadkowego rozpadu kompleksu naprawczego i odyfundowania części cząsteczek. Inną potencjalnie możliwą funkcją może być lokalna stabilizacja chromatyny - postulowane zjawisko będące elementem sformułowanej 176 Rozdział 9. Dyskusja przeze mnie hipotezy roboczej. Pełnienie takich funkcji przez większość zgromadzonych cząsteczek mogłoby być odzwierciedlone w zmianie mobilności XRCC1 (oraz chromatyny) w pomiarach FLIP i FCS. Pierwsze obserwacje zmniejszenia mobilności białka XRCC1 w rejonie naprawy wykonałem w doświadczeniach FLIP. Krzywa zaniku fluorescencji dla puli cząsteczek XRCC1 zakumulowanych w obszarze naprawy DNA znacząco różni się kształtem, jak i tempem zaniku (czasy połowicznego zaniku t1 i t2) od analogicznej krzywej dla obszaru poza nim. Na krzywej wyróżnić można co najmniej dwa składowe zaniki - jeden bardzo szybki, który utożsamiam ze swobodnie przepływającą pulą białka XRCC1, oraz drugi, wolniejszy, który można intepretować jako tę pulę białka, która znacznie dłużej, niż to dzieje się w nukleoplazmie przebywa w tym miejscu i bardzo powoli wymienia się z otoczeniem. Jednak pomiary FLIP pozwoliły jedynie na przybliżony opis zachowania cząsteczek białka XRCC1 w rejonie naprawy. W celu określenia relacji ilościowych pomiędzy postulowanymi subpopulacjami oraz oszacowania ich współczynników dyfuzji konieczne było przeprowadzenie pomiarów FCS. Pomiary takie wykonywałem kilkanaście sekund po skończeniu punktowego naświetlania. Widoczne ognisko pojawiało się natychmiast, a jedyną zwłoką w przeprowadzanych pomiarach był czas potrzebny na ustawienie parametrów do przeprowadzenia doświadczenia FCS. Wywołane ogniska XRCC1 charakteryzowały się na obrazie mikroskopowym średnicą od 600 do 800nm oraz relatywnie dużą ruchliwością. Mobilność powstałych ognisk XRCC1 opisał wcześniej już dr Kamil Solarczyk w swojej pracy (Solarczyk et al., 2016). Możliwym następstwem ruchliwości ogniska może być opuszczanie przez niego obszaru prowadzonego pomiaru. Zarejestrowane fluktuacje fluorescencji, na których obserwowany był znaczący spadek sygnału świadczący właśnie o takim przesunięciu ogniska poza obszar pomiaru, były odrzucane z dalszej analizy. W dopasowywaniu modeli do krzywych użyłem w pierwszej kolejności modelu trójskładowej anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej. Uznałem, że skoro w nukleoplazmie występują co najmniej dwie subpopulacje białka XRCC1, to i w obszarze prowadzonej naprawy liczba możliwych subpopulacji będzie nie mniejsza od dwóch (obszar detekcji z konieczności obejmuje rejon większy niż ognisko naprawy). Uzyskane wyniki dla białka mRFP-XRCC1 w ognisku naprawczym i w nukleoplazmie jako miejscu do porównania przedstawia pierwsza kolumna tabeli 9.15. Przedstawione wartości świadczą o wyraźnym zmniejszeniu ruchliwości białka XRCC1 w obszarze naprawy. Współczynnik dyfuzji dla pierwszej subpopulacji wynosi D1XRCC1(wt) ognisko = 3,26 ± 0,36^m2/s, a dla drugiej, 177 Dyskusja Rozdział 9. wolniejszej subpopulacji D2XRCC1(wt)ognisko = 0,17 ± 0,03 ^m2/s. Stosunek ilościowy między obiema subpopulacjami wynosi w przybliżeniu 2,6:1 (f1 = 0,72 i f2 = 0,28). Porównując uzyskane wartości parametrów pomiędzy ogniskiem XRCC1 a nukleoplazmą dostrzegam wyraźną różnicę w mobilności. Zarówno pierwsza, jak i druga subpopulacja znacząco zwalnia (około dwukrotnie), natomiast stosunek ilościowy pomiędzy nimi w ognisku jest prawie zachowany i jest taki jak w nukleoplazmie (z dokładnością do zakresu niepewności). Nie ma też znaczącej zmiany w parametrach a dla pierwszej subpopulacji w obu przypadkach. Świadczy to o występowaniu prostej dyfuzji, natomiast dla drugiej subpopulacji o widocznej subdyfuzji. Aby sprawdzić, czy istnieje trzecia subpopulacja, przeprowadziłem dopasowanie analogicznego modelu jak wcześniej, lecz tym razem z trzema postulowanymi subpopulacjami. W celu sprawdzenia, czy bardziej rozbudowany model znacząco poprawił jakość dopasowania do krzywych przeprowadziłem trzy testy - kryterium informacyjne Akaikego, Bayesowskie kryterium informacyjne Schwarza oraz F-test. Pierwsze dwa z nich wskazują, że model dwuskładowy jest wystarczający do opisu zachowania XRCC1 w ognisku naprawczym. F-test wskazuje na model trójskładowy. Ponieważ wyniki testów nie wskazują jednoznacznie na istnienie trzech subpopulacji, sądzę że, wystarczającym przybliżeniem opisu mobilności XRCC1 jest model dwuskładowy. 178 Rozdział 9. Dyskusja Rycina 9.7. Schemat ilustrujący mobilność XRCC1 w rejonie prowadzonej naprawy DNA. Czarne strzałki ilustrują skalę mobilności cząsteczek XRCC1. Im dłuższa strzałka tym cząsteczka porusza się szybciej. W bliskim otoczeniu SSB cząsteczki XRCC1 poruszają się wolniej, a także więcej z nich wiąże się do chromatyny i pełnią rolę platformy molekularnej dla pozostałych czynników naprawczych.. 9.5.1 Dezaktywacja miejsc fosforylacji XRCC1 nie wpływa na jego mobilność w miejscu uszkodzenia DNA Biologiczny efekt fosforylacji XRCC1 w miejscu naprawy nie jest do końca poznany. Fosforylacja jest zazwyczaj sygnałem wielofunkcyjnym. Może wpływać na oddziaływania pomiędzy białkami lub pomiędzy białkiem a DNA, ale także znakować cząsteczki białka do degradacji. W przypadku XRCC1 doniesienia literaturowe wskazują na możliwą funkcję fosforylacji XRCC1 w mechanizmie naprawy DNA. Chk2 tworzy kompleks z XRCC1 i fosforyluje je w pozycji T284. Brak fosforylacji tego aminokwasu powoduje zmniejszenie efektywności naprawy SSB (Chou et al., 2008). Fosforylacja T284 powoduje wzrost oddziaływania między XRCC1 a glikozylazą OGG1, która rozpoznaje rejon uszkodzenia DNA. Wydaje się zatem, że fosforylacja XRCC1 wzmaga gromadzenie się białka XRCC1 (Chou et al., 2008). W odpowiedzi na uszkodzenia DNA 179 Dyskusja Rozdział 9. wywołane promieniowaniem jonizującym kinaza DNA-PK wiąże się z XRCC1, a także fosforyluje serynę znajdującą się na pozycji 371 tego białka. Fosforylacja powoduje dysocjację dimeru XRCC1 (Lévy et al., 2006). W pracy (Loizou et al., 2004) autorzy zidentyfikowali osiem miejsc w rejonie przed domeną BRCT1, które najczęściej ulegają fosforylacji przez kinazę CK2. Wykazali, że fosforylacja przez CK2 wzmaga oddziaływanie XRCC1 z kinazą PNK (z ang. polynucleotide kinase). W komórkach z zdezaktywowanymi miejscami fosforylacji kinazy CK2 poddanymi stresowi oksydacyjnemu nie zaobserwowali gromadzenia się znakowanego XRCC1, co wskazuje na kluczową rolę fosforylacji wybranych miejsc XRCC1 w procesie jego gromadzenia w ognisku naprawy. Mając na uwadze potencjalny wpływ fosforylacji XRCC1 na jego zachowanie w miejscu uszkodzenia przeprowadziłem pomiary mobilności także dla mutantów z zdezaktywowanymi wybranymi miejscami fosforylacji w ogniskach naprawczych. W przeprowadzonych doświadczeniach opisanych w niniejszej pracy wprowadzenie mutacji dezaktywujących miejsca fosforylacji XRCC1 nie wpłynęło na zdolność gromadzenia się białka XRCC1 w rejonie uszkodzenia DNA. Jednak pomimo widocznego gromadzenia się białka XRCC1 z mutacjami możliwe są zmiany w jego zachowaniu m. in inne tempo gromadzenia się lub czas trwania takiego ogniska. Te możliwe zmiany zachowania białka XRCC1 nie były jednak przedmiotem badań w niniejszej pracy. Zrezygnowałem z prowadzenia takich doświadczeń, ponieważ już dla białka XRCC1 bez mutacji występuje bardzo duża różnorodność zarówno w tempie odpowiedzi na lokalne uszkodzenie, jak i w czasie trwania widocznego ogniska. Takie doświadczenia były już prowadzone w Zakładzie Biofizyki Komórki m.in. przez dr Magdę Kordon oraz dra Kamila Solarczyka (dane niepublikowane). Akumulacja białka XRCC1 w miejscu po naświetleniu wiązką światła laserowego świadczy o powstałych uszkodzeniach nici DNA. Gromadzenie białka przebiega gwałtownie zarówno dla typu dzikiego, jak i dla jego mutantów z dezaktywowanymi miejscami fosforylacji. Czas trwania ogniska nie był przeze mnie monitorowany. Porównując wyniki z analizy krzywych FCS z pomiarów mobilności w nukleoplazmie oraz w miejscu gromadzenia dla znakowanego białka XRCC1 typu dzikiego oraz jego mutantów (Tabela 9.16), nie zauważyłem znaczących zmian zarówno ani w mobilności, ani w stosunku ilościowym szybszej i wolniejszej subpopulacji. W miejscu akumulacji za każdym razem obserwowałem około dwukrotny spadek mobilności dla pierwszej, 180 Rozdział 9. Dyskusja szybszej subpopulacji oraz podobnie dla drugiej, wolniejszej. Mobilność znakowanego białka XRCC1wt zmniejsza się dwukrotnie w obszarze prowadzonej naprawy. Wydaje się, że dezaktywacja tylko kilku wybranych miejsc fosforylacji nie zaburza procesu akumulacji, choć nie oznacza to, że efektywność całego procesu naprawy nie została zaburzona. Wprowadzenie czterech mutacji (XRCC1-4P) także nie wpływa na zdolność gromadzenia się XRCC1 w odpowiedzi na powstałe uszkodzenia. Dopiero zdezaktywowanie co najmniej ośmiu miejsc, może wpłynąć widocznie na proces odpowiedzi komórki (Loizou et al., 2004). W celu udzielenia odpowiedzi na pytanie, czy brak fosforylacji białka może potencjalnie wpłynąć na jego stałą wiązania z innymi białkowymi składnikami lub chromatyną w obszarze naprawy, można byłoby przeprowadzić pomiary FCCS pomiędzy zmutowanym XRCC1, a badanym partnerem. Tabela 9.16. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacji dla pomiarów FCS przeprowadzonych dlaXRCCl oraz jego mutantów XRCC1S371A, XRCC1T284A, XRCC1~4P w nukleoplazmie oraz w ognisku naprawczym. Mobilność mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie wt S371A T284A -4P D1 [^m2 /s] 6,10 ± 0,69 7,2041 ± 1,3 6,79 ± 0,6 6,98 ± 0,8 “1 0,93 ± 0,03 0,96 ± 0,1 0,94 ± 0,04 0,95 ± 0,06 f1 0,65 ± 0,05 0,6966 ± 0,18 0,67 ,1 o° ± 0,68 ± 0,1 D2 [^m2 /s] 0,35 ± 0,04 0,4 ± 0,1 0,35 ± 0,08 0,41 ± 0,07 «2 0,87 ± 0,01 0,89 ± 0,08 0,86 ± 0,02 0,86 ± 0,03 f2 0,35 ± 0,05 0,3034 ± 0,18 0,33 ± 0,1 0,32 ± 0,1 Mobi ność mRFP-XRCC1 w ognisku naprawczym wt S371A T284A -4P D1 [^m2 /s] 3,26 ± 0,36 3,08 ± 0,05 3,59 ± 0,75 3,48 ± 0,42 “1 1,02 ± 0,09 0,94 ± 0,16 0,94 ± 0,09 0,97 ± 0,10 f1 0,72 ± 0,10 0,61 ± 0,27 0,55 ± 0,10 0,58 ± 0,09 D2 [^m2 /s] 0,17 ± 0,03 0,18 ± 0,02 0,17 ± 0,05 0,18 ± 0,05 «2 0,85 ± 0,04 0,90 ± 0,08 0,98 ± 0,28 0,92 ± 0,11 f2 0,28 ± 0,11 0,39 ± 0,27 0,45 ± 0,10 0,42 ± 0,09 181 Dyskusja Rozdział 9. 9.6. Czy nietypowe oscylacje krzywej korelacyjnej mogą być śladem dyfuzji kierunkowej? Jedną z obserwacji jakie poczyniłem w czasie prowadzenia doświadczeń było występowanie niespodziewanych oscylacji w końcowym przebiegu krzywej autokorelacji. Pisząc ’’oscylacje” mam na myśli występowanie pewnej periodyczności podobnej do przebiegu sinusoidalnego w końcowej części krzywej autokorelacji. Występowanie tej anomalii uniemożliwia analizę i dopasowanie modelu. Jednak jej występowanie nie wydaje się zawsze przypadkowe. Na krzywych FCS w zakresie długich czasów korelacji pojawienie się przebiegu, który niemonotonicznie zmierza do G=0, bardzo często świadczy o pewnym ruchu jaki miał miejsce w czasie pomiaru. Bardzo często jest to ruch całego szkiełka z komórkami na skutek drgań stolika, bądź poruszenie się komórki. Takie wybrzuszenie zazwyczaj pojawia się na końcu przebiegu krzywej i w przypadku, kiedy znacząco nie wpływa na dopasowanie modelu, pozostawiłem je w zbiorze analizowanych krzywych. Jednak czasem obserwowałem inny rodzaj anomalii na końcu przebiegu krzywej - niespodziewane oscylacje. Na samym początku uznałem je za następstwo źle przeprowadzonego pomiaru np. z powodu drgań stolika, lecz mając już zarejestrowany komplet pomiarów zacząłem doszukiwać się pewnych reguł ich występowania. Inspiracją do przyjrzenia się tym oscylacjom była praca (Zamir et al., 2017), w której autorzy uzyskali bardzo podobne krzywe FCS z widocznymi oscylacjami. W doświadczeniach użyli mikro przepływu umożliwiającego regulowanie częstotliwości przepływu kropel barwnika przez objętość detekcji. W ciągu prowadzonych doświadczeń na przestrzeni kilkunastu miesięcy spotkałem się z dwiema sytuacjami, kiedy występowanie oscylacji na krzywej autokorelacji, które pomimo, że niepożądane, było jednak spodziewane. Oba typy sytuacji zdarzały się bardzo sporadycznie. Otóż, w czasie prowadzenia pomiarów FCS w komórkach zdarzało się, że na odczytach losowo pojawiały się charakterystyczne periodyczności. Ich amplituda mogła nawet całkowicie zasłonić prowadzone pomiary jak to miało miejsce w przypadku opisanym na Rycinie 9.7.A. Odczyty na poziomie 400 tysięcy zliczeń są niemożliwe do przeprowadzenia. Jest to wartość powyżej górnego progu czułości detektora i grozi uszkodzeniem go. Sygnał rejestrowany przez detektor nie miał jednak takiej intensywności. Sądzę, że w późniejszym etapie przetwarzania sygnału został nałożony periodyczny szum widoczny na wykresach. Periodyczność szumu pokrywa się dobrze z czasem t dla pierwszego maksimum krzywej FCS powstałej z korelowania takiego 182 Rozdział 9. Dyskusja pomiaru. Zgadza się to z relacją opisaną przez (Zamir et al., 2017) dowodzącą, że pierwsze maksimum na wykresie FCS może odpowiadać częstotliwości przepływu kropel z barwnikiem, a w moim przypadku częstotliwości szumu. W drugim przypadku także rejestrowałem periodyczny szum, jednak jego amplituda tylko nieznacznie przewyższała średni poziom fluktuacji sygnału z próbki, ale także po 2-3 sekundach zanikała. Szum ten także powodował, że na krzywej FCS pojawiały się charakterystyczne oscylacje. Jednak czas charakterystyczny dla pierwszego maksimum bywał różny. Takie pomiary były zawsze odrzucane z analizy doświadczeń, jakie opisałem w niniejszej pracy. Rzeczą zaskakującą dla mnie było pojawienie się oscylacji w sytuacji, kiedy jej się nie spodziewałem. Otóż w pomiarach prowadzonych w ognisku XRCC1 pomimo braku widocznego periodycznego szumu w rejestracji fluktuacji fluorescencji na krzywej FCS pojawiały się bardzo często niespodziewane oscylacje. W przypadku pomiarów HP1 w jego ogniskach naprawczych takich periodyczności nie obserwowałem. Wydaje się, że możliwym wytłumaczeniem pojawiających się oscylacji jest potencjalna obserwacja w czasie pomiaru nie tylko stochastycznego ruchu cząsteczek XRCC1 w rejonie jego akumulacji, ale także ich kierunkowy ruch w trakcie gromadzenia. Pomiary prowadziłem zaraz po uszkodzeniu, nie odczekiwałem paru minut, jak to miało miejsce w przypadku HP1. Wydaje się, że w trakcie prowadzenia pomiarów dla XRCC1 ognisko pomimo, że było już widoczne, nie było do końca uformowane, cząsteczki białka ciągle napływały. Zogniskowanie wiązki lasera w centrum uszkodzenia wydaje się z przyczyn technicznych niemożliwe, przez to zapewne prowadziłem pomiary niecentrycznie lub na obrzeżach rejonu uszkodzenia i przez to mogłem obserwować kierunkowy ruch molekuł. Należy podkreślić, że przy obecnym stanie wiedzy jest to hipoteza. W celu jej potwierdzenia warto byłoby przeprowadzić kontrolne eksperymenty na prostszym układzie. Należałoby zweryfikować, czy faktycznie możliwe jest zmierzenie przy pomocy FCS kierunkowego ruchu cząsteczek. Jednym z takich doświadczeń mógłby być przepływ barwnika fluorescencyjnego pomiędzy dwoma ściśniętymi szkiełkami położonymi na stoliku mikroskopu. Zjawisko to, pomimo, że może być artefaktem metody lub przyczynkiem od innego nieznanego mi rodzaju szumu, zainspirowało mnie. Uzyskane dane nie rozstrzygają czy oscylacje, których częstotliwość występowania w przypadku pomiarów w ogniskach XRCC1 jest bardzo wysoka, niosą za sobą istotną informacje biologiczną czy jest to raczej stochastycznie pojawiający się szum elektroniczny. Intrygujące jest to, że niespodziewane oscylacje nie występują w przypadku pomiarów HP1 w nukleoplazmie, w jego ognisku czy dla innych białek (pomiary FCS prowadziłem także 183 Dyskusja Rozdział 9. dla białek RAD51, 53BP1 czy histonów). Wydaje się, że w przypadku XRCC1, dla którego obserwujemy najsilniejszy efekt szybkiego gromadzenia, jest największa szansa obserwacji postulowanego ruchu kierunkowego. Obserwację tę traktuję jako inspirację do podjęcia próby wykazania oscylacji w pomiarach innych układów biologicznych, gdzie kierunkowy ruch cząsteczek byłby przewidywalny. 184 Rozdział 9. Dyskusja Rycina 9.8. Oscylacje na krzywej FCS w czasie pomiarów w komórkach. A - Odczytfotonów na detektorze. Odczyty rzędu 400 tys. zliczeń na sekundę są niemożliwe, detektor uległ by uszkodzeniu. Jest to regularny sygnał powstały w późniejszym etapie przetwarzania sygnału; B - powiększenie fragmentu wykresu, pokazujący, że okresowość wykresu wynosi w przybliżeniu 99ms; C - krzywa autokorelacji wykonana na podstawie tak zarejestrowanego sygnału. Pierwsze maksimum wynosi 97,18ms; D,E - periodyczne szumy pojawiające się w czasie pomiaru FCS wpływają znacząco na kształt krzywej FCS - pojawiają się niespodziewane oscylacje; F - pomiary fluktuacji fluorescencji bez wyraźnego wzoru oraz krzywe FCS dla kolejnych pomiarów. Uzyskane krzywe zawierają niespodziewaną oscylacje pod koniec przebiegu. 185 Streszczenie wyników Rozdział 10. Rozdział 10. Streszczenie wyników • W nukleoplazmie pod względem mobilności można wyróżnić dwie subpopulacje białka XRCC1. Pierwsza z nich złożona jest z cząsteczek swobodnie poruszających się, natomiast druga reprezentuje cząsteczki które wiążą się przejściowo z innymi relatywnie stabilnymi strukturami w nukleoplazmie. • Domena BRCT1 odgrywa istotną rolę w dynamice białka XRCC1 w nukleoplazmie. Jej deaktywacja skutkująca zaburzeniem procesów homodimeryzacji białka XRCC1, a także jego potencjalnego oddziaływania z domeną BRCT polimeraz PARP1 oraz PARP2, powoduje znaczący spadek mobilności białka w obszarze jądra komórkowego. Mniejsza ruchliwość może być skutkiem niespecyficznego wiązania się białka XRCC1 poprzez domenę BRCT1 do innych składników jądra komórkowego. • Brak domeny BRCT2 w białku XRCC1 może powodować zaburzenie w oddziaływaniu tego białka z innymi składnikami jądra komórkowego. Poprzez tę domenę białko XRCC1 oddziałuje m. in. z domeną BRCT ligazy IIIa. Ograniczenie lub nawet brak oddziaływania z innymi białkami mogło spowodować, że XRCC1P537STOP porusza się szybciej. Jego mobilność w nukleoplazmie jest niższa niż białka XRCC1 typu dzikiego w cytoplazmie. Może to świadczyć, że część jego zdolności do oddziaływań została jednak zachowana. • Dezaktywacja miejsc fosforylacji białka XRCC1 nie wpłynęła na jego mobilność w nukleoplazmie. Oznacza to, że potencjalna fosforylacja białka nie wpływa na jego oddziaływanie z innymi składnikami nukleoplazmy poza obszarem naprawy uszkodzenia DNA. • Wśród cząsteczek XRCC1 wchodzących w skład ogniska naprawy DNA można wyróżnić dwie subpopulacje, szybszą i wolniejszą. Cząsteczki należące zarówno do pierwszej, jak i drugiej subpopulacji poruszają się około dwukrotnie wolniej od cząsteczek obu subpopulacji w nukleoplazmie. Możliwe, że pierwsza pula cząsteczek 186 Rozdział 10. Streszczenie wyników porusza się wolniej od subpopulacji w nukleoplazmie na skutek wzrostu lokalnego zagęszczenia molekularnego w obszarze prowadzonej naprawy DNA. Natomiast niska wartość współczynnika dyfuzji drugiej puli cząsteczek może świadczyć o wiązaniu XRCC1 do chromatyny i zaangażowaniu w proces rekrutacji innych białek biorących udział w procesie naprawy lub lokalnej stabilizacji chromatyny wokół miejsca uszkodzenia. • Dezaktywacja miejsc fosforylacji białka XRCC1 nie wpływa znacząco na jego zachowanie w obszarze prowadzonej naprawy DNA w porównaniu z znakowanym XRCC1 formy dzikiej. Wydaje się, że fosforylacja białka XRCC1 nie wpływa w istotny sposób na jego oddziaływanie z innymi białkami lub chromatyną w rejonie naprawy DNA. • Mobilność wszystkich paralogów HP1 w nukleoplazmie jest do siebie zbliżona. W każdym przypadku pierwsza, szybsza subpopulacja reprezentuje tę pulę cząsteczek HP1, które swobodnie poruszają się w obrębie jądra komórkowego. Drugą, poruszającą się wolniej, można utożsamiać z cząsteczkami oddziałującymi z chromatyną w nukleoplazmie, ponieważ wyznaczone dla drugiej subpopulacji współczynniki dyfuzji są zbliżone do współczynnika dyfuzji znakowanego histonu H2B, będącego markerem chromatyny. Dla każdego paralogu stosunek ilościowy pomiędzy subpopulacją związaną z chromatyną a subpopulacją swobodnie dyfundującą wynosi 1:4. • W rejonie naprawy DNA można wyróżnić trzy subpopulacje wśród znajdujących się tam HP1, różniące się mobilnością. Pierwsza (D1HP1ß DDR = 3,74±0,47^m2/s) opisuje cząsteczki HP1 nie wiążące się do chromatyny, jednak przez jej potencjalne zagęszczenie, ta subpopulacja HP1 ma utrudnioną możliwość poruszania się w porównaniu ze swobodnie dyfundującymi cząsteczkami HP1 w nukleoplazmie poza ogniskiem naprawy. Mobilność drugiej i trzeciej subpopulacji wskazuje, że są one związane z chromatyną (D2HP1ß DDR = 1,13±0,78 ^m2/s, D3HP1ß DDR = 0,17±0,05 |im2/s). Stosunek ilościowy pomiędzy wszystkimi subpopulacjami wynosi (frÆf = 3:1:2.5). Druga z nich dyfunduje z tempem domniemywanej mobilności chromatyny w regionie uszkodzenia. Możliwe, że przywołane cząsteczki HP1 w obszar uszkodzenia są zaangażowane w tworzenie mostków pomiędzy włóknami chromatyny i ją stabilizują. 187 Najważniejsze wnioski Rozdział 11. Rozdział 11. Najważniejsze wnioski Rycina 11.1 ujmuje syntetycznie najważniejsze wnioski z przeprowadzonych badań: • W ognisku DDR następuje gwałtowny spadek dynamiki XRCC1 oraz HP1 w porównaniu do obszarów nieuszkodzonej chromatyny. • Wśród cząsteczek wchodzących w skład ogniska DDR ponad 30% porusza się bardzo wolno. • Możliwe, że tak duża liczba wolno poruszających się cząsteczek wiąże się do chromatyny. • Część cząsteczek obu białek porusza się w ognisku DDR wolniej niż nawet nieuszkodzona chromatyna, co może wskazywać na ich uczestniczenie w stabilizowaniu lokalnej struktury chromatyny poprzez współtworzenie węzłów w jej sieci pomiędzy fragmentami chromatyny. • Ruchliwość najwolniejszych subpopulacji XRCC1 i HP1 w obszarze naprawy DNA jest bardzo do siebie podobna. • Tak duża ilość cząsteczek XRCC1 niemal unieruchomiona w rejonie uszkodzenia może także pełnić rolę silnego sygnału gromadzenia dla pozostałych czynników naprawczych. 188 Rozdział 11. Najważniejsze wnioski mRFP-XRCC1 eGFP-HP1ß Rycina 11.1. Wartości współczynników dyfuzji (A) oraz stosunek ilościowy (B) pomiędzy subpopulacjami mRFP-XRCC1 oraz eGFP-HP1 w cytoplazmie, nukleoplazmie oraz ognisku naprawy oraz przykładowe obrazy mikroskopowe ognisk naprawy DNA w komórkach (C). 189 Perspektywy dalszych badań Rozdział 12. Rozdział 12. Perspektywy dalszych badań Przedstawione w niniejszej rozprawie wyniki doświadczeń skupiające się na opisie dynamiki dwóch wybranych białek (HP1 oraz XRCC1) w rejonie zachodzącej naprawy DNA stały się impulsem do dalszych badań w tym kierunku. Zmiana ich mobilności świadczy o potencjalnym ich wiązaniu się do chromatyny w rejonie uszkodzenia. Jest to zjawisko, które może wpływać na wydajność i efektywność prowadzonej naprawy. W ramach kontynuowania badań planowane jest zbadanie roli wybranych białek naprawczych w lokalnych zmianach kondensacji chromatyny w rejonie uszkodzenia. Obecne doniesienia literaturowe wskazują na możliwe zmiany w strukturze chromatyny po jej lokalnym uszkodzeniu. Autorzy pracy (Kruhlak et al., 2006) sugerują lokalne rozluźnienie struktury chromatyny w celu ułatwienia sygnalizacji oraz gromadzenia kolejnych białek naprawczych. Późniejsza praca (Burgess et al., 2014) dowodzi jednak, że to kondensacja chromatyny jest integralną i przejściową odpowiedzią na uszkodzenie DNA. Skondensowana chromatyna wzmaga sygnalizację, ale także może spowodować zahamowanie dalszej naprawy. Wydaje się, że zmiany w kondensacji chromatyny są kluczowe w procesie naprawy DNA. W celu uchwycenia zmian w lokalnej dynamice chromatyny w rejonie uszkodzenia planuję przeprowadzić pomiary FCS. W doświadczeniach jako znacznika chromatyny planowane jest użycie znakowanych histonów rdzeniowych. Pomiary będą wykonywane w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA z odpowiednio dobranym krokiem czasowym. W ten sposób będzie można oszacować zmianę dynamiki chromatyny w czasie prowadzonej naprawy. Pierwszym etapem było udowodnienie tezy, że znakowany histon może służyć w pomiarach FCS jako znacznik chromatyny. W tym celu przeprowadzono pomiary FCCS pomiędzy różnie wyznakowanymi histonami rdzeniowymi - Rycina 12.1. Krzywa FCCS pomiędzy H3-RFP670, a H4-eGFP. Wskazuje ona na ich bliskie sąsiedztwo. Doświadczenie przeprowadzone we współpracy z panią mgr. Agnieszką Hoang- Bujnowicz. 190 Rozdział 12. Perspektywy dalszych badań H3-miRFP670 oraz H4-eGFP (Rycina 12.1). W pierwszych doświadczeniach zaobserwowano wyraźną korelację pomiędzy ruchami tych białek świadczące o ich oddziaływaniu co potwierdziło, że FCS jest narzędziem zdolnym do pomiaru dynamiki chromatyny. Pierwsze doświadczenia przeprowadzone we współpracy z panią mgr. Agnieszką Hoang Bujnowicz, wykorzystujące znakowany histon H3 sugerują, że po indukcji uszkodzenia ruchy chromatyny ulegają z czasem spowolnieniu. Wynik ten wymaga potwierdzenia m. in poprzez wykorzystanie także innych znakowanych histonów. Kolejnym krokiem w toku planowanych badań jest oszacowanie wpływu gromadzących się białek na lokalną dynamikę chromatyny w rejonie naprawy. W tym celu zostaną przeprowadzone analogiczne doświadczenia na komórkach z knockdown’em genów kodującego HP1 i 53BP1. Brak białek w miejscu naprawy, które mogą pełnić rolę czynnika stabilizującego powinien spowodować rozluźnienie struktury chromatyny i zaburzyć sam proces naprawy. Oprócz zmian w dynamice samej chromatyny interesujący jest także proces oddziaływania z nią białek naprawczych. Dzięki zastosowaniu techniki FCCS będzie możliwe oszacowanie stałej wiązania wybranych białek do nici DNA (szczególnie interesujące doświadczenie to FCCS pomiędzy H3-RFP670, a eGFP-HP1 z zastosowaniem filtru FLCS, dzięki któremu będzie możliwe poprawienie jakości rejestrowanego sygnału). Dodatkowo planowane jest podjęcie próby wyznaczenia ilości białka tworzącego powstałe ogniska. Zakłada się, że ogniska składają się z setek albo tysięcy cząsteczek białka, jednak do tej pory liczba ta opiera się na przybliżonych rachunkach, ogólnej wiedzy z zakresu mikroskopii i biologii komórki, 191 Rycina 12.2. Struktura ogniska yH2AX w miejscu uszkodzenia DNA. Porównanie wizualizacji ogniska yH2AX przy użyciu szerokiego pola (A,C) i mikroskopii wysokorozdzielczej (B,D). Obrazy uzyskane przez K. Berniaka w Laboratorium prof. Ch.Cremera w Moguncji w Niemczech. Rycina 12.3. Rozkład przestrzenny białek RAD51(czerwony) oraz yH2AX (zielony) w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA. A,C - mikroskopia szerokiego pola; B,D - mikroskopia wysokorozdzielcza. Obrazy uzyskane przez K. Berniaka w Laboratorium prof. Ch.Cremera w Moguncji w Niemczech. Perspektywy dalszych badań Rozdział 12. ale nie była do tej pory precyzyjnie mierzona. W celu odpowiedzenia na to pytanie opracowałem algorytm pozwalający na podstawie zarejestrowanych przekrojów przez ognisko przy użyciu mikroskopii konfokalnej oszacować wielkość, a także ilość zgromadzonego białka XRCC1 lub HP1 w ognisku. Rozmiar i architektura powstałych ognisk naprawy, gdzie białka jak HP1 zajmują określony obszar, jest kolejnym aspektem planowanych badań. Struktura taka, trudna jest do zobrazowania przy użyciu mikroskopii konfokalnej z powodu jej niewielkich rozmiarów (rzędu 300 nm). W celu uzyskania lepszej rozdzielczości i dokładniejszej informacji o obszarze naprawy w obrazowaniu zakumulowanego białka HP1 oraz innych białek jak RAD51 oraz 53BP1 zamierzam użyć mikroskopii wysokorozdzielczej dostępnej w laboratorium. Wstępne doświadczenia z wykorzystaniem wysokorozdzielczego obrazowania struktury ognisk naprawczych przeprowadziłem w Moguncji pod opieką prof. Cremera, (Rycina 12.2 oraz 12.3). Dzięki zastosowaniu tej techniki będzie możliwe zaobserwowanie zmian przestrzennych w rozkładzie białek w obszarze naprawy. Pierwsze wyniki z pomiarów FCS i FCCS chromatyny oraz obrazowania wysokorozdzielczego w miejscu uszkodzenia są obiecujące, a ich dalsze kontynuacja może pozwolić znacznie poszerzyć wiedzę z zakresu mechanizmów molekularnych procesów naprawy uszkodzeń DNA oraz ich organizacji przestrzennej w odniesieniu do rozkładu chromatyny. 192 Rozdział 13. Spis tabel i rycin Rozdział 13. Spis tabel i rycin 13.1 Spis tabel Rozdział 7. Materiały i Metody Tabela 7.1. Odczyty pomiaru moce laserów 470nm i 488nm. 54 Tabela 7.2. Wartości współczynników dyfuzji dla barwników kalibracyjnych w temperaturach 25oC oraz 37oC. 65 Rozdział 8. Wyniki Tabela 8.1. Porównanie mobilności białek eGFP-HP1ß oraz mCherry-HP1ß w jądrze komórkowym na podstawie pomiarów FCS i dopasowania modelu. 130 Rozdział 9. Dyskusja Tabela 9.1. Syntetyczne ujęcie wyników pomiarów mobilność HP1 i XRCC1 oraz ich metek. 139 Tabela 9.2 Długość łańcucha aminokwasowego i masa użytych metek fluorescencyjnych oraz badanych białek. Mutanty XRCC1(oprócz XRCC1P537STOP) mają podobną masę do XRCC1 typu dzikiego. 140 Tabela 9.3. Zestawienie wybranych parametrów dopasowania modelu jedno- i dwuskładowej anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej dla swobodnego białka eGFP w cytoplazmie i nukleoplazmie komórek HeLa. 143 Tabela 9.4 Zestawienie wybranych parametrów dla białek GFP oraz HP1 (Muller i inni 2009) 147 Tabela 9.5 Zestawienie wybranych parametrów z dopasowania modelu do krzywej dla swobodnego mRFM w nukleoplazmie na podstawie pomiarów opisanych w tej rozprawie. 147 Tabela 9.6 Wartości współczynników dyfuzji dla mono-, di- i pentamerów białka GFP i RFP wyznaczone przy użyciu 147 193 Spis tabel i rycin Rozdział 13. technik msFCCS i FRAP. Tabela zaczerpnięta z pracy Baum i inni. 2014 Tabela 9.7 Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywej autokorelacyjnej dla pomiarów FCS wszystkich paralogów białka HP1 (HP1a, HP1ß, HP1y) w cytoplazmie. 149 Tabela 9.8 Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacyjnych dla pomiarów FCS wszystkich paralogów białka HP1 (HP1a, HP1ß, HP1y) w nukleoplazmie. 152 Tabela 9.9. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwu lub trzyskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywej autokorelacyjnej dla pomiarów FCS białka HP1 w nukleoplazmie. 153 Tabela 9.10 Wyniki pomiarów dyfuzji metodą FCS dla HP1a oraz HP1ß w komórkach linii 3T3 (tabela zaczerpnięta z pracy K.Muller 2009). 157 Tabela 9.11. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywej autokorelacyjnej dla pomiarów FCS białka HP1 w cytoplazmie, nukleoplazmie (dwie subpopulacje) oraz w ognisku naprawczym (dwie i trzy subpopulacje). 161 Tabela 9.12. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywej autokorelacyjnej dla pomiarów FCS białka eGFP-HP1ß w nukleoplazmie oraz analogicznie modelu z trzema składowymi dla HP1ß w ognisku naprawczym. 165 Tabela 9.13. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacyjnych dla pomiarów FCS białka XRCC1 z metką mRFP oraz z metką eGFP. 169 Tabela 9.14. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacyjnych dla pomiarów FCS białka mRFP-XRCC1 oraz jego 174 194 Rozdział 13. Spis tabel i rycin znakowanych mutantów XRCC1L360R oraz XRCC1P537STOP w nukleoplazmie. Tabela 9.15. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacyjnych dla pomiarów FCS białka XRCC1 oraz jego mutantów XRCC1S371A, XRCC1T284A oraz XRCC1-4P w nukleoplazmie. 175 Tabela 9.16. Wyniki dopasowania modelu anomalnej dyfuzji dwuskładowej z uwzględnieniem subpopulacji trypletowej do krzywych autokorelacji dla pomiarów FCS przeprowadzonych dla XRCC1 oraz jego mutantów XRCC1S371A, XRCC1T284A, XRCC1-4P w nukleoplazmie oraz w ognisku naprawczym. 181 13.2. Spis rycin Rozdział 5. Wstęp Rycina 5.1. Struktura białka XRCC1 21 Rycina 5.2. Porównanie mobilności GFP-XRCC1 i RFP-PCNA w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA po inkubacji z BrdU i lokalnym naświetlaniu światłem o długości fali 405 nm. 23 Rycina 5.3. Struktura cząsteczki HP1. 26 Rycina 5.4. Dynamika HP1ß, PCNA i kompleksu HP1-PCNA w miejscu naprawy DNA. 29 Rycina 5.5. Wykres średniego kwadratu przemieszczenia cząsteczek w czasie w zależności od rodzaju dyfuzji. 33 Rycina 5.6. Porównanie skal czasowych wybranych metod mikroskopowych oraz typów procesów biologicznych. 35 Rycina 5.7. Przykładowe krzywe FRAP i FLIP. 36 Rycina 5.8. Zasada metody FCS. 40 Rozdział 6. Hipoteza i Cele badań Rycina 6.1. Lokalizacja białka XRCC1 w rejonie prowadzonej naprawy DNA. 47 Rycina 6.2. Lokalizacja HP1 w rejonie uszkodzenia DNA. 48 Rozdział 7. Materiały i Metody Rycina 7.1. Badanie dynamiki XRCC1 - schemat doświadczenia FLIP na komórkach z ekspresją mRFP-XRCC1. 58 195 Spis tabel i rycin Rozdział 13. Rycina 7.2. Schemat blokowy układu mikroskopowego użytego w doświadczeniach FCS. 61 Rycina 7.3. Kluczowe etapy kalibracji mikroskopu przed doświadczeniem FCS. 64 Rycina 7.4. Rozkład intensywności fluorescencji sygnału od białka eGFP-HP1ß (w przejściowej ekspresji). 68 Rycina 7.5. Weryfikacja generowania widocznej akumulacji białka HP1 wywołanej pomiarem FCS. 70 Rycina 7.6 Obrazy rozmieszczenia eGFP-HP1 w kolejnych etapach doświadczenia z pomiarem FCS w miejscu jego gromadzenia. 72 Rycina 7.7. Przykładowe pomiary średnicy ognisk XRCC1 w układach z obiema metkami fluorescencyjnymi (eGFP i mRFP). 74 Rycina 7.8. Wpływ światła wzbudzającego używanego w czasie pomiaru FCS na fluorofor i chromatynę. 75 Rozdział 8. Wyniki Rycina 8.1 Pomiar FLIP swobodnej metki mRFP w jądrze komórkowym. 86 Rycina 8.2 Krzywa FLIP dla swobodnej metki mRFP w jądrze komórkowym wraz z dopasowaniem modeli. 87 Rycina 8.3 Badanie mobilności białka mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie metodą FLIP. 89 Rycina 8.4 Krzywa FLIP dla mRFP-XRCC1 w ognisku naprawy. 91 Rycina 8.5 Mobilność swobodnej metki eGFP w jądrze komórkowym mierzona metodą FCS. 94 Rycina 8.6 Mobilność swobodnej metki mRFP w jądrze komórkowym zmierzona metodą FCS. 96 Rycina 8.7 Porównanie dopasowania modelu dwu- i trójskładowego do krzywej FCS dla mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie. 100 Rycina 8.8 Mobilność mRFP-XRCC1 w nukleoplazmie oraz w cytoplazmie badana metodą FCS. 101 Rycina 8.9 Mobilność eGFP-XRCC1 w nukleoplazmie oraz w cytoplazmie badana metodą FCS. 103 Rycina 8.10 Porównanie dopasowania modelu dwu- i trójskładowego do krzywej FCS dla mRFP-XRCC1 w obszarze jego akumulacji. 105 Rycina 8.11 Mobilność mRFP-XRCC1 w ognisku naprawczym badana metodą FCS. 106 Rycina 8.12 Mobilność mRFP-XRCC1P537STOP w nukleoplazmie. 109 Rycina 8.13 Mobilność mRFP-XRCC1L360R w nukleoplazmie. 111 196 Rozdział 13. Spis tabel i rycin Rycina 8.14 Mobilność mRFP-XRCC1S371A w nukleoplazmie metodą FCS. 113 Rycina 8.15 Mobilność mRFP-XRCC1S371A w ognisku naprawczym badana metodą FCS. 115 Rycina 8.16 Mobilność mRFP-XRCC1T284A w nukleoplazmie metodą FCS. 117 Rycina 8.17 Mobilność mRFP-XRCC1T284A w ognisku naprawczym badana metodą FCS. 119 Rycina 8.18 Dwie subpopulacje komórek różniące się rozkładem białka RFP-XRCC1"4P w jądrze komórkowym. 120 Rycina 8.19 Mobilność mRFP-XRCC1-4P w nukleoplazmie badana metodą FCS. 122 Rycina 8.20 Mobilność mRFP-XRCC1-4P w ognisku naprawczym badana metodą FCS. 124 Rycina 8.21 Mobilność eGFP- HP1a w jądrze komórkowym, w pomiarach FCS. 127 Rycina 8.22 Mobilność eGFP-HPy w jądrze komórkowym w pomiarach FCS. 129 Rycina 8.23 Pomiary FCS białka eGFP-HP1ß w nukleoplazmie oraz w miejscu jego akumulacji jako odpowiedzi na lokalne uszkodzenie DNA. 133 Rycina 8.24 Porównanie dopasowania modelu dwu- i trójskładowego do krzywej FCS dla eGFP-HP1ß w ognisku naprawy DNA. 134 Rycina 8.25 Mobilność eGFP-H2B w nukleoplazmie badana metodą FCS. 136 Rozdział 9. Dyskusja Rycina 9.1. Widma emisji eGFP i pochodnych flawin. 141 Rycina 9.2. Zestawienie zarejestrowanej przeze mnie fluktuacji intensywności fluorescencji w pomiarach FCS dla znakowanego HP1 w cytoplazmie i w nukleoplazmie wraz z pomiarami przedstawionymi w pracy Schmiedeberg et al. 2004. 155 Rycina 9.3. Wykresy profili intensywności sygnału fluorescencji z obszarów akumulacji białka HP1ß. 162 Rycina 9.4. Schemat ilustrujący mobilność postulowanych subpopulacji HP1 w rejonie prowadzonej naprawy DNA. 166 Rycina 9.5. Widmo wzbudzenia i emisji białka mRFP. 169 Rycina 9.6. Wykresy profili intensywności sygnału fluorescencji z obszarów akumulacji białka XRCC1. 172 197 Spis tabel i rycin Rozdział 13. Rycina 9.7. Schemat ilustrujący mobilność XRCC1 w rejonie prowadzonej naprawy DNA. 179 Rycina 9.8. Oscylacje na krzywej FCS w czasie pomiarów w komórkach. 185 Rozdział 11. Najważniejsze wnioski Rycina 11.1. Wartości współczynników dyfuzji oraz stosunek ilościowy pomiędzy subpopulacjami mRFP-XRCC1 oraz eGFP-HP1 w cytoplazmie, nukleoplazmie oraz ognisku naprawy oraz przykładowe obrazy mikroskopowe ognisk naprawy DNA w komórkach. 189 Rozdział 12. Perspektywy dalszych badań Rycina 12.1. Krzywa FCCS pomiędzy H3-RFP670, a H4-eGFP. 190 Rycina 12.2. Struktura ogniska yH2AX w miejscu uszkodzenia DNA. 191 Rycina 11.3. Rozkład przestrzenny białek RAD51 oraz yH2AX w miejscu lokalnego uszkodzenia DNA. 191 198 Rozdział 14. Literatura Rozdział 14. Literatura Aasland R, Stewart AF. 1995. The chromo shadow domain, a second chromo domain in heterochromatin-binding protein 1, HP1. Nucleic acids research 23: 3168-73. Aleksandrov R, Dotchev A, Poser I, Krastev D, Georgiev G, Panova G, Babukov Y, Danovski G, Dyankova T, Hubatsch L, Ivanova A, Atemin A, Nedelcheva-Veleva MN, Hasse S, Sarov M, Buchholz F, Hyman AA, Grill SW, Stoynov SS. 2018. Protein Dynamics in Complex DNA Lesions. Molecular Cell 69: 1046-1061.e5. Ayoub N, Jeyasekharan AD, Bernal J a, Venkitaraman AR. 2008. HP1-beta mobilization promotes chromatin changes that initiate the DNA damage response. Nature 453: 682-6. Ayoub N, Jeyasekharan AD, Venkitaraman AR. 2009. Mobilization and recruitment of HP1ß: A bimodal response to DNA breakage. Cell Cycle 8: 2946-2951. Ayrapetov MK, Gursoy-Yuzugullu O, Xu C, Xu Y, Price BD. 2014. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences 111: 9169-9174. Bag N, Wohland T. 2014. Imaging fluorescence fluctuation spectroscopy: new tools for quantitative bioimaging. Annual review of physical chemistry 65: 225-48. Baldeyron C, Soria G, Roche D, Cook AJL, Almouzni G. 2011. HP1alpha recruitment to DNA damage by p150CAF-1 promotes homologous recombination repair. The Journal of cell biology 193: 81-95. Banks DS, Fradin C. 2005. Anomalous Diffusion of Proteins Due to Molecular Crowding. Biophysical Journal 89: 2960-2971. Bannister AJ, Zegerman P, Partridge JF, Miska EA, Thomas JO, Allshire RC, Kouzarides T. 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410: 120-4. Baum M, Erdel F, Wachsmuth M, Rippe K. 2014. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications 5: 4494. Benson RC, Meyer RA, G.M. ZMEM. 1979. Cellular Autofluorescence - Is it due to Flavins? The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 27: 44-48. Berland KM, So PT, Gratton E. 1995. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy: method and application to the intracellular environment. Biophysical Journal 68: 694-701. Bolderson E, Savage KI, Mahen R, Pisupati V, Graham ME, Richard DJ, Robinson PJ, Venkitaraman AR, Khanna KK. 2012. Kruppel-associated Box (KRAB)-associated co-repressor (KAP-1) Ser-473 phosphorylation regulates heterochromatin protein 1ß (HP1-ß) mobilization and DNA repair in heterochromatin. The Journal of biological chemistry 287: 28122-31. Brasher S V. 2000. The structure of mouse HP1 suggests a unique mode of single peptide recognition by the shadow chromo domain dimer. The EMBO Journal 19: 1587-1597. 199 Literatura Rozdział 14. Brock R, Hink MA, Jovin TM. 1998. Fluorescence Correlation Microscopy of Cells in the Presence of Autofluorescence. 75: 2547-2557. Brown TA. 2009. Genomy. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa: 676-682. Burgess RC, Burman B, Kruhlak MJ, Misteli T. 2014. Activation of DNA Damage Response Signaling by Condensed Chromatin. Cell Reports 9: 1703-1718. Caldecott KW. 2008. Single-strand break repair and genetic disease. Nature Reviews Genetics 9: 619-631. Caldecott KW, Aoufouchi S, Johnson P, Shall S. 1996. XRCC1 polypeptide interacts with DNA polymerase ß and possibly poly (ADP-ribose) polymerase, and DNA ligase III is a novel molecular 'nick-sensor' in vitro. Nucleic Acids Research 24: 4387-4394. Caldecott KW, McKeown CK, Tucker JD, Ljungquist S, Thompson LH. 1994. An interaction between the mammalian DNA repair protein XRCC1 and DNA ligase III. Molecular and cellular biology 14: 68-76. Campalans A, Marsin S, Nakabeppu Y, O'Connor TR, Boiteux S, Radicella JP. 2005. XRCC1 interactions with multiple DNA glycosylases: A model for its recruitment to base excision repair. DNA Repair 4: 826-835. Chang HHY, Pannunzio NR, Adachi N, Lieber MR. 2017. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology 18: 495-506. Chapman JR, Sossick AJ, Boulton SJ, Jackson SP. 2012. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. Journal of cell science 125: 3529-34. Chen J, Irudayaraj J. 2010. Fluorescence lifetime cross correlation spectroscopy resolves EGFR and antagonist interaction in live cells. Analytical Chemistry 82: 6415-6421. Chen S, Wang C, Sun L, Wang DL, Chen L, Huang Z, Yang Q, Gao J, Yang XB, Chang JF, Chen P, Lan L, Mao Z, Sun FL. 2015. RAD6 Promotes Homologous Recombination Repair by Activating the Autophagy-Mediated Degradation of Heterochromatin Protein HP1. Molecular and Cellular Biology 35: 406-416. Cheutin T, Mcnairn AJ, Jenuwein T. 2003. Maintenance of Stable Heterochromatin Domains by Dynamic HP1 Binding. Science 299: 721-726. Chiolo I, Minoda A, Colmenares SU, Polyzos A, Costes S V., Karpen GH. 2011. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell 144: 732-744. Chou WC, Wang HC, Wong FH, Ding SL, Wu PE, Shieh SY, Shen CY. 2008. Chk2-dependent phosphorylation of XRCC1 in the DNA damage response promotes base excision repair. EMBO Journal 27: 3140-3150. Chu J, Haynes RD, Corbel SY, Li P, Gonzalez-Gonzalez E, Burg JS, Ataie NJ, Lam AJ, Cranfill PJ, Baird MA, Davidson MW, Ng HL, Garcia KC, Contag CH, Shen K, Blau HM, Lin MZ. 2014a. Non- invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nature methods 11: 572-8. Chu L, Huo Y, Liu X, Yao P, Thomas K, Jiang H, Zhu T, Zhang G, Chaudhry M, Adams G, Thompson W, Zhen D, Jin C, He P, Yao X. 2014b. The spatiotemporal dynamics of chromatin protein HP1alpha is essential for accurate chromosome segregation during cell division. The 200 Rozdział 14. Literatura Journal of biological chemistry. Cooper G. 2000. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates; Protein Folding and Processing. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9843/. Cremer T, Cremer M, Hübner B, Strickfaden H, Smeets D, Popken J, Sterr M, Markaki Y, Rippe K, Cremer C. 2015. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co- aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters 589: 2931-2943. Croce AC, Bottiroli G. 2015. New Light in Flavin Autofluorescence. European Journal of Histochemistry 59: 3-4. Cseresnyes Z, Schwarz U, Green CM. 2009. Analysis of replication factories in human cells by super-resolution light microscopy. BMC Cell Biology 10: 88. Douarin B Le, Nielsen AL, Garnier J marie, Ichinose H, Jeanmougin F, Losson R. 1996. A possible involvement of TIFIa and TIF1, in the epigenetic control of transcription by nuclear receptors. The EMBO Journal 15: 6701-6715. Downs JA, Jackson SP. 2004. A means to a DNA end: the many roles of KU. 5: 367-378. Dross N, Spriet C, Zwerger M, Müller G, Waldeck W, Langowski J. 2009. Mapping eGFP oligomer mobility in living cell nuclei. PloS one 4: e5041. Van Dyck E, Stasiak AZ, Staslak A, West SC. 1999. Binding of double-strand breaks in DNA by human Rad52 protein. Nature 398: 728-731. Eigen M, Rigler R. 1994. Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91: 5740-7. El-Khamisy SF, Masutani M, Suzuki H, Caldecott KW. 2003. A requirement for PARP-1 for the assembly or stability of XRCC1 nuclear foci at sites of oxidative DNA damage. Nucleic Acids Research 31: 5526-5533. Enderlein J, Gregor I, Patra D, Dertinger T, Kaupp UB. 2005. Performance of fluorescence correlation spectroscopy for measuring diffusion and concentration. ChemPhysChem 6: 2324- 2336. Eskeland R, Eberharter A, Imhof A. 2007. HP1 binding to chromatin methylated at H3K9 is enhanced by auxiliary factors. Molecular and cellular biology 27: 453-65. Fan J, Otterlei M, Wong HK, Tomkinson AE, Wilson DM. 2004. XRCC1 co-localizes and physically interacts with PCNA. Nucleic Acids Research 32: 2193-2201. Fanti L, Pimpinelli S. 2008. HP1: a functionally multifaceted protein. Current opinion in genetics & development 18: 169-74. Feng Y li, Xiang J feng, Kong N, Cai X jun, Xie A yong. 2016. Buried territories : heterochromatic response to DNA double-strand breaks. 48: 594-602. Festenstein R, Pagakis S, Hiragami K, Lyon D, Verreault A, Sekkali B, Kioussis DO. 2003. Modulation of Heterochromatin Protein 1 Dynamics in Primary Mammalian Cells. Science 299: 719-721. Festenstein R, Sharghi-namini S, Fox M, Roderick K, Tolaini M, Norton T, Saveliev A, Kioussis D, Singh P. 1999. Heterochromatin protein 1 modifies mammalian PEV in a dose- and chromosomal-context-dependent manner. Nature America Letter 23: 457-461. 201 Literatura Rozdział 14. Forster T. 1946. Energiewanderung und Fluoreszenz. Die Naturwissenschaften 33: 166-175. Giancaspero TA, Busco G, Panebianco C, Carmone C, Miccolis A, Liuzzi GM, Colella M, Barile M. 2013. FAD synthesis and degradation in the nucleus create a local flavin cofactor pool. Journal of Biological Chemistry 288: 29069-29080. Goodarzi AA, Noon AT, Deckbar D, Ziv Y, Shiloh Y, Löbrich M, Jeggo P a. 2008. ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin. Molecular cell 31: 167-77. Goodarzi AA, Yu Y, Riballo E, Douglas P, Walker A, Ye R, Ha C, Marchetti C, Morrice N, Jeggo A, Lees-miller SP. 2006. DNA-PK autophosphorylation facilitates Artemis endonuclease activity. 25:3880-3889. Goosen N. 2013. Nucleotide Excision Repair in Eukaryotes. Encyclopedia of Biological Chemistry: Second Edition: 341-344. Gorisch SM. 2005. Histone acetylation increases chromatin accessibility. Journal of Cell Science 118: 5825-5834. Grawunder U, Wilm M, Wu X, Kulesza P, Wilson TE, Mann M, Lieber MR. 1997. letters to nature Activity of DNA ligase IV stimulated by complex formation with XRCC4 protein in mammalian cells. 388: 3-6. Gueven N, Becherel OJ, Kijas AW, Chen P, Howe O, Rudolpg JH, Gatti R, Date H, Onodera O, Taucher-Scholz G, Lavin MF. 2004. Aprataxin, a novel protein that protects against genotoxic stress. Human Molecular Genetics 13: 1081-1093. Guigas G, Kalla C, Weiss M. 2007. The degree of macromolecular crowding in the cytoplasm and nucleoplasm of mammalian cells is conserved. FEBS Letters 581: 5094-5098. Halford SE, Marko JF. 2004. How do site-specific DNA-binding proteins find their targets? 32: 3040-3052. Haupts U, Maiti S, Schwille P, Webb WW. 1998. Dynamics of fluorescence fluctuations in green fluorescent protein observed by fluorescence correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 13573-13578. Heinze KG, Koltermann A, Schwille P. 2000. Simultaneous two-photon excitation of distinct labels for dual-color fluorescence crosscorrelation analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97: 10377-82. Hemmerich P, Schmiedeberg L, Diekmann S. 2011. Dynamic as well as stable protein interactions contribute to genome function and maintenance. Chromosome Research 19: 131- 151. Hirano M, Yamamoto A, Mori T, Lan L, Iwamoto TA, Aoki M, Shimada K, Furiya Y, Kariya S, Asai H, Yasui A, Nishiwaki T, Imoto K, Kobayashi N, Kiriyama T, Nagata T, Konishi N, Itoyama Y, Ueno S. 2007. DNA single-strand break repair is impaired in aprataxin-related ataxia. Annals of Neurology 61: 162-174. Hoch NC, Hanzlikova H, Rulten SL, Tétreault M, Komulainen E, Ju L, Hornyak P, Zeng Z, Gittens W, Rey SA, Staras K, Mancini GMS, McKinnon PJ, Wang ZQ, Wagner JD, Yoon G, Caldecott KW. 2017. XRCC1 mutation is associated with PARP1 hyperactivation and cerebellar ataxia. Nature 541: 87-91. Huang DW, Fanti L, Pak DTS, Botchan MR, Pimpinelli S, Kellum R. 1998. Distinct cytoplasmic and nuclear fractions of drosophila heterochromatin protein 1: Their phosphorylation levels 202 Rozdział 14. Literatura and associations with origin recognition complex proteins. Journal of Cell Biology 142: 307- 318. Jackson SP. 2002. Carcinogenesis Young Investigator Award COMMENTARY Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis 23: 687-696. James TC, Elgin SC. 1986. protein associated with heterochromatin in Identification of a Nonhistone Chromosomal Protein Associated with Heterochromatin in Drosophila melanogaster and Its Gene. 6: 3862-3872. Jares-Erijman EA, Jovin TM. 2003. FRET imaging. Nature Biotechnology 21: 1387-1395. Jasin M, Rothstein R. 2013. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology 5: 1-18. Jilani A, Ramotar D, Slack C, Ong C, Yang XM, Scherer SW, Lasko DD. 1999. Molecular cloning of the human gene, PNKP, encoding a polynucleotide kinase 3'-phosphatase and evidence for its role in repair of DNA strand breaks caused by oxidative damage. Journal of Biological Chemistry 274: 24176-24186. Kalousi A, Hoffbeck AS, Selemenakis PN, Pinder J, Savage KI, Khanna KK, Brino L, Dellaire G, Gorgoulis VG, Soutoglou E. 2015. The Nuclear Oncogene SET Controls DNA Repair by KAP1 and HP1 Retention to Chromatin. Cell Reports 11: 149-163. Kapusta P. 2010. Absolute diffusion coefficients: compilation of reference data for FCS calibration. Application note: 0-1. Kapusta P, Wahl M, Benda A, Hof M, Enderlein J. 2007. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. Journal of fluorescence 17: 43-8. Karimi-Busheri F, Daly G, Robins P, Canas B, Pappin DJC, Sgouros J, Miller GG, Fakhrai H, Davis EM, Le Beau MM, Weinfeld M. 1999. Molecular characterization of a human DNA kinase. Journal of Biological Chemistry 274: 24187-24194. Kettling U, Koltermann A, Schwille P, Eigen M. 1998. Real-time enzyme kinetics monitored by dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 1416-1420. Khanna KK, Jackson SP. 2001. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics 27: 247-254. Khrenova M, Topol I, Collins J, Nemukhin A. 2015. Article Estimating Orientation Factors in the FRET Theory of Fluorescent Proteins : The TagRFP-KFP Pair and Beyond. Biophysj 108: 126- 132. Kim YJ, Wilson Iii DM. 2013. Overview of Base Excision Repair Biochemistry. Curr Mol Pharmacol. 5: 3-13. Kimura H, Cook PR. 2001. Kinetics of Core Histones in Living Human Cells: Little Exchange of H3 and H4 and Some Rapid Exchange of H2b. The Journal of Cell Biology 153: 1341-1354. Kohl T, Haustein E, Schwille P. 2005. Determining Protease Activity In Vivo by Fluorescence Cross-Correlation Analysis. 89: 2770-2782. Koppel DE. 1974. Statistical accuracy in fluorescence correlation spectroscopy. Physical Review A 10:1938-1945. Kordon M. 2017. O mechanizmie rekrutacji białka XRCC1 do jednoniciowych pęknięć DNA w rejonach replikacji (rozprawa doktorska). WBBiB Uniwersytet Jagielloński. 203 Literatura Rozdział 14. Kordon M, Szczurek A, Berniak K, Szelest O, Solarczyk K, Tworzydło M, Wachsmann-Hogiu S, Vaahtokari A, Cremer C, Pederson T, Dobrucki JW. 2018. PML-like subnuclear bodies, containing XRCC1, juxtaposed to DNA replication-based single-strand breaks. The FASEB Journal 33: 2301-2313. Krejci L, Altmannova V, Spirek M, Zhao X. 2012. Homologous recombination and its regulation. Nucleic Acids Research 40: 5795-5818. Krokan HE, Rjoras M. 2013. Base Excision Repair. Cold Spring Harb Perspect Biol.: 6-11. Kruhlak MJ, Celeste A, Dellaire G, Fernandez-Capetillo O, Müller WG, McNally JG, Bazett-Jones DP, Nussenzweig A. 2006. Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks. The Journal of cell biology 172: 823-34. Kubota Y, Horiuchi S. 2003. Independent roles of XRCC1's two BRCT motifs in recovery from methylation damage. DNA Repair 2: 407-415. Kubota Y, Nash RA, Klungland A, Schär P, Barnes DE, Lindahl T. 1996. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein. The EMBO journal 15: 6662-70. Kwon SH, Workman JL. 2008. The heterochromatin protein 1 (HP1) family: put away a bias toward HP1. Molecules and cells 26: 217-227. Lan L, Nakajima S, Oohata Y, Takao M, Okano S, Masutani M, Wilson SH, Yasui A. 2004. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101: 13738-43. Lee YH, Kuo CY, Stark JM, Shih HM, Ann DK. 2013. HP1 promotes tumor suppressor BRCA1 functions during the DNA damage response. Nucleic acids research 41: 5784-98. Lemaître C, Soutoglou E. 2014. Double strand break (DSB) repair in heterochromatin and heterochromatin proteins in DSB repair. DNA Repair 19: 163-168. Lévy N, Martz A, Bresson A, Spenlehauer C, de Murcia G, Ménissier-de Murcia J. 2006. XRCC1 is phosphorylated by DNA-dependent protein kinase in response to DNA damage. Nucleic Acids Research 34: 32-41. Li X, Heyer WD. 2008. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Research 18: 99-113. Lieber MR. 2011. The Mechanism of Double-Strand DNA Break Repair by the Nonhomologous DNA End Joining Pathway. Molecular Microbiology 79: 181-211. Lindahl T, Satoh MS, Poirier GG, Klungland A. 1995. Post-translational modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks. Trends in Biochemical Sciences 20: 405-411. Loizou JI, El-Khamisy SF, Zlatanou A, Moore DJ, Chan DW, Qin J, Sarno S, Meggio F, Pinna LA, Caldecott KW. 2004. The protein kinase CK2 facilitates repair of chromosomal DNA single- strand breaks. Cell 117: 17-28. Loyola A, Tagami H, Bonaldi T, Roche D, Quivy JP, Imhof A, Nakatani Y, Dent SYR, Almouzni G. 2009. The HP1alpha-CAF1-SetDB1-containing complex provides H3K9me1 for Suv39-mediated K9me3 in pericentric heterochromatin. EMBO reports 10: 769-75. Luijsterburg MS, Dinant C, Lans H, Stap J, Wiernasz E, Lagerwerf S, Warmerdam DO, Lindh M, Brink MC, Dobrucki JW, Aten JA, Fousteri MI, Jansen G, Dantuma NP, Vermeulen W, 204 Rozdział 14. Literatura Mullenders LHF, Houtsmuller AB, Verschure PJ, van Driel R. 2009. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. The Journal of Cell Biology 185: 577-586. Magde D, Elson E, Webb WW. 1972. Thermodynamic fluctuations in a reacting system measurement by fluorescence correlation spectroscopy. Physical Review Letters 29: 705-708. Maison C, Almouzni G. 2004. HP1 and the dynamics of heterochromatin maintenance. Nature reviews. Molecular cell biology 5: 296-304. Mani RS, Karimi-Busheri F, Fanta M, Caldecott KW, Cass CE, Weinfeld M. 2004. Biophysical characterization of human XRCC1 and its binding to damaged and undamaged DNA. Biochemistry 43: 16505-16514. Marintchev A, Mullen MA, Maciejewski MW, Pan B, Gryk MR, Mullen GP. 1999. Solution structure of the single-strand break repair protein XRCC1 N-terminal domain. Nature structural biology 6: 884-893. Marsin S, Vidal AE, Sossou M, Ménissier-De Murcia J, Le Page F, Boiteux S, De Murcia G, Radicella JP. 2003. Role of XRCC1 in the Coordination and Stimulation of Oxidative DNA Damage Repair Initiated by the DNA Glycosylase hOGG1. Journal of Biological Chemistry 278: 44068-44074. Matsumoto Y, Kim K. 1995. Excision of deoxyribose phosphate residues by DNA polymerase ß during DNA repair. Science 269: 699-702. McGinnis W, Levine M, Hafen E, Kuroiwa A, Gehring W. 1984. A conserved DNA sequence in homoeotic genes of the Drosophila Antennapedia and Bithorax complexes. Nature 308(5958): 428-33. Merlitz H, Klenin K V, Wu C xu, Langowski J. 2015. Facilitated diffusion of DNA-binding proteins : Simulation of large systems Facilitated diffusion of DNA-binding proteins : Simulation of large systems. The Journal of Chemical Physics 125. Michelman-Ribeiro A, Mazza D, Rosales T, Stasevich TJ, Boukari H, Rishi V, Vinson C, Knutson JR, McNally JG. 2009. Direct measurement of association and dissociation rates of DNA binding in live cells by fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Journal 97: 337-346. Minton AP. 1992. Confinement as a determinant of macromolecular structure and reactivity. Biophysical Journal 63: 1090-1100. Minton AP. 2001. The Influence of Macromolecular Crowding and Macromolecular Confinement on Biochemical Reactions in Physiological Media. Journal of Biological Chemistry 276:10577-10580. Mortusewicz O, Leonhardt H. 2007. XRCC1 and PCNA are loading platforms with distinct kinetic properties and different capacities to respond to multiple DNA lesions. BMC Molecular Biology 8: 81. Müller KP, Erdel F, Caudron-Herger M, Marth C, Fodor BD, Richter M, Scaranaro M, Beaudouin J, Wachsmuth M, Rippe K. 2009. Multiscale analysis of dynamics and interactions of heterochromatin protein 1 by fluorescence fluctuation microscopy. Biophysical Journal 97: 2876-2885. Murzina N, Verreault A, Laue E, Stillman B. 1999. Heterochromatin dynamics in mouse cells: interaction between chromatin assembly factor 1 and HP1 proteins. Molecular cell 4: 529-40. Nash RA, Caldecott KW, Barnes DE, Lindahl T. 1997. XRCC1 protein interacts with one of two distinct forms of DNA ligase III. Biochemistry 36: 5207-5211. 205 Literatura Rozdział 14. Nielsen AL, Ortiz JA, You J, Oulad-Abdelghani M, Khechumian R, Gansmuller A, Chambon P, Losson R. 1999. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. EMBO Journal 18: 6385-6395. Nielsen AL, Sanchez C, Ichinose H, Cervino M, Lerouge T, Chambon P, Losson R. 2002. Selective interaction between the chromatin-remodeling factor BRG1 and the heterochromatin- associated protein HP1alpha. The EMBO journal 21: 5797-806. Nishibuchi G, Machida S, Osakabe A, Murakoshi H, Hiragami-Hamada K, Nakagawa R, Fischle W, Nishimura Y, Kurumizaka H, Tagami H, Nakayama J i. 2014. N-terminal phosphorylation of HP1 increases its nucleosome-binding specificity. Nucleic Acids Research 42: 12498-12511. Nitsche JM, Chang HC, Weber PA, Nicholson BJ. 2004. A Transient Diffusion Model Yields Unitary Gap Junctional Permeabilities from Images of Cell-to-Cell Fluorescent Dye Transfer between Xenopus Oocytes. Biophysical Journal 86: 2058-2077. Pack C, Saito K, Tamura M, Kinjo M. 2006. Microenvironment and Effect of Energy Depletion in the Nucleus Analyzed by Mobility of Multiple Oligomeric EGFPs. Biophysical Journal 91: 3921- 3936. Pan X, Aw C, Du Y, Yu H, Wohland T. 2006. Characterization of poly(acrylic acid) diffusion dynamics on the grafted surface of poly(ethylene terephthalate) films by fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical Reviews and Letters 1: 433-441. Paro R, Hogness DS. 1991. The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88: 263-7. Parsons JL, Dianova II, Finch D, Tait PS, Ström CE, Helleday T, Dianov GL. 2010. XRCC1 phosphorylation by CK2 is required for its stability and efficient DNA repair. DNA Repair 9: 835-841. Phair RD, Misteli T. 2000. High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus. Nature 404: 604-609. Piacentini L, Fanti L, Berloco M, Perrini B, Pimpinelli S. 2003. Heterochromatin protein 1 (HP1) is associated with induced gene expression in Drosophila euchromatin. The Journal of cell biology 161: 707-14. Polo SE, Jackson SP. 2011. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development 25: 409-33. Pouliot JJ, Yao KC, Robertson CA, Nash HA. 1999. Yeast Gene for a Tyr-DNA Phosphodiesterase that Repairs Topoisomerase I Complexes. Science 286: 552-555. Qian H. 1990. On the statistics of fluorescence correlation spectroscopy. Biophys Chem 38: 49- 57. Rahbari R, Sheahan T, Modes V, Collier P, Macfarlane C, Badge RM. 2009. A novel L1 retrotransposon marker for HeLa cell line identification. BioTechniques 46: 277-284. Ryan RF, Schultz DC, Ayyanathan K, Singh PB, Friedman JR, Fredericks WJ, Iii FJR. 1999. KAP-1 Corepressor Protein Interacts and Colocalizes with Heterochromatic and Euchromatic HP1 Proteins : a Potential Role for Kru " ppel-Associated Box - Zinc Finger Proteins in Heterochromatin-Mediated Gene Silencing. 19: 4366-4378. San Filippo J, Sung P, Klein H. 2008. Mechanism of Eukaryotic Homologous Recombination. 206 Rozdział 14. Literatura Annual Review of Biochemistry 77: 229-257. Schmiedeberg L, Weisshart K, Diekmann S, Meyer G, Hemmerich P, Biotechnology M, Gmbh C zeiss J, Imaging A. 2004. High- and Low-mobility Populations of HP1 in Heterochromatin of Mammalian Cells. 15: 2819-2833. Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. 2012. NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis. Nature Methods 9: 671-675. Schreiber V, Amé JC, Dollé P, Schultz I, Rinaldi B, Fraulob V, Ménissier-de Murcia J, De Murcia G. 2002. Poly(ADP-ribose) polymerase-2 (PARP-2) is required for efficient base excision DNA repair in association with PARP-1 and XRCC1. Journal of Biological Chemistry 277: 23028- 23036. Schwaiger M, Kohler H, Oakeley EJ, Stadler MB, Schu D. 2010. the Drosophila genome Heterochromatin protein 1 (HP1) modulates replication timing of the Drosophila genome. 1: 771-780. Schwille P, Haupts U, Maiti S, Webb WW. 1999. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy with one- and two-photon excitation. Biophysical journal 77: 2251-65. Schwille P, Meyer-Almes FJ, Rigler R. 1997. Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophysical journal 72: 1878- 86. Scott MP, Weinert AMYJ. 1984. Structural relationships among genes that control development: Sequence homology between the Antennapedia, Ultrabithorax, and fushi tarazu loci of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 4115-4119. Shibahara K, Stillman B. 1999. Replication-dependent marking of DNA by PCNA facilitates CAF- 1-coupled inheritance of chromatin. Cell 96: 575-85. Siegel AP, Baird MA, Davidson MW, Day RN. 2013. Strengths and weaknesses of recently engineered red fluorescent proteins evaluated in live cells using fluorescence correlation spectroscopy. International Journal of Molecular Sciences 14: 20340-20358. Solarczyk KJ, Kordon M, Berniak K, Dobrucki JW. 2016. Two stages of XRCC1 recruitment and two classes of XRCC1 foci formed in response to low level DNA damage induced by visible light , or stress triggered by heat shock. DNA Repair 37: 12-21. Solarczyk KJ, Zarębski M, Dobrucki JW. 2012. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA repair 11: 996-1002. Soria G, Almouzni G. 2013. Differential contribution of HP1 proteins to DNA end resection and homology-directed repair. Cell cycle (Georgetown, Tex.) 12: 422-9. Spagnolo L, Rivera-calzada A, Pearl LH, Llorca O. 2006. Three-Dimensional Structure of the Human DNA-PKcs / Ku70 / Ku80 Complex Assembled on DNA and Its Implications for DNA DSB Repair. : 511-519. Spivak G. 2015. Nucleotide excision repair in humans. DNA Repair (Amst) 36: 13-18. Stixova L, Sehnalova P, Suchankova J, Hru T, Kozubek S, Sorokin D V, Matula P, Ra I, Fulne J, Bartova E. 2014. HP1 ß -dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. 7: 1-17. Swaminathan R, Hoang CP, Verkman AS. 1997. Photobleaching recovery and anisotropy decay 207 Literatura Rozdział 14. of green fluorescent protein GFP-S65T in solution and cells: Cytoplasmic viscosity probed by green fluorescent protein translational and rotational diffusion. Biophysical Journal 72: 1900- 1907. Taheri F, Isbilir B, Müller G, Krieger JW, Chirico G, Langowski J, Tóth K. 2018. Random Motion of Chromatin Is Influenced by Lamin A Interconnections. Biophysical Journal 114: 2465-2472. Thiru A, Nietlispach D, Mott HR, Okuwaki M, Lyon D, Nielsen PR, Hirshberg M, Verreault A, Murzina N V, Laue ED. 2004. Structural basis of HP1/PXVXL motif peptide interactions and HP1 localisation to heterochromatin. The EMBO journal 23: 489-99. Thompson LH, Brookman KW, Dillehay LE, Carrano A V., Mazrimas JA, Mooney CL, Minkler JL. 1982. A CHO-cell strain having hypersensitivity to mutagens, a defect in DNA strand-break repair, and an extraordinary baseline frequency of sister-chromatid exchange. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 95: 427-440. Tobias F, Löb D, Lengert N, Durante M, Drossel B, Taucher-Scholz G, Jakob B. 2013. Spatiotemporal Dynamics of Early DNA Damage Response Proteins on Complex DNA Lesions. PLoS ONE 8: 17-21. Toth KF. 2004. Trichostatin A-induced histone acetylation causes decondensation of interphase chromatin. Journal of Cell Science 117: 4277-4287. Trembecka-Lucas D. 2013. Heterochromatin Protein (HP1) dimer and Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) interact in DNA replication and repair - PhD Thesis. Trembecka-Lucas DO, Dobrucki JW. 2012. A heterochromatin protein 1 (HP1) dimer and a proliferating cell nuclear antigen (PCNA) protein interact in vivo and are parts of a multiprotein complex involved in DNA replication and DNA repair. Cell Cycle 11: 2170-2175. Trembecka-Lucas DO, Szczurek AT, Dobrucki JW. 2013. Dynamics of the HP1 ß -PCNA- containing complexes in DNA replication and repair © 2013 Landes Bioscience. Nucleus 4: 74- 82. Tubbs A, Nussenzweig A. 2017. Endogenous DNA Damage as a Source of Genomic Instability in Cancer. Cell 168: 644-656. Wachsmuth M, Conrad C, Bulkescher J, Koch B, Mahen R, Isokane M, Pepperkok R, Ellenberg J. 2015. High-throughput fluorescence correlation spectroscopy enables analysis of proteome dynamics in living cells. Nature biotechnology 33: 384-389. Wachsmuth M, Waldeck W, Langowski J. 2000. Anomalous diffusion of fluorescent probes inside living cell nuclei investigated by spatially-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Journal of Molecular Biology 298: 677-89. Weidemann T, Wachsmuth M, Tewes M, Rippe K, Langowski J. 2002. Analysis of ligand binding by two-colour fluorescence cross-correlation spectroscopy. Single Molecules 3: 49-61. Weiss M, Elsner M, Kartberg F, Nilsson T. 2004. Anomalous Subdiffusion Is a Measure for Cytoplasmic Crowding in Living Cells. Biophysical Journal 87: 3518-3524. Wennmalm S, Chmyrov V, Widengren J, Tjernberg L. 2015. Highly Sensitive FRET-FCS Detects Amyloid ß-Peptide Oligomers in Solution at Physiological Concentrations. Analytical Chemistry 87:11700-11705. Whitehouse CJ, Taylor RM, Thistlethwaite A, Zhang H, Karimi-Busheri F, Lasko DD, Weinfeld M, Caldecott KW. 2001. XRCC1 stimulates human polynucleotide kinase activity at damaged DNA termini and accelerates DNA single-strand break repair. Cell 104: 107-117. 208 Rozdział 14. Literatura Wiernasz E. 2004. MSc Thesis. Jagiellonian University. Wilson SH, Sobol RW, Prasad R, Evenski A, Baker A, Yang XP, Horton JK. 2000. The lyase activity of the DNA repair protein beta-polymerase protects from DNA-damage-induced cytotoxicity. Nature 405: 807-810. Wu W, Nishikawa H, Fukuda T, Vittal V, Asano M, Miyoshi Y, Klevit RE, Ohta T. 2015. Interaction of BARD1 and HP1 is required for BRCA1 retention at sites of DNA damage. Cancer Research 5: 1311. Ye Yq, Callebaut I, Pezhman A, Courvalin JC, Howard J. 1997. Domain-specific Interactions of Human HP1-type Chromodomain Proteins and Inner Nuclear Membrane Protein LBR. Journal of Biological Chemistry 272: 14983-14989. Zamir E, Frey C, Weiss M, Antona S, Frohnmayer JP, Janiesch JW, Platzman I, Spatz JP. 2017. Reconceptualizing fluorescence correlation spectroscopy for monitoring and analyzing periodically passing objects. Analytical Chemistry: acs.analchem.7b03108. Zarebski M. 2008. Zastosowanie metod lokalnego fotouczulanego uszkadzania składników komórki do badania mechanizmów naprawy błony komórkowej i chromatyny (rozprawa doktorska). Jagiellonian University. Zarebski M, Wiernasz E, Dobrucki JW. 2009. Recruitment of heterochromatin protein 1 to DNA repair sites. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology 75: 619-25. Zeng W, Ball AR, Yokomori K. 2010. HP1: heterochromatin binding proteins working the genome. Epigenetics : official journal of the DNA Methylation Society 5: 287-92. Zhang G, Ignatova Z. 2011. Folding at the birth of the nascent chain: Coordinating translation with co-translational folding. Current Opinion in Structural Biology 21: 25-31. Zimmermann M, Lottersberger F, Buonomo SB, Sfeir A, de Lange T. 2013. 53BP1 regulates DSB repair using Rif1 to control 5' end resection. Science (New York, N.Y.) 339: 700-4. Liczba pozycji: 171. 209 Dodatki Rozdział 15. Rozdział 15. Dodatki • Program stworzony na potrzebę analizy pomiarów FCS opisanych w niniejszej pracy jest ciągle rozwijany przez autora. Z tego powodu kod programu jeszcze nie został udostępniony publicznie. Jakkolwiek na życzenie osób zainteresowanych możliwy jest wgląd w jego treść. • Mapy plazmidów kodujące fuzyjne białko eGFP-XRCC1 oraz mRFP-XRCC1, które było także podstawową do stworzonych mutantów zostały zaczerpnięte z pracy doktorskiej dr M. Kordon, natomiast mapy plazmidów kodujące fuzyjne białko eGFP-HP1ß zostały zaczerpnięte z pracy doktorskiej dr D. Trembeckiej- Lucas. 210 Rozdział 15. Dodatki 211 Spis własnych publikacji Rozdział 16. Rozdział 16. Spis własnych publikacji • Kordon MM, Szczurek A, Berniak K, Szelest O, Solarczyk K, Tworzydło M, Wachsmann-Hogiu S, Vaahtokari A, Cremer C, Pederson T, Dobrucki JW. PML-like subnuclear bodies, containing XRCC1, juxtaposed to DNA replication-based single- strand breaks. FASEB J. 2018 Sep 27:fj201801379R. doi: 10.1096/fj.201801379R. [Epub ahead of print] PubMed PMTD: 30260704. • Milewska A, Nowak P, Owczarek K, Szczepanski A, Zarebski M, Hoang-Bujnowicz A, Berniak K, Wojarski J, Zeglen S, Baster Z, Rajfur Z, Pyrc K. Entry of human coronavirus NL63 to the cell. J Virol. 2017 Nov 15. pii: JVT.01933-17. doi: 10.1128/JVT.01933-17. PubMed PMTD: 29142129. • Rybak P, Hoang A, Bujnowicz L, Bernas T, Berniak K, Zarębski M, Darzynkiewicz Z, Dobrucki J. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (yH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 2016 Aug 2;7(31):49574-49587. doi: 10.18632/oncotarget.10411. PubMed PMTD: 27391338; PubMed Central PMCTD: PMC5226530. • Solarczyk KJ, Kordon M, Berniak K, Dobrucki JW. Two stages of XRCC1 recruitment and two classes of XRCC1 foci formed in response to low level DNA damage induced by visible light, or stress triggered by heat shock. DNA Repair (Amst). 2016 Jan;37:12- 21. doi: 10.1016/j.dnarep.2015.10.006. Epub 2015 Nov 2. PubMed PMTD: 26630398. • Berniak K, Rybak P, Bernas T, Zarębski M, Biela E, Zhao H, Darzynkiewicz Z, Dobrucki JW. Relationship between DNA damage response, initiated by camptothecin or oxidative stress, and DNA replication, analyzed by quantitative 3D image analysis. Cytometry A. 2013 0ct;83(10):913-24. doi: 10.1002/cyto.a.22327. Epub 2013 Jul 11. PubMed PMTD: 23846844; PubMed Central PMCTD: PMC3888650. • Bernas T, Berniak K, Rybak P, Zarębski M, Zhao H, Darzynkiewicz Z, DobruckiJW. Analysis of spatial correlations between patterns of DNA damage response and DNA replication in nuclei of cells subjected to replication stress or oxidative damage. Cytometry A. 2013 0ct;83(10):925-32. doi: 10.1002/cyto.a.22325. Epub 2013 Jul 30. PubMed PMTD: 23900967; PubMed Central PMCTD: PMC3907470 • Zhao H, Halicka HD, Li J, Biela E, Berniak K, Dobrucki J, Darzynkiewicz Z. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5- ethynyl-2'-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry A. 2013 Nov;83(11):979-88. doi: 10.1002/cyto.a.22396. Epub 2013 Sep 30. PubMed PMTD: 24115313; PubMed Central PMCTD: PMC3846616. 212