Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji nowotworowej jasnokomórkowego raka nerki Paulina Marona Rozprawa doktorska wykonana pod opieką Dr hab. Katarzyny Miękus W Zakładzie Biochemii Ogólnej, Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego Recenzenci: Dr hab. Anna Żaczek Prof. dr hab. n. med. Piotr Widłak Kraków 2020 Pracę dedykuję Rodzicom i Dziadkowi Szczególnie pragnę podziękować Pani Promotor dr hab. Katarzynie Miękus za jej nieustające wsparcie, cenne wskazówki zarówno merytoryczne jak i praktyczne i pomoc w rozwiązywaniu problemów nie tylko badawczych, a także za możliwość realizacji badań zawartych w niniejszej rozprawie doktorskiej. Pragnę podziękować Pani prof. dr hab. Jolancie Jurze za cenne uwagi i pomoc oraz za możliwość pracy w Zakładzie Biochemii Ogólnej i stworzenie dobrej i kreatywnej atmosfery pracy. Dziękuję bardzo Pani dr hab. Annie Żaczek i Panu prof. dr hab. n. med. Piotrowi Widłakowi za podjęcie się recenzji niniejszej pracy oraz wszystkie cenne uwagi i komentarze. Dziękuję wszystkim koleżankom i kolegom z Zakładu z którymi miałam okazję współpracować, przede wszystkim Judycie oraz Oliwii, a także Beacie, Magdzie, Piotrkowi, Mateuszowi, Natalii, Róży, Jurkowi, Agacie, Darkowi – za pomoc w wykonywaniu doświadczeń, ciekawe dyskusje i miłą atmosferę. Dziękuję koleżankom i kolegom z innych Zakładów Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii za wszelką pomoc. Rodzicom, Rodzinie i Przyjaciołom serdecznie dziękuję za ich wsparcie w realizacji swojej pasji, dobre słowa i wiarę we mnie. FINANSOWANIE Badania wykonane w ramach rozprawy doktorskiej były współfinansowane ze środków Narodowego Centrum Nauki, w ramach projektu Preludium 13: „Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji nowotworowej jasnokomórkowego raka nerki” – UMO-2017/25/N/NZ5/03014 – P. Marona, Sonata 5: „Analiza molekularna progresji jasnokomórkowego raka nerki w aspekcie poszukiwania czynników predykcyjnych przed planowanym leczeniem” – UMO-2013/09/D/NZ5/00249 – K. Miękus, Opus 10: „Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, progresji i unaczynienia jasnokomórkowego raka nerki” – UMO-2015/19/B/NZ5/01405 – K. Miękus. Autorka rozprawy doktorskiej jest stypendystką programów: Etiuda 6 przyznanym przez Narodowe Centrum Nauki – UMO-2018/28/T/NZ5/00347, stypendium START 2018 przyznanym przez Fundację na rzecz Nauki Polskiej oraz stypendium L’Oreal- UNESCO, Dla Kobiet i Nauki 2019. Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego był członkiem Konsorcjum, które uzyskało status Krajowego Naukowego Ośrodka Wiodącego (KNOW). Znalezione obrazy dla zapytania: narodowe centrum nauki logo Znalezione obrazy dla zapytania: logo l'oreal unesco dla kobiet i nauki Znalezione obrazy dla zapytania: logo FNP Spis treści 1 Rozwinięcie skrótów ..................................................................................................... 8 2 Streszczenie ................................................................................................................. 11 3 Summary ...................................................................................................................... 13 4 Wstęp teoretyczny ....................................................................................................... 15 4.1 Jasnokomórkowy rak nerki ................................................................................ 15 4.1.1 Epidemiologia i obraz histologiczny raka nerki ....................................... 15 4.1.2 Podłoże genetyczne jasnokomórkowego raka nerki .............................. 16 4.1.3 Mutacje genu VHL w jasnokomórkowym raku nerki .............................. 17 4.2 Angiogeneza (neowaskularyzacja) w procesie rozwoju nowotworu ........... 19 4.2.1 Charakterystyka procesu angiogenezy .................................................... 19 4.2.2 Etapy angiogenezy ...................................................................................... 20 4.3 Rola receptora c-Met w progresji ccRCC ........................................................ 23 4.3.1 Charakterystyka receptora c-Met .............................................................. 23 4.3.2 Receptor c-Met w raku nerki ...................................................................... 26 4.3.3 Znaczenie receptora c-Met w regulacji procesu przejścia epitelialno-mezenchymalnego (EMT) .......................................................................................... 27 4.3.4 Rola receptora c-Met w aktywności migracyjnej i przerzutowaniu ...... 30 4.3.5 Terapie jasnokomórkowego raka nerki .................................................... 31 4.3.6 Oporność na inhibitory angiogenezy ........................................................ 32 4.3.7 Receptor c-Met, a nabywanie oporności na leki celowane ................... 33 4.4 Białko MCPIP1 jako regulator procesów zapalnych i nowotworzenia......... 34 4.4.1 Procesy zapalne w chorobie nowotworowej ........................................... 34 4.4.2 Budowa i mechanizm działania białka MCPIP1 ..................................... 35 4.4.3 Regulacja ekspresji białka MCPIP1 ......................................................... 37 4.4.4 MCPIP1 jako negatywny regulator stanu zapalnego i strażnik homeostazy .................................................................................................................. 38 4.4.5 Rola białka MCPIP1 w rozwoju nowotworu ............................................. 40 5 Cel pracy doktorskiej .................................................................................................. 42 6 Materiały i metody ....................................................................................................... 43 6.1 Materiały ............................................................................................................... 43 6.1.1 Materiał ludzki .............................................................................................. 43 6.1.2 Materiał zwierzęcy ....................................................................................... 43 6.1.3 Materiał biologiczny..................................................................................... 43 6.1.4 Odczynniki .................................................................................................... 44 6.1.5 Przeciwciała ................................................................................................. 46 6.1.6 Startery .......................................................................................................... 47 6.2 Metody .................................................................................................................. 48 6.2.1 Hodowle komórkowe................................................................................... 48 6.2.2 Przejściowa transfekcja małym interferującym RNA (siRNA) .............. 49 6.2.3 Stabilna transdukcja za pomocą wektorów wirusowych ....................... 49 6.2.4 Stymulacja komórek .................................................................................... 50 6.2.5 Analiza mikromacierzy ................................................................................ 51 6.2.6 Izolacja i analiza poziomu białek metodą western blot .......................... 51 6.2.7 Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym ....................................... 52 6.2.8 Test redukcji MTT ........................................................................................ 53 6.2.9 Test proliferacji ............................................................................................ 54 6.2.10 Test migracji – zarastanie rany ................................................................. 54 6.2.11 Test tworzenia się rozgałęzień w hodowli komórek endotelialnych .... 54 6.2.12 Test fibrynowy .............................................................................................. 55 6.2.13 Test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) .............................................................................................. 55 6.2.14 Analiza poziomu białek przy pomocy macierzy białkowych ................. 56 6.2.15 Barwienie fioletem krystalicznym .............................................................. 56 6.2.16 Ocena uśpienia komórek przy pomocy barwienia SA β-gal ................. 56 6.2.17 Analiza cyklu komórkowego ...................................................................... 57 6.2.18 Barwienie immunocytofluorescencyjne komórek ................................... 57 6.2.19 Badanie wzrostu guzów in vivo ................................................................. 57 6.2.20 Obrazowanie za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości ....... 59 6.2.21 Analiza krążących komórek nowotworowych przy pomocy cytometrii przepływowej ................................................................................................................ 59 6.2.22 Barwienie immunohistofluorescencyjne CD31 skrawków mrożeniowych .............................................................................................................. 59 6.2.23 Barwienie immunohistochemiczne preparatów tkankowych ................ 60 6.2.24 Analiza statystyczna ................................................................................... 60 7 Wyniki ............................................................................................................................ 61 7.1 Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji nowotworowej jasnokomórkowego raka nerki ............................................................ 61 7.1.1 Niski poziom białka MCPIP1 powoduje zwiększoną proliferację komórek nowotworowych in vitro i przyspiesza wzrost guzów in vivo ................ 61 7.1.2 Aktywność RNazy białka MCPIP1 wpływa na szybkość wzrostu guzów w warunkach in vivo .................................................................................................... 63 7.1.3 Aktywność RNazy białka MCPIP1 reguluje unaczynienie guzów w warunkach in vivo ........................................................................................................ 65 7.1.4 Niski poziom białka MCPIP1 wpływa na destabilizację połączeń międzykomórkowych, aktywną migrację komórek endotelialnych i tworzenie naczyniopodobnych struktur w warunkach in vitro ................................................. 68 7.1.5 Białko MCPIP1 reguluje poziom wydzielanych czynników proangiogennych w komórkach nowotworowych ................................................... 71 7.1.6 Białko MCPIP1 reguluje proces przerzutowania wpływając na oś SDF-1/CXCR4 ....................................................................................................................... 72 7.1.7 Niski poziom MCPIP1 zwiększa aktywność migracyjną i powoduje nabywanie cech mezenchymalnych w komórkach ccRCC .................................. 75 7.1.8 Aktywność RNazy MCPIP1 reguluje fosforylację receptora c-Met ...... 77 7.2 Poziom białka MCPIP1 w próbkach klinicznych pacjentów z ccRCC ......... 79 7.3 Poziom białka MCPIP1, a oporność na terapie celowane w jasnokomórkowym raku nerki ........................................................................................ 82 7.3.1 Sunitinib i sorafenib wpływają na potencjał proliferacyjny i cykl komórkowy ccRCC ...................................................................................................... 82 7.3.2 Stymulacja sunitinibem i sorafenibem wpływa na fenotyp komórek ccRCC i zmienia ich profil białkowy .......................................................................... 84 7.3.3 Oporność na sunitinib i sorafenib wpływa na progresję ccRCC w warunkach in vivo ........................................................................................................ 87 7.3.4 Białko GSK3β reguluje poziom receptora c-Met oraz białka MCPIP1 90 8 Dyskusja ....................................................................................................................... 92 8.1 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje proliferację i żywotność ...................... 93 8.2 Poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych wpływa na aktywność komórek śródbłonka i angiogenezę .......................................................... 95 8.3 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje aktywność migracyjną i progresję nowotworu ........................................................................................................................ 99 8.4 Białko MCPIP1 stanowi czynnik prognostyczny w ccRCC ......................... 102 8.5 Oporność na sunitinib i sorafenib jest regulowana przez białko MCPIP1 i receptor c-Met ................................................................................................................ 104 9 Wnioski końcowe ....................................................................................................... 110 10 Bibliografia .............................................................................................................. 112 1 Rozwinięcie skrótów Akt (ang. Protein Kinase B) – kinaza białkowa Akt AP-1 (ang. Activator Protein 1) - Czynnik transkrypcyjny BAP1 (ang. BRCA1 associated protein-1) BCA (ang. Bicinchonic acid) – kwas bicynchoniowy BSA (ang. Bovine serum albumin) – albumina z surowicy wołowej CBP (ang. CREB binding protein) – białko wiążące CREB ccRCC (ang. Clear cell renal cell carcinoma) – jasnokomórkowy rak nerki CD31 (ang. Cluster of differentiation 31, PECAM- Platelet endothelial cell adhesion molecule) antygen różnicowania komórkowego 31, cząsteczka adhezji komórkowej płytek I śródbłonka c/EBP β (ang. CCAAT/enhancer binding protein b) – białko wiążące sekwencję CCAATβ cDNA (ang. Complementary DNA) – komplementarny DNA CDK (ang. Cyklin-dependent kinase) – kinaza zależna od cyklin Ct (ang. Cycle treshold) – numer cyklu reakcji qPCR w którym fluorescencja emitowana przez próbkę osiągnęła wartość progową CTC (ang. Circulating tumor cells) – krążące komórki nowotworowe CSC (ang.Cancer stem cells) - nowotworowe komórki macierzyste CXCL (ang. CXC Ligand) - chemokina o motywie Cysteina-Aminokwas-Cysteina CXCR4 (ang. Chemokine receptor 4) – receptor dla chemokin 4 DAPI (ang. 4’-6-diamidino-2-phenylindole) – 4'-6-diamidyno-2-fenyloindol DMSO (ang. Dimethyl sulfoxide) – dimetylosulfotlenek DNA (ang. Deoxyrybonucleic acid) – kwas deoksyrybonukleinowy dNTP (ang. Deoxynucleosides triphosphate) - trifosforany deoksyrybonukleozydów EC (ang. Endothelial cell) – komórka endotelialna e-kadheryna (ang. Epithelial cadherin) EDTA (ang. Ethylenediaminetetraacetic Acid) - Kwas etylenodiaminotetraoctowy EF2 (ang. Elongation factor-2) – czynnik elongacyjny-2 EGF (ang. Epidermal Growth Factor) - Epidermalny czynnik wzrostu ELISA (ang. Enzyme-linked immunosorbent assay) – test immunoenzymatyczny Elk-1 (ang. ETS domain-containing protein 1) EMT (ang. Epithelial-mesenchymal transition) - przejście epitelialno-mezenchymalne EpCAM (ang. Epithelial cell adhesion molecule) – cząsteczka adhezji komórek nabłonkowych EPO Erytropoetyna ERK (ang. Extracellular Signal-Regulated Kinase) - Kinazy białkowe aktywowane czynnikami zewnątrzkomórkowymi FAK (ang. Focal adhesion kinase) – kinaza ogniskowo-adhezyjna FBS (ang. Fetal bovine serum) – bydlęca surowica płodowa GAB1 (ang. GRB2-associated binding protein 1) – białko oddziałujące z GRB2 GAPDH (ang. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) – dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego GFP (ang. Green fluorescent protein) – zielone białko fluorescencyjne GLUT-1 (ang. Glucose transporter 1) – transporter glukozy GSK3β (ang. Glycogen synthase kinase 3 beta) – kinaza syntazy glikogenowej GRB2 (ang. Growth factor receptor-bound protein 2) – białko wiążące receptor dla czynnika wzrostu typu 2) HGF (ang. Hepatocyte growth factor) – czynnik wzrostu hepatocytów HIF (ang. Hypoxia-inducible factor) – czynnik indukowany przez hipoksję HMEC-1 (ang. Human microvascular endothelial cells) HUVEC (ang. Human umbilical vein endothelial cells) HRE (ang. Hypoxia responsive elelments) – element odpowiedzi na hipoksję HRP (ang. Horseradish peroxidase) – peroksydaza chrzanowa IKK (ang. IκB Kinase) - Kompleks o aktywności kinazy dla IκB IκB Inhibitor κB IL (ang. Interleukin) – interleukina INF Interferon LIF (ang. Leukemia inhibitory factor) – czynnik hamujący białaczkę LPS (ang. Lipopolisaccharide) - Lipopolisacharyd MAPK (ang. Mitogen-activated protein kinases) – kinazy białkowe aktywowane mitogenami MCP-1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1) - Czynnik chemotaktyczny monocytów 1 MCPIP1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1 Induced Protein 1) - Białko indukowane przez czynnik MCP-1 MET (ang. Mesenchymal-epithelial transition) - przejście mezenchymalno-epitelialne MMP (ang. Matrix Metalloproteinase) - Metaloproteinaza macierzy zewnątrzkomórkowej mRNA (ang. Messenger RNA) – matrycowy RNA mTOR (ang. Mammalian Target Of Rapamycin) - Ssaczy cel Rapamycyny n-kadheryna (ang. Neural cadherin) NF-κB (ang. Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) – czynnik jądrowy oddziałujący ze wzmacniaczem sekwencji lekkiego łańcucha immunoglobuliny w aktywowanych limfocytach B PAK (ang. P21-activated kinase) – kinaza aktywowana p21 PBS (ang. Phosphate buffered saline) – zbuforowany roztwór soli fizjologicznej PCR (ang. Polymerase chain reaction) - łańcuchowa reakcja polimerazy PDGF (ang. Platelet-derived growth factor) - Płytkopochodny czynnik wzrostu PI3K (ang. Phosphatidylinositol 3-kinase) - 3-kinaza fosfatydyloinozytolu PIN (ang. PilT N- Terminus) - Domena homologiczna do N-terminalnego fragmentu białka PilT Rac1 (ang. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) – substrat toksyny botulinowej C3 związany z Ras RAS (ang. Rat sarcoma viral homolog) RB1 (ang. Retinoblastoma) - siatkówczak qRT PCR (ang. Quantitative reverse transcriptase PCR) – ilościowa RT-PCR w czasie rzeczywistym RNA (ang. Rybonucleic acid) – kwas rybonukleinowy RNaza Rybonukleaza RT (ang. Reverse transcription) – odwrotna transkrypcja RTK (ang. Tyrosine kinase receptor) – receptor o właściwościach kinazy tyrozynowej SDF1 (ang. Stromal cell-derived factor-1 alpha) – czynnik-1 alfa pochodzenia podścieliskowego SD (ang. Standard deviation) – odchylenie standardowe próby SEM (ang. Standard error of mean) – błąd standardowy próby siRNA (ang. Short interfering RNA) – małe interferujące RNA SOS (ang. Son of Sevenless) STAT3 (ang. Signal transducer and activator of transcription 3) TBS (ang. Tris buffered saline) – bufor trisowy TCF (ang. T-cell factor) – czynnik transkrypcyjny komórek T TEMED (ang. Tetramethylethylenediamine) – N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiamina TGF (ang. Transforming growth factor) – transformujący czynnik wzrostu TKI (ang. Tyrosine kinase inhibitor) – inhibitor receptorów o właściwości kinazy tyrozynowej TNF α (ang. Tumor necrosis factor-αlpha) – czynnik martwicy nowotworów alfa UTR (ang. Untranslated region) – obszar mRNA nie ulegający translacji VEGF (ang. Vascular endothelial growth factor) – czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VE-kadheryna (ang. Vascular endothelial cadherin) VEGF-R1 (ang. VEGF receptor-1) – receptor 1 czynnika VEGF, inaczej FLT1 VEGF-R2 (ang. VEGF receptor-2) – receptor 2 czynnika VEGF VHL Białko von Hippel-Lindau ZEB (ang. Zinc finger E-box binding homeobox) ZO-1 (ang. Zonula occludens-1) 2 Streszczenie Nowotwory nerki dotykają co roku prawie 300 tysięcy osób, a 120 tysięcy umiera z powodu tej choroby. Najczęściej spotykanym typem jest jasnokomórkowy rak nerki który stanowi ok. 80% wszystkich przypadków. Ze względu na brak typowych objawów w pierwszych stadiach, w chwili wykrycia choroby przerzuty stwierdza się już u jednej trzeciej pacjentów, a szanse na przeżycie dramatycznie maleją. Obecnie najczęściej stosowanym leczeniem jest wycięcie guza z fragmentem bądź całą nerką, a następnie chemio- lub radioterapia, które wiążą się z licznymi skutkami ubocznymi. Ze względu na wysoki stopień unaczynienia guzów, w stadium zaawansowanym, terapia opiera się na nowych lekach antyangiogennych blokujących receptory niektórych kinaz tyrozynowych. Niestety, taka forma terapii nie jest w pełni satysfakcjonująca ponieważ wydłuża czas przeżycia chorych jedynie o kilka miesięcy co więcej, nowotwór bardzo szybko wykształca oporność na stosowane leki. ccRCC tworzy guzy silnie unaczynione, ze względu na częste mutacje genu supresorowego von Hippel-Lindau i nadmierne wydzielanie czynników proangiogennych. Nabywanie przez komórki umiejętności do opuszczania pierwotnego ogniska, aktywnej migracji i osiedlania się w odległych narządach, warunkowana jest wieloma czynnikami m. in. stopniem unaczynienia, obecnością komórek układu immunologicznego, a także nabieraniem przez komórki epitelialne właściwości i fenotypu komórek mezenchymalnych. Istotną rolę, zarówno w procesie angiogenezy jak i przejścia epitelialno-mezenchymalnego pełni receptor c-Met, ponieważ stymuluje proliferację i hamuje apoptozę oraz reguluje szereg czynników odpowiedzialnych za przerzutowanie. Procesy zapalne odgrywają bardzo ważną rolę w procesie wzrostu i rozwoju nowotworu. Jednym z modulatorów odpowiedzi zapalnej jest białko MCPIP1, kodowane przez gen ZC3H12A. Białko to zaangażowane jest w negatywną regulację stanu zapalnego dzięki aktywności RNazy, która pozwala na degradację transkryptów cytokin prozapalnych. Rosnąca liczba publikacji naukowych sugeruje, że białko MCPIP1 może istotnie wpływać na rozwój nowotworu, poprzez pośrednią lub bezpośrednią regulację czynników zaangażowanych w procesy wzrostu, proliferacji czy śmierci komórkowej. Co więcej, wykazano że poziom MCPIP1 w tkance nowotworowej jest znacząco niższy w porównaniu z otaczającą zdrową, a także może regulować poziom czynników proangiogennych takich jak VEGF czy HIF. Celem niniejszej pracy doktorskiej było określenie roli białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji jasnokomórkowego raka nerki, a także jego wpływ na nabieranie przez komórki nowotworowe oporności na leki celowane sunitinib i sorafenib. W pierwszym etapie badań wykorzystano linie komórkowe Caki-1 oraz Caki-2 z obniżonym poziomem białka MCPIP1, a także ze stabilną nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy MCPIP1. Wykazano, że niski poziom białka MCPIP1 lub zahamowanie jego aktywności RNazy prowadzi do zwiększenia potencjału proliferacyjnego komórek nowotworowych oraz przyspieszenia wzrostu guzów in vivo. Dodatkowo, brak białka MCPIP1 wpływa na wzrost ilości funkcjonalnych naczyń krwionośnych w porównaniu z kontrolą. Nadekspresja dzikiej formy MCPIP1 spowalnia wzrost guzów i zmniejsza unaczynienie in vivo. W toku doświadczeń wykazano również, że od poziomu białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych zależy aktywacja komórek endotelialnych. Zarówno komórki ccRCC z wyciszeniem jak i mutacją w domenie RNazowej MCPIP1 wydzielają zdecydowanie więcej czynników proangiogennych w porównaniu z komórkami kontrolnymi czy z nadekspresją dzikiej formy MCPIP1, co w konsekwencji wpływa na rozluźnianie połączeń komórkowych przez internalizację VE-kadheryny i aktywuje komórki endotelialne do migracji. Równocześnie, po obniżeniu aktywności MCPIP1, dochodzi do zwiększenia ekspresji genów CXCR4, SDF-1 czy c-Met, odpowiedzialnych za podziały komórkowe i przerzutowanie. Co istotne, nadekspresja MCPIP1 zmniejsza ilość powstających przerzutów oraz hamuje proces EMT. Analizując próbki kliniczne pacjentów w różnym stadium zaawansowania ccRCC wykazano, że razem z obniżającym się poziomem białka MCPIP1 w kolejnych stadiach choroby, rośnie poziom receptora c-Met oraz innych białek zaangażowanych w progresję nowotworową. W ostatnim etapie badań zaobserwowano, że mechanizm oporności na leki sunitinib i sorafenib może polegać na podwyższeniu aktywności receptora c-Met z jednoczesnym obniżeniem poziomu białka MCPIP1, co zwiększa agresywność komórek nowotworowych, ilość przerzutów oraz zmienia ich fenotyp. Podsumowując, białko MCPIP1 może być markerem zaawansowania choroby nowotworowej oraz pełnić kluczową rolę w rozwoju ccRCC, poprzez kontrolę procesu proliferacji, progresji oraz wydzielania czynników proangiogennych. Uzyskane wyniki wskazały także na zależną regulację białka MCPIP1 i receptora c-Met oraz ich wpływ na lekooporność komórek ccRCC. Biorąc pod uwagę wyniki przedstawione w niniejszej pracy i opublikowane przez inne zespoły badawcze, można zasugerować, że MCPIP1 może być uniwersalnym białkiem supresorowym. 3 Summary Every year, kidney cancers affect nearly 300 000 people, and 120 000 die of this disease. The most common type is clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) which comprises 80% of all cases. Due to the lack of typical symptoms in the first stages, at the time of diagnosis, metastases are found in one-third of patients, and the chances of survival are dramatically reduced. Currently, the most commonly used treatment is tumor excision with partial or total nefrectomy, followed by chemo- or radiotherapy, which are associated with numerous side effects. Due to high level of tumor vasculature, therapy of more advanced stages of ccRCC is based on new antiangiogenic drugs, which inhibit multiple tyrosine kinase receptors such as VEGFR or PDGFR. Treatment with small molecules showed in approximately 38% of patients significant tumor control. However, despite of the efficacy of therapy, ccRCC often develops drug resistance, and the majority of patients who receive such treatment exhibit progressive disease after one year. Formation of new blood vessels is a critical step during tumorigenesis and metastatic spread. ccRCC develops highly vascularized tumors due to common mutation in von Hippel-Lindau gene and overexpression of proangiogenic factors. The ccRCC ability to leave primary site, active migration and settle in distant organs, is orchestrated by many factors such as angiogenesis, presence of immune cells and acquisition of the properties of more aggressive, mesenchymal phenotype. C-Met receptor plays an important role in both angiogenesis and epithelial to mesenchymal transition. It stimulates proliferation, inhibits apoptosis and regulates a number of factors responsible for metastasis. Inflammatory processes play a significant role in ccRCC growth and development. One of the negative modulators of the inflammatory response is the MCPIP1 protein, encoded by the ZC3H12A gene. MCPIP1 acts as an endonuclease due to RNase activity, which allows degradation of mRNA coding proinflammatory cytokines. Recent reports suggests that the MCPIP1 protein may significantly affect tumor development through direct or indirect regulation of factors involved in the processes of growth, proliferation or cell death. Moreover, it has been shown that MCPIP1 affects expression of proangiogenic factors such as VEGF or HIFs, and its level in tumor is lower than in adjacent healthy tissue. The main aim of doctoral dissertation research was to determine the role of MCPIP1 protein in the processes of growth, vascularization and progression of clear cell renal cell carcinoma, as well as its effect on acquiring resistance to targeted drugs sunitinib and sorafenib. In the first stage of the study, Caki-1 and Caki-2 cell lines with downregulation of MCPIP1 protein, as well as with stable overexpression of the wild type MCPIP1 and mutation in PIN domain which completely abolishes endonuclease activity were used. The following work demonstrates that low level of MCPIP1 or inhibition of its RNase activity lead to an increase in the proliferative potential of tumor cells and tumor growth in vivo. In addition, lack of MCPIP1 protein increases the number of functional blood vessels compared to control. In contrast, overexpression of the MCPIP1 slows tumor growth and reduces vascularization in vivo. Conducted experiments showed that activation of endothelial cells depends on the level of MCPIP1 protein in cancer cells. Both, inhibition and mutation of MCPIP1 in ccRCC increased secretion of proangiogenic factors such as IL-6, IL-8 and VEGF compared to control or MCPIP1 overexpressed cells. In consequence, this leads to internalization of VE-cadherin, relaxation of cell-cell junctions and activation of endothelial cells migratory potential. Concominantly, MCPIP1 level affects the expression of CXCR4, SDF-1 and c-Met genes, which are responsible for cell division and metastasis. Importantly, MCPIP1 overexpression reduces the number of lung micrometastases and inhibits the EMT process. Further analysis of clinical samples of patients at various stages of ccRCC, has shown that MCPIP1 protein level decreases with cancer progression. Furthermore, the level of c-Met receptor and other factors involved in cancer progression increase with successive stages of the disease. In the last part of the study, it was observed that therapy with small molecules such as sunitinib and sorafenib increases the aggressiveness of cancer cells and amount of lung metastases. Moreover, elevated phosphorylation of c-Met receptor with simultaneous decrease in the level of MCPIP1 may be a potential mechanism of resistance to sunitinib and sorafenib treatment. In summary, the MCPIP1 protein can be one of the factors modulating tumor development and marker of ccRCC progression. MCPIP1 controls cell proliferation, migration and secretion of proangiogenic factors. Furthermore, dependent regulation of MCPIP1 protein and c-Met receptor and their effect on drug resistance has been proven during research. Considering the results presented in this dissertation and published by other researchers, it is plausible that MCPIP1 may act as universal tumor suppressor. 4 Wstęp teoretyczny 4.1 Jasnokomórkowy rak nerki 4.1.1 Epidemiologia i obraz histologiczny raka nerki Rak nerki (ang. Renal Cell Carcinoma, RCC), wywodzi się z komórek epitelialnych kanalików nerkowych i jest najczęstszym nowotworem nerek (ok. 90% wszystkich przypadków), znajdującym się w pierwszej dziesiątce najczęściej diagnozowanych nowotworów złośliwych (1,2). Odsetek zachorowań na raka nerki wzrósł o 30% w ciągu ostatnich 20 lat, co może być spowodowane zmianą trybu życia jak również udoskonaleniem metod obrazowania i diagnostyki. Według klasyfikacji histologicznej wyróżnić można kilka różnych typów (3,4): • Jasnokomórkowy rak nerki (ok. 80% przypadków) • Rak brodawkowaty (10-15% przypadków) • Rak chromofobowy (5% przypadków) • Rak z cewek zbiorczych (1-2% przypadków) • Rak sarkomatoidalny (1% przypadków) • Niesklasyfikowany rak nerki Wymienione rodzaje raka nerki różnią się etiologią, molekularnym charakterem zmian prowadzących do powstania nowotworu, przebiegiem oraz agresywnością (2,5,6). Jasnokomórkowy rak nerki (ang. Clear cell renal cell carcinoma, ccRCC), który jest najczęstszym i bardzo agresywnym typem RCC, występuje zazwyczaj w korze nerki, makroskopowo ma wygląd żółtawych nacieków z występującymi miejscami nekrotycznymi i krwotocznymi, a jego komórki charakteryzują się jasną cytoplazmą, przez nagromadzenie dużej ilości lipidów (5). Prawidłowa klasyfikacja histologiczna jest niezwykle istotna dla oceny prognozy oraz dobrania właściwej terapii leczniczej (7). Dowiedziono, że wykrycie choroby we wczesnych stadiach zaawansowania klinicznego znacząco zwiększa odsetek przeżyć pięcioletnich, natomiast szanse na przeżycie pacjentów w ostatnich stadiach choroby, wiążących się z wysokim stopniem inwazji i obecnością przerzutów, maleją prawie trzykrotnie. Ocena rokowania dokonywana jest zazwyczaj na podstawie klasyfikacji TNM, gdzie T - oznacza opis wielkość guza pierwotnego i inwazję okolicznych żył, N – oznacza zajęcie okolicznych węzłów chłonnych, a M – oznacza obecność odległych przerzutów (3). Niezależną klasyfikacją histologiczną jest skala Fuhrman, gdzie ocenie poddawane są jądra komórkowe (8,9): • Stadium 1 - Okrągłe jądra o średnicy ok. 10 μm, bez lub z bardzo małym jąderkiem • Stadium 2 - Nieco nieregularne, średnica ok. 15 μm, jąderko widoczne przy powiększeniu 400x • Stadium 3 - Średnio lub bardzo nieregularne kontury jąder, średnica ok. 20 μm, z dużym jąderkiem widocznym pod powiększeniem 100x • Stadium 4 - Jądro podobne do stadium 3, często komórki wielojądrzaste, z dużymi fragmentami chromatyny Co roku wykrywanych jest ok. 300 tysięcy nowych przypadków ccRCC, a 120 tysięcy osób umiera z powodu tej choroby (2,5). Wysoka śmiertelność spowodowana jest zwykle zbyt późną diagnostyką. W początkowych stadiach nie występuje klasyczna triada objawów: ból w okolicy lędźwiowej, wyczuwalny guz i krwiomocz. Z tego względu, nowotwór często wykrywany jest przez przypadek podczas badań obrazowych, zazwyczaj z współistniejącymi przerzutami. Ryzyko choroby rośnie wraz z wiekiem, a szczyt zachorowań przypada między szóstą i siódmą dekadą życia, dodatkowo predyspozycje rodzinne zwiększają ryzyko wystąpienia około dwukrotnie (4). Mężczyźni zapadają na ten nowotwór prawie dwukrotnie częściej niż kobiety (5). 4.1.2 Podłoże genetyczne jasnokomórkowego raka nerki Czynnikami zwiększającymi ryzyko zapadalności na jasnokomórkowego raka nerki są m. in. palenie papierosów, otyłość czy nadciśnienie tętnicze oraz predyspozycje genetyczne. Analiza genomowa oraz analiza transkryptomu setek próbek od pacjentów ze zdiagnozowanym ccRCC wykazała, że najczęściej występującą zmianą genetyczną w jasnokomórkowym raku nerki jest delecja chromosomu 3p (10,11). Te same badania wykazały utratę heterozygotyczności 3p (ang. Loss of heterozygosity, LOH) u ponad 90% przebadanych przypadków (10,11). Większość zaobserwowanych zmian na chromosomie 3p obejmowała delecje, mutacje lub metylacje. Supresorami nowotworzenia okazały się 4 najbardziej zmutowane geny: PBRM1, BAP1, SETD2 oraz VHL znajdujące się blisko siebie na chromosomie 3p (10,11). PBRM1, SETD2 i BAP1 pełnią funkcję modulatorów chromatyny oraz histonów (12). Natomiast VHL jest niezwykle istotnym regulatorem angiogenezy i czynników indukowanych przez hipoksję (ang. Hypoxia inducible factors, HIFs) (12). Co ciekawe, mediana przeżycia pacjentów z mutacją genu BAP1 była zdecydowanie niższa w porównaniu z pacjentami z mutacją genu PBRM1 (13). Inne zmiany genetyczne, obserwowane w 28% przypadków ccRCC, to utrata fragmentów chromosomów 6q, 8p12, 9p21-22, 10q (4,6) oraz mutacje genu TP53 oraz genów ścieżki sygnalizacyjnej PI3K-Akt-mTOR (10,11). Dodatkowo, często występujące mutacje genu MTOR prowadzą do aktywacji wielu ścieżek zaangażowanych m.in. w proliferację, angiogenezę i metabolizm komórek. Powyższe badania podkreślają jak istotna, oprócz oceny histologicznej jest charakterystyka molekularna zmian w celu odpowiedniej klasyfikacji pacjentów i zaproponowania najbardziej efektywnej terapii. 4.1.3 Mutacje genu VHL w jasnokomórkowym raku nerki Białko von Hippel-Lindau (VHL), kodowane przez gen VHL, jest kluczowym modulatorem odpowiedzi komórki na niedobór tlenu - hipoksję. Gen VHL jest zaliczany do genów supresorowych, a jego mutacje sprzyjają powstawaniu silnie unaczynionych nowotworów (14). Ekspresja genu VHL występuje we wszystkich tkankach i tak jak wspomniano w poprzednim akapicie, jego locus znajduje się na ramieniu krótkim chromosomu 3p25-26. Natomiast białko VHL wykazuje specyficzność tkankową, największa jego ilość występuje kolejno w nerkach, wątrobie i trzustce (15). Główną funkcją białka VHL jest regulacja poziomu czynnika transkrypcyjnego HIF1α. Działanie VHL polega na tworzeniu kompleksu VBC, razem z elonginą B i C, kulliną i acetylotransferazą SSAT2, który posiada aktywność ligazy E3 ubikwityny i rozpoznaje substrat, którym jest czynnik transkrypcyjny HIF1α (po hydroksylacji proliny) (14,16–18). W wyniku tego HIF1α jest ubikwitynowany, a następnie ulega degradacji w proteasomie. W sytuacji niedoboru tlenu lub mutacji VHL kompleks VBC nie rozpoznaje białka HIF1α, którego poziom gwałtownie rośnie. Następnie, HIF1α jest stabilizowany i przeniesiony z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie łączy się z drugim, niewrażliwym na poziom tlenu, białkiem HIF1β oraz białkami CBP i p300 (14,16–18). Cały kompleks wiąże się z sekwencją HRE co powoduje ekspresję genów zaangażowanych w odpowiedzi na hipoksję takich jak: czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. Vascular endothelial growth factor, VEGF), transporter glukozy 1 (ang. Glucose transporter 1, GLUT-1), płytkopochodny czynnik wzrostu (ang. Platelet-derived growth factor, PDGF), transformujący czynnik wzrostu alfa (ang. Transforming growth factor alpha, TGFα), czynnik-1 alfa pochodzenia podścieliskowego (ang. Stromal-derived growth factor 1, SDF-1) czy erytropoetyna (EPO) (Rycina 4.1.) (14,19–22). Wiele ścieżek sygnałowych zaangażowanych w rozwój nowotworów jest także aktywowanych hipoksją m.in. ścieżka PI3K-Akt-mTOR, Ras-Raf-ERK czy HGF-c-Met (6,23–25) Zespół von Hippel-Lindau (VHL) jest schorzeniem dziedziczonym autosomalnie dominująco, znacząco zwiększającym ryzyko zachorowania na jasnokomórkowego raka nerki (26). Najczęstszymi mutacjami prowadzącymi do choroby VHL są przesuwające ramkę odczytu delecje i insercje oraz mutacje zmiany sensu genu VHL, które prowadzą do powstania niefunkcjonalnego produktu (27). Większość pacjentów dziedziczy zmienioną kopię genu od jednego z rodziców, ale ok. 20% przypadków jest spowodowanych spontaniczną mutacją zazwyczaj w fazie wczesnej embriogenezy (28). Zmiana drugiego allelu nabywana jest spontanicznie w trakcie życia, co w efekcie prowadzi do ujawnienia zespołu VHL, powstawania cyst i zmian nowotworowych. Mutacja germinalna jednego allelu, a następnie somatyczna drugiego jest określana jako utrata heterozygotyczności (29). Hipermetylacja w promotorze genu VHL także powoduje jego inaktywację i jest obserwowana od 5 do 20% przypadków ccRCC (6). Rycina 4.1. Schemat ilustrujący działanie białka VHL w warunkach normalnego poziomu tlenu (normoksja), głodu tlenowego (hipoksja) oraz przy mutacji genu VHL. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (14-22). Przy zespole VHL obserwuje się większą predyspozycję do nowotworów nerek (przede wszystkim ccRCC), nadnerczy, siatkówki czy móżdżku, dodatkowo ich objawy pojawiają się wcześniej, niż u osób nieobarczonych zespołem von Hippel-Lindau (30). Kliniczna klasyfikacja choroby von Hippel-Lindau obejmuje 2 główne grupy, z których każda wiąże się z inną etiologią i predyspozycją do konkretnego rodzaju nowotworu. Grupa pierwsza charakteryzuje się głównie mutacjami nonsensownym i delecjami VHL oraz niskim ryzykiem wystąpienia guza chromochłonnego, natomiast grupa druga mutacją zmiany sensu genu VHL i wysoką predyspozycją rozwinięcia guza chromochłonnego (30,31). Dodatkowo grupę drugą dzieli się na 3 podtypy 2A, 2B i 2C. Chorzy z typem 1 i 2B są obarczeni wysokim ryzykiem zachorowania na jasnokomórkowego raka nerki, natomiast pacjenci z typem 2A posiadają niskie predyspozycje do ccRCC (30,31). W komórkach epitelialnych kanalików nerkowych pacjentów z zespołem VHL rozwijają się zmiany nienowotworowe i łagodne zmiany nowotworowe w postaci cyst i torbieli, które z czasem przekształcają się w zmiany złośliwe. Inaktywacja VHL, akumulacja HIFα w warunkach normoksji i hipoksji oraz ekspresja czynników proangiogennych powodują, że rozwijające się guzy są ekstremalnie unaczynione, przez co stosowanie inhibitorów angiogenezy stało się głównym celem terapeutycznym w ccRCC. Kolejną ważną cechą czynników HIFα i białka VHL w komórkach ccRCC jest regulacja poziomu cykliny D1 która wraz z kinazami zależnymi od cyklin (ang. Cyclin dependent kinase, Cdk) cdk4 i cdk6 stymuluje proliferację komórek nowotworowych (32,33). Linie komórkowe RCC, negatywne względem genu VHL charakteryzowały się wysokim poziomem cykliny D1 oraz brakiem zdolności do wyjścia z cyklu komórkowego. Przywrócenie normalnego poziomu VHL w warunkach doświadczalnych powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego i areszt w fazie G0 (32,33). Co ciekawe, niektóre dane literaturowe sugerują, że hipoksja wraz z czynnikami HIF hamują proliferację poprzez aktywację białka Rb, utratę Cdk i obniżenie poziomu cyklin (34), jednak w przypadku komórek raka nerki z defektem genu VHL, które zasadniczo są niewrażliwe na zmiany stężenia tlenu, sytuacja wydaje się odwrotna. 4.2 Angiogeneza (neowaskularyzacja) w procesie rozwoju nowotworu 4.2.1 Charakterystyka procesu angiogenezy Angiogeneza jest procesem tworzenia się nowych naczyń krwionośnych z już istniejących. W warunkach fizjologicznych zachodzi przede wszystkim w rozwoju embrionalnym razem z waskulogenezą (tworzeniem naczyń de novo), oraz w trakcie gojenia się ran czy regeneracji endometrium w trakcie cyklu miesięcznego u kobiet (35). Angiogeneza jest też krytycznym krokiem podczas przemiany łagodnego nowotworu w złośliwy, gdy zostaje zachwiana równowaga między czynnikami stymulującymi, a hamującymi rozwój unaczynienia (36). Gwałtownie dzielące się komórki nowotworowe do swojego wzrostu potrzebują tlenu i substancji odżywczych dostarczonych z krwią. Małe skupiska komórek nowotworowych, nie przekraczające 2 mm3, pobierają tlen na drodze dyfuzji z okolicznych naczyń krwionośnych (37,38). Rozrost tkanki nowotworowej powoduje hipoksję i kwasicę, poprzez brak usuwania resztek przemiany materii, co prowadzi do aktywacji czynników HIFα (37). Istnieją trzy formy HIFα z czego najlepiej poznanymi są HIF1α i HIF2α, które działają podobnie w odpowiedzi na zmiany stężenia tlenu (39). Co ciekawe, wykazano, że w przypadku ccRCC to właśnie poziom izoformy HIF2α jest krytycznym czynnikiem stymulującym wzrost i rozwój guzów VHL-/-, a jej zahamowanie powoduje znaczące spowolnienie wzrostu guzów in vivo (40–43). W raku nerki obarczonym mutacją genu VHL, HIFα jest akumulowany nawet w warunkach normoksji i powoduje wzmożoną ekspresję czynników proangiogennych: PDGFβ, czynnika wzrostu hepatocytów (ang. Hepatocyte growth factor, HGF), angiopoetyny-2, epidermalnego czynnika wzrostu (ang. Epidermal growth factor, EGF), oraz głównego stymulatora neowaskularyzacji – VEGF (30,43–45). Do rodziny VEGF należy 6 czynników (od A do E oraz czynnik wzrostu łożyska - PlGF), z których VEGFA jest najlepiej poznanym. W wyniku alternatywnego składania, powstają izoformy różniące się ilością aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym, które cechuje różne powinowactwo do heparyny i biodostępność. VEGFA działa przez wiązanie się do jednego ze swoich receptorów (ang, VEGF receptor, VEGFR1, VEGFR2) znajdujących się na powierzchni komórek śródbłonka i aktywacji dalszych ścieżek przekazu sygnału (46,47). 4.2.2 Etapy angiogenezy W wyniku martwicy i niedotlenienia, w komórkach nowotworowych dochodzi do przełączenia angiogennego (ang. angiogenic switch). Przełączenie to powoduje niekontrolowaną produkcję wcześniej wymienionych czynników proangiogennych, które wiążąc się ze swoimi receptorami na komórkach śródbłonka, aktywują kinazy białkowe i powodują wzrost przepuszczalności naczyń oraz redystrybucję międzykomórkowych białek adhezyjnych m.in. CD31 czy VE-kadheryny (Ryc. 4.2. A) (36,47). VE-kadheryna tworzy połaczenia pomiędzy komórkami endotelialnymi zapewniając integralność śródbłonka (48,49). Komórki nowotworowe wydzielają czynnik VEGFA, który łączy się ze swoim receptorem na powierzchni komórki endotelialnej. Następnie, dochodzi do autofosforylacji receptora VEGF i przeniesienia reszty fosforanowej z VEGFR2 przez kinazy Src, PAK, kinazę ogniskowo-adhezyjną (ang. Focal andhesion kinase, FAK) oraz substrat 1 toksyny botulinowej C3 związany z Ras (ang. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1) na VE-kadherynę (50). Fosforylowana VE-kadheryna ulega internalizacji i translokacji w inne miejsce, bądź degradacji co prowadzi do destabilizacji połączeń międzykomórkowych, rearanżacji cytoszkieletu i w konsekwencji zwiększonej przepuszczalności naczyń (48–50). Co więcej, wykazano, że nie tylko stymulacja VEGF powoduje osłabienie połączeń komórkowych, ale również wydzielane przez komórki nowotworowe metaloproteinazy (ang. Metalloproteinase, MMP), zwłaszcza MMP2 oraz MMP9 (51). W tym przypadku jednak nie dochodzi do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, a odcięcia jej zewnątrzkomórkowej domeny i destabilizacji połączeń komórka-komórka (51,52). Metaloproteinazy biorą również udział w degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej co przyczynia się do proliferacji i migracji komórek endotelialnych (ECs) (35). Rozwojowi guza towarzyszy przewlekły stan zapalny i napływ komórek układu odpornościowego. Wykazano, że nadekspresja VEGF powoduje wzrost czynnika SDF-1 co z kolei wpływa na rekrutację komórek mieloidalnych posiadających na powierzchni receptor dla chemokin 4 (ang. Chemokine receptor 4, CXCR4) (53). Oprócz komórek nowotworowych, także komórki układu odpornościowego, a przede wszystkim makrofagi są istotnym źródłem cytokin i chemokin prozapalnych, które pełnią również istotną funkcję w promocji neowaskularyzacji (54). Dobrze poznaną chemokiną proangiogenną, syntetyzowaną przez komórki nowotworowe, jest IL-8, która aktywuje nie tylko neutrofile, ale również makrofagi, komórki tuczne i komórki endotelialne (54,55). VEGF, IL-8 oraz SDF-1 stymulują komórki endotelialne do migracji przez zdegradowaną macierz otaczającą śródbłonek w stronę gradientu czynników wzrostowych i w ten sposób rozpoczyna się proces kiełkowania (ang. Sprouting) naczyń krwionośnych (Ryc. 4.2. B). Ważną rolę podczas migracji i kiełkowania naczyń pełnią receptory integrynowe, których ekspresję stymuluje VEGF, czynnik martwicy nowotworów alfa (ang. Tumor necrosis factor alpha,TNF-α) oraz sama IL-8 (37). Ostatnim etapem angiogenezy nowotworowej jest dojrzewanie powstałych naczyń, w którym biorą udział m.in. czynniki antyangiogenne oraz PDGFβ który stymuluje komórki otaczające komórki śródbłonka, tzw. perycyty, do osiadania i stabilizowania powierzchni nowych naczyń (45,56). Dobrze rozwinięty system naczyń krwionośnych w guzie jest istotną składową procesu przerzutowania, czyli opuszczenia pierwotnego ogniska przez agresywne komórki nowotworowe i migracji z krwioobiegiem w poszukiwaniu nowej niszy (Ryc. 4.2. C). Rycina 4.2. Schemat procesu angiogenezy w obrębie guza nowotworowego. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (36, 37). Sieć naczyń krwionośnych obecna w guzie nowotworowym ze względu na brak równowagi między czynnikami pro i antyangiogennymi różni się od unaczynienia fizjologicznego. Naczynia krwionośne w guzie tworzą chaotyczny układ, który ciągle ulega przebudowie. Posiada nieregularne, często ślepo zakończone naczynia, z których większość jest niefunkcjonalna oraz charakteryzuje się zwiększoną przepuszczalnością powodującą drobne, lecz liczne krwotoki (38). Naczynia nowotworowe nie dostarczają komórkom guza odpowiedniej ilości tlenu, co skutkuje niedotlenieniem i obumarciem części tkanki. Słaba jakość naczyń krwionośnych jest również spowodowana tym, że budują je oprócz wyspecjalizowanych komórek śródbłonka, także komórki nowotworowe. Zjawisko przejmowania przez agresywne komórki nowotworowe fenotypu i właściwości komórek endotelialnych i formowania de novo sieci tubularnych struktur, połączonych z właściwymi naczyniami krwionośnymi nosi nazwę mimikry naczyniowej (57). Wykazano, iż również komórki ccRCC posiadają zdolność formowania naczynio-podobnych struktur (58–60). Oprócz typowych receptorów kinaz tyrozynowych takich jak VEGFR czy PDGFR, w proces angiogenezy nowotworowej zaangażowany jest także receptor c-Met. Receptor ten, działając na szereg białek wpływa na stabilizację HIF1α oraz, niezależnie od stężenia tlenu, aktywuje czynniki transkrypcyjne STAT w efekcie stymulując ekspresję VEGF (61). Podobne działanie wykazuje IL-6, która łącząc się parakrynnie lub autokrynnie ze swoim receptorem, fosforyluje białko STAT3 (ang. Signal transducer and activator of transcription 3), które następnie ulega dimeryzacji i translokacji do jądra. Ścieżka sygnałowa IL-6/STAT3 stymuluje ekspresję VEGF oraz metaloproteinaz MMP2 i MMP9 (62,63). Ekspresję VEGF regulują również receptor CXCR4 wraz ze swoim ligandem SDF1, który jest silnym chemoatraktantem dla endotelialnych komórek progenitorowych migrujących ze szpiku kostnego (64,65). Wysoki poziom VEGF w guzie jest zazwyczaj złym czynnikiem prognostycznym w wielu typach nowotworów, także w ccRCC i świadczy on o skłonności komórek nowotworowych do progresji i tworzenia przerzutów. Analiza próbek pacjentów w różnych stadiach zaawansowania choroby wykazała, że wraz z progresją ccRCC rośnie ekspresja czynników stymulujących rozwój unaczynienia (66). Ze względu na częste mutacje genu VHL, akumulację HIF oraz nadekspresję wielu stymulatorów angiogenezy, jasnokomórkowy rak nerki tworzy silnie ukrwione guzy i logicznym wydało się wprowadzenie terapii opartych o leki celujące zarówno w sam VEGF jak i receptory kinaz tyrozynowych zaangażowanych w rozwój unaczynienia. Stosowanie inhibitorów kinaz tyrozynowych (ang. Tyrosine kinase inhibitors, TKIs) początkowo daje zadowalające efekty, jednak w trakcie długotrwałej terapii ich skuteczność jest kwestionowana ze względu na wykształcanie na nie mechanizmów oporności. 4.3 Rola receptora c-Met w progresji ccRCC Rozsiew komórek nowotworowych i powstanie odległego przerzutu jest długotrwałym i wieloetapowym procesem. Niezbędny do tego jest rozwój unaczynienia w obrębie ogniska pierwotnego guza nowotworowego oraz nabycie przez komórkę nowotworową szeregu cech, które pozwolą jej na aktywną migrację, przeżycie w krwioobiegu, a następnie umożliwią przedostanie się przez ścianę naczynia i osiedlenie w nowej niszy. Jednym z dobrze poznanych czynników zaangażowanych w progresję nowotworową, jest receptor c-Met wraz ze swoim ligandem HGF. Nadekspresja lub konstytutywna fosforylacja receptora c-Met prowadzi do aktywacji wielu szlaków przekazu sygnału i w konsekwencji do zwiększonej proliferacji, migracji i inwazyjności komórek nowotworowych (67). 4.3.1 Charakterystyka receptora c-Met Błonowy receptor c-Met, produkt proto-onkogenu MET, jest obecny głównie na powierzchni komórek epitelialnych, podczas gdy ekspresja jego ligandu, HGF, zachodzi selektywnie, w komórkach pochodzenia mezenchymalnego (67). W warunkach fizjologicznych receptor c-Met bierze udział w embriogenezie i organogenezie, różnicowaniu czy gojeniu ran (68–70). C-Met jest zaliczany do receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej i składa się z podjednostki α oraz β połączonych mostkami disiarczkowymi. Podjednostka α znajduje się po zewnętrznej stronie błony komórkowej, natomiast podjednostka β przechodzi przez błonę komórkową i po stronie wewnątrzkomórkowej zawiera kilka miejsc fosforylacji oraz domenę kinazy tyrozynowej (Y1234, Y1235), regulującą aktywność receptora (67,71). Przyłączenie ligandu HGF, powoduje homodimeryzację receptora i krzyżową fosforylację reszt tyrozynowych Y1234 i Y1235. Następnie, fosforylacji ulegają tyrozyny Y1349 i Y1356, które aktywują pośrednio, przez białko oddziałujące z GRB2 (ang. GRB2-associated-binding protein 1, GAB1), lub bezpośrednio białka: wiążące receptor dla czynnika wzrostu typu 2 (ang. Growth factor receptor-bound protein 2, GRB2), 3-kinazę fosfatydyloinozytolu (ang. Phosphoinositide 3-kinase, PI3K), czynnik transkrypcyjny STAT3 czy kinazy Src oraz SHP2 (ang. Src homology region 2 domain-containing phosphatase-2) (67,70,71). Receptor c-Met może aktywować kilka ścieżek sygnalizacyjnych zaangażowanych w regulację angiogenezy, migracji, różnicowania czy proliferacji. Na skutek aktywacji przez receptor c-Met, białko GRB2 wiąże się z czynnikiem SOS (ang. Son of sevenless), po czym następuje przekaz sygnału na białko Ras (ang. Rat sarcoma viral homolog) oraz RAF i dalsza aktywacja szlaku kinaz MAPK regulujących m.in. proliferację komórek i różnicowanie (72). Dodatkowo, białko Ras jest czynnikiem aktywującym inne małe GTPazy: Rac1 (ang. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1) i Cdc42 (ang. Cell division control protein 42 homolog) zaangażowane w rearanżację cytoszkieletu aktynowego, przejście epitelialno-mezenchymalne (ang. Epithelial to mesenchymal transition, EMT) i migrację (73). Z kolei, poprzez aktywację białka PI3K następuje przekaz sygnału na kinazę Akt i mTOR, które w głównej mierze odpowiedzialne są za przeżywalność komórek (74). Jednocześnie z PI3K, kinaza Src aktywuje kinazę ogniskowo-adhezyjną (ang. Focal adhesion kinase, FAK) regulującą ruchliwość i inwazyjność komórek, w odpowiedzi na fosforylację receptora c-Met (75). W końcu, przekaz sygnału z receptora c-Met na czynnik STAT3 powoduje jego dimeryzację i translokację do jądra, gdzie reguluje transkrypcję wielu genów m.in. HIF1α (76) (Ryc. 4.3.). Rycina 4.3. Schemat budowy receptora c-Met i szlaki przekazu sygnału aktywowane osią HGF/c-Met. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (67). Tak szerokie spektrum działania receptora c-Met powoduje, że jego nadmierna aktywacja ma bardzo istotny wpływ na rozwój i progresję wielu typów nowotworów. Wykazano, że wzmożona amplifikacja genu MET powoduje nadekspresję białka c-Met i jego konstytutywną fosforylację w nowotworach wątroby, żołądka, piersi, mózgu czy nerki (77–80). Co więcej, oprócz autokrynnej bądź parakrynnej aktywacji zależnej od liganda, może dochodzić do transaktywacji receptora poprzez współdziałanie z innymi receptorami błonowymi m.in. CD44, EGFR, CXCR4 czy receptorami integrynowymi, często bez udziału HGF (67,81–84). Hipoksja także jest jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za ekspresję c-Met zarówno w warunkach in vitro oraz in vivo (85). Badania nad rakiem trzustki wykazały, że czynnik transkrypcyjny HIF1α wiążąc się do promotora MET aktywuje jego transkrypcję pod wpływem hipoksji (86). Co więcej, poziom c-Met różni się w obrębie tkanki nowotworowej, obszary guza objęte hipoksją charakteryzują się nadekspresją c-Met w porównaniu z fragmentami z rozwiniętym unaczynieniem (85). 4.3.2 Receptor c-Met w raku nerki W zdrowej nerce receptor c-Met znajduje się głównie w epitelialnych komórkach kanalików nerkowych i bierze udział w stymulacji tych komórek do tworzenia rozgałęzień kanalików w trakcie rozwoju nerki i jej regeneracji po urazie bądź nefrektomii (87,88). W 1996 r. po raz pierwszy wykazano, że poziom receptora c-Met rośnie w tkance nowotworowej w porównaniu ze zdrową nerką (89). Natali i wsp. przebadali, za pomocą barwień immunohistochemicznych (IHC), 50 próbek od pacjentów z różnymi typami raka nerki i zaobserwowali wysoki poziom c-Met w 87% próbek nowotworowych, podczas gdy w zdrowej nerce sygnał był bardzo słaby i ograniczony jedynie do kanalików dystalnych (89). Rok później, potwierdzono te wyniki i dodatkowo powiązano wzrastający poziom receptora c-Met z progresją choroby i obecnością przerzutów (90). W stadium 1 i 2 wg skali Fuhrman, receptor c-Met wykryto jedynie w 8 na 17 przypadków, podczas gdy w stadium 3 i 4 aż 20 próbek na 24 było pozytywne dla c-Met (90). Badania prowadzone przez koreańską grupę Choi i wsp. wykazały, że ponad 90% próbek brodawkowatego raka nerki posiadało silny sygnał receptora c-Met podczas barwienia IHC, podczas gdy próbki raka jasnokomórkowego jedynie 45% (91). Brodawkowaty rak nerki (ang. papillary RCC, pRCC) charakteryzuje się częstymi mutacjami w obrębie chromosomu 7, na którym zlokalizowane jest locus genu MET (7q31) (92). Trisomia chromosomu 7 występująca w typie sporadycznym pRCC powoduje zwiększoną ilość kopii MET, co zazwyczaj przekłada się na podwyższoną ilość białka (92). Dodatkowo, zarówno w dziedzicznym jak i sporadycznym pRCC zaobserwować można mutacje typu brak sensu głównie w domenie kinazy tyrozynowej prowadzące do konstytutywnej fosforylacji receptora c-Met, nawet przy braku HGF, i w konsekwencji aktywacji szlaków przekazu sygnału omówionych w poprzednim podrozdziale (80,91,92). W przypadku ccRCC, Choi i wsp. wykazali, że ekspresja c-Met pozytywnie koreluje ze stopniem zaawansowania choroby wg skali Fuhrman oraz z innymi czynnikami zaangażowanymi w inwazyjność i agresywność nowotworu (91). Inne zespoły potwierdziły, na większej grupie pacjentów, wysoki poziom receptora c-Met w tkance nowotworowej w porównaniu z otaczającą zdrową oraz wzrost ekspresji MET wraz z progresją nowotworową (93,94). Co więcej, receptor c-Met uznano, za negatywny wskaźnik predykcyjny związany z agresywnym fenotypem i niekorzystnym rokowaniem dla pacjenta (93,94). Zwiększająca się ilość kopii genu MET była wykryta w ponad 310 przypadkach na 572 i korelowała z większą objętością guza, zajęciem okolicznych węzłów chłonnych i obecnością odległych przerzutów (93). Dodatkowo, Miyata i wsp. jako pierwsi powiązali fosforylację receptora c-Met na tyrozynie Y1349 ze stadium zaawansowania klinicznego i przeżywalnością (95). W przypadku ccRCC istotną rolę w utrzymaniu konstytutywnej fosforylacji c-Met pełni białko VHL. Wykazano, że w liniach komórkowych ccRCC z mutacją w genie VHL, receptor c-Met był konstytutywnie aktywowany nawet w przypadku braku ligandu HGF (96). Natomiast, przywrócenie prawidłowego poziomu VHL w komórkach, powodowało spadek fosforylacji c-Met (96). 4.3.3 Znaczenie receptora c-Met w regulacji procesu przejścia epitelialno-mezenchymalnego (EMT) Proces EMT charakteryzuje się zmianą fenotypu komórki z epitelialnego na mezenchymalny. W jego wyniku komórka stopniowo traci zdolność do połączeń międzykomórkowych oraz adhezji do błony podstawnej na rzecz zwiększonej ruchliwości i inwazyjności (97,98). Podobnie jak w przypadku angiogenezy, EMT może zachodzić w warunkach fizjologicznych podczas embriogenezy i tworzenia narządów (typ pierwszy EMT) oraz w dorosłym organizmie w trakcie regeneracji, gojenia ran i fibrozy (typ drugi EMT). W takcie rozwoju nowotworu, trzeci typ EMT, jest inicjowany szeregiem czynników m. in. hipoksją, degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej czy wydzielaniem cytokin. EMT pełni kluczową rolę w nabywaniu przez ccRCC zdolności do aktywnej migracji i stanowi jeden z podstawowych mechanizmów progresji nowotworowej (98,99). Komórki epitelialne charakteryzuje obecność różnego rodzaju białek budujących połączenia międzykomórkowe oraz przytwierdzających komórkę do błony podstawnej. W pierwszym etapie EMT zmniejsza się ekspresja białek fenotypu epitelialnego e-kadheryny, ZO-1, cytokeratyny, cząsteczki adhezji komórek nabłonkowych (ang. Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM) czy lamininy-1. Główny składnik obwódek przylegania i najważniejszy marker komórek epitelialnych, e-kadheryna, zastępowana jest przez n-kadherynę (99). E-kadheryna jest zaliczana do białek supresorowych, ponieważ jej spadek związany jest ze wzrostem agresywności nowotworu i gorszymi rokowaniami. Do tej pory odkryto wiele czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za obniżenie ekspresji e-kadheryny. Należą do nich białka z rodziny Snail, ZEB czy Twist (100,101). Czynniki te wiążą się z różnym powinowactwem do sekwencji E-box w promotorze genu CDH1 kodującego e-kadherynę hamując jej ekspresję (100). Część badaczy sugeruje, że największe powinowactwo do promotora e-kadheryny ma Snail1, który w warunkach fizjologicznych nie jest obecny w komórkach endotelialnych, występuje natomiast w komórkach nowotworowych pochodzenia nabłonkowego (102). Niedawno wykazano, że Snail1 może być negatywnym czynnikiem prognostycznym w ccRCC wskazującym na możliwość nawrotu choroby po wycięciu guza oraz u pacjentów chorych na raka piersi czy pęcherza moczowego (103–105). Następnie, dochodzi do utraty połączeń komórka-komórka oraz zmiany polaryzacji apikalno-bazalnej na rzecz polaryzacji tył-przód. Wzrasta także poziom markerów charakterystycznych dla komórek mezenchymalnych: wimentyny, β-kateniny oraz fibronektyny (97–99). W kolejnym etapie dochodzi do rearanżacji cytoszkieletu, przebudowy i polimeryzacji filamentów aktynowych. Komórka zmienia swoją morfologię na podłużną i wrzecionowatą i traci zdolność do zahamowania kontaktowego. W końcowym etapie następuje protruzja, czyli formowanie wypustek cytoplazmatycznych umożliwiających ruch i wydzielanie metaloproteinaz degradujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Zwiększa się aktywność migracyjna komórek, które stymulowane czynnikami wzrostu przemieszczają się w stronę zwiększającego się gradientu chemoatraktantów. Komórki opuszczają guz pierwotny i przedostają się przez błonę podstawną do naczyń krwionośnych bądź limfatycznych (Ryc. 4.4.) (98,99,101). Rycina 4.4. Schemat procesu przejścia epitelialno-mezenchymalego. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (97, 98). Przejście epitelialno-mezenchymalne regulowane jest przez wiele szlaków sygnalizacyjnych m.in. TGF-β, Wnt czy Notch, aktywowanych przez mikrośrodowisko nowotworu, stan zapalny, a także hipoksję (106–109). Receptor c-Met zaangażowany jest w regulację wielu procesów komórkowych biorących udział w inicjacji, progresji i przerzutowaniu nowotworu. Z tego względu, może stanowić nadrzędny modulator czynników biorących udział w EMT. Aktywacja c-Met angażuje szlaki sygnalizacyjne MAPK, FAK czy PI3K-Akt-mTOR i w sposób pośredni prowadzi do rearanżacji cytoszkieletu i zmiany fenotypu komórki na mezenchymalny, a także zwiększa aktywność ruchową i inwazyjność, czyli reguluje wszystkie procesy charakterystyczne dla EMT (110). Z kolei wykazano, że receptor c-Met bezpośrednio wpływa na aktywację kluczowego szlaku indukującego EMT, czyli Wnt/β-katenina (111). Aktywacja szlaku Wnt przez fosforylację i inaktywację GSK3β, prowadzi do stabilizacji cytoplazmatycznej β-kateniny, która ulega translokacji do jądra, gdzie łączy się z czynnikami transkrypcyjnymi TCF/LEF (107). Powoduje to zwiększoną transkrypcję genów zaangażowanych w progresję i przeżywalność, ale także wyższą ekspresję cykliny D1, VEGF oraz IL-8 dzięki czemu szlak Wnt/β-katenina promuje również proliferację i angiogenezę. Dodatkowo, β-katenina stabilizuje poziom Snail1 przez blokowanie jego fosforylacji i degradacji (107). W przypadku komórek glioblastomy wykazano, że zastosowanie specyficznego inhibitora receptora c-Met - SU11274 powoduje obniżenie ilości β-kateniny w jądrze komórkowym. Natomiast stymulacja HGF spowodowała translokację β-kateniny do jądra wskazując na istotną rolę c-Met w regulacji szlaku Wnt (111). W badaniach nad rakiem piersi wykazano, że współdziałanie receptora c-Met i szlaku Wnt/β-katenina prowadzi do nabierania agresywnego fenotypu i tworzenia przerzutów (112). Co ciekawe, w przypadku hepatocytów, ich stymulacja czynnikiem HGF indukowała translokację β-kateniny do jądra komórkowego, niezależnie od ścieżki Wnt (113). Oprócz wpływu na szlak Wnt/β-katenina, istnieją również inne mechanizmy aktywujące proces EMT, zależne od receptora c-Met. Badania nad rakiem szyjki macicy wykazały, że receptor c-Met wraz z CXCR4 negatywnie regulują poziom e-kadheryny, natomiast pozytywnie czynnik Slug (84). Wyniki przedstawione przez grupę badaczy z Chin potwierdziły, że receptor c-Met może działać synergistycznie lub addytywnie z CXCR4 aktywując czynnik transkrypcyjny STAT3, który z kolei reguluje ekspresję ZEB1 w raku żołądka (114). Z kolei w raku płuc, wykorzystanie inhibitora c-Met hamowało EMT, poprzez obniżanie poziomu czynnika Snail i podwyższenie e-kadheryny (115). Także wśród pacjentów ze zdiagnozowanym rakiem żołądka, wykazano negatywną korelację pomiędzy receptorem c-Met i e-kadheryną, gdzie niski poziom e-kadheryny i wysoki c-Met był złym czynnikiem prognostycznym (116,117). 4.3.4 Rola receptora c-Met w aktywności migracyjnej i przerzutowaniu Pomimo nabrania przez komórki nowotworowe nowych cech mających im pomóc w utworzeniu przerzutu, niewiele komórek jest w stanie samodzielnie przeżyć w krwioobiegu, wydostać się z niego i osiedlić w nowej niszy. Dzięki wysokiej plastyczności i adaptacji do gwałtownie zmieniających się warunków i otaczającego mikrośrodowiska komórki nowotworowe przedostaja się do światła naczynia, przemieszczają z krwią, a następnie osadzaja w odległych naczyniach włosowatych. Fenotyp mezenchymalny pozwala nowotworowym komórkom krążącym (ang. Circulating tumor cells, CTCs) na ucieczkę przed anoikis czyli apoptozą spowodowaną brakiem adhezji do podłoża (118). Po wydostaniu się z krwioobiegu do nowej tkanki, komórki przechodzą proces odwrotny do EMT czyli przejście mezenchymalno-epitelialne (ang. Mesenchymal to epithelial transition MET), który ułatwia osiedlenie się w nowej niszy i formowanie ogniska wtórnego (119). Jednym z wielu czynników zaangażowanych w tworzenie odległych przerzutów, jest receptor c-Met, który regulując poziom i fosforylację wielu białek w tym Ras i Rac1 oraz kinaz Src i FAK stymuluje ruchliwość komórek nowotworowych (75,120). Jak pokazano w modelu in vivo raka płaskonabłonkowego głowy i szyi, wyciszenie c-Met zmniejszało ruchliwość komórek i ilość przerzutów do węzłów chłonnych (121). Podobne wyniki uzyskano w badaniach nad mięsakiem prążkowanokomórkowym gdzie niski poziom receptorów c-Met i CXCR4 wpływał na zmniejszenie ruchliwości i agresywności komórek (122). Pojedyncze komórki nowotworowe, po migracji do krwioobiegu, narażone są na stres oksydacyjny i atak ze strony układu immunologicznego. Z tego względu, wykształciły mechanizm pozwalający im przetrwać w niekorzystnym środowisku, polegający na łączeniu się w klastry. Pierwotnie klaster zbudowany jest z różnych typów komórek, zarówno epitelialnych jak i mezenchymalnych oraz komórek wykazujących stadia pośrednie między fenotypem epitelialnym, a mezenchymalnym. Takie epitelialno-mezenchymalne hybrydy, przechodzą niepełne EMT oraz posiadają markery charakterystyczne zarówno dla nabłonka jak i komórek mezenchymalnych (123). Co więcej, w takich klastrach, komórki nie tracą połączeń komórka-komórka, ale zyskują zdolność do aktywnej, kolektywnej migracji. Po opuszczeniu pierwotnej niszy, do klastra dołączają płytki krwi i komórki podścieliska, które pełnią rolę ochronną oraz wydzielają czynniki wzrostu i chemokiny. Klastry występują rzadziej niż pojedyncze CTCs, natomiast ich potencjał inwazyjny i przerzutowania jest zdecydowanie wyższy. Tworzony przez klaster mikroprzerzut jest także bardziej heterogenny niż przerzut utworzony przez wzrost klonalny pojedynczej komórki, a co za tym idzie bardziej oporny na stosowane terapie (123). Dodatkowo, obecność we krwi klastrów jest negatywnym czynnikiem prognostycznym w wielu typach nowotworów w tym także w raku nerki (124). Co ciekawe, wykazano, że po stymulacji HGF, receptor c-Met aktywuje komórki wątroby do łączenia się w grupy i kolektywnej migracji, a także zwiększa ich inwazyjność przez zwiększenie ekspresji MMP3, MMP9 i MMP10 (125). 4.3.5 Terapie jasnokomórkowego raka nerki Ze względu na stopień zaawansowania choroby i podłoże genetyczne możemy wyróżnić kilka możliwości terapeutycznych proponowanych pacjentom ze zdiagnozowanym jasnokomórkowym rakiem nerki. Są to: postępowanie chirurgiczne wraz z radioterapią lub farmakoterapia, do której zaliczamy chemioterapię, inhibitory kinazy mTOR oraz inhibitory angiogenezy. Obecnie, podstawową strategią leczniczą pacjentów z rakiem nerki w postaci ograniczonej jest chirurgiczne usunięcie guza. W zależności od wielkości guza oraz zajęcia okolicznych węzłów chłonnych, operacja wycięcia obejmuje część lub całą nerkę. Dodatkowo, uzupełniająco stosuje się radioterapię w celu usunięcia pozostałych komórek nowotworowych (126,127). Z kolei w przypadku choroby rozsianej stosuje się chemioterapię skojarzoną z interferonem alfa (IFNα). Jednak ze względu na szybkie wykształcanie oporności na cytostatyki terapię tę stosuje się rzadko gdy inne formy leczenia nie dają rezultatów (128). W przypadku pacjentów w stadiach zaawansowanych, z guzem nieoperowalnym lub choroby rozsianej stosuje się terapie celujące w aktywność kinazy mTOR lub inhibitory angiogenezy. Ze względu na częste mutacje w obrębie genu MTOR obecne w ccRCC, u pacjentów z rakiem nerki niewrażliwych na inhibitory angiogenezy, stosuje się inhibitory blokujące kinazę mTOR – temsirolimus i ewerolimus (129). Leki działają poprzez związanie się z receptorem FKB12, co z kolei hamuje aktywację mTOR. W rezultacie dochodzi do zatrzymania cyklu komórkowego i zahamowania wzrostu guza. Inhibitory stosuje się zarówno w monoterapii jak i terapii łączonej z IFNα. Inhibitory kinazy mTOR, oprócz działania na proliferację komórek, negatywnie regulują proces angiogenezy, poprzez zahamowanie syntezy VEGF (130). Największą grupę leków celowanych stanowią inhibitory angiogenezy z których można wyróżnić przeciwciała monoklonalne i inhibitory kinaz tyrozynowych (ang. Tyrosine kinase inhibitors, TKIs) (131). Humanizowane przeciwciała monoklonalne – bevacizumab i nivolumab, są skierowane przeciwko VEGF i receptorowi programowanej śmierci 1 (ang. Programmed death 1, PD-1) (131,132). Natomiast do inhibitorów kinaz tyrozynowych zalicza się sunitinib, sorafenib, pazopanib, axitinib, lenvantinib oraz cabozantinib. Terapia z udziałem inhibitorów kinaz tyrozynowych opiera się na blokowaniu wielu receptorów z różnym powinowactwem oraz ścieżek sygnalizacyjnych przez nie kontrolowanych (131). Najczęściej stosowany sunitinib jest zalecany zazwyczaj jako lek I rzutu w ostatnim stadium zaawansowania choroby. Oprócz wszystkich receptorów VEGF oraz receptora PDGF, lek blokuje kinazę Raf, receptory Flt3 i RET (133). Sorafenib stosowany jest jako lek II rzutu i wykazuje aktywność podobną do sunitinibu (134,135). Ze względu na kluczową rolę receptora c-Met w rozwoju wielu typów nowotworów, również on stał się interesującym celem terapeutycznym, także w przypadku ccRCC. Jednym z niedawno opracowanych małocząsteczkowych inhibitorów kinaz tyrozynowych jest cabozantinib, który blokuje, oprócz typowych receptorów zaangażowanych w proces angiogenezy, receptor c-Met (136). 4.3.6 Oporność na inhibitory angiogenezy Wiele typów nowotworów pomimo pierwszej, dobrej odpowiedzi na zastosowane leki, z czasem wykształca mechanizmy obronne, które zmuszają lekarzy do zmian w strategii terapeutycznej. Oporność komórek nowotworowych jest zjawiskiem powszechnie znanym i jest definiowana jako progresja choroby, pomimo zastosowanej terapii (137). Terapie antyangiogenne, oparte na inhibitorach kinaz tyrozynowych takich jak sunitinib czy sorafenib, wykazują istotne znaczenie w redukcji unaczynienia i wielkości guza, zwłaszcza u pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki. Niemniej, długa ekspozycja na TKIs w większości przypadków powoduje nabywanie oporności poprzez przejście na alternatywne ścieżki sygnalizacyjne, które będą promować angiogenezę (138,139). Stopniowe zwiększanie dawki leku może opóźnić pojawienie się oporności. W przypadku sunitinibu wykazano, że oporność może być odwracalna, a zwiększenie dawki powoduje przywrócenie wrażliwości komórek nowotworowych (140). O ile stosowanie sunitinibu w wyższych dawkach może być skuteczne, to w przypadku sorafenibu wysoka dawka powoduje zdecydowanie wyższą toksyczność i brak zadowalających efektów (141). Mechanizmy leżące u podstaw oporności to przede wszystkim neutralizacja leku, aktywacja alternatywnych szlaków sygnalizacyjnych, modyfikacja i adaptacja komórek na działania leku, a także przejście epitelialno-mezenchymalne, które w znacznym stopniu ułatwia komórce adaptację do niekorzystnych warunków (139). Wyniki przedstawione przez Hammers i wsp. sugerują, że komórki oporne na sunitinib, pochodzące z przerzutu posiadają kształt podobny do fibroblastów oraz bardzo wysoki poziom HIF1α oraz wimentyny – głównego markera EMT (142). Kolejnym procesem odgrywającym istotną rolę w rozwoju oporności jest aktywacja alternatywnych szlaków sygnalizacyjnych. Komórka, zmuszona jest do kompensacji zablokowanych receptorów i rozpoczyna przekaz sygnału innymi ścieżkami, które w efekcie, będą prowadzić do utrzymania unaczynienia i proliferacji na wysokim poziomie (139). Co więcej, aktywacja nowych czynników nie tylko może podtrzymać angiogenezę, ale dodatkowo jest w stanie doprowadzić do stymulacji innych procesów korzystnych dla komórki nowotworowej, w tym zwiększonej inwazyjności, ruchliwości czy przeżywalności. Dowiedziono, że zahamowanie angiogenezy za pomocą sunitinibu prowadzi do nadmiernego wydzielania IL-8, istotnego czynnika zaangażowanego w rozwój unaczynienia, który kompensuje blokadę receptorów VEGF (143). 4.3.7 Receptor c-Met, a nabywanie oporności na leki celowane Szlak syngalizacyjny HGF/c-Met odgrywa istotną rolę zarówno w komórkach nowotworowych jak i komórkach śródbłonka, gdzie działa jako czynnik proangiogenny. Jak dotąd opublikowano kilka badań potwierdzających rolę receptora c-Met w nabieraniu oporności na TKIs w różnych typach nowotworów oraz w raku nerki (144–148). Shojaei i wsp. jako pierwsi wykazali, że receptor c-Met jest aktywowany w guzach opornych na sunitinib i przejmuje rolę VEGFR. Co więcej, zaobserwowali zwiększoną ekspresję HGF przez komórki stromy pochodzenia mezenchymalnego, który powodował fosforylację receptora c-Met znajdujący się na powierzchni komórek endotelialnych (148). Podobne wyniki przedstawiły inne grupy wskazując, że oporność na sunitinib była powodowana aktywacją receptorów c-Met oraz AXL i promowała nie tylko angiogenezę ale także EMT, inwazję i przerzutowanie (145–147). Receptor c-Met został również zaproponowany jako marker prognostyczny dla pacjentów RCC leczonych sunitinibem (149). Wydaje się, że receptor c-Met ulega fosforylacji w komórkach nowotworowych opornych na inhibitory kinaz tyrozynowych jako efekt kompensacji po zablokowaniu receptorów odpowiedzialnych za angiogenezę. Niestety aktywacja alternatywnej ścieżki prowadzącej do zwiększenia ekspresji czynnika VEGF, może prowadzić do indukcji szlaków sygnalizacyjnych regulowanych przez receptor c-Met zaangażowanych w proliferację, przeżywalność, migrację czy przerzutowanie. Dlatego niezbędnym stało się opracowanie terapii, która jednocześnie zatrzyma proces angiogenezy oraz zablokuje receptor c-Met. Okazało się, że jednoczesne zastosowanie specyficznego inhibitora c-Met z sunitinibem bądź axitinibem powodowało zahamowanie wzrostu guzów, mniejsze unaczynienie i ilość przerzutów oraz zwiększało przeżywalność myszy (144,145,147). W ten sposób rozpoczęto badania nad nową generacją TKIs, celujących także w receptor c-Met, które wydają się być odpowiedzią na problem oporności. Cabozantinib jest stosunkowo nowym (zaakceptowanym przez FDA w 2016) inhibitorem kinaz tyrozynowych, który blokuje VEGFR-2, c-Met, AXL, RET, KIT, Flt3 oraz Tie-2 hamującym zarówno proces angiogenezy jak i przerzutowanie czy inwazję nowotworową (150). Wydaje się, że cabozantinib jest bardzo dobrym lekiem wykazującym podobną tolerancję jak starsze inhibitory kinaz tyrozynowych, ale zdecydowanie lepszą skuteczność we wszystkich próbach klinicznych (151–153). 4.4 Białko MCPIP1 jako regulator procesów zapalnych i nowotworzenia 4.4.1 Procesy zapalne w chorobie nowotworowej Zapalenie stanowi kluczowy element w ochronie organizmu przed patogenami, a także podczas regeneracji tkanek, gojeniu ran i utrzymaniu homeostazy. Ze względu na podobieństwo zachodzących procesów i zaangażowanie tych samych komórek i szlaków metabolicznych biorących udział w chronicznym zapaleniu, nowotwór jest nazywany raną, która nigdy się nie goi w której toczą się ciągłe procesy zapalne i przebudowa tkanek (154). Zapalenie pełni główną rolę w tworzeniu mikrośrodowiska sprzyjającego wzrostowi guza, w efekcie promując angiogenezę i powstawanie odległych przerzutów (155). Co więcej, przewlekłe zapalenie obserwowane między innymi w wątrobie towarzyszące wrzodom żołądka, niealkoholowemu stłuszczeniu wątroby, czy fibrozie może bezpośrednio wpływać na powstawanie nowotworu (156–158). Oddziaływanie między makrofagami, neutrofilami limfocytami, komórkami podścieliska, fibroblastami i komórkami nowotworowymi, zachodzi przy udziale wielu czynników w tym interleukin, oraz metaloproteinaz (159). Jednym z głównych modulatorów odpowiedzi zapalnej w obrębie nowotworu jest czynnik transkrypcyjny NF-κB (ang. Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), który reguluje ekspresję cytokin prozapalnych i czynników wzrostu wydzielanych przez komórki układu odpornościowego oraz podścieliska, modulując ekspresję wielu genów zaangażowanych w rozwój nowotworu i unaczynienie (160). Proces zapalny reguluje inwazję, EMT i migrację na kilku poziomach. Wydzielane cytokiny TNF oraz IL-1β indukują ekspresję czynników transkrypcyjnych Twist i Slug (161). Komórki mieloidalne wpływają na produkcję metaloproteinaz i degradację macierzy zewnątrzkomórkowej (162). Produkcja IL-6 powoduje aktywację ścieżki sygnalizacyjnej czynnika transkrypcyjnego STAT3 i ekspresję genów zaangażowanych w angiogenezę, transformację nowotworową, przeżywalność i dalszą produkcję cytokin (163). Większość komórek układu odpornościowego stymuluje także napływ subpopulacji fibroblastów związanych z rakiem (ang. Cancer-associated fibroblasts, CAFs), które stanowią składową mikrośrodowiska guza sprzyjając wzrostowi komórek nowotworowych, nasilają angiogenezę i przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej. Dodatkowo, CAFs regulują infiltrację komórek mieloidalnych i limfocytów T i produkują czynniki zaangażowane w różnicowanie komórek odpornościowych (164). Obecne w dużych ilościach w obrębie nowotworu makrofagi, także produkują cytokiny m.in. IL-17, która nasila produkowanie innych interleukin: IL-1β, IL-6 czy IL-8 oraz TNFα. To z kolei zwiększa napływ neutrofili i komórek śródbłonka w obręb guza (165). Makrofagi swoiste dla guza (ang. Tumor-associated macrophages, TAM) wydzielają m.in. czynniki o działaniu angiogennym oraz główny induktor EMT – TGFβ (166). Przewlekły stan zapalny predysponuje do rozwoju nowotworu i towarzyszy wszystkim jego etapom, począwszy od inicjacji aż po tworzenie odległych przerzutów. Jednym z regulatorów stan zapalnego jest białko indukowane przez czynnik MCP-1 (ang. Monocyte Chemoattractant Protein-1-Induced Protein, MCPIP1). Białko to jest zaangażowane w degradację transkryptów prozapalnych cytokin, takich jak IL-1β, IL-2 czy IL-6 (167–169). Ostatnie badania wskazują na rolę białka MCPIP1 w rozwoju wielu typów nowotworów, w tym jasnokomórkowego raka nerki. 4.4.2 Budowa i mechanizm działania białka MCPIP1 Białko MCPIP1, znane również pod nazwą Regnaza-1, składa się z 599 aminokwasów, natomiast jego masa cząsteczkowa wynosi 66 kDa (170). Białko to, kodowane jest przez gen ZC3H12A, znajdujący się na chromosomie 1 i należy do rodziny białek MCPIP, w skład której wchodzą jeszcze trzy izoformy: MCPIP2, MCPIP3 i MCPIP4 (171). Białko MCPIP1 wykazuje budowę domenową która determinuje jego funkcje. Wyróżniamy N-końcową domenę (ang. N-terminal domain, NTD) oddziałującą z domeną PIN i zawierającą domenę wiążącą ubikwitynę (ang. Ubiquitin association domain, UBA), następnie region bogaty w prolinę (ang. Proline rich region, PRR), domenę katalityczną o aktywności RNazy PIN (ang. PilT N-terminal (PIN)-like RNase domain), która determinuje aktywność białka MCPIP1, motyw palca cynkowego typu CCCH (ang. Zinc finger, ZF) który bierze udział w bezpośrednim wiązaniu RNA, region natywnie nieuporządkowany NDR i region bogaty w prolinę oraz konserwatywny region C-końcowy (ang. Conservative c-terminal region, CCR)(Ryc. 4.5.) (168,172–176). Rycina 4.5. Schemat budowy domenowej białka MCPIP1. Zaadaptowano i zaprojektowano na podstawie (168, 172-176). Pierwsze doniesienia opisujące białko MCPIP1 pojawiły się w 2006 roku i dotyczyły badań na kardiomiocytach, gdzie wykazano, że aktywność MCP-1 indukuje nieznany czynnik transkrypcyjny o aktywności proapoptotycznej (177). Dalsze badania wskazały, że MCPIP1 może działać jako deubikwitynaza białek z rodziny TRAF (ang. TNF receptor associated factor), w tym TRAF2, TRAF3 oraz TRAF6, a także białek RIP (ang. Receptor-interacting protein) i NEMO (ang. NF-kappa-B essential modulator), czego efektem jest negatywna regulacja szlaków JNK i NF-κB (178). Kolejne Badania wskazały, że MCPIP1 pośredniczy w procesie usuwania ubikwityny z białka NEMO, poprzez współpracę z deubikwitynazą USP10 (ang. Ubiquiting specific peptidase 10) (179). Jednak główną i najlepiej poznaną funkcją białka MCPIP1 jest degradacja transkryptów wielu prozapalnych cytokin i negatywna regulacja stanu zapalnego dzięki aktywności RNazy. Mechanizm działania endonukleazy MCPIP1 polega na rozpoznawaniu i wiązaniu się do II-rzędowych struktur mRNA typu „spinki do włosów” w rejonie 3’UTR (ang. Untranslated region) i ich destabilizacji (172). Dodatkowo wykazano, że MCPIP1 rozpoznaje trzynukleotydowy motyw pętli struktury spinki: pirymidyna-puryna-pirymidyna (YRY) (180). Inne badania sugerują jednak, że obecność motywu YRY nie jest niezbędna do rozpoznania i degradacji mRNA przez MCPIP1. Przykładami takich transkryptów jest IL-2, BIRC3 (ang. Baculoviral IAP Repeat Containing 3) czy BCL2L1 (ang. Bcl-2-like protein 1) (167,181). Co ciekawe, analiza przeprowadzona w 2018 roku pokazała, że MCPIP1 może rozpoznawać kilka rodzajów pętli w regionie 3’UTR oraz jednoniciowy RNA (ang. Single stranded RNA, ssRNA) (172). Prawdopodobnie, białko MCPIP1 ulega także homooligomeryzacji w obecności substratu. Wiązanie mRNA zachodzi poprzez dwie związane domenami PIN cząsteczki MCPIP1 (dimer), które łączą się, w obecności substratu mRNA z kolejnym dimerem tworząc pierścieniowy tetramer (172). Obecność aktywnej domeny PIN jest niezbędna do degradacji mRNA, natomiast wiązanie MCPIP1 z helikazą UPF1 (ang. Upframeshift 1) powoduje oddziaływanie domeny NTD z domeną PIN zwiększając aktywność enzymatyczną białka (180). Analiza krystalograficzna potwierdziła, że domena PIN determinuje funkcje białka MCPIP1, wskazała także które aminokwasy są niezbędne do zachowania aktywności enzymatycznej. Dodatnio naładowane reszty kwasu asparaginowego znajdujące się w obrębie domeny PIN: D141, D225, D226 oraz D244 oddziałują z ujemnie naładowanymi grupami fosforanowymi mRNA (173). Mutageneza ukierunkowana powodująca pojedynczą mutację poprzez zmianę kwasu asparaginowego w pozycji 141 na asparaginę (D141N) prowadziła do powstania nieaktywnego enzymatycznie białka MCPIP1 (168,169). Wykazano także, że do degradacji mRNA przez MCPIP1, niezbędny jest fragment około 20 nukleotydów między kodonem STOP, a strukturą spinki, w regionie terminacji translacji (180). Substratami dla białka MCPIP1 są m. in. IL-1β, IL-6, IL-8, c-Rel, Ox40 czy Gata3 (167–169,182) oraz białko wiążące sekwencję CCAATβ (ang. CCAAT/enhancer binding protein b, c/EBPβ) czyli czynnik transkrypcyjny kontrolujący szerokie spektrum genów (183). Podobieństwo w strukturze „spinki” prekursorowych cząteczek mikroRNA (pre-miRNA) z regionami 3’UTR transkryptów rozpoznawanych przez MCPIP1, czynią je potencjalnym substratem dla jego aktywności RNazy. Rzeczywiście, wykazano, że MCPIP1 negatywnie reguluje dojrzewanie wielu miRNA, w tym miR-21, miR-155, miR-135b, miR-200 czy miR-146a, działając jako antagonista dla białka Dicer (175,180). 4.4.3 Regulacja ekspresji białka MCPIP1 Ze względu na szerokie spektrum działania białka MCPIP1 i udział w utrzymaniu homeostazy, jego ekspresja jest ściśle kontrolowana zarówno na poziomie transkrypcyjnym jak i translacyjnym. Ekspresja genu ZC3H12A jest szybko indukowana po stymulacji: MCP-1 (w monocytach krwi obwodowej, ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (ang. Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) czy mysich fibroblastach zarodkowych 3T3-L1) (184–186), IL-1β (w makrofagach, linii komórkowej raka wątroby HepG2 oraz liniach komórkowych THP-1 i U937) (169,171,187,188), lipopolisacharydem (w makrofagach) (169,171), TNFα (liniach THP-1 i U937 oraz pierwotnych mysich hepatocytach) (169,171) czy IL-17 (w pierwotnych keratynocytach mysich i ludzkich) (189,190). Dodatkowo, w odpowiedzi na rozpoznanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (and. Pathogen-associated molecular patterns, PAMP) przez receptory TLR (ang. Toll-like receptor), dochodzi do ekspresji MCPIP1 w ludzkich makrofagach pochodzenia monocytarnego (191). Wykazano także, że aktywacja NF-κB, zwiększa ekspresję MCPIP1 pod wpływem stymulacji IL-1β. Podobnie czynniki Elk-1 (ang. ETS domain-containing protein 1) i SRF (ang. Serum response factor), biorą udział w indukcji MCPIP1 po stymulacji LPS i IL-1β (192). Co ciekawe, sam transkrypt MCPIP1 tworzy pętlę w rejonie 3’UTR której obecność powoduje, że staje się substratem dla własnego białka. W efekcie dochodzi do sprzężenia zwrotnego i negatywnej regulacji poziomu MCPIP1 (169). Dodatkowe badania pokazały, że poziom transkryptu MCPIP1 jest także regulowany przez miR-9 w komórkach mikrogleju i ludzkich chondrocytach (193,194). Na poziomie potranslacyjnym, regulacja poziomu białka MCPIP1 polega na jego fosforylacji i degradacji proteasomalnej. Wykazano, że pod wpływem stymulacji IL-1β następuje aktywacja kinazy inhibitora NF-κB (IKK), która z kolei powoduje fosforylację MCPIP1 w pozycji S435 i 439, ubikwitynację i w efekcie degradację przez proteasom (195). Nieco inny mechanizm degradacji MCPIP1 przedstawiono w limfocytach T, gdzie aktywacja receptorów TCR prowadzi do cięcia białka MCPIP1 w pozycji R111 pomiędzy domenami NTD i PIN, przez parakaspazę MALT-1 (ang. Mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1) (196). 4.4.4 MCPIP1 jako negatywny regulator stanu zapalnego i strażnik homeostazy Białko MCPIP1 jest uważane przede wszystkim za negatywny regulator stanu zapalnego ze względu na jego aktywność RNazy wobec transkryptów cytokin prozapalnych. Jego wysoką ekspresję obserwować można przede wszystkim w komórkach układu odpornościowego takich jak makrofagi, gdzie degraduje mRNA takich cytokin jak IL-6 i IL-12b (po indukcji receptorów TLR), a także transkryptów zaangażowanych w aktywację limfocytów T i TREG, takich jak c-Rel, Icos, Ox40 i IL-2 (168,196). Co więcej, wykazano, że MCPIP1 hamuje ekspresję IL-6, IκBNS i IκBζ zaangażowanych w proces różnicowania limfocytów Th17 (180,197). Kolejne badania wskazały na rolę MCPIP1 w negatywnej regulacji szlaku IL-17, który bierze udział w odpowiedzi na infekcje grzybiczne oraz chorobach autoimmunologicznych w tym w łuszczycy, poprzez degradację mRNA receptorów IL-17Ra i IL-17Rc (190). Z kolei badania naszej grupy przedstawiają rolę białka MCPIP1 w regulowaniu stanu zapalnego indukowanego promieniowaniem UVB (198). Dalsze wyniki potwierdziły, że podwyższenie poziomu MCPIP1 w ludzkich keratynocytach powoduje obniżenie stanu zapalnego w skórze działając na ścieżkę IL-36/IL-36R (199). Myszy charakteryzujące się brakiem ZC3H12A w naskórku rozwijały różnego rodzaju choroby skórne i trudno gojące się rany (200). Jak ważna jest rola białka MCPIP1 w procesach zapalnych obrazują badania z udziałem myszy pozbawionych genu ZC3H12A w całym organizmie, które rozwijają ogólnoustrojowe zapalenie, splenomegalię, podwyższoną produkcję cytokin i upośledzenie narządów limfoidalnych co w konsekwencji prowadziło do przedwczesnej śmierci do 12 tygodnia życia (201). Badania in vivo z udziałem zwierząt z delecją MCPIP1 w limfocytach T prowadziło do aktywacji zarówno komórek T jak i B oraz indukcji choroby autoimmunologicznej (196). Co ciekawe, MCPIP1 negatywnie reguluje ścieżkę sygnałową NF-κB, zaangażowaną w indukcję genów odpowiedzi zapalnej, na zasadzie sprzężenia zwrotnego (176). Podobne obserwacje poczyniono po stymulacji LPS i TNFα, gdzie MCPIP1 hamował aktywację NF-κB i AP-1, przez co pośrednio wpływał na szereg procesów komórkowych takich jak proliferacja czy różnicowanie (176,178). Oprócz regulacji procesów zapalnych, białko MCPIP1 jest również zaangażowane w procesy fizjologiczne takie jak adipogeneza, angiogeneza czy różnicowanie. Badania prowadzone na linii 3T3-L1 sugerują, że nadekspresja MCPIP1 zaburza adipogenezę przez degradację transkryptu c/EBPβ i obniżenie PPARγ, które niezbędne są podczas różnicowania pre-adipocytów do dojrzałych adipocytów (202,203). Z kolei inna grupa, przedstawiła przeciwstawne wyniki, gdzie wysoki poziom MCPIP1, aktywuje czynniki transkrypcyjne c/EBPα, c/EBPβ i c/EBPδ (184). Szereg prac naukowych pokazuje rolę białka MCPIP1 w różnicowaniu wielu typów komórek. Podczas biogenezy osteoklastów wykazano, że stymulacja MCP-1 ludzkich monocytów szpiku kostnego powodowała różnicowanie do prekursorów osteoklastów za pośrednictwem MCPIP1 (204). Delecja MCPIP1 w keratynocytach powodowała utratę kontroli nad ich proliferacją i różnicowaniem co rozwijało lokalny stan zapalny i choroby skóry (200). Inne badania pokazały, że mysie MSC posiadające nadekspresję MCPIP1 posiadały wyższy poziom transkryptów Nkx2.5, Gata-4, Myl-2 i Myh6 w porównaniu z kontrolą i rozpoczynały różnicowanie kardiomiogenne (205). Dodatkowo, białko MCPIP1 indukowało różnicowanie ludzkich monocytów w komórki o fenotypie endotelialnym promując w ten sposób angiogenezę (185). Pierwsze doniesienia dotyczące udziału MCPIP1 w angiogenezie pojawiły się w 2008 roku, gdzie wykazano, że indukcja MCPIP1 w komórkach HUVEC za pomocą MCP-1 powodowała formowanie struktur przypominających kapilary. Przejściowe wyciszenie MCPIP1, przy pomocy specyficznych siRNA, hamowało ekspresję genów zaangażowanych w angiogenezę: VEGF i HIF1α (206). Dalsze badania tego samego zespołu potwierdziły rolę MCPIP1 w indukcji angiogenezy, pokazując mechanizm bazujący na rozpoznawaniu przez MCPIP1 dwóch miRNA zaangażowanych w hamowanie angiogenezy: miR20b oraz miR34a, które tłumią translację odpowiednio HIF1α i SIRT-1 (ang. Silent information regulator) (207). Wykorzystane w badaniach komórki HUVEC z mutacją D141N nie były w stanie tworzyć tubularnych struktur, a poziom obu miRNA nie ulegał zmianie co wskazało, na istotną rolę aktywności RNazy MCPIP1 w kontroli angiogenezy (207). Kolejne doniesienia wykazały, że mezenchymalne komórki macierzyste (ang. Mesenchymal stem cells MSC) pochodzące z mysiego szpiku kostnego transdukowane wektorem retrowirusowym z nadekspresją MCPIP1 zaczynały różnicować w komórki endotelialne, tworzące struktury kapilarne z dużą ilością rozgałęzień. Dodatkowo, podwyższony poziom MCPIP1 korelował z wyższym poziomem markerów związanych z angiogenezą, w tym vWF, Tie-2 czy VE-kadheryną (205). Co ciekawe, ze względu na swoją aktywność enzymatyczną względem transkryptu IL-8, można zasugerować, że MCPIP1 negatywnie kontroluje rozwój unaczynienia (182). 4.4.5 Rola białka MCPIP1 w rozwoju nowotworu Kontrola odpowiedzi immunologicznej, proliferacji komórkowej i różnicowania sprawiła, że białko MCPIP1 stało się obiektem wielu badań dotyczących rozwoju nowotworów. Po raz pierwszy rolę MCPIP1 w raku piersi przedstawiono w 2015 roku, gdzie MCPIP1 stabilizował poziom białka RGS2 (ang. Regulator of G protein signaling 2), którego poziom był zdecydowanie niższy w tkance nowotworowej i linii MCF7 w porównaniu z tkanką prawidłową i normalną linią komórek piersi MCF10A (208). Rok później wykazano niższy poziom MCPIP1 w tkankach nowotworowych w porównaniu ze zdrowymi, który silnie korelował z niską przeżywalnością i gorszymi rokowaniami pacjentek z rakiem piersi (181). Indukowana doksycykliną nadekspresja MCPIP1 w komórkach raka piersi MDA-MB-231 i 4T12 zwiększała apoptozę komórek, gdzie obserwowano wzrost ekspresji kaspazy 3 oraz PARP1, a także obniżało ilość przerzutów w badaniach in vivo w porównaniu z kontrolą. Dodatkowo, MCPIP1 negatywnie regulował szereg antyapoptotycznych genów Bcl2L1, Bcl2A1, Birc3, RelB i Bcl3. Z kolei obniżenie poziomu białka MCPIP1 promowało proliferację komórek nowotworowych (181). Podobne wyniki otrzymano w badaniach nad neuroblastomą, gdzie linie komórkowe ludzkiej neuroblastomy charakteryzowały się znikomym poziomem zarówno transkryptu jak i białka MCPIP1 (209,210). Stabilna nadekspresja MCPIP1 w linii BE(2)-C powodowała znaczący spadek ekspresji MYCN wraz z potencjałem proliferacyjnym oraz żywotnością (210). W komórkach raka trzustki, białko MCPIP1 obniżało poziom miR-200, które jest zaangażowane w regulację EMT (211). Wyniki naszej grupy wskazały podobnie jak w przypadku raka piersi czy neuroblastomy, że poziom MCPIP1 znacząco spada w tkance nowotworowej w porównaniu z otaczającą zdrową u pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki (212). Doświadczenia przeprowadzone na linii komórkowej Caki-1 pokazały, że ekspresja MCPIP1 zależy od aktywności proteasomu oraz hipoksji. Co ciekawe, białko MCPIP1 negatywnie regulowało poziom HIF1α oraz HIF2α, a jego nadekspresja powodowała obniżenie transkryptów VEGFA, GLUT1 oraz IL-6 przez co pośrednio kontrolowało rozwój i angiogenezę ccRCC (212). Sekwencjonowanie nowej generacji komórek Caki-1 z nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy MCPIP1 ujawniło zmiany w wielu procesach w tym w cyklu komórkowym, replikacji i naprawie DNA (213). Walidacja wyników RNAseq wykazała, że nadekspresja dzikiej formy białka MCPIP1 powodowała wzrost poziomu białka p21 zaangażowanego w kontrolę cyklu komórkowego oraz spadek genów zaangażowanych w angiogenezę w tym VEGFA, AGR2 czy MMP2 (213). Najnowsza analiza mikromacierzy próbek od pacjentów z ccRCC wykazała spadek genów supresorowych PTEN, RECK i TIMP3 wraz z progresją nowotworu (214). Nadekspresja MCPIP1 w komórkach Caki-1 i Caki-2 powodowała wzrost ich transkryptów in vitro oraz in vivo. Co ciekawe, zaobserwowano, że wysoki poziom MCPIP1 powoduje spadek ekspresji MMP2, MMP9, które dodatkowo są negatywnie regulowane przez TIMP3 i RECK (214). Powyższe prace sugerują, że białko MCPIP1 może regulować rozwój nowotworów na wielu poziomach, z jednej strony promując ekspresję genów supresorowych i proapoptotycznych, z drugiej degradując transkrypty czynników zaangażowanych w proliferację, angiogenezę. 5 Cel pracy doktorskiej Jasnokomórkowy rak nerki jest najczęściej występującym typem wśród nowotworów nerek, opornym na stosowane inhibitory angiogenezy takie jak sunitinib czy sorafenib. Nowotwór ten tworzy silnie ukrwione guzy, a w chwili diagnozy, przerzuty stwierdza się już u 30% pacjentów. Istotną rolę w procesie rozwoju jasnokomórkowego raka nerki oprócz angiogenezy, odgrywają procesy zapalne. Białko MCPIP1 jest istotnym regulatorem stanu zapalnego, odpowiedzialnym za utrzymanie homeostazy, a poprzez swoje właściwości proapoptotyczne jest uważane za potencjalne białko supresorowe, które może w przyszłości stanowić istotny element terapii. Głównym celem niniejszej pracy doktorskiej było wyjaśnienie znaczenia białka MCPIP1 w progresji i rozwoju jasnokomórkowego raka nerki. Szczegółowe zadania badawcze obejmowały: • Zbadanie czy istnieje związek między poziomem bądź aktywnością białka MCPIP1, a proliferacją komórek nowotworowych in vitro oraz in vivo • Wyjaśnienie wpływu białka MCPIP1 na poziom wydzielanych czynników proangiogennych, zachowanie komórek endotelialnych i proces angiogenezy in vivo • Analizę próbek od pacjentów w różnych stadiach zaawansowania klinicznego jasnokomórkowego raka nerki pod kątem zmian w poziomie białka MCPIP1 i jego korelacja z poziomem receptora c-Met • Zbadanie mechanizmu odpowiedzialnego za nabywanie oporności na stosowane w terapii jasnokomórkowego raka nerki leki: sunitinib i sorafenib oraz ocena roli białka MCPIP1 w tym procesie 6 Materiały i metody 6.1 Materiały 6.1.1 Materiał ludzki Tkanka nowotworowa wykorzystana w badaniach, została pobrana od pacjentów ze zdiagnozowanym jasnokomórkowym rakiem nerki w Centrum Onkologii im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Krakowie. Badanie zostało zatwierdzone przez Lokalną Komisję Bioetyczną (nr zgody 68/KBL/OIL/2011), a od pacjentów uzyskano pisemne zgody na wykorzystanie materiału. Wszystkie próbki zostały poddane histologicznej ocenie przez lekarzy patologów oraz sklasyfikowane wg wytycznych Światowej Organizacji Zdrowia, a następnie podzielone na cztery grupy (I-IV) w skali Fuhrman. Każda próbka została podzielona i zamrożona w ciekłym azocie, a następnie przechowywana w -80 ᵒC do czasu izolacji białka, lub inkubowana przez noc w RNA-later w 4 ᵒC i przeniesiona do -80 ᵒC do czasu izolacji RNA. 6.1.2 Materiał zwierzęcy Wszystkie doświadczenia z użyciem zwierząt laboratoryjnych były prowadzone zgodnie ze standardami krajowymi i europejskimi, za zgodą II Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach w Krakowie (zgoda nr 20/2017 oraz 21/2017) oraz Lokalnej Komisji Etycznej przy Collegium Medicum UJ (zgoda nr 117/2014). Do doświadczeń wykorzystano immunokompetentne myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu (Envigo) oraz NOD-SCID (Charles River Laboratories). Myszy były przechowywane w klatkach w standardzie SPF, z dostępem do wody i pożywienia ad libitum. W rozdziale „Wyniki” opisano do jakiego doświadczenia i dlaczego został wykorzystany konkretny szczep myszy 6.1.3 Materiał biologiczny W badaniach wykorzystano linie komórkowe ludzkiego jasnokomórkowego raka nerki: pochodzące z przerzutu Caki-1 (ATCC; 2011) oraz pochodzące z guza pierwotnego Caki-2 (Sigma; 2015). Do badań nad angiogenezą wykorzystano komórki HMEC-1 (Human Microvascular Endothelial Cells, ATCC; 2016) oraz komórki HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, otrzymane z Zakładu Transplantologii Collegium Medicum UJ). 6.1.4 Odczynniki Tabela 1. Zestawienie odczynników wykorzystanych w trakcie doświadczeń. Odczynnik Producent Pożywka hodowlana McCoy 5A Lonza Pożywka hodowlana Eagle minimal essential medium (EMEM) Lonza Zmodyfikowana pożywka Eagle’a (DMEM) z wysoką zawartością glukozy Lonza Pożywka hodowlana MCDB 131 Lonza Pożywka hodowlana Endothelial Basal Medium (EBM-2) Lonza EGM-2 MV SingleQuots (suplementy do pożywki EBM-2) Lonza Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Bioshop Płodowa surowica bydlęca (FBS) Sigma Aldrich Surowica kozia Sigma Aldrich Trypsyna Lonza Penicylina i Streptomycyna Lonza Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (PBS) Lonza Puromycyna InvivoGen Doksycyklina Bioshop Woda wolna od RNaz i DNaz Sigma Aldrich L-glutamina Lonza Epidermalny czynnik wzrostu (EGF) Sigma Aldrich Hydrokortyzon Sigma Aldrich Hydroksymocznik Sigma Aldrich Kulki lateksowe Sigma Aldrich Fibrynogen Sigma Aldrich Trombina Sigma Aldrich ludzka IL8 DuoSet ELISA R&D Systems ludzki VEGF DuoSet ELISA R&D Systems ludzka IL6 DuoSet ELISA R&D Systems ludzki SDF-1 DuoSet ELISA R&D Systems Proteom Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit (Macierze do analizy fosforylowanych kinaz białkowych) R&D Systems 10% obojętna zbuforowana formalina Chempur Alkohol etylowy POCH Alkohol metylowy POCH Formaldechyd Chempur Hoechst 33258 Thermo Fischer Medium do zatapiania wodnych preparatów (Glycerol Mounting Medium) Dako Medium do zatapiania preparatów fluorescencyjnych (Fluorescent Mounting Medium) Dako Medium do zatapiania preparatów fluorescencyjnych z DAPI (Gold antifade reagent) Invitrogen Medium do zamrażania preparatów tkankowych (O.C.T.) Tissue-Tek Zestaw do izolacji i oczyszczania RNA (Eurx Universal RNA Purification Kit EURx Zestaw do analizy mikromacierzy (Affymetrix Gene-Chip WT PLUS Reagent Kit) Affymetrix Izofluran Baxter Fenozol A&A Biotechnology Master mix SYBR Green qPCR A&A Biotechnology Odwrotna transkryptaza M-MLV Promega Oligo(dT) 15 primer Promega Taq PCR Master Mix EURx Mammalian Protein Extraction Reagent (M-PER) Thermo Fischer Bufor do lizy Protein Lysis buffer 6 R&D Systems Jet Prime transfection reagent Polyplus Transfection Membrana PVDF Merck Millipore Tween 20 Sigma Aldrich Immobilon Western HRP substrate Merck Millipore Roztwór MTT Sigma Aldrich Chlorowodór (HCl) POCH Izopropanol Chempur Matrigel BD Biosciences Kalceina AM Sigma Aldrich Bufor do lizy czerwonych krwinek High-Yield Lyse Fixative-Free Lysing Solution Life Technologies Triton X-100 Sigma Aldrich SU11274 Selleckchem Sunitinib LC Laboratories Sorafenib LC Laboratories U0126 Sigma Aldrich Ly294002 Sigma Aldrich Chlorek litu LiCl Sigma Aldrich Dimetylosulfotlenek (DMSO) BioShop Akutaza Sigma Aldrich Jodek propidyny Life Technologies RNaza A Sigma Aldrich Zestaw do barwienia SA β-gal Cell Signaling Sondy do ludzkiego i mysiego GAPDH Life Technologies siRNA 1-6, siRNA Negative low, med GC Invitrogen 6.1.5 Przeciwciała Tabela 2. Wykaz przeciwciał wykorzystanych do doświadczeń. Przeciwciało Rozcieńczenie Producent Nr Mysie α-tubulina 1:1000 (WB) Calbiochem CP06 Królicze GAPDH 1:1000 (WB) Cell Signaling 5174 Mysie β-aktyna 1:1000 (WB) Sigma 1978 Królicze MCPIP1 1:1000 (WB) GeneTex gtx110807 Królicze Src 1:1000 (WB) Cell Signaling 2123T Królicze p-Src (Y416) 1:1000 (WB) Cell Signaling 2101S Mysie β-katenina 1:1000 (WB) 1:100 (IF) BD Biosciences 610154 Królicze e-kadheryna 1:1000 (WB) 1:100 (IF) Abcam ab40772 Królicze c-Met 1:1000 (WB) 1:100 (IF) Santa Cruz Biotechnology sc-10 Królicze p-c-Met (Y1234/1235) 1:1000 (WB) Cell Signaling 3077S Królicze STAT3 1:1000 (WB) Cell Signaling 4904S Mysie p-STAT3 (Y705) 1:1000 (WB) Cell Signaling 4113S Królicze IKKβ 1:1000 (WB) GeneTex gtx634834 Królicze p-IKKα/β (S176/S180) 1:1000 (WB) Cell Signaling 2078T Królicze Fibronektyna 1:1000 (WB) Abcam ab23750 Królicze GSK3β 1:1000 (WB) GeneTex gtx133372 Królicze GSK3β (S9) 1:1000 (WB) Cell Signaling 9336S Królicze VE-kadheryna 1:1000 (WB) 1:100 (IF) Abcam ab33168 Królicze p-VE-kadheryna (Y685) 1:1000 (WB) Abcam ab119785 Królicze Akt 1:1000 (WB) Cell Signaling 4685S Królicze p-Akt (S473) 1:1000 (WB) Cell Signaling 4685S Królicze wimentyna 1:1000 (WB) Cell Signaling 3932 Królicze CEBPβ 1:1000 (WB) Cell Signaling 90081 Szczurze CD31 1:50 (IF) BD Pharmingen 4234535 Kozie anty-mysie Alexa Fluor 488 1:1000 (IF) Invitrogen A11001 Kozie anty-królicze Alexa Fluor 594 1:1000 (IF) Invitrogen A11007 Kozie anty-szczurze Alexa Fluor 546 1:1000 (IF) Invitrogen A11035 Kozie anty-królicze Alexa Fluor 647 1:1000 (IF) Invitrogen A21241 Kozie anty-królicze IgG-HRP 1:4000 Santa Cruz Biotechnology Sc-2004 Kozie anty-mysie IgG-HRP 1:4000 Santa Cruz Biotechnology Sc-2005 Szczurze IgG2α κ Kontrola izotypowa 1:50 BD Pharmingen 4234535 Falloidyna (rodamina) 1:100 (IF) Abcam Ab235138 6.1.6 Startery Tabela 3. Wykaz ludzkich starterów wykorzystanych do doświadczeń Gen Sekwencja Temperatura Długość ZC3H12A F 5’ GGAAGCAGCCGTGTCCCTATG 3’ R 5’ TCCAGGCTGCACTGCTCACTC 3’ 62 °C 226 MET F 5’ CATCTCAGAACGGTTCATGCC 3’ R 5’ TGCACAATCAGGCTACTGGG 3’ 62 °C 193 EF2 F 5’ GACATCACCAAGGGTGTGCAG 3’ R 5’ TTCAGCACACTGGCATAGAGGC 3’ 62 °C 215 SDF-1 F 5’ CGAAAGCCATGTTGCCAGAG 3’ R 5’ CTTCGGGTCAATGCACACTTG 3’ 62 °C 121 CXCR4 F 5’ TGCTTGCTGAATTGGAAGTG 3’ R 5’ GGTAACCCATGACCAGGATG 3’ 62 °C 229 IL-8 F 5’ ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT 3’ R 5’ TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC 3’ 62 °C 292 VEGF F 5’ AGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTC 3’ R 5’GCCTCGGCTTGTCACATCTGCAA 3’ 62 °C 155 IL-6 F 5’ GGTACATCCTCGACGGCATCT 3’ R 5’ GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC 3’ 62 °C 81 Snail F 5’ GCACATCCGAAGCCACAC 3’ R 5’ GGAGAAGGTCCGAGCACA 3’ 62 °C 226 ZEB2 F 5’ CGGTGCAAGAGGCGCAAACA 3’ R 5’ GGAGGACTCATGGTTGGGCA 3’ 62 °C 183 CEBPβ F 5’ AGCGACGAGTACAAGATCCG 3’ R 5’ GCTGCTCCACCTTCTTCTGC 3’ 62 °C 148 6.2 Metody 6.2.1 Hodowle komórkowe Linie komórkowe ludzkiego jasnokomórkowego raka nerki Caki-1 były hodowane w pożywce EMEM, natomiast Caki-2 w pożywce McCoy 5A, obie z dodatkiem 10% FBS. Komórki HMEC-1 były hodowane w pożywce MCDB 131 z dodatkiem 10% FBS, L-glutaminy (2mmol/L), EGF (10ng/ml) oraz hydrokortyzonem (1μg/ml). Komórki HUVEC były hodowane w pożywce EBM-2 z dodatkiem suplementu EGM-2 MV SingleQuots. Wszystkie linie komórkowe były hodowane nie dłużej niż piętnaście kolejnych pasaży i były rutynowo sprawdzane na obecność mykoplazmy co trzy miesiące. Komórki były hodowane do osiągnięcia ok. 80% gęstości, przepłukiwane roztworem PBS z 0,02% EDTA, a następnie zalewane roztworem trypsyny z 0,02% EDTA i inkubowane od 30 sek-3 min w 37 ᵒC. Trypsynę inaktywowano pożywką hodowlaną z dodatkiem 10% FBS, a zawiesinę komórek przenoszono do probówki i wirowano przez 5 minut przy 1200 rpm. Osad komórek zawieszano w 1 ml właściwej pożywki hodowlanej, następnie komórki liczono i wysiewano na poszczególne doświadczenie. Wszystkie linie komórkowe hodowano w temperaturze 37 ᵒC, w atmosferze 5% CO2 i 95% wilgotności. W celu zebrania medium warunkowanego z linii Caki-1 oraz Caki-2 komórki były hodowane przez 48 godzin w warunkach normalnego poziomu tlenu (normoksji - 21% tlenu) bądź głodu tlenowego (hipoksji - 1% tlenu) w pożywce z dodatkiem 0,5% BSA. 6.2.2 Przejściowa transfekcja małym interferującym RNA (siRNA) W celu obniżenia poziomu MCPIP1 sprawdzono sześć różnych siRNA (ang. Small interfering RNA) wraz z odpowiednimi kontrolami (kontrola negatywna ze średnią zawartością GC do si 1, 2, 3, kontrola negatywna z niską zawartością GC do si 4, 5, 6). Komórki Caki-1 wysiewano 24 godziny przed transfekcją na 12-dołkową płytkę w gęstości 60%. Transfekcję przeprowadzano z wykorzystaniem zestawu JetPrime zgodnie z instrukcją producenta. Kolejnego dnia, zmieniano pożywkę hodowlaną. Po kolejnych 48 godzinach analizowano wydajność transfekcji przy pomocy metody western blot. 6.2.3 Stabilna transdukcja za pomocą wektorów wirusowych W celu określenia roli białka MCPIP1 w rozwoju ccRCC, użyto trzech różnych wektorów wirusowych. Aby stabilnie obniżyć poziom białka MCPIP1 wykorzystano wektor lentiwirusowy przeciw sekwencji genu ZC3H12A kodującej białko MCPIP1 (shMCPIP1) wraz z wektorem kontrolnym (shCtrl)(Sigma Aldrich) kodującym jedynie oporność na puromycynę. W celu podwyższenia poziomu białka MCPIP1 zastosowano system TetON zależny od doksycykliny, gdzie pLIX MCPIP1 był wektorem zawierającym enzymatycznie aktywną formę MCPIP1, a pLIX PURO wektorem kontrolnym opornym na puromycynę. W badaniach został także użyty wektor pLIX D141N zawierający enzymatycznie nieaktywny MCPIP1, w którym wprowadzono mutację punktową w domenie RNazowej (168,169). Aby rozpocząć ekspresję MCPIP1 w systemie TetON, do pożywki hodowlanej dodawano 1μg/ml doksycykliny na 48 godzin. Dodatkowo, w celu uzyskania nadekspresji genu ZC3H12A użyto system retrowirusowy, gdzie dla zwiększenia ekspresji użyto wektor pMX MCPIP1, a jako kontroli użyto pusty wektor pMX PURO. Aby uzyskać ekspresję białka zielonej fluorescencji (ang. Green fluorescence protein, GFP), użyto wektora lentiwirusowego, shGFP. Komórki wysiewano na płytkę 6-dołkową w gęstości 50%, po 24 godzinach pożywkę zmieniano na świeżą z dodatkiem polibrenu w stężeniu 6μg/ml w celu ułatwienia wnikania wirusa. Po 15 minutach dodawano odpowiednie wektory wirusowe. Komórki umieszczano w inkubatorze (37ᵒC, 5%CO2, 95% wilgotność), następnie by zwiększyć wydajność transdukcji po 24 godzinach czynność powtarzano. MOI (ang. multiplicity of infection – wielokrotność infekcji) dodawanych na komórki wektorów wirusowych wynosiło 50. Po kolejnych 24 godzinach pożywka z wirusami była zmieniana na świeżą, a po dodatkowych 24 godzinach dodawana była puromycyna (1μg/ml) w celu rozpoczęcia selekcji. 6.2.4 Stymulacja komórek Stymulacja komórek nowotworowych lekami. Inhibitory użyte w doświadczeniach zostały przygotowane w następujący sposób: SU11274, sunitnib, sorafenib oraz Ly294002 użyte w doświadczeniach, zostały rozpuszczone w DMSO, LiCl został rozpuszczony w wodzie. Następnie stężone roztwory zostały rozcieńczone w pożywce hodowlanej w celu stymulacji komórek nowotworowych tak, by końcowe stężenie wynosiło odpowiednio: SU11274 - 2,5μM, sunitnib - 5μM, sorafenib - 2,5μM, Ly294002 – 10μM, a LiCl – 10mM. Jako kontroli użyto DMSO, którego końcowe stężenie w pożywce hodowlanej nie przekraczało 0.1% (v/v). Komórki były traktowane lekami od 24 godzin do 5 tygodni. Pożywka hodowlana była wymieniana na świeżą z dodatkiem leków co 48 godzin. Indukcja fosforylacji IKK za pomocą IL-1β. Do analizy poziomu i fosforylacji kinazy IKK, komórki Caki-1 wysiewano na 6-dołkową płytkę w gęstości 300 000 komórek na dołek. Po 24 godzinach pożywka była zmieniana na EMEM z 0,5% BSA. Następnego dnia, komórki traktowano IL-1β w stężeniu 10 ng/ml w EMEM z 0,5% BSA i inkubowano w 37ᵒC przez 5 min, 15 min, 30 min, 1 godz. i 2 godz. Przygotowanie medium warunkowanego. W celu przygotowania medium warunkowanego, transdukowane komórki Caki-1 lub Caki-2, z różnym poziomem MCPIP1 były wysiewane na płytki 6-dołkowe (Caki-1: 300 000; Caki-2: 200 000 komórek na dołek) we właściwym medium. Po 48 godzinach, gdy osiągnęły pełną gęstość, pożywka była zmieniana na 1 ml pożywki EMEM/MCCoy 5A z dodatkiem 0,5% BSA, po uprzednim przepłukaniu komórek PBS. Komórki były dalej hodowane w warunkach normoksji lub hipoksji i po 24 godzinach pożywka znad komórek była zbierana, odwirowywana 5 minut 300 rpm z resztek komórkowych i przechowywana w -20ᵒC do dalszych analiz. Komórki HMEC-1 oraz HUVEC przed stymulacją medium warunkowanym były wysiewane na płytki 12 lub 24-dołkowe i hodowane do uzyskania pełnej gęstości. Następnie, pożywka hodowlana była zmieniana na nową z dodatkiem 0.5% BSA. Po 24 godzinach pożywka była usuwana, komórki przepłukiwano PBS i zalewano medium warunkowanym, a następnie inkubowano 3 godziny w inkubatorze (37ᵒC, 5%CO2, 95% wilgotność). Po tym czasie przeprowadzano barwienia immunofluorescencyjne lub izolowano białko do dalszych analiz. 6.2.5 Analiza mikromacierzy Analiza mikromacierzy została przeprowadzona z użyciem mikromacierzy Affymetrix HuGene ST 2.1 na próbkach pobranych od pacjentów z ccRCC. Próbki zostały podzielone na 4 grupy zgodnie ze skalą Fuhrman. Całkowite RNA zostało wyizolowane za pomocą zestawu Eurx Universal Purification Kit, zgodnie z protokołem producenta. Jakość wyizolowanego RNA została następnie sprawdzona za pomocą elektroforezy na 1% żelu denaturującym. Stężenie RNA zostało zmierzone przy pomocy spektrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Fischer Scientific). Do dalszej syntezy i amplifikacji ss-CDNA wykorzystano 100ng całkowitego RNA. Następnie wykonano fragmentację i znakowanie biotyną wg zaleceń producenta. 10μg otrzymanego cRNA zostało poddane 16 godzinnej hybrydyzacji w 48ᵒC w Affymetrix HuGene2.1 ST Array Strip, następnie przepłukane i barwione w Affymetrix Gene Atlas Fluidics Station. Każda macierz została przeskanowana przez GeneAtlas Imaging Station. Otrzymane wyniki zostały znormalizowane przy użyciu oprogramowania Expression Console Software 1.4.1 (z użyciem algorytmu RMA), a następnie analizowane przy pomocy oprogramowania Affymetrix Transcriptome Analysis Console (TAC) 3.1. Do analizy statystycznej została wykorzystana jednokierunkowa ANOVA (niesparowana). Dodatkowo, surowe dane zostały umieszczone w bazie danych Gene Expression Omnibus (GEO) z numerem dostępu GSE89563. 6.2.6 Izolacja i analiza poziomu białek metodą western blot Hodowane komórki zostały przepłukane zimnym roztworem PBS, zalane buforem M-PER (z dodatkiem inhibitorów proteaz i fosfataz) lub Lysis Buffer 6 i przeniesione do probówek typu eppendorf. Po 10 minutowej inkubacji na lodzie, lizaty zostały zwirowane przez 20 min, 11 000 g, 4ᵒC a otrzymany nadsącz przeniesiono do nowych probówek. W przypadku tkanek, zamrożony fragment był zawieszany w 400μl buforu M-PER i poddawany homogenizacji przy użyciu ręcznego homogenizatora (Miccra D1). Resztki komórkowe były odwirowywane (11 000 g, 4ᵒC), a nadsącz przenoszono do nowych probówek. Analizę stężenia całkowitego białka przeprowadzono za pomocą metody BCA (kwas bicynchoninowy i siarczan miedzi). Na podstawie otrzymanego wyniku na 10% żel poliakrylamidowy nakładano, w zależności od doświadczenia, równo między 20 a 40 μg białka zmieszanego z buforem obciążającym (0,375 M Tris-HCl, pH 6,8, 12% SDS, 60 % glicerolu 0,6 M DTT, 0,06% błękitu bromofenolowego) i prowadzono elektroforezę SDS-PAGE przez 1,5 godziny. Transfer białek z żelu na membranę PVDF przeprowadzano przy pomocy aparatu do mokrego transferu (Bio-Rad). Membranę blokowano przez godzinę w temperaturze pokojowej w odpowiednim buforze (3% BSA lub 5% odtłuszczone mleko w TBS z 0,1% Tween-20), następnie membrany inkubowano w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych w buforze do blokowania, przez noc w temperaturze 4ᵒC na kołysce laboratoryjnej (Tabela 2). Kolejnego dnia membrany przepłukiwano 3 x 10min w buforze TBS z dodatkiem 0,1% Tween-20. Po tym czasie membrany inkubowano w roztworze odpowiednich drugorzędowych przeciwciał HRP (Tabela 2) rozpuszczonych w buforze do blokowania. Niezwiązane przeciwciała odpłukiwano 3 x 10min w buforze TBS+0,1% Tween-20. Detekcja sygnału była przeprowadzana po 5 minutowej inkubacji z substratem Immobilon Western HRP przy pomocy systemu ChemiDoc (Bio-Rad). Analizę densytometryczną przeprowadzno z użyciem oprogramowania ImageLab. Lista przeciwciał i rozcieńczeń została przedstawiona w Tabeli 2. Analiza densytometryczna była przeprowadzana poprzez przyrównanie wartości densytometrycznej danego prążka do odpowiadającej mu kontroli ilościowej według wzoru Wśr = Wbadane / Wkontrola, gdzie Wśr to średnia wartość densytometryczna, Wbadane wartość densytometryczna badanego białka, a Wkontrola wartość densytometryczna odpowiedniej kontroli. W przypadku białek fosforylowanych, najpierw wartość densytometryczna formy fosforylowanej jak i całkowitej zostały przyrównane do odpowiedniej kontroli ilościowej, a następnie uzyskane średnie wartości densytometryczne formy fosforylowanej do formy całkowitej według wzoru: Wśr = (Wfosforylowane/Wkontrola) / (Wcałkowite/Wkontrola). 6.2.7 Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym Całkowite RNA z linii komórkowych było izolowane przy pomocy zestawu Eurx Universal Purification Kit zgodnie z protokołem producenta. RNA z tkanek zwierzęcych izolowano przy pomocy zmodyfikowanej metody Chomczyńskiego używając odczynnika Fenozol. Czystość i stężenie całkowitego RNA mierzono za pomocą spektrofotometru NanoDrop 1000, natomiast jakość i ewentualne zanieczyszczenie DNA sprawdzano poprzez elektroforezę w 1% żelu denaturującym. Do reakcji odwrotnej transkrypcji używano 1μg całkowitego RNA, 0,25μg oligo(dT) i odwrotnej transkryptazy M-MLV. Uzyskane cDNA 5-krotnie rozcieńczano wodą przed użyciem do reakcji PCR w czasie rzeczywistym, którą prowadzono z użyciem odczynnika SybrGreen Master Mix i urządzenia Quant Studio 3 (Applied Biosystems) lub Eco (Illumina). Etapy reakcji i temperatury zostały podane poniżej. Tabela 4. Warunki reakcji PCR w czasie rzeczywistym Etap Temperatura Czas Il. cykli Wstępna denaturacja 95ᵒC 5 minut 1 Denaturacja 95ᵒC 20 sekund 40 Przyłączanie starterów 62ᵒC 20 sekund Synteza produktu 72ᵒC 25 sekund Końcowe wydłużanie 72ᵒC 10 minut 1 Ekspresja genów została znormalizowana do genu referencyjnego EF2 (ang. Elongation factor-2), a każdą próbkę analizowano w duplikacie. Aby określić specyficzność powstałego produktu wykreślono krzywą topnienia, charakterystyczną dla danego zestawu starterów. Względną ekspresję (gen badany/gen referencyjny) obliczono na podstawie wzoru: ΔΔCT=2-ΔCT. Sekwencję starterów i ich temperatury przyłączania zostały przedstawione w Tabeli 3. W celu oceny ilości przerzutów do płuc izolowanych z myszy, użyto specyficznych sond dla ludzkiego i mysiego GAPDH oraz Taq PCR Master Mix. Poszczególne etapy reakcji i temperatury zostały podane w Tabeli 5. Ekspresję ludzkiego GAPDH znormalizowano do genu referencyjnego mysiego GAPDH. Względną ekspresję (gen badany/gen referencyjny) obliczono na podstawie wzoru: ΔΔCT=2-ΔCT. Etapy reakcji i temperatury zostały podane poniżej. Tabela 5. Warunki reakcji PCR w czasie rzeczywistym z użyciem sond. Etap Temperatura Czas Il. cykli Wstępna denaturacja 95ᵒC 3 minut 1 Denaturacja 95ᵒC 30 sekund 50 Przyłączanie starterów 95ᵒC 30 sekund Synteza produktu 95ᵒC 60 sekund 6.2.8 Test redukcji MTT Pomiar aktywności mitochondrialnych dehydrogenaz wykorzystano w celu oceny żywotności komórek zarówno po zmianie ilości białka MCPIP1 jak i po zastosowaniu inhibitorów angiogenezy. Komórki ccRCC wysiewano w ilości 3 000 (Caki-2) lub 5 000 (Caki-1) na płytkę 96-dołkową w 100μl pożywki hodowlanej. Następnie, dodawano 0,5 mg/ml roztworu MTT (sól tetrazolowa) w pożywce, na 2 godziny, po ukazaniu się kryształków formazanu reakcję zatrzymywano przez dodanie 5mmol/L HCl w izopropanolu i wytrząsano płytkę przez 30 min. Absorbancja była mierzona przy użyciu czytnika mikropłytek Tecan Spectra Fluor Plus (Tecan Group) przy długości fali 570 nm wraz z referencją o długości 500 nm. Pomiary były wykonywane 24, 48, 72, 96 godzin po wysianiu, lub 1, 2, 4 oraz 7 dni po pierwszej stymulacji inhibitorami. Doświadczenie zostało powtórzone trzy razy w tryplikacie. 6.2.9 Test proliferacji Linie komórkowe Caki-1 oraz Caki-2 z różnym poziomem białka MCPIP1 były wysiewane w ilości 20 000 komórek na dołek, na płytki 24-dołkowe. Po 24, 48, 72 i 96 godzinach od wysiania, komórki były trypsynizowane i liczone w komorze Burkera. Doświadczenie zostało powtórzone trzy razy w tryplikacie. Wynik został przedstawiony jako ilość komórek w 1ml pożywki. 6.2.10 Test migracji – zarastanie rany Komórki ccRCC zostały wysiane na płytkę 24-dołkową i hodowane do osiągnięcia pełnej gęstości. Tuż przed rozpoczęciem doświadczenia do pożywki hodowlanej został dodany 10 mmol/L hydroksymocznik, w celu zahamowania proliferacji. Rana została zrobiona przy pomocy małej końcówki do pipety. Następnie, płytkę przeniesiono do komory inkubacyjnej (37ᵒC, 5%CO2) znajdującej się w obrębie mikroskopu. Zdjęcia każdego dołka były wykonywane co 10 minut przez 16 godzin, w powiększeniu 10x, przy pomocy mikroskopu odwróconego Leica DMI6000B wyposażonego w cyfrową kamerę CCD Leica DFC360 FX (Leica Microsystems). Zdjęcia były analizowane przy pomocy oprogramowania Leica LAS X oraz Hiro v. 1.0.0.4. 6.2.11 Test tworzenia się rozgałęzień w hodowli komórek endotelialnych W celu oceny wpływu obecności i poziomu białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych na rozwój unaczynienia in vitro, analizowano zachowanie komórek endotelialnych HMEC-1 wysianych na warstwę Matrigelu. Płytki 96-dołkowe były pokrywane Matrigelem w ilości 50 μl bez dodatku czynników wzrostu i inkubowane przez 30 minut w 37ᵒC aby zestalić Matrigel. Na warstwę Matrigelu wysiewano 10 000 komórek HMEC-1 w 200μl medium warunkowanym z komórek Caki-1 shCtrl lub shMCPIP1. Komórki inkubowano przez 4 godziny w 37ᵒC i 5%CO2, 95% wilgotności. Następnie, komórki wybarwiano barwnikiem przyżyciowym Kalceina AM (1μmol/L). Zdjęcia poszczególnych dołków wykonywano przy pomocy odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego Olympus IX50 (Olympus) z użyciem suchego obiektywu 4x. Rozwój sieci unaczynienia i tworzenie punktów rozgałęzień analizowano przy pomocy oprogramowania ImageJ i dodatku Angiogenesis Analyzer (Carpentier G., Angiogenesis Analyzer for ImageJ; dostępnych online: http://imagej.nih.gov/ij/macros/toolstes/Angiogenesis%20Analyzer.txt). 6.2.12 Test fibrynowy Test fibrynowy został zaprojektowany do badań nad angiogenezą in vitro i polega na współhodowli komórek endotelialnych wysianych na kulki lateksowe, w macierzy trójwymiarowej z komórkami nowotworowymi Caki-1. Kulki lateksowe, po przygotowaniu wg zaleceń producenta, aktywowano przepłukując ciepłą pożywką hodowlaną. Linię komórkową HMEC-1 trypsynizowano, następnie wirowano (5 minut, 1200 rpm), osad zawieszano w pożywce i komórki liczono w komorze Burkera. Odpowiednią ilość komórek mieszano z zawiesiną kulek lateksowych tak aby na jedną kulkę przypadało 400 komórek endotelialnych. Taką mieszaninę inkubowano 6 godzin w inkubatorze (37ᵒC, 5%CO2, 95% wilgotności), mieszając ją co 20 minut tak, by zapewnić odpowiednie pokrycie kulek komórkami. Po tym czasie, zawiesinę przeniesiono do butelki hodowlanej T-25cm2 i zostawiono na noc w inkubatorze, by komórki niezwiązane z kulkami przyczepiły się do dna naczynia. Poprzez rozpuszczenie fibrynogenu (2mg/ml) w pożywce hodowlanej z dodatkiem 0,5% BSA przygotowywano żel fibrynowy. Do roztworu fibrynogenu, dodawano przepłukaną zawiesinę kulek lateksowych opłaszczonych komórkami endotelialnymi. Na płytkę 24-dołkową dodano po 0,625U/ml roztworu trombiny a następnie mieszaninę fibrynogenu z kulkami. Całość wymieszano kilkukrotnie przez pipetowanie tak, by nie utworzyć bąbelków. Aby przyspieszyć polimeryzację, płytkę umieszczono na 20 minut w inkubatorze. W tym czasie przygotowywano komórki Caki-1 kontrolne (shCtrl) oraz komórki z obniżonym poziomem białka MCPIP1 (shMCPIP1). Komórki te wysiewano następnie na górę spolimeryzowanego żelu w ilości 30 000 komórek na dołek w medium zawierającym 0,5% BSA. Komórki hodowano w inkubatorze i zmieniano medium co 48 godzin. Aby ocenić stopień migracji komórek endotelialnych w żelu fibrynowym i tworzenie tubularnych struktur, przez sześć dni robiono zdjęcia przy pomocy mikroskopu Nikon Eclipse Ti-S (Nikon) z użyciem suchego obiektywu 10x. Do analizy migracji i mierzenia powierzchni zajmowanej przez komórki HMEC-1 użyto oprogramowania ImageJ (NIH, Bethseda). 6.2.13 Test immunoenzymatyczny ELISA (ang. Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Ocena ilościowa poziomu białek sekrecyjnych uwalnianych do pożywki hodowlanej, została przeprowadzona przy użyciu testów immunoenzymatycznych typu ELISA. Oznaczenie poziomu IL-6, IL-8 oraz VEGF przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta oraz znormalizowano do poziomu białka całkowitego pochodzącego z lizatów komórkowych z których zebrane zostało medium warunkowane. Poziom czynnika SDF-1 wydzielanego przez ludzkie komórki nowotworowe do mysiego osocza oznaczono według protokołu producenta. Absorbancja była mierzona przy długości 450 nm wraz z referencją o długości 540 nm przy użyciu czytnika mikropłytek Tecan Spectra Fluor Plus. Doświadczenie wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach w tryplikacie. 6.2.14 Analiza poziomu białek przy pomocy macierzy białkowych Poziom fosforylowanych kinaz w materiale od pacjentów z ccRCC oraz w komórkach Caki-1 po 7-dniowej stymulacji SU11274, sunitinibem lub sorafenibem został zbadany przy pomocy zestawu macierzy białkowych Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array Kit, według protokołu producenta. Komórki Caki-1 przepłukano zimnym buforem PBS, lizowano przy pomocy dołączonego do zestawu buforu lizującego (Lysis buffer 6) i inkubowano 30 minut na lodzie. W przypadku próbek klinicznych, zamrożony kawałek tkanki został zalany buforem lizującym (400 μl), a następnie homogenizowany homogenizatorem ręcznym. Lizaty następnie wirowano przez 5 minut, 15 000g w 4ᵒC. Dalej przeprowadzono pomiar ilości białka w lizacie przy pomocy metody BSA i na każdy zestaw membran nałożono po 600 μg lizatu. Chemiluminescencja była mierzona po 10 minutach inkubacji membran z substratem Chemi Reagent Mix znajdującym się w zestawie przy użyciu urządzenia ChemiDoc. Wartości densytometryczne każdego duplikatu kropek obecnych na membranie były mierzone przy pomocy oprogramowania Image Lab 5.2.1. 6.2.15 Barwienie fioletem krystalicznym Komórki linii Caki-1 oraz Caki-2 po 96 godzinnej stymulacji SU11274, sunitinibem lub sorafenibem zostały przepłukane buforem PBS i utrwalone 5 minut w temperaturze pokojowej 100% metanolem. Po ściągnięciu metanolu komórki barwiono 20% roztworem fioletu krystalicznego w metanolu (20 minut, temperatura pokojowa). Następnie, każdy dołek przepłukiwano co najmniej 3 razy buforem PBS. Wysuszone płytki analizowano przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse Ti-S z suchymi obiektywami 10x, 20x oraz 40x. Do analizy długości i powierzchni komórek użyto oprogramowania ImageJ. 6.2.16 Ocena uśpienia komórek przy pomocy barwienia SA β-gal Komórki Caki-1 zostały wysiane na płytkę 24-dołkową z umieszczonymi na dnie szkiełkami podstawowymi. Po 7-dniowej stymulacji SU11274, sunitinibem lub sorafenibem komórki zostały wybarwione przy pomocy zestawu SA β-gal Staining Kit według protokołu producenta. Po odpłukaniu pożywki, komórki zostały utrwalone przy użyciu Fixative Solution w temperaturze pokojowej. Następnie dodano β-gal Staining Solution, a płytki zabezpieczono parafilmem i inkubowano przez noc w suchym inkubatorze z temperaturą 37ᵒC. Następnego dnia wyjęto szkiełka z wybarwionymi komórkami i zaklejono przy pomocy medium do preparatów wodnych (Glycergel Mounting Medium). Zdjęcia szkiełek zrobiono przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6 B (Leica Microsystems) z użyciem suchego obiektywu 10x i oprogramowania Leica LAS X. 6.2.17 Analiza cyklu komórkowego Po siedmiodniowym traktowaniu komórek ccRCC SU11274, sunitinibem lub sorafenibem, komórki odczepiono od naczynia hodowlanego przy pomocy akutazy i policzono. 100 000 komórek utrwalono w zimnym 70% etanolu przez 30 minut w 4ᵒC. Następnie, komórki zostały zwirowane przez 3 minuty w 3 000 rpm, przepłukane buforem PBS i ponownie zwirowane w tych samych warunkach. Dalej, osad zawieszono w 250 μl roztworu barwiącego (zawierającego 1μl jodku propidyny (50mg/ml) i 25 μl Rnazy A (100mg/ml) w 10 ml PBS). Próbki inkubowano 30 minut w 37ᵒC. Pomiar wykonano przy użyciu cytometru przepływowego Attune NxT Acousting Focusing wraz z oprogramowaniem Attune v2.4. 6.2.18 Barwienie immunocytofluorescencyjne komórek W celu analizy immunocytofluorescencyjnej, komórki ccRCC jak i komórki HUVEC zostały wysiane na płytkę 24-dołkową z umieszczonymi na dnie szkiełkami podstawowymi. Po zakończeniu stymulacji (Caki-1 lub Caki-2) lub osiągnięciu pełnej gęstości (HUVEC) komórki utrwalano poprzez 15 minutową inkubację w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej. Następnie, przeprowadzano permabilizację błony i blokowanie w buforze blokującym (1% BSA, 0,3% Triton X-100 w PBS) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Preparaty inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4ᵒC w buforze 1% BSA w PBS. Następnego dnia, po trzykrotnym przepłukaniu roztworem PBS, preparaty inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor lub barwnikiem falloidyna (1:1 000) wraz barwnikiem jądrowym Hoechst 33258 (1μg/ml) w 1% BSA w PBS. Po godzinnej inkubacji w ciemności, preparaty przepłukano 3 razy PBS i raz wodą destylowaną i zaklejono medium do barwień fluorescencyjnych. Analizę preparatów prowadzono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6 B, z suchymi obiektywami 10x i 20x oraz obiektywem immersyjnym 63x. Rozcieńczenia użytych przeciwciał zostały przedstawione w Tabeli 2. 6.2.19 Badanie wzrostu guzów in vivo Do badania roli białka MCPIP1 we wzroście i progresji guzów wykorzystano sześciotygodniowe samice myszy szczepów Foxn1nu/Foxn1nu oraz NOD-SCID, o upośledzonym układzie odpornościowym. Myszom została podana zawiesina komórek Caki-1 lub Caki-2 ze stabilną nadekspresją (pMX MCPIP1, pLIX MCPIP1), mutacją białka MCPIP1 (pLIX D141N) i właściwymi komórkami kontrolnymi (pMX PURO, pLIX PURO), a także wyciszeniem białka MCPIP1 (shMCPIP1) i kontrolą (shCtrl). Komórki zostały podane podskórnie w okolicę tylnej pachwiny (2 500 000 komórek w 200μl PBS – Caki-1; 5 000 000 komórek w 200μl PBS – Caki-2). Myszy z podanymi komórkami w systemie TetON były pojone wodą z dodatkiem doksycykliny oraz sacharozy (1%) przez cały okres trwania doświadczenia. Wzrost guzów był monitorowany przez 6 tygodni (shCtrl, shMCPIP1, pLIX PURO, pLIX MCPIP1, pLIX D141N) lub 8 tygodni (pMX PURO, pMX MCPIP1). Do badania wpływu oporności na SU11274, sunitinib i sorafenib wykorzystano sześciotygodniowe samice myszy szczepu NOD-SCID. Myszom zostały podane komórki Caki-1 przygotowane w następujący sposób. Komórki wysiewano na duże butelki T-75 cm2 w gęstości ok. 60%, po 24 godzinach do pożywki hodowlanej dodawano DMSO, SU11274, sunitinib lub sorafenib (stężenia podano w podpunkcie 6.2.3 Stymulacja komórek) i hodowano przez kolejne 3 tygodnie. Co 48 godzin medium było zmieniane na świeże, komórki rozsiewano co 7 dni na nowe butelki. Po okresie 21 dni nastąpiła 7 dniowa przerwa w stymulacji w celu namnożenia komórek, po której wznowiono stymulację przez kolejny tydzień. Następnie zbierano i liczono komórki oporne. Sześciotygodniowym samicom szczepu NOD-SCID podawano zawiesinę komórek Caki-1GFP (kontrolne - traktowane DMSO oraz oporne na SU11274, sunitinib lub sorafenib) zmieszanych w stosunku 1:1 z dzikimi komórkami Caki-1. Wzrost guzów był monitorowany przez 6 tygodni. Schemat doświadczenia został przedstawiony na rycinie 6.1. Rycina 6.1. Schemat doświadczeń in vivo z użyciem opornych komórek Caki-1. A. Schemat otrzymania opornych komórek Caki-1 GFP B. Schemat iniekcji podskórnej. Oporne komórki Caki-1 GFP mieszano w stosunku 1:1 z dzikimi komórkami Caki-1. Taką mieszaninę w PBS wstrzykiwano podskórnie do czterech grup myszy szczepu NOD-SCID. Wzrost guzów był mierzony przy pomocy suwmiarki 2 razy w tygodniu a otrzymane wartości przeliczono wg wzoru: objętość = szerokość x głębokość2. Dodatkowo, w przypadku myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu wykonywano pomiary metodą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości 3D (raz w tygodniu). Po zakończeniu doświadczeń zwierzęta poddano eutanazji, a tkankę nowotworową, płuca i krew pobrano do dalszych analiz. Guzy nowotworowe podzielono, połowa została poddana analizie histologicznej lub immunohistologicznej, z drugiej połowy wyizolowano RNA oraz białko. 6.2.20 Obrazowanie za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości Obrazowanie wzrostu guza i rozwoju naczyń krwionośnych w jego obrębie wykonano za pomocą ultrasonografu 3D wysokiej rozdzielczości VEVO2100 (VisualSonics) z głowicą z funkcją PowerDoppler dzięki której można monitorować unaczynienie. Pomiary wykonywano na myszach szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, które pozbawione były sierści. Przed pomiarem zwierzęta były usypiane wziewnie za pomocą 2% izofluranu (przepływ powietrza 0,5 L/min). Wyniki były analizowane w trybie 3D przy pomocy oprogramowania VEVO 2100. 6.2.21 Analiza krążących komórek nowotworowych przy pomocy cytometrii przepływowej Ilość krążących we krwi komórek nowotworowych Caki-1 transdukowanych wektorem lentiwirusowym GFP kontrolnych oraz z wyciszeniem białka MCPIP1, została oceniona przy pomocy metod cytometrii przepływowej. 6 tygodni po podaniu komórek nowotworowych do myszy szczepu NOD-SCID wyizolowano ich krew obwodową i analizowano ilość komórek pozytywnych dla GFP. Krew została poddana lizie w celu usunięcia erytrocytów przy pomocy buforu lizującego High-Yeld Lyse Fixative-Free Lysing Solution (30 minut, temperatura pokojowa), rozcieńczona 100 razy w buforze PBS i 10 ml każdej próbki zostało poddane analizie cytometrem przepływowym Attune NxT Acousting Focusing wraz z oprogramowaniem Attunev2.4. 6.2.22 Barwienie immunohistofluorescencyjne CD31 skrawków mrożeniowych Aby przygotować mrożeniowe preparaty histologiczne, tkankę utrwalono w roztworze 4% paraformaldehydu przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, po przepłukaniu w buforze PBS, tkanki przeniesiono do 30% roztworu sacharozy i inkubowano przez noc w 4ᵒC. Następnie, tkanki ponownie przepłukano w buforze PBS oraz zatopiono w medium do zamrażania O.C.T. (ang. Optimal Cutting Temperature Embedding Medium). Preparaty krojono przy użyciu kriostatu na skrawki o grubości 9 μm. 9 μm skrawki tkanki umieszczone na pokrytych poli-L-lizyną szkiełkach zostały wyjęte z -80ᵒC i rozmrożone w temperaturze pokojowej. Po uwodnieniu w buforze PBS, preparaty permeabilizowano (0,1% Triton X-100 w PBS) 20 minut i blokowano (5% BSA, 2% odtłuszczone mleko w PBS) przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Próbki tkankowe obrysowano pisakiem PAP PEN tworzącym hydrofobową barierę dookoła skrawka. Następnie, preparaty inkubowano przez noc z przeciwciałami pierwszorzędowymi przygotowanymi w 1% BSA w PBS, w 4ᵒC. Następnego dnia, po trzykrotnym przepłukaniu roztworem PBS, preparaty inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi Alexa Fluor wraz barwnikiem jądrowym Hoechst 33258 (1μg/ml) w 1% BSA w PBS. Po godzinnej inkubacji w ciemności, preparaty przepłukano 3 razy PBS i raz wodą destylowaną i zaklejono medium do barwień fluorescencyjnych. Analizę preparatów prowadzono przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM6 B, z suchymi obiektywami 10x i 20x oraz obiektywem immersyjnym 63x. Rozcieńczenia użytych przeciwciał zostały przedstawione w Tabeli 2. 6.2.23 Barwienie immunohistochemiczne preparatów tkankowych Barwienie hematoksyliną i eozyną zostało wykorzystane by ocenić morfologię tkanki. W tym celu usuwano parafinę i uwadniano preparaty parafinowe. Odzyskiwanie antygenu przeprowadzano poprzez inkubację w 95ᵒC buforze cytrynianowym przez 30 minut. Preparaty schładzano i przepłukiwano w buforze PBS. Preparaty barwiono hematoksyliną, a następnie dobarwiano eozyną. Do barwienia unaczynienia użyto króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-CD31 (1:50, Abcam) oraz zestawu EnVision Detection Systems Peroxidase/DAB, Rabbit/Mouse (Dako) zgodnie z protokołem producenta. Szkiełka zaklejano medium do preparatów bezwodnych. Analizę prowadzono przy użyciu mikroskopu odwróconego Leica DMI6000B wyposażonego w kamerę CCD Leica DFC360 FX (Leica Microsystems). Zdjęcia analizowano za pomocą oprogramowani Leica LAS X. 6.2.24 Analiza statystyczna Wszystkie doświadczenia in vitro były przeprowadzone co najmniej trzy razy. Ilość użytych w poszczególnych doświadczeniach zwierząt lub próbek klinicznych została przedstawiona w podpisach do rycin. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, z wyjątkiem niektórych doświadczeń z użyciem zwierząt, gdzie wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. Do przygotowania wykresów i analizy statystycznej użyto oprogramowania GraphPad Prism 7, poza wykresem okrągłości/powierzchni komórek, który przygotowano w programie Origin 2019b. Do porównania dwóch grup badawczych użyto niesparowanego testu t-Studenta (unpaired two-tailed t-test). W przypadku trzech lub więcej grup użyto jedno- lub dwukierunkowego testu ANOVA z testem post hoc Bonferroni. Wartości p są oznaczone gwiazdkami na wykresach gdzie (*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001 vs kontrola). 7 Wyniki 7.1 Rola białka MCPIP1 w procesach wzrostu, unaczynienia i progresji nowotworowej jasnokomórkowego raka nerki Jasnokomórkowy rak nerki jest najczęściej występującym typem raka nerki tworzącym silnie unaczynione guzy. Proces zapalny jest kluczowym elementem rozwoju nowotworu, jednak jego regulacja jest słabo poznana. Białko MCPIP1, jest kluczowym modulatorem zaangażowanym w kontrolę stanu zapalnego i utrzymanie homeostazy, a także, może odgrywać ważną rolę w rozwoju nowotworu. W pierwszym etapie badań sprawdzono: i) jak zmiana poziomu lub aktywności białka MCPIP1 w komórkach ccRCC, wpłynie na proliferację i rozwój guzów in vivo, ii) czy poziom białka MCPIP1 w komórkach ccRCC wpłynie na aktywność komórek endotelialnych i rozwój unaczynienia, iii) czy poziom lub aktywność RNazy białka MCPIP1 reguluje aktywność migracyjną komórek nowotworowych, proces przejścia epitelialno-mezenchymalnego oraz tworzenie się przerzutów w warunkach in vivo. 7.1.1 Niski poziom białka MCPIP1 powoduje zwiększoną proliferację komórek nowotworowych in vitro i przyspiesza wzrost guzów in vivo Do oceny przejściowego obniżenia poziomu białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych, wykorzystano sześć różnych siRNA (nazwane kolejno 1-6) wyciszających MCPIP1, wraz z dwoma siRNA kontrolnymi (z niską oraz średnią zawartością reszt GC). Wykazano najwyższą wydajność transfekcji siRNA-4, -5 oraz -6 (Ryc. 7.1. A). Następnie, wykorzystano sekwencje siRNA4 oraz siRNA5 na podstawie których, otrzymano wektory lentiwirusowe nazwane odpowiednio shMCPIP1#4 oraz shMCPIP1#5, z których nr 5 wykazywał lepszą skuteczność w obniżeniu poziomu MCPIP1 (Ryc. 7.1. B). Do dalszych analiz wykorzystano shMCPIP1#5, które dla uproszczenia, w dalszej części pracy, nazwano shMCPIP1. Komórki Caki-1 i Caki-2 zostały poddane transdukcji, a po kilkudniowej selekcji puromycyną sprawdzono poziom transkryptu i białka MCPIP1. Zaobserwowano 20-50% spadek ilości transkryptu MCPIP1 w zależności od badanej linii komórkowej (Ryc. 7.1. C, E), oraz obniżenie poziomu białka MCPIP1 o ponad 50% w stosunku do kontroli (shCtrl) w obu liniach (Ryc. 7.1. D, F). Rycina 7.1. Poziom MCPIP1 w komórkach ccRCC po transfekcji i transdukcji. A, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-1 po przejściowym wyciszeniu białka MCPIP1 za pomocą siRNA, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową B, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-1 po stabilnym wyciszeniu białka MCPIP1 wektorami lentiwirusowymi, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. C, Poziom mRNA MCPIP1 po stabilnej transdukcji komórek Caki-1 wektorami lentiwirusowymi D, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-1 po wyciszeniu białka MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. E, Poziom mRNA MCPIP1 po stabilnej transdukcji komórek Caki-2 wektorami lentiwirusowymi F, Reprezentatywny wynik western blot na komórkach Caki-2 po wyciszeniu białka MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych doświadczeń, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Aby określić, czy wyciszenie białka MCPIP1 wpływa na żywotność i proliferację komórek, komórki linii Caki-1 i Caki-2 hodowano przez okres 4 dni, po czym wykonano test redukcji MTT oraz test proliferacji. Wykazano, że obniżenie poziomu białka MCPIP1 w obu liniach powoduje istotny wzrost żywotności i potencjału proliferacyjnego komórek nowotworowych (Ryc. 7.2. A, B). Największa różnica pomiędzy kontrolą, a wyciszeniem białka MCPIP1 była widoczna po 96 godzinach co sugerowało, że dalsza hodowla mogłaby pogłębić zaobserwowane różnice. Rycina 7.2. Wpływ obniżenia poziomu białka MCPIP1 na proliferację i żywotność komórek ccRCC. A i B, Test redukcji MTT (żywotność) i analiza proliferacji komórek linii Caki- 1 (A) i Caki-2 (B) po 96 godzinnej hodowli. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych doświadczeń, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Aby potwierdzić wyniki uzyskane w hodowlach in vitro, wskazujące na znaczenie białka MCPIP1 w proliferacji komórek ccRCC, wykorzystano modele zwierzęce. Kontrolne komórki ccRCC (Caki-1 shCtrl) oraz komórki z niskim poziomem MCPIP1 (Caki-1 shMCPIP1) podano podskórnie do myszy z upośledzonym układem odporności szczepu NOD-SCID. Użycie myszy immunokompetentnych, pozbawionych komórek T oraz B było niezbędne, żeby ludzkie komórki nowotworowe nie zostały odrzucone przez organizm gospodarza. Pomiary wzrostu guzów były wykonywane co tydzień, przez okres 6 tygodni. Wykazano, że już po dwóch tygodniach od podania, komórki z obniżonym poziomem MCPIP1 rosły szybciej tworząc większe guzy (Ryc. 7.3. A). Po zakończeniu doświadczenia różnica w objętości była znacząca, podobnie waga guzów była około trzykrotnie większa w grupie traktowanej komórkami shMCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.3. B). Dodatkowo, na przekroju poprzecznym guzów wybarwionych hematoksyliną i eozyną widać było znaczącą różnicę wielkości, guzy kontrolne charakteryzowały się małym przekrojem w porównaniu do guzów tworzonych przez komórki Caki-1 shMCPIP1 (Ryc. 7.3. C). Rycina 7.3. Wpływ obniżenia poziomu białka MCPIP1 na wzrost guzów in vivo. A, Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki wykonywany tygodniowo przez okres 6 tygodni po podaniu podskórnym komórek Caki-1 z obniżonym poziomem białka MCPIP1. B, Waga guzów po zakończeniu doświadczenia. C, Reprezentatywne zdjęcia przekroju guzów, po wybarwieniu hematoksyliną/eozyną. Do badania wykorzystano 30 myszy szczepu NOD-SCID: Caki-1 shCtrl, n=14; Caki-1 shMCPIP1, n=16. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. 7.1.2 Aktywność RNazy białka MCPIP1 wpływa na szybkość wzrostu guzów w warunkach in vivo W celu sprawdzenia czy aktywność RNazy MCPIP1 ma znaczenie w procesie wzrostu guza, przygotowano komórki ccRCC z nadekspresją funkcjonalnej formy dzikiej białka MCPIP1 (pLIX MCPIP1) oraz zmutowanej, pozbawionej aktywności RNazy (pLIX D141N). Indukcja nadekspresji odpowiedniej formy białka MCPIP1 następowała po dodaniu doksycykliny. Najwyższy wzrost poziomu MCPIP1 był obserwowany po 48 godzinach, inkubacji z doksycykliną, zarówno w komórkach Caki-1 (Ryc. 7.4. A) jak i Caki-2 (Ryc.7.4. B). Dodatkowo, najwyższy poziom MCPIP1 można było zaobserwować w przypadku formy zmutowanej, która została pozbawiona aktywności RNazy (Ryc. 7.4.). Rycina 7.4. Poziom białka MCPIP1 w komórkach ccRCC po transdukcji lentiwirusowej. A, Reprezentatywny wynik western blot po nadekspresji formy dzikiej (pLIX MCPIP1) i zmutowanej (pLIX D141N) MCPIP1 w komórkach Caki-1, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Reprezentatywny wynik western blot po nadekspresji formy dzikiej i zmutowanej MCPIP1 w komórkach Caki-2, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. Po podaniu komórek Caki-1 pLIX do myszy szczepu NOD-SCID, zaobserwowano najwolniejszy wzrost guzów i najniższą ich wagę w grupie z podwyższonym poziomem białka MCPIP1 (pLIX MCPIP1), podczas gdy komórki kontrolne (pLIX PURO) i z nadekspresją formy zmutowanej (pLIX D141N) rosły podobnie (Ryc. 7.5. A, B). Linia Caki-2 została podana do bezgrasiczych myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu. Komórki linii Caki-2 z nadekspresją białka MCPIP1 zachowywały się podobnie do komórek Caki-1 tworząc najmniejsze guzy. Największe guzy były utworzone przez komórki Caki-2 z mutacją białka MCPIP1 pozbawionego aktywności RNazy (Ryc.7.5. C, D). Wyniki te potwierdziły, że niski poziom białka MCPIP1, lub brak aktywności enzymatycznej białka MCPIP1 przyspiesza wzrost guzów in vivo. Rycina 7.5. Wpływ aktywności RNazy białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na wzrost guzów in vivo. A, Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki przez okres 6 tygodni po podaniu podskórnym komórek Caki-1 z nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy białka MCPIP1. B, Waga guzów po zakończeniu doświadczenia. Do badania wykorzystano 18 myszy szczepu NOD-SCID, grupa pLIX PURO n=5, grupa pLIX D141N n=5, grupa pLIX MCPIP1 n=8. C, Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki przez okres 6 tygodni po podaniu podskórnym komórek Caki-2 z nadekspresją dzikiej lub zmutowanej formy białka MCPIP1. D, Waga guzów po zakończeniu doświadczenia. Do badania wykorzystano 9 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, gdzie n=3 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; MCPIP1 vs kontrola; #, P < 0.05; ##, P < 0.01; MCPIP1 vs D141. 7.1.3 Aktywność RNazy białka MCPIP1 reguluje unaczynienie guzów w warunkach in vivo W celu zbadania poziomu unaczynienia guzów nowotworowych z różnym poziomem białka MCPIP1, przeanalizowano poziom białka CD31 będącego markerem komórek śródbłonka. Wykazano, że guzy grupy z wyciszeniem białka MCPIP1, posiadały bardzo dobrze rozwinięte unaczynienie (Ryc. 7.6. A). Guzy te, charakteryzował znaczący wzrost ilości komórek pozytywnych dla antygenu CD31 oraz funkcjonalnych naczyń posiadających światło naczynia, w porównaniu z grupą kontrolną (Ryc. 7.6. B). Dodatkowo, za pomocą oprogramowania ImageJ zmierzono powierzchnię naczyń i zaobserwowano, że w guzach z obniżonym poziomem białka MCPIP1 powierzchnia naczyń była prawie trzykrotnie wyższa niż w guzach kontrolnych (Ryc. 7.6. C). Rycina 7.6. Wpływ wyciszenia białka MCPIP1 na poziom CD31 in vivo. A, Reprezentatywne zdjęcia tkanek nowotworowych po barwieniu CD31 - markera naczyń krwionośnych, po podaniu podskórnym komórek Caki-1 shCtrl i z obniżonym poziomem białka MCPIP1 Caki-1 shMCPIP1. B, Wykres przedstawiający ilość funkcjonalnych (zawierających światło naczynia) naczyń krwionośnych CD31 . C, Wykres przedstawiający powierzchnię światła naczyń CD31 . Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=6 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Wykorzystanie myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu ze względu na brak sierści, pozwoliło na monitorowanie rozwoju unaczynienia w czasie wzrostu guzów. Guzy poddano analizie przy pomocy ultrasonografu 3D i zaobserwowano, że w trakcie wzrostu, znacznie lepiej rozwijało się unaczynienie w guzach z niskim poziomem MCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.7. A, B). Wyniki te, potwierdzono za pomocą barwień immunofluorescencyjnych dla CD31. W trakcie wzrostu guzów, zdecydowanie więcej naczyń krwionośnych zaobserwować można było w guzach shMCPIP1 (Ryc. 7.7. C). Rycina 7.7. Wpływ wyciszenia białka MCPIP1 na rozwój unaczynienia in vivo. A, Unaczynienie guzów mierzone przy pomocy ultrasonografii wysokiej rozdzielczości. B, Reprezentatywne zdjęcia wykonane za pomocą ultrasonografu VEVO2100 gdzie kolorem czerwonym są zaznaczone funkcjonalne naczynia krwionośne, a biała przerywana linia oznacza granice guza. Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, Caki-1 shCtrl, n=5; Caki-1 shMCPIP1, n=10. C, Immunofluorescencyjne barwienie CD31 tkanek nowotworowych. Reprezentatywne zdjęcia rozwoju unaczynienia po 21, 28, 35 i 41 dniach od podania podskórnego komórek Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. Do badania wykorzystano 8 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Barwienie immunohistochemiczne CD31 tkanek z nadekspresją formy dzikiej i pozbawionej funkcji RNazy białka MCPIP1 i wskazało, jak istotna jest funkcja enzymatyczna białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych dla rozwoju unaczynienia in vivo (Ryc. 7.8. A). Guzy utworzone przez komórki Caki-1 z nieaktywną formą białka MCPIP1 (pLIXD141N) charakteryzowały się najlepiej rozwiniętym unaczynieniem, podobnie, jak guzy z obniżonym poziomem MCPIP1 (Ryc. 7.8. A, B). Natomiast, wysoki poziom MCPIP1 w przypadku komórek Caki-1 nie powodował zmian w ilości funkcjonalnych naczyń krwionośnych w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.8. A, B). Rycina 7.8. Wpływ nadekspresji białka MCPIP1 na poziom CD31. A, Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające wynik barwienia immunohistochemicznego dla CD31 na tkankach nowotworowych po podaniu podskórnym komórek Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. B, Wykres przedstawiający średnią powierzchnię naczyń o średnicy ≥ 200μm. Do badania wykorzystano 12 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Dalsza analiza unaczynienia, w guzach utworzonych przez komórki Caki-2 w modelu Foxn1nu/Foxn1nu potwierdziła, że unaczynienie rozwijało się najlepiej w grupie z formą zmutowaną białka MCPIP1 w porównaniu z kontrolą (pLIX PURO) (Ryc. 7.9. A, B). Co ciekawe, w tym modelu najsłabsze unaczynienie występowało wśród guzów z nadekspresją funkcjonalnej, dzikiej formy MCPIP1 (Ryc. 7.9. A, B), co wskazało, że zarówno poziom białka MCPIP1 jak i jego aktywność RNazy, w komórkach nowotworowych, miały istotny wpływ na rozwój nowych naczyń krwionośnych w obrębie guza. Rycina 7.9. Wpływ nadekspresji białka MCPIP1 na rozwój unaczynienia in vivo. A, Unaczynienie guzów mierzone przy pomocy ultrasonografii wysokiej rozdzielczości. B, Reprezentatywne zdjęcia USG guzów utworzonych przez komórki Caki-2 z nadekspresją formy dzikiej lub zmutowanej białka MCPIP1. Do badania wykorzystano 9 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, gdzie n=3 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. 7.1.4 Niski poziom białka MCPIP1 wpływa na destabilizację połączeń międzykomórkowych, aktywną migrację komórek endotelialnych i tworzenie naczyniopodobnych struktur w warunkach in vitro Kolejnym etapem badań było poszukiwanie mechanizmów odpowiedzialnych za zaobserwowany w badaniach in vivo wpływ braku aktywnego białka MCPIP1 na wzrost guzów i rozwój ich unaczynienia. W celu wyjaśnienia uzyskanych wyników, w pierwszej kolejności analizowano potencjalne oddziaływanie komórek ccRCC na komórki endotelialne. Oceniono zdolność do migracji komórek endotelialnych w żelu fibrynowym w trakcie współhodowli z komórkami ccRCC. W teście tym, opłaszczające kulki lateksowe, komórki endotelialne HMEC-1 zostały poddane wpływowi komórek nowotworowych Caki-1 kontrolnych (shCtrl) oraz z obniżonym poziomem białka MCPIP1 (shMCPIP1) znajdujących się na powierzchni żelu fibrynowego (Ryc. 7.10. A, B). Zaobserwowano, że komórki endotelialne pod wpływem komórek Caki-1 shMCPIP1 zaczęły wykształcać naczyniopodobne struktury (tubule), podczas gdy hodowla HMEC-1 z nowotworowymi komórkami kontrolnymi posiadała tych struktur istotnie mniej (Ryc. 7.10. A). Przeanalizowano obszar migracji komórek HMEC-1 i okazało się, że jest on znacząco większy pod wpływem hodowli z komórkami z niskim poziomem MCPIP1 w porównaniu z hodowlą w obecności nowotworowych komórek kontrolnych (Ryc. 7.10. B). Aby sprawdzić, czy pożywka hodowlana zebrana znad komórek nowotworowych (tzw. medium warunkowane) może wpływać na ilość tworzących się rozgałęzień między komórkami endotelialnymi, komórki HMEC-1 wysiano w Matrigelu, a następnie stymulowano zebranym medium warunkowanym. Dodatkowo, dla lepszego zobrazowania komórki śródbłonka wybarwiono kalceiną. Wykazano, że po stymulacji medium warunkowanym znad komórek Caki-1 shMCPIP1 wzrasta ilość rozgałęzień pomiędzy komórkami HMEC-1 tworząc lepiej rozbudowaną i zorganizowaną sieć (Ryc. 7.10. C, doświadczenie przeprowadzone przez dr hab. Katarzynę Miękus, natomiast przeanalizowane przez P. Maronę). Rycina 7.10. Efekt wyciszenia białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na komórki endotelialne HMEC-1. A, Wykres przedstawiający procent naczyniopodobnych struktur utworzonych przez komórki HMEC-1 w przeliczeniu na wszystkie kulki lateksowe. Komórki HMEC-1 hodowano w żelu fibrynowym w ko-kulturze z komórkami Caki-1 shCtrl lub shMCPIP1. Po prawej, reprezentatywne zdjęcia kulek lateksowych, strzałkami zaznaczono naczyniopodobne struktury, w które formują się komórki HMEC-1. B, Wykres przedstawiający średnią powierzchnię migracji komórek HMEC-1 w żelu fibrynowym. Po prawej, reprezentatywne zdjęcia kulek z zaznaczoną białą linią granicą migrujących komórek. C, Wykres średniej ilości rozgałęzień utworzonych przez komórki HMEC-1 hodowanych w Matrigelu i stymulowanych medium kondycjonowanym znad komórek Caki-1 po wyciszeniu białka MCPIP1. Pod wykresem reprezentatywne zdjęcia wybarwionych kalceiną komórek HMEC-1. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Przepuszczalność naczyń jest regulowana przez wiele różnych białek, z których VE-kadheryna pełni jedną z bardziej istotnych funkcji. VE-kadheryna znajduje się na powierzchni komórek śródbłonka. W wyniku stymulacji komórek czynnikami proangiogennymi dochodzi do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, przez co integralność połączeń jest zaburzona, a komórki zaczynają migrować (48–50). 3-godzinna stymulacja komórek endotelialnych HUVEC medium warunkowanym znad komórek Caki-1 oraz Caki-2 z wyciszonym białkiem MCPIP1 spowodowała znaczący wzrost fosforylacji VE-kadheryny bez zmian w jej całkowitym poziomie, względem kontroli (Ryc. 7.11. A). Odwrotną sytuację można było zaobserwować po stymulacji medium znad komórek z nadekspresją funkcjonalnej formy MCPIP1. Poziom fosforylacji VE-kadheryny w komórkach HUVEC po stymulacji medium warunkowanym znad komórek ccRCC z nadekspresją MCPIP1 był niższy, niż w komórkach stymulowanych medium znad kontrolnych komórek ccRCC. Poziom aktywacji VE-kaheryny w komórkach HUVEC stymulowanych medium znad dwóch różnych linii ccRCC, Caki-1 jak i Caki-2 był podobny (Ryc. 7.11. A). W celu oceny wpływu medium kondycjonowanego znad komórek nowotworowych na integralność warstwy komórek endotelialnych oraz lokalizację VE-kadheryny wykonano barwienie immunofluorescencyjne komórek HUVEC (Ryc. 7.11. B). Media izolowane znad komórek z wyciszonym białkiem MCPIP1 (Caki-1 i Caki-2) powodowały utratę połączeń komórkowych i internalizację VE-kadheryny z błony komórkowej do wnętrza komórki (zaznaczono strzałkami) w porównaniu z kontrolą. Natomiast, po stymulacji medium znad komórek po nadekspresji MCPIP1 nie obserwowano zmian w wyglądzie komórek i zmian w lokalizacji VE-kadheryny względem kontroli (Ryc. 7.11. B). Otrzymane wyniki wykazały, że poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych wpływa na wydzielanie przez nie czynników zaangażowanych w aktywację komórek endotelialnych, fosforylację VE-kadheryny i tracenie kontaktów komórka-komórka. Rycina 7.11. Wpływ różnego poziomu białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na VE-kadherynę. A, Reprezentatywny wynik western blot dla VE-kadheryny (forma całkowita i fosforylowana) w komórkach HUVEC po 3 godzinnej stymulacji medium kondycjonowanym znad komórek Caki-1 lub Caki-2 z wyciszeniem bądź nadekspresją białka MCPIP1, z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Reprezentatywne zdjęcia komórek HUVEC po barwieniu immunofluorescencyjnym dla VE-kadheryny po 3 godzinnej stymulacji medium kondycjonowanym znad komórek Caki-1 lub Caki-2 z różnym poziomem białka MCPIP1. Strzałkami zaznaczono przerwy w ciągłości warstwy komórek. 7.1.5 Białko MCPIP1 reguluje poziom wydzielanych czynników proangiogennych w komórkach nowotworowych Hipoksja jest jednym z czynników promujących angiogenezę. W celu sprawdzenia czy poziom i aktywność białka MCPIP1 w komórkach ccRCC reguluje wydzielanie czynników proangiogennych, wpływających na komórki endotelialne, komórki linii Caki-1 i Caki-2, kontrolne (shCtrl) oraz z obniżonym poziomem MCPIP1 (shMCPIP1), inkubowano w warunkach normoksji (21% O2) lub hipoksji (0,5% O2) przez 48 godzin. Po tym czasie sprawdzono ekspresję i ilość wydzielonych białek proangiogennych, takich jak VEGF, IL-6 oraz IL-8 (Ryc. 7.12. A-C). Za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym wykazano istotny wzrost poziomu transkryptów dla IL-6, IL-8 i VEGF w komórkach z wyciszonym poziomem MCPIP1. Obserwowany wzrost ekspresji był szczególnie istotny w warunkach hipoksji dla obu badanych linii. W warunkach normoksji, wyższy poziom transkryptów badanych czynników proangiogennych charakteryzował również komórki linii Caki-2 z wyciszonym poziomem MCPIP1. (Ryc. 7.12. A-C). Podobne różnice obserwowano w poziomie wydzielanych białek, gdzie w warunkach hipoksji gwałtownie rosło wydzielanie badanych czynników proangiogennych do pożywki przez komórki z wyciszonym białkiem MCPIP1 (Ryc. 7.12. A-C). Rycina 7.12. Poziom czynników proangiogennych w komórkach ccRCC z wyciszeniem MCPIP1. Komórki linii Caki-1 oraz Caki-2 z obniżonym poziomem białka MCPIP1 hodowano przez 48 godzin w warunkach hipoksji i normoksji. Poziom mRNA IL8 (A), VEGF (B), i IL6 (C), został zmierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Poziom mRNA próbek Caki shCtrl w warunkach normoksji został przyrównany do 1. Poziom wydzialanych czynników został zmierzony przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Białko MCPIP1 rozpoznaje i degraduje transkrypty dla wielu cytokin w tym IL-6 oraz IL-8 (182,187). Dlatego, kolejnym krokiem było sprawdzenie czy w komórkach ccRCC białko MCPIP1, dzięki swojej aktywności RNazy, może regulować poziom czynników proangiogennych. W tym celu wykorzystano komórki ccRCC z nadekspresją (pLIX MCPIP1) i mutacją białka MCPIP1 (pLIX D141N) (Ryc. 7.13. A, B). Wykazano, że w warunkach hipoksji, komórki z nieaktywnym białkiem MCPIP1 (pLIXD141N) posiadały najwięcej transkryptów dla analizowanych czynników oraz wydzielały najwięcej białek sekrecyjnych do pożywki, w porównaniu z komórkami kontrolnymi czy z nadekspresją MCPIP1 (Ryc. 7.13. A, B). Nadekspresja MCPIP1 powodowała jedynie nieznaczny (nieistotny statystycznie) spadek poziomu transkryptów i białek sekrecyjnych wydzielanych do pożywki względem komórek kontrolnych (pLIX PURO) (Ryc. 7.13. A, B). Rycina 7.13. Poziom czynników proangiogennych w komórkach ccRCC z nadekspresją MCPIP1. A, Poziom mRNA czynników proangiogennych w komórkach Caki-1 z formą dziką (pLIX MCPIP1) i zmutowaną (pLIX D141N) białka MCPIP1. Poziom mRNA próbek Caki-1 pLIX PURO w warunkach normoksji został przyrównany do 1. B, Poziom wydzielniczych czynników został zmierzony testem immunoenzymatycznym ELISA. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. 7.1.6 Białko MCPIP1 reguluje proces przerzutowania wpływając na oś SDF-1/CXCR4 Jednym z czynników wpływającym na zwiększona ekspresje VEGF jest SDF-1 wraz ze swoim receptorem CXCR4. SDF-1 i VEGF mogą indukować rozwój unaczynienia w guzach, a oś SDF-1-CXCR4 wpływa na zwiększenie inwazyjności komórek nowotworowych i tworzenie przerzutów w wielu typach nowotworów (64,65,84). Dlatego, w kolejnych doświadczeniach sprawdzono poziom tych czynników w komórkach ccRCC z różnym poziomem białka MCPIP1. Zaobserwowano znacząco zwiększony poziom SDF-1 w komórkach Caki-1 z obniżonym poziomem białka MCPIP1, podobnie, poziom transkryptu dla CXCR4 był dwukrotnie wyższy w komórkach Caki-1 shMCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.14. A). Następnie, sprawdzono poziom SDF-1 w komórkach z nadekspresją MCPIP1 i nieaktywną formą MCPIP1, pozbawioną aktywności Rnazy i wykazano, że pod wpływem nadekspresji MCPIP1 poziom mRNA dla SDF-1 istotnie obniża się (Ryc. 7.14. A, trzeci wykres). Podobne wyniki otrzymano dla drugiej z badanych linii komórkowych ccRCC, Caki-2, zarówno po wyciszeniu, jak i nadekspresji MCPIP1 (Ryc. 7.14. B). Dodatkowo, sprawdzono poziom mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w guzach otrzymanych po podskórnym podaniu do myszy komórek ccRCC. Zaobserwowano wzrost, zarówno SDF-1 jak i CXCR4 w grupie guzów z wyciszeniem białka MCPIP1 (Ryc. 7.14. C). Następnie, zbadano poziom wydzielonego ludzkiego SDF-1 do osocza myszy i zaobserwowano jego wyższe stężenie w osoczu myszy, którym podano komórki Caki-1 shMCPIP1 (Ryc. 7.14. D). Rycina 7.14. Białko MCPIP1 reguluje oś SDF1-CXCR4. A, Poziom ekspresji mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w komórkach Caki-1 z wyciszeniem lub nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. B, Poziom ekspresji mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w komórkach Caki-2 z wyciszeniem lub nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) lub zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1. C, Poziom ekspresji mRNA dla SDF-1 i CXCR4 w guzach został zmierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Do doświadczenia użyto 15 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, Caki-1 shCtrl, n=5; Caki-1 shMCPIP1, n=10. D, Poziom wydzielonego do osocza SDF-1 u myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, mierzony przy pomocy testu immunoenzymatycznego ELISA. Wyniki in vitro przedstawiono jako średnia ± SD, natomiast in vivo jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Jednym z czynników transkrypcyjnych regulujących poziom ekspresji SDF-1 jest c/EBPβ, który z kolei jest degradowany przez białko MCPIP1 (183,215). Ze względu na to, zdecydowano sprawdzić czy białko MCPIP1 w sposób pośredni, przez c/EBPβ, może regulować poziom SDF-1. Wykazano, że zarówno poziom transkryptu jak i białka c/EBPβ w komórkach Caki-1 z wyciszeniem MCPIP1 był dwukrotnie wyższy niż w komórkach kontrolnych (Ryc. 7.15. A). Natomiast, w przypadku nadekspresji MCPIP1, poziom c/EBPβ spadał w stosunku do kontroli (Ryc. 7.15. B). Co ciekawe, najwyższe poziomy były obserwowane w komórkach z mutacją w domenie RNazowej MCPIP1 co potwierdziło, że aktywność RNazy MCPIP1, pośrednio przez c/EBPβ, pełni istotną funkcję w regulacji poziomu białka SDF-1. Rycina 7.15. Białko MCPIP1 reguluje poziom c/EBPβ. A, Poziom ekspresji c/EBPβ mierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym z EF2 jako genem referencyjnym. Reprezentatywny wynik western blot dla białka c/EBPβ z α-tubuliną jako kontrolą ilościową, w komórkach Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. B, Poziom ekspresji c/EBPβ mierzony przy pomocy reakcji PCR w czasie rzeczywistym z EF2 jako genem referencyjnym. Reprezentatywny wynik western blot dla białka c/EBPβ z α-tubuliną jako kontrolą ilościową, w komórkach Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej lub zmutowanej białka MCPIP1. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD z trzech niezależnych doświadczeń. Wysoki poziom SDF-1 wiąże się z wysoką inwazyjnością, skłonnością komórek nowotworowych do migracji i przerzutowania. Dlatego, w celu oceny wpływu białka MCPIP1 na potencjał do tworzenia przerzutów przeprowadzono analizę krążących komórek nowotworowych. W tym celu, do myszy szczepu NOD-SCID podano podskórnie ludzkie komórki Caki-1 kontrolne (shCtrl) i z wyciszeniem MCPIP1 (shMCPIP1). Komórki te były dodatkowo transdukowane białkiem zielonej fluorescencji, GFP. Analizie poddano zarówno krew myszy jak i płuca, w których komórki nowotworowe mogły potencjalnie tworzyć przerzuty. Wykazano, że wyciszenie białka MCPIP1 zwiększyło ilość ludzkich krążących komórek nowotworowych w mysim krwioobiegu (Ryc. 7.16. A), a następnie osadzanie się w płucach, co obserwowano przez 6 tygodni trwania doświadczenia (Ryc. 7.16. B). Po zakończeniu doświadczenia, zaobserwowano znacząco wyższą ilość mikroprzerzutów tworzonych przez komórki z obniżonym poziomem białka MCPIP1 w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.16. C). Nadekspresja MCPIP1 powodowała z kolei, spadek ilości mikroprzerzutów w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.16. D). Rycina 7.16. Białko MCPIP1 wpływa na oś SDF-1/CXCR4 oraz proces przerzutowania. A, Analiza cytometryczna poziomu krążących komórek nowotworowych, po 28, 35 i 41 dniach od podania podskórnego komórek Caki-1 GFP z wyciszeniem białka MCPIP1. B, Poziom ekspresji ludzkiego GAPDH w RNA izolowanym z mysich płuc na przestrzeni 6 tygodni. Do doświadczeń wykorzystano 8 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę. C, Poziom ekspresji ludzkiego GAPDH obecnego w mysich płucach po 6 tygodniach od podania komórek nowotworowych Caki-1 z wyciszeniem białka MCPIP1. Do doświadczeń wykorzystano 8 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie n=4 na grupę oraz 10 myszy szczepu Foxn1nu/Foxn1nu, Caki-1 shCtrl, n=4; Caki-1 shMCPIP1, n=6. D, Poziom ekspresji ludzkiego GAPDH obecnego w mysich płucach po 6 tygodniach od podania komórek nowotworowych Caki-1 z nadekspresją białka MCPIP1. Jako referencję wykorzystano mysi GAPDH. Do doświadczeń wykorzystano 10 myszy szczepu NOD-SCID, Caki-1 pLIX PURO/MCPIP1 n=5 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. 7.1.7 Niski poziom MCPIP1 zwiększa aktywność migracyjną i powoduje nabywanie cech mezenchymalnych w komórkach ccRCC Skłonność komórek nowotworowych do tworzenia odległych przerzutów spowodowana jest między innymi ich wyższą aktywnością migracyjną. Aby sprawdzić, czy białko MCPIP1 wpływa na ruchliwość komórek analizowano ścieżki, po których poruszały się losowo wybrane komórki nagrywane przez 16 godzin podczas testu zarastania rany, (Ryc.7.17. A-D). Wykazano, że zarówno w przypadku komórek linii Caki-1 jak i Caki-2, po wyciszeniu białka MCPIP1, komórki poruszały się znacząco szybciej i przebywały 20-40% dłuższą drogę niż komórki kontrolne (Ryc.7.17. E-F). Rycina 7.17. Efekt obniżenia poziomu białka MCPIP1 na aktywność ruchową komórek. A, B, Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające proces zarastania rany w komórkach Caki-1 (A) oraz Caki-2 (B) z wyciszeniem białka MCPIP1. Zdjęcia zrobione w momencie zrobienia rysy, oraz po 8 godzinach trwania doświadczenia. C, D, Mapy przedstawiające ścieżki migracyjne pojedynczych komórek w czasie 16-godzinnego nagrywania. N=18 komórek dla każdego warunku. E, F, Analiza przebytej odległości oraz średnia szybkość komórek w trakcie 16 godzinnego doświadczenia. Wyniki są przedstawione jako średnia z 3 niezależnych doświadczeń z liczbą analizowanych komórek n=100 dla każdego warunku. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, z trzech niezależnych doświadczeń. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Zmiany w aktywności migracyjnej oznaczają zazwyczaj zmiany w organizacji cytoszkieletu i nabywanie przez komórki fenotypu mezenchymalnego, który charakteryzuje się utratą e-kadheryny i podwyższonym poziomem białek związanych z EMT takich jak wimentyna, n-kadheryna czy β-katenina oraz czynników regulujących EMT np. Snail, Slug,czy bialka Zeb (98). Za pomocą techniki western blot, potwierdzonej dalszą analizą densytometryczną zbadano poziom tych czynników w kontrolnych komórkach ccRCC oraz komórkach z obniżonym poziomem białka MCPIP1. Wykazano, że niski poziom MCPIP1 wpływa na znacząco niższy poziom e-kadheryny i wzrost β-kateniny, wimentyny, a także kinazy Src oraz receptora c-Met, zarówno formy całkowitej jak i fosforylowanej (Ryc. 7.18. A). Następnie, przeanalizowano poziom mRNA dla czynników transkrypcyjnych Snail i ZEB2 które jednocześnie biorą udział w negatywnej regulacji poziomu e-kadheryny (100). Zaobserwowano wzrost poziomu mRNA dla obu czynników w komórkach ccRCC z wyciszeniem białka MCPIP1 (Ryc. 7.18. B). Rycina 7.18. Efekt obniżenia poziomu białka MCPIP1 na markery EMT. A, Analiza markerów EMT, reprezentatywny wyniki western blot dla komórek Caki-1 oraz Caki-2 po obniżeniu poziomu MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. Po prawej wykresy z analizą densytometryczną dla co najmniej trzech niezależnych doświadczeń. B, Poziom ekspresji mRNA dla genów Snail oraz ZEB2 z EF2 jako referencją w komórkach Caki-1 oraz Caki-2 po wyciszeniu białka MCPIP1, mierzone za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. 7.1.8 Aktywność RNazy MCPIP1 reguluje fosforylację receptora c-Met Wyciszenie białka MCPIP1 w kom ccRCC spowodowało zmiany poziomu i fosforylacji receptora c-Met dlatego, w dalszej części badań, skupiono się na sprawdzeniu wpływu białka MCPIP1 na poziom receptora c-Met, który zaangażowany jest w regulację procesu angiogenezy, proliferację komórek, i regulację czynników odpowiedzialnych za przerzutowanie nowotworu (67). Wykazano, że komórki z nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) i zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1 różniły się znacząco poziomem receptora c-Met. Brak aktywności RNazy MCPIP1 w komórkach pLIX D141N powodował wzrost poziomu receptora c-Met, zarówno jego formy całkowitej jak i fosforylowanej (Ryc. 7.19. A, B). Podobne wyniki uzyskano dzięki analizie PCR w czasie rzeczywistym, gdzie zaobserwowano najwyższy poziom ekspresji MCPIP1 i c-Met w komórkach Caki-1 pLIX D141N (Ryc. 7.19. C). Rycina 7.19. Wpływ aktywności RNazy białka MCPIP1 w komórkach ccRCC na poziom receptora c-Met. A, Reprezentatywny wyniki western blot dla komórek Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) oraz zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Analiza densytometryczna. C, Poziom ekspresji mRNA dla MCPIP1 i c-Met z EF2 jako referencją w komórkach Caki-1 z nadekspresją lub mutacją białka MCPIP1, mierzone za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Nadekspresja MCPIP1 powodowała istotny spadek poziomu nie tylko receptora c-Met, ale również kinazy Src jak i czynnika transkrypcyjnego STAT3, który regulowany jest m. in. przez receptor c-Met (Ryc. 7.20. A, B). Dodatkowo, przeprowadzono analizę poziomu mRNA czynników transkrypcyjnych Snail i ZEB2 zaangażowanych w EMT i wykazano istotnie niższą ich ekspresję w komórkach z nadekspresją dzikiej formy MCPIP1 w porównaniu z kontrolą oraz komórkami z mutacją (Ryc. 7.20. C). Rycina 7.20. Wpływ aktywności RNazy białka MCPIP1 na poziom czynników zaangażowanych w aktywność migracyjną. A, Reprezentatywny wyniki western blot dla komórek Caki-1 z nadekspresją formy dzikiej (pLIX MCPIP1) oraz zmutowanej (pLIX D141N) białka MCPIP1 z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Analiza densytometryczna poziomu czynników Src i STAT3. C, Poziom ekspresji mRNA dla genów Snail oraz ZEB2 z EF2 jako referencją w komórkach Caki-1 z nadekspresją lub mutacją białka MCPIP1, mierzone za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, gdzie n=3. Wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Podsumowując, wyniki uzyskane w tej części pracy doktorskiej wykazały, że poziom i aktywność białka MCPIP1 w komórkach jasnokomórkowego raka nerki ma istotne znaczenie w regulacji poziomu czynników zaangażowanych w potencjał proliferacyjny, tworzeniu unaczynienia zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo, a także, wpływa na aktywność migracyjną komórek i nabywanie fenotypu mezenchymalnego, co bezpośrednio przekłada się na szybkość wzrostu guzów i rozwoju przerzutów. Niski poziom MCPIP1 lub brak aktywności RNazy tego białka powoduje także wzrost ilości i fosforylację receptora c-Met, który jest kluczowym białkiem zaangażowanym w rozwój nowotworów i proces tworzenia przerzutów. 7.2 Poziom białka MCPIP1 w próbkach klinicznych pacjentów z ccRCC Wyniki badań in vivo oraz in vitro wskazały na istotne znaczenie poziomu białka MCPIP1 na szybkość rozwoju, unaczynienie i tworzenie przerzutów przez komórki ccRCC. W kolejnym etapie pracy doktorskiej skupiono się na zbadaniu poziomu białka MCPIP1, receptora c-Met oraz czynników zaangażowanych w rozwój i unaczynienie nowotworu w próbkach klinicznych. Przeanalizowano 60 tkanek nowotworowych pobranych od pacjentów ze zdiagnozowanym jasnokomórkowym rakiem nerki. Próbki zostały przebadane przez patomorfologa i podzielone według skali Fuhrman. Analiza tkanek nowotworowych wykonana metodą western blot wykazała spadek poziomu białka MCPIP1 wraz ze wzrostem zaawansowania choroby (Ryc. 7.21. A, B). Następnie, próbki od pacjentów zbadano za pomocą analizy mikromacierzy, pod kątem ekspresji genów związanych z progresją nowotworową jak i rozwojem unaczynienia (Ryc. 7.21. C, D). Zaobserwowano stosunkowo niski poziom transkryptu MCPIP1 (gen ZC3H12A) we wszystkich próbkach, co potwierdziło wynik przedstawiony przez Ligęzę i in. 2016, gdzie poziom białka i transkryptu MCPIP1 był istotnie niższy w tkance nowotworowej u pacjentów z jasnokomórkowym rakiem nerki w porównaniu z otaczającą ją tkanką zdrową (212). Następnie wykazano, że poziom czynników zaangażowanych w inwazyjność komórek nowotworowych takich jak HGF, MET, SRC, ZEB2, IL6 oraz LIF rósł wraz z progresją nowotworową. Część powyższych czynników zaangażowana jest również w rozwój unaczynienia razem z VEGFA, FLT1, CDH5 czy EPAS1 których poziom był generalnie wysoki we wszystkich stadiach klinicznych (Ryc. 7.21. C, D). Rycina 7.21. Białko MCPIP1 w próbkach klinicznych. A, Analiza poziomu białka MCPIP1 w próbkach klinicznych, reprezentatywny wynik western blot 12 próbek z białkiem GAPDH jako kontrolą ilościową. B, Analiza densytometryczna 60 próbek klinicznych, podzielonych na 4 grupy zgodnie ze stadium zaawansowania klinicznego (I-IV). Czerwony kolor oznacza próbki analizowane następnie przy pomocy mikromacierzy. C, Mapa przedstawiająca poziom ekspresji poszczególnych genów zaangażowanych w procesy angiogenne oraz przerzutowanie ccRCC. Każda kolumna przedstawia pojedynczą próbkę. Wynik przedstawiono za pomocą skali logarytmicznej z poziomem ekspresji genów od 2.03 do 10.98. D, Wykres średniej ekspresji genów przedstawionych na mapie dla próbek stadium I II (n=8) i III IV (n=8). Statystyka została przeprowadzona jednokierunkowym, niesparowanym testem ANOVA pomiędzy podmiotami. Wyniki otrzymane z analizy mikromacierzy wskazujące na wzrost poziomu receptora c-Met wraz z progresją choroby, potwierdzono metodą western blot z analizą densytometryczną i wykazano istotny statystycznie wzrost poziomu białka zarówno formy całkowitej jak i fosforylowanej (Y1234/1235) receptora c-Met, wraz z progresją nowotworu (Ryc. 7.22. A). Następnie, przeprowadzono analizę stosunku poziomu białka MCPIP1 do poziomu dwóch form receptora c-Met i wykazano ich negatywną korelację zarówno w przypadku formy całkowitej jak i fosforylowanej receptora c-Met (Ryc. 7.22. B). Rycina 7.22. Korelacja między białkiem MCPIP1, a receptorem c-Met w próbkach klinicznych. A, Analiza densytometryczna poziomu białka c-Met (lewy wykres) oraz jego formy fosforylowanej (prawy wykres) w 60 próbkach klinicznych. B, Analiza negatywnej korelacji poziomu białka MCPIP1 oraz receptora c-Met (lewy wykres) lub jego formy fosforylowanej (prawy wykres) w próbkach klinicznych. Wyniki przedstawiono jako średnia ±SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Ostatnim etapem tej części pracy była analiza fosforylacji kinaz białkowych u pacjentów z ccRCC w różnym stopniu zaawansowania choroby. Wykorzystując macierze białkowe, wykazano wzrost poziomu białek zaangażowanych w rozwój unaczynienia i inwazyjność w próbkach od pacjentów z bardziej zaawansowanym stadium choroby (stadia III-IV). Zaobserwowano wyższy poziom białek takich jak Src, Yes, β-katenina, FAK, Pyk2 czy STAT3 (Ryc. 7.23). Rycina 7.23. Analiza poziomu fosforylowanych kinaz, przy pomocy zestawu Proteome Profiler, w próbkach klinicznych, gdzie stadium I II n=10, a stadium III IV n=9. Pod każdym wykresem znajdują się reprezentatywne zdjęcia kropek (w duplikacie) odpowiadających danemu białku (lewa strona: grupa I+II, prawa strona: grupa III+IV). Wyniki przedstawiono jako średnia ±SD, wartości p zostały obliczone przy pomocy testu t-Studenta. Podsumowując, uzyskane w tej części pracy wyniki wykazały, iż poziom MCPIP1 spada wraz z rozwojem nowotworu, co w rezultacie może wpłynąć na wzrost inwazyjności i unaczynienia, a w konsekwencji gorsze rokowania u pacjentów. 7.3 Poziom białka MCPIP1, a oporność na terapie celowane w jasnokomórkowym raku nerki Ze względu na silny rozwój unaczynienia, terapie jasnokomórkowego raka nerki opierają się często na wykorzystaniu inhibitorów kinaz tyrozynowych w tym, receptorów VEGF czy PDGF takich jak m.in. sunitinib oraz sorafenib. Jednak podczas stosowania leków celowanych, często obserwowanym zjawiskiem jest wykształcanie oporności i nawrót choroby. Dodatkowo wykazano, że zahamowanie niektórych receptorów powoduje wzrost fosforylacji receptora c-Met i aktywację innych ścieżek zaangażowanych w unaczynienie (145,216). Dlatego, w ostatniej części pracy doktorskiej, zbadano molekularne podłoże nabywania oporności na sunitinib i sorafenib, określono znaczenie białka MCPIP1 w tym procesie i sprawdzono rolę receptora c-Met w progresji nowotworu. 7.3.1 Sunitinib i sorafenib wpływają na potencjał proliferacyjny i cykl komórkowy ccRCC Sunitinib i sorafenib są obecnie jednymi z najczęściej używanych inhibitorów receptorów kinaz tyrozynowych wykorzystywanych w terapii ccRCC. Jednak spora grupa pacjentów wykształca silną oporność podczas stosowania tych związków (139). Dlatego tak istotne jest poznanie mechanizmów wpływających na nabywanie oporności na stosowane terapie. W pierwszej części badań, sprawdzono, czy stymulacja komórek ccRCC sunitinibem, sorafenibem lub specyficznym inhibitorem receptora c-Met – SU11274 wpłynie na ich żywotność. W tym celu wykonano test redukcji MTT (Ryc. 7.24. A). Wykazano, że w komórkach Caki-1 jedynie stymulacja sunitinibem powodowała spadek żywotności komórek w porównaniu z kontrolą (Ryc. 7.24. A). Większe różnice zaobserwować można było w komórkach linii Caki-2 gdzie żywotność spadała nie tylko po stymulacji sunitinibem, ale także inhibitorem c-Met – SU11274. Sorafenib nie wpływał na zmianę żywotności komórek (Ryc. 7.24. A). Podobne wyniki można było zaobserwować po barwieniu komórek fioletem krystalicznym, gdzie istotny spadek ilości można było zaobserwować jedynie wśród komórek stymulowanych sunitinibem zarówno w linii Caki-1 jak i Caki-2 (Ryc. 7.24. B). Aby wytłumaczyć różnice w proliferacji komórek, wykonano barwienie jodkiem propidyny po tygodniowej stymulacji komórek lekami, a następnie przeanalizowano komórki przy pomocy cytometru przepływowego (Ryc. 7.24. C). Zaobserwowano zmiany w procentowym rozkładzie komórek między kolejnymi fazami cyklu pomiędzy badanymi warunkami. Zarówno w linii Caki-1, jak i Caki-2, po stymulacji sunitinibem rosła ilość komórek w fazie apoptotycznej, natomiast spadała w fazie G2/M. Odwrotnie reagowały komórki oporne na sorafenib, których ilość rosła w fazie G2/M w porównaniu z innymi warunkami. Stymulacja SU11274 powodowała z kolei, wzrost ilości komórek w fazie G0/G1 (Ryc. 7.24. C). Rycina 7.24. Wpływ SU11274, sunitinibu i sorafenibu na żywotność, proliferację i cykl komórkowy. A, Test redukcji MTT dla komórek Caki-1 i Caki-2 w trakcie 7 dniowej hodowli z lekami B, Barwienie fioletem krystalicznym komórek Caki-1 i Caki-2 po 96 godzinnej stymulacji lekami. Zdjęcia reprezentatywne. C, Analiza cyklu komórkowego po 7 dniowej stymulacji lekami komórek Caki-1 oraz Caki-2. Wykresy przedstawiają procentowy rozkład komórek pomiędzy poszczególnymi fazami cyklu komórkowego. Stymulacja lekami nie tylko zmieniała potencjał proliferacyjny i cykl komórkowy, ale w wyraźny sposób wpływała na morfologię komórek. Podczas gdy komórki stymulowane SU11274 nie różniły się znacząco od komórek kontrolnych, stymulacja sunitinibem powodowała, że komórki stawały się bardziej zaokrąglone i lepiej przytwierdzone do podłoża, natomiast hodowla w obecności sorafenibu powodowała, że komórki wydłużały się i przybierały wrzecionowaty kształt (Ryc. 7.25. A, B). Dodatkowo, oporne komórki Caki-1 wysiano w ilości 1 000 komórek na dołek 6-dołkowej płytki, by zaobserwować czy mają one zdolność do tworzenia kolonii. Komórki oporne na sorafenib miały najniższy potencjał klonogenny w porównaniu z resztą badanych grup, gdzie ilość powstałych klonów była podobna (Ryc. 7.25. C). Rycina 7.25. Wpływ leków na morfologię. A, Wykres przedstawiający średnią kolistości komórek Caki-1 po 7-dniowej hodowli w obecności leków. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD. Wartości p zostały obliczone przy pomocy jednokierunkowego testu ANOVA (post hoc Bonferroni). B, Porównanie kolistości komórek Caki-1 do ich powierzchni po 7 dniach stymulacji lekami. Każdy punkt oznacza pojedynczą komórkę. Do każdego warunku została dopasowana elipsa z 95% prawdopodobieństwem, n=30 komórek na grupę. C, Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające ilość powstałych klonów po 2-tygodniowej hodowli, przed którą komórki Caki-1 były traktowane 7 dni lekami, a następnie wysiane na płytkę 6-dołkową w gęstości 1 000 komórek na dołek. 7.3.2 Stymulacja sunitinibem i sorafenibem wpływa na fenotyp komórek ccRCC i zmienia ich profil białkowy Podwyższenie poziomu receptora c-Met może pełnić istotną rolę w nabywaniu oporności na sunitinib (145). Wykonana analiza western blot komórek ccRCC po 24-godzinnej stymulacji lekami wykazała, że nie tylko sunitinib, ale również sorafenib powodował wzrost fosforylacji receptora c-Met (Ryc. 7.26. A). Co ciekawe, zahamowanie aktywności receptora c-Met specyficznym inhibitorem SU11274 powodował prawie dwukrotny wzrost ilości białka MCPIP1 (Ryc. 7.26. A). Efekt działania inhibitorów na poziom receptora c-Met i białka MCPIP1 utrzymywał się nawet po 3 tygodniowej ciągłej stymulacji komórek Caki-1 jak i Caki-2 (Ryc. 7.26. B). Obserwowano wysoki poziom MCPIP1 po działaniu inhibitora fosforylacji receptora c-Met i spadek poziomu tego białka po działaniu sunitinibu i sorafenibu wraz ze wzrostem poziomu całkowitego receptora c-Met (Ryc. 7.26. B). Dodatkowo, zaobserwowano znaczący wzrost e-kadheryny w komórkach stymulowanych sunitinibem (Ryc. 7.26. B). W celu zobrazowania cytoszkietu i morfologii, komórki Caki-1 po tygodniowej stymulacji lekami, wybarwiono falloidyną, dzięki której uwidoczniono filamenty aktynowe cytoszkieletu komórki. Zaobserwowano, że stymulacja SU11274 nie zmieniła fenotypu komórek (Ryc. 7.26. C). Komórki oporne na sunitinib ściśle do siebie przylegały, formując owalne, przypominające klony kształty, a stymulacja sorafenibem powodowała znaczące wydłużanie się komórek, które przybierały wrzecionowaty kształt (Ryc. 7.26. C), potwierdzając wcześniejsze obserwacje (7.25 B). Dodatkowe barwienia receptora c-Met, e-kadheryny potwierdziły wcześniej uzyskane wyniki metodą western blot, wskazując ich podwyższony poziom po stymulacji sunitinibem (Ryc. 7.26.C). Również poziom β-kateniny rósł w komórkach opornych na sunitinib (Ryc. 7.26.C). Po tygodniowej hodowli komórek Caki-1 z lekami przeprowadzono również analizę fosforylowanych kinaz przy pomocy macierzy białkowych (Ryc. 7.26. D). Zaobserwowano między innymi, że fosforylacja białek z rodziny STAT rosła po stymulacji lekami, podobnie jak EGFR, JNK, FAK, c-Jun. Wzrastał również poziom całkowitej formy β-kateniny zaangażowanej m.in. w rearanżację cytoszkieletu jak i przekaz sygnału (Ryc. 7. 26. D). Rycina 7.26. Wpływ leków na poziom MCPIP1 oraz receptora c-Met. A, Reprezentatywny wynik western blot dla komórek Caki-1 oraz Caki-2 po 24-godzinnej stymulacji lekami z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. B, Reprezentatywny wynik western blot dla komórek Caki-1 oraz Caki-2 po 3-tygodniowej stymulacji lekami z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. C, Barwienie immunofluorescencyjne komórek Caki-1 po 7 dniowej stymulacji lekami. Kolorem niebieskim wybarwione są jądra wybarwione przy pomocy barwnika Hoechst, czerwonym badane białka. D, Mapa przedstawiająca analizę densytometryczną poziomu fosforylowanych kinaz mierzonych przy pomocy zestawu Proteome Profiler, przed izolacją komórki były traktowane lekami przez 7 dni. Każde doświadczenie przeprowadzono co najmniej 3 razy. Z uwagi na ciekawe obserwacje uzyskane po stymulacji pojedynczymi lekami, komórki Caki-1 potraktowano kombinacjami leków, aby sprawdzić jak połączenie inhibitora receptora c-Met, który podwyższa poziom MCPIP1, z inhibitorami angiogenezy wpłynie na komórki nowotworowe (Ryc. 7.27.). Kombinacja sunitinibu i inhibitora SU11274 miała bardzo toksyczny wpływ na komórki (apoptoza komórek po ok. tygodniu hodowli). Natomiast połączenie sorafenibu z SU11274 obniżało fosforylację receptora c-Met, ale poziom białka MCPIP1 był niewykrywalny (Ryc. 7.27.). Wyniki tego doświadczenia wskazały, iż kombinacje leków są albo zbyt toksyczne i mogą zaszkodzić prawidłowym komórkom, albo nieskuteczne i należy szukać innych rozwiązań problemu lekooporności. Rycina 7.27. Wpływ mieszanki leków na poziom MCPIP1 oraz receptora c-Met. Reprezentatywny wynik western blot dla komórek Caki-1 po 3-tygodniowej stymulacji lekami lub kombinacją leków z α-tubuliną jako kontrolą ilościową. Obniżenie potencjału proliferacyjnego, zmiany w cyklu komórkowym oraz morfologii i migracji mogą być oznakami uśpienia (senesencji) komórek (217). Z tego powodu przeprowadzono barwienie β-galaktozydazy zestawem SA-β-gal (ang. Senescence-associated β-galactosidase activity). Wykazano, że stymulacja sunitinibem powodowała istotny wzrost β-gal pozytywnych komórek (kolor niebieski), co sugerowało, że mechanizm oporności na sunitinib może polegać na wprowadzeniu komórek w stan uśpienia (Ryc. 7.28.). Rycina 7.28. Wpływ leków na uśpienie komórek Caki-1. Reprezentacyjne zdjęcia po barwieniu przy pomocy zestawu SA β-gal komórek Caki-1 po 7-dniowej stymulacji lekami. Kolor niebieski oznacza komórki uśpione. 7.3.3 Oporność na sunitinib i sorafenib wpływa na progresję ccRCC w warunkach in vivo Aby zbadać wpływ oporności na sunitinib, sorafenib oraz SU11274 na rozwój guzów in vivo, komórki Caki-1 ze stabilną ekspresją GFP hodowano w obecności leków przez okres 5 tygodni. Po tym czasie zmieszano oporne komórki Caki-1GFP z komórkami dzikimi Caki-1 w stosunku 1:1 i podano podskórnie immunokompetentnym myszom szczepu NOD-SCID (schemat doświadczenia na rycinie 6.1.). Po 6 tygodniach od podania komórek zaobserwowano, że największą objętość i wagę osiągnęły guzy tworzone przez komórki oporne na sorafenib, podczas gdy najmniejsze, były w grupie traktowanej sunitinibem (Ryc. 7.29. A, B). Wyniki te, pokrywały się z rezultatami otrzymanymi w badaniach in vitro w testach redukcji MTT. Co ciekawe, najwięcej mikroprzerzutów w płucach mierzonych za pomocą reakcji PCR w czasie rzeczywistym tworzyły komórki oporne na sunitinib tworzące najmniejsze guzy i komórki oporne na sorafenib, dające największe guzy (Ryc. 7.29. C). Najmniej przerzutów było w grupie traktowanej SU11274, co może wskazywać na ochronną rolę MCPIP1 (Ryc. 7.29. C). Analiza tkanek nowotworowych pobranych od myszy wykazała, że najwięcej sygnału zielonej fluorescencji, wskazującego na obecność komórek opornych, znajdowało się w centrum guzów. Dodatkowo, guzy z grupy traktowanej sorafenibem posiadały najwyższy sygnał GFP, co znaczy, że komórki oporne miały wyższy potencjał proliferacyjny niż podane razem z nimi komórki dzikie (Ryc. 7.29. D, E). Rycina 7.29. Efekt oporności na leki na wzrost guzów i ilość przerzutów in vivo. A, Pomiar wzrostu guzów przy pomocy suwmiarki po 6 tygodniach od podania podskórnego komórek Caki-1GFP opornych na SU11274, sunitinib lub sorafenib, zmieszanych w stosunku 1:1 z dzikimi komórkami Caki-1. B, Waga guzów po zakończeniu doświadczenia. Do badań wykorzystano 66 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie Caki-1 kontrola, n=18; SU11274, n=14; sunitinib, n=16; sorafenib, n=18. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy jednokierunkowego testu ANOVA (post hoc Bonferroni). C, Poziom ekspresji ludzkiego GAPDH obecnego w mysich płucach po 6 tygodniach od podania komórek nowotworowych. D, Analiza skorygowanej całkowitej fluorescencji białka GFP w guzach. Do badania wykorzystano 12 myszy, gdzie n=3 na grupę. E, Reprezentatywne zdjęcia przekrojów guzów w jasnym polu z nałożoną fluorescencją pochodzącą od komórek GFP pozytywnych. W kolejnym etapie, za pomocą techniki western blot oraz analizy densytometrycznej, przeanalizowano tkanki nowotworowe w celu oceny poziomu białek c-Met, MCPIP1 oraz e-kadheryny (Ryc. 7.30. A, B). W grupach traktowanych sunitinibem i sorafenibem obserwowano najwyższy poziom fosforylowanego receptora c-Met i najniższy białka MCPIP1. Grupa traktowana SU11274, charakteryzowała się najwyższym poziomem białka MCPIP1, a traktowana sunitinibem najwyższym poziomem e-kadheryny (Ryc. 7.30. A, B). Rycina 7.30. Efekt oporności na leki na poziom MCPIP1 i c-Met in vivo. A, Reprezentatywny wynik western blot dla 20 próbek nowotworowych z GAPDH jako kontrolą ilościową. B, Analiza densytometryczna wszystkich próbek nowotworowych uzyskanych metodą western blot. Do badań wykorzystano 66 myszy szczepu NOD-SCID, gdzie Caki-1 kontrola, n=18; SU11274, n=14; sunitinib, n=16; sorafenib, n=18. W przypadku analizy densytometrycznej e-kadheryny wykorzystano 32 myszy, gdzie n=8 na grupę. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM, wartości p zostały obliczone przy pomocy jednokierunkowego testu ANOVA (post hoc Bonferroni). Uzyskane wyniki wskazują, że poziom MCPIP1 oraz receptora c-Met w komórkach opornych ma istotne znaczenie zarówno dla wzrostu i rozwoju guzów jak i dla procesu przerzutowania in vivo. 7.3.4 Białko GSK3β reguluje poziom receptora c-Met oraz białka MCPIP1 Ostatnim etapem badań było wyjaśnienie, w jaki sposób regulowany jest poziom białek MCPIP1 i c-Met w opornych komórkach nowotworowych. W 2011 roku pojawiło się doniesienie, że pod wpływem stymulacji IL1β, fosforylowana kinaza IKKβ rozpoznaje motyw DSGXXS białka MCPIP1, które ulega fosforylacji, a następnie ubikwitynacji i degradacji w proteasomie (195). Inna publikacja wskazała, że receptor c-Met reguluje aktywację IKKβ, przez co, w sposób pośredni, mógłby regulować poziom białka MCPIP1 (218). Dlatego sprawdzono, czy w komórkach jasnokomórkowego raka nerki, po stymulacji IL-1β, rośnie poziom kinazy IKK przy jednoczesnym spadku poziomu białka MCPIP1. Badania wykazały, że już po 5 minutach stymulacji IL-1β, IKK było fosforylowane, jednak nie wpływało to na poziom MCPIP1 (Ryc. 7.31.). Rycina 7.31. Wpływ fosforylacji kinazy IKK na białko MCPIP1. Reprezentatywny wynik western blot dla komórek Caki-1 po stymulacji IL1β, z β-aktyną jako kontrolą ilościową. Otrzymany wynik spowodował rozpoczęcie poszukiwań innego czynnika, który rozpoznaje motyw DSGXXS białka MCPIP1. Wykorzystując bazę danych NetPhos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) udało się wykazać, że czynnikiem tym może być białko GSK3β, które przez fosforylację może kierować inne białka na drogę degradacji (107). Aby sprawdzić, czy GSK3β reguluje poziom MCPIP1 użyto jego specyficznego inhibitora LiCl. Zaobserwowano, że po 24 godzinach inkubacji komórek Caki-1 z inhibitorem LiCl, poziom MCPIP1 w komórkach Caki-1 znacząco wzrastał. Zastosowanie inhibitora LiCl powodowało wzrost poziomu MCPIP1 nawet w obecności w sunitinibu i sorafenibu (Ryc. 7.32. A). Co więcej, poziom formy całkowitej i fosforylowanej receptora c-Met oraz fibronektyny obniżał się w obecności tego inhibitora (Ryc. 7. 32. A). Dodatkowo, oprócz zastosowania inhibitora GSK3β komórki traktowano inhibitorem szlaku sygnalizacyjnego PI3K-Akt – Ly294002, który jednak nie wpłynął ani na poziom receptora c-Met, ani MCPIP1 (Ryc. 7.32. A). Co ciekawe, zwłaszcza po stymulacji sunitinibem, zaobserwować można było wzrost poziomu β-kateniny, która zazwyczaj związana jest z e-kadheryną tworząc z nią połączenia międzykomórkowe oraz fibronektyny, zaangażowanej w rearanżację macierzy zewnątrzkomórkowej (Ryc. 7.32. A). Po 7 dniach stymulacji lekami sprawdzono poziom GSK3β i wykazano, że jego poziom istotnie rośnie w komórkach traktowanych sunitinibem i sorafenibem, co może być przyczyną niskiego poziomu MCPIP1 i wzrostu fosforylacji receptora c-Met w komórkach opornych na te inhibitory (Ryc. 7.32. B). Następnie, komórki Caki-1 poddane stabilnej transdukcji wektorami lentiwirusowymi z nadekspresją MCPIP1, poddano stymulacji lekami i wykazano, że wysoki poziom MCPIP1 istotnie może pełnić rolę ochronną, poprzez obniżenie poziomu fosforylacji receptora c-Met, kinazy Src czy czynnika transkrypcyjnego STAT3 (Ryc. 7.32. C). Rycina 7.32. Wpływ białka GSK3β na poziom MCPIP1. A, Reprezentatywny wynik western blot dla komórek Caki-1 po 24-godzinnej stymulacji sunitinibem, sorafenibem, Ly294002 lub LiCl z β-aktyną jako kontrolą ilościową. B, Reprezentatywny wynik western blot poziomu GSK3β dla komórek Caki-1 po 7-dniowej stymulacji lekami z β-aktyną jako kontrolą ilościową. C, Reprezentatywny wynik western blot dla komórek Caki-1 po stabilnej transdukcji wektorami lentiwirusowymi w celu nadekspresji białka MCPIP1. Po indukcji nadekspresji doksycykliną komórki były traktowane lekami przez 24 godziny. Każde doświadczenie przeprowadzono co najmniej 3 razy. Uzyskane w tej części pracy doktorskiej wyniki wskazują, że białko MCPIP1 może działać jako supresor nowotworzenia, a poznanie mechanizmów jego działania i współdziałania z lekami może być kluczowe podczas tworzenia nowych leków celowanych. 8 Dyskusja Rozwój nowotworu jest wieloetapowym procesem który obejmuje inicjację, promocję i progresję. Każdy z tych etapów zależy od szeregu czynników zaangażowanych w różne procesy i szlaki metaboliczne w tym stan zapalny, angiogenezę, apoptozę, proliferację czy regulację aktywności migracyjnej. W przypadku jasnokomórkowego raka nerki opisano dotychczas szereg genów i ich produktów białkowych mających istotne znaczenie w powstawaniu i rozwoju choroby (10,11). U pacjentów z ccRCC dochodzi do częstych mutacji genu supresorowego VHL, które powodują zachwianie równowagi pomiędzy ekspresją czynników pro i antyangiogennych, a formowane guzy charakteryzują się silnie rozwiniętą siecią naczyń krwionośnych (12,14). Bardzo dobre ukrwienie guzów nerki połączone z umiejętnością komórek nowotworowych do nabywania bardziej agresywnego fenotypu sprawia, że podczas detekcji przerzuty stwierdza się już u 30% pacjentów (219). Obecnie, główną strategią terapeutyczną stosowaną w leczeniu nowotworów nerki jest chirurgiczne wycięcie guza, w zależności od stopnia zaawansowania choroby: nerkooszczędzające bądź radykalne (z całą nerką i okolicznymi węzłami chłonnymi) (220). Od kilku lat powstaje jednak coraz więcej leków celowanych, blokujących aktywność przede wszystkim receptorów kinaz tyrozynowych zaangażowanych w rozwój angiogenezy w tym receptory VEGF czy PDGF (127). Terapie te, pomimo że początkowo skuteczne, niosą jednak pewne ograniczenia, związane głównie ze zdolnością komórek nowotworowych do adaptacji do niekorzystnego środowiska i wykształcania przez nie oporności (221). Kolejnym, niezwykle istotnym procesem zaangażowanym w karcynogenezę jest chroniczne zapalenie, które nie tylko bierze udział w tworzeniu mikrośrodowiska sprzyjającego wzrostowi guza, ale także promuje angiogenezę, EMT czy inwazyjność (222). Odpowiedź zapalna jest pewnego rodzaju strażnikiem homeostazy organizmu, która jest ściśle kontrolowana przez wiele czynników, w tym białko MCPIP1 (223). Podczas rozwoju nowotworu, kontrola stanu zapalnego jest mocno zaburzona, m.in. przez aktywację onkogenów czy obniżenie poziomu genów supresorowych. Białko MCPIP1, ze względu na swoją funkcję negatywnego regulatora stanu zapalnego, stało się interesującym obiektem badań dotyczących jego potencjalnej roli w rozwoju nowotworów (223). Wykazano, że MCPIP1, oprócz regulowania stabilności transkryptów dla typowych czynników i cytokin prozapalnych, takich jak IL-1β, IL-2 czy IL-6, negatywnie wpływa na czynniki zaangażowane w apoptozę, proliferację oraz angiogenezę w komórkach nowotworowych (181,210,212). W niniejszej pracy podjęto próbę oceny roli białka MCPIP1 podczas rozwoju i progresji jasnokomórkowego raka nerki zarówno in vitro wykorzystując ludzkie linie ccRCC: Caki-1 oraz Caki-2 jak i in vivo, a także tkanki pobrane od pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą. Dodatkowo, scharakteryzowano wpływ poziomu i aktywności RNazy białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych oddziałujących na komórki śródbłonka HUVEC i HMEC-1. Zbadano także rolę MCPIP1 i receptora c-Met w procesie wykształcania oporności przez komórki ccRCC, na stosowane inhibitory kinaz tyrozynowych: sunitinib i sorafenib. 8.1 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje proliferację i żywotność Zwiększony, nie poddający się regulacji podział komórkowy, stanowi podstawę w rozwoju nowotworów. Do tej pory wykazano, że białko MCPIP1 negatywnie reguluje żywotność, proliferację i cykl komórkowy w liniach komórkowych HeLa, HepG2, neuroblastomy i MDA-MB-231, a także ccRCC (181,188,210,212,213). W pierwszym etapie pracy doktorskiej wykorzystano dwie ludzkie linie jasnokomórkowego raka nerki: Caki-1, pochodzące z przerzutu oraz Caki-2 z guza pierwotnego, które zostały stabilnie transdukowane wektorami lentiwirusowymi w celu obniżenia poziomu MCPIP1. Wykazano, że komórki z wyciszonym białkiem MCPIP1 rosły szybciej i miały wyższą żywotność w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Uzyskane wyniki w badaniach in vitro, potwierdzono również na modelu mysim, gdzie zaobserwowano znacząco szybszy wzrost guzów i większą wagę guzów z niskim poziomem MCPIP1. Uzyskane wyniki w zestawieniu z danymi literaturowymi wskazują, że konstytutywnie niski poziom białka MCPIP1 indukuje czynniki zaangażowane w regulację cyklu komórkowego i proliferacji. W przypadku badań nad rakiem piersi, naukowcy wykazali, że wyciszenie MCPIP1 specyficznym shRNA zwiększało zarówno proliferację i żywotność jak również ekspresję genów antyapoptotycznych (181). Natomiast, podskórne podanie komórek MDA-MB-231 z nadekspresją białka MCPIP1, do myszy z upośledzonym układem odporności, po indukcji doksycykliną, skutkowało spadkiem objętości guza, aż do jego kompletnego zaniku w niespełna dwa tygodnie (181). Z kolei Ligęza i wsp. oraz Lichawska-Cieślar i wsp. wykazali, że komórki Caki-1 z nadekspresją MCPIP1 aktywowaną doksycykliną w systemie TetON, charakteryzowały się niższą żywotnością i akumulacją ATP w stosunku do kontroli, zarówno w warunkach hipoksji jak i normoksji (212,213). Powyższe wyniki potwierdzają przedstawione w pracy badania in vivo, gdzie komórki nowotworowe posiadające podwyższony poziom MCPIP1 osiągały najmniejsze rozmiary. Co ciekawe, wprowadzona do komórek Caki-2 punktowa mutacja D141N, która całkowicie znosi aktywność RNazy białka, prowadziła do powstania największych guzów, co sugeruje, że negatywna rola MCPIP1 w kontroli proliferacji może zależeć od jego funkcji enzymatycznej. Jednym z mechanizmów tłumaczącym, w jaki sposób białko MCPIP1 może kontrolować proliferację, jest regulacja transkryptów biorących udział w cyklu komórkowym. Badania z udziałem ludzkich keratynocytów transfekowanych specyficznym siMCPIP1 wykazały, że spadek MCPIP1 powodował wzrost poziomu cykliny D1 i fosforylację ERK1/2 oraz obniżał poziom p21 i fosforylację p53, po traktowaniu komórek promieniowaniem UVB (198). Sekwencjonowanie nowej generacji komórek Caki-1, a następnie walidacja wyników metodą PCR w czasie rzeczywistym, wykazały najwyższą ekspresję mRNA dla p21Cip1 w komórkach z nadekspresją dzikiej formy MCPIP1, w porównaniu z komórkami kontrolnymi i komórkami niosącymi mutacją punktową w domenie PIN (213). Należące do rodziny inhibitorów Cip/Kip, zaangażowanych w negatywną regulację cyklu komórkowego, białko p21Cip1 hamuje tworzenie kompleksów CDK-Cyklina i prowadzi do zatrzymania cyklu w fazach G1, S i G2 (224). Z kolei białko to jest degradowane między innymi podczas fazy S przez kompleks ligazy E3 CUL4B-DDB1-CDT2 (224). Wykazano, że poziom DDB1 (ang. DNA damage-binding protein 1) spadał w komórkach posiadających nadekspresję MCPIP1 co sugeruje, że może być substratem dla aktywności enzymatycznej MCPIP1 (213). Prawdopodobnie, wysoki poziom MCPIP1 powoduje degradację DDB1, przez co kompleks ligazy E3 nie jest w stanie rozpoznawać białka p21, które hamuje cykl komórkowy, co w konsekwencji prowadzi do spadku proliferacji. Najnowsze badania potwierdziły powyższe wyniki i pokazały, że nadekspresja MCPIP1 w dwóch liniach neuroblastomy powoduje spadek proliferacji i ekspresji cyklin A2, B1, D1, D3 i E2, a także spadek fosforylowanych kinaz CDK2 i CDK3 oraz białka Rb, czego efektem jest blokada w punkcie kontrolnym G1/S i areszt komórek w fazie G1 (209). Wysoka ekspresja głównego markera komórek dzielących się – Ki67 zazwyczaj stanowi negatywny czynnik prognostyczny. Co ciekawe, Ki67 jest powiązane także z promocją EMT i progresją złośliwych nowotworów (225). Także w przypadku ccRCC przedstawiono, że pacjenci z wysoką ekspresją Ki67 charakteryzowali się gorszym wynikiem przeżywalności. Dodatkowo, poziom Ki67 korelował ze stadium zaawansowania choroby zarówno w skali TNM jak i Fuhrman (226). Analiza RNAseq wykazała pięciokrotnie wyższą ekspresję Ki67 w komórkach z mutacją D141N w porównaniu z komórkami z nadekspresją MCPIP1 (213). Wynik ten nie jest istotny statystycznie, ale sugeruje, że ekspresja Ki67 może być regulowana przez białko MCPIP1. Co ciekawe, białko MCPIP1 może negatywnie regulować proliferację komórek, także w sposób pośredni, przez degradowanie miR155, nazywanego również oncomiR155 (175). Dowiedziono, że miR155 zaangażowany jest w kontrolę apoptozy, proliferacji oraz cyklu komórkowego, a jego wzmożona ekspresja występuje w wielu typach nowotworów w tym w ccRCC (227). Do tej pory przedstawiono wiele mechanizmów działania miR155 na proliferację. W przypadku raka wątroby miR155 zwiększa ekspresję ARID2 (ang. AT-rich interactive domain 2) oraz powoduje wzrost poziomu Cykliny D1 i fosforylacji kinazy Akt (228). Z kolei, w ccRCC, nadekspresja miR155 powodowała wzrost proliferacji i agresywności komórek 786-O i ACHN, a także indukowała EMT przez spadek e-kadheryny i wzrost n-kadheryny i wimentyny zarówno in vitro jak i in vivo. Autorzy tych badań sugerowali, że w obserwowanych zmianach pośredniczyło białko E2F2, posiadające miejsce w regionie 3’UTR, rozpoznawane przez miR155 (229). Białka z rodziny E2F tworzą kompleks z białkiem Rb i modulują ekspresję genów zaangażowanych w cykl komórkowy. Głównym wnioskiem wysnutym przez autorów było uznanie E2F2 za gen supresorowy ccRCC negatywnie regulowany przez miR155 (229). Obserwowane zmiany w żywotności komórek i wzroście guzów in vivo mogą również wynikać ze zmian w regulacji apoptozy. Badania prowadzone przy wykorzystaniu linii komórkowej MDA-MB-231 wykazały, że białko MCPIP1 rozpoznaje i degraduje transkrypty antyapoptotycznych genów Bcl2L1, Bcl2A1, RelB, Birc3 i Bcl3 (181). Wynika z tego, że komórki nowotworowe posiadające niski poziom MCPIP1 charakteryzują się wysokim poziomem przedstawionych genów i zaburzonym procesem programowanej śmierci. Uzyskane przez nas wyniki mogą być addytywnym efektem zwiększonej proliferacji oraz zablokowanej apoptozy przy wyciszeniu bądź mutacji białka MCPIP1. Dłużej żyjące i ciągle dzielące się komórki z wysoką ekspresją genów antyapoptotycznych, tworzą większą masę guza oraz wykazują większą żywotność w testach MTT. Z kolei, nadekspresja MCPIP1 wzmaga apoptozę komórek co może prowadzić nie tylko do spadku masy i objętości guzów, ale i do całkowitej ich regresji. 8.2 Poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych wpływa na aktywność komórek śródbłonka i angiogenezę Zdolność do tworzenia naczyń krwionośnych w obrębie guza nowotworowego umożliwia jego dalszy wzrost dzięki dostarczaniu składników odżywczych oraz tlenu, a także prowadzi do dalszej progresji i tworzenia odległych przerzutów (36). Pomimo udziału tych samych czynników jak w angiogenezie fizjologicznej, naczynia w obrębie guza różnią się od prawidłowych budową ściany i jej rozmiarami. Naczynia w guzie są także nieregularne i niedojrzałe oraz posiadają dużą przepuszczalność (37). ccRCC tworzy guzy silnie unaczynione, charakteryzujące się wysoką ekspresją czynników angiogennych, w tym HIF1α czy VEGF (43). Chroniczne zapalenie jest procesem istotnie zaangażowanym w rozwój angiogenezy. Z jednej strony, wydzielane przez komórki nowotworowe i odpornościowe, czynniki i cytokiny prozapalne mogą rekrutować komórki śródbłonka oraz modulować ekspresję wielu genów zaangażowanych w degradację macierzy zewnątrzkomórkowej, migrację i kiełkowanie nowych naczyń. Z drugiej, aktywacja wielu typów komórek przez te same czynniki, w tym makrofagów, fibroblastów może stabilizować nowo powstałe naczynia (230,231). Białko MCPIP1, jako negatywny regulator stanu zapalnego, może pośrednio kontrolować rozwój unaczynienia. Jednakże, wyniki badań dotyczących aktywności RNazy MCPIP1 w angiogenezie,nie zawsze są jednoznaczne, ze względu na zróżnicowane działanie MCPIP1 w zależności od warunków fizjologicznych lub patologicznych w jakich badanie było prowadzone. W prawidłowych komórkach śródbłonka HUVEC, indukcja ekspresji MCPIP1 czynnikami prozapalnymi, MCP-1, TNFα, IL-1β czy IL-8, powodowała formowanie struktur kapilarnych, przypominających naczynia włosowate (186,206). Z kolei, zastosowanie specyficznego siRNA wyciszającego ekspresję MCPIP1, hamowało ekspresję VEGF i HIF1α oraz formowanie tubul (186,206). Dalsze badania wskazały mechanizm działania białka MCPIP1 w komórkach HUVEC. Roy i wsp. dowiedli, że MCPIP1 rozpoznaje dwa antyangiogenne miRNA miR20b i miR34a, których substratami są odpowiednio HIF1α i SIRT-1 (207). Wykorzystane w doświadczeniach komórki z mutacją punktową D141N, pozbawione aktywności RNazy, nie tworzyły kapilar, a poziom badanych miRNA nie ulegał zmianie w stosunku do kontroli (207). Związek pomiędzy angiogenezą, a białkiem MCPIP1 został zaobserwowany także w mezenchymalnych komórkach macierzystych, pochodzących z mysiego szpiku kostnego, które po nadekspresji MCPIP1 zaczynały różnicować w komórki o fenotypie endotelialnym, wykazujące wysoką ekspresję czynnika von Willebranda, Tie-2 oraz VE-kadheryny. Co ciekawe, wraz ze zwiększonym poziomem MCPIP1 w MSC i stopniem ich zróżnicowania, zmniejszała się proliferacja tych komórek (205). Podobny mechanizm przedstawił Niu i wsp. na ludzkich monocytach pochodzących ze szpiku kostnego po stymulacji MCP-1 bądź transdukcji wektorem niosącym nadekspresję MCPIP1. Komórki traciły ekspresję swoich typowych markerów CD11b i CD14, a nabierały cech komórek endotelialnych z wysokim poziomem Flt-1, Flk-1, CD31 i Tie-2. Przeszczepienie takich komórek do kończyny z niedokrwieniem powodował proces odtworzenia uszkodzonych naczyń krwionośnych (185). Wydaje się, że wysoki poziom białka MCPIP1 w prawidłowych komórkach endotelialnych pełni rolę induktora angiogenezy, poprzez pozytywne regulowanie wielu markerów typowych dla śródbłonka i hamowanie inhibitorowych miRNA. Aby określić związek pomiędzy poziomem białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych, a rozwojem unaczynienia, komórki Caki-1 i Caki-2 podano podskórnie do myszy z upośledzonym układem odporności. Rozwój unaczynienia obserwowano zarówno w trakcie trwania doświadczenia, za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości, jak i po jego zakończeniu, wykorzystując metody barwienia markera naczyń CD31. Guzy, z wyciszonym poziomem białka MCPIP1 lub jego nieaktywną formą charakteryzował znaczący rozwój unaczynienia, który sugerował, że MCPIP1 reguluje ekspresję i sekrecję ważnych w procesie angiogenezy czynników. W obrębie guza ze względu na niekontrolowane podziały komórkowe i niewystarczające unaczynienie często dochodzi do spadku stężenia tlenu, czego efektem jest hipoksja, lokalna nekroza i naciek komórek układu immunologicznego (37). Wyniki uzyskane przez Ligeze i wsp. wskazały, że hipoksja, wpływa na spadek poziomu białka MCPIP1 w komórkach Caki-1 (212). Być może, zwiększony napływ komórek immunologicznych jest efektem obniżenia poziomu MCPIP1 w warunkach hipoksji. Kwestią wymagającą dalszego wyjaśnienia pozostaje pytanie, czy komórki nowotworowe pozbawione ekspresji MCPIP1, w sposób niekontrolowany wydzielają cytokiny takie jak IL-6 oraz IL-1β, które rekrutują makrofagi lub limfocyty w miejsce hipoksji. Kolejne przeprowadzone doświadczenia wykazały, że medium znad komórek nowotworowych posiadających obniżony poziom MCPIP1, aktywowało śródbłonek do migracji, tworzenia kapilarnych struktur i fosforylacji głównego markera integralności naczyń VE-kadheryny. Z kolei, wysoki poziom MCPIP1 w komórkach nowotworowych nie wpływał istotnie na komórki endotelialne. Na podstawie otrzymanych wyników, można wysnuć wniosek, że poziom białka MCPIP1 w komórkach nowotworowych ma istotne znaczenie w regulacji wydzielania cytokin zaangażowanych w aktywację komórek śródbłonka i proces angiogenezy. Powyższą hipotezę potwierdzają wyniki Ligęzy i wsp., gdzie wykazano, że MCPIP1 negatywnie reguluje poziom czynników i cytokin proangiogennych w warunkach głodu tlenowego. Dodatkowo, wraz z obniżeniem ilości tlenu rosła ekspresja VEGFA, GLUT1, IL-6 i IL-8 (212). Dalsze badania pokazały, że nadekspresja MCPIP1 w warunkach hipoksji hamuje produkcję zarówno HIF1α jak i HIF2α, a także ekspresję IL6, VEGFA i GLUT1. Obserwowany spadek poziomu VEGFA i GLUT1 mógł być spowodowany bezpośrednio aktywnością RNazy MCPIP1, lub wynikiem obniżenia poziomu czynników HIF, które regulują ich transkrypcję w warunkach hipoksji. Co ciekawe, autorzy wykazali, że HIF2α, negatywnie regulował poziom MCPIP1 w warunkach hipoksji (212). Analiza wyników RNA-Seq wykazała, że poziom VEGF znacząco spadał w komórkach posiadających podwyższony poziom MCPIP1 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (213). Dalsze badania wykazały, że MCPIP1 negatywnie reguluje transkrypty czynników odpowiedzi na hipoksję w tym SPHK1 ((and. Sphingosine Kinase 1), który promuje proliferację komórek, a podczas hipoksji reguluje poziom HIF1α i HIF2α), ENPP2 ((ang. Ectonucleotide Pyrophopsphatase/Phosphodiesterase damily member 2) również stymuluje proliferację, a także chemotaksję i angiogenezę w odpowiedzi na hipoksję), PLOD2 (ang. Procollagen-Lysine 2-Oxoglutarate 5-Dioxygense 2) i MMP2. MMP2 wraz z PLOD2 degradują macierz zewnątrzkomórkową co sprzyja rozwojowi unaczynienia, progresji i przerzutowaniu (213). Ostatnie badania przedstawione przez Górkę i wsp. pokazały, że MCPIP1 pozytywnie reguluje ekspresję genów supresorowych RECK, PTEN i TIMP3 z których RECK i TIMP3 negatywnie kontrolują angiogenezę przez obniżanie szeregu metaloproteinaz, VEGF i VEGFR2. Autorzy wykazali następnie, że nadekspresja MCPIP1 powodowała spadek MMP2 i MMP9 in vivo (214). Warunki hipoksyjne promują nowotworzenie oraz pomagają utrzymać cechy nowotoworowych komórek macierzystych (232). Co więcej, aktywowane w hipoksji czynniki HIF mogą, w przypadku wielu nowotworów złośliwych, promować przejście komórki z metabolizmu tlenowego na glikolizę (efekt Warburga), (233). W dalszym etapie badań potwierdzono obserwacje Ligęzy i wsp. i wykazano, na liniach Caki-1 i Caki-2, że spadek MCPIP1 powoduje wzrost ekspresji IL-6, IL-8 i VEGF i wyższy poziom białek wydzielanych do pożywki (212). Podobnie, nadekspresja białka nieaktywnego enzymatycznie prowadziła do podwyższonego poziomu ekspresji i sekrecji IL-6, IL-8 i VEGF w warunkach normalnego stężenia tlenu i niedotlenienia. Czynniki te mogą odgrywać istotną rolę w procesie ukrwienia jasnokomórkowego raka nerki. VEGF należy do typowych czynników proangiogennych, a IL-8 może, niezależnie od obecności VEGF, łączyć się z receptorem VEGFR2 i prowadzić do fosforylacji i internalizacji VE-kadheryny, a w konsekwencji do migracji komórek endotelialnych i wzmożonej angiogenezy (234). Regulowana przez białko MCPIP1, prozaplana IL-6, stymuluje angiogenezę w pośrednio przez aktywację czynnika transkrypcyjnego STAT3, który reguluje transkrypcję wielu genów w tym VEGF (62). Innym znanym induktorem angiogenezy, zaangażowanym również w progresję nowotworu jest SDF-1, którego ekspresję reguluje m.in. VEGF, HIF1α oraz czynnik transkrypcyjny c/EBPβ (20,53,215). Wykazano, że SDF-1 powoduje rekrutację komórek mieloidalnych CXCR4 ze szpiku kostnego oraz komórek progenitorowych śródbłonka indukując w ten sposób angiogenezę nowotworową (65). Rezultatem obniżenia poziomu MCPIP1 w komórkach ccRCC, była podwyższona ekspresja SDF-1 i CXCR4 in vitro oraz in vivo. Co ciekawe, nadekspresja dzikiej formy MCPIP1 hamowała ekspresję SDF-1, podczas gdy mutacja D141N nie wpływała na poziom SDF-1, co sugeruje, że białko MCPIP1 nie reguluje bezpośrednio ekspresji SDF-1. Otrzymane wyniki wskazują, że MCPIP1 dzięki swojej aktywności RNazy reguluje poziom czynnika transkrypcyjnego c/EBPβ, który kontroluje ekspresję SDF-1. Kwestią wymagającą wyjaśnienia pozostało pytanie, jak zmienia się poziom MCPIP1 w komórkach śródbłonka po stymulacji medium kondycjonowanym znad komórek nowotworowych. Takie doświadczenie stanowiłoby most łączący dane literaturowe dotyczące roli MCPIP1 w komórkach śródbłonka jako induktora angiogenezy, z wynikami przedstawionymi w niniejszej pracy pokazującymi, że niski poziom MCPIP1 w komórkach nowotworowych zwiększa ekspresję czynników proangiogennych. Najprawdopodobniej, komórki nowotworowe charakteryzujące się niskim poziomem MCPIP1 wydzielają cytokiny indukujące ekspresję MCPIP1 w komórkach endotelialnych, aktywując je do migracji i angiogenezy. Jednak przedstawiona hipoteza wymaga dalszych badań. 8.3 Białko MCPIP1 negatywnie reguluje aktywność migracyjną i progresję nowotworu Zdolność komórek nowotworowych do aktywnej migracji i tworzenia odległego przerzutu w nowej niszy jest ich najniebezpieczniejszą cechą i jednocześnie główną przyczyną śmierci pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą. Nabywanie przez komórkę epitelialną specyficznego fenotypu mezenchymalnego i cech umożliwiających migrację i inwazję jest znane jako przejście epitelialno-mezenchymalne (EMT) (98). Pierwszym etapem EMT jest utrata połączeń międzykomórkowych i spadek ekspresji e-kadheryny, która z kolei jest negatywnie kontrolowana przez szereg czynników transkrypcyjnych należących do rodziny ZEB i Snail. Następnie, dochodzi do zmiany polaryzacji komórki, ekspresji czynników zaangażowanych w ruchliwość i rearanżację cytoszkieletu: wimentyny, n-kadheryny czy β-kateniny (235). Zmiany powodowane EMT mają charakter przejściowy opierający się głównie na zmianach epigenetycznych i modyfikacjach potranskrypcyjnych, często zależnych od warunków otaczającego mikrośrodowiska (236). Tak więc, gdy komórka znajdzie się w odpowiedniej niszy, może wystąpić proces odwrotny do EMT, czyli przejście mezenchymalno-epitelialne, co sprzyja tworzeniu nowego, wtórnego ogniska. Badania in vivo wykazały, że obniżony poziom MCPIP1, aktywuje komórki do opuszczenia pierwotnego guza i migracji do krwioobiegu, co w konsekwencji powoduje powstawanie większej ilości przerzutów w płucach. Z kolei, ilość przerzutów obserwowanych w grupie z nadekspresją białka MCPIP1 była najmniejsza. Podobne wyniki wskazali Lu i wsp. na komórkach MDA-MB-231, które podane do myszy immunokompetentnych, po indukcji nadekspresji MCPIP1 doksycykliną, charakteryzowały się ok 75% spadkiem ilości przerzutów do płuc (181). Wyniki zamieszczone w pracy wykazują, że komórki z wyciszonym białkiem MCPIP1 migrują szybciej w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Dodatkowe wyniki przedstawione przez naszą grupę ujawniły, że nadekspresja MCPIP1 powodowała spadek ruchliwości o ponad 90% w porównaniu z kontrolą (237). Kolejne doniesienie potwierdziło, iż białko MCPIP1 negatywnie reguluje aktywność migracyjną zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Autorzy zidentyfikowali gen ZC3H12A jako istotnie zaangażowany w kontrolę ruchliwości i dowiedli negatywną korelację pomiędzy bazowym poziomem MCPIP1, a aktywnością migracyjną w różnych liniach komórkowych raka piersi (238). Co więcej, po wprowadzeniu wektora z nadekspresją MCPIP1 do linii MDA-MB-231 odsetek komórek o wysokim potencjale migracyjnym drastycznie spadał. Dodatkowo, wysoki poziom MCPIP1 powodował spadek genów zaangażowanych w ścieżkę sygnalizacyjną TGFβ, w tym NOG, ID4, SMAD4 i SMAD5 co sugeruje, że supresja mobilności komórek może zależeć od, negatywnie regulowanej przez MCPIP1, ścieżki TGFβ (238). Należy zaznaczyć, że aktywacja szlaku TGFβ odgrywa kluczową rolę w procesie EMT, regulując ekspresję czynników transkrypcyjnych Snail, oraz markerów fenotypu mezenchymalnego N-CAD, FN1, czy VIM oraz aktywując szlak kinaz MAPK i PI3K/Akt (106). Jednym z czynników odpowiedzialnych za przerzutowanie wielu typów nowotworów jest receptor c-Met. Zwiększona aktywność migracyjna komórek i wyższa ilość przerzutów w płucach po wyciszeniu MCPIP1 może wynikać z aktywacji procesu EMT oraz z aktywacji receptora c-Met. Otrzymane wyniki wskazały, że badane linie komórkowe ccRCC, po wyciszeniu MCPIP1, charakteryzowały się spadkiem e-kadheryny i wyższym poziomem β-kateniny, wimentyny, kinazy Src i receptora c-Met, a także czynników transkrypcyjnych Snail i ZEB2 w porównaniu z kontrolą. Dalsze badania wykazały, że podobne zmiany zachodzą również w prawidłowych komórkach HEK293, co sugeruje, że brak białka MCPIP1 może prowadzić do nabywania przez komórki agresywnego fenotypu i w konsekwencji aktywować proces inicjacji nowotworowej (237). Z kolei, wysoki poziom MCPIP1 pełni rolę protekcyjną zmniejszając ekspresję markerów EMT, ruchliwość i ilość przerzutów (237). Liczne doniesienia wskazują, że kluczowe białko odpowiedzi zapalnej NF-κB, odgrywa istotną rolę w procesie EMT m. in. poprzez wiązanie się do promotora wimentyny (108). Można przypuszczać, że białko MCPIP1 rozpoznając i degradując NF-κB, w sposób pośredni przyczynia się do spadku poziomu wimentyny. Receptor c-Met, w wyniku stymulacji swoim ligandem HGF, aktywuje wiele procesów komórkowych m.in. proliferację, migrację czy utrzymanie niezróżnicowanego fenotypu komórek macierzystych (218). Gen MET jest zaliczany do protoonkogenów, a jego nadekspresja jest obserwowana w wielu typach nowotworów (77,78,80). Receptor c-Met został również pokazany jako aktywator procesu EMT działając na szlaki sygnalizacyjne MAPK i PI3K/Akt czy bezpośrednio na szlak Wnt/β-katenina (239). Wykazano także, że obniżenie poziomu receptora c-Met indukuje ekspresję e-kadheryny, głównego markera fenotypu epitelialnego (84). Zaobserwowane zmiany w poziomie i fosforylacji receptora c-Met pod wpływem białka MCPIP1 pozwalają przypuszczać, że jego transkrypt może stanowić substrat dla aktywności RNazy MCPIP1. Istotnie, obecność mutacji w domenie PIN białka MCPIP1, która całkowicie znosi jego aktywność enzymatyczną, prowadziła do wzrostu poziomu transkryptu i białka dla c-Met. Co więcej, istnieją doniesienia wskazujące na możliwość zaangażowania szlaków receptorów c-Met i CXCR4 w proces EMT. Dowiedziono, że oba receptory negatywnie regulują poziom e-kadheryny i powodują wzrost ekspresji Slug. Receptory te również, wspólnie zwiększają poziom czynnika STAT3, który reguluje transkrypcję ZEB1 (114). Sama oś SDF-1/CXCR4, także wpływa na powstawanie przerzutów (240). W świetle powyższych danych, MCPIP1 wydaje się być nadrzędnym regulatorem EMT. Uzyskane wyniki wskazują na szerokie działanie MCPIP1, który regulując poziom receptorów CXCR4, c-Met, oraz czynnika transkrypcyjnego STAT3 może wpływać na fenotyp komórek nowotworowych i w konsekwencji ich dalsze losy. Co ciekawe, także hipoksja może stymulować EMT, głównie przez aktywację czynników transkrypcyjnych HIFα (109). Wykazano, że HIF1α aktywuje TGFβ w komórkach wątroby podczas fibrozy oraz szlak Wnt/β-katenina w raku wątroby (241,242). HIF1α, przez wiązanie się do fragmentu HRE promotora czynników transkrypcyjnych Twist, Snail, Slug, ZEB1 i ZEB2, promuje ich ekspresję (109,243,244). Dodatkowo, Cheng i wsp. wykazali, że NF-κB jest aktywowany przez HIF1α w warunkach hipoksji, co z kolei, promowało związany z EMT spadek e-kadheryny i wzrost n-kadheryny w raku trzustki (245). Również szlak sygnalizacyjny Notch, który także jest zaliczany do głównych induktorów EMT, promuje tworzenie przerzutów zależnie od aktywności HIFα, STAT3 oraz miR200 (246–248), które są negatywnie regulowane przez MCPIP1. Powyższe obserwacje sugerują, że białko MCPIP1 pełni bezpośrednią rolę w kontroli progresji nowotworowej, migracji i EMT przez regulację poziomu transkryptów czynników wpływających na progresję nowotworu: c-Met, CXCR4, NF-κB, STAT3 czy HIFα. Co więcej, MCPIP1 może działać również pośrednio, przyczyniając się do regulacji poziomu białek i czynników transkrypcyjnych charakterystycznych dla EMT w tym: wimentyny, e-kadheryny, β-kateniny, Snail i ZEB2. 8.4 Białko MCPIP1 stanowi czynnik prognostyczny w ccRCC Do tej pory ukazało się kilka prac wskazujących na rolę białka MCPIP1 w procesie nowotworzenia. W raku piersi wykazano znaczący spadek ekspresji MCPIP1 w tkance nowotworowej w porównaniu ze zdrową (181). Dalsza analiza wykazała, że guzy potrójnie negatywne (ER-/PR-/HER2-) charakteryzujące się gorszymi rokowaniami posiadały mniej MCPIP1 niż potrójnie pozytywne (181). Podobne wyniki przedstawił Ligęza i wsp. w jasnokomórkowym raku nerki, gdzie zarówno poziom transkryptu, jak i białka MCPIP1 w tkance nowotworowej był znacząco niższy w porównaniu z odpowiadającą mu tkanką prawidłową (212). Analizy wielu nowotworowych linii komórkowych wykazały, że charakteryzowały się one niskim, często wręcz znikomym poziomem MCPIP1, a wraz ze spadkiem poziomu MCPIP1 rosła ich agresywność (210,249). W kolejnym etapie pracy doktorskiej, sprawdzono, jak zmienia się poziom białka MCPIP1 wraz z progresją ccRCC. Wykazano, że wraz z zaawansowaniem choroby poziom białka MCPIP1 maleje. Dodatkowo, poziom genu ZC3H12A był na bardzo niskim poziomie we wszystkich badanych próbkach niezależnie od stopnia progresji. Natomiast, ekspresja genów zaangażowanych w EMT, migrację i inwazyjność takich jak? HGF, IL6, LIF, ZEB2 oraz MET, a także fosforylacja białek Src, Yes, β-katenina i STAT3 rosły wraz z postępem choroby. Górka i wsp. wykazali, że u pacjentów z ccRCC wraz z rozwojem nowotworu spada poziom genów supresorowych TIMP3, RECK i PTEN, a ich ekspresja jest pozytywnie regulowana przez białko MCPIP1 zarówno in vitro jak i in vivo (214). W świetle uzyskanych wyników i dostępnych danych literaturowych, można zasugerować, że ZC3H12A pełni rolę genu supresorowego, który ulega znaczącemu obniżeniu w tkance nowotworowej oraz że białko MCPIP1 może pełnić rolę czynnika prognostycznego stanowiącego o przyszłych rokowaniach pacjentów. Dane literaturowe wskazują, że stadium zaawansowania choroby koreluje z proliferacją komórek śródbłonka i powierzchnią naczyń. Także wyniki naszej grupy pokazują, że na każdym etapie progresji, guzy jasnokomórkowego raka nerki posiadają wysoki poziom markera naczyń CD31, a wraz z rosnącym stadium rozwoju ccRCC wg skali Fuhrman, rośnie powierzchnia światła naczyń. Dodatkowo, czwarte stadium zaawansowania klinicznego charakteryzowało się największą ilością funkcjonalnych naczyń krwionośnych z wysoką ekspresją CD31 (237). Yao i wsp. na podstawie swoich badań zasugerowali, że w przypadku ccRCC, markerem prognostycznym nie może być tylko ilość CD31 czy gęstość mikronaczyń, ale także stopień ich zróżnicowania i dojrzałości. Wskazali, że obecność zróżnicowanych naczyń CD31+CD34+, pokrytych perycytami, które biorą udział w dojrzewaniu i stabilizacji naczyń krwionośnych jest pozytywnym czynnikiem prognostycznym dla pacjentów z ccRCC. Natomiast, duża ilość niefunkcjonalnych naczyń (niezróżnicowanych) pozytywnych dla CD31, z małym lub bez niego, oraz nie posiadających perycytów na powierzchni, charakteryzuje guzy o wyższym stopniu zaawansowania i gorszymi rokowaniami (250). Nasze badania wskazują co prawda, na korelację ilości naczyń i wielkości światła z progresją choroby, jednak na podstawie uzyskanych wyników nie można stwierdzić, czy należą one do grupy zróżnicowanych, dojrzałych naczyń (237). Dalsza analiza wyników mikromacierzy wykazała, że poziom genów zaangażowanych w unaczynienie jest generalnie wysoki we wszystkich próbkach, ale najwyższy w początkowych stadiach, co może sugerować, że stosowanie inhibitorów angiogenezy jako terapii leczniczej powinno rozpocząć się w momencie diagnozy. Obecność receptora c-Met jest uznawana za zły czynnik prognostyczny w przypadku wielu typów nowotworów, w tym ccRCC. W rozwoju mięsaka prążkowanokomórkowego (RMS) autorzy wykazali, że wysoka aktywność HGF i receptora c-Met prowadzi do zwiększonej proliferacji oraz przerzutowania przy jednoczesnym zahamowaniu apoptozy (122). Podobnie, w wynikach Cieśli i wsp. pokazano, że c-Met, HGF a także CXCR4 i SDF-1 są znacząco wyższe w bardziej agresywnej linii RMS (251). Co więcej, w ccRCC wysoki poziom c-Met jest powiązany z progresją choroby i obecnością przerzutów (90). W przypadku badanej puli pacjentów wykazano, że wraz z progresją choroby rośnie poziom receptora c-Met jak również jego fosforylacji. Negatywna korelacja obserwowana między receptorem c-Met i białkiem MCPIP1 w próbkach pacjentów z ccRCC, może być wynikiem rozpoznawania przez MCPIP1 transkryptu genu MET jako specyficznego substratu, co potwierdzają przedstawione wcześniej wyniki uzyskane w badaniach na linii komórkowej Caki-1. Przypuszczalnie jednak, nie jest to główny mechanizm w wyniku którego MCPIP1 obniża poziom c-Met w ccRCC. Czynnik transkrypcyjny NF-κB, który jest negatywnie regulowany przez białko MCPIP1, kontroluje ekspresję c-Met poprzez wiązanie się do promotora genu MET i aktywację transkrypcji (176,252). Można więc sądzić, że receptor c-Met jest regulowany przez MCPIP1 bezpośrednio dzięki aktywności RNazy lub pośrednio przez czynnik transkrypcyjny NF-κB. 8.5 Oporność na sunitinib i sorafenib jest regulowana przez białko MCPIP1 i receptor c-Met Unaczynienie guza jest krytycznym krokiem podczas rozwoju nowotworu ponieważ promuje miejscową progresję guza i rozprzestrzenianie się przerzutów. Z powodu częstych mutacji genu supresorowego VHL, ccRCC tworzy zazwyczaj niezwykle unaczynione guzy, głównie ze względu na akumulację czynników transkrypcyjnych HIFs i nadmiernego wydzielania czynników proangiogennych, niezależnie od warunków tlenowych (10). W przypadku ccRCC opisano dotychczas szereg genów, mających istotne znaczenie w rozwoju choroby, które mogą stanowić potencjalny cel terapeutyczny (10). Indywidualne podejście do pojedynczych przypadków klinicznych i dobieranie terapii celowanych pod konkretnego pacjenta można już zaobserwować śledząc badania dotyczące terapii przeciwnowotworowych. Zdolność do tworzenia naczyń krwionośnych przez guz nowotworowy, może być wykorzystywana do jego niszczenia, poprzez zastosowanie leków hamujących działalność czynników angiogennych. Do tej pory, opracowano i dopuszczono do użytku kilka leków działających przede wszystkim jako inhibitory angiogenezy (127). Sunitinib i sorafenib blokują liczne receptory kinaz tyrozynowych, które biorą udział w angiogenezie, wzroście i progresji nowotworowej. Sunitinib (STUTENT®, Pfizer In.) został zaprojektowany jako inhibitor receptorów PDGFRα, PDGFRβ, VEGFR1, VEGFR2 i VEGFR3, receptorów czynnika komórek pnia (ang. KIT Proto-Oncogen, KIT), kinazy tyrozynowej podobnej do Fms-3 (ang. Fms Related Receptor Tyrosine Kinase 3, FLT3), receptorów czynnika powstawania kolonii (ang. Colony Stimulating Factor 1 Receptor, CSF-1R) i receptorów glejopochodnego czynnika neutroficznego (ang. Ret proto-oncogene, RET) (253). Sorafenib (NEXAVAR®, Bayer HealthCare) z kolei, hamuje aktywność czynników zlokalizowanych w komórkach nowotworowych CRAF, BRAF, c-KIT i FLT3, oraz w komórkach śródbłonka CRAF, VEGFR2, VEGFR3 i PDGFRβ (134). Pomimo hamowania specyficznych szlaków sygnałowych w komórkach nowotworowych, mediana czasu przeżycia wolnego od choroby (ang. Progression-free survival, PFS) pacjentów z ccRCC, podczas stosowaniu sunitinibu wynosi jedynie 11,4 miesiąca, a w grupie placebo 5,5 miesiąca oraz 5,6 miesiąca w grupie otrzymującej sorafenib w porównaniu do 2,9 miesiąca w grupie przyjmującej placebo (133,135). Ponadto, znacząca grupa pacjentów z ccRCC nie reaguje na terapie celowane, podczas gdy w innych przypadkach, po początkowym okresie poprawy, następuje nawrót choroby spowodowany wykształceniem silnej oporności na leki. Głównymi mechanizmami leżącymi u podstaw oporności są zmiany epigenetyczne i mutacje zachodzące w komórkach nowotworowych prowadzące do zmian konformacyjnych białek rozpoznawanych przez lek, jak również aktywacja alternatywnych szlaków sygnałowych, będąca metodą kompensacji zablokowanych receptorów (139). W ostatniej części pracy doktorskiej zbadano jaki może być potencjalny mechanizm nabierania oporności przez komórki ccRCC, na stosowane w terapii sunitinib i sorafenib. Ze względu na częste mutacje genu MET i nadmierną fosforylację receptora c-Met w ccRCC, oraz z uwagi na fakt, iż c-Met pełni istotną rolę w nabieraniu oporności na sunitinib, w badaniach użyto również jego specyficznego inhibitora, SU11274. Wykazano, że 7-dniowe traktowanie komórek lekami bądź inhibitorem c-Met, jedynie w przypadku sunitinibu powoduje istotny spadek żywotności w obu badanych liniach komórkowych. Nieznaczny spadek można było również zaobserwować po inhibicji fosforylacji receptora c-Met. Jednak stymulacja sorafenibem komórek Caki-2 nie wpływała w żaden sposób na spadek żywotności czy proliferacji, co jest o tyle zaskakujące, że sorafenib powinien mieć działanie przeciw-proliferacyjne, ze względu na blokowanie białek RAF i hamowanie dalszej ścieżki kinaz MAPK (134). Dalsza analiza cyklu komórkowego wykazała, najwyższy odsetek komórek w fazie G2/M w grupie traktowanej sorafenibem. Tymczasem w fazie sub-G0 (apoptotycznej) najwyższy odsetek komórek obserwowany był w grupie stymulowanej sunitnibem, co może sugerować, że komórki wchodzą w stan uśpienia (senesencji) (254). Kolejne doświadczenia wykazały znaczące zmiany w morfologii komórek po zastosowaniu sunitinibu i sorafenibu. Komórki po stymulacji sunitinibem zaokrąglały się oraz rosły w zwartych grupach przypominających klony posiadając fenotyp epitelialny. Co ciekawe, otrzymane wyniki stanowią przeciwieństwo danych literaturowych. Hwang i wsp. oraz Hammers i wsp. wykazali, że oporność komórek raka nerki na sunitinib jest spowodowana zmianą fenotypu na mezenchymalny i zwiększoną ekspresją genów związanych z EMT: CD44, SNAI2, CLDN1, ZEB1, ZEB2 i TWIST (142,255). Z kolei, zastosowanie sorafenibu, miało zupełnie inny efekt na fenotyp komórek ccRCC, które charakteryzowały się bardzo wydłużonym kształtem przypominającym fibroblasty. Komórki oporne na sorafenib także niechętnie się łączyły preferując indywidualną migrację. W komórkach raka wątroby wykazano, że mechanizm oporności na sorafenib także opierał się na zmianie fenotypu na mezenchymalny, spadkiem poziomu e-kadheryny i wzrostem wimentyny, Snail a także MMP9 w komórkach raka wątroby (256). Dostępne dane literaturowe wskazują, że jednym z głównych czynników zaangażowanych w rozwój oporności na badane leki jest receptor c-Met. Jak wspomniano wcześniej, receptor c-Met bierze udział w kontroli licznych procesów takich jak EMT, przerzutowanie oraz angiogeneza. Wykazano, że receptor ten kontroluje ekspresję VEGF przez aktywację ścieżek sygnalizacyjnych IL-6/STAT3, PI3K/Akt oraz kinaz MAPK (61). Wydaje się więc, że podczas stosowania inhibitorów angiogenezy, następuje aktywacja alternatywnych receptorów w tym c-Met, jako mechanizmu kompensacyjnego. Istnieje szereg doniesień wskazujących na aktywację receptora c-Met w komórkach opornych na sunitinib. Zazwyczaj wraz z fosforylacją c-Met obserwowano także wzrost markerów EMT oraz zwiększoną inwazyjność in vivo oraz in vitro (144,147,148). Co ciekawe, również komórki podścieliska odpowiadały na stosowany sunitinib poprzez zwiększoną ekspresję HGF (148). Z kolei, zastosowanie kombinacji sunitinibu ze specyficznym inhibitorem c-Met, bądź wyciszeniem c-Met, uwrażliwiało komórki na lek co wskazało, że oporność na sunitinib jest zależna od receptora c-Met. Zaobserwowano także równoczesną aktywację receptorów AXL oraz EGFR wraz z c-Met (145,257). Pinato i wsp. wykazali, że podobnie może wyglądać mechanizm oporności na sorafenib, który polegał na aktywacji receptorów AXL i c-Met, a komórki charakteryzowały się wysokim poziomem markerów EMT (216). Wyniki przedstawione w niniejszej pracy potwierdziły, że zarówno stymulacja sunitinibem jak i sorafenibem charakteryzowała się wysoką fosforylacją receptora c-Met. Jednak nowością było wykazanie spadku poziomu MCPIP1 w komórkach opornych in vitro jak i in vivo. Co niezwykle interesujące, zastosowanie inhibitora receptora c-Met, SU11274, oprócz hamowania fosforylacji receptora, powodowało wzrost poziomu białka MCPIP1, co wskazuje na zależność MCPIP1 od aktywności c-Met. Ciekawym wynikiem, wymagającym jednak dalszych badań jest efekt połączenia SU11274 wraz z sorafenibem, który powodował całkowity brak fosforylacji receptora c-Met. Być może, zastosowanie cabozantinibu, który wykazuje podobną specyficzność substratową co sunitinib czy sorafenib oraz dodatkowo blokuje receptor c-Met, spowodowałoby wzrost poziomu MCPIP1 i lepszą odpowiedź nowotworu na terapię. Wydaje się więc, że komórka nowotworowa w obecności leków próbuje zwiększyć swoje szanse na przeżycie przez aktywację receptora, który jest istotnie zaangażowany w progresję choroby oraz znaczącą redukcję białka odpowiedzialnego za utrzymanie homeostazy. Istotną rolę w oporności na sorafenib może pełnić również ścieżka IL-6/STAT3 (258). Oporne na sorafenib komórki raka wątroby nie tylko wykazywały spadek e-kadheryny oraz wzrost markerów EMT, ale także wzrost markerów macierzystych komórek nowotworowych (ang. Cancer Stem Cells, CSC) CD44 i Oct3/4 oraz IL-6 i STAT3. Dodatkowo, wyciszenie IL-6 w komórkach opornych powodowało spadek poziomu wymienionych białek i wolniejszy wzrost guzów in vivo. Autorzy wysunęli wniosek, że zablokowanie IL-6 wraz z zastosowaniem sorafenibu ma efekt przeciw-nowotworowy (258). Wiedząc, że białko MCPIP1 negatywnie reguluje zarówno IL-6 jak i STAT3, można uznać, że to właśnie spadek białka MCPIP1 w komórkach opornych na sorafenib wpływa na wzrost ekspresji IL-6 i aktywację dalszej kaskady sygnałowej. Wiele badań dotyczących oporności na sunitinib pokazuje, że komórki tracą ekspresję e-kadheryny, a zyskują ekspresję markerów mezenchymalnych (255,259). Tymczasem, w przedstawionych wynikach zarówno in vitro jak i in vivo, poziom e-kadheryny gwałtownie rośnie, a razem z nim poziom β-kateniny. Co ciekawe, oprócz puli cytoplazmatycznej β-kateniny zaangażowanej w szlak Wnt, występuje również pula błonowa, gdzie β-katenina, wchodzi wraz z e-kadheryną i α-kateniną w skład kompleksu budującego połączenia międzykomórkowe (260). Wysoki poziom e-kadheryny i lokalizacja błonowa β-kateniny mogą powodować obserwowane zmiany w fenotypie komórek po stymulacji sunitinibem. Obserwowane zmiany w proliferacji, cyklu komórkowym i fenotypie w komórkach traktowanych sunitinibem, mogą świadczyć o wejściu komórki w stan uśpienia. W 1965 roku L. Hayflick wykazał, że prawidłowe komórki mają ograniczoną zdolność do podziałów, po których następuje zatrzymanie cyklu komórkowego. To zjawisko zostało nazwane uśpieniem (ang. Senescence) (261). Co ciekawe, uśpienie komórek może również wpływać na rozwój nowotworów, poprzez regulację mikrośrodowiska oraz być sposobem ucieczki przed radio- lub chemioterapią (217). Komórki, które weszły w stan uśpienia, pozostają żywe, ale nie dzielą się. Obserwuje się również pojawienie specyficznego fenotypu sekrecyjnego (ang. Senescence-associated secreted phenotype, SASP), który moduluje mikrośrodowisko guza. Uśpione komórki mogą wydzielać także metaloproteinazy promujące inwazję i tworzenie przerzutów. Cechami komórek uśpionych jest wzrost poziomu inhibitorów cyklu komórkowego p21 lub p16 oraz aktywności enzymu lizosomalnego β-galaktozydazy (ang. Senescent-associated β-galactosidase, SA-β-gal) (217). W przedstawionych badaniach wykazano, iż komórki oporne na sunitinib posiadają bardzo wysoki sygnał po barwieniu SA-β-gal. Wynik ten potwierdził, że stymulacja sunitinibem prowadzi do uśpienia komórek. Być może, obserwowany spadek poziomu białka MCPIP1 również sprzyja uśpieniu, przez brak kontroli nad ekspresją najważniejszych SASP: IL-1β, IL-6 oraz IL-8. Co ciekawe, SASP jest regulowany również przez czynniki transkrypcyjne NF-κB oraz c/EBPβ, które stanowią substrat dla aktywności RNazy białka MCPIP1 (262,263). Zarówno uśpienie i obecność SASP, jak i fenotyp mezenchymalny oraz fosforylacja receptora c-Met istotnie wpływają na progresję nowotworową i tworzenie odległych przerzutów. Obserwowany wzrost ilości mikroprzerzutów do płuc w grupie opornej na sorafenib jest spowodowany głównie wzrostem poziomu receptora c-Met, EMT i wzrostem aktywności proliferacyjnej. Pomimo, iż populacja komórek GFP+ opornych na sunitinib jest dużo mniejsza niż komórek dzikich w guzie, ilość przerzutów rośnie w porównaniu z grupą kontrolną. Wynik ten sugeruje, że komórki oporne wydzielają duże ilości czynników modulujących mikrośrodowisko guza i sprzyjających angiogenezie i migracji. Dodatkowo, zmiany w morfologii wpływające na formowanie struktur przypominających klony może także ułatwiać osiedlenie się w nowej niszy. Jak wspomniano w części „Wstęp”, klastry komórkowe posiadają wysoki potencjał inwazyjny ułatwiający przerzutowanie i składają się zarówno z komórek o fenotypie epitelialnym jak i mezenchymalnym. Dzięki obecności białek regulujących połączenia komórkowe, takich jak e-kadheryna, klaster nie rozpada się, natomiast komórki mezenchymalne stanowią jego siłę napędową (123). Większa ilość przerzutów oraz łączenie się komórek w grupy sugeruje, że komórki oporne na sunitinib migrują kolektywnie w klastrach posiadających wysoki poziom e-kadheryny i fosforylację receptora c-Met, który zwiększa inwazyjność grupy. Obserwowany spadek poziomu białka MCPIP1 w komórkach opornych na sunitinib i sorafenib, skłonił do poszukiwania czynnika, który jest odpowiedzialny za przedstawione zmiany. Iwasaki i wsp. wykazali nowy mechanizm degradacji białka MCPIP1, polegający na rozpoznawaniu przez kinazę IKKβ motywu DGSXXS białka MCPIP1, które następnie ulegało fosforylacji w pozycjach S435 oraz S439, ubikwitynacji i degradacji proteasomalnej (195). Jednakże, przedstawione w pracy doktorskiej wyniki nie potwierdziły opublikowanych doniesień. Stymulacja IL-1β powodowała wzrost fosforylacji kinazy IKKβ, ale również wzrost poziomu białka MCPIP1. Enzym GSK3β, który zaangażowany jest w negatywną regulację wielu białek w tym β-kateniny, również rozpoznaje motyw DGSXXS białka MCPIP1 (264). Po zastosowaniu specyficznego inhibitora GSK3β – LiCl wykazano znaczący wzrost poziomu MCPIP1 i spadek fosforylacji receptora c-Met nawet w obecności sunitinibu lub sorafenibu. Dodatkowo, tygodniowa stymulacja lekami powodowała wzrost poziomu GSK3β. Powyższe wyniki sugerują, iż aktywne białko GSK3β negatywnie reguluje poziom MCPIP1. W ostatnim etapie badań, zaobserwowano, że nadekspresja białka MCPIP1 powoduje spadek poziomu receptora c-Met, czynnika STAT3 i kinazy Src, również po stymulacji sunitinibem i sorafenibem. Wskazuje to na protekcyjną rolę MCPIP1 i przyszłe możliwości w wykorzystaniu tego białka, jako metody terapeutycznej. Obecnie coraz większą uwagę poświęca się badaniu oddziaływań pomiędzy komórkami nowotworowymi, a komórkami podścieliska, śródbłonka czy układu immunologicznego, które pełnią istotną rolę w rozwoju i progresji nowotworu. Poznanie funkcji białek biorących udział w procesach zachodzących w obrębie guza jest niezbędne do opracowania nowych możliwości terapeutycznych. Przedstawiona w niniejszej pracy analiza tkanek pacjentów z ccRCC i linii komórkowych pokazała, że oprócz dobrze poznanej roli MCPIP1 w odpowiedzi zapalnej i utrzymaniu homeostazy, białko to pełni rolę w rozwoju i progresji nowotworu. Wyniki in vitro i in vivo wskazują, że MCPIP1 w sposób bezpośredni przez swoją aktywność enzymatyczną, lub pośredni, działając na szereg czynników zaangażowanych w proliferację, angiogenezę, proces EMT i przerzutowanie, reguluje rozwój i progresję nowotworu. Co więcej, poziom MCPIP1 negatywnie koreluje z poziomem i aktywnością receptora c-Met, który jest nadrzędnym modulatorem progresji nowotworowej. Dodatkowo, w trakcie rozwoju choroby, poziom białka MCPIP1 spada, co sugeruje, że może pełnić potencjalną rolę supresora nowotworzenia. Z kolei, stymulacja komórek inhibitorami angiogenezy powoduje zmiany fenotypu w proliferacji i cyklu komórkowym, a także morfologii. Mechanizm oporności najprawdopodobniej polega na wzroście aktywności receptora c-Met i spadku białka MCPIP1, które jest regulowane przez czynnikiem GSK3β. Wyniki przedstawione w niniejszej pracy doktorskiej sugerują, że białko MCPIP1 może stanowić potencjalny czynnik prognostyczny jasnokomórkowego raka nerki, który w przyszłości może mieć znaczenie terapeutyczne. 9 Wnioski końcowe Wyniki uzyskane w niniejszej rozprawie doktorskiej wskazują, że białko MCPIP1 jest niezwykle istotne podczas rozwoju i progresji jasnokomórkowego raka nerki (Ryc. 9.1.). Na podstawie przedstawionych wyników można stwierdzić, że: 1. Regulacja proliferacji, żywotności i wzrostu guzów in vivo zależy od poziomu i aktywności RNazy białka MCPIP1. 2. Niski poziom białka MCPIP1 sprzyja rozwinięciu unaczynienia w obrębie guza in vivo. 3. Białko MCPIP1 negatywnie reguluje ekspresję i sekrecję czynników proangiogennych w warunkach hipoksji i normoksji. Wydzielane cytokiny wpływają na fosforylację VE-kadheryny, utratę połączeń międzykomórkowych i aktywację komórek śródbłonka do migracji. 4. Niski poziom białka MCPIP1, poprzez aktywację osi SDF-1/CXCR4, powoduje wzrost agresywności komórek nowotworowych i sprzyja powstawaniu przerzutów. 5. Proces EMT jest regulowany bezpośrednio lub pośrednio przez MCPIP1. Towarzyszy temu zmiana w poziomie receptora c-Met, Src, STAT3, wimentyny, β-kateniny i e-kadheryny. 6. Poziom MCPIP1 spada wraz z progresją jasnokomórkowego raka nerki i negatywnie koreluje z poziomem całkowitego i fosforylowanego receptora c-Met. 7. Stymulacja sunitinibem i sorafenibem powoduje wzrost fosforylacji receptora c-Met i spadek białka MCPIP1. 8. Mechanizm oporności na sunitinib polega na wejściu komórek w stan uśpienia, podczas gdy oporność na sorafenib prowadzi do zmiany fenotypu komórki na mezenchymalny. 9. Komórki oporne na sunitinib i sorafenib tworzą więcej przerzutów niż komórki kontrolne. 10. Spadek poziomu białka MCPIP1 po stymulacji sunitinibem lub sorafenibem może być spowodowany aktywacją GSK3β, który rozpoznaje motyw DSGXXS i powoduje jego fosforylację i degradację proteasomalną. Rycina 9.1. Podsumowanie roli białka MCPIP1 w rozwoju, angiogenezie i progresji jasnokomórkowego raka nerki, a także podczas nabywania oporności na sunitinib i sorafenib. 10 Bibliografia 1. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2018;68(1):7–30. 2. Hsieh JJ, Purdue MP, Signoretti S, Swanton C, Albiges L, Schmidinger M, et al. Renal cell carcinoma. Nature reviews Disease primers. 2017 Mar 9;3:17009. 3. Moch H, Cubilla AL, Humphrey PA, Reuter VE, Ulbright TM. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Urinary System and Male Genital Organs—Part A: Renal, Penile, and Testicular Tumours. European Urology. 2016 Jul 1;70(1):93–105. 4. Lopez-Beltran A, Scarpelli M, Montironi R, Kirkali Z. 2004 WHO Classification of the Renal Tumors of the Adults. European Urology. 2006 May 1;49(5):798–805. 5. Rini BI, Campbell SC, Escudier B. Renal cell carcinoma. The Lancet. 2009 Mar 28;373(9669):1119–32. 6. Zhou M, He H. Pathology of Renal Cell Carcinoma BT - Renal Cell Carcinoma: Clinical Management. In: Campbell SC, Rini BI, editors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013. p. 23–41. 7. Muglia VF, Prando A. Renal cell carcinoma: histological classification and correlation with imaging findings. Radiologia brasileira. 2015;48(3):166–74. 8. Fuhrman SA, Lasky LC, Limas C. Prognostic significance of morphologic parameters in renal cell carcinoma. The American journal of surgical pathology. 1982 Oct;6(7):655–63. 9. Lang H, Lindner V, de Fromont M, Molinié V, Letourneux H, Meyer N, et al. Multicenter determination of optimal interobserver agreement using the Fuhrman grading system for renal cell carcinoma. Cancer. 2005 Feb 1;103(3):625–9. 10. Creighton CJ, Morgan M, Gunaratne PH, Wheeler DA, Gibbs RA, Gordon Robertson A, et al. Comprehensive molecular characterization of clear cell renal cell carcinoma. Nature. 2013;499(7456):43–9. 11. Sato Y, Yoshizato T, Shiraishi Y, Maekawa S, Okuno Y, Kamura T, et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 2013;45(8):860–7. 12. Hakimi AA, Pham CG, Hsieh JJ. A clear picture of renal cell carcinoma. Nature Genetics. 2013;45(8):849–50. 13. Kapur P, Peña-Llopis S, Christie A, Zhrebker L, Pavía-Jiménez A, Rathmell WK, et al. Effects on survival of BAP1 and PBRM1 mutations in sporadic clear-cell renal-cell carcinoma: a retrospective analysis with independent validation. The Lancet Oncology. 2013 Feb 1;14(2):159–67. 14. Maxwell PH, Wiesener MS, Chang G-W, Clifford SC, Vaux EC, Cockman ME, et al. The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature. 1999;399(6733):271–5. 15. Tissue @ Www.Proteinatlas.Org. Available from: http://www.proteinatlas.org/ENSG00000233276-GPX1/tissue 16. Jaakkola P, Mole DR, Tian Y-M, Wilson MI, Gielbert J, Gaskell SJ, et al. Targeting of HIF-α to the von Hippel-Lindau Ubiquitylation Complex by O2 Regulated Prolyl Hydroxylation. Science. 2001 Apr 20;292(5516):468 LP – 472. 17. Yu F, White SB, Zhao Q, Lee FS. HIF-1α binding to VHL is regulated by stimulus-sensitive proline hydroxylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001 Aug 14;98(17):9630 LP – 9635. 18. Ivan M, Kondo K, Yang H, Kim W, Valiando J, Ohh M, et al. HIFα Targeted for VHL-Mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing. Science. 2001 Apr 20;292(5516):464 LP – 468. 19. Knebelmann B, Ananth S, Cohen HT, Sukhatme VP. Transforming Growth Factor α Is a Target for the Von Hippel-Lindau Tumor Suppressor. Cancer Research. 1998 Jan 15;58(2):226 LP – 231. 20. Zagzag D, Krishnamachary B, Yee H, Okuyama H, Chiriboga L, Ali MA, et al. Stromal Cell–Derived Factor-1α and CXCR4 Expression in Hemangioblastoma and Clear Cell-Renal Cell Carcinoma: von Hippel-Lindau Loss-of-Function Induces Expression of a Ligand and Its Receptor. Cancer Research. 2005 Jul 15;65(14):6178 LP – 6188. 21. Gong K, Zhang N, Zhang K, Na Y. The relationship of erythropoietin overexpression with von Hippel-Lindau tumour suppressor gene mutations between hypoxia-inducible factor-1alpha and -2alpha in sporadic clear cell renal carcinoma. International journal of molecular medicine. 2010 Dec;26(6):907–12. 22. Buchler P, Reber HA, Buchler M, Shrinkante S, Buchler MW, Friess H, et al. Hypoxia-inducible factor 1 regulates vascular endothelial growth factor expression in human pancreatic cancer. Pancreas. 2003 Jan;26(1):56–64. 23. Kucejova B, Peña-Llopis S, Yamasaki T, Sivanand S, Tran TAT, Alexander S, et al. Interplay between pVHL and mTORC1 pathways in clear-cell renal cell carcinoma. Molecular cancer research : MCR. 2011/07/28. 2011 Sep;9(9):1255–65. 24. Koochekpour S, Jeffers M, Wang PH, Gong C, Taylor GA, Roessler LM, et al. The von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Gene Inhibits Hepatocyte Growth Factor/Scatter Factor-Induced Invasion and Branching Morphogenesis in Renal Carcinoma Cells. Molecular and Cellular Biology. 1999 Sep 1;19(9):5902 LP – 5912. 25. Hara S, Nakashiro K-I, Klosek SK, Ishikawa T, Shintani S, Hamakawa H. Hypoxia enhances c-Met/HGF receptor expression and signaling by activating HIF-1alpha in human salivary gland cancer cells. Oral oncology. 2006 Jul;42(6):593–8. 26. von-hippel-lindau-syndrome @ ghr.nlm.nih.gov. Available from: https://ghr.nlm.nih.gov/condition/von-hippel-lindau-syndrome#synonyms 27. Calzada MJ. Von Hippel-Lindau syndrome: molecular mechanisms of the disease. Clinical and Translational Oncology. 2010;12(3):160–5. 28. Richards FM, Payne SJ, Zbar B, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Maher ER. Molecular analysis of de novo germline mutations in the von Hippel-Lindau disease gene. Human molecular genetics. 1995 Nov;4(11):2139–43. 29. Lee JY, Dong SM, Park WS, Yoo NJ, Kim CS, Jang JJ, et al. Loss of heterozygosity and somatic mutations of the VHL tumor suppressor gene in sporadic cerebellar hemangioblastomas. Cancer research. 1998 Feb;58(3):504–8. 30. Shuin T, Yamasaki I, Tamura K, Okuda H, Furihata M, Ashida S. Von Hippel–Lindau Disease: Molecular Pathological Basis, Clinical Criteria, Genetic Testing, Clinical Features of Tumors and Treatment. Japanese Journal of Clinical Oncology. 2006 Jun 1;36(6):337–43. 31. Kaelin WG. The von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Protein and Clear Cell Renal Carcinoma. Clinical Cancer Research. 2007 Jan 15;13(2):680s LP – 684s. 32. Bindra RS, Vasselli JR, Stearman R, Linehan WM, Klausner RD. VHL-mediated Hypoxia Regulation of Cyclin D1 in Renal Carcinoma Cells. Cancer Research. 2002 Jun 1;62(11):3014 LP – 3019. 33. Zatyka M, da Silva NF, Clifford SC, Morris MR, Wiesener MS, Eckardt K-U, et al. Identification of Cyclin D1 and Other Novel Targets for the von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Gene by Expression Array Analysis and Investigation of Cyclin D1 Genotype as a Modifier in von Hippel-Lindau Disease. Cancer Research. 2002 Jul 1;62(13):3803 LP – 3811. 34. Goda N, Ryan HE, Khadivi B, McNulty W, Rickert RC, Johnson RS. Hypoxia-inducible factor 1alpha is essential for cell cycle arrest during hypoxia. Molecular and cellular biology. 2003 Jan;23(1):359–69. 35. Conway EM, Collen D, Carmeliet P. Molecular mechanisms of blood vessel growth. Cardiovascular Research. 2001 Feb 16;49(3):507–21. 36. Folkman J. Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis. Seminars in Oncology. 2002;29(6, Supplement 16):15–8. 37. Sacewicz I, Wiktorska M, Wysocki T, Niewiarowska J. [Mechanisms of cancer angiogenesis]. Postepy higieny i medycyny doswiadczalnej (Online). 2009 Apr;63:159–68. 38. Furuya M, Nishiyama M, Kasuya Y, Kimura S, Ishikura H. Pathophysiology of tumor neovascularization. Vascular health and risk management. 2005;1(4):277–90. 39. Kumar H, Choi D-K. Hypoxia Inducible Factor Pathway and Physiological Adaptation: A Cell Survival Pathway? Mediators of inflammation. 2015/09/27. 2015;2015:584758. 40. Raval RR, Lau KW, Tran MGB, Sowter HM, Mandriota SJ, Li J-L, et al. Contrasting Properties of Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF-1) and HIF-2 in von Hippel-Lindau-Associated Renal Cell Carcinoma. Molecular and Cellular Biology. 2005 Jul 1;25(13):5675 LP – 5686. 41. Zimmer M, Doucette D, Siddiqui N, Iliopoulos O. Inhibition of hypoxia-inducible factor is sufficient for growth suppression of VHL-/- tumors. Molecular cancer research : MCR. 2004 Feb;2(2):89–95. 42. Kondo K, Kim WY, Lechpammer M, Kaelin Jr WG. Inhibition of HIF2alpha is sufficient to suppress pVHL-defective tumor growth. PLoS biology. 2003/12/22. 2003 Dec;1(3):E83–E83. 43. Shen C, Kaelin Jr WG. The VHL/HIF axis in clear cell renal carcinoma. Seminars in cancer biology. 2012/06/13. 2013 Feb;23(1):18–25. 44. Dorević G, Matusan-Ilijas K, Babarović E, Hadzisejdić I, Grahovac M, Grahovac B, et al. Hypoxia inducible factor-1alpha correlates with vascular endothelial growth factor A and C indicating worse prognosis in clear cell renal cell carcinoma. Journal of experimental & clinical cancer research : CR. 2009 Mar 20;28(1):40. 45. Wang W, Qi L, Tan M, Zhang Z, Du J, Wei X, et al. Effect of platelet-derived growth factor-B on renal cell carcinoma growth and progression. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 2015;33(4):168.e17-168.e27. 46. Ferrara N, Gerber H-P, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nature medicine. 2003 Jun;9(6):669–76. 47. Carmeliet P, Collen D. Molecular basis of angiogenesis. Role of VEGF and VE-cadherin. Annals of the New York Academy of Sciences. 2000 May;902:244–9. 48. Dejana E, Bazzoni G, Lampugnani MG. Vascular Endothelial (VE)-Cadherin: Only an Intercellular Glue? Experimental Cell Research. 1999;252(1):13–9. 49. Dejana E, Orsenigo F, Lampugnani MG. The role of adherens junctions and VE-cadherin in the control of vascular permeability. Journal of Cell Science. 2008 Jul 1;121(13):2115 LP – 2122. 50. Li X, Padhan N, Sjöström EO, Roche FP, Testini C, Honkura N, et al. VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread. Nature communications. 2016 Mar;7:11017. 51. Herren B, Levkau B, Raines EW, Ross R. Cleavage of β-Catenin and Plakoglobin and Shedding of VE-Cadherin during Endothelial Apoptosis: Evidence for a Role for Caspases and Metalloproteinases. Molecular Biology of the Cell. 1998 Jun 1;9(6):1589–601. 52. Vilgrain I, Sidibe A, Polena H, Cand F, Mannic T, Arboleas M, et al. Evidence for Post-Translational Processing of Vascular Endothelial (VE)-Cadherin in Brain Tumors: Towards a Candidate Biomarker. PloS one. 2013 Dec 16;8:e80056. 53. Grunewald M, Avraham I, Dor Y, Bachar-Lustig E, Itin A, Yung S, et al. VEGF-Induced Adult Neovascularization: Recruitment, Retention, and Role of Accessory Cells. Cell. 2006 Jan 13;124(1):175–89. 54. Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, et al. Interleukin-8 as a Macrophage-Derived Mediator of Angiogenesis. Science. 1992 May 12;258(5089):1798–801. 55. Li A, Dubey S, Varney ML, Dave BJ, Singh RK. IL-8 Directly Enhanced Endothelial Cell Survival, Proliferation, and Matrix Metalloproteinases Production and Regulated Angiogenesis. The Journal of Immunology. 2003 Mar 15;170(6):3369 LP – 3376. 56. CUMPĂNAS AA, CIMPEAN AM, FERICIAN O, CEAUSU RA, SARB S, BARBOS V, et al. The Involvement of PDGF-B/PDGFRβ Axis in the Resistance to Antiangiogenic and Antivascular Therapy in Renal Cancer. Anticancer Research. 2016 May 1;36(5):2291–5. 57. Maniotis AJ, Folberg R, Hess A, Seftor EA, Gardner LM, Pe’er J, et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. The American journal of pathology. 1999 Sep;155(3):739–52. 58. Lin H, Pan J, Zhang F, Huang B, Chen X, Zhuang J, et al. Matrix metalloproteinase-9 is required for vasculogenic mimicry by clear cell renal carcinoma cells. Urologic oncology. 2015 Apr;33(4):168.e9-16. 59. Wang X, Yang R, Wang Q, Wang Y, Ci H, Wu S. Aberrant expression of vasculogenic mimicry, PRRX1, and CIP2A in clear cell renal cell carcinoma and its clinicopathological significance. Medicine. 2019 Sep;98(36):e17028. 60. Bai J, Yeh S, Qiu X, Hu L, Zeng J, Cai Y, et al. TR4 nuclear receptor promotes clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) vasculogenic mimicry (VM) formation and metastasis via altering the miR490-3p/vimentin signals. Oncogene. 2018 Nov;37(44):5901–12. 61. Matsumura A, Kubota T, Taiyoh H, Fujiwara H, Okamoto K, Ichikawa D, et al. HGF regulates VEGF expression via the c-Met receptor downstream pathways, PI3K/Akt, MAPK and STAT3, in CT26 murine cells. International journal of oncology. 2013 Feb;42(2):535–42. 62. Gopinathan G, Milagre C, Pearce OMT, Reynolds LE, Hodivala-Dilke K, Leinster DA, et al. Interleukin-6 Stimulates Defective Angiogenesis. Cancer research. 2015 Aug;75(15):3098–107. 63. Ishibashi K, Koguchi T, Matsuoka K, Onagi A, Tanji R, Takinami-Honda R, et al. Interleukin-6 induces drug resistance in renal cell carcinoma. Fukushima journal of medical science. 2018/10/23. 2018 Dec 8;64(3):103–10. 64. Kijowski J, Baj-Krzyworzeka M, Majka M, Reca R, Marquez LA, Christofidou-Solomidou M, et al. The SDF-1-CXCR4 axis stimulates VEGF secretion and activates integrins but does not affect proliferation and survival in lymphohematopoietic cells. Stem cells (Dayton, Ohio). 2001;19(5):453–66. 65. Zheng H, Fu G, Dai T, Huang H. Migration of endothelial progenitor cells mediated by stromal cell-derived factor-1alpha/CXCR4 via PI3K/Akt/eNOS signal transduction pathway. Journal of cardiovascular pharmacology. 2007 Sep;50(3):274–80. 66. Baldewijns MM, Thijssen VL, van den Eynden GG, van Laere SJ, Bluekens AM, Roskams T, et al. High-grade clear cell renal cell carcinoma has a higher angiogenic activity than low-grade renal cell carcinoma based on histomorphological quantification and qRT-PCR mRNA expression profile. British journal of cancer. 2007/05/15. 2007 Jun 18;96(12):1888–95. 67. Organ SL, Tsao M-S. An overview of the c-MET signaling pathway. Therapeutic advances in medical oncology. 2011 Nov;3(1 Suppl):S7–19. 68. Uehara Y, Minowa O, Mori C, Shiota K, Kuno J, Noda T, et al. Placental defect and embryonic lethality in mice lacking hepatocyte growth factor/scatter factor. Nature. 1995;373(6516):702–5. 69. Huh C-G, Factor VM, Sánchez A, Uchida K, Conner EA, Thorgeirsson SS. Hepatocyte growth factor/c-met signaling pathway is required for efficient liver regeneration and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004 Mar 30;101(13):4477 LP – 4482. 70. Bladt F, Riethmacher D, Isenmann S, Aguzzi A, Birchmeier C. Essential role for the c-met receptor in the migration of myogenic precursor cells into the limb bud. Nature. 1995 Aug;376(6543):768–71. 71. Trusolino L, Comoglio PM. Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for invasive growth. Nature reviews Cancer. 2002 Apr;2(4):289–300. 72. Fixman ED, Fournier TM, Kamikura DM, Naujokas MA, Park M. Pathways downstream of Shc and Grb2 are required for cell transformation by the tpr-Met oncoprotein. The Journal of biological chemistry. 1996 May;271(22):13116–22. 73. Ménard L, Parker PJ, Kermorgant S. Receptor tyrosine kinase c-Met controls the cytoskeleton from different endosomes via different pathways. Nature Communications. 2014;5(1):3907. 74. Xiao GH, Jeffers M, Bellacosa A, Mitsuuchi Y, vande Woude GF, Testa JR. Anti-apoptotic signaling by hepatocyte growth factor/Met via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001 Jan;98(1):247–52. 75. Hui AY, Meens JA, Schick C, Organ SL, Qiao H, Tremblay EA, et al. Src and FAK mediate cell-matrix adhesion-dependent activation of Met during transformation of breast epithelial cells. Journal of cellular biochemistry. 2009 Aug;107(6):1168–81. 76. Zhang Y-W, Wang L-M, Jove R, vande Woude GF. Requirement of Stat3 signaling for HGF/SF-Met mediated tumorigenesis. Oncogene. 2002 Jan;21(2):217–26. 77. Hara T, Ooi A, Kobayashi M, Mai M, Yanagihara K, Nakanishi I. Amplification of c-myc, K-sam, and c-met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 1998 Sep;78(9):1143–53. 78. Lengyel E, Prechtel D, Resau JH, Gauger K, Welk A, Lindemann K, et al. C-Met overexpression in node-positive breast cancer identifies patients with poor clinical outcome independent of Her2/neu. International journal of cancer. 2005 Feb;113(4):678–82. 79. Tong CYK, Hui ABY, Yin X-L, Pang JCS, Zhu X-L, Poon W-S, et al. Detection of oncogene amplifications in medulloblastomas by comparative genomic hybridization and array-based comparative genomic hybridization. Journal of neurosurgery. 2004 Feb;100(2 Suppl Pediatrics):187–93. 80. Schmidt L, Junker K, Nakaigawa N, Kinjerski T, Weirich G, Miller M, et al. Novel mutations of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Oncogene. 1999;18(14):2343–50. 81. Jo M, Stolz DB, Esplen JE, Dorko K, Michalopoulos GK, Strom SC. Cross-talk between epidermal growth factor receptor and c-Met signal pathways in transformed cells. The Journal of biological chemistry. 2000 Mar;275(12):8806–11. 82. Orian-Rousseau V, Morrison H, Matzke A, Kastilan T, Pace G, Herrlich P, et al. Hepatocyte growth factor-induced Ras activation requires ERM proteins linked to both CD44v6 and F-actin. Molecular biology of the cell. 2007 Jan;18(1):76–83. 83. Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM. A signaling adapter function for alpha6beta4 integrin in the control of HGF-dependent invasive growth. Cell. 2001 Nov;107(5):643–54. 84. Miekus K, Pawlowska M, Sekuła M, Drabik G, Madeja Z, Adamek D, et al. MET receptor is a potential therapeutic target in high grade cervical cancer. Oncotarget. 2015 Apr;6(12):10086–101. 85. Pennacchietti S, Michieli P, Galluzzo M, Mazzone M, Giordano S, Comoglio PM. Hypoxia promotes invasive growth by transcriptional activation of the met protooncogene. Cancer cell. 2003 Apr;3(4):347–61. 86. Kitajima Y, Ide T, Ohtsuka T, Miyazaki K. Induction of hepatocyte growth factor activator gene expression under hypoxia activates the hepatocyte growth factor/c-Met system via hypoxia inducible factor-1 in pancreatic cancer. Cancer science. 2008 Jul;99(7):1341–7. 87. Kawaida K, Matsumoto K, Shimazu H, Nakamura T. Hepatocyte growth factor prevents acute renal failure and accelerates renal regeneration in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1994 May 10;91(10):4357 LP – 4361. 88. Nagaike M, Hirao S, Tajima H, Noji S, Taniguchi S, Matsumoto K, et al. Renotropic functions of hepatocyte growth factor in renal regeneration after unilateral nephrectomy. The Journal of biological chemistry. 1991 Dec;266(34):22781–4. 89. Natali PG, Prat M, Nicotra MR, Bigotti A, Olivero M, Comoglio PM, et al. Overexpression of the met/HGF receptor in renal cell carcinomas. International Journal of Cancer. 1996 Jun 21;69(3):212–7. 90. Pisters LL, El-Naggar AK, Luo W, Malpica A, Lin S-H. C-Met Proto-Oncogene Expression in Benign and Malignant Human Renal Tissues. The Journal of Urology. 1997;158(3):724–8. 91. Choi JS, Kim M-K, Seo JW, Choi Y-L, Kim DH, Chun YK, et al. MET Expression in Sporadic Renal Cell Carcinomas. J Korean Med Sci. 2006 Aug;21(4):672–7. 92. Schmidt L, Duh F-M, Chen F, Kishida T, Glenn G, Choyke P, et al. Germline and somatic mutations in the tyrosine kinase domain of the MET proto-oncogene in papillary renal carcinomas. Nature Genetics. 1997;16(1):68–73. 93. Macher-Goeppinger S, Keith M, Endris V, Penzel R, Tagscherer KE, Pahernik S, et al. MET expression and copy number status in clear-cell renal cell carcinoma: prognostic value and potential predictive marker. Oncotarget. 2017 Jan 3;8(1):1046–57. 94. Gibney GT, Aziz SA, Camp RL, Conrad P, Schwartz BE, Chen CR, et al. c-Met is a prognostic marker and potential therapeutic target in clear cell renal cell carcinoma. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology. 2012/09/28. 2013 Feb;24(2):343–9. 95. Miyata Y, Kanetake H, Kanda S. Presence of Phosphorylated Hepatocyte Growth Factor Receptor/c-Met Is Associated with Tumor Progression and Survival in Patients with Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 2006 Aug 15;12(16):4876 LP – 4881. 96. Nakaigawa N, Yao M, Baba M, Kato S, Kishida T, Hattori K, et al. Inactivation of von Hippel-Lindau Gene Induces Constitutive Phosphorylation of MET Protein in Clear Cell Renal Carcinoma. Cancer Research. 2006 Apr 1;66(7):3699 LP – 3705. 97. Lamouille S, Xu J, Derynck R. Molecular mechanisms of epithelial–mesenchymal transition. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2014;15(3):178–96. 98. Thiery JP, Sleeman JP. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nature reviews Molecular cell biology. 2006 Feb;7(2):131–42. 99. Nisticò P, Bissell MJ, Radisky DC. Epithelial-mesenchymal transition: general principles and pathological relevance with special emphasis on the role of matrix metalloproteinases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2012 Feb 1;4(2):a011908. 100. Peinado H, Portillo F, Cano A. Transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis. The International journal of developmental biology. 2004;48(5–6):365–75. 101. Reinhold WC, Reimers MA, Lorenzi P, Ho J, Shankavaram UT, Ziegler MS, et al. Multifactorial Regulation of E-Cadherin Expression: An Integrative Study. Molecular Cancer Therapeutics. 2010 Jan 1;9(1):1 LP – 16. 102. Wang Y, Shi J, Chai K, Ying X, Zhou BP. The Role of Snail in EMT and Tumorigenesis. Current cancer drug targets. 2013 Nov;13(9):963–72. 103. Liu W, Liu Y, Liu H, Zhang W, An H, Xu J. Snail predicts recurrence and survival of patients with localized clear cell renal cell carcinoma after surgical resection. Urologic oncology. 2015 Feb;33(2):69.e1-10. 104. Gou Y, Ding W, Xu K, Wang H, Chen Z, Tan J, et al. Snail is an independent prognostic indicator for predicting recurrence and progression in non-muscle-invasive bladder cancer. International urology and nephrology. 2014 Nov 12;47. 105. Muenst S, Daster S, Obermann EC, Droeser RA, Weber WP, von Holzen U, et al. Nuclear expression of snail is an independent negative prognostic factor in human breast cancer. Disease markers. 2013;35(5):337–44. 106. Wendt MK, Allington TM, Schiemann WP. Mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition by TGF-beta. Future oncology (London, England). 2009 Oct;5(8):1145–68. 107. MacDonald BT, Tamai K, He X. Wnt/β-Catenin Signaling: Components, Mechanisms, and Diseases. Developmental Cell. 2009 Jul 21;17(1):9–26. 108. Huber MA, Azoitei N, Baumann B, Grünert S, Sommer A, Pehamberger H, et al. NF-kappaB is essential for epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a model of breast cancer progression. The Journal of clinical investigation. 2004 Aug;114(4):569–81. 109. Tam SY, Wu VWC, Law HKW. Hypoxia-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition in Cancers: HIF-1α and Beyond. Frontiers in oncology. 2020 Apr 8;10:486. 110. Birchmeier C, Birchmeier W, Gherardi E, vande Woude GF. Met, metastasis, motility and more. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2003;4(12):915–25. 111. Kim KH, Seol HJ, Kim EH, Rheey J, Jin HJ, Lee Y, et al. Wnt/β-catenin signaling is a key downstream mediator of MET signaling in glioblastoma stem cells. Neuro-oncology. 2012/12/20. 2013 Feb;15(2):161–71. 112. Previdi S, Maroni P, Matteucci E, Broggini M, Bendinelli P, Desiderio MA. Interaction between human-breast cancer metastasis and bone microenvironment through activated hepatocyte growth factor/Met and b-catenin/Wnt pathways. European Journal of Cancer. 2010 Jun 1;46(9):1679–91. 113. Monga SPS, Mars WM, Pediaditakis P, Bell A, Mulé K, Bowen WC, et al. Hepatocyte Growth Factor Induces Wnt-independent Nuclear Translocation of β-Catenin after Met-β-Catenin Dissociation in Hepatocytes. Cancer Research. 2002 Apr 1;62(7):2064 LP – 2071. 114. Cheng Y, Song Y, Qu J, Che X, Song N, Fan Y, et al. The Chemokine Receptor CXCR4 and c-MET Cooperatively Promote Epithelial-Mesenchymal Transition in Gastric Cancer Cells. Translational Oncology. 2018;11(2):487–97. 115. Cañadas I, Rojo F, Taus Á, Arpí O, Arumí-Uría M, Pijuan L, et al. Targeting Epithelial-to-Mesenchymal Transition with Met Inhibitors Reverts Chemoresistance in Small Cell Lung Cancer. Clinical Cancer Research. 2014 Feb 15;20(4):938 LP – 950. 116. Yonemura Y, Nojima N, Kaji M, Kawamura T, Fushida S, Fujimura T, et al. E-cadherin and c-met expression as a prognostic factor in gastric cancer. Oncology reports. 1997;4(4):743–8. 117. Han S-U, Lee H-Y, Lee J-H, Kim W-H, Nam H, Kim H, et al. Modulation of E-cadherin by hepatocyte growth factor induces aggressiveness of gastric carcinoma. Annals of surgery. 2005 Nov;242(5):676–83. 118. Simpson CD, Anyiwe K, Schimmer AD. Anoikis resistance and tumor metastasis. Cancer letters. 2008 Dec;272(2):177–85. 119. Chaffer CL, Thompson EW, Williams ED. Mesenchymal to epithelial transition in development and disease. Cells, tissues, organs. 2007;185(1–3):7–19. 120. Webb CP, Taylor GA, Jeffers M, Fiscella M, Oskarsson M, Resau JH, et al. Evidence for a role of Met-HGF/SF during Ras-mediated tumorigenesis/metastasis. Oncogene. 1998 Oct;17(16):2019–25. 121. Tao X, Hill KS, Gaziova I, Sastry SK, Qui S, Szaniszlo P, et al. Silencing Met receptor tyrosine kinase signaling decreased oral tumor growth and increased survival of nude mice. Oral oncology. 2014 Feb;50(2):104–12. 122. Miekus K, Lukasiewicz E, Jarocha D, Sekula M, Drabik G, Majka M. The decreased metastatic potential of rhabdomyosarcoma cells obtained through MET receptor downregulation and the induction of differentiation. Cell death & disease. 2013 Jan;4(1):e459. 123. Yang Y, Zheng H, Zhan Y, Fan S. An emerging tumor invasion mechanism about the collective cell migration. American journal of translational research. 2019 Sep 15;11(9):5301–12. 124. Santoni M, Cimadamore A, Cheng L, Lopez-Beltran A, Battelli N, Massari F, et al. Circulating Tumor Cells in Renal Cell Carcinoma: Recent Findings and Future Challenges. Frontiers in oncology. 2019 Apr 5;9:228. 125. Suárez-Causado A, Caballero-Díaz D, Bertrán E, Roncero C, Addante A, García-Álvaro M, et al. HGF/c-Met signaling promotes liver progenitor cell migration and invasion by an epithelial–mesenchymal transition-independent, phosphatidyl inositol-3 kinase-dependent pathway in an in vitro model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 2015;1853(10, Part A):2453–63. 126. Peczkowski P. The role of radiation therapy in renal cancer. In 2007. 127. Chowdhury N, Drake CG. Kidney Cancer: An Overview of Current Therapeutic Approaches. The Urologic clinics of North America. 2020 Nov;47(4):419–31. 128. Buti S, Bersanelli M, Sikokis A, Maines F, Facchinetti F, Bria E, et al. Chemotherapy in metastatic renal cell carcinoma today? A systematic review. Anti-cancer drugs. 2013 Jul;24(6):535–54. 129. Iacovelli R, Cartenì G, Milella M, Berardi R, di Lorenzo G, Verzoni E, et al. Clinical outcomes in patients with metastatic renal cell carcinoma receiving everolimus or temsirolimus after sunitinib. Canadian Urological Association journal = Journal de l’Association des urologues du Canada. 2014;8(3–4):E121–5. 130. Voss MH, Molina AM, Motzer RJ. mTOR inhibitors in advanced renal cell carcinoma. Hematology/oncology clinics of North America. 2011 Aug;25(4):835–52. 131. Mihaly Z, Sztupinszki Z, Surowiak P, Gyorffy B. A comprehensive overview of targeted therapy in metastatic renal cell carcinoma. Current cancer drug targets. 2012 Sep;12(7):857–72. 132. George S, Motzer RJ, Hammers HJ, Redman BG, Kuzel TM, Tykodi SS, et al. Safety and Efficacy of Nivolumab in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma Treated Beyond Progression: A Subgroup Analysis of a Randomized Clinical Trial. JAMA oncology. 2016 Sep 1;2(9):1179–86. 133. Motzer RJ, Hutson TE, Tomczak P, Michaelson MD, Bukowski RM, Oudard S, et al. Overall survival and updated results for sunitinib compared with interferon alfa in patients with metastatic renal cell carcinoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2009 Aug;27(22):3584–90. 134. Wilhelm SM, Adnane L, Newell P, Villanueva A, Llovet JM, Lynch M. Preclinical overview of sorafenib, a multikinase inhibitor that targets both Raf and VEGF and PDGF receptor tyrosine kinase signaling. Molecular Cancer Therapeutics. 2008 Oct 1;7(10):3129 LP – 3140. 135. Escudier B, Eisen T, Stadler WM, Szczylik C, Oudard S, Siebels M, et al. Sorafenib in advanced clear-cell renal-cell carcinoma. The New England journal of medicine. 2007 Jan;356(2):125–34. 136. Abdelaziz A, Vaishampayan U. Cabozantinib for Renal Cell Carcinoma: Current and Future Paradigms. Current treatment options in oncology. 2017 Mar;18(3):18. 137. Eisenhauer EA, Therasse P, Bogaerts J, Schwartz LH, Sargent D, Ford R, et al. New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). European journal of cancer (Oxford, England : 1990). 2009 Jan;45(2):228–47. 138. Marona P, Górka J, Kotlinowski J, Majka M, Jura J, Miekus K. C-Met as a Key Factor Responsible for Sustaining Undifferentiated Phenotype and Therapy Resistance in Renal Carcinomas. Cells. 2019 Mar 22;8(3):272. 139. Bielecka ZF, Czarnecka AM, Solarek W, Kornakiewicz A, Szczylik C. Mechanisms of Acquired Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors in Clear - Cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC). Current signal transduction therapy. 2014 Dec;8(3):218–28. 140. Adelaiye R, Ciamporcero E, Miles KM, Sotomayor P, Bard J, Tsompana M, et al. Sunitinib dose escalation overcomes transient resistance in clear cell renal cell carcinoma and is associated with epigenetic modifications. Molecular cancer therapeutics. 2015 Feb;14(2):513–22. 141. Houk BE, Bello CL, Poland B, Rosen LS, Demetri GD, Motzer RJ. Relationship between exposure to sunitinib and efficacy and tolerability endpoints in patients with cancer: results of a pharmacokinetic/pharmacodynamic meta-analysis. Cancer chemotherapy and pharmacology. 2010 Jul;66(2):357–71. 142. Hammers HJ, Verheul HM, Salumbides B, Sharma R, Rudek M, Jaspers J, et al. Reversible epithelial to mesenchymal transition and acquired resistance to sunitinib in patients with renal cell carcinoma: evidence from a xenograft study. Molecular cancer therapeutics. 2010 Jun;9(6):1525–35. 143. Huang D, Ding Y, Zhou M, Rini BI, Petillo D, Qian C-N, et al. Interleukin-8 mediates resistance to antiangiogenic agent sunitinib in renal cell carcinoma. Cancer research. 2010 Feb;70(3):1063–71. 144. Ciamporcero E, Miles KM, Adelaiye R, Ramakrishnan S, Shen L, Ku S, et al. Combination strategy targeting VEGF and HGF/c-met in human renal cell carcinoma models. Molecular cancer therapeutics. 2015 Jan;14(1):101–10. 145. Zhou L, Liu X-D, Sun M, Zhang X, German P, Bai S, et al. Targeting MET and AXL overcomes resistance to sunitinib therapy in renal cell carcinoma. Oncogene. 2016 May;35(21):2687–97. 146. Rankin EB, Fuh KC, Castellini L, Viswanathan K, Finger EC, Diep AN, et al. Direct regulation of GAS6/AXL signaling by HIF promotes renal metastasis through SRC and MET. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014 Sep;111(37):13373–8. 147. Sennino B, Ishiguro-Oonuma T, Wei Y, Naylor RM, Williamson CW, Bhagwandin V, et al. Suppression of tumor invasion and metastasis by concurrent inhibition of c-Met and VEGF signaling in pancreatic neuroendocrine tumors. Cancer discovery. 2012 Mar;2(3):270–87. 148. Shojaei F, Lee JH, Simmons BH, Wong A, Esparza CO, Plumlee PA, et al. HGF/c-Met acts as an alternative angiogenic pathway in sunitinib-resistant tumors. Cancer research. 2010 Dec;70(24):10090–100. 149. Peltola KJ, Penttilä P, Rautiola J, Joensuu H, Hänninen E, Ristimäki A, et al. Correlation of c-Met Expression and Outcome in Patients With Renal Cell Carcinoma Treated With Sunitinib. Clinical genitourinary cancer. 2017 Aug;15(4):487–94. 150. Choueiri TK, Pal SK, McDermott DF, Morrissey S, Ferguson KC, Holland J, et al. A phase I study of cabozantinib (XL184) in patients with renal cell cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology. 2014 Aug;25(8):1603–8. 151. Choueiri TK, Escudier B, Powles T, Tannir NM, Mainwaring PN, Rini BI, et al. Cabozantinib versus everolimus in advanced renal cell carcinoma (METEOR): final results from a randomised, open-label, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 2016 Jul;17(7):917–27. 152. Lacy SA, Miles DR, Nguyen LT. Clinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Cabozantinib. Clinical pharmacokinetics. 2017 May;56(5):477–91. 153. Choueiri TK, Halabi S, Sanford BL, Hahn O, Michaelson MD, Walsh MK, et al. Cabozantinib Versus Sunitinib As Initial Targeted Therapy for Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma of Poor or Intermediate Risk: The Alliance A031203 CABOSUN Trial. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2017 Feb;35(6):591–7. 154. Dvorak HF. Tumors: wounds that do not heal-redux. Cancer immunology research. 2015 Jan;3(1):1–11. 155. Greten FR, Grivennikov SI. Inflammation and Cancer: Triggers, Mechanisms, and Consequences. Immunity. 2019 Jul 16;51(1):27–41. 156. White DL, Kanwal F, El–Serag HB. Association Between Nonalcoholic Fatty Liver Disease and Risk for Hepatocellular Cancer, Based on Systematic Review. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 2012 Dec 1;10(12):1342-1359.e2. 157. Pohl C, Hombach A, Kruis W. Chronic inflammatory bowel disease and cancer. Hepato-gastroenterology. 2000;47(31):57—70. 158. Chandler C, Liu T, Buckanovich R, Coffman LG. The double edge sword of fibrosis in cancer. Translational Research. 2019;209:55–67. 159. Singh N, Baby D, Rajguru JP, Patil PB, Thakkannavar SS, Pujari VB. Inflammation and cancer. Annals of African medicine. 2019;18(3):121–6. 160. Tak PP, Firestein GS. NF-kappaB: a key role in inflammatory diseases. The Journal of clinical investigation. 2001 Jan;107(1):7–11. 161. Francart M-E, Lambert J, Vanwynsberghe AM, Thompson EW, Bourcy M, Polette M, et al. Epithelial-mesenchymal plasticity and circulating tumor cells: Travel companions to metastases. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 2018 Mar;247(3):432–50. 162. Akkari L, Gocheva V, Kester JC, Hunter KE, Quick ML, Sevenich L, et al. Distinct functions of macrophage-derived and cancer cell-derived cathepsin Z combine to promote tumor malignancy via interactions with the extracellular matrix. Genes & development. 2014 Oct;28(19):2134–50. 163. Grivennikov S, Karin E, Terzic J, Mucida D, Yu G-Y, Vallabhapurapu S, et al. IL-6 and Stat3 are required for survival of intestinal epithelial cells and development of colitis-associated cancer. Cancer cell. 2009 Feb;15(2):103–13. 164. Erez N, Truitt M, Olson P, Arron ST, Hanahan D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner. Cancer cell. 2010 Feb;17(2):135–47. 165. Coffelt SB, Kersten K, Doornebal CW, Weiden J, Vrijland K, Hau C-S, et al. IL-17-producing γδ T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 2015 Jun;522(7556):345–8. 166. Zhang S, Che D, Yang F, Chi C, Meng H, Shen J, et al. Tumor-associated macrophages promote tumor metastasis via the TGF-β/SOX9 axis in non-small cell lung cancer. Oncotarget. 2017 Sep 16;8(59):99801–15. 167. Li M, Cao W, Liu H, Zhang W, Liu X, Cai Z, et al. MCPIP1 down-regulates IL-2 expression through an ARE-independent pathway. PloS one. 2012/11/21. 2012;7(11):e49841–e49841. 168. Matsushita K, Takeuchi O, Standley DM, Kumagai Y, Kawagoe T, Miyake T, et al. Zc3h12a is an RNase essential for controlling immune responses by regulating mRNA decay. Nature. 2009 Apr;458(7242):1185–90. 169. Mizgalska D, Wegrzyn P, Murzyn K, Kasza A, Koj A, Jura J, et al. Interleukin-1-inducible MCPIP protein has structural and functional properties of RNase and participates in degradation of IL-1beta mRNA. The FEBS journal. 2009 Dec;276(24):7386–99. 170. Jura J, Skalniak L, Koj A. Monocyte chemotactic protein-1-induced protein-1 (MCPIP1) is a novel multifunctional modulator of inflammatory reactions. Biochimica et biophysica acta. 2012 Oct;1823(10):1905–13. 171. Liang J, Wang J, Azfer A, Song W, Tromp G, Kolattukudy PE, et al. A novel CCCH-zinc finger protein family regulates proinflammatory activation of macrophages. The Journal of biological chemistry. 2008 Mar;283(10):6337–46. 172. Wilamowski M, Gorecki A, Dziedzicka-Wasylewska M, Jura J. Substrate specificity of human MCPIP1 endoribonuclease. Scientific Reports. 2018;8(1):7381. 173. Xu J, Peng W, Sun Y, Wang X, Xu Y, Li X, et al. Structural study of MCPIP1 N-terminal conserved domain reveals a PIN-like RNase. Nucleic acids research. 2012/05/04. 2012 Aug;40(14):6957–65. 174. Lin R-J, Chien H-L, Lin S-Y, Chang B-L, Yu H-P, Tang W-C, et al. MCPIP1 ribonuclease exhibits broad-spectrum antiviral effects through viral RNA binding and degradation. Nucleic acids research. 2013/01/25. 2013 Mar 1;41(5):3314–26. 175. Suzuki HI, Arase M, Matsuyama H, Choi YL, Ueno T, Mano H, et al. MCPIP1 ribonuclease antagonizes dicer and terminates microRNA biogenesis through precursor microRNA degradation. Molecular cell. 2011 Nov;44(3):424–36. 176. Skalniak L, Mizgalska D, Zarebski A, Wyrzykowska P, Koj A, Jura J. Regulatory feedback loop between NF-kappaB and MCP-1-induced protein 1 RNase. The FEBS journal. 2009 Oct;276(20):5892–905. 177. Zhou L, Azfer A, Niu J, Graham S, Choudhury M, Adamski FM, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 induces a novel transcription factor that causes cardiac myocyte apoptosis and ventricular dysfunction. Circulation research. 2006 May;98(9):1177–85. 178. Liang J, Saad Y, Lei T, Wang J, Qi D, Yang Q, et al. MCP-induced protein 1 deubiquitinates TRAF proteins and negatively regulates JNK and NF-kappaB signaling. The Journal of experimental medicine. 2010/11/29. 2010 Dec 20;207(13):2959–73. 179. Niu J, Shi Y, Xue J, Miao R, Huang S, Wang T, et al. USP10 inhibits genotoxic NF-κB activation by MCPIP1-facilitated deubiquitination of NEMO. The EMBO journal. 2013/11/22. 2013 Dec 11;32(24):3206–19. 180. Mino T, Murakawa Y, Fukao A, Vandenbon A, Wessels H-H, Ori D, et al. Regnase-1 and Roquin Regulate a Common Element in Inflammatory mRNAs by Spatiotemporally Distinct Mechanisms. Cell. 2015 May;161(5):1058–73. 181. Lu W, Ning H, Gu L, Peng H, Wang Q, Hou R, et al. MCPIP1 Selectively Destabilizes Transcripts Associated with an Antiapoptotic Gene Expression Program in Breast Cancer Cells That Can Elicit Complete Tumor Regression. Cancer research. 2016/02/01. 2016 Mar 15;76(6):1429–40. 182. Dobosz E, Wilamowski M, Lech M, Bugara B, Jura J, Potempa J, et al. MCPIP-1, Alias Regnase-1, Controls Epithelial Inflammation by Posttranscriptional Regulation of IL-8 Production. Journal of innate immunity. 2016;8(6):564–78. 183. Lipert B, Wilamowski M, Gorecki A, Jura J. MCPIP1, alias Regnase-1 binds and cleaves mRNA of C/EBPβ. PloS one. 2017 Mar 22;12(3):e0174381–e0174381. 184. Younce CW, Azfer A, Kolattukudy PE. MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1)-induced protein, a recently identified zinc finger protein, induces adipogenesis in 3T3-L1 pre-adipocytes without peroxisome proliferator-activated receptor gamma. The Journal of biological chemistry. 2009 Oct;284(40):27620–8. 185. Niu J, Wang K, Zhelyabovska O, Saad Y, Kolattukudy PE. MCP-1-induced protein promotes endothelial-like and angiogenic properties in human bone marrow monocytic cells. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2013/09/05. 2013 Nov;347(2):288–97. 186. Roy A, Kolattukudy PE. Monocyte chemotactic protein-induced protein (MCPIP) promotes inflammatory angiogenesis via sequential induction of oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and autophagy. Cellular signalling. 2012 Nov;24(11):2123–31. 187. Jura J, Wegrzyn P, Korostyński M, Guzik K, Oczko-Wojciechowska M, Jarzab M, et al. Identification of interleukin-1 and interleukin-6-responsive genes in human monocyte-derived macrophages using microarrays. Biochimica et biophysica acta. 2008;1779(6–7):383–9. 188. Skalniak L, Koj A, Jura J. Proteasome inhibitor MG-132 induces MCPIP1 expression. The FEBS journal. 2013/05/07. 2013 Jun;280(11):2665–74. 189. Ruiz-Romeu E, Ferran M, Giménez-Arnau A, Bugara B, Lipert B, Jura J, et al. MCPIP1 RNase Is Aberrantly Distributed in Psoriatic Epidermis and Rapidly Induced by IL-17A. The Journal of investigative dermatology. 2016 Aug;136(8):1599–607. 190. Monin L, Gudjonsson JE, Childs EE, Amatya N, Xing X, Verma AH, et al. MCPIP1/Regnase-1 Restricts IL-17A- and IL-17C-Dependent Skin Inflammation. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 2017 Jan;198(2):767–75. 191. Blazusiak E, Florczyk D, Jura J, Potempa J, Koziel J. Differential regulation by Toll-like receptor agonists reveals that MCPIP1 is the potent regulator of innate immunity in bacterial and viral infections. Journal of innate immunity. 2013;5(1):15–23. 192. Kasza A, Wyrzykowska P, Horwacik I, Tymoszuk P, Mizgalska D, Palmer K, et al. Transcription factors Elk-1 and SRF are engaged in IL1-dependent regulation of ZC3H12A expression. BMC molecular biology. 2010 Feb;11:14. 193. Yao H, Ma R, Yang L, Hu G, Chen X, Duan M, et al. MiR-9 promotes microglial activation by targeting MCPIP1. Nature communications. 2014 Jul 14;5:4386. 194. Makki MS, Haseeb A, Haqqi TM. MicroRNA-9 promotion of interleukin-6 expression by inhibiting monocyte chemoattractant protein-induced protein 1 expression in interleukin-1β-stimulated human chondrocytes. Arthritis & rheumatology (Hoboken, NJ). 2015 May;67(8):2117–28. 195. Iwasaki H, Takeuchi O, Teraguchi S, Matsushita K, Uehata T, Kuniyoshi K, et al. The IκB kinase complex regulates the stability of cytokine-encoding mRNA induced by TLR-IL-1R by controlling degradation of regnase-1. Nature immunology. 2011 Oct;12(12):1167–75. 196. Uehata T, Iwasaki H, Vandenbon A, Matsushita K, Hernandez-Cuellar E, Kuniyoshi K, et al. Malt1-induced cleavage of regnase-1 in CD4(+) helper T cells regulates immune activation. Cell. 2013 May;153(5):1036–49. 197. Garg A v, Amatya N, Chen K, Cruz JA, Grover P, Whibley N, et al. MCPIP1 Endoribonuclease Activity Negatively Regulates Interleukin-17-Mediated Signaling and Inflammation. Immunity. 2015/08/25. 2015 Sep 15;43(3):475–87. 198. Bugara B, Konieczny P, Wolnicka-Glubisz A, Eckhart L, Fischer H, Skalniak L, et al. MCPIP1 contributes to the inflammatory response of UVB-treated keratinocytes. Journal of dermatological science. 2017 Jul;87(1):10–8. 199. Takaishi M, Satoh T, Akira S, Sano S. Regnase-1, an Immunomodulator, Limits the IL-36/IL-36R Autostimulatory Loop in Keratinocytes to Suppress Skin Inflammation. Vol. 138, The Journal of investigative dermatology. United States; 2018. p. 1439–42. 200. Konieczny P, Lichawska-Cieslar A, Kwiecinska P, Cichy J, Pietrzycka R, Szukala W, et al. Keratinocyte-specific ablation of Mcpip1 impairs skin integrity and promotes local and systemic inflammation. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 2019 Dec;97(12):1669–84. 201. Miao R, Huang S, Zhou Z, Quinn T, van Treeck B, Nayyar T, et al. Targeted disruption of MCPIP1/Zc3h12a results in fatal inflammatory disease. Immunology and cell biology. 2013 May;91(5):368–76. 202. Losko M, Dolicka D, Pydyn N, Jankowska U, Kedracka-Krok S, Kulecka M, et al. Integrative genomics reveal a role for MCPIP1 in adipogenesis and adipocyte metabolism. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2020 Dec;77(23):4899–919. 203. Lipert B, Wegrzyn P, Sell H, Eckel J, Winiarski M, Budzynski A, et al. Monocyte chemoattractant protein-induced protein 1 impairs adipogenesis in 3T3-L1 cells. Biochimica et biophysica acta. 2014 Apr;1843(4):780–8. 204. Wang K, Niu J, Kim H, Kolattukudy PE. Osteoclast precursor differentiation by MCPIP via oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, and autophagy. Journal of molecular cell biology. 2011/10/11. 2011 Dec;3(6):360–8. 205. Labedz-Maslowska A, Lipert B, Berdecka D, Kedracka-Krok S, Jankowska U, Kamycka E, et al. Monocyte Chemoattractant Protein-Induced Protein 1 (MCPIP1) Enhances Angiogenic and Cardiomyogenic Potential of Murine Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. PloS one. 2015 Jul 27;10(7):e0133746–e0133746. 206. Niu J, Azfer A, Zhelyabovska O, Fatma S, Kolattukudy PE. Monocyte chemotactic protein (MCP)-1 promotes angiogenesis via a novel transcription factor, MCP-1-induced protein (MCPIP). The Journal of biological chemistry. 2008/03/24. 2008 May 23;283(21):14542–51. 207. Roy A, Zhang M, Saad Y, Kolattukudy PE. Antidicer RNAse activity of monocyte chemotactic protein-induced protein-1 is critical for inducing angiogenesis. American journal of physiology Cell physiology. 2013/09/18. 2013 Nov 15;305(10):C1021–32. 208. Lyu JH, Park D-W, Huang B, Kang SH, Lee SJ, Lee C, et al. RGS2 Suppresses Breast Cancer Cell Growth via a MCPIP1-Dependent Pathway. Journal of Cellular Biochemistry. 2015 Feb 1;116(2):260–7. 209. Boratyn E, Nowak I, Karnas E, Ryszawy D, Wnuk D, Polus A, et al. MCPIP1 overexpression in human neuroblastoma cell lines causes cell-cycle arrest by G1/S checkpoint block. Journal of cellular biochemistry. 2020 Jun;121(5–6):3406–25. 210. Boratyn E, Nowak I, Horwacik I, Durbas M, Mistarz A, Kukla M, et al. Monocyte Chemoattractant Protein-Induced Protein 1 Overexpression Modulates Transcriptome, Including MicroRNA, in Human Neuroblastoma Cells. Journal of cellular biochemistry. 2016 Mar;117(3):694–707. 211. Boudouresque F, Siret C, Dobric A, Silvy F, Soubeyran P, Iovanna J, et al. Ribonuclease MCPiP1 contributes to the loss of micro-RNA-200 family members in pancreatic cancer cells. Oncotarget. 2018 Nov;9(89):35941–61. 212. Ligeza J, Marona P, Gach N, Lipert B, Miekus K, Wilk W, et al. MCPIP1 contributes to clear cell renal cell carcinomas development. Angiogenesis. 2017;20(3). 213. Lichawska-Cieslar A, Pietrzycka R, Ligeza J, Kulecka M, Paziewska A, Kalita A, et al. RNA sequencing reveals widespread transcriptome changes in a renal carcinoma cell line. Oncotarget. 2018 Jan 16;9(9):8597–613. 214. Gorka J, Marona P, Kwapisz O, Rys J, Jura J, Miekus K. The anti-inflammatory protein MCPIP1 inhibits the development of ccRCC by maintaining high levels of tumour suppressors. European journal of pharmacology. 2020 Sep;888:173591. 215. Calonge E, Alonso-Lobo JM, Escandón C, González N, Bermejo M, Santiago B, et al. c/EBPbeta is a major regulatory element driving transcriptional activation of the CXCL12 promoter. Journal of molecular biology. 2010 Feb;396(3):463–72. 216. Pinato DJ, Brown MW, Trousil S, Aboagye EO, Beaumont J, Zhang H, et al. Integrated analysis of multiple receptor tyrosine kinases identifies Axl as a therapeutic target and mediator of resistance to sorafenib in hepatocellular carcinoma. British journal of cancer. 2019/02/15. 2019 Mar;120(5):512–21. 217. Zeng S, Shen WH, Liu L. Senescence and Cancer. Cancer translational medicine. 2018/06/29. 2018;4(3):70–4. 218. Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM. MET signalling: principles and functions in development, organ regeneration and cancer. Nature reviews Molecular cell biology. 2010 Dec;11(12):834–48. 219. Gupta K, Miller JD, Li JZ, Russell MW, Charbonneau C. Epidemiologic and socioeconomic burden of metastatic renal cell carcinoma (mRCC): a literature review. Cancer treatment reviews. 2008 May;34(3):193–205. 220. Peycelon M, Hupertan V, Comperat E, Renard-Penna R, Vaessen C, Conort P, et al. Long-term outcomes after nephron sparing surgery for renal cell carcinoma larger than 4 cm. The Journal of urology. 2009 Jan;181(1):35–41. 221. Rini BI, Atkins MB. Resistance to targeted therapy in renal-cell carcinoma. The Lancet Oncology. 2009 Oct;10(10):992–1000. 222. Coussens LM, Werb Z. Inflammation and cancer. Nature. 2002 Dec 19;420(6917):860–7. 223. Takeuchi O. Endonuclease Regnase-1/Monocyte chemotactic protein-1-induced protein-1 (MCPIP1) in controlling immune responses and beyond. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2018 Jan;9(1). 224. Abbas T, Dutta A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nature reviews Cancer. 2009 Jun;9(6):400–14. 225. Menon SS, Guruvayoorappan C, Sakthivel KM, Rasmi RR. Ki-67 protein as a tumour proliferation marker. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 2019 Apr;491:39–45. 226. Xie Y, Chen L, Ma X, Li H, Gu L, Gao Y, et al. Prognostic and clinicopathological role of high Ki-67 expression in patients with renal cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. Scientific reports. 2017 Mar 13;7:44281. 227. Higgs G, Slack F. The multiple roles of microRNA-155 in oncogenesis. Journal of clinical bioinformatics. 2013 Sep 28;3(1):17. 228. Zhang L, Wang W, Li X, He S, Yao J, Wang X, et al. MicroRNA-155 promotes tumor growth of human hepatocellular carcinoma by targeting ARID2. International journal of oncology. 2016 Jun;48(6):2425–34. 229. Gao Y, Ma X, Yao Y, Li H, Fan Y, Zhang Y, et al. miR-155 regulates the proliferation and invasion of clear cell renal cell carcinoma cells by targeting E2F2. Oncotarget. 2016 Apr;7(15):20324–37. 230. Albini A, Tosetti F, Benelli R, Noonan DM. Tumor Inflammatory Angiogenesis and Its Chemoprevention. Cancer Research. 2005 Dec 1;65(23):10637 LP – 10641. 231. Ono M. Molecular links between tumor angiogenesis and inflammation: inflammatory stimuli of macrophages and cancer cells as targets for therapeutic strategy. Cancer science. 2008 Aug;99(8):1501–6. 232. Mathieu J, Zhang Z, Nelson A, Lamba DA, Reh TA, Ware C, et al. Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency. Stem cells (Dayton, Ohio). 2013 Sep;31(9):1737–48. 233. Lu H, Forbes RA, Verma A. Hypoxia-inducible factor 1 activation by aerobic glycolysis implicates the Warburg effect in carcinogenesis. The Journal of biological chemistry. 2002 Jun;277(26):23111–5. 234. Petreaca ML, Yao M, Liu Y, Defea K, Martins-Green M. Transactivation of vascular endothelial growth factor receptor-2 by interleukin-8 (IL-8/CXCL8) is required for IL-8/CXCL8-induced endothelial permeability. Molecular biology of the cell. 2007/10/10. 2007 Dec;18(12):5014–23. 235. Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 2009 Jun;119(6):1420–8. 236. Wu C-Y, Tsai Y-P, Wu M-Z, Teng S-C, Wu K-J. Epigenetic reprogramming and post-transcriptional regulation during the epithelial–mesenchymal transition. Trends in Genetics. 2012;28(9):454–63. 237. Marona P, Gorka J, Mazurek Z, Wilk W, Rys J, Majka M, et al. MCPIP1 downregulation in clear cell renal cell carcinoma promotes vascularization and metastatic progression. Cancer Research. 2017;77(18). 238. Zhuang J, Wu Y, Chen L, Liang S, Wu M, Zhou L, et al. Single-Cell Mobility Analysis of Metastatic Breast Cancer Cells. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany). 2018 Dec;5(12):1801158. 239. Jeon H-M, Lee J. MET: roles in epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Annals of translational medicine. 2017 Jan;5(1):5. 240. Kucia M, Reca R, Miekus K, Wanzeck J, Wojakowski W, Janowska-Wieczorek A, et al. Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis. Stem cells (Dayton, Ohio). 2005 Aug;23(7):879–94. 241. Copple BL. Hypoxia stimulates hepatocyte epithelial to mesenchymal transition by hypoxia-inducible factor and transforming growth factor-beta-dependent mechanisms. Liver international : official journal of the International Association for the Study of the Liver. 2010 May;30(5):669–82. 242. Zhang Q, Bai X, Chen W, Ma T, Hu Q, Liang C, et al. Wnt/β-catenin signaling enhances hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma via crosstalk with hif-1α signaling. Carcinogenesis. 2013 May;34(5):962–73. 243. Yang M-H, Wu M-Z, Chiou S-H, Chen P-M, Chang S-Y, Liu C-J, et al. Direct regulation of TWIST by HIF-1alpha promotes metastasis. Nature cell biology. 2008 Mar;10(3):295–305. 244. Yang M-H, Wu K-J. TWIST activation by hypoxia inducible factor-1 (HIF-1): implications in metastasis and development. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2008 Jul;7(14):2090–6. 245. Cheng Z-X, Sun B, Wang S-J, Gao Y, Zhang Y-M, Zhou H-X, et al. Nuclear factor-κB-dependent epithelial to mesenchymal transition induced by HIF-1α activation in pancreatic cancer cells under hypoxic conditions. PloS one. 2011;6(8):e23752. 246. Yang Y, Ahn Y-H, Gibbons DL, Zang Y, Lin W, Thilaganathan N, et al. The Notch ligand Jagged2 promotes lung adenocarcinoma metastasis through a miR-200-dependent pathway in mice. The Journal of clinical investigation. 2011/03/14. 2011 Apr;121(4):1373–85. 247. Gustafsson M v, Zheng X, Pereira T, Gradin K, Jin S, Lundkvist J, et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Developmental cell. 2005 Nov;9(5):617–28. 248. Zhang X, Zhao X, Shao S, Zuo X, Ning Q, Luo M, et al. Notch1 induces epithelial-mesenchymal transition and the cancer stem cell phenotype in breast cancer cells and STAT3 plays a key role. International journal of oncology. 2015 Mar;46(3):1141–8. 249. Skalniak A, Boratyn E, Tyrkalska SD, Horwacik I, Durbas M, Lastowska M, et al. Expression of the monocyte chemotactic protein-1-induced protein 1 decreases human neuroblastoma cell survival. Oncology reports. 2014 May;31(5):2385–92. 250. Yao X, Qian C-N, Zhang Z-F, Tan M-H, Kort EJ, Yang XJ, et al. Two distinct types of blood vessels in clear cell renal cell carcinoma have contrasting prognostic implications. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2007 Jan;13(1):161–9. 251. Ciesla M, Marona P, Kozakowska M, Jez M, Seczynska M, Loboda A, et al. Heme oxygenase-1 controls an HDAC4-MIR-206 pathway of oxidative stress in rhabdomyosarcoma. Cancer Research. 2016;76(19). 252. Dai JY, DeFrances MC, Zou C, Johnson CJ, Zarnegar R. The Met protooncogene is a transcriptional target of NF kappaB: implications for cell survival. Journal of cellular biochemistry. 2009 Aug;107(6):1222–36. 253. Papaetis GS, Syrigos KN. Sunitinib: a multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor in the era of molecular cancer therapies. BioDrugs : clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy. 2009;23(6):377–89. 254. Wengerodt D, Schmeer C, Witte OW, Kretz A. Amitosenescence and Pseudomitosenescence: Putative New Players in the Aging Process. Cells. 2019 Nov;8(12). 255. Hwang HS, Go H, Park J-M, Yoon SY, Lee J-L, Jeong SU, et al. Epithelial-mesenchymal transition as a mechanism of resistance to tyrosine kinase inhibitors in clear cell renal cell carcinoma. Laboratory Investigation. 2019;99(5):659–70. 256. Dong J, Zhai B, Sun W, Hu F, Cheng H, Xu J. Activation of phosphatidylinositol 3-kinase/AKT/snail signaling pathway contributes to epithelial-mesenchymal transition-induced multi-drug resistance to sorafenib in hepatocellular carcinoma cells. PloS one. 2017 Sep 21;12(9):e0185088–e0185088. 257. Mizumoto A, Yamamoto K, Nakayama Y, Takara K, Nakagawa T, Hirano T, et al. Induction of Epithelial-Mesenchymal Transition via Activation of Epidermal Growth Factor Receptor Contributes to Sunitinib Resistance in Human Renal Cell Carcinoma Cell Lines. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2015 Nov 1;355(2):152 LP – 158. 258. Li Y, Chen G, Han Z, Cheng H, Qiao L, Li Y. IL-6/STAT3 Signaling Contributes to Sorafenib Resistance in Hepatocellular Carcinoma Through Targeting Cancer Stem Cells. OncoTargets and therapy. 2020 Sep 30;13:9721–30. 259. Tomida C, Yamagishi N, Nagano H, Uchida T, Ohno A, Hirasaka K, et al. Antiangiogenic agent sunitinib induces epithelial to mesenchymal transition and accelerates motility of colorectal cancer cells. The journal of medical investigation : JMI. 2017;64(3.4):250–4. 260. Tian X, Liu Z, Niu B, Zhang J, Tan TK, Lee SR, et al. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. Journal of biomedicine & biotechnology. 2011/10/11. 2011;2011:567305. 261. HAYFLICK L. THE LIMITED IN VITRO LIFETIME OF HUMAN DIPLOID CELL STRAINS. Experimental cell research. 1965 Mar;37:614–36. 262. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LCW, Douma S, van Doorn R, Desmet CJ, et al. Oncogene-Induced Senescence Relayed by an Interleukin-Dependent Inflammatory Network. Cell. 2008 Jun 13;133(6):1019–31. 263. Acosta JC, O’Loghlen A, Banito A, Guijarro M v, Augert A, Raguz S, et al. Chemokine signaling via the CXCR2 receptor reinforces senescence. Cell. 2008 Jun;133(6):1006–18. 264. Xu C, Kim N-G, Gumbiner BM. Regulation of protein stability by GSK3 mediated phosphorylation. Cell cycle (Georgetown, Tex). 2009 Dec 15;8(24):4032-9