Uniwersytet Jagielloński

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Zakład Biotechnologii Medycznej

Rozwój metod i modeli badawczych umożliwiających selekcję oraz potwierdzenie specyficzności i mechanizmu działania innowacyjnych związków małocząsteczkowych celujących w białka kompleksu SWI/SNF

Rozprawa doktorska: Karolina Pyziak Promotor rozprawy: Dr hab. Agnieszka Łoboda Promotor pomocniczy: Dr Anna Wróbel

Podziękowania

Pragnę podziękować Promotor dr hab. Agnieszce Łobodzie, prof. UJ

oraz Promotor Pomocniczej dr Annie Wróbel za cenne wskazówki i uwagi merytoryczne, które stanowiły nieocenioną pomoc w powstaniu tej rozprawy doktorskiej.

Serdecznie dziękuję Panu prof. dr hab. Józefowi Dulakowi, kierownikowi

Zakładu Biotechnologii Medycznej WBBiB UJ za umożliwienie mi przeprowadzenia przewodu doktorskiego w Zakładzie Biotechnologii Medycznej WBBiB UJ w ramach współpracy z firmą Ryvu Therapeutics S.A.

Dziękuję dr Tomaszowi Rzymskiemu za zaufanie, wsparcie oraz wiarę w moje możliwości.

Dziękuję dr Krzysztofowi Brzózce za okazanie mi zaufania i umożliwienie realizacji doktoratu bez konieczności rezygnacji z kariery zawodowej.

Dziękuję dr Kamilowi Sitarzowi oraz dr Paulinie Węgrzyn za rozwiązywanie spraw formalno-prawnych.

Dziękuję wszystkim współpracownikom z Ryvu Therapeutics, z którymi mogłam współpracować podczas realizacji projektu. Za pomoc w eksperymentach, wsparcie merytoryczne, jak i prywatne.

Szczególne słowa podziękowania składam moim Najbliższym za cierpliwość, wyrozumiałość i okazane wsparcie, bez których napisanie tej pracy nie byłoby możliwe.

Praca doktorska wykonana we współpracy pomiędzy Wydzialem Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego z firmą Ryvu Therapeutics S.A. w Krakowie w ramach ścieżki edukacyjnej Doktorat wdrożeniowy. Projekt został zatwierdzony przez Radę Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ na posiedzeniu w dniu 23 maja 2017 r., a następnie zakwalifikowany do finansowania przez MNiSW decyzją z dnia 24 lipca 2017 r. (umowa nr 31/DW/2017/01/1).

2

Spis treści

Wykaz skrótów	6

Streszczenie	10

Abstract	12

Wstęp teoretyczny	14

Budowa i funkcja kompleksu SWI/SNF	14

Budowa kompleksu SWI/SNF	15

Budowa i funkcja białek katalitycznych kompleksu SWI/SNF	16

Regulacja ekspresji genów przez kompleks SWI/SNF.	19

Kompleks SWI/SNF w komórkach nowotworowych	20

Potencjalna terapia dla nowotworów z mutacją w genie SMARCA4	22

Wczesny proces odkrywania nowych leków	23

Celowane podejście do rozwoju nowych leków	24

1.4.1.1	Dostępne inhibitory białka BRM	28

Fenotypowe podejście do rozwoju nowych leków	30

Cel pracy	31

Materiały i metody	32

Analizy bioinformatyczne	32

Narzędzie MultiDep (linie komórkowe)	32

Analizy wykonane z wykorzystaniem portalu DepMap	33

Analizy wykonane z wykorzystaniem portalu cBioPortal	34

Hodowla komórkowa i kontrola jakości dla linii modelowych	34

CRISPR	36

Procedura CRISPR i selekcji klonalnej	39

Transfekcja plazmidem pcDNA3.1+UBC_SMARCA4_FLAG	40

Transfekcja siRNA	41

Procedura transfekcji z wykorzystaniem odczynnika HiPerFect	42

Procedura transfekcji z wykorzystaniem odczynnika RNAiMAX	43

Krótkoterminowy test żywotności	43

Długoterminowy test żywotności	45

Pomiar potencjału redukcyjnego komórek (AlamarBlue)	46

Wizualizacja komórek na płytkach z wykorzystaniem fioletu krystalicznego	47

Kontrolny długoterminowy test żywotności w formacie płytki 96-dołkowej	47

PCR w czasie rzeczywistym	48

Izolacja RNA z komórek	48

Izolacja RNA z materiału tkankowego	48

Procedura reakcji odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym	48

Sekwencjonowanie RNA (RNAseq)	50

Sekwencjonowanie RNA po wyciszeniu genu SMARCA2	51

Sekwencjonowanie RNA po traktowaniu związkiem referencyjnym	51

Western Blot	52

Izolacja białka z komórek	52

Izolacja frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej	52

Izolacja białka z materiału tkankowego	53

Procedura Western Blot	53

Dot Blot	54

Manualny Dot Blot	54

Dot Blot z wykorzystaniem Labcyte Echo	55

Metody pozwalające na walidację oddziaływań białko-ligand	55

CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego – krzywa denaturacji	57

CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego – zakres stężeń	58

CETSA z wykorzystaniem żywych komórek	58

Optymalizacja zmodyfikowanej metody Thermal Shift	59

Test wnikania związku do komórek (ang. cellular uptake)	62

Analiza interakcji białek z DNA (ChIP-seq)	64

Przygotowanie materiału oraz analiza wyników	65

AlphaLISA	66

Przygotowanie materiału z hodowli komórkowej	66

Przygotowanie materiału tkankowego	67

Procedura AlphaLISA	67

Badania in vivo	68

Wzrost ksenoprzeszczepu pary linii izogenicznych w myszach NOD/SCID	68

Wzrost ksenoprzeszczepu linii izogenicznych w myszach BALB/c nude	69

Wzrost ksenoprzeszczepu linii komórkowych: A549, NCI-H2030, NCI-H1944	69

Badanie farmakokinetyczne	70

Badania farmakodynamiczne (A549, Athymic nude)	71

Badania farmakodynamiczne (A549, BALB/c nude)	71

Wysokoprzepustowy fenotypowy test przesiewowy	72

Kontrola jakości testów wysokoprzepustowych	73

Etap I: Optymalizacja fenotypowego testu przesiewowego	74

Połowiczny czas podziału	74

Określenie przebiegu eksperymentu	75

Końcowe warunki testu przesiewowego	75

Etap II: Walidacja warunków fenotypowego testu przesiewowego	76

Parametry wykorzystywane do selekcji związków	76

Badanie przesiewowe biblioteki LOPAC1280	76

Analiza statystyczna wyników	77

Wyniki	78

Opracowanie koncepcji strategicznej projektu (podejście celowane)	78

Analizy bioinformatyczne	78

Biologiczna walidacja celu molekularnego	84

Metodyka umożliwiająca selekcję i charakterystykę związków małocząsteczkowych celujących w białko BRM	88

Zmodyfikowana metoda Thermal Shift	88

CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego	95

Test wnikania związku referencyjnego do komórek	98

CETSA z wykorzystaniem żywych komórek	99

Izogeniczne linie komórkowe	100

Stworzenie linii komórkowej z usuniętym genem SMARCA4	100

Odwrócenie fenotypu linii komórkowej z usuniętym genem SMARCA4	102

Stworzenie linii komórkowej z usuniętym genem SMARCA2	103

Sprawdzenie fenotypu komórek linii izogenicznych po wyciszeniu ekspresji genu

SMARCA2 i/lub SMARCA4	104

Charakterystyka panelu linii izogenicznych	107

Selekcja i charakterystyka panelu linii nowotworowych	111

Biomarkery odpowiedzi komórkowej na zahamowanie białka BRM.	117

Analizy RNAseq	117

Analizy ChIPseq	126

Badania in vivo	129

Wybór linii komórkowej do badań farmakodynamicznych	129

Badania farmakokinetyczne i farmakodynamiczne	133

Metoda umożliwiająca selekcję związków małocząsteczkowych celujących w nieopisany dotychczas cel molekularny	138

Optymalizacja wysokoprzepustowego fenotypowego testu przesiewowego	138

Walidacja warunków fenotypowego testu przesiewowego	140

Określenie algorytmu do selekcji związków w kolejnych fenotypowych testach przesiewowych	142

Dyskusja	143

Opracowanie koncepcji strategicznej projektu	143

Metodyka umożliwiająca selekcję i charakterystykę związków małocząsteczkowych celujących w białko BRM.	146

Metody pozwalające na walidację oddziaływań białko-ligand	146

Test wnikania związku do komórek	149

Linie izogeniczne	150

Panel linii komórkowych	153

Zmiany w poziomie biomarkerów in vitro i in vivo	155

Kaskada testów przesiewowych i ortogonalnych	156

Metoda umożliwiająca selekcję związków małocząsteczkowych celujących w nieopisany dotychczas cel molekularny (podejście fenotypowe)	159

Podsumowanie i wnioski końcowe	160

Spis Literatury	161

Wykaz skrótów

ACN – acetonitryl

ADME – podawanie, dystrybucja, metabolizm, wydalanie, ang. administration, distribution, metabolism and excretion

AmpR – gen oporności na ampicylinę, ang. ampicilin resistance ARP7/9 – białka powiązane z aktyną, ang. actin related protein ATP-aza – adenozynotrifosfataza

ATCC – zbiór linii komórkowych, ang. American type culture collection

AURKA – kinaza Aurora A, ang. Aurora kinase A

BAF – czynniki związane z BRG1 lub BRM, ang. BRG1- or BRM- associated factors

bGH – bydlęcy hormon wzrostu, ang. bovine growth hormone

BICRA – gen kodujący białko GLTSCR1 wchodzące w skład kompleksu GBAF, ang. BRD4-interacting chromatin remodeling complex associated

BICRAL – gen kodujący białko GLTSCR1L wchodzące w skład kompleksu GBAF, ang. BICRA-like

BRCA1/2 – gen podatności na raka piersi 1/2, ang. breast cancer susceptibility gene 1/2 BRD7/9 – białko 7/9 zawierające bromodomenę, ang. bromodomain containing 7/9 BRG1 – związany z Brahma gen 1, ang. Brahma-related gene 1

BRIT – białko związane z chromatyną biorące udział w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, ang. BRCT- repeat inhibitor of hTERT expression

BRM – białko Brahma

BSA – surowicza albumina wołowa, ang. bovine serum albumin

CADD – wspomagane komputerowo projektowanie leków, ang. computer-aided drug design

Cas9 – endonukleaza Cas9, ang. CRISPR-associated protein 9

CDK 4/6 – kinaza 4/6 zależna od cyklin, ang. cyclin-dependent kinase 4/6

CETSA – komórkowy test przesunięcia termicznego, ang. cellular thermal shift assay

CERES – parametr zależności genowej dla techniki CRISPR, ang. CERESdependency score

CHD – helikaza wiążąca DNA o charakterze chromodomeny, ang. chromodomain helicase DNA- binding

ChIP-seq – analiza interakcji białek z DNA, ang. chromatin immunoprecipitation-sequencing

CLS – zbiór linii komórkowych, ang. cell lines service

CRISPR – zgrupowane, regularnie przerywane, krótkie powtórzenia palindromiczne, ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats

CT – cykl progowy, ang. cycle threshold

CTG – test żywotności oparty na luminescencji, ang. CellTiter-Glo® luminescent cell viability assay

DEG – geny o zróżnicowanej ekspresji, ang. differentially expressed genes

DEMETER2 – parametr zależności genowej dla techniki RNAi, ang. DEMETERdependency score

DGE – różnicowa ekspresja genów, ang. differential genes expression

DMPK – metabolizm środków leczniczych i ich parametry farmakokinetyczne, ang. drug metabolism and pharmacokinetics

DMSO – dimetylosulfotlenek, ang. dimethyl sulfoxide

DNMTs – metylotransferazy DNA, ang. DNA methyltransferases

DOX – doksorubicyna, ang. doxorubicin

DRIVE – baza danych reprezentująca wpływ RNAi na żywotność komórek nowotworowych, ang. deep RNAi interrogation of viability effects in cancer

DSF – różnicowa fluorymetria skaningowa, ang. differential scanning fluorimetry

ECACC – zbiór linii komórkowych, ang. the European collection of authenticated cell cultures

EC50 – połowiczne stężenie efektywne, ang. 50% effective concentration

EZH2 – wzmacniacz białka homologicznego do Zeste 2, ang. enhancer of zeste homolog 2 FBDD – projektowanie leków oparte na fragmentach, ang. fragment-based drug design FBS – płodowa surowica bydlęca, ang. fetal bovine serum

GAPDH – białko/gen o konstytutywnej ekspresji, ang. glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GBAF – niekanoniczny kompleks BAF zwany także ncBAF, ang. GLTSCR1/like-containing BAF complex

GFP – zielone białko fluorescencyjne, ang. green fluorescent protein

GI50 – stężenie hamujące wzrost komórek w 50%, ang. 50% growth inhibition

GLTSCR1 – białko wchodzące w skład kompleksu GBAF, ang. glioma tumor suppressor candidate region gene 1 protein

GLTSCR1L – białko wchodzące w skład kompleksu GBAF, ang. GLTSCR1-like

HDR – rekombinacja homologiczna, ang. homology-directed repair

HEPES – środek buforujący, ang. (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) HIT – cząsteczka aktywna

HTS – wysokoprzepustowy test przesiewowy, ang. high throughput screening

IC50 – połowiczne stężenie hamujące, ang. 50% inhibitory concentration

IHC – badanie immunohistochemiczne, ang. immunohistochemistry

ISWI – kompleks remodelujący chromatynę naśladujący SWI, ang. imitation switch

ITS-G – Insulina-Transferyna-Selen

KIF11 – element rodziny kinezyny 11, ang. kinesin family member 11 KT – kontrola dla procedury transfekcji, traktowana kontrolnym siRNA LEAD – struktura wiodąca

LC-MS – chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas, ang. liquid chromatography-mass spectrometry

LC50 – stężenie powodujące śmierć 50% komórek, ang. 50% lethal concentration

ln – L-glutamina, ang. L-glutamine

MAX – czynnik transkrypcyjny, ang. MYC-associated factor X

Mock – próba traktowana czynnikiem transfekcyjnym

MST – mikrotermoforeza kapilarna, ang. microscale thermophoresis

NaP – pirogronian sodu, ang. sodium pyruvate

ncBAF – niekanoniczny kompleks BAF zwany także GBAF, ang. non-canonical BAF

NeoR/KanR - geny oporności na neomycynę i G418

NGS – sekwencjonowanie nowej generacji, ang. next-generation sequencing

NHEJ - scalanie niehomologicznych końców DNA, ang. non-homologous end-joining

NSCLC – niedrobnokomórkowy rak płuca, ang. non-small cell lung cancer

NT – kontrola dla procedury transfekcji, nietraktowana

Ori – punkt wyjściowy replikacji, ang. origin of replication

qPCR – ilościowy PCR, ang. quantitative polymerase chain reaction PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy, ang. polymerase chain reaction PO – podanie doustne, łac. per os

P/S – penicylina/streptomycyna, ang. penicillin/streptomycin

PAM – krótka sekwencja sąsiadująca, ang. protospacer adjacent motif

PBAF – BAF powiązany z polibromem, ang. polybromo-associated BAF

PBS – roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami, ang. phosphate-buffered saline

PD – badania farmakodynamiczne, ang. pharmacodynamics

PDD – proces odkrywania nowych leków bazujący na podejściu fenotypowym, ang. phenotype-based drug discovery

PK – badania farmakokinetyczne, ang. pharmacokinetics

PN – przez noc

PRC1/2 – kompleks białkowy z grupy Polycomb wyciszający ekspresję genów, ang. Polycomb Repressive Complex 1/2

PROTAC – chimera ukierunkowująca do proteolizy, ang. proteolysis-targeting chimera

PTMs – modyfikacje potranslacyjne, ang. post-translational modifications

pz – par zasad

RCB – zbiór linii komórkowych, ang. RIKEN cell bank

RFP – czerwone białko fluorescencyjne, ang. red fluorescent protein

RFU – względna jednostka fluorescencji, ang. relative fluorescence unit

RIPA + PI – bufor do lizy komórek z inhibitorami proteaz i fosfataz, ang. radioimmunoprecipitation assay buffer with protease and phosphatase inhibitors

RISC – indukowany przez RNA kompleks wyciszający, ang. RNA-induced silencing complex

RLU – względna jednostka luminescencji, ang. relative luminescence unit

RNAseq – sekwencjonowanie RNA, ang. RNA sequencing

RQ – względny poziom ekspresji genu, ang. relative quantification

rpm – ilość obrotów na minutę, ang. repeats per minute

S/B – sygnał do tła, ang. signal-to-background

SAR – zależność struktura-aktywność, ang. structure-activity relationship

SCCOHT- pierwotny rak drobnokomórkowy jajnika, typ hiperkalcemiczny, ang. small cell carcinoma of the ovary, hypercalcemic type

SCLC – drobnokomórkowy rak płuca, ang. small cell lung cancer

SD – odchylenie standardowe, ang. standard deviation

sgRNA - mała cząsteczka RNA kierująca nukleazę Cas do komplementarnych sekwencji DNA, ang.

single guide RNA

SMARCA2/4 – ludzki gen kodujący białko ATPazy BRM/BRG1, ang. SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily A, member 2/4

SnAC - domena odpowiedzialna za interakcję z histonami, ang. Snf ATP coupling

SPR – powierzchniowy rezonans plazmonowy, ang. surface plasmon resonance

SSXT – białko kodowane przez gen SS18, którego aberracje chromosomowe mogą być przyczyną powstania mięsaka maziowego, ang. Synovial Sarcoma X chromosome Translocated

SWI/SNF – zależny od ATP kompleks przebudowujący chromatynę, ang. switch/sucrose non- fermentable chromatin remodeling complex

TBS – sól fizjologiczna buforowana TRISem, ang. tris-buffered saline

TBST – bufor TBS z dodatkiem 0,1% Tween 20, ang. Tris buffered saline with 0.1% Tween 20

TDD – proces odkrywania leków bazujący na podejściu celowanym, ang. target-based drug discovery

TP – temperatura pokojowa

Tr – domena ATPazowo-helikazowa białek BRM i BRG1, odpowiedzialna za translokację TSA – metody sprawdzające zmiany w temperaturze topnienia białek, ang. thermal shift assays

Streszczenie

Jednym z mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolę ekspresji genów są kompleksy remodelujące chromatynę, takie jak SWI/SNF (ang. SWitch/Sucrose Non-Fermentable chromatin remodeling complex). Mogą one zmieniać lokalizację nici DNA względem nukleosomu powodując rozluźnienie lub skondensowanie chromatyny, co wpływa zarówno na aktywację, jak i represję ekspresji genów. Badania genomu nowotworowych linii komórkowych oraz próbek pobranych od pacjentów onkologicznych wskazały na wysoki odsetek alteracji w podjednostkach SWI/SNF, które obejmowały mutacje genu SMARCA4 (ang. SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily A, member 4) kodującego kluczowe dla funkcji kompleksu białko katalityczne - BRG1 (ang. Brahma-related gene 1). Według wstępnych przesłanek brak wspomnianej proteiny w komórkach nowotworowych uzależniał je od obecności innych regulatorów, takich jak homologiczne białko katalityczne – BRM (ang. Brahma), kodowane przez gen SMARCA2. Zaobserwowane zjawisko, nazwane syntetyczną letalnością, jest obecnie ogólnie wykorzystywanym mechanizmem do stworzenia nowych terapii przeciwnowotworowych, co jest głównym celem działań prowadzonych przez firmę Ryvu Therapeutics. W ramach niniejszej rozprawy doktorskiej podjęto się opracowania metodyki, która zostanie wykorzystana w procesie rozwoju nowych leków efektywnych u pacjentów z nowotworami charakteryzującymi się niefunkcjonalnym białkiem BRG1.

Wykorzystując dane bioinformatyczne umieszczone na portalach DepMap i cBioPortal potwierdzono wrażliwość komórek z mutacjami genu SMARCA4 na wyciszenie genu SMARCA2 oraz wskazano na komórki niedrobnokomórkowego raka płuca BRM+BRG1-, jako typ nowotworu o najwyższej wrażliwości. Według doniesień literaturowych, terapia selektywnymi inhibitorami BRM nie powinna wywołać toksyczności ogólnoustrojowej, jednak w przypadku podania związków o specyficzności dualnej wobec białek BRM i BRG1 brano pod uwagę wystąpienie znaczących efektów ubocznych. Rozwój małocząsteczkowych inhibitorów białka BRM wiązał się z wysokim ryzykiem, gdyż sekwencje aminokwasowe BRM i BRG1 są w 90% identyczne. Firma Ryvu Therapeutics zdecydowała się jednak podjąć to ryzyko i stworzyć kaskadę testów przesiewowych do selekcji i charakterystyki nowych związków małocząsteczkowych, których część została zoptymalizowana w ramach niniejszej rozprawy. W pracy doktorskiej skupiono się w głównej mierze na optymalizacji testów komórkowych, lecz w metodyce znalazły się także testy biofizyczne i badania in vivo. Metody sprawdzające wpływ związków na stabilność temperaturową białek BRM/BRG1

(zmodyfikowana metoda Thermal Shift, CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego, CETSA z wykorzystaniem żywych komórek wraz z testem wnikania związku do komórek) stworzyły unikalny zbiór metod, które mogą potwierdzić oddziaływanie związku z białkiem docelowym nie tylko w układzie wykorzystującym białko rekombinowane, ale także w lizacie komórkowym, a nawet w żywych komórkach. W ramach rozprawy doktorskiej stworzono także unikalny panel czterech komórkowych linii izogenicznych do badania aktywności i selektywności związków. Ponadto, wyselekcjonowano 19 ogólnodostępnych linii komórkowych reprezentujących w głównej mierze docelowe wskazanie terapeutyczne i zoptymalizowano z ich wykorzystaniem długoterminowy test żywotności. Kluczowym w procesie rozwoju nowych leków etapem jest określenie biomarkerów odpowiedzi komórek na terapię. W tym celu wykorzystano metody RNAseq i ChIPseq. W wyniku analiz wybrano dwa biomarkery bezpośrednie, których pomiar wykonywany był na poziomie genu (KRT80, qPCR) lub białka (Biomarker 2 – nazwa poufna, AlphaLISA). Dalsze badania in vivo pokazały, że KRT80 i Biomarker 2 mogą pełnić także funkcję biomarkerów farmakodynamicznych w modelu ksenoprzeszczepu linii komórkowej A549 w myszach szczepu Athymic nude. Wszystkie zoptymalizowane w ramach rozprawy testy zostały włączone w kaskadę testów stworzoną przez firmę Ryvu Therapeutics, co pokazuje ich wysoki potencjał wdrożeniowy.

Ze względu na wysoką trudność uzyskania selektywnych inhibitorów białka BRM zdecydowano się na równoległą optymalizację wysokoprzepustowego fenotypowego testu przesiewowego, w którym wykorzystano stworzoną w ramach rozprawy parę linii izogenicznych z i bez mutacji typu utrata funkcji w genie SMARCA4. Dzięki tej strategii zamierzano wyłonić związki aktywne w komórkach bez białka BRG1 o nowym mechanizmie działania. Zoptymalizowana metoda w formacie HTS jest obecnie dostępna do testu większych bibliotek związków małocząsteczkowych.

Podsumowując, badania wykonane w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej doprowadziły do zoptymalizowania metod umożliwiających testowanie małocząsteczkowych związków w formacie wysokoprzepustowym, co otwiera nowe możliwości dla rozwoju terapii skierowanej do pacjentów z nowotworami z niefunkcjonalnym białkiem BRG1.

Abstract

One of the mechanisms responsible for gene expression are chromatin remodeling complexes, such as SWI/SNF (SWitch/Sucrose Non-Fermentable chromatin remodeling complex). As the result of the complex interaction, nucleosomes can slide along the DNA, causing chromatin relaxation or condensation, which in turn can affect both the activation and repression of gene expression. Previous studies of the cancer cells and patient samples genome have detected a high percentage of SWI/SNF subunits alterations, which also included mutations in the SMARCA4 gene (SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily A, member 4), encoding the key catalytic protein of the complex - BRG1 (Brahma-related gene 1). According to the preliminary findings, the lack of BRG1 in cancer cells made them dependent on the presence of other regulators, including homologous catalytic protein - BRM (Brahma), encoded by the SMARCA2 gene. Such observed phenomenon, called synthetic lethality, is now a widely used mechanism for the development of new anti-cancer therapies and became the main focus of Ryvu Therapeutics' efforts.

The aim of the study conducted within this doctoral dissertation was to develop the methodology that could be used in the process of new drugs development, which can prove effective in patients with neoplasms characterized by non-functional BRG1 protein.

In the first step, the sensitivity of cells with SMARCA4 mutations to SMARCA2 silencing has been confirmed by bioinformatic analysis of data published on the DepMap and cBioPortal portals. Moreover, the BRM+BRG1- non-small cell lung cancer cells were identified as the most sensitive tumor type. According to the literature reports, a therapy with selective BRM inhibitors should not cause systemic toxicity, numerous side effects were however observed for compounds with dual specificity for BRM and BRG1 proteins. The development of BRM small molecule inhibitors was challenging, as the amino acid sequences of BRM and BRG1 are identical in 90%. Nevertheless, Ryvu Therapeutics decided to take the risk approach and create a cascade of screening tests for the selection and characterization of the new small molecule compounds. This doctoral dissertation mainly focused on the optimization of cellular tests, as well as biophysical and in vivo assays. The developed Thermal Shift-based assays, optimized for BRM or BRG1 protein, created a unique set of methods which enabled confirmation of the interaction of the compound with a target protein. As part of the doctoral dissertation, four isogenic cell lines have been created to study compounds' activity and selectivity. In addition, an extended cell lines panel, representing therapeutic potential, has

been selected and optimized to perform long-term viability studies. The key step in the new drug development process includes the determination of cellular biomarkers, which can be defined with the use of RNAseq and ChIPseq methods. As a result of such analyses, two direct biomarkers were selected (KRT80 – measured by qPCR and the confidential Biomarker 2 – evaluated by AlphaLISA). Further in vivo studies have shown that both KRT80 and Biomarker 2 could also act as pharmacodynamic biomarkers in the A549 xenograft model in Athymic nude mice. All optimized methods used in the dissertation work were included in the test cascade created by the Ryvu Therapeutics, which emphasizes their high application potential.

Due to the encountered challenges in the process of the selective BRM inhibitors development, the high-throughput phenotypic screening test has been developed in parallel. For assay optimization, the isogenic cell lines with and without loss of function mutations in the SMARCA4 gene were used in the study. As the result, it was intended to identify compounds, which will be able active only in cells lacking the BRG1 protein, and, will represent a new mechanism of action.

In conclusion, the project performed within this doctoral dissertation led to the development of a novel method for small molecule compound libraries testing in a high-throughput format which brings new hope for patients with BRG1-loss tumors.

Wstęp teoretyczny

Budowa i funkcja kompleksu SWI/SNF

Stabilna struktura nukleosomowa poprzez ograniczenie dostępności do sekwencji promotorowych i regulatorowych stanowi fizyczną przeszkodę dla maszynerii transkrypcyjnej [1–4], która musi zostać rozluźniona, aby ekspresja genów mogła przebiegać z należytą wydajnością. Poziom kondensacji chromatyny jest ściśle kontrolowany przez mechanizmy epigenetyczne (Rycina 1-1) [5–7]:

Rycina 1-1. Mechanizmy epigenetyczne wpływające na poziom kondensacji chromatyny [6].

Zmodyfikowana rycina zaczerpnięta z pracy Lee i in.[7]. PTMs - modyfikacje potranslacyjne histonów.

Kompleksy remodelujące klasyfikuje się w obrębie czterech podstawowych podrodzin różniących się między sobą białkiem katalitycznym, ATP-azą (adenozynotrifosfataza) oraz podjednostkami związanymi. Wyróżnia się: SWI/SNF (ang. SWItch/Sucrose Non-Fermentable chromatin remodeling complex), ISWI (naśladujący SWI, ang. imitation switch), CHD (helikaza wiążąca DNA o charakterze chromodomeny, ang. chromodomain helicase DNA-binding), oraz INO80 [8]. SWI/SNF jest jednym z najlepiej zbadanych kompleksów odpowiedzialnych za rearanżację [9, 10]. Jego budowa i funkcja wykazuje się niską zmiennością ewolucyjną [11–14], a główna rola w globalnej aktywacji ekspresji genów została dowiedziona nie tylko w przypadku ludzkiego organizmu, lecz także u much i drożdży [15].

Budowa kompleksu SWI/SNF

W skład SWI/SNF wchodzi od 12 do 15 podjednostek, które można podzielić na białka rdzeniowe, strukturalne, dodatkowe i katalityczne. Podjednostki rdzeniowe (BAF155, BAF170, BAF60a,b,c) tworzą platformę, która jest niezbędna do przyłączenia pozostałych białek i utworzenia poszczególnych podtypów kompleksu SWI/SNF takich jak kanoniczny BAF (ang. BRG1- or BRM- associated factors), PBAF (ang. polybromo-associated BAF) [16, 17] oraz niekanoniczny kompleks BAF (ncBAF, ang. non-canonical BAF), zwany także GBAF [18] (Rycina 1-2). Do białek rdzeniowych przyłączają się kolejno białka strukturalne i dodatkowe, tworząc unikalną powierzchnię zdolną do interakcji z innymi cząsteczkami. Kompleksy BAF i PBAF charakteryzuje obecność podjednostek rdzeniowych oraz białek BAF47 i BAF57. Rozróżnia je natomiast obecność pozostałych, wzajemnie wykluczających się białek specyficznych dla kompleksu BAF (BAF250a, BAF250b, BAF45d, SSXT ang. synovial sarcoma X chromosome translocated) oraz PBAF (BAF200, BRD7 ang. bromodomain containing 7, BAF45a i BAF180) [19]. Ostatni z dotychczas odkrytych podtypów kompleksu SWI/SNF – GBAF składa się z białek rdzeniowych (z wyjątkiem BAF170), wzajemnie wykluczających się podjednostek GLTSCR1 (ang. glioma tumor suppressor candidate region gene 1 protein) i GLTSCR1L (ang. GLTSCR1-like) oraz białek BRD9 i SSXT, które wchodzą także w skład kompleksu BAF [20]. Bardziej wnikliwa analiza składu kompleksów pokazała także obecność dodatkowych, pomocniczych podjednostek zaangażowanych w proces ich składania i określenia funkcjonalności w poszczególnych tkankach organizmu [21]. Większość białek wchodzących w skład kompleksu SWI/SNF reguluje jego specyficzność, wpływając m.in. na rekrutację do poszczególnych lokalizacji genomowych. Niektóre z podjednostek (rdzeniowe i strukturalne, obecne odpowiednio we wszystkich i poszczególnych podtypach SWI/SNF) pełnią dodatkową funkcję utrzymania integralności kompleksu (Rycina 1-2). Obecność wspomnianych białek jest niezbędna do utworzenia prawidłowej formy BAF, PBAF czy GBAF, zawierającej kluczowe dla ich aktywności białko katalityczne BRM (ang. Brahma) lub BRG1 (ang. Brahma-related gene 1) [22]. Białko BRM wchodzi w skład kompleksów BAF i GBAF, natomiast BRG1 jest obecne we wszystkich podtypach SWI/SNF. Pomimo wysokiego podobieństwa, podtypy kompleksu SWI/SNF pełnią nieco inne funkcje w fizjologii komórki. Kompleksy BAF i GBAF są zaangażowane w procesy związane z prenatalnym rozwojem organizmu, natomiast rola PBAF jest kluczowa w mitozie i regulacji różnicowania komórek [18, 24].

Rycina 1-2. Schemat obrazujący budowę trzech podtypów kompleksu SWI/SNF (kanoniczne BAF i PBAF oraz niekanoniczny GBAF). Białka rdzeniowe zostały oznaczone kolorem czarnym, dodatkowe podjednostki szarym, natomiast białka strukturalne oznaczono za pomocą szarych owali z bordowym konturem. Każdy z kompleksów zawiera także rdzeń katalityczny (bordowy owal) utworzony przez białko BRM (BAF, GBAF) lub BRG1 (BAF, PBAF i GBAF). Przerywana linia konturu przy białkach GLSCR1/1L wynika z małej liczby doniesień literaturowych świadczących o jego funkcji strukturalnej [18, 25]. Białka rdzeniowe i strukturalne są niezbędne do utworzenia prawidłowej formy (zawierającej rdzeń katalityczny) poszczególnych podtypów kompleksu. BAF170 i BAF155 tworzą homo- lub heterodimery, w danym podtypie kompleksu może występować tylko jedno z nich.

Budowa i funkcja białek katalitycznych kompleksu SWI/SNF

BRM (kodowane przez SMARCA2) lub BRG1 (kodowane przez SMARCA4) tworzą centrum katalityczne, które dzięki swojej budowie domenowej jest w stanie zmienić umiejscowienie nukleosomów na drodze zależnej od ATP translokacji DNA. Zmiana lokalizacji nici DNA względem nukleosomu powoduje rozluźnienie chromatyny dzięki jednemu z trzech mechanizmów obejmujących: przesunięcie nukleosomu (pozycjonowanie), jego usunięcie lub wysunięcie dimeru histonów H2A:H2B [6, 26–29] (Rycina 1-3).

Kluczowymi dla wszystkich mechanizmów są domeny ATPazowa i helikazowa, które na potrzeby niniejszego rozdziału rozprawy doktorskiej zostały nazwane domeną Tr (odpowiedzialna za translokację). Wcześniejsze badania sugerowały, że niezbędną do przeprowadzenia procesu rearanżacji jest także bromodomena [30, 31], która oddziałuje z modyfikacją potranslacyjną w postaci acetylowanej lizyny [32]. Jednak doświadczenia przeprowadzone z wykorzystaniem jej inhibitora (PFI-3), jak i metod inżynierii genetycznej nie potwierdziły kluczowej roli bromodomeny dla funkcji kompleksu SWI/SNF [33–35]. Domena Tr zostaje ustabilizowana w obrębie jednostki nukleosomu dzięki równoczesnemu przyłączeniu domeny wiążącej histon SnAC (ang. Snf ATP coupling), która pełni szczególną rolę podczas wymagającego energii procesu usunięcia nukleosomu lub dimeru H2A-H2B. Mechanizm decydujący o sile translokacji przekładającej się na przesunięcie lub usunięcie nukleosomu jest kontrolowany przez domenę HSA oraz mniejsze domeny post-HSA

i protrusion 1. Wymienione domeny, wchodzące w skład białka katalitycznego oddziałują bowiem z białkami powiązanymi z aktyną ARP7/9 (ang. actin related protein) i kontrolują wydajność i szybkość ATP-zależnej translokacji DNA [29] (Rycina 1-4 A). Motyw QLQ, jak i AT-Hook odpowiadają za dodatkowe oddziaływanie z białkami i DNA, natomiast funkcja domeny BRK nie została dotychczas poznana [36].

Rycina 1-3. Rearanżacja chromatyny przeprowadzana przez kompleks SWI/SNF. Zwiększenie dostępności DNA dla czynników transkrypcyjnych zostało zaznaczone na schemacie zielonym prostokątem ze strzałką, natomiast ograniczenie dostępności DNA oznaczono czarnym krzyżykiem. Czerwony owal reprezentuje łącznikowy histon H1.

W celu rozpoczęcia procesu reorganizacji chromatyny konieczne jest przemieszczenie nukleosomu do kieszeni wiążącej, której otworzenie może nastąpić wskutek zmiany konformacyjnej wywołanej np. rozpoznaniem PTMs przez jedno z białek wchodzących w skład SWI/SNF. Po otwarciu kieszeni wiążącej, domeny Tr i SnAC przyłączają się do jednostki nukleosomu (Rycina 1-4 B). Po ustabilizowaniu kompleksu w odpowiedniej konformacji następuje przesunięcie nici DNA względem powierzchni histonów, które jest możliwe dzięki obecności dwóch płatów RecA-podobnych (ang. RecA-like lobes, Dexx-lobe1, HELICc-lobe2) wchodzących w skład domeny Tr. Oba płaty łączą się z tą samą nicią kwasu DNA jeden za drugim, a następnie poprzez sekwencyjne łapanie i puszczanie nici DNA powodują jej przesunięcie o 1-2 pary zasad na każde zhydrolizowane ATP (Rycina 1-4 B, C). Na skutek przesuwania nici DNA za domeną Tr następuje nadmierne skręcenie helisy DNA oraz obniżenie poziomu jej skręcenia przed domeną Tr (zielona gwiazdka). Powstałe siły naprężające powodują zerwanie wiązania histonu z DNA i przesunięcie helisy w stronę

„wyjścia” z nukleosomu. Powtarzające się cykle zrywania i tworzenia połączeń DNA z histonami powodują przesunięcie nukleosomu. W sytuacji, gdy białko katalityczne przeprowadza wydajne i silne przesunięcia nici DNA może nastąpić równoczesne przerwanie

Rycina 1-4. Budowa oraz funkcjonowanie białek katalitycznych kompleksu SWI/SNF. A: Domeny oraz motywy wchodzące w skład ludzkich białek BRM i BRG1. Szare pole reprezentuje obszar stanowiący domenę Tr (odpowiedzialnej za translokację), w skład której wchodzą dwa płaty bezpośrednio odpowiedzialne za przesuwanie nici DNA względem powierzchni histonów. B: Schemat przedstawiający miejsce przyłączenia domen Tr i SnAC do jednostki nukleosomu. Czerwona i zielona gwiazdka oznaczają odpowiednio nadmierne i obniżone skręcenie helisy DNA powstałe na skutek przesuwania nici DNA przez domenę Tr; Strzałkami zaznaczono kierunek przesuwania nici DNA. C: Schemat obrazujący mechanizm, na bazie którego płaty wchodzące w skład domeny Tr przesuwają nić DNA względem powierzchni histonu. Schemat w sposób uproszczony obrazuje proces translokacji DNA nie uwzględniając dowiedzionego eksperymentalnie przesunięcia nici DNA o 1-2 pz na jedno zhydrolizowane ATP.

wielu połączeń pomiędzy DNA, a histonami i usunięcie dimeru H2A-H2B lub całego nukleosomu. Inną możliwością usunięcia całego oktameru histonów przez kompleks SWI/SNF jest wystąpienie sytuacji, gdy przesuwający się z dużą siłą/prędkością nukleosom zderzy się z nukleosomem sąsiadującym i spowoduje jego destabilizację i odłączenie od helisy DNA [29]. Translokacja przeprowadzana przez BRM i BRG1 przebiega w taki sam sposób, a wspomniane białka katalityczne charakteryzuje bardzo wysoka homologia (86%) [37]. Analiza identyczności sekwencji oraz stopnia jej podobieństwa (uwzględniająca reszty aminokwasowe, które mogą w podobny sposób oddziaływać z innymi cząsteczkami) dla poszczególnych domen

i motywów została przedstawiona poniżej (Tabela 1-1).

Tabela 1-1 Stopień identyczności i podobieństwa sekwencji poszczególnych domen białek BRM i BRG1. Analiza została przeprowadzona przez grupę CADD (wspomagane komputerowo projektowanie leków, ang. computer-aided drug design) firmy Ryvu Therapeutics.

.

Regulacja ekspresji genów przez kompleks SWI/SNF.

Kompleks SWI/SNF, poprzez wpływ na poziom kondensacji chromatyny ma zdolność kontroli poziomu ekspresji genów (zarówno aktywacji jak i represji). Pozycjonowanie, usuwanie lub zmiana składu nukleosomów powoduje zwiększenie dostępności do sekwencji regulatorowych odpowiedzialnych za napędzanie lub hamowanie procesu transkrypcji. Z drugiej strony przesuwanie nukleosomów z jednego obszaru genomu może spowodować ich zagęszczenie w innym regionie i ograniczyć oddziaływanie z białkami kontrolującymi proces transkrypcji [6, 26–29] (Rycina 1-3).

Dotychczas opisano sześć głównych mechanizmów rekrutacji kompleksu do konkretnej lokalizacji jądrowej (Rycina 1-5). Ukierunkowanie kompleksu zależy od białek wchodzących w jego skład oraz ich modyfikacji potranslacyjnych, gdyż poprzez kombinacyjne łączenie poszczególnych modułów białkowych tworzy się unikalna powierzchnia zdolna do interakcji z innymi cząsteczkami [38]. Białka wchodzące w skład kompleksu (np. BAF170, BAF155,

BAF180, BRM, BRG1) mogą w bezpośredni sposób odczytywać kod genetyczny zapisany w modyfikacjach potranslacyjnych histonów [32, 39–41]. Niektóre z nich oddziałują z białkami pośredniczącymi, takimi jak receptory jądrowe, inne czynniki transkrypcyjne (BAF60a/b/c [38, 42], BAF57 [43–48]) oraz proteiny odpowiedzialne między innymi za rekrutację kompleksu do miejsc w których nastąpiło podwójne pęknięcie nici DNA (BAF170 [49]). Kolejne z mechanizmów odpowiedzialnych za rekrutację obejmują oddziaływanie białek kompleksu (np. BRG1, BAF47, ARID1A) z długimi niekodującymi RNA lub małym jądrowym RNA [50]. Mechanizm bazuje na różnicy w stopniu powinowactwa RNA do białek kompleksu oraz do sekwencji docelowej i powoduje ustabilizowanie lub zablokowanie oddziaływania SWI/SNF z daną lokalizacją genomową [51–55]. Ostatni mechanizm wpływający na rekrutację kompleksu zależy od oddziaływania jego białek z lipidami [38, 56, 57].

Rycina 1-5. Mechanizmy odpowiedzialne za rekrutację oraz blokowanie migracji kompleksu SWI/SNF do poszczególnych regionów genomu. 1 - Podjednostkowy skład kompleksu oraz modyfikacje potranslacyjne jego białek. 2 - Rozpoznawanie PTMs przez domeny obecne w białkach wchodzących w skład SWI/SNF. 3 - Oddziaływanie białek SWI/SNF z czynnikami transkrypcyjnymi. 4 - Oddziaływanie podjednostek SWI/SNF z innymi białkami. 5 - Oddziaływanie z niekodującymi RNA: wchodzącym w interakcję tylko z DNA (5.1 - blokowanie przyłączenia SWI/SNF), wchodzącym w interakcję tylko z SWI/SNF (5.2 - blokowanie przyłączenia SWI/SNF poprzez jego wyłapywanie) lub wchodzącym w interakcję zarówno z DNA jak i SWI/SNF (5.3). 6 - Oddziaływanie białek SWI/SNF z lipidami. BRIT

- białko związane z chromatyną biorące udział w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, ang. BRCT – ang. BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression.

Kompleks SWI/SNF w komórkach nowotworowych

Mutacje podjednostek kompleksu SWI/SNF są obecne w około 20% wszystkich typów nowotworów [58–62] (Tabela 1-2). Według Pulice i Kadoch [23] mogą one zostać podzielone na dwie grupy obejmujące defekty powodujące zmiany funkcjonalne i strukturalne. Pierwsza

dotyczy większości podjednostek, gdyż alteracje prowadzące do utraty funkcji któregokolwiek z białek kompleksu zmieniają specyficzność jego działania. Natomiast defekty podjednostek strukturalnych BAF47, BAF200, BRD9 lub równoczesny brak obecności rdzeniowych (BAF155/BAF170, BAF60a/b/c), strukturalnych (BAF250a/b, GLTSCR1/1L) i katalitycznych (BRM/BRG1) podjednostek homologicznych, wywołuje zmiany strukturalne uniemożliwiające utworzenie prawidłowej formy kompleksu danego typu [22, 58, 59, 61]

(Rycina 1-2).

Tabela 1-2 Obecność mutacji poszczególnych podjednostek SWI/SNF w zależności od typu nowotworu. W pierwszej kolumnie umieszczono dane dotyczące odsetka mutacji w danym genie uzyskane za pomocą analizy największego dostępnego na cBioPortal zbioru danych dotyczących prób od pacjentów (MSK-IMPACT Clinical Sequencing Cohort [63]). We wspomnianym zbiorze prób nie wykryto mutacji w genach SMARCC1, SMARCC2, SMARCD2, SMARCD3, SMARCE1, BRD7, DPF2,

PHF10, BRD9, BICRA, BICRAL, SMARCA2, SS18. Brak wykrytych mutacji może być spowodowany zbyt mało reprezentatywną grupą i nie oznacza braku ich występowania. SCCOHT - pierwotny rak drobnokomórkowy jajnika typ hiperkalcemiczny (ang. small cell carcinoma of the ovary, hypercalcemic type); PAN - różne typy nowotworów (ang. pan cancer).

Opisane powyżej alteracje poszczególnych podjednostek kompleksu oraz ich wpływ na istnienie podtypów SWI/SNF rzuciły światło na występowanie potencjalnych zjawisk syntetycznej letalności, które mają miejsce, gdy jednoczesne usunięcie dwóch lub większej liczby genów wywołuje w komórce negatywny efekt na żywotność, ale zmiana każdego z nich z osobna jest przez komórkę tolerowana [64–67]. Występowanie wspomnianych zależności w większości przypadków dotyczy białek, których równoczesna utrata najprawdopodobniej powoduje niefunkcjonalność wszystkich podtypów kompleksu SWI/SNF (Rycina 1-6 A, C, D) [35, 66, 68, 69]. W literaturze opisano także inne zjawiska syntetycznej letalności opierające

się na bardziej złożonych mechanizmach, takich jak np. uzależnienie komórek z mutacją w genie ARID1A od jego paralogu ARID1B (Rycina 1-6 B, E) [66, 70].

Rycina 1-6. Zależności syntetycznie letalne występujące w obrębie białek wchodzących w skład kompleksu SWI/SNF [66, 67].

Potencjalna terapia dla nowotworów z mutacją w genie SMARCA4.

Mutacje w genie SMARCA4 (kodującym białko BRG1, ang. SWI/SNF Related, Matrix Associated, Actin Dependent Regulator Of Chromatin, Subfamily A, Member 4) występują z wysoką częstotliwością i obejmują wiele typów nowotworów takich jak rak płuc [71, 72], SCCOHT [73, 74], rdzeniak [75], chłoniak Burkitta [76] i inne [24, 77] (Tabela 1-2). Nie wprowadzono jednak dotychczas na rynek leku, który miałby szansę wywołać efekt terapeutyczny u pacjentów z powyższymi nowotworami [78].

Najważniejszą przesłanką do rozpoczęcia projektu rozwoju leków celujących w nowotwory z mutacjami typu utrata funkcji w genie SMARCA4 były wcześniejsze doniesienia o syntetycznej letalności z zahamowaniem ekspresji genu SMARCA2 (kodującego białko BRM) [35]. Na tej podstawie opracowano koncepcję strategiczną projektu mającego na celu otrzymanie małocząsteczkowego inhibitora BRM (podejście celowane). W literaturze dostępne były także przesłanki o braku szkodliwości potencjalnych inhibitorów BRM, które opublikowali Oike i in. pokazując brak wpływu wyciszenia genu SMARCA2 na proliferację ludzkich fibroblastów (HFL-1 i MRC-5) [35]. Badania zostały podparte wynikami Hoffmana i in. na linii komórek ludzkiego nabłonka płuc BEAS2B [68]. Ponadto, badania wykonane z wykorzystaniem myszy transgenicznych pokazały, że zwierzęta do których wprowadzono homozygotyczną mutację w genie Smarca2 są zdolne do życia oraz zachowują płodność [79]. Kluczową kwestią w procesie rozwoju inhibitora białka BRM jest jednak jego specyficzność i selektywność. W zdrowych komórkach organizmu występuje homologiczne do BRM białko BRG1 o bardzo zbliżonej budowie domenowej (Tabela 1-1). Pierwszą sugestią dotyczącą toksyczności wynikającej z zahamowania białka BRG1 były badania na myszach

transgenicznych, które po homozygotycznym usunięciu genu Smarca4 obumierały już na przedimplantacyjnym etapie rozwoju. Heterozygotyczne usunięcie genu nie wpływało na śmiertelność zwierząt, lecz zwiększało ich skłonność do rozwoju nowotworów i egzencefalii [80]. Ponadto, z wykorzystaniem myszy, u których usunięto gen Smarca4 postnatalnie (VillinCreERT2), pokazano krytyczną rolę BRG1 w homeostazie komórek macierzystych jelita cienkiego [81]. Toksyczność jelitowa została także później potwierdzona przez Jagani i in., którzy pokazali obniżenie poziomu markerów komórek macierzystych krypt jelitowych (Olfm4) oraz spadek masy ciała zwierząt traktowanych dualnym inhibitorem BRM i BRG1 [82–84]. Według innych badań, wykorzystujących zwierzęta transgeniczne, równoczesne usunięcie genów Smarca2 i Smarca4 powodowało niewydolność serca i śmierć osobników [85–87].

Ze względu na dane dotyczące toksyczności wynikającej z zahamowania funkcjonalności białka BRG1 oraz potencjalnej trudności otrzymania inhibitorów selektywnych (związanej z wysoką homologią białek), w trakcie trwania projektu zdecydowano się także wykorzystać alternatywne podejście fenotypowe, umożliwiające równoczesną identyfikację nowego celu molekularnego oraz specyficznej dla niego cząsteczki spełniającej kryteria wymagane dla testów komórkowych. Co prawda nowsze badania odkryły kilka potencjalnych celów molekularnych dla nowotworów z mutacją w genie SMARCA4 (BAF47, BAF200, MAX, AURKA, CDK 4/6) [88–90], lecz ich zastosowanie w kontekście terapii wymaga dalszych badań.

Wczesny proces odkrywania nowych leków

Wczesny proces odkrywania nowych leków może zostać podzielony na trzy fazy: opracowanie koncepcji strategicznej, fazę odkrycia oraz fazę przedkliniczną, których przebieg jest zależny od zastosowanego podejścia (celowane i fenotypowe; Rycina 1-7). Główną różnicą pomiędzy celowaną a fenotypową koncepcją rozwoju nowych leków jest znajomość celu molekularnego. Ich punkt wspólny stanowi natomiast określone wskazanie terapeutyczne, które jest kluczowe w aktualnym podejściu do rozwoju nowych leków, bazującym na uwzględnieniu potrzeb pacjenta już na wstępnym etapie projektu.

Rycina 1-7. Schemat obrazujący dostępne strategie, według których może zostać przeprowadzony proces rozwoju nowych leków. FBDD - projektowanie leków oparte na fragmentach, ang. fragment- based drug design, CADD - wspomagane komputerowo projektowanie leków, ang. computer-aided drug design, HTS - wysokoprzepustowy test przesiewowy, ang. high throughput screening.

Celowane podejście do rozwoju nowych leków

Cele molekularne pierwszych spersonalizowanych leków onkologicznych to głównie białka, które poprzez mutacje nabierały nowe aktywności. Tworzono związki specyficzne wobec konkretnych zmienionych chorobowo białek, ściśle powiązanych z procesami onkogennymi nowotworów, takich jak np. konstytutywnie aktywne receptory kinaz tyrozynowych, które odkryto w niedrobnokomórkowym raku płuca (mutacje EGFR, translokacje ALK). Ta strategia pokazała wysoką skuteczność kliniczną, lecz jej możliwości zostały obecnie już wyczerpane [91]. W ostatnich latach w celu odkrycia nowych celów do rozwoju terapii wykorzystywano funkcjonalne badania przesiewowe genomu oparte m.in.

o technologię CRISPR (zgrupowane, regularnie przerywane, krótkie powtórzenia palindromiczne, ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Wybór nowych celów molekularnych bazował na selekcji genów, których wyciszenie powodowało zmniejszenie tempa proliferacji lub żywotności komórek nowotworowych. Dalsze analizy bioinformatyczne wykorzystujące dane genomiczne doprowadziły do identyfikacji markerów predykcyjnych korelujących z wrażliwością komórek na wyciszenie ekspresji poszczególnych genów (określenie wskazania terapeutycznego w oparciu o zjawisko syntetycznej letalności) [64, 65]. Dodatkową zaletą takiego podejścia jest minimalizacja potencjalnych skutków ubocznych rozwijanej terapii, gdyż wybrane cele molekularne spełniają kluczową rolę tylko

w komórkach zmienionych chorobowo [92, 93]. Koncepcja syntetycznej letalności została sprawdzona klinicznie, m.in. dzięki zatwierdzeniu leku Olaparyb (inhibitor polimeraz poli ADP-rybozy), który w badaniach przedklinicznych pokazał różnicową aktywność w komórkach z mutacją w genach BRCA1/2 (ang. breast cancer susceptibility gene 1/2). W oparciu o marker predykcyjny - BRCA1/2 przeprowadzana jest obecnie stratyfikacja pacjentek z rakiem jajnika oraz piersi, które odnoszą z terapii największe korzyści terapeutyczne [94, 95].

Podczas opracowywania koncepcji strategicznej projektu rozwijanego zgodnie z podejściem celowanym konieczne jest przeprowadzenie dogłębnej analizy danych literaturowych oraz ich weryfikacja w oparciu o dane bioinformatyczne i doświadczenia laboratoryjne. Uzyskane wyniki umożliwiają oszacowanie prawdopodobieństwa odniesienia sukcesu zakładającego wprowadzenie potencjalnego leku do fazy badań klinicznych. Kluczowe etapy oceny ryzyka zostały przedstawione poniżej (Tabela 1-3).

Tabela 1-3. Kwestie, które powinny zostać określone podczas opracowywania celowanej koncepcji strategicznej projektu nakierowanego na rozwój nowej cząsteczki terapeutycznej.

Dla danego białkowego celu terapeutycznego konieczne jest określenie:

Zapotrzebowania rynkowego/terapeutycznego (Pacjenci, dla których nie została dotychczas stworzona odpowiednia terapia lub terapie o niezadowalającej skuteczności)

Domeny białka, której zahamowanie wywołuje efekt terapeutyczny

Możliwości rozwoju testów przesiewowych pozwalających na selekcję specyficznych cząsteczek modulujących aktywność określonej domeny białkowej

Bezpieczeństwa zastosowania związków specyficznych dla celu terapeutycznego (określenie ewentualnej toksyczności)

Białek wykazujących homologię z celem terapeutycznym (ryzyko braku specyficzności cząsteczek)

Toksyczność w przypadku niezachowania selektywności

Prawdopodobieństwo uzyskania związków selektywnych

Możliwości ustalenia biomarkerów odpowiedzi komórek na traktowanie związkiem oraz markerów do stratyfikacji pacjentów

Potencjalnej oporności pacjentów zgodnych z markerami predykcyjnymi na rozwijaną terapię

Konkurencyjnych programów dotyczących rozwoju cząsteczek specyficznych wobec określonego celu terapeutycznego

Możliwość modyfikacji chemicznej związków (własność intelektualna określona patentami)

Kwestie ekonomiczne i biznesowe

Należy jednak pamiętać, że prawdopodobieństwo odniesienia sukcesu może zmieniać się wraz z przebiegiem projektu, gdyż dla pierwszych w swojej klasie programów badawczych w momencie ich rozpoczęcia nie ma możliwości określenia wszystkich wymienionych w powyższej tabeli zmiennych. Ponadto ryzyko rozpoczęcia każdego nowego projektu jest spotęgowane brakiem możliwości przewidzenia, czy zoptymalizowane metody przesiewowe wyłonią związki modulujące wybrany cel terapeutyczny. Kluczowa dla sukcesu jest jakość, różnorodność i wielkość tzw. bibliotek związków, w odniesieniu do całości teoretycznie dostępnej dla związków małocząsteczkowych przestrzeni chemicznej. Wyłonione związki powinny dobrze rokować pod kątem dalszych modyfikacji chemicznych prowadzących do uzyskania odpowiednich parametrów ADME (podawanie, dystrybucja, metabolizm, wydalanie, ang. administration, distribution, metabolism and excretion), specyficzności, selektywności, efektywności, bezpieczeństwa, formulacji i patentowalności. Ryzyko związane z kontynuacją projektu powinno być rozważane na każdym jego etapie.

W obrębie celowanego podejścia, selekcja pierwszych cząsteczek wykazujących powinowactwo do celu molekularnego przeprowadzana jest z wykorzystaniem testów laboratoryjnych bądź wirtualnie, metodami chemoinformatycznymi (CADD). W procesie eksperymentalnym z wykorzystaniem testów przesiewowych rozwiniętych m.in. w oparciu

o białka rekombinowane poszukuje się specyficznych związków małocząsteczkowych (metody biofizyczne i biochemiczne przeprowadzane zwykle z wysoką przepustowością, HTS [96]). Alternatywnym podejściem jest przeszukiwanie bibliotek fragmentów (metody biofizyczne, FBDD [97, 98]), z których kolejno konstruuje się trójwymiarowe związki małocząsteczkowe (Rycina 1-8). Stosując podejście oparte o metodologię CADD, w pierwszej kolejności wykonuje się wirtualne testy przesiewowe w oparciu o dane bioinformatyczne [99, 100] (Rycina 1-7).

Rycina 1-8. Rozwój związków małocząsteczkowych w oparciu o przeszukiwanie bibliotek fragmentów.

FBDD - projektowanie leków oparte na fragmentach, ang. fragment-based drug design

Zastosowanie FBDD, HTS oraz CADD (test przesiewowy, pierwszorzędowy) ma na celu doprowadzić do wyłonienia pierwszych cząsteczek modulujących wybrany cel molekularny, które po przeprowadzeniu zależnej od specyfiki projektu wstępnej charakterystyki (aktywność, parametry ADME) mogą zostać uznane za cząsteczkę typu HIT (faza odkrycia). Specyficzność i selektywność działania związków HIT jest kolejno oceniana za pomocą szeregu drugorzędowych testów biochemicznych, biofizycznych, ADME, komórkowych oraz badań in vivo [101] (Rycina 1-9).

Rycina 1-9. Schemat obrazujący poszczególne fazy rozwoju nowych cząsteczek o potencjale terapeutycznym zgodnie z podejściem celowanym. Schemat nie stanowi sztywnej reguły, ale reprezentuje przykładowy przebieg poszczególnych faz. Liczba związków wyłonionych w testach przesiewowych (HIT) ulega stopniowemu zmniejszeniu w wyniku przeprowadzania kolejnych testów. ADME - podawanie, dystrybucja, metabolizm, wydalanie, ang. administration, distribution, metabolism and excretion; PK/PD - badania farmakokinetyczne/farmakodynamiczne. Pogrubioną czcionką zaznaczono elementy, które obejmuje niniejsza rozprawa doktorska.

W procesie rozwoju chemicznego cząsteczek pod uwagę brane są nie tylko właściwości farmakodynamiczne, lecz także ich parametry fizykochemiczne, farmakokinetyczne oraz bezpieczeństwo i ewentualna toksyczność (Tabela 1-4). Dane opisujące nowo zsyntetyzowane związki są wykorzystywane do tworzenia modelu zależności struktura-aktywność, czyli tzw. SAR (ang. structure-activity relationship), a scharakteryzowane związki rozwijane są chemicznie aż do uzyskania struktur wiodących (LEAD – faza przedkliniczna) [102, 103]. Liczba związków w początkowych etapach projektu (faza odkrycia) zależy od puli cząsteczek wyłonionych w testach przesiewowych (HIT) oraz od mnogości modyfikacji chemicznych

wprowadzonych do ich struktury. Wraz z biegiem projektu i wejściem w fazę przedkliniczną, wybiera się związki o najlepszych parametrach, co prowadzi do wyłonienia cząsteczki wiodącej (określanej typowo jako LEAD, Rycina 1-9, prawa strona).

Tabela 1-4 Zestawienie najbardziej istotnych parametrów związku małocząsteczkowego do rozważenia pod kątem potencjału klinicznego.

Parametr	Pożądana charakterystyka
Właściwości chemiczne	Stabilność chemiczna i rozpuszczalność Łatwość syntezy z potencjałem do jej skalowania Łatwość formulacji
Właściwości farmakologiczne	Wysokie powinowactwo do miejsca wiążącego Selektywny efekt funkcjonalny dla celu molekularnego in vitro Efektywność in vivo (model dla danej jednostki chorobowej)
Parametry farmakokinetyczne	Właściwa stabilność metaboliczna Właściwa biodostępność dla wybranej drogi podania
Bezpieczeństwo / toksyczność	Satysfakcjonujący profil interakcji z innymi lekami Brak toksyczności, szczególnie kardiologicznej związanej z hamowaniem kanału potasowego hERG (ang. the human ether-à-go-go-related gene) Brak ostrych efektów toksycznych w fazie testów na zwierzętach

1.4.1.1 Dostępne inhibitory białka BRM

Badania nad rozwojem inhibitorów białka BRM przyczyniły się do opatentowania wielu nowych związków małocząsteczkowych (Rycina 1-10), lecz żadna z odkrytych cząsteczek nie wykazała dotychczas odpowiedniej efektywności i braku toksyczności w badaniach klinicznych (www.clinicaltrials.gov). W 2018 roku w literaturze pojawiły się doniesienia o odkryciu przez firmę Novartis pierwszych w swojej klasie małocząsteczkowych dualnych inhibitorów białek BRM i BRG1, wykazujących aktywność w testach biochemicznych, biofizycznych, komórkowych oraz w badaniach in vivo (WO 2020/035779 A1) [83 - czasopismo nierecenzowane, 84]. Kluczową wadą związków stworzonych przez firmę Novartis jest jednak brak selektywności wobec białka BRM względem BRG1 oraz ograniczone możliwości zastosowania potencjalnych modyfikacji chemicznych, w celu spełnienia ostrych wymogów stawianych nowym cząsteczkom o potencjale terapeutycznym. Jeden z inhibitorów rozwiniętych przez firmę Novartis (numer 14, [84]) został wykorzystany jako związek referencyjny do sprawdzenia metod zoptymalizowanych w ramach tej rozprawy doktorskiej (Rycina 1-10 A, B). Kolejne struktury związków hamujących aktywność ATPazową białka BRM zostały opatentowane przez firmę Epizyme (WO 2020/023657 A1). Pomimo lepszej aktywności wyselekcjonowanego związku (82c) wobec białka BRM względem BRG1, wykazano toksyczność w badaniach in vivo (spadek masy ciała zwierząt). Zaskakującym

doniesieniem było wprowadzenie do pierwszej fazy badań klinicznych dualnego, allosterycznego inhibitora

białek BRM i BRG1 (FHD-286) rozwiniętego przez firmę Foghorn Therapeutics (NCT04879017, NCT04891757). Wskazaniem terapeutycznym dla związku FHD-286 są czerniak błony naczyniowej gałki ocznej oraz ostra białaczka szpikowa, a celem pierwszej fazy badań klinicznych jest określenie bezpieczeństwa, tolerancji oraz właściwości farmakokinetycznych i farmakodynamicznych cząsteczki.

Rycina 1-10. Opatentowane inhibitory białka BRM. A: Związki małocząsteczkowe. B: Struktura małocząsteczkowego inhibitora domeny ATPazowo-helikazowej białka BRM opublikowana przez firmę Novartis (związek 14, [84]), który został wykorzystany jako związek narzędziowy w rozprawie doktorskiej. C: Ligandy dwufunkcyjne do celowanej degradacji białek poprzez ubikwitynację (PROTAC, ang. proteolysis-targeting chimera).

Jedno z najbardziej nowatorskich podejść do rozwoju leków, wykorzystuje ligandy dwufunkcyjne PROTAC (Rycina 1-10 C). W obrębie struktury takich cząsteczek można wyróżnić fragment oddziałujący z celem białkowym oraz fragment wiążący się do ligazy E3, pomiędzy którymi występuje dodatkowo długi element łącznikowy (ang. linker). W wyniku oddziaływania chimerycznej cząsteczki PROTAC z białkiem docelowym następuje rekrutacja ligazy E3, a później ubikwitynacja oraz degradacja ubikwitynowanego celu białkowego w proteasomie [105, 106]. Pierwsza chimera ukierunkowana na białko BRM została opisana przez Farnaby i in. w 2019 roku (ACBI1, Boehringer Ingelheim, WO 2020/078933) [107]. Do jej stworzenia wykorzystano ligand wiążący się do bromodomeny, co określiło jej specyficzność wobec białek BRM, BRG1 i PBRM1. Związek ACBI1 obniżał proliferację i wywoływał śmierć komórek z mutacjami typu utrata funkcji w genie SMARCA4. Opatentowano także inne związki typu PROTAC, które zostały przedstawione na rycinie powyżej (Rycina 1-10 C).

Fenotypowe podejście do rozwoju nowych leków

Możliwe jest także odwrócenie celowanego podejścia i wykorzystanie tzw. testów fenotypowych, których przeprowadzenie nie wymaga określenia konkretnego celu molekularnego. Kluczowe w tym podejściu jest stworzenie wiarygodnego modelu komórkowego odzwierciedlającego docelową jednostkę chorobową. Podejście fenotypowe umożliwia odkrycie nieopisanych wcześniej mechanizmów wrażliwości komórek zmienionych chorobowo na cząsteczki terapeutyczne oraz wprowadzenie na rynek pierwszych w swojej klasie innowacyjnych leków [108]. Ta strategia wymaga jednak przeprowadzenia dwóch wymagających etapów obejmujących: uzyskanie wspomnianego powyżej, wiarygodnego modelu jednostki chorobowej oraz czasochłonną identyfikację celu molekularnego dla wyselekcjonowanych cząsteczek [109] (Rycina 1-11). Liczba związków w początkowych etapach projektu (faza odkrycia) zależy od ich puli wyłonionej w testach przesiewowych (HIT). Zwiększa się ona wraz z identyfikacją celu molekularnego, gdyż do struktur związków wprowadza się modyfikacje chemiczne poprawiające ich parametry. Wraz z biegiem projektu i wejściem w fazę przedkliniczną liczba związków się zmniejsza, gdyż wybiera się cząsteczki o najlepszych właściwościach (Rycina 1-11, prawa strona).

Rycina 1-11. Schemat obrazujący poszczególne fazy rozwoju nowych cząsteczek o potencjale terapeutycznym zgodnie z podejściem fenotypowym. Schemat reprezentuje przykładowy przebieg poszczególnych faz, ale nie stanowi on sztywnej reguły. Pogrubioną czcionką zaznaczono elementy, które obejmuje niniejsza rozprawa doktorska.

Cel pracy

Głównym celem rozprawy doktorskiej zrealizowanej w ramach programu Doktorat wdrożeniowy pomiędzy WBBB UJ i Ryvu Therapeutics było opracowanie metodyki, która zostanie wykorzystana w procesie rozwoju nowych leków efektywnych u pacjentów z nowotworami charakteryzującymi się niefunkcjonalnym białkiem BRG1. Aby osiągnąć główne założenie rozprawy doktorskiej postawiono szereg pomniejszych celów badawczych obejmujących:

Opracowanie koncepcji strategicznej projektu zgodnie z podejściem celowanym:

Wstępny wybór celu i wskazania terapeutycznego na podstawie doniesień literaturowych;

Potwierdzenie wybranego celu i wskazania terapeutycznego w analizach bioinformatycznych;

Eksperymentalne potwierdzenie założeń projektu w modelach komórkowych.

Zoptymalizowanie metod umożliwiających selekcję i charakterystykę związków małocząsteczkowych specyficznych wobec określonego celu molekularnego (podejście celowane):

Optymalizacja metod umożliwiających testowanie oddziaływania celu molekularnego ze związkami małocząsteczkowymi (oddziaływanie białko-ligand);

Optymalizacja metody umożliwiającej testowanie wnikania związków małocząsteczkowych do komórek nowotworowych;

Wybór panelu linii komórkowych oraz stworzenie izogenicznych par linii komórkowych służących do badania skuteczności działania i selektywności nowych inhibitorów;

Przeprowadzenie analiz prowadzących do określenia biomarkera odpowiedzi komórkowej na działanie specyficznych inhibitorów celu molekularnego;

Wybór modelu umożliwiającego przeprowadzenie badań farmakodynamicznych

in vivo.

Zoptymalizowanie metody umożliwiającej selekcję nowych klas związków małocząsteczkowych celujących w komórki z mutacjami SMARCA4 w podejściu fenotypowym.

Ze względu na wdrożeniowy charakter rozprawy doktorskiej w pracy nie ujawniono informacji o znaczącym potencjale komercyjnym, które w przyszłości mogą zostać objęte prawem patentowym (m.in. nazwy genów biomarkerowych).

Materiały i metody

Analizy bioinformatyczne

Analizy bioinformatyczne zostały wykonane w oparciu o dwie bazy danych umieszczone na ogólnodostępnych portalach: cBioPortal - https://www.cbioportal.org/ oraz DepMap - https://depmap.org/portal/ (Suplement, Rozdział uzupełniający 1.1). cBioPortal [110] umożliwia wizualizację i analizę obszernych zbiorów danych genomicznych dla linii komórkowych oraz próbek klinicznych. Dostępne na portalu dane obejmują między innymi szczegółowe informacje o obecności i typie mutacji, amplifikacji, fuzji czy delecji danego genu. Ponadto cBioPortal umożliwia określenie przeżywalności pacjentów w zależności od mutacji w badanym genie. Główną funkcją portalu DepMap jest natomiast udostępnienie społeczności badawczej dostępu do kluczowych narzędzi analitycznych i wizualizacyjnych, które mogą przyczynić się do identyfikacji nowych przeciwnowotworowych celów terapeutycznych. Z wykorzystaniem portalu DepMap przeanalizowano dane opisujące zależność komórek od ekspresji genu SMARCA2. W analizach brano pod uwagę zarówno parametr DEMETER2 (ang. DEMETER2dependency score), jak i CERES (ang. CERESdependency score) uzyskane odpowiednio za pomocą metod interferencji RNA (RNAi) oraz CRISPR [111, 112]. Interpretacja wyników otrzymanych za pomocą portalu DepMap opierała się na założeniu, że im niższa wartość parametrów CERES i DEMETER2 dla badanego genu, tym dany gen pełni bardziej kluczową funkcję w danej linii komórkowej (Suplement, Rozdział uzupełniający 1.1).

Narzędzie MultiDep (linie komórkowe)

W celu identyfikacji nowych i potwierdzania opisanych w literaturze syntetycznie letalnych zależności pomiędzy genami, Dział Bioinformatyczny firmy Ryvu Therapeutics stworzył narzędzie MultiDep, wykorzystujące dane umieszczone na portalach DepMap i cBioPortal (2020Q3). MultiDep umożliwia podział panelu linii komórkowych, dla których wygenerowano wartości parametrów DEMETER2 lub CERES, na dwie grupy pod względem występowania konkretnych alteracji zadanego genu (grupa zmieniona i niezmieniona). Dla każdego z wyciszanych genów MultiDep oblicza uśrednione wartości parametrów DEMETER2 i CERES odpowiednio dla grupy zmienionej i niezmienionej, które następnie przelicza według poniższego wzoru w celu uzyskania parametrów DEMETER2CohenD oraz CERESCohenD (obliczenia analogiczne).

Kolejno narzędzie MultiDep przeprowadza obliczenia sprawdzające które z wyciszanych w komórkach nowotworowych genów (za pomocą RNAi lub CRISPR) w sposób najbardziej istotny statystycznie różnicują komórki grupy zmienionej od niezmienionej (test statystyczny Manna-Whitneya-Wilcoxona) generując wartości parametru p dla wszystkich badanych genów. Otrzymane wyniki są przedstawiane w formie tabelarycznej oraz jako wykres wulkanu (ang. volcano plot) konstruowanego przez wykreślenie ujemnego logarytmu wartości parametru p na osi y oraz parametrów DEMETER2CohenD lub CERESCohenD na osi x.

W niniejszej rozprawie doktorskiej przeprowadzono analizę z wykorzystaniem narzędzia MultiDep, sprawdzając który z wyciszanych w komórkach nowotworowych genów (niezależnie od typu nowotworu) w sposób najbardziej istotny statystycznie różnicuje komórki z mutacją typu utrata funkcji w genie SMARCA4 i dziką formą tego genu. Do analizy wykorzystano zarówno wyniki wygenerowane za pomocą RNAi, jak i metody CRISPR.

Analizy wykonane z wykorzystaniem portalu DepMap

W celu potwierdzenia założeń projektu i określenia wskazania terapeutycznego dla inhibitorów białka BRM za pomocą portalu DepMap wykonano analizy sprawdzające, czy wyciszenie ekspresji genu SMARCA2 w komórkach wywodzących się z różnych typów nowotworów wpływa na ich proliferację. Zależność danej linii komórkowej od ekspresji badanego genu (SMARCA2) określano na podstawie parametrów CERES oraz DEMETER2. Pod uwagę brano zbiór linii komórkowych, dla których wartość parametru p była mniejsza od 0.0005. W wyniku analizy wybrano typ nowotworu, którego komórki były najbardziej zależne od ekspresji genu SMARCA2. Linie komórkowe danego typu posegregowano w zależności od wartości parametrów CERES (Avana Public 20Q2, 78 linii komórkowych) i DEMETER2 (Broad, Novartis, Marcotte, 101 linii komórkowych), a następnie sprawdzono za pomocą danych umieszczonych na cBioPortal obecność mutacji w genie SMARCA4. Otrzymane wyniki porównano z danymi literaturowymi.

W celu weryfikacji czy linie komórkowe z mutacją w genie SMARCA4, dla których nie zaobserwowano spadku proliferacji po wyciszeniu genu SMARCA2 mają niższy poziom ekspresji tego genu, wykorzystano narzędzie Data Explorer (DepMap). Sprawdzono zależność pomiędzy wartościami parametrów CERES i DEMETER2 dla genu SMARCA2, a poziomem ekspresji tego genu (baza danych: Expression Public 20Q2). Kolejno z wykorzystaniem funkcji

umieszczonej na portalu DepMap zaznaczono na wykresach linie komórkowe z mutacjami typu utrata funkcji w genie SMARCA4.

Analizy wykonane z wykorzystaniem portalu cBioPortal

Portal cBioPortal posłużył do sprawdzenia częstości występowania mutacji w genie SMARCA4 (ogółem, powodujących wcześniejsze skrócenie łańcucha polipeptydowego białka BRG1 oraz typu zmiany sensu) w zależności od typu nowotworu. Analizę przeprowadzono w oparciu o największy dostępny na cBioPortal zbiór danych dla próbek od pacjentów obejmujący 10945 prób (MSK-IMPACT Clinical Sequencing Cohort) [63].

Hodowla komórkowa i kontrola jakości dla linii modelowych

Wybrane do badań linie komórkowe były hodowane w warunkach jałowych, w sterylnych, jednorazowych naczyniach hodowlanych. Do hodowli wykorzystano wymienione poniżej (Tabela 3-1) pełne pożywki wzrostowe, które zostały wzbogacone 5% lub 10% (v/v) inaktywowaną termicznie bydlęcą surowicą płodową (FBS, ang. fetal bovine serum, Gibco) oraz antybiotykami: penicyliną (100 U/ml) i streptomycyną (100 µg/ml) (P/S; Corning). Komórki hodowano w standardowych warunkach w inkubatorze komórkowym CO2 (37°C, 5% CO₂, 95% wilgotności), w których wykonano także wszystkie doświadczenia komórkowe.

Komórki wszystkich linii utrzymywano w fazie wzrostu logarytmicznego przez regularne pasażowanie do nowych naczyń hodowlanych po osiągnięciu przez hodowlę ok. 80% konfluencji. Monowarstwę komórek, po usunięciu medium hodowlanego, przemywano buforem PBS (Gibco) bez jonów wapnia i magnezu. Następnie dodawano 0,25% roztwór trypsyny z EDTA (Gibco) w ilości odpowiedniej dla powierzchni danego naczynia hodowlanego. Komórki inkubowano z trypsyną przez 3-5 min w inkubatorze CO2, a proces trypsynizacji kontrolowano pod mikroskopem świetlnym. Po zakończeniu trypsynizacji dodawano medium hodowlane zawierające surowicę w celu inaktywacji działania enzymu, w objętości odpowiedniej dla danego naczynia hodowlanego. Otrzymaną zawiesinę komórek odwirowywano (5 min, 200 x g), a otrzymany osad komórkowy zawieszano w świeżej pożywce hodowlanej i przenoszono do nowych, jałowych naczyń hodowlanych. Po każdym pasażu dokonywano oceny żywotności komórek z wykorzystaniem roztworu błękitu trypanu (Lonza), który wnika jedynie do komórek z uszkodzoną błoną komórkową, barwiąc je na kolor niebieski. Niewielką ilość zawiesiny komórek mieszano w stosunku 1:1 z roztworem barwnika. Otrzymaną zawiesinę komórek nanoszono na szkiełko pomiarowe (Bio-Rad) i zliczano z wykorzystaniem licznika komórek (BioRad).

Tabela 3-1. Tabela przedstawiająca media hodowlane dla badanych linii komórkowych. Wszystkie media zostały zakupione w firmie Gibco. NaP – pirogronian sodu, stężenie (Gibco), NEAA – aminokwasy endogenne, stężenie (Gibco), L-Gln – L-Glutamina (Gibco), Hydrokortyzon (Sigma- Aldrich), Betaestradiol (Sigma-Aldrich), ITS-G – Insulina-Transferyna-Selen (Gibco). ATCC – ang. American Type Culture Collection, ECACC - The European Collection of Authenticated Cell Cultures, RCB - General cell lines, CLS – Cell Lines Service, Hg – wysokie stężenie glukozy, ang. high glucose - 4,5g/l, które zostało zwiększone glukozą firmy Gibco, HEPES - środek buforujący.

Linia komórkowa	Dystrybutor	Medium hodowlane	Typ nowotworu
A549	ATCC	DMEM + NEAA + 10% FBS	Gruczolakorak płuca
NCI-H1299	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Wielkokomórkowy rak płuca z przerzutów do węzłów chłonnych
NCI-H661	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Wielkokomórkowy rak płuca z przerzutów do węzłów chłonnych
NCI-H2030	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca z przerzutów do węzłów chłonnych
NCI-H2126	ATCC	RPMI1640 + 10 mM HEPES + NaP + 1,5 mM L-Gln + 10 nM Hydrokortyzon + 10 nM Betaestradiol + ITS-G + 10% FBS	Wielkokomórkowy rak płuca z przerzutów do wysięku opłucnego
NCI-H1693	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 5% FBS	Gruczolakorak płuca
NCI-H1944	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca
NCI-H838	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca wywodzący się z przerzutów do węzłów chłonnych
NCI-H1568	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca wywodzący się z przerzutów do węzłów chłonnych
SK-HEP-1	ATCC	MEM + NEAA + NaP + 10% FBS	Rak wątrobowokomórkowy wywodzący się z przerzutów do płynu puchlinowego
HT1080	ATCC	MEM + NEAA + NaP + 10% FBS	Włókniakomięsak
HT1080 SM4KO	Applied StemCell	MEM + NEAA + NaP + 10% FBS	Włókniakomięsak
HT1080 SM4R	-	MEM + NEAA + NaP + 10% FBS + 300 µg/ml G418	Włókniakomięsak
HT1080 SM2KO	-	MEM + NEAA + NaP + 10% FBS	Włókniakomięsak
NCI-H460	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Wielkokomórkowy rak płuca z przerzutów do wysięku opłucnego
PC9	ECACC	RPMI1640 + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca z przerzutów do węzłów chłonnych
HCC827	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca
NCI-H1915	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Niedrobnokomórkowy rak płuca
NCI-H1437	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca z przerzutów do wysięku opłucnego
NCI-H441	ATCC	RPMI1640 Hg + 10 mM HEPES + NaP + 10% FBS	Brodawkowy gruczolakorak płuc z przerzutów do wysięku osierdziowego
NCI-H1792	ATCC	RPMI1640 Hg + 10mM HEPES + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca z przerzutów do wysięku opłucnego
OVK-18	RCB	MEM + NEAA + NaP + 10% FBS	Endometrialny gruczolakorak jajnika z przerzutów do płynu puchlinowego
A427	CLS	MEM + NEAA + NaP + 10% FBS	Gruczolakorak płuca

W trakcie hodowli komórek przeprowadzano regularną kontrolę obejmującą codzienną weryfikację poprawności morfologii komórek. Ponadto, przed wykonaniem banków komórkowych wykonywano genotypowanie komórek (Małopolskie Centrum Biotechnologii UJ), w celu potwierdzenia zgodności genotypu badanej linii komórkowej oraz sprawdzenia ewentualnego zanieczyszczenia linii innymi komórkami. Kolejnym etapem kontroli hodowli było comiesięczne badanie komórek pod kątem zakażenia bakteriami z rodzaju Mycoplasma. Do sprawdzenia zakażenia wykorzystano dostępny komercyjnie zestaw MycoAlert™ (Lonza). Przygotowanie medium komórkowego do badania obejmowało: zbiór 1 ml pożywki hodowlanej znad monowarstwy komórek (po minimum 72-godzinnej hodowli), wirowanie medium przy prędkości 200 x g przez 5 minut oraz przeniesienie otrzymanego nadsączu do studzienek płytki 96-dołkowej. Analogicznie postępowano z kontrolami pozytywną i negatywną, a następnie przeprowadzono test zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.

Wymienione powyżej (Tabela 3-1) linie komórkowe HT1080 (z dziką formą genów SMARCA4 i SMARCA2), HT1080 SM4KO (KO - knockout; z usuniętym genem SMARCA4), HT1080 SM4R (R - z przywróconą ekspresją genu SMARCA4, ang. rescue) oraz HT1080 SM2KO (KO - knockout; z usuniętym genem SMARCA2) są liniami izogenicznymi (Tabela 3-2). Ze względu na identyczną morfologię linii przed procedurą bankowania komórek oraz w trakcie przeprowadzania eksperymentów wykonywano dodatkową kontrolę jakości w postaci oznaczenia poziomów białek BRM (gen SMARCA2) i BRG1 (gen SMARCA4) metodą Western Blot.

Tabela 3-2. Dane dotyczące ekspresji genów SMARCA2 i SMARCA4 w liniach izogenicznych.

Nazwa linii komórkowej	Ekspresja SMARCA2	Ekspresja SMARCA4	Linia komórkowa, która została zmodyfikowana / Metoda modyfikacji
HT1080	Tak	Tak	Brak modyfikacji
HT1080 SM4KO	Tak	Nie	HT1080 / CRISPR
HT1080 SM4R	Tak	Tak	HT1080 SM4KO / Transfekcja plazmidem
HT1080 SM2KO	Nie	Tak	HT1080 / CRISPR

CRISPR

Metoda CRISPR, opracowana przez Emmanuelle Charpentier oraz Jennifer Doudna, pozwala na specyficzną, celowaną modyfikację genomowego DNA [113]. Technologia ta wymaga wprowadzenia do komórki sekwencji sgRNA (ang. single guide RNA) oraz sekwencji kodującej endonukleazę Cas9 (ang. CRISPR-associated protein 9). W komórkach docelowych białko Cas9 ulega ekspresji i zostaje przetransportowane do jądra komórkowego, gdzie dokonuje enzymatycznego dwuniciowego przecięcia DNA w miejscu wskazanym przez sgRNA. Miejsce

cięcia Cas9 zostało zobrazowane poniżej (Rycina 3-1 A) [114]. Kolejno następuje proces naprawy podwójnych pęknięć DNA (DBSs, ang. double-strand breaks) na drodze jednego z dwóch możliwych mechanizmów: scalania niehomologicznych końców DNA (NHEJ, ang. non-homologous end-joining) lub rekombinacji homologicznej (HDR, ang. homology-directed repair) (Rycina 3-1 B).

Rycina 3-1 Metoda CRISPR. A: Schemat obrazujący miejsce cięcia maszynerii CRISPR; PAM - 2-6 nukleotydowa sekwencja występująca bezpośrednio po 20-nukleotydowej sekwencji sgRNA homologicznej do DNA genomowego (ang. protospacer adjacent motif). B: Schemat obrazujący proces naprawy dwuniciowych pęknięć DNA.

Powstała na skutek naprawy NHEJ modyfikacja to mutacja punktowa, insercja lub delecja, która może zostać wykryta poprzez genotypowanie zmienionego fragmentu genomowego DNA. Drugą możliwą metodą naprawy DBSs jest rekombinacja homologiczna (HDR). Ta metoda umożliwia wprowadzenie do genomu dodatkowej sekwencji, takiej jak gen oporności na antybiotyk selekcyjny czy sekwencja kodująca białko fluorescencyjne. Z punktu widzenia metodologicznego daje to możliwość łatwiejszej selekcji komórek zmodyfikowanych.

W celu stworzenia linii komórkowej z usuniętym za pomocą metod inżynierii genetycznej genem SMARCA4 wybrano komórki nowotworu płuc NCI-H460, NCI-H1437 oraz włókniakomięsaka HT1080. Dwie pierwsze zmodyfikowano poprzez wprowadzenie do sekwencji SMARCA4 genu oporności na puromycynę, wykorzystując proces rekombinacji homologicznej HDR (Santa Cruz Biotechnology, sc-400168, sc-400168-HDR, Rycina 3-2). Po procedurze CRISPR wykonano selekcję klonalną. Stworzenie linii izogenicznej o podłożu

genetycznym HT1080 zostało zlecone firmie zewnętrznej – Applied StemCell, która wykonała metodę CRISPR NHEJ według własnego protokołu i dostarczyła dwie linie komórkowe z delecją w genie SMARCA4 o długości 43 i 10 par zasad (adekwatnie, klon HT1080 c1 i HT1080 c2). Sprecyzowane miejsce delecji wspomnianych fragmentów genomowego DNA jest objęte tajemnicą firmy Ryvu Therapeutics i nie może być przedstawione w niniejszej rozprawie doktorskiej.

Rycina 3-2. Plazmidy wykorzystane do przeprowadzenia procedury edycji genu SMARCA4 metodą CRISPR. A: Plazmid Brg-1 CRISPR/Cas9 KO, sc-400168; B: Plazmid Brg-1 HDR, sc-400168-HDR.

Do przeprowadzenia procesu wyciszenia genu SMARCA2 metodą CRISPR (HDR) wykorzystano dostępne komercyjnie plazmidy firmy Santa Cruz Biotechnology (sc-401049-

KO-2, sc-401049-HDR-2) oraz linię HT1080. Po procedurze CRISPR wykonano selekcję klonalną.

Procedura CRISPR i selekcji klonalnej

Komórki NCI-H460, NCI-H1437 lub HT1080 wysiano na studzienki płytki 6-dołkowej w 2 ml pełnej pożywki hodowlanej. Komórki hodowano przez noc w inkubatorze komórkowym. Kolejnego dnia przeprowadzono procedurę transfekcji: zmieniono pełną pożywkę hodowlaną na medium bez dodatku antybiotyków, przygotowano mieszaniny do transfekcji zgodnie z danymi zawartymi w tabeli poniżej (Tabela 3-3), które następnie inkubowano w temperaturze pokojowej przez 12 minut i dodano kroplami do komórek. Komórki hodowano w inkubatorze przez 4 godziny, a następnie zmieniono medium na pełną pożywkę hodowlaną zawierającą antybiotyki (P/S) i kontynuowano hodowlę przez noc w inkubatorze komórkowym. 72 godziny po transfekcji komórki zostały poddane 11-dniowej selekcji antybiotykowej (1 µg/ml Puromycyna, BioShop).

Tabela 3-3. Skład mieszanin do transfekcji. Przygotowanie mieszanin A: DNA rozpuszczono w OptiMEM, następnie dodano Reagent P3000TM i dokładnie zmieszano; Przygotowanie mieszanin B: Lipofektamina 3000 rozcieńczono w OptiMEM i dokładnie zmieszano; Mieszaninę A zmieszano z mieszaniną B w stosunku 1:1, OptiMEM (Gibco).

Mieszanina 1	Mieszanina 2	Kontrola1	Kontrola2
A:	1,25 µg (12.5 µl) Plazmid Brg-1/Brm CRISPR/Cas9 KO 1,25 µg (12.5 µl) Plazmid Brg-1/Brm HDR 5 µl Reagent P3000™ 125 µl OptiMEM	1,25 µg (12,5 µl) Plazmid Brg-1/Brm CRISPR/Cas9 KO 1,25 µg (12,5 µl) Plazmid Brg-1 HDR 5 µl Reagent P3000™ 125 µl OptiMEM	5 µl Reagent P3000™ 125 µl OptiMEM	5 µl Reagent P3000™ 125 µl OptiMEM
B:	3,75 µl Lipofektamina™ 3000 125 µl OptiMEM	7,5 µl Lipofektamina™ 3000 125 µl OptiMEM	3,75 µl Lipofektamina™ 3000 125 µl OptiMEM	7,5 µl Lipofektamina™ 3000 125 µl OptiMEM

Następnie przeprowadzono etap selekcji klonalnej. Komórki po transfekcji CRISPR (Mieszanina 1 oraz Mieszanina 2) wysiano na studzienki płytki 96-dołkowej w gęstości 1 komórka/dołek w pełnym medium hodowlanym bez dodatku antybiotyku selekcyjnego (MEM + 10%FBS + NEAA + NaP + P/S). Komórki hodowano w inkubatorze komórkowym aż do uzyskania 80% konfluencji (przez 11/12 dni), a następnie poszczególne klony przesiano do studzienek płytki 24-dołkowej. Wraz ze wzrostem komórki były pasażowane do większych naczyń hodowlanych, aż do etapu butelek o powierzchni 25 cm2 (T25). Po uzyskaniu odpowiedniej ilości materiału komórkowego zebrano część komórek w celu analizy poziomu białka BRG1 lub BRM metodą Western Blot. Pozostałe komórki utrzymywano w hodowli

w pełnej pożywce hodowlanej, bez dodatku puromycyny. Poszczególne klony oznaczono numerem mieszaniny (1., 2.), a następnie numerowano według kolejności przenoszenia na płytki 24-dołkowe.

Transfekcja plazmidem pcDNA3.1+UBC_SMARCA4_FLAG

W celu przywrócenia ekspresji genu kodującego białko BRG1 wykorzystano plazmid pcDNA3.1+ firmy GenScript® z wklonowaną sekwencją genu SMARCA4 (NM_001128844.1) pod kontrolą promotora ubikwityny C (UBC) (Rycina 3-3). Komórki HT1080 SM4KO zostały wysiane do studzienek płytki 6-dołkowej (0,75 mln komórek/dołek) w 2 ml pełnej pożywki hodowlanej, a następnie hodowane przez noc w inkubatorze. Kolejnego dnia przeprowadzono procedurę transfekcji: zmieniono pełną pożywkę hodowlaną na medium bez dodatku antybiotyków (MEM + NEAA + NaP + 10% FBS) i przygotowano mieszaninę do transfekcji zawierającą 2,5 µg plazmidu DNA, 5 µl Reagentu P3000™ i 7,5 µl Lipofektaminy™ 3000 w 250 µl OptiMEM. Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 12 minut, a następnie dodano kroplami do komórek. Komórki hodowano w inkubatorze komórkowym przez 4 godziny, a następnie zmieniono medium na pełną pożywkę hodowlaną zawierającą antybiotyki (MEM + NEAA + NaP + 10% FBS + P/S) i hodowano przez noc w inkubatorze komórkowym. Po upływie 48 godzin dodano do hodowli antybiotyk selekcyjny G418 (Genetycyna, Sigma-Aldrich) w stężeniu równym 700 µg/ml.

Rycina 3-3. Mapa plazmidu pcDNA3.1+UBC_SMARCA4_FLAG, który został wykorzystany do stworzenia linii HT1080 SM4R. pz - par zasad; AmpR - gen oporności na ampicylinę; ori - punkt wyjściowy replikacji; NeoR/KanR - geny oporności na neomycynę i G418; Sygnał poly(A) bGH- sekwencja terminacyjna.

Po upływie 10 dni od procedury transfekcji, w celu przeprowadzenia selekcji klonalnej, komórki wysiano na płytki 96-dołkowe w gęstości 1 komórka/dołek w pełnym medium hodowlanym z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego G418. Komórki hodowano w inkubatorze komórkowym aż do uzyskania 80% konfluencji (przez 11/12 dni), a następnie poszczególne klony przesiano do studzienek płytki 24-dołkowej. Wraz ze wzrostem komórki były pasażowane do większych naczyń hodowlanych, aż do etapu butelek o powierzchni 25 cm2 (T25). Następnie, zebrano część komórek w celu analizy poziomu białka BRG1 metodą Western Blot. Pozostałe komórki utrzymywano w hodowli w pełnej pożywce hodowlanej z dodatkiem antybiotyku selekcyjnego G418. Kolejno, po 10 dniach od transfekcji przeprowadzono selekcję klonalną.

Transfekcja siRNA

Interferencja RNA jest zjawiskiem prowadzącym do wyciszenia mRNA z udziałem krótkich, dwuniciowych fragmentów RNA, które po związaniu z kompleksem białkowym RISC (indukowany przez RNA kompleks wyciszający, ang. RNA-induced silencing complex) ulegają rozdzieleniu do pojedynczych nici i przyłączają się do komplementarnych transkryptów mRNA. Celowane mRNA jest następnie trawione w wyniku endonukleazowej aktywności RISC [115]. Proces wprowadzenia siRNA do komórki eukariotycznej wymaga użycia tzw. czynnika transfekcyjnego, który po zmieszaniu z siRNA tworzy lipopleksy lub polipleksy zdolne do wniknięcia do komórek [116]. Podczas optymalizacji warunków transfekcji należy dla każdej z badanych linii dobrać odpowiedni rodzaj czynnika transfekcyjnego oraz odpowiednie stężenie siRNA, dla których uzyska się jak najlepszy poziom wyciszenia badanego genu. W przeprowadzonych doświadczeniach wykorzystano dwa rodzaje czynników transfekcyjnych: HiPerFect oraz RNAiMAX oraz siRNA przedstawione poniżej (Tabela 3-4).

Tabela 3-4. siRNA wykorzystane do transfekcji. Dharmacon - ON-TARGETplus Human SMARCA2/4. KIF11 - ang. kinesin family member 11.

Cel / Nazwa	Numer katalogowy
SMARCA2 / S205 / S206 / S207 / S208	J-017253-05 / -06 / -07 / -08
SMARCA4 / S405 / S406 / S407 / S408	J-010431-05 / -06 / -07 / -08
Kontrola negatywna (Dharmacon)	D-001810-10-20
Kontrola negatywna (Ambion)	#4390843
Kontrola pozytywna KIF11 (Ambion)	AM4639

W każdym z przeprowadzonych eksperymentów wykonano także dwie kontrole negatywne: NT – próba nietraktowana oraz KT - próba traktowana czynnikiem transfekcyjnym i siRNA kontrolnym. Ponadto w niektórych eksperymentach wykonano kontrolę pozytywną dla transfekcji, z wykorzystaniem siRNA specyficznego wobec genu KIF11 [117], którego zahamowanie jest letalne dla komórek eukariotycznych. Zoptymalizowane warunki transfekcji zostały przedstawione w tabeli poniżej (Tabela 3-5). W liniach komórkowych, w których brak jest obecności białka BRG1 oraz linii NCI-H1437 nie optymalizowano procedury transfekcji z wykorzystaniem siRNA specyficznego wobec genu SMARCA4.

Tabela 3-5. Zestawienie stężeń siRNA, typów czynnika transfekcyjnego oraz gęstości komórek, dla których uzyskano najlepszy poziom wyciszenia genów SMARCA2 i SMARCA4.

Procedura transfekcji z wykorzystaniem odczynnika HiPerFect

W celu przeprowadzenia procedury transfekcji z wykorzystaniem czynnika transfekcyjnego HiPerFect postępowano zgodnie z zaleceniami producenta (Qiagen). Wybrano procedurę transfekcji typu ang. fast-forward, w której polipleksy zawierające siRNA są dodawane do komórek bezpośrednio po wysianiu ich na płytki lub szalki. Komórki poszczególnych linii komórkowych wysiano do odpowiednich naczyń hodowlanych. Przygotowano polipleksy: rozcieńczono poszczególne siRNA w medium OptiMEM, aż do uzyskania odpowiednich stężeń. Kolejno dodano odpowiednią, przedstawioną w tabeli poniżej (Tabela 3-6) objętość czynnika transfekcyjnego HiPerFect (Qiagen, 1029975), dokładnie zmieszano i inkubowano przez 12 minut w temperaturze pokojowej. Otrzymane polipleksy dodano do komórek kroplami. Komórki hodowano w inkubatorze komórkowym przez 72.

Tabela 3-6. Objętości pełnej pożywki hodowlanej, siRNA rozcieńczonego w OptiMEM oraz czynnika transfekcyjnego HiPerFect użyte do przeprowadzenia procedury transfekcji w poszczególnych naczyniach hodowlanych.

Rodzaj naczynia hodowlanego	Objętość pełnej pożywki hodowlanej [µl]	Objętość siRNA rozcieńczonego w OptiMEM [µl]	Objętość czynnika transfekcyjnego HiPerFect [µl]
Płytka 6-dołkowa	2300	88	12
Szalka 60 mm	3800	180	20
Szalka 100 mm	7000	960	40

Procedura transfekcji z wykorzystaniem odczynnika RNAiMAX

W celu przeprowadzenia procedury transfekcji typu ang. fast-forward z wykorzystaniem czynnika transfekcyjnego RNAiMAX postępowano zgodnie z zaleceniami producenta (Invitrogen). Komórki poszczególnych linii komórkowych wysiano do odpowiednich naczyń hodowlanych. Przygotowano polipleksy: rozcieńczono poszczególne siRNA w medium OptiMEM, aż do uzyskania odpowiednich stężeń. Kolejno dodano odpowiednią, przedstawioną w tabeli poniżej (Tabela 3-7) objętość czynnika transfekcyjnego RNAiMAX, dokładnie zmieszano i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przygotowano także kontrolę składającą się tylko z czynnika transfekcyjnego rozcieńczonego w medium OptiMEM. Otrzymane polipleksy dodano do komórek kroplami. Komórki hodowano w inkubatorze komórkowym przez 72 godziny.

Tabela 3-7. Objętości pełnej pożywki hodowlanej, siRNA rozcieńczonego w OptIMEM oraz czynnika transfekcyjnego RNAiMAX użyte do przeprowadzenia procedury transfekcji w poszczególnych naczyniach hodowlanych.

Rodzaj naczynia hodowlanego	Objętość pełnej pożywki hodowlanej [µl]	Objętość siRNA rozcieńczonego w OptIMEM [µl]	Objętość czynnika transfekcyjnego RNAiMAX [µl]
Płytka 6-dołkowa	2300	88	7,5
Szalka 60 mm	3800	191	9
Szalka 100 mm	7000	977	23

Krótkoterminowy test żywotności

Komórki na płytkach 96-dołkowych hodowano w inkubatorze przez czas krótszy niż 96 godzin, który był zależny od danego typu eksperymentu. Czas trwania poszczególnych doświadczeń wskazano w rozdziale Wyniki. Do sprawdzenia żywotności komórek wykorzystano dostępny komercyjnie odczynnik CTG (ang. CellTiter-Glo® luminescent cell viability assay, Promega), który umożliwia pomiar żywotności w oparciu o ilość ATP jako wskaźnika aktywności metabolicznej komórek. Krótkoterminowy test żywotności CTG był wykonywany na płytkach 96-dołkowych, a jego przebieg wyglądał następująco: usunięto medium znad komórek, dodano 50 µl świeżej pożywki hodowlanej w temperaturze pokojowej,

następnie w temperaturze pokojowej dodano 25 µl odczynnika CTG i wytrząsano płytkę przez 10 minut na orbitalnej wytrząsarce do mikropłytek. Przeniesiono 70 µl lizatów komórkowych do studzienek białej płytki 96-dołkowej i przeprowadzono odczyt luminescencji (EnSpire Multimode Plate Reader, Perkin Elmer, czas integracji 0,25 sekundy). We wszystkich eksperymentach żywotność komórek sprawdzano na początku eksperymentu (czas T0, dzień, w którym rozsiewano komórki po transfekcji lub traktowano związkami) oraz wykonywano próbę ślepą (odczyt dla mieszaniny medium hodowlanego i odczynnika CTG).

W zależności od rodzaju eksperymentu wyniki przedstawiano na wykresach na jeden z dwóch sposobów. W doświadczeniach, w których badano różnice w żywotności komórek po transfekcji siRNA na osi rzędnych przedstawiono wynik jako % kontroli obliczony według poniższego wzoru:

, gdzie

RLUb/k - odczyty luminescencji dla próby badanej (b) i kontrolnej (traktowanej kontrolnym siRNA, k) pomniejszone o wartość RLU dla próby ślepej i podzielone przez wartość RLU (ang. relative luminescence unit) dla próby zmierzonej w dniu wysiania komórek na eksperyment (T0).

W przypadku eksperymentów, w których określano żywotność komórek po traktowaniu różnymi stężeniami związków (odpowiedź zależna od dawki), w danym punkcie czasowym, wynik przedstawiono jako % kontroli, który obliczano zgodnie z poniższymi wzorami:

A: Równanie dla prób badanych, dla których odczyt luminescencji [RLU] jest wyższy lub równy odczytowi luminescencji dla próby zmierzonej w czasie T0 (cytostatyczne działanie związku):

B: Równanie dla prób badanych, dla których odczyt luminescencji [RLU] jest niższy niż odczyt luminescencji dla próby zmierzonej w czasie T0 (cytotoksyczne działanie związku):

Wszystkie wartości RLU przedstawione we wzorach zostały pomniejszone o wartość RLU dla próby ślepej. Wartość RLU dla próby kontrolnej zawarta w równaniu A jest odczytem luminescencji dla komórek nietraktowanych (przewidywany brak wpływu na żywotność komórek) lub traktowanych rozpuszczalnikiem (np. DMSO). Takie przedstawienie wyniku pozwala na określenie podstawowych parametrów charakteryzujących działanie związków małocząsteczkowych w testach komórkowych uwzględniających pomiar w czasie T0. Po naniesieniu wyników na wykres zależności % kontroli od stężenia związku (wyrażonego w skali logarytmicznej) wykonano estymację nieliniową opisaną równaniem krzywej czteroparametrycznej (GraphPad Prism analysis, Rycina 3-4), a następnie określono wartości parametrów GI50 (ang. 50% growth inhibition) oraz LC50 (ang. 50% lethal concentration). Wartość GI50 jest stężeniem związku powodującym 50% spadek proliferacji komórek, natomiast parametr LC50 jest równy stężeniu związku, które powoduje śmierć połowy komórek, które zostały wysiane do studzienki płytki eksperymentalnej (T0).

Rycina 3-4. Schemat reprezentujący wykres zależności żywotności komórek od stężenia związku. Na wykresie zaznaczono parametry, które są wykorzystywane do określenia działania związków małocząsteczkowych. Stężenie związku na osi x jest przedstawione w skali logarytmicznej.

Długoterminowy test żywotności

Długoterminowy test żywotności wykonywano na płytkach 6- lub 12-dołkowych. Komórki na płytkach hodowano w inkubatorze komórkowym przez 7, 10 lub 14 dni, w zależności od specyfiki danej linii komórkowej (wielkość komórek, czas podziału). Kolejno, sprawdzono żywotność komórek z wykorzystaniem odczynnika AlamarBlue, a następnie przeprowadzono etap wizualizacji komórek na płytkach z wykorzystaniem fioletu krystalicznego.

Pomiar potencjału redukcyjnego komórek (AlamarBlue)

Odczynnik AlamarBlue® (Bio-Rad) umożliwia pomiar żywotności komórek poprzez określenie ich potencjału redukcyjnego. Głównym składnikiem odczynnika jest resazuryna, która po wniknięciu do żywych komórek, jest przekształcana przez enzymy mitochondrialne do rezorufiny, której detekcję można przeprowadzić spektrofotometrycznie lub fluorymetrycznie. Dodatkową zaletą testu jest jego minimalna toksyczność, co umożliwia dalszą hodowlę komórek. Pomiar żywotności komórek za pomocą odczynnika AlamarBlue® przebiegał następująco: usunięto medium znad komórek, dodano świeżą pożywkę hodowlaną z dodatkiem 10-krotnie rozcieńczonego odczynnika AlamarBlue i inkubowano od 1 do 4 godzin w inkubatorze komórkowym. Czas inkubacji z odczynnikiem zależał od charakterystyki danej linii komórkowej (szybkość metabolizowania resazuryny oraz czas wzrostu komórek, przekładający się na finalną liczbę komórek na płytce). Następnie przeniesiono po 200 µl pożywki do studzienek płytki 96-dołkowej i przeprowadzono pomiar fluorescencji z wykorzystaniem czytnika EnSpire (długość fali wzbudzenia 560 nm, długość fali emisji 590 nm). Żywotność komórek przedstawiono na wykresie jako poziom aktywności metabolicznej komórek traktowanych badanymi związkami w stosunku do kontroli DMSO, dla której przyjęto wartość 100% (% kontroli). Przedstawione na wykresach wartości obliczono według wzoru:

, gdzie

RFUb/k - odczyty fluorescencji dla próby badanej (b) i kontrolnej (traktowanej DMSO, k) pomniejszone o wartość RFU dla próby ślepej, RFU - ang. relative fluorescence unit.

Analiza wyników długoterminowego testu żywotności z wykorzystaniem AlamarBlue jest odmienna od analizy wyniku testu krótkoterminowego (CTG) ze względu na brak pomiaru dla próby T0. Po naniesieniu wyników na wykres zależności % kontroli od stężenia związku (wyrażonego w skali logarytmicznej) wykonano estymację nieliniową opisaną równaniem krzywej czteroparametrycznej (GraphPad Prism, Rycina 3-5), a następnie określono wartości parametrów: górne plateau, dolne plateau, Zakres oraz EC50 (połowiczne stężenie hamujące, ang. 50% inhibitory concentration).

Rycina 3-5. Schemat reprezentujący wykres zależności żywotności komórek od stężenia związku w teście AlamarBlue. Na wykresie zaznaczono parametry, które są wykorzystywane do określenia działania związków małocząsteczkowych, które zostały opisane w tekście. Stężenie związku na osi x jest przedstawione w skali logarytmicznej.

Parametr Zakres obrazuje skuteczność modulacji efektu biologicznego (rozumianą jako różnica pomiędzy poziomem górnego a dolnego plateau, dla dopasowanej do punktów pomiarowych krzywej). W przypadku testów sprawdzających zahamowanie żywotności przyjmuje się, że związek jest aktywny, jeśli Zakres osiąga wartość większą niż 25%. Nie powinien on jednak przekroczyć wartości 125%. Parametr EC50 jest stężeniem związku powodującym osiągnięcie przez krzywą sigmoidalną połowy maksymalnego efektu biologicznego (½ parametru Zakres), niezależnie czy krzywa opisuje zjawisko inhibicji czy stymulacji.

Wizualizacja komórek na płytkach z wykorzystaniem fioletu krystalicznego

Płytki z komórkami umieszczono na lodzie, po odciągnięciu pożywki hodowlanej, przepłukano zimnym buforem PBS i utrwalono przez 10 minut na lodzie za pomocą 100% schłodzonego do temperatury -20°C metanolu. Następnie odciągnięto metanol znad komórek, a na komórki dodano 0,5% roztwór fioletu krystalicznego (Sigma-Aldrich) w 20% metanolu (Merck Millipore) i inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. W celu wizualizacji barwienia komórek odciągnięto barwnik i wypłukano płytki w wodzie wodociągowej. Po wyschnięciu płytek wykonano zdjęcia za pomocą aparatu ChemiDoc (ChemiDoc MP imaging system, Bio-Rad).

Kontrolny długoterminowy test żywotności w formacie płytki 96-dołkowej

Do studzienek płytki 96-dołkowej wysiano po 150 komórek HT1080 oraz HT1080 SM4KO i hodowano przez noc w inkubatorze komórkowym. Zmieniono pożywkę hodowlaną, komórki

potraktowano związkiem referencyjnym z wykorzystaniem TecanD300e, a następnie hodowano przez 7 dni w inkubatorze komórkowym. Do sprawdzenia żywotności komórek wykorzystano dostępny komercyjnie odczynnik CTG postępując zgodnie z procedurą krótkoterminowego testu żywotności, opisaną w rozdziale 3.6. Żywotność komórek przedstawiono na wykresie jako % kontroli obliczony według poniższego wzoru:

, gdzie

RLUb/k - odczyty luminescencji dla próby badanej (b) i kontrolnej (traktowanej nośnikiem) pomniejszone o wartość RLU dla próby ślepej.

PCR w czasie rzeczywistym

Izolacja RNA z komórek

Komórki na płytkach lub szalkach przepłukano schłodzonym roztworem PBS, a następnie zdrapano na lodzie za pomocą skrobaczki do komórek. Otrzymane zawiesiny komórek przeniesiono do probówek typu Eppendorf i zwirowano (200 x g, 5 min, 4ºC). RNA izolowano z komórek przy użyciu odczynnika TriReagent (Sigma-Aldrich) lub zestawu do izolacji RNA RNeasy Mini Kit (Qiagen). W obu przypadkach postępowano zgodnie z protokołem producenta. Stężenie oraz czystość otrzymanego RNA sprawdzono z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop (Thermo Fisher Scientific).

Izolacja RNA z materiału tkankowego

Izolację RNA z guzów przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu do izolacji ReliaPrep RNA Tissue (Promega). Fragmenty guzów rozdrobniono w 500 µl buforu do lizy dwukrotnie przez 30 sekund z wykorzystaniem elektrycznego homogenizatora (MICCRA D1). Kolejne etapy izolacji wykonano zgodnie z protokołem producenta. Stężenie oraz czystość otrzymanego RNA sprawdzono z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop.

Procedura reakcji odwrotnej transkrypcji i PCR w czasie rzeczywistym

Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific). Do reakcji pobrano 1 µg wyizolowanego RNA. Do przeprowadzenia reakcji ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR, ang. quantitative chain reaction) wykorzystano zestawy firmy Applied Biosystems składające się z niewyznakowanych starterów oraz sondy typu TaqMan zawierającej barwnik fluorescencyjny FAM oraz wyciszacz. Reakcję qPCR wykonano z użyciem 5 µl gotowej

mieszaniny reakcyjnej TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) wzbogaconej o 2 µl (12,5 ng) matrycy cDNA, 0,5 µl mieszaniny zawierającej startery oraz sondę typu TaqMan (Tabela 3-8) i 2,5 µl wody wolnej od RNAz. Reakcję qPCR przeprowadzono na płytkach 384-dołkowych w warunkach przedstawionych poniżej (Rycina 3-6) wykorzystując aparat QuantStudio™ 6 Flex Real-Time PCR Systems (Thermo Fisher Scientific). W każdym z przeprowadzonych eksperymentów wykonano także dwie kontrole negatywne: niezawierającą matrycy cDNA oraz bez odwrotnej transkryptazy.

Tabela 3-8. Spis sond TaqMan wykorzystanych do reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Ze względu na poufność informacji w tabeli nie uwzględniono nazw i numerów katalogowych wszystkich wykorzystanych w pracy doktorskiej sond TaqMan.

TaqMan	Numer katalogowy
Hs02786624_g1 GAPDH 60x	PN4351368
Hs00946379 m1 SMARCA4 FAM 20x	PN4351372
Hs01030846_m1 SMARCA2 FAM 20x	PN4351370
Hs 00766118_m1 KRT80 FAM 20x	PN4351370
Biomarker2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12/13/14/15/ 16/17/18/19/20/21/22_ FAM 20x	Informacja poufna

Rycina 3-6. Warunki reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Wyniki przeanalizowano z wykorzystaniem oprogramowania QuantStudioTM Real-Time PCR Software v1.1. Względną ekspresję genu przedstawiono na podstawie parametrów: RQ (ang. relative quantification) [118], log2RQ (krotność zmiany) lub 2-ΔCT, które obliczano zgodnie z równaniami przedstawionymi poniżej (Równanie 3-1).

Równanie 3-1. Analiza danych uzyskanych w metodzie PCR w czasie rzeczywistym. CT - numer cyklu, w którym wartość mierzonej fluorescencji przekroczyła zadany punkt progowy (ang. cycle threshold).

Sekwencjonowanie RNA (RNAseq)

W celu jakościowego oraz ilościowego określenia ekspresji różnych sekwencji RNA (w tym mRNA, rRNA, tRNA) w próbach biologicznych przeprowadzono sekwencjonowanie RNA (RNAseq) z wykorzystaniem techniki NGS (ang. next-generation sequencing) [119]. W ramach niniejszej rozprawy doktorskiej do określenia genów o różnicowej ekspresji (DEG) pomiędzy próbami kontrolnymi a traktowanymi siRNA lub badanym związkiem wykorzystano technologię sekwencjonowania przez syntezę DNA z detekcją protonów na układzie scalonym (Ion Torrent) [120]. Etapy metody RNAseq zostały schematyczne przedstawione poniżej (Rycina 3-7). W pierwszym kroku z wykorzystaniem wyizolowanego materiału RNA przeprowadza się reakcję odwrotnej transkrypcji, następnie otrzymane cDNA fragmentuje się na odcinki długości 200 par zasad, do których kolejno przyłączane są sekwencje adaptorowe. Każdy fragment matrycy z przyłączoną sekwencją adaptorową jest kolejno amplifikowany na mikronowej wielkości kulkach (PCR emulsyjny).

Rycina 3-7. Przebieg procedury Ion Torrent RNAseq. Zmodyfikowana rycina zaczerpnięta z pracy Golan i in. [121]. A: Etapy procedury RNAseq. B: Fragmentacja DNA i ligacja sekwencji adaptorowych. C: Klonalny, emulsyjny PCR. D: Sekwencjonowanie na mikroprocesorze z detekcją uwalnianych H+.

Po reakcji PCR kulki przenoszone są do znajdujących się na mikroprocesorze dołków, które są kolejno napełniane roztworami zawierającym jeden rodzaj nukleotydów. Jeżeli dany nukleotyd zostanie przyłączony do matrycy cDNA zostaje uwolniony jon wodoru, co wpływa na zmianę pH roztworu, która może być odczytana i przetworzona na sygnał elektryczny (Ion Torrent). Siła sygnału jest wprost proporcjonalna do liczby przyłączonych nukleotydów w danym cyklu.

Sekwencjonowanie RNA po wyciszeniu genu SMARCA2

0,5 mln komórek A549 lub 0,4 mln komórek HT1080 i HT1080 SM4KO wysiano na 60 mm szalki i przeprowadzono procedurę transfekcji według standardowego protokołu z wykorzystaniem siRNA specyficznego wobec genu SMARCA2 (S205, S206, S207, S208). Po upływie 72 godzin (inkubator komórkowy) od transfekcji komórki przepłukano roztworem PBS i zdrapano. Z otrzymanej zawiesiny komórek odebrano 1/3 objętości w celu sprawdzenia poziomu wyciszenia metodą Western Blot. Pozostałą część zawiesiny zwirowano, odciągnięto nadsącz, a uzyskany osad komórkowy zamrożono w -80ºC. Zamrożone osady komórkowe wysłano do zespołu dr hab. n. med. Michała Mikuli, z Zakładu Genetyki w Centrum Onkologii, w Instytucie im. Marii Skłodowskiej-Curie w Warszawie w celu izolacji RNA i przeprowadzenia procedury RNAseq (Ion Torrent).

Sekwencjonowanie RNA po traktowaniu związkiem referencyjnym

Komórki HT1080 SM4KO wysiano do studzienek płytki 6-dołkowej (0,3 mln/dołek) i hodowano przez noc w inkubatorze komórkowym. Po zmianie pożywki hodowlanej dodano związek referencyjny firmy Novartis (0,1 µM) lub nośnik (0,1% DMSO). Komórki inkubowano przez 4 lub 24 godziny, przepłukano roztworem PBS, a następnie przeprowadzono lizę komórek z wykorzystaniem buforu RLT (Qiagen RNAeasy Mini Kit, 74106). Izolację RNA przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Sprawdzono stężenie oraz czystość otrzymanego RNA z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop, zamrożono w -80ºC i przekazano firmie Macrogen Europe w celu przeprowadzenia procedury RNAseq (Ion Torrent).

Analiza wyników

Dane dostarczone przez zespół dr hab. n. med. Michała Mikuli i firmę Macrogen zostały przeanalizowane we współpracy z Działem Bioinformatycznym firmy Ryvu Therapeutics. Poszczególne etapy analizy zostały przedstawione w Suplemencie (Suplement, Rozdział uzupełniający 1.3).

Western Blot

Izolacja białka z komórek

Komórki zebrano z naczynia hodowlanego za pomocą skrobaczki lub poprzez trypsynizację. W pierwszym przypadku płytkę hodowlaną umieszczono na lodzie, komórki przepłukano schłodzonym roztworem PBS (Corning), a następnie zdrapano. W przypadku trypsynizacji, po inaktywacji trypsyny za pomocą medium z dodatkiem surowicy bydlęcej, komórki odwirowano (200 x g, 5 min) i przepłukano schłodzonym roztworem PBS w probówkach typu Eppendorf. Kolejne etapy przeprowadzano w ten sam sposób dla obu warunków. Komórki odwirowano (200 x g, 5 min), a otrzymany osad komórkowy zawieszono w schłodzonym na lodzie buforze lizującym (bufor RIPA zawierający inhibitory fosfataz – PI oraz EDTA, Thermo Fisher Scientific). W celu dokładnej lizy komórek otrzymane lizaty komórkowe poddano procesowi sonikacji w łaźni wodnej (EMMI 30 HC EMAG, 2 x 30 sekund, 100% mocy ultradźwięków), a następnie odwirowano (16 900 x g, 10 min). Otrzymane nadsącza przeniesiono do świeżych probówek typu Eppendorf i zmierzono stężenie białka w próbkach za pomocą metody Bradford (PanReac Applichem) zgodnie z zaleceniami producenta. Próbki przygotowano poprzez zmieszanie odpowiedniej ilości białka (20 µg na studzienkę) z 6 x stężonym buforem do prób (1 x stężony bufor: 62,5 mM Tris (VWR), HCl (Avantor), 2% SDS (VWR), 10% glicerol (Sigma-Aldrich), 100 mM DTT (Bio-Rad), 0,02% Coomassie Brilliant Blue G-250 (Thermo Fisher Scientific).

Izolacja frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej

Komórki zebrano z naczyń hodowlanych poprzez trypsynizację, następnie odwirowano (200 x g, 5 min, 4°C) i przepłukano schłodzonym buforem PBS. Otrzymany osad komórkowy zawieszono w 5-krotnej objętości hipotonicznego buforu A (10 mM HEPES pH 7.9, 0.2 mM EDTA, 0.2 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM inhibitory fosfataz i proteaz), inkubowano przez 10 minut na lodzie, a następnie dodano Triton X-100 do uzyskania finalnego stężenia równego 0,1%. Komórki energicznie mieszano z wykorzystaniem worteksu przez 15 sekund, a następnie sprawdzono za pomocą mikroskopu świetlnego poziom lizy komórek. Lizat odwirowano (1600 x g, 5 min, 4°C). Otrzymany nadsącz stanowił frakcję cytoplazmatyczną. Uzyskany osad przepłukano dwukrotnie buforem A, a następnie zawieszono w buforze RIPA + PI (frakcja jądrowa). Otrzymane lizaty (frakcja cytoplazmatyczna i jądrowa) sonikowano, a następnie odwirowano (16 900 x g, 10 min, 4°C). Stężenie białka w otrzymanych nadsączach zmierzono metodą Bradforda.

Izolacja białka z materiału tkankowego

Fragmenty guzów (Rozdział 3.17) zważono i rozdrobniono w schłodzonym buforze RIPA +

x PI (20 µl na każde 10 mg tkanki) za pomocą urządzenia TissueLyser II (Qiagen) z wykorzystaniem 7 mm kulek ze stali nierdzewnej (2 x 2 min / 18 Hz). Otrzymane homogenaty krótko zwirowano, otrzymane nadsącza przeniesiono do świeżych probówek typu Eppendorf i zamrożono w -80°C. Po przemrożeniu lizaty poddano sonikacji (Hielscher, UP100H, 0,5 cyklu/amplituda 70%/2-4 wystrzały), a następnie zwirowano (16 900 x g, 10 min, 4°C). Stężenie białka w otrzymanych nadsączach zmierzono metodą Bradforda.

Procedura Western Blot

W zależności od liczby prób wykorzystano żele 15- lub 26-studzienkowe. W celu uzyskania jak najlepszego rozdziału elektroforetycznego dużych białek w każdym z eksperymentów korzystano z gradientowych żeli poliakrylamidowych (ang. Criterion TGX Stain-Free Precast Gels, 4-15%, Bio-Rad). Elektroforezę rozpoczęto od nałożenia 20 µg białka do każdej studzienki żelu poliakrylamidowego i przeprowadzono rozdział z wykorzystaniem urządzenia firmy Bio-Rad (ang. Criterion™ Vertical Electrophoresis Cell). W celu określenia wysokości migracji badanych białek w żelu, do pierwszej i ostatniej studzienki żelu nałożono po 3 µl wzorca masy molekularnej białek ProSieve QuadColor (Lonza) (Rycina 3-8 A). W celu dodatkowej kontroli ilości rozdzielanych białek na żelu przeprowadzono jego wizualizację, wykorzystując funkcję umożliwiającą detekcję białek na żelu bez konieczności jego wybarwiania (ang. stain-free, ChemiDoc MP imaging system, Bio-Rad). Następnie przeniesiono białka na membranę z fluorku poliwinylidenu (PVDF) za pomocą urządzenia firmy Bio-Rad (ang. Trans-Blot Turbo Transfer System) z wykorzystaniem gotowego zestawu do transferu półsuchego (Bio-Rad, 170-4273) i programu przeznaczonego do białek o dużej masie molowej (10 min, 2,5 A, 25 V). Membranę PVDF zobrazowano z wykorzystaniem funkcji „stain-free” (ponowna kontrola ilości białek po transferze na membranę), a następnie pocięto, w zależności od badanych białek, zgodnie ze schematem przedstawionym poniżej (Rycina 3-8 A).

Rycina 3-8. Białka, których detekcja została wykonana metodą Western Blot. A: Wzorzec masy molekularnej białek ProSieve QuadColor (Lonza, 00193837), liniami przerywanymi zaznaczono miejsca cięcia membrany PVDF. B: Spis przeciwciał, które zostały wykorzystane do przeprowadzenia metody Western Blot. W tabeli zaprezentowano także zoptymalizowane warunki poszczególnych etapów metody oraz stężenia przeciwciał wykorzystanych do detekcji konkretnych białek. TP - temperatura pokojowa, PN - przez noc.

Kolejno przeprowadzono etapy blokowania oraz inkubacji z przeciwciałami I-rzędowymi i II-rzędowymi zgodnie z warunkami przedstawionymi powyżej (Rycina 3-8 B). Pomiędzy poszczególnymi etapami membrany płukano w buforze TBST (8,76 g/l NaCl (STANLAB), zasada Tris (VWR), HCl do uzyskania pH 7,5 (Avantor)). Kolejno, wykorzystując obecność peroksydazy chrzanowej skoniugowanej do przeciwciał II-rzędowych, wykonano chemiluminescencyjną detekcję białek na membranie z wykorzystaniem substratu firmy Bio-Rad ECL (ang. Clarity Western ECL Substrate) oraz urządzenia ChemiDoc (Bio-Rad). Analiza otrzymanych wyników została przeprowadzona w programie ImageLab (Bio-Rad).

Dot Blot

Manualny Dot Blot

Membranę PVDF z gotowego zestawu do transferu półsuchego (Bio-Rad) aktywowano w 100% metanolu przez 30 sekund, namoczono w buforze TBST przez 2 minuty i pozostawiono do wyschnięcia. 2 µl nadsączy uzyskanych w procesie zmodyfikowanej metody

Thermal Shift nakropiono na membranę i pozostawiono do wyschnięcia. Następnie membranę namaczano w buforze TBST przez godzinę i blokowano w 5% roztworze BSA. Kolejne etapy (inkubacja z przeciwciałem I- i II-rzędowym oraz chemiluminescencyjną detekcję białek) wykonano zgodnie ze standardową procedurą Western Blot.

Dot Blot z wykorzystaniem Labcyte Echo

10 µl nadsączy uzyskanych w procesie zmodyfikowanej metody Thermal Shift przeniesiono na płytkę źródłową Labcyte Echo 550 (PP-0200). Membranę PVDF z gotowego zestawu do transferu półsuchego (Bio-Rad) aktywowano w 100% metanolu przez 30 sekund i namoczono w buforze TBST przez 2 minuty. Membranę zostawiono do wyschnięcia, a następnie przymocowano do płytki 384-dołkowej za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Przeprowadzono procedurę dozowania białek na membranę PVDF z wykorzystaniem urządzenia Labcyte Echo 550, wykorzystując protokół dla stężonych roztworów wodnych (P2) i objętość kropli równą 0,25 µl. Membranę pozostawiono do wyschnięcia, a następnie namaczano w buforze TBST przez godzinę i blokowano w 5% roztworze BSA. Kolejne etapy (inkubacja z przeciwciałem I- i II-rzędowym oraz chemiluminescencyjną detekcję białek) wykonano zgodnie ze standardową procedurą Western Blot.

Metody pozwalające na walidację oddziaływań białko-ligand

Metody sprawdzające zmiany w temperaturze topnienia białek (TSA, ang. thermal shift assays) zapewniają jedną z możliwości potwierdzenia specyficzności wiązania się związku do danego celu białkowego. Metody te bazują na założeniu, że przyłączenie się do białka małocząsteczkowego liganda powoduje zmianę jego stabilności termicznej (zmiana temperatury denaturacji), co może zostać zwizualizowane m.in. za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej, czy techniki Western Blot (Rycina 3-9) [122–126]. Najczęściej, do przeprowadzenia metody Thermal Shift wykorzystuje się oczyszczone białka rekombinowane, które poddaje się próbie termicznej w obecności badanego związku. Jednakże metoda ta wymaga produkcji dużych ilości badanego białka oraz charakteryzuje ją wysoka sztuczność układu. Istotną do podkreślenia wadą metod sprawdzających zmiany w temperaturach topnienia białek jest wysoki odsetek wyników fałszywie negatywnych, gdyż nie każdy związek, który wiąże się do badanego białka powoduje zmianę jego temperatury denaturacji. Ponadto w niektórych przypadkach można zaobserwować destabilizację termiczną białka po przyłączeniu związku.

Rycina 3-9. Schemat obrazujący stabilizację temperaturową białka pod wpływem przyłączenia liganda małocząsteczkowego. Schemat sfałdowanego białka został zaczerpnięty ze strony: http://www.wwpdb.org/; Czerwona gwiazdka reprezentuje związek małocząsteczkowy.

Aż do roku 2013 nie było, opisanej w literaturze, metody pozwalającej na monitorowanie efektywności wiązania się związku do białka docelowego w układach biologicznych, takich jak komórki czy tkanki. Efektywność związków oceniano w sposób pośredni, przez zbadanie biomarkerów. W roku 2013 Molina i inni po raz pierwszy opisali metodę umożliwiającą badanie interakcji związku z białkiem w lizatach komórkowych, żywych komórkach i tkankach [127, 128]. Metoda CETSA (ang. cellular thermal shift assay) obrazuje zmiany w temperaturze denaturacji badanych białek pod wpływem związania liganda. Przebieg dwóch typów metody CETSA (z wykorzystaniem lizatu komórkowego lub żywych komórek) został przedstawiony poniżej (Rycina 3-10). Ten rodzaj metody Thermal Shift ma dodatkową zaletę, bowiem umożliwia równoległe badanie zmian w stabilizacji termicznej wielu białek, co zostało wykorzystane w badaniu specyficzności wiązania się związków do białek BRM i BRG1.

Rycina 3-10. Schemat przedstawiający przebieg kolejnych etapów metody CETSA A: z wykorzystaniem lizatu komórkowego, B: z wykorzystaniem żywych komórek

CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego – krzywa denaturacji

Komórki HT1080 zebrano za pomocą trypsynizacji, przepłukano schłodzonym buforem PBS, zwirowano (200 x g, 5 min, 4°C), a następnie otrzymany osad zawieszono w schłodzonym buforze PBS z dodatkiem inhibitorów fosfataz w gęstości komórek równej 8,5 mln/ml. Zawiesina komórek została trzykrotnie zamrożona z wykorzystaniem ciekłego azotu i rozmrożona w termo-wytrząsarce (150 rpm, 25°C). Otrzymany lizat komórkowy rozdzielono na dwie części, dodano DMSO lub badany związek i inkubowano w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie każdą mieszaninę rozdzielono do 9 probówek PCR i inkubowano w gradiencie temperaturowym (Bio-Rad T100 Thermal Cycler) przez 3 minuty, a następnie schłodzono próbki przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. W eksperymencie uwzględniono także kontrolę inkubowaną przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Zwirowano próbki z wykorzystaniem adapterów do probówek PCR (16900 x g, 20 min, 4°C). Otrzymane nadsącza przeniesiono do świeżych probówek i zmieszano z 6 razy stężonym buforem do próbek Western Blot. Na żel nakładano równe objętości otrzymanych prób. Metodę Western Blot przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym w punkcie 3.11.3. Intensywność sygnału poszczególnych prążków na membranie określano za pomocą densytometrii wykonanej z wykorzystaniem programu ImageLab. Otrzymane wyniki normalizowano względem poziomu endogennego białka kontrolnego zgodnie ze wzorem przedstawionym poniżej (Równanie 3-2).

Równanie 3-2. Analiza danych uzyskanych w metodzie CETSA. Int - intensywność sygnału.

W analizie wyniku przyjęto założenie, że wpływ związku na stabilność białek może być interpretowany jedynie w temperaturach, w których poziom denaturacji BRM i BRG1 był większy lub równy 30% (Równanie 3-3) w odniesieniu do próby inkubowanej w temperaturze pokojowej.

Równanie 3-3. Analiza danych uzyskanych w metodzie CETSA. TB - temperatura badana, TP - temperatura pokojowa, Int - intensywność sygnału

W przypadku spełnienia powyższego warunku obliczano parametr % Kontroli (Równanie 3-4). W analizie przyjęto, że związek oddziałuje z białkiem, jeżeli w próbie nim

traktowanej ilość białka na żelu (% Kontroli) zwiększyła się lub obniżyła o minimum 30% w odniesieniu do próby traktowanej nośnikiem.

Równanie 3-4. Analiza danych uzyskanych w metodzie CETSA.

CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego – zakres stężeń

Lizat komórkowy przygotowano zgodnie z procedurą opisaną w rozdziale 3.13.1, następnie rozdzielono go do 9 probówek PCR, dodano odpowiednie stężenia badanego związku i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Kolejno przeprowadzono etap denaturacji, próbki inkubowano w wybranej na podstawie wcześniejszego eksperymentu temperaturze (Bio-Rad T100 ThermalCycler) przez 3 minuty, a następnie schłodzono przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. W eksperymencie uwzględniono także dwie kontrole inkubowane przez 6 minut w temperaturze pokojowej zawierające najwyższe stężenie związku lub nośnik (DMSO). Następnie postępowano zgodnie z protokołem opisanym w rozdziale 3.13.1.

CETSA z wykorzystaniem żywych komórek

Komórki HT1080 wysiano w pełnej pożywce hodowlanej w gęstości 0,5 mln/dołek płytki 6-dołkowej, hodowano przez noc w inkubatorze komórkowym, a następnie traktowano różnymi stężeniami badanego związku. W dalszej kolejności komórki inkubowano ze związkiem przez 3 godziny w inkubatorze komórkowym, a następnie poddano trypsynizacji, zwirowano (300 x g, 3 min, 4°C), a otrzymany osad zawieszono w 65 µl zimnego buforu PBS z inhibitorami fosfataz. Przeniesiono po 60 µl zawiesin komórkowych do probówek PCR i przeprowadzono denaturację w trzech temperaturach 44,7°C, 49,4°C i 55,0°C (Bio-Rad T100 ThermalCycler) przez 3 minuty, a następnie schłodzono przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. W eksperymencie uwzględniono także dwie kontrole inkubowane przez 6 minut w temperaturze pokojowej zawierające najwyższe stężenie związku lub DMSO. Kolejno, przeprowadzono lizę komórek przez trzykrotne zamrożenie zawiesiny komórek w ciekłym azocie i rozmrożenie w termo-wytrząsarce (150 rpm, 25°C). Lizaty odwirowano w adapterach do probówek PCR (16 900 x g, 20 min, 4°C). Otrzymane nadsącza przeniesiono do świeżych probówek typu Eppendorf i zmieszano z 6 razy stężonym buforem do próbek Western Blot. Na żel nakładano równe objętości otrzymanych prób. Metodę Western Blot przeprowadzono

zgodnie z protokołem opisanym powyżej. Dla otrzymanych wyników przeprowadzono analizę densytometryczną z wykorzystaniem programu ImageLab.

Przyjęto założenie, że wpływ związku na stabilność białek może być analizowany jedynie w temperaturach, w których poziom denaturacji BRM i BRG1 był większy lub równy 30% w odniesieniu do próby TP (% TP, Równanie 3-3). Ponadto przyjęto, że związek oddziałuje z białkiem, jeżeli w próbie nim traktowanej ilość białka na żelu zwiększyła się o minimum 30% w odniesieniu do próby traktowanej nośnikiem (% Kontroli, Równanie 3-4).

W przypadku metody CETSA z wykorzystaniem żywych komórek należy także rozważyć sytuację, w której wyjściowy poziom badanych białek zmienia się pod wpływem 4-godzinnego traktowania związkiem. Należy bowiem pamiętać, że doświadczenie wykonywane jest na żywych komórkach, w których zahamowanie celu molekularnego może wywołać zależną od niego odpowiedź komórkową, taką jak zmiana ekspresji poszczególnych genów czy ogólny wpływ na poziom translacji. W tym przypadku należy przeprowadzić dodatkową kontrolę w postaci parametru % TPnorm (Równanie 3-5). Parametr można zastosować w sytuacji, gdy w badanej temperaturze nie następuje większy niż 30% spadek poziomu białka kontrolnego. Stwierdza się, że związek stabilizuje lub destabilizuje badane białko, gdy % TPnorm dla próby traktowanej związkiem zmienia się więcej niż o 1/3 wartości dla próby traktowanej nośnikiem.

Równanie 3-5. Analiza danych uzyskanych w metodzie CETSA. TB - temperatura badana, TP - temperatura pokojowa,

Optymalizacja zmodyfikowanej metody Thermal Shift

Ze względu na brak dostępnego komercyjnie, aktywnego białka BRM, zostało ono oczyszczone przez firmę Ryvu Therapeutics. Dokładna sekwencja konstruktu oraz szczegóły poszczególnych etapów produkcji białka są objęte tajemnicą firmy i nie mogą być przedstawione w niniejszej rozprawie doktorskiej. Schemat obrazujący domeny, które wchodzą w skład rekombinowanego ludzkiego białka hBRM (pełnej długości) wykorzystanego do przeprowadzenia metody Thermal Shift został przedstawiony w suplemencie (Suplement, Rycina uzupełniająca 1-3).

Przeprowadzenie zmodyfikowanej metody Thermal Shift jest możliwe ze względu na fakt, że zdenaturowane białka ulegają agregacji i mogą zostać odwirowane z mieszaniny reakcyjnej, w której następnie przeprowadza się detekcję białka np. metodą Western Blot (Rycina 3-11, Rycina 3-12). Kolejne etapy optymalizacji metody Thermal Shift z wykorzystaniem

rekombinowanego białka BRM obejmowały: ustalenie składu buforu, czasu inkubacji ze związkiem, zakresu gradientu temperaturowego, wybranie temperatury użytej do zbadania pełnego zakresu stężeń związku, metody wirowania (probówki, płytki) oraz metody detekcji (Western Blot, manualny Dot Blot, Dot Blot z wykorzystaniem Labcyte Echo) (Tabela 3-9).

Rycina 3-11. Zmodyfikowana metoda Thermal Shift z wykorzystaniem rekombinowanego białka BRM (pierwszy etap optymalizacji). A: gradient temperaturowy. B: IC50.

Rycina 3-12. Zmodyfikowana metoda Thermal Shift z wykorzystaniem rekombinowanego białka BRM (Końcowy etap optymalizacji).

Tabela 3-9. Etapy optymalizacji. TP-temperatura pokojowa, Skład buforu 1 i 2 stanowi dane poufne Ryvu Therapeutics, główną różnicą pomiędzy buforami jest obecność białka stabilizującego.

Poprzednie warunki	Nowe (finalne) warunki
Skład buforu	Bufor 1 +/- DNA + 1% DMSO + 1,38% BRM	Bufor 2 +/- DNA + 1% DMSO + 0,65% BRM
Czas inkubacji ze związkiem	15 min 4°C, 30 min 4°C, 15 min TP, 1h TP	15 min TP
Gradient temperaturowy	12 punktów temperaturowych 35°C-65°C	8 punktów temperaturowych 40°C-65°C
Metoda wirowania	Probówki typu Eppendorf lub probówki PCR w adapterach, 16 900 x g, 20 minut, 4°C	Płytki 96-dołkowe, 2250 x g, 40 minut, 4°C
Metoda detekcji	Western Blot, Manualny Dot Blot	Dot Blot z wykorzystaniem Labcyte Echo 550
Ilość białka dozowanego na membranę	Manualny Dot Blot - 2µl	Dot Blot z wykorzystaniem Labcyte Echo 550 - 0,25µl

Schemat pierwszych eksperymentów został przedstawiony powyżej (Rycina 3-11). Po inkubacji białka z badanym związkiem przeprowadzono etap denaturacji próbek w gradiencie temperatury przez 3 minuty (Bio-Rad T100 Thermal Cycler – 8 punktów temperaturowych lub Eppendorf, AG2331Hamburg, No.5345 – 12 punktów temperaturowych), a następnie schłodzono próbki w temperaturze pokojowej przez kolejne 3 minuty. Po tym czasie umieszczono probówki na lodzie, a następnie zwirowano 16 900 x g, 20 min, 4°C. W eksperymencie uwzględniono także kontrolę inkubowaną przez 6 minut w temperaturze pokojowej oraz kontrolę inkubowaną przez 6 minut na lodzie. Otrzymane nadsącza przeniesiono do świeżych probówek typu Eppendorf i zmieszano z 6 razy stężonym buforem do próbek Western Blot. Na żel nakładano równe objętości otrzymanych prób. Metodę Western Blot przeprowadzono z wykorzystaniem przeciwciała I-rzędowego specyficznego wobec białka BRM (Abcam, ab12165).

Końcowy protokół zmodyfikowanej metody Thermal Shift z wykorzystaniem rekombinowanego białka BRM obejmował inkubację związków z białkiem na płytce 96-dołkowej, denaturację w gradiencie temperatury przez 3 minuty, schłodzenie próbek w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, a następnie wirowanie płytek w rotorze wychylnym (2250 x g, 40 min, 4°C). W eksperymencie uwzględniono także kontrolę inkubowaną przez 6 minut w temperaturze pokojowej oraz kontrolę inkubowaną przez 6 minut na lodzie. Kolejno, otrzymane nadsącza przeniesiono za pomocą przestawnej elektronicznej pipety wielokanałowej do studzienek płytki 384-dołkowej dedykowanej do aparatury Labcyte Echo 550 i przeprowadzono procedurę Dot Blot z wykorzystaniem Labcyte Echo. W zoptymalizowanych warunkach sprawdzono wpływ opisanego w literaturze inhibitora metylotransferaz DNMT,

SGI-1027, który powodował spadek aktywności ATP-azowej białka BRM mierzonej za pomocą testu biochemicznego [129, 130].

Dla wszystkich etapów optymalizacji ilość białka na membranie określano za pomocą densytometrii wykonanej z wykorzystaniem programu ImageLab. Ze względu na potrzebę porównania wyniku otrzymanego metodą Western Blot i Dot Blot densytometrię dla metody Western Blot wykonywano dla wszystkich prążków widocznych na żelu, co było możliwe dzięki inkubacji całej membrany z przeciwciałami. Wartość przedstawiona na wykresie została obliczona zgodnie ze wzorem przedstawionym poniżej (Równanie 3-6).

Równanie 3-6. Analiza danych uzyskanych w zmodyfikowanej metodzie Thermal Shift. Int - intensywność sygnału; TP - temperatura pokojowa.

Wyniki eksperymentów wykonanych w gradiencie temperatury naniesiono na wykres zależności % intensywności sygnału Western Blot od temperatury, wykonano estymację nieliniową opisaną równaniem sigmoidalnym Boltzmana (GraphPad Prism), a następnie określono punkt przegięcia krzywej, który reprezentuje przybliżoną temperaturę denaturacji/agregacji białka (TD). Stopień stabilizacji lub destabilizacji określano na podstawie różnicy w temperaturach denaturacji. Przyjęto, że istotna zmiana w przybliżonej temperaturze denaturacji mierzonej za pomocą zmodyfikowanej metody Thermal Shift wynosi 2°C.

Test wnikania związku do komórek (ang. cellular uptake)

W celu zbadania potencjału działania związków w układzie in vitro przeprowadzono test wnikania związku do komórek. W tym teście określono ilość moli związków w pełnym lizacie komórkowym oraz w komórkowej frakcji cytoplazmatycznej po 4-godzinnym traktowaniu komórek badanymi związkami. Komórki HT1080 wysiano w pełnej pożywce hodowlanej w gęstości 100 000 komórek na dołek płytki 24-dołkowej i hodowano przez noc w inkubatorze komórkowym. Następnego dnia zmieniono medium na świeżą pożywkę hodowlaną (500 µl), potraktowano komórki badanymi związkami (w stężeniu równym 3 µM każdy) lub nośnikiem (0,1% DMSO) i inkubowano przez 4h. Uwzględniono serię prób T0, do których nie dodano badanych związków. Kolejno, zebrano medium znad komórek i przeniesiono po 100 µl do studzienek 96-dołkowej płytki typu MasterBlock (Greiner Bio-One; 780215). Komórki na płytkach przepłukano dwukrotnie buforem PBS (300 µl), dodano po 300 µl mieszaniny metanol:acetonitryl (Merck Millipore) w stosunku objętościowym 1:1 i wytrząsano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przeniesiono po 100 µl ekstraktów komórkowych

do studzienek 96-dołkowej płytki typu MasterBlock. Do próbek zawierających medium komórkowe dodano po 100 µl acetonitrylu, a do próbek z ekstraktami komórkowymi po 100 µl wody oczyszczonej za pomocą systemu MiliQ (Merck Millipore).

W celu stworzenia krzywej standardowej dla pożywki hodowlanej zebrano medium znad komórek T0 (bez związku), dodano badany związek (10 µM), wykonano seryjne 2-krotne rozcieńczenia związku (po 100 µl, w medium z czasu T0), a następnie dodano po 100 µl acetonitrylu. W celu przygotowania krzywej standardowej dla ekstraktów komórkowych wykonano seryjne 2-krotne rozcieńczenia związku w wodzie (po 100 µl), a następnie dodano po 100 µl ekstraktu z komórek T0 (bez związku). Wszystkie próbki wytrząsano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, zwirowano (4°C, 2000 x g, 5 min), a otrzymane nadsącza przeniesiono do studzienek płytki 96-dołkowej przeznaczonej do analizy LC/MS (Thermo Fisher Scientific, 267245). Spektrometrię mas sprzężoną z wysokosprawną chromatografią cieczową (LC-MS, ang. liquid chromatography - mass spectrometry) wykonano we współpracy z grupą badawczą DMPK (ang. drug metabolism and pharmacokinetics) Ryvu Therapeutics (Suplement, Rozdział uzupełniający 1.2). Otrzymane wyniki przedstawiono na wykresie jako liczba nmoli w medium znad komórek oraz w ekstrakcie komórkowym, które obliczono według

wzorów przedstawionych poniżej

Równanie 3-7). Na wykresie wynikowym uwzględniono także liczbę moli związku w medium, którym traktowano komórki, która wynosiła Mt = 3 µM * 0,5 ml = 1,5 nmol.

Równanie 3-7. Analiza danych uzyskanych w metodzie wnikania związku do komórek. Mm/k - liczba moli badanego związku, odpowiednio w medium komórkowym (m) lub w ekstrakcie komórkowym (k); Cm/k - obliczone na podstawie krzywej standardowej stężenie badanego związku, odpowiednio w medium komórkowym (m) lub w ekstrakcie komórkowym (k); Vm - objętość medium z 3 µM związkiem, którym traktowano komórki (500 µl); Vk – objętość ekstraktu komórkowego (300 µl).

Kolejno oszacowano stężenie związku w komórce z założeniem, że średnia jej objętość wynosi 3 pl (pikolitry) [131]. Należy jednak podkreślić, że obliczona wartość (Równanie 3-8) jest jedynie przybliżonym stężeniem związku, które może być obecne w komórce, gdyż objętości poszczególnych komórek mogą różnić się od siebie w znaczący sposób.

Równanie 3-8. Analiza danych uzyskanych w metodzie wnikania związku do komórek. Mk - liczba moli badanego związku w ekstrakcie komórkowym, Lkom – liczba komórek równa 100 000, Vkom – objętość pojedynczej komórki oszacowana na 3 pl, Ckom – potencjalne stężenie inhibitora wewnątrz komórki.

Analiza interakcji białek z DNA (ChIP-seq)

W celu określenia genomowych sekwencji DNA, w obrębie których przyłącza się białko BRM lub BRG1 przeprowadzono procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq, ang. chromatin immunoprecipitation-sequencing). Etapy metody zostały schematycznie przedstawione poniżej (Rycina 3-13). W pierwszym kroku materiał komórkowy zawieszono w buforze zawierającym formaldehyd w celu utrwalenia oddziaływań białek z DNA poprzez ich usieciowanie i przeprowadzono etap sonikacji w celu fragmentacji DNA. Kolejno, pofragmentowane DNA z przyłączonymi białkami inkubowano z przeciwciałami specyficznymi wobec badanych białek (BRM, BRG1).

Rycina 3-13. Przebieg procedury ChIP-seq. Zmodyfikowana rycina zaczerpnięta ze strony ActiveMotif (https://www.activemotif.com/catalog/868/chip-it-high-sensitivity).

Kompleksy białko/DNA związane z przeciwciałem wyłapano poprzez użycie kulek agarozowych z przyłączonym białkiem G (immunoprecypitacja). W ostatnim kroku usieciowanie kompleksów białko/DNA przerwano za pomocą proteinazy K, a oczyszczone fragmenty DNA analizowano z wykorzystaniem techniki NGS w technologii Illumina (Rycina 3-14). Po związaniu sekwencji adaptorowych do fragmentów DNA przeprowadzono ich inkubację ze starterami przyłączonymi do powierzchni celki przepływowej. Kolejno,

wykonano reakcję PCR w celu namnożenia fragmentów DNA oraz utworzenia klastrów. Utworzona matryca była następnie zalewana znanymi znakowanymi fluorescencyjnie nukleotydami w porządku sekwencyjnym. Detekcja dobudowywanych do rosnącego łańcucha DNA nukleotydów przebiegała poprzez detekcję fluorescencji generowanej podczas ich przyłączenia do nici DNA.

Rycina 3-14. Przebieg sekwencjonowania w technologii Illumina. Zmodyfikowana rycina zaczerpnięta z pracy Lu i in. [132].

Przygotowanie materiału oraz analiza wyników

Zamrożone osady komórkowe linii HT1080 i HT1080 SM4KO wysłano do firmy ActiveMotif w celu przeprowadzenia procedury ChIP-seq z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec białek BRM i BRG1 (Tabela 3-10).

Tabela 3-10. Charakterystyka prób przeanalizowanych metodą ChIP-seq.

Dane dostarczone przez firmę ActiveMotif zostały przeanalizowane we współpracy z Działem Bioinformatycznym firmy Ryvu Therapeutics. Poszczególne etapy analizy zostały przedstawione w Suplemencie (Rozdział uzupełniający 1.4).

AlphaLISA

Powszechnie używane metody bazujące na immunodetekcji, takie jak ELISA czy Western Blot, wymagają przeprowadzenia długotrwałych protokołów. Metoda AlphaLISA zapewnia dla nich znacznie wydajniejszą alternatywę. Dzięki wykluczeniu etapów płukania procedura jest znacznie krótsza i pozwala na oznaczanie stężeń analitów w szerokim zakresie dynamicznym. Charakteryzuje ją także wysoka czułość. Dodatkową zaletą metody jest niska objętość próby badanej. AlphaLISA może być wykorzystywana do ilościowego oznaczania cząsteczek zarówno w prostych jak i złożonych typach próbek oraz umożliwia oznaczanie kilku analitów w jednym eksperymencie (multipleks z technologią AlphaPlex). Zasada metody opiera się na wykorzystaniu pokrytych streptawidyną kulek donorowych, biotynylowanego przeciwciała specyficznego wobec badanej molekuły oraz kulek akceptorowych skoniugowanych z przeciwciałem specyficznym wobec innego fragmentu badanego analitu [133]. Tak jak zostało to zaprezentowane na rycinie poniżej (Rycina 3-15) w przypadku, gdy w układzie obecna jest badana molekuła kulka donorowa znajduje się w odległości mniejszej niż 200 nm od kulki adaptorowej. Kulka donorowa zostaje wzbudzona za pomocą lasera

o długości fali równej 680 nm, w skutku czego wytwarza się tlen singletowy, który dyfunduje do kulki akceptorowej i wywołuje serię zdarzeń chemicznych, wywołujących emisję chemiluminescencji o długości fali równej 615 nm. Siła chemiluminescencji jest wprost proporcjonalna do ilości analitu w badanej próbce.

Rycina 3-15. Schemat działania metody AlphaLISA. Zmodyfikowana grafika, która została zaczerpnięta ze strony producenta: https://www.perkinelmer.com/pl/category/immunoassays-alpha.

Przygotowanie materiału z hodowli komórkowej

Komórki A549 (3000 komórek/dołek) lub HT1080 SM4KO (2500 komórek/dołek) wysiano do dołków płytki 96-dołkowej i hodowano przez noc w inkubatorze komórkowym. Zmieniono

medium komórkowe, a następnie za pomocą dyspensera Tecan D300e dodano związek referencyjny firmy Novartis lub nośnik (0,1% DMSO). Komórki inkubowano przez 72 godziny, zebrano medium i zwirowano (200 x g, 5 min, RT). Otrzymane nadsącza zamrożono w -20ºC w celu przeprowadzenia analizy AlphaLISA w późniejszym czasie. Aby uzyskać informację czy spadek stężenia oznaczanego analitu nie wynika z obniżenia żywotności komórek, równolegle przeprowadzono krótkoterminowy test żywotności (CTG).

Przygotowanie materiału tkankowego

Fragmenty guzów (Rozdział 3.17) zawieszono w zimnym roztworze PBS z 2-krotnie stężonymi inhibitorami proteaz - PI (Thermo Fisher Scientific) i 0,05% Tween20 (Sigma- Aldrich) w objętości 20 µl na każde 10 mg tkanki i rozdrabniano przez 30 sekund za pomocą homogenizatora elektrycznego. Próbki, które nie zostały całkowicie zhomogenizowane rozdrabniano ponownie przez 30 sekund. Homogenaty zwirowano (16 900 x g, 15 min, 4ºC), otrzymane nadsącza przeniesiono do nowych probówek typu Eppendorf i oznaczono w nich stężenie białka za pomocą metody Bradforda. Próby rozcieńczono w PBS + 2x PI + 0.05% Tween20 do stężenia 10 µg/µl, a następnie przeprowadzono procedurę AlphaLISA w celu określenia stężenia oznaczanego analitu.

Procedura AlphaLISA

W celu określenia stężenia analitu - Biomarkera 2 (Rozdział 4.2.7) w próbach wykorzystano zestaw firmy PerkinElmer Shared Services. Numer katalogowy odczynników wykorzystanych do przeprowadzenia metody AlphaLISA jest objęty tajemnicą przedsiębiorstwa ze względu na poufność nazwy oznaczanego białka. Procedurę przeprowadzono na białych płytkach 384-dołkowych (OptiPlate, Perkin Elmer Shared Services), do których dodano po 2 µl badanych prób lub standardu Biomarkera 2. Następnie dodano 4 µl 5-krotnie stężonych kulek akceptorowych z przyłączonym przeciwciałem specyficznym wobec Biomarkera 2. Płytkę inkubowano w 23ºC przez 30 minut, dodano 4 µl 5-krotnie stężonego biotynylowanego przeciwciała specyficznego wobec Biomarkera 2 i inkubowano przez 60 minut w 23ºC. Kolejno dodano 10 µl 2-krotnie stężonych kulek donorowych sprzężonych ze streptawidyną i inkubowano w ciemności w 23ºC przez 30 minut. Detekcję przeprowadzono za pomocą czytnika Tecan SPARK20M z wykorzystaniem protokołu dedykowanego do technologii AlphaLISA. W odczycie uwzględniono długość fali ekscytacji kulek donorowych (680 nm) oraz długość fali emisji kulek akceptorowych (615 nm). Stężenie Biomarkera 2 obliczono według krzywej standardowej (zależność sygnału AlphaLISA od zlogarytmowanego stężenia

Biomarkera 2, krzywa czteroparametryczna). Dla każdego eksperymentu obliczano dolny limit detekcji (LD) w oparciu o odczyty 12 dołków zawierających próby ślepe zgodnie ze wzorem:

Badania in vivo

Wykonane eksperymenty in vivo miały na celu wybór modelu do testowania nowych inhibitorów białka BRM projektowanych przez firmę Ryvu Therapeutics. W pierwszych heteroprzeszczepach ludzkich komórek nowotworowych zbadano wydajność implantacji i kinetykę wzrostu w wybranych szczepach myszy z upośledzonym układem odpornościowym. Kolejno z wykorzystaniem związku referencyjnego firmy Novartis sprawdzono zmiany w poziomach wyselekcjonowanych biomarkerów (Rozdział 4.2.7, KRT80 oraz Biomarker 2) w komórkach heteroprzeszczepu. W tym celu określono farmakokinetykę (PK) i biodostępność związku, a następnie przeprowadzono badania farmakodynamiczne. Badania in vivo zostały przeprowadzone we współpracy z grupą badawczą DMPK firmy Ryvu Therapeutics.

Wzrost ksenoprzeszczepu pary linii izogenicznych w myszach NOD/SCID

Badania zostały przeprowadzone w Zwierzętarni Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ, zgodnie z pozwoleniem II Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Krakowie (nr 162/2017). Nastrzykiwanie myszy oraz pobieranie materiału było przeprowadzone przez wykwalifikowany personel zwierzętarni, mgr Karolinę Hajduk oraz mgr Ewę Werner. Badanie zostało wykonane na samicach myszy szczepu NOD/SCID (8 myszy na grupę), do których wszczepiono podskórnie po 5 mln komórek linii HT1080 oraz HT1080 SM4KO (100 µl, PBS:Matrigel GFR (Corning), 3:1). Czas trwania eksperymentu wynosił 21 dni. Pomiary objętości guza (Równanie 3-9) oraz masy zwierząt (Równanie 3-10) rozpoczęto 7 dnia po wszczepieniu komórek nowotworowych i wykonywano co drugi dzień, z wykluczeniem dni wolnych od pracy. Myszy, u których zaobserwowano co najmniej jedną z następujących oznak: i) ponad 20% spadek masy,

ii) objętość guza przekraczająca 2000 mm3, iii) rany w pobliżu guza, poddawano eutanazji.

Równanie 3-9 Wzór, według którego obliczono objętość guza. OG - objętość guza [mm3], S1 - najdłuższa średnica guza [mm], S2 - średnica guza prostopadła do S1 [mm], pomiary wykonano za pomocą suwmiarki.

𝑍𝑚𝑖𝑎𝑛𝑎 𝑚𝑎𝑠𝑦 𝑐𝑖𝑎ł𝑎 [%] = 100% −	∗ 100% 𝑀𝑋 𝑀1

Równanie 3-10 Wzór, według którego obliczono spadek masy., MX - masa ciała w dniu x [g], M1 – masa ciała w dniu 1 [g].

Wzrost ksenoprzeszczepu linii izogenicznych w myszach BALB/c nude

Badania zostały przeprowadzone w Zwierzętarni Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ, zgodnie z pozwoleniem II Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Krakowie (nr 111/2019). Nastrzykiwanie myszy oraz pobieranie materiału było przeprowadzone przez wykwalifikowany personel zwierzętarni, mgr Karolinę Hajduk oraz mgr Ewę Werner. Badanie zostało wykonane na samicach myszy szczepu BALB/c nude (10 myszy na grupę), do których wszczepiono podskórnie po 1 mln komórek linii HT1080 oraz HT1080 SM4KO (100 µl, PBS:Matrigel GFR (Corning), 3:1). Czas trwania eksperymentu wynosił 28 dni. Pomiary objętości guza oraz masy zwierząt wykonywano co drugi dzień z wykluczeniem dni wolnych od pracy. Myszy, u których zaobserwowano co najmniej jedną z następujących oznak: i) ponad 20% spadek masy,

ii) objętość guza przekraczająca 2000 mm3, iii) rany w pobliżu guza, poddawano eutanazji. W dniu zakończenia eksperymentu pobrano do analizy krew oraz fragment guza. Pobraną od zwierząt krew mieszano z roztworem antykoagulantu (5% EDTA) i wirowano w celu uzyskania osocza. Guzy oraz osocza zostały zamrożone w ciekłym azocie, a następnie przechowywane były w temperaturze -80°C do momentu przeprowadzenia analizy AlphaLISA.

Wzrost ksenoprzeszczepu linii komórkowych: A549, NCI-H2030, NCI-H1944

Badania zostały przeprowadzone w Zwierzętarni Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego, zgodnie z pozwoleniem Lokalnej Komisji Etycznej do Dpraw Doświadczeń na Zwierzętach w Bydgoszczy (nr 15/2018). Nastrzykiwanie myszy oraz pobieranie materiału było przeprowadzone przez wykwalifikowany personel zwierzętarni. Badanie zostało wykonane na samicach atymicznych myszy szczepu NUDE (Athymic nude) lub myszy SCID/beige (12 myszy na grupę), do których wszczepiono podskórnie 6 mln komórek linii A549 lub po 5 mln komórek linii NCI-H2030 i NCI-H1944 (100 µl, PBS:Matrigel GFR (Corning), 3:1). Czas trwania eksperymentu wynosił 20 dni. Pomiary objętości guza oraz masy zwierząt wykonywano co drugi dzień z wykluczeniem dni wolnych od pracy. Myszy, u których zaobserwowano co najmniej jedną z następujących oznak: i) ponad 20% spadek masy,

objętość guza przekraczająca 2000 mm3, iii) rany w pobliżu guza, poddawano eutanazji. Pobraną od zwierząt z ksenoprzeszczepem A549 krew mieszano z roztworem antykoagulantu

(5% EDTA) i wirowano w celu uzyskania osocza. Guzy oraz osocza zostały zamrożone w ciekłym azocie, a następnie przechowywane były w temperaturze -80°C do momentu przeprowadzenia analizy AlphaLISA.

Badanie farmakokinetyczne

Badanie zostało przeprowadzone w Zwierzętarni Instytutu Zoologii i Badań Biomedycznych, zgodnie z pozwoleniem II Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Krakowie (nr 13/2018). Nastrzykiwanie myszy oraz pobieranie materiału było przeprowadzone przez wykwalifikowany personel zwierzętarni. Badanie zostało wykonane na samicach myszy szczepu Swiss (CD-1). Związek referencyjny firmy Novartis podano doustnie (21 myszy), stosując jako rozpuszczalnik roztwór 2% DMSO (Sigma-Aldrich) z 20% Captisolem (CyDex Pharmaceuticals) w buforze cytrynianowym, po czym pobierano krew do analizy w kolejnych wyszczególnionych punktach czasowych (Tabela 3-11). Pobraną od zwierząt krew mieszano z roztworem antykoagulantu (5% EDTA), wirowano w celu uzyskania osocza, a następnie oznaczano poziom związku techniką LC-MS (Suplement, Rozdział uzupełniający 1.2).

Tabela 3-11 Przebieg eksperymentu PK (badanie farmakokinetyczne), PO -podanie doustne (per os).

Związek	Dawka [mg/kg]	Roztwór	Droga podania	Schemat
Kontrola	-	-	-	-
Novartis	3	DMSO 2% + Captisol 20% w buforze cytrynianowym	PO	5', 30', 1h, 2h, 4h, 8h, 24h

Na podstawie otrzymanych wyników za pomocą programu WinNonLin oznaczono poniższe parametry:

AUC [ng/ml*h] – pole pod krzywą zależności stężenia leku we krwi od czasu (ang. area under the curve). Parametr ten informuje o całkowitej ilości leku, jaka została wchłonięta do organizmu;

Cmax [ng/ml] – maksymalne stężenie leku we krwi;

Tmax [h] – czas mijający od podania leku do osiągnięcia we krwi maksymalnego stężenia substancji aktywnej;

T1/2 [h] – czas, po upływie którego stężenie leku we krwi zmniejsza się o połowę. Parametr pozwala określić odstępy dawkowania leków.

Badania farmakodynamiczne (A549, Athymic nude)

Badania zostały przeprowadzone w Zwierzętarni Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego, zgodnie z pozwoleniem Lokalnej Komisji Etycznej do Spraw Doświadczeń na Zwierzętach w Bydgoszczy (nr 14/2018). Nastrzykiwanie myszy oraz pobieranie materiału było przeprowadzone przez wykwalifikowany personel zwierzętarni. Badanie zostało wykonane na samicach atymicznych myszy szczepu NUDE (Athymic nude) (15 myszy), do których wszczepiono podskórnie 10 mln komórek linii A549 (100 µl, PBS:Matrigel GFR (Corning), 3:1). Po upływie 25 dni od wszczepienia komórek (kiedy średnia objętość guza przekroczyła 400 mm3) przeprowadzono randomizację myszy w oparciu o pomiary objętości guza i masy ciała. Utworzono grupę kontrolną (3 myszy) oraz grupę badaną (10 myszy, traktowanie związkiem). Kolejnego dnia podano zwierzętom jednorazowo doustnie (PO) związek referencyjny firmy Novartis, stosując jako rozpuszczalnik roztwór 2% DMSO z 20% Captisolem w buforze cytrynianowym. Grupie kontrolnej został podany nośnik. W wyszczególnionych poniżej (Tabela 3-12) punktach czasowych (schemat) pobrano do analizy krew oraz dwa fragmenty guza. Pobraną od zwierząt krew mieszano z roztworem antykoagulantu (5% EDTA) i wirowano w celu uzyskania osocza. Guzy oraz osocza zostały zamrożone w ciekłym azocie, a następnie przechowywane były w temperaturze -80°C do momentu przeprowadzenia analiz PCR w czasie rzeczywistym, AlphaLISA i LC-MS.

Tabela 3-12 Przebieg eksperymentu PD (Badanie farmakodynamiczne, A549, Athymic nude). PO - podanie doustne (per os).

Związek	Dawka [mg/kg]	Roztwór	Droga podania	Schemat
Kontrola	-	DMSO 2% + Captisol 20% w buforze cytrynianowym	PO	8h
Novartis	20	DMSO 2% + Captisol 20% w buforze cytrynianowym	PO	2h, 8h, 24h

Badania farmakodynamiczne (A549, BALB/c nude)

Badanie zostało wykonane przez firmę CrownBio na samicach myszy szczepu BALB/c nude (104 myszy, z 30% zapasem), do których wszczepiono podskórnie 5 mln komórek linii A549 (100µl PBS). Nastrzykiwanie myszy oraz pobieranie materiału było przeprowadzone przez wykwalifikowany personel zwierzętarni. Randomizację zwierząt przeprowadzono 22 dni po inokulacji komórek, gdy średnia objętość guza osiągnęła 380 mm3, wykorzystując do eksperymentu 80 zwierząt. Kolejnego dnia zwierzętom podano związek referencyjny firmy Novartis zgodnie z danymi umieszczonymi w tabeli poniżej (Tabela 3-13). Jako rozpuszczalnik zastosowano roztwór 2% DMSO z 20% Captisolem w buforze cytrynianowym, grupie kontrolnej podano sam nośnik. Każda z grup składała się z 10 myszy, z których od pięciu myszy

pobrano przeżyciowo osocze w trzech punktach czasowych (30 min, 4h, 8h od ostatniej dawki związku) oraz dwa fragmenty guza 8h od ostatniej dawki związku. Od pozostałych 5 myszy z danej grupy pobrano przyżyciowo osocze w trzech punktach czasowych (2h, 12h, 24h od ostatniej dawki związku) oraz dwa fragmenty guza 24h od ostatniej dawki związku. Guzy oraz osocza zostały zamrożone w ciekłym azocie, a następnie przechowywane były w temperaturze -80°C aż do momentu przeprowadzenia analiz PCR w czasie rzeczywistym, AlphaLISA, Western Blot i LC-MS. Pomiary objętości guza (Równanie 3-9) oraz masy zwierząt wykonano w dniu randomizacji oraz jeden dzień (grupy 1-8) i trzy dni (grupy 5-8) po rozpoczęciu dawkowania związku.

Tabela 3-13 Przebieg eksperymentu PD (Badanie farmakodynamiczne, A549, BALB/c nude). PO- podanie doustne. QDx1 - podanie raz dziennie przez jeden dzień. QDx3 - podanie raz dziennie przez trzy dni.

Grupa	Związek	Dawka [mg/kg]	Dawkowanie	Droga podania
1	Kontrola	-	QDx1	PO
2	Novartis	2.5	QDx1	PO
3	Novartis	7.0	QDx1	PO
4	Novartis	20.0	QDx1	PO
5	Kontrola	-	QDx3	PO
6	Novartis	2.5	QDx3	PO
7	Novartis	7.0	QDx3	PO
8	Novartis	20.0	QDx3	PO

Wysokoprzepustowy fenotypowy test przesiewowy

W ramach rozprawy stworzono także metodę umożliwiającą odkrycie nowych klas związków, których aktywność powodowałaby spadek żywotności komórek bez obecności białka BRG1. W tym celu wykorzystano parę linii izogenicznych HT1080 i HT1080 SM4KO oraz zoptymalizowano warunki hodowli w taki sposób, by umożliwić przeprowadzenie zautomatyzowanego badania przesiewowego. Optymalizację testu wykonano w dwóch etapach. Pierwszy obejmował ustalenie warunków eksperymentalnych w taki sposób, by test spełniał kryteria jakościowe dla testów wysokoprzepustowych w formacie płytki 384-dołkowej. Natomiast kolejny etap umożliwił weryfikację zoptymalizowanych warunków na większej ilości płytek oraz doprowadził do określenia algorytmów pozwalających na odsiewanie związków nieaktywnych lub takich, które wykazywały brak aktywności różnicowej w linii z mutacją SMARCA4.

Kontrola jakości testów wysokoprzepustowych

Testy przesiewowe wymagają nie tylko małej objętości próbki i wysokiej przepustowości, ale także odpowiedniej czułości metody, jej dokładności i powtarzalności. Przed rokiem 1999, w celu określania wiarygodności wysokoprzepustowych testów przesiewowych oraz ich podatności na między-eksperymentalne fluktuacje sygnału wykorzystywano parametr S/B (sygnał do tła ang. signal-to-background; Równanie 3-11). Przyjęto, że test jest wiarygodny, gdy minimalna wartość S/B jest ≥ 3 [135].

Równanie 3-11. Wzór pozwalający na obliczenie wartości S/B.

Parametr S/B nie jest wystarczający do właściwej oceny jakości testu wysokoprzepustowego, ponieważ nie uwzględnia on zmienności danych [134]. Wzór na S/B obejmuje bowiem jedynie średnie wartości sygnału dla kontroli oraz próby ślepej, bez odchyleń standardowych. We wspomnianej pracy z 1999 roku Zhang i in. [134] zaproponowali współczynnik Z’ (Równanie 3-12), który uwzględnił brakujące parametry i stał się rutynowo stosowanym współczynnikiem do monitorowania jakości danych w kampaniach testów przesiewowych. Współczynnik Z’ dostarcza informacji o różnicy w poziomach sygnału pomiędzy kontrolami odzwierciedlającymi maksymalny i minimalny poziom odpowiedzi w teście (tzw. zakres dynamiczny) oraz uwzględnia zmienność danych na płytce badanej – finalnie określając szerokość tzw. pasma separacji (Rycina 3-16).

Równanie 3-12. Wzór pozwalający na obliczenie wartości współczynnika Z’. 𝜎p/n - odchylenie standardowe dla kontroli pozytywnej (p) i negatywnej (n), µp/n - średnie dla odpowiednich kontroli.

Rycina 3-16. Wykres przedstawiający rozkład danych i ich zmienność w teście wysokoprzepustowym. Przedstawione parametry stanowią składowe równania do obliczania parametru Z’ (na podstawie [134]). Zgodnie z krzywą rozkładu Gaussa, 3 odchylenia standardowe od średniej w każdą ze stron obejmują statystycznie 99,73% wyników.

Warunki, w których współczynnik Z’ wynosi 1 oznaczają sytuację idealną, w której brak jest zmienności danych dla pozytywnych jak i negatywnych kontroli stosowanych w danym teście. Z’ ≥ 0,5 jest traktowany jako test o dużej wiarygodności, wartości 0,5 > Z’ > 0 są dopuszczane marginalnie (wymagana jest wtedy reoptymalizacja metody), natomiast Z’ ≤ 0 oznacza, że sygnały od kontroli negatywnej i pozytywnej nachodzą na siebie, a zatem wynik testu nie jest wiarygodny, czasami nawet niemożliwy do zinterpretowania.

Etap I: Optymalizacja fenotypowego testu przesiewowego

W celu zoptymalizowania warunków testu porównano czas podziału linii komórkowych HT1080 i HT1080 SM4KO oraz określono przebieg eksperymentu (gęstość komórek, czas inkubacji ze związkami, metoda detekcji żywotności, maksymalne dopuszczalne stężenie DMSO, kontrola pozytywna). Ponadto opracowano układ eksperymentu w celu zwiększenia przepustowości testu (finalne warunki testu przesiewowego). Podczas optymalizacji zwrócono szczególną uwagę na parametry jakościowe.

Połowiczny czas podziału

W celu określenia połowicznego czasu podziału linii HT1080 i HT1080 SM4KO do studzienek płytki 96-dołkowej wysiano po 1000 komórek, hodowano w inkubatorze komórkowym przez 24, 48, 72 lub 96 godzin, a następnie przeprowadzono odczyt żywotności komórek zgodnie z procedurą krótkoterminowego testu żywotności (Rozdział 3.6), (Etap 1). Równolegle wykreślono zależność sygnału luminescencji od ilości komórek (Etap 2). Do studzienek płytki 96-dołkowej wysiano 1000, 2000, 4000, 8000, 16000, 32000 lub 64000 komórek, pozostawiono w inkubatorze komórkowym przez 6 godzin w celu umożliwienia adhezji komórek, a następnie przeprowadzono odczyt żywotności zgodnie z procedurą krótkoterminowego testu żywotności. Po naniesieniu wyników na wykres zależności sygnału luminescencji (RLU) od liczby komórek wykonano estymację nieliniową opisaną równaniem hiperboli (GraphPad Prism), a następnie poprzez interpolację odczytów RLU otrzymanych w etapie 1 eksperymentu obliczono ilości komórek linii HT1080 i HT1080 SM4KO w poszczególnych punktach czasowych. W oparciu o otrzymane dane wykreślono wykres zależności liczby komórek od czasu, a następnie dopasowano krzywą opisującą wzrost ekspotencjalny oraz określono parametr połowicznego czasu podziału T1/2 (GraphPad Prism).

Określenie przebiegu eksperymentu

W celu określenia przebiegu eksperymentu komórki HT1080 i HT1080 SM4KO wysiano z wykorzystaniem dyspensera MultiFlo™ FX do studzienek białej płytki 384-dołkowej (Greiner) w różnych gęstościach i hodowano przez noc w inkubatorze komórkowym. Kolejno, z wykorzystaniem MultiFlo™ FX usunięto medium znad komórek (pozostawiając 10 µl) i dodano 40 µl świeżej pełnej pożywki hodowlanej. Podczas optymalizacji wykorzystano znany induktor apoptozy – staurosporynę [137–139] oraz inhibitor kinazy AURKA – VX-680, który według wiedzy literaturowej powinien silniej działać na komórki z mutacją typu utrata funkcji w genie SMARCA4 [90]. Komórki potraktowano powyższymi związkami lub DMSO z wykorzystaniem dyspensera Tecan D300 (D300e Digital Dispenser, Life Sciences), a następnie hodowano przez 72, 96 lub 120 godzin w inkubatorze komórkowym. Do komórek dodano (MultiFlo™ FX, RAD) 5, 10, 15 lub 25 µl odczynnika CTG, płytki krótko zwirowano, wytrząsano w wychylnej wytrząsarce do płytek przez 15 minut, a następnie wykonano pomiar luminescencji z wykorzystaniem czytnika EnSpire (czas integracji 0,25 sekundy). Na podstawie otrzymanych wyników obliczano parametry jakościowe Z’, S/B oraz wartości GI50 i LC50 zgodnie ze standardową procedurą dla krótkoterminowego testu żywotności (Rozdział 3.6).

Końcowe warunki testu przesiewowego

Testowane związki dodano do odpowiednich studzienek białych płytek 384-dołkowych (Greiner) z wykorzystaniem dyspensera akustycznego Labcyte Echo 550. Na każdej płytce uwzględniono dołki zawierające 0,2% DMSO (kontrola negatywna) oraz 0,5 µM staurosporynę (kontrola pozytywna). Do związków dodano 10 µl pożywki hodowlanej, płytki wytrząsano przez 15 minut, a następnie krótko zwirowano. Kolejno do przygotowanych dołków ze związkami wysiano z wykorzystaniem dyspensera MultiFlo™ FX po 40 µl zawiesin odpowiednich komórek HT1080 i HT1080 SM4KO w gęstości równej 200 komórek/dołek, krótko zwirowano i hodowano przez 102 godziny (6 godzin dla adhezji komórek i 96 godzin inkubacji) w inkubatorze komórkowym. Następnie, płytki wyjęto z inkubatora komórkowego w celu osiągnięcia temperatury pokojowej (20 minut). Do komórek dodano 10 µl odczynnika CTG, płytki krótko zwirowano, wytrząsano w ciemności w wychylnej wytrząsarce do płytek przez 15 minut, a następnie wykonano pomiar luminescencji z wykorzystaniem czytnika EnSpire (czas integracji 0,25 sekundy). Kryterium akceptacji jakościowej dla każdej badanej płytki było osiągnięcie minimalnej wartości parametru Z’ równej 0,5. Jako kontrolę pozytywną

przyjęto komórki traktowane 1 µM staurosporyną, natomiast kontrolę negatywną stanowiły komórki traktowane 0,2% DMSO.

Etap II: Walidacja warunków fenotypowego testu przesiewowego

Parametry wykorzystywane do selekcji związków

Istnieje wiele parametrów, które mogą zostać wykorzystane do selekcji związków aktywnych w testach przesiewowych, w których nie zastosowano replikatów pomiarowych. Najłatwiejsze w interpretacji są: % inhibicji i krotność zmiany (Równanie 3-13 A, B), jednak nie biorą one pod uwagę zmienności danych [140, 141]. Brak replikatów pomiarowych może zostać jednak ominięty dzięki określeniu wartości parametru B (ang. B-score), który oblicza się zgodnie ze wzorami przedstawionymi poniżej (Równanie 3-13 C) [142–144]. Parametr B-score, weryfikuje czy dany wynik nie jest efektem odchylenia zachodzącego w danej kolumnie lub wierszu, w których znajduje się próba badana. Ponadto sprawdza on, czy wynik nie jest efektem danej płytki eksperymentalnej, gdyż wartości r dla danej próby są dzielone przez medianę odchylenia bezwzględnego wszystkich płytek.

Równanie 3-13. Wzory, które zostały wykorzystane do selekcji związków działających różnicowo na linie HT1080 i HT1080 SM4KO. A: RLU b/k - odczyt luminescencji dla próby badanej (b)/ kontrolnej (traktowanej DMSO) (k) pomniejszony o wartość RLU dla próby ślepej; B: Parametr krotność zmiany. C: MAD - średnie odchylenie bezwzględne dla danej płytki (ang. median absolute deviation);

µ'-oszacowana średnia wartość RLU dla całej płytki (ang. estimated average of the plate), R'- oszacowane przesunięcie pomiaru dla rzędu, w którym znajduje się próba badana (ang. estimated systematic measurement offset for row with calculated sample), C' - oszacowane przesunięcie pomiaru dla kolumny, w której znajduje się próba badana (ang. estimated systematic measurement column offset for column with calculated sample).

Badanie przesiewowe biblioteki LOPAC1280

W celu sprawdzenia parametrów fenotypowego testu przesiewowego oraz określenia algorytmu do selekcji związków przetestowano 1280 cząsteczek wchodzących w skład biblioteki LOPAC1280 ang. Library of Pharmacologically Active Compounds. Badanie przesiewowe oraz analizę otrzymanych danych przeprowadzono we współpracy z Działem

Badań Przesiewowych oraz CADD firmy Ryvu Therapeutics (Suplement, Rozdział uzupełniający 1.5).

Analiza statystyczna wyników.

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism (wersja 8.0). W celu określenia istotności statystycznej zaobserwowanych zmian wykorzystano trzy typy testów:

W przypadku analizy wyników in vitro w obrębie jednej linii komórkowej wykorzystano niesparowany, parametryczny t-test z uwzględnieniem poprawki Welcha;

W przypadku analizy wyników in vitro dla różnych linii komórkowych wykorzystano niesparowany, nieparametryczny test Mann-Whitney;

Jeśli analiza dotyczyła danych in vivo uzyskanych z wykorzystaniem ponad pięciu osobników w pierwszej kolejności przeprowadzono test normalności (Shapiro-Wilk), a następnie dla grup o rozkładzie normalnym przeprowadzono sparowany, parametryczny t-test;

Dla analiz in vivo poniżej 5 osobników, w których wykonywano porównania wielokrotne wykorzystano nieparametryczny test jednoczynnikowy ANOVA.

Wartość p < 0.05 została uznana jako statystycznie istotna. Liczba gwiazdek umieszczonych na rycinach została przyznana zgodnie z poniższą tabelą (Tabela 3-14). Liczba powtórzeń w większości eksperymentów, dla których wykonano test statystyczny wynosiła n=3. W przypadku innej liczby powtórzeń umieszczono odpowiednią informację pod ryciną.

Tabela 3-14 Symbole określające istotność statystyczną zaobserwowanych zmian.

Symbol	Znaczenie
brak	p>0,05
*	p≤0,05
**	p≤0,01
***	p≤0,001

Wyniki pokazano jako wartość średnią +/- odchylenie standardowe (SD). W przypadku danych dotyczących wzrostu guzów nowotworowych na wykresach słupki błędów oznaczają wartości błędu standardowego średniej (SEM), co zaznaczono pod odpowiednimi rycinami. W analizach zależnej od dawki odpowiedzi komórek na działanie związku nie przeprowadzano analizy statystycznej, lecz wyznaczano parametr EC50.

Wyniki

Opracowanie koncepcji strategicznej projektu (podejście celowane).

Kluczowym etapem projektów, mających na celu stworzenie nowych leków, które prowadzone są zgodnie z podejściem celowanym, jest określenie wskazania terapeutycznego. W ramach niniejszej rozprawy doktorskiej w celu wyboru docelowej grupy pacjentów, którzy mogliby odnieść korzyść z terapii inhibitorami białka BRM (kodowanego przez gen SMARCA2) wykonano szereg analiz bioinformatycznych oraz eksperymentów biologicznych.

Analizy bioinformatyczne

Analiza danych wygenerowanych zarówno z wykorzystaniem RNAi jak i CRISPR przeprowadzona narzędziem MultiDep wskazała na gen SMARCA2 jako najbardziej istotny dla proliferacji komórek z niefunkcjonalnym genem SMARCA4 (Rycina 4-1). W tabeli poniżej (Tabela 4-1) przedstawiono parametry statystyczne opisujące powyższą zależność.

Rycina 4-1. Zależność nowotworowych linii komórkowych z mutacjami typu utrata funkcji w genie SMARCA4 od ekspresji różnych genów, które zostały wyciszone za pomocą RNAi (A) lub CRISPR (B). (Analiza bioinformatyczna – MultiDep).

Tabela 4-1. Parametry statystyczne opisujące zależność nowotworowych linii komórkowych z mutacjami typu utrata funkcji w genie SMARCA4 od ekspresji genu SMARCA2, który został wyciszony za pomocą RNAi lub CRISPR.

Metoda	Nazwa genu	DEMETER2CohenD /CERESCohenD	Parametr p
RNAi	SMARCA2	-1.93	2.1-10
CRISPR	SMARCA2	-1.74	1.0-6

W kolejnym etapie testów sprawdzono za pomocą portalu DepMap w jakim typie nowotworu wyciszenie genu SMARCA2 powoduje największy spadek proliferacji komórek. Wyniki analizy danych otrzymanych zarówno metodą CRISPR jak i RNAi wskazały na szczególną wrażliwość komórek niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) (Rycina 4-2). W tym typie nowotworu odsetek mutacji w genie SMARCA4 okazał się wysoki i wyniósł 23.7%.

Rycina 4-2. Wpływ braku ekspresji genu SMARCA2 na proliferację komórek (Analiza bioinformatyczna – DepMap). Na wykresie zaprezentowano grupy linii komórkowych poszczególnych typów nowotworów, dla których zaobserwowano szczególną zależność od ekspresji genu SMARCA2. A: RNAi, B: CRISPR. p - prawdopodobieństwo zależności, n - liczba linii komórkowych zaprezentowanych na rycinie dla poszczególnych grup. Analizę przeprowadzono dla 131 linii komórkowych, https://bit.ly/383dN2T.

Powyższe analizy przeprowadzone dla komórkowych linii nowotworowych, zweryfikowano w oparciu o dane genomiczne dla pacjentów z nowotworami. Odsetek mutacji w genie SMARCA4 różnił się znacząco w zależności od typu nowotworu (4,5% ogółem). Największy odsetek mutacji odnotowano u pacjentów z niebarwnikowymi nowotworami skóry (13,51%), a niedrobnokomórkowy rak płuca (8,63%) znalazł się na 5 miejscu (Rycina 4-3 A). W kolejnym kroku sprawdzono możliwe rodzaje mutacji genu SMARCA4. W oparciu o opublikowane dane dla próbek klinicznych [145] oraz informacje z cBioPortal stwierdzono, że mutacje w genie SMARCA4 są różne w każdym przypadku nowotworu, nie lokalizują w charakterystycznych klastrach i są rozproszone po całej sekwencji genu (Rycina 4-3 B). Ponadto, w przypadku próbek klinicznych nie wszystkie typy mutacji w równej mierze przyczyniają się do spadku ekspresji genu SMARCA4. Za brak białka BRG1 odpowiadają bowiem mutacje nonsensowne i przesunięcia ramki odczytu, powodujące wcześniejsze skrócenie łańcucha polipeptydowego.

Rycina 4-3. Mutacje w genie SMARCA4 w zależności od typu nowotworu. A: odsetek mutacji ogółem, B: Schemat przedstawiający lokalizację mutacji genu SMARCA4. Wynik otrzymano za pomocą cBioPortal (MSK-IMPACT Clinical Sequencing Cohort [63], https://bit.ly/37IgmXB). Zielona kropka - mutacje typu zmiany sensu, czarna kropka - mutacje powodujące wcześniejsze skrócenie łańcucha polipeptydowego, fioletowa kropka – fuzja genu, brązowa kropka – mutacje niezmieniające ramki odczytu. HSA - domena odpowiedzialna za interakcję z DNA, BRK - domena o nieznanej funkcji, SNF2_N oraz Helica - Domena ATPazowo-helikazowa, SnAC - domena odpowiedzialna za interakcję z histonami, Brom - Bromodomena [146, 147]. C: odsetek mutacji powodujących wcześniejsze skrócenie łańcucha polipeptydowego. D: odsetek mutacji typu zmiany sensu, W analizie (A, C, D) przedstawiono dane, dla których częstość zmian wyniosła ponad 2%. Analizę przeprowadzono z wykorzystaniem największego dostępnego na cBioPortal zbioru danych dotyczących prób od pacjentów (MSK-IMPACT Clinical Sequencing Cohort [63]). Czerwonym kolorem zaznaczono NSCLC. 1 - Niebarwnikowe nowotwory skóry, 2 - Nowotwór złośliwy bez określenia jego umiejscowienia, 3 - Rak pęcherza moczowego, 4 - Rak trzonu macicy, 5 - NSCLC, 6 - Rak jelita grubego, 7 - Czerniak, 8 - Guz grasicy, 9 - Nowotwór obwodowego układu nerwowego, 10 - Drobnokomórkowy rak płuca, 11 - Glejak, 12 - Rak połączenia przełykowo-żołądkowego, 13 - neuroendokrynny guz przewodu pokarmowego, 14 - Rak szyjki macicy, 15 - Rak regionu głowy i szyi, 16 - Nowotwór z dojrzałych komórek B, 17 - Rak jelita cienkiego, 18 - Rak wątroby, 19 - Rak kości, 20 - Nowotwór centralnego układu nerwowego, 21 - Rak trzustki.

W kolejnym kroku sprawdzono jaki odsetek mutacji powodujących wcześniejsze skrócenie łańcucha polipeptydowego białka BRG1 występuje w poszczególnych typach nowotworów (Rycina 4-3 C). Wynik tej analizy umiejscowił NSCLC na drugim miejscu (4,32%), tuż za grupą nowotworów złośliwych bez określonego umiejscowienia (8,6%) wskazując niedrobnokomórkowy rak płuca jako możliwą indykację terapeutyczną dla inhibitorów białka BRM. Mutacje powodujące wcześniejsze skrócenie łańcucha polipeptydowego białka BRG1

stanowią niemalże połowę mutacji genu SMARCA4 w NSCLC (4,32% z 8,63%). Pozostały odsetek alteracji to mutacje typu zmiany sensu, które także mogą prowadzić do powstania niefunkcjonalnego białka BRG1 i uwrażliwić komórki na działanie inhibitorów białka BRM (Rycina 4-3 B). Na podstawie opisanych powyżej analiz bioinformatycznych można wnioskować, że głównym markerem, pozwalającym na stratyfikację pacjentów z NSCLC do terapii potencjalnymi inhibitorami białka BRM są mutacje genu SMARCA4 które prowadzą do obniżonego poziomu białka BRG1.

Ze względu na niedostępność selektywnych inhibitorów białka BRM i brak danych klinicznych dla skuteczności ich działania, dalsze analizy przeprowadzono z wykorzystaniem linii komórkowych i danych uzyskanych metodami inżynierii genetycznej. Analizę przeprowadzono w oparciu o wyniki sekwencjonowania (brak wiarygodnych danych proteomiczych). Takie podejście było możliwe, ponieważ w liniach komórkowych mutacje w genie SMARCA4 przekładają się w większości przypadków na brak białka BRG1. Bazując na danych dla linii komórkowych NSCLC sprawdzono, czy spadek proliferacji komórek jest zależny jedynie od obecności mutacji w genie SMARCA4 (Rycina 4-4). Na wykresach przedstawiono parametry zależności linii komórkowych od wyciszenia i utraty ekspresji genu SMARCA2 (DEMETER2, CERES) uzyskane z wykorzystaniem RNAi lub metody CRISPR. Następnie, dla badanych linii komórkowych zaznaczono na wykresach obecność mutacji w genie SMARCA4 w oparciu o dane uzyskane z portalu cBioPortal oraz dane literaturowe (NCI-H1355, NCI-H1299) [83, 90, 148]. Dla większości badanych linii komórkowych zaobserwowano zjawisko syntetycznej letalności pomiędzy mutacją w genie SMARCA4, a wyciszeniem genu SMARCA2 w komórkach NSCLC.

Rycina 4-4. Wpływ wyciszenia genu SMARCA2 na proliferację komórek NSCLC (Analiza bioinformatyczna – DepMap). A: RNAi, B: CRISPR. Linie komórkowe z mutacją w genie SMARCA4 (według cBioPortal);	Linie komórkowe z mutacją w genie SMARCA4 (według literatury);Linie komórkowe z dziką formą genu Linie komórkowe z mutacją

w genach SMARCA4 i SMARCA2.

Nie wszystkie linie komórkowe posiadające mutację w genie SMARCA4 odpowiadały oczekiwanym spadkiem proliferacji po wyciszeniu genu SMARCA2. Dla linii z mutacją w genie SMARCA4, dla których nie zaobserwowano spadku proliferacji (CERES/DEMETER2 ≥-0,15), wykonano za pomocą cBioPortal analizę sprawdzającą obecność alteracji w genie SMARCA2 (mutacje i delecje homozygotyczne). Jedynie w nielicznych liniach komórkowych wykryto obecność mutacji w genie SMARCA2 (najczęściej delecja homozygotyczna), która mogłaby w łatwy sposób wyjaśnić brak odpowiedzi tych linii na wyciszenie genu SMARCA2 (Rycina 4-4, zielone słupki). Mutacje genu SMARCA2 w nowotworach nie są bowiem częste, a według doniesień literaturowych jednym z mechanizmów wyciszenia ekspresji SMARCA2 są modyfikacje epigenetyczne (np. w linii NCI-H522) [149–151]. W celu sprawdzenia czy linie komórkowe z mutacją w genie SMARCA4, które nie były wrażliwe na wyciszenie genu SMARCA2 (CERES/DEMETER2 ≥-0,15) mają obniżony poziom jego ekspresji wykonano dodatkową analizę z wykorzystaniem portalu DepMap. Pokazano, że brak wpływu na proliferację tych komórek wynikał z obniżonego poziomu ekspresji genu SMARCA2 (Rycina 4-5, niebieska ramka).

Rycina 4-5. Zależność poziomu ekspresji genu SMARCA2 od wpływu wyciszenia genu SMARCA2 na proliferację komórek NSCLC (Analiza bioinformatyczna – DepMap). A: RNAi, B: CRISPR. Każda z kropek przedstawionych na wykresach reprezentuje dane dla oddzielnej linii komórkowej. Czerwonym kolorem zaznaczono linie komórkowe z mutacjami typu utrata funkcji w genie SMARCA4.

Podsumowując, wykonane analizy, oparte na danych uzyskanych zarówno metodą CRISPR, jak i RNAi wskazały na zjawisko syntetycznej letalności pomiędzy mutacją w genie SMARCA4, a wyciszeniem ekspresji genu SMARCA2 w komórkach NSCLC. Ponadto w oparciu o otrzymane dane wyciągnięto wstępny wniosek o potrzebie zastosowania dwóch

markerów predykcyjnych w postaci braku obecności białka BRG1 i obecności białka BRM (ekspresja mRNA i brak mutacji typu utrata funkcji w genie SMARCA2) do przeprowadzenia stratyfikacji pacjentów mających szansę uzyskać korzyść z terapii inhibitorami białka BRM.

Biologiczna walidacja celu molekularnego

W celu potwierdzenia założeń uzyskanych w wyniku przeglądu literaturowego oraz analiz bioinformatycznych zaplanowano i wykonano doświadczenia pozwalające sprawdzić zmiany w fenotypie wybranych linii komórkowych po wyciszeniu genów SMARCA2 i SMARCA4. Do przeprowadzenia analizy wyselekcjonowano 3 linie posiadające mutacje typu utrata funkcji w genie SMARCA4 (A549, NCI-H1299, SK-HEP-1) oraz 3 linie z dziką formą tego genu (NCI-H460, NCI-H1437, HT1080). Linie komórkowe zostały wybrane w oparciu o dane literaturowe [35, 68], bioinformatyczne oraz wyniki genotypowania sekwencji genu SMARCA4. W badaniu uwzględniono także linie komórkowe wywodzące się z innych niż NSCLC typów nowotworów: SK-HEP-1 – rak wątrobowokomórkowy oraz HT1080 - włókniakomięsak. Wszystkie linie komórkowe wykazały obecność białka BRM wykrytą za pomocą metody Western Blot (Rycina 4-6). W liniach komórkowych z mutacją typu utrata funkcji w genie SMARCA4 nie pokazano obecności białka BRG1 lub była ona na znikomym poziomie. Dla linii z dziką formą genu SMARCA4 pokazano prążek pochodzący od białka BRG1. Analiza Western Blot uwidoczniła dla niektórych linii komórkowych dwa prążki, co wynika z obecności różnych izoform białek BRM i BRG1.

Rycina 4-6. Poziomy białek BRM i BRG1 w wybranych liniach komórkowych. Zaprezentowany wynik Western Blot jest fragmentem membrany przedstawionej na rycinie poniżej (Rycina 4-31).

W celu potwierdzenia hipotezy o występowaniu zjawiska syntetycznej letalności pomiędzy BRM i BRG1 wykorzystano metodę wyciszania genów siRNA oraz krótko- i długoterminowy test żywotności. Procedura transfekcji została zoptymalizowana dla każdej z badanych linii komórkowych by uzyskać jak najlepszy poziom wyciszenia. Wykluczono także ewentualną toksyczność dla kontroli negatywnej, wykorzystanego czynnika transfekcyjnego, czy niespecyficznego siRNA. Przebieg eksperymentu został przedstawiony na rycinie poniżej (Rycina 4-7).

Rycina 4-7 Przebieg eksperymentu sprawdzającego odpowiedź proliferacyjną komórek na wyciszenie ekspresji genów SMARCA2 i/lub SMARCA4. D – dzień. W niektórych przypadkach zbiór komórek do analizy Western Blot wykonywano także w D2 lub D3.

Poziom wyciszenia genu SMARCA2, przekładający się na obniżony poziom białka BRM sprawdzano za pomocą techniki Western Blot. Dla wszystkich testowanych siRNA w każdej badanej linii komórkowej uzyskano ponad 80% (analiza densytometryczna) obniżenie poziomu białka BRM (Rycina 4-8 A). W liniach komórkowych NCI-H460 i HT1080 oprócz genu SMARCA2 wyciszano także ekspresję SMARCA4. Pomimo optymalizacji procedury transfekcji spadek ilości białka BRG1 po wyciszeniu SMARCA4 był niższy niż w przypadku BRM i oscylował na poziomie 70% (Rycina 4-8 A).

Zarówno w krótkoterminowym, jak i długoterminowym teście obserwowano spadek żywotności komórek posiadających mutację typu utrata funkcji w genie SMARCA4 (A549, SK-HEP-1, Rycina 4-8 B, C, brak białka BRG1 Rycina 4-6). Większy spadek żywotności komórek został jednak uwidoczniony w teście długoterminowym (A549, SK-HEP-1, NCI- H1299; Rycina 4-8 C). Wygenerowane dane świadczą o tym, że efekty fenotypowe w wyniku wyciszenia ekspresji genów kodujących białka epigenetyczne mogą pojawić się w późniejszym czasie. Są one także przesłanką sugerującą, że testy sprawdzające żywotność komórek po traktowaniu nowymi inhibitorami celującymi w białko BRM powinny być przeprowadzane zgodnie z procedurą długoterminowego testu żywotności.

Rycina 4-8. Zmiany fenotypu komórek nowotworowych po wyciszeniu ekspresji genu SMARCA2/4 za pomocą siRNA. A: Wynik Western Blot, B: Krótkoterminowy test żywotności (72 godziny), na wykresie przedstawiono uśrednione wartości dla wszystkich testowanych siRNA. Komórki po transfekcji wysiano na studzienki płytek 96-dołkowych w gęstościach 750 (A549, SK-HEP-1, NCI-H1299), 15000 (NCI-H1437) i 1000 kom/dołek (NCI-H460, HT1080), ***p≤0,001.

C: Długoterminowy test żywotności (6-8 dni w zależności od szybkości wzrostu danej linii komórkowej), komórki po transfekcji wysiano na studzienki płytek 6-dołkowych w gęstościach 750 (A549, SK-HEP-1, NCI-H1299), 4000 (NCI-H1437) oraz 1000 kom/dołek (NCI-H460, HT1080); Obraz otrzymany dla linii SK-HEP-1 jest słabej intensywności ze względu na długi czas podziału komórek. NT – próba nietraktowana oraz KT - próba traktowana czynnikiem transfekcyjnym i siRNA kontrolnym.

Wyciszenie genu SMARCA4 w liniach komórkowych z funkcjonalnym białkiem BRG1 nie spowodowało spadku żywotności mierzonej za pomocą krótko- jak i długoterminowego testu żywotności (Rycina 4-8 B, C). Nie zaobserwowano także wpływu podwójnego wyciszenia siRNA SMARCA2/4 na żywotność komórek. Może być to spowodowane niewystarczającym poziomem wyciszenia badanych genów lub faktem, że komórki w których występuje mutacja typu utraty funkcji w genie SMARCA4 (całkowita niefunkcjonalność białka BRG1) dopiero po czasie uzależniają się od funkcji białka BRM.

Metodyka	umożliwiająca	selekcję	i	charakterystykę	związków małocząsteczkowych celujących w białko BRM

Przeprowadzenie kampanii testów przesiewowych mającej na celu wyłonienie nowych związków małocząsteczkowych celujących w białko BRM wymagało optymalizacji szeregu metod biochemicznych, biofizycznych i/lub komórkowych.

Zmodyfikowana metoda Thermal Shift

Optymalizacja zmodyfikowanej metody Thermal Shift została rozpoczęta w warunkach, w jakich przeprowadzane były pierwsze testy biochemicznej aktywności białka BRM. W pierwszych etapach sprawdzono stabilność białka w różnych buforach oraz w obecności DNA czy ATP/ADP. Ponadto ustalono zakres temperatur powodujących denaturację białka oraz oszacowano optymalny czas inkubacji z pierwszymi potencjalnymi inhibitorami białka BRM. Związek referencyjny firmy Novartis został przetestowany w końcowych, zoptymalizowanych warunkach zmodyfikowanej metody Thermal Shift. Cały proces optymalizacji obejmował większą liczbę eksperymentów, lecz dla przejrzystości rozprawy doktorskiej przedstawiono jedynie wyniki reprezentujące główne kroki optymalizacyjne. Poszczególne, kluczowe etapy zostały zestawione na rycinie poniżej (Rycina 4-9).

Rycina 4-9. Etapy optymalizacji Zmodyfikowanej metody Thermal Shift. Skład Buforu 1 jest tajemnicą handlową firmy Ryvu Therapeutics.

Do przeprowadzenia pierwszych eksperymentów wykorzystano specyficzne wobec N-końca białka BRM przeciwciało firmy Santa Cruz Biotechnology (sc-6450), za pomocą którego uwidoczniono na żelu jeden prążek na przewidywanej wysokości równej 250 kDa (Rycina 4-10 A, B, C). Otrzymany wynik sugerował, że nie następuje degradacja białka od C-końca lub zdegradowane fragmenty wytrącają się z roztworu i zostają z niego usunięte na etapie wirowania. W celu weryfikacji czy degradacja białka nie następuje od N-końca wykorzystano przeciwciało innego producenta specyficzne wobec C-końca białka BRM (Abcam, ab12165; Rycina 4-10 D, E). Przeciwciało firmy Abcam uwidoczniło na żelu wiele prążków, co wskazało na prawdopodobną degradację rekombinowanego białka BRM zachodzącą od N-końca. Rozpad białka od N-końca został także potwierdzony z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec metek His-Tag i Twin-Strep-Tag przyłączonych odpowiednio do N-końca i C-końca białka BRM (dane uzyskane od Działu Biochemicznego firmy Ryvu Therapeutics, Rycina 4-10 F). Pomimo pokazanej, niewielkiej degradacji białka BRM, stwierdzono, że jego czystość jest wystarczająca do przeprowadzenia testów biochemicznych oraz zmodyfikowanej metody Thermal Shift. W kilku kolejnych doświadczeniach optymalizacyjnych przeprowadzano etap detekcji z wykorzystaniem obu przeciwciał specyficznych wobec białka BRM (Abcam, Santa Cruz Biotechnology), uzyskując spójne wyniki. Jednakże, końcową decyzję o wykorzystaniu przeciwciała firmy Abcam do detekcji wyniku zmodyfikowanej metody Thermal Shift podjęto ze względu na silniejszy sygnał chemiluminescencji uzyskiwany w eksperymentach z wykorzystaniem tego przeciwciała, co przekładało się na wyższą czułość metody.

Pierwsze analizy pokazały bardzo niską stabilność białka BRM (1 godzina), która zwiększała się w obecności DNA (Rycina 4-10 A). W celu weryfikacji, czy brak białka na żelu w próbach bez DNA wynika z czasu inkubacji w temperaturze pokojowej, przetestowano krótszy punkt czasowy równy 15 minut. Skrócenie czasu inkubacji nie poprawiło stabilności białka w próbach bez DNA (Rycina 4-10 B).

Rycina 4-10. Wynik poszczególnych etapów optymalizacji zmodyfikowanej metody Thermal Shift z wykorzystaniem Buforu 1. A: Denaturacja białka BRM +/- DNA w gradiencie temperaturowym 35°C

- 60°C, godzinna inkubacja w temperaturze pokojowej przed denaturacją, wirowanie 16 900 x g 20 minut 4°C, Western Blot, przeciwciało sc-6450. B: 15 minutowa inkubacja BRM w temperaturze pokojowej, wirowanie 16900 x g, 20 minut, 4 °C, Western Blot, przeciwciało sc-6450. C: 15 minutowa lub godzinna inkubacja BRM + DNA z poszczególnymi związkami (100 µM każdy) w temperaturze pokojowej, wirowanie 16900 x g, 20 minut, 4°C, Western Blot, przeciwciało sc-6450. Eksperyment został przeprowadzony w pełnym gradiencie temperaturowym (TP oraz 35°C - 60°C), jednak ze względu na całkowitą destabilizację białka w temperaturze pokojowej na rycinie nie uwzględniono pozostałych punktów temperaturowych. Z1-Z4 - potencjalne, stworzone przez dział chemiczny firmy Ryvu Therapeutics, inhibitory białka BRM. D: 15 minutowa inkubacja BRM z 100 µM doksorubicyną w temperaturze pokojowej, wirowanie 16900 x g, 20 minut, 4 °C, Western Blot, przeciwciało Santa Cruz Biotechnology (sc-6450) oraz Abcam (ab12165). E: 15 minutowa inkubacja BRM + DNA z doksorubicyną (zakres stężeń) w temperaturze pokojowej, wirowanie 16900 x g 20 minut 4 °C, Western Blot, przeciwciało Abcam ab12165. F: 1 - Obraz żelu wybarwionego odczynnikiem Coomasie Blue, 2,3,4,5 - Western Blot z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych wobec metki His-Tag (2), metki Twin-Strep-Tag (3) oraz N końca (4) i C-końca (5) białka BRM. TP - temperatura pokojowa; DOX - doksorubicyna.

Równolegle sprawdzono wpływ potencjalnych, stworzonych przez Dział Chemiczny firmy Ryvu Therapeutics, inhibitorów (Z1-Z4) na temperaturę denaturacji białka BRM w obecności DNA, uwzględniając dwa czasy inkubacji ze związkami przed denaturacją. Eksperyment nie pokazał różnic pomiędzy poszczególnymi czasami inkubacji (Rycina 4-10 C). Do przeprowadzenia kolejnych eksperymentów wybrano krótszy czas inkubacji ze związkami równy 15 minut. Część z testowanych na tym etapie związków (Z1, Z2, Z3) powodowała destabilizację białka BRM (w obecności DNA) podczas inkubacji w temperaturze pokojowej (Rycina 4-10 C). Postulowano, że mogło być to spowodowane wpływem cząsteczek na oddziaływanie białka BRM z DNA. W celu sprawdzenia hipotezy, czy destabilizacja może

między innymi wynikać z zaburzenia oddziaływania białka BRM z DNA sprawdzono jaki wynik zostanie uzyskany dla znanego interkalatora DNA – doksorubicyny (DOX). Obecność DOX, tak jak w przypadku badanych związków, spowodowała zależną od dawki destabilizację białka BRM (z DNA) podczas 15-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej (Rycina 4-10 D, E). Otrzymany wynik był przesłanką o konieczności równoczesnego badania związków w teście sprawdzającym interkalację z DNA, w celu prawidłowej interpretacji danych zmodyfikowanej metody Thermal Shift w Buforze 1.

Ze względu na wysoką niestabilność białka BRM w pierwotnym buforze (Bufor 1, brak białka po 15 minutach inkubacji w TP) zdecydowano się na optymalizację jego składu. W ustalonych warunkach (Bufor 2) pokazano brak wytrącania się BRM z roztworu w temperaturze pokojowej aż do 2 godzin (Rycina 4-11).

Rycina 4-11. Stabilność białka BRM w temperaturze pokojowej. Eksperyment wykonano z wykorzystaniem Buforu 2 (skład Buforu 2 jest tajemnicą handlową firmy Ryvu Therapeutics).

Kolejno sprawdzono przybliżoną temperaturę denaturacji białka BRM w Buforze 2 bez i w obecności DNA. We wszystkich badanych próbach, inkubowanych w temperaturach niższych niż 57,9 °C, pokazano większą ilość białka na żelu w próbach, w których obecne było DNA (Rycina 4-12 A). Przesunięcie przybliżonej temperatury denaturacji wyniosło 11,9 °C, co świadczy o stabilizacji białka BRM w obecności DNA (Rycina 4-12 A). Kolejne etapy optymalizacji zostały wykonane w celu zwiększenia przepustowości metody, którą limitował etap wirowania (probówki typu PCR w adapterach) oraz sposób detekcji (Western Blot). Podczas optymalizacji brano pod uwagę konieczność kompromisu pomiędzy obniżeniem czułości metody, a zwiększeniem jej przepustowości.

Etap denaturacji w gradiencie temperaturowym mógł być przeprowadzony na płytce 96- lub 384-dołkowej. Sprawdzono więc czy istnieje możliwość odwirowania próbek po denaturacji na płytce. Ze względu na ograniczenia sprzętowe wirowanie przeprowadzono przy maksymalnej możliwej prędkości równej 2250 x g, która była znacząco niższa niż prędkość wirowania probówek typu PCR w adapterach (16900 x g). Aby doprowadzić do odwirowania wszystkich agregatów zdenaturowanego białka czas wirowania wydłużono

z 20 do 40 minut (Rycina 4-12 B). Pomimo większej ilości białka na żelu w próbach odwirowanych przy 2250 x g pokazano stabilizację temperaturową białka BRM w obecności DNA, czułość metody była jednak niższa, a przesunięcie przybliżonej temperatury denaturacji pod wpływem DNA wyniosło 4,3 °C.

Rycina 4-12. Wynik poszczególnych etapów optymalizacji zmodyfikowanej metody Thermal Shift z wykorzystaniem Buforu 2. A, B, C, D: Krzywa denaturacji białka BRM bez i w obecności DNA: Wirowanie 16900 x g, 20 minut, 4 °C, Western Blot (A). Wirowanie 2250 x g, 40 minut, 4 °C, Western Blot (B). Wirowanie 16900 x g, 20 minut, 4 °C, manualny Dot Blot, kropla 2 µl, duplikat (C). Wirowanie 2250 x g, 40 minut, 4 °C, manualny Dot Blot, kropla 2 µl, duplikat (D). Wszystkie wyniki zostały wygenerowane z wykorzystaniem przeciwciała firmy Abcam (ab12165). % TP - % intensywności sygnału Western Blot / Dot Blot dla próby inkubowanej w temperaturze pokojowej (Równanie 3-6). TD – przybliżona temperatura denaturacji.

Równolegle sprawdzono, czy metoda Western Blot może zostać zastąpiona szybszą metodą detekcji – manualnym Dot Blot. Wynik uzyskany z wykorzystaniem prędkości wirowania równej 16900 x g był nieznacznie mniej czuły niż rezultat Western Blot, a przesunięcie przybliżonej temperatury denaturacji wyniosło 7,2 °C (Rycina 4-12 C). Postulowano, że niższa

czułość może być spowodowana niewystarczającą precyzją w nakładaniu prób na membranę PVDF oraz zbyt dużą objętością kropli.

Następnie sprawdzono, czy możliwe jest przeprowadzenie eksperymentu, w którym próby wirowane będą na płytce (2250 x g), a metodą detekcji będzie manualny Dot Blot. Otrzymany wynik nie pokazał satysfakcjonującego przesunięcia temperatury topnienia spowodowanej obecnością DNA, który wyniósł jedynie 1,1 °C (Rycina 4-12 D). Znaczny spadek czułości metody był najprawdopodobniej sumą dwóch czynników w postaci obniżenia czułości poprzez niższą szybkość wirowania oraz wykorzystania metody Dot Blot. Aby przezwyciężyć te ograniczenia zdecydowano się na dalszą optymalizację metody detekcji.

W celu poprawienia parametrów metody Dot Blot do nałożenia nadsączy na membranę wykorzystano akustyczny dyspenser Labcyte Echo550. W pierwszym kroku sprawdzono jaka ilość białka na membranie może być wykryta przez przeciwciało (Rycina 4-13 A). Pokazano, że stężenie białka BRM równe 0,33% w kropli o objętości 0,5 µl jest wystarczające do przeprowadzenia detekcji białka na membranie. Ze względu na potrzebę uzyskania jak najlepszej rozdzielczości metody Dot Blot i potrzeby zmniejszenia odległości pomiędzy poszczególnymi kroplami (możliwość testowania 384 prób na jednej membranie), zmniejszono objętość kropli do 0,25 µl (0,65% BRM), uzyskując w próbce taką samą ilość białka jak w kropli o stężeniu 0,33% BRM i objętości 0,5 µl (Rycina 4-13 B). Ponadto zoptymalizowano metodę, według którego urządzenie Labcyte Echo 550 nakłada próby są na membranę PVDF. Między innymi, porównano protokół dla stężonych roztworów wodnych (P2) oraz rozcieńczonych roztworów wodnych (B2), nie obserwując różnic (Rycina 4-13 C). Kolejne eksperymenty wykonywano z wykorzystaniem protokołu P2 oraz objętości kropli równej 0,25 µl. Zoptymalizowana metoda Thermal Shift z wykorzystaniem Labcyte Echo 550 wykazała wystarczającą dla testu czułość (przesunięcie przybliżonej temperatury denaturacji spowodowanej obecnością DNA równe 4 °C), rozdzielczość (odległość między kroplami) i powtarzalność (replikaty techniczne; Rycina 4-13 B).

Rycina 4-13. Wynik poszczególnych etapów optymalizacji metody Dot Blot – Labcyte Echo 550. A: Miareczkowanie ilości białka BRM na membranie PVDF. Protokół P2, kropla 0,5 µl. Zdjęcie membrany obejmuje jedno z trzech powtórzeń. Densytometria została wykonana w oparciu o wszystkie powtórzenia techniczne. B: Krzywa denaturacji białka BRM bez i w obecności DNA. Wirowanie 2250 x g 40 minut 4 °C, Protokół P2, kropla 0,25 µl. C: Porównanie protokołu P2 (dla stężonych roztworów wodnych) i B2 (dla rozcieńczonych roztworów wodnych) dozowania prób na membranę PVDF, kropla 0,5 µl.

Sprawdzono także wpływ opisanego w literaturze inhibitora metylotransferaz DNMT, SGI-1027, który powodował spadek aktywności ATP-azowej białka BRM mierzonej za pomocą testu biochemicznego [129, 130]. Związek SGI-1027 pokazał znaczącą destabilizację białka BRM. Przesunięcie temperatury topnienia bez obecności DNA wyniosło 7 °C, natomiast w obecności DNA 2 °C (Rycina 4-14 A). Otrzymany dla tego związku wynik był zgodny z oczekiwaniami, gdyż według danych wewnętrznych firmy Ryvu Therapeutics związek SGI-1027 oddziałuje z białkiem BRM, jest interkalatorem DNA oraz agregatorem BRM, co powinno przekładać się na jego destabilizację w obu testowanych warunkach. Przykład związku SGI-1027 pokazuje, że cząsteczki testowane za pomocą zmodyfikowanej metody Thermal Shift powinny być uprzednio sprawdzone pod kątem agregacji białka BRM i interkalacji z DNA.

Rycina 4-14. Wpływ ADP, DNA oraz inhibitorów małocząsteczkowych na stabilność temperaturową białka BRM. Krzywa denaturacji białka BRM bez i w obecności DNA, ATP i testowanych związków: SGI-1027 – 10 µM (A) Związek referencyjny Novartis – 1 µM, ADP – 100 µM (B). Wirowanie 2250 x g, 40 minut, 4 °C, Protokół P2, kropla 0,25 µl. Zdjęcia membran Dot Blot obejmują jedno z trzech powtórzeń technicznych. Densytometria została wykonana w oparciu o wszystkie wykonane powtórzenia techniczne.

W końcowych warunkach zmodyfikowanej metody Thermal Shift przetestowano związek referencyjny. Cząsteczka Novartis nie pokazała znaczącego wpływu na przesunięcie przybliżonej temperatury denaturacji białka BRM (1,1 °C) pomimo zastosowania stukrotnie wyższego stężenia (1 µM), niż wartość IC50 ~ 10 nM wyznaczona w teście biochemicznym (Rycina 4-14 B, Suplement, Tabela uzupełniająca 2-1). W oparciu o dane opublikowane, pokazujące, że związek referencyjny firmy Novartis [84] wykazuje częściową kompetycję z ATP sprawdzono, czy ADP wpływa na stabilność temperaturową BRM. Pomimo użycia wysokiego stężenia ADP nie zaobserwowano żadnych zmian w temperaturze topnienia BRM (Rycina 4-14 B), co potwierdziło założenie, że mimo oddziaływania z białkiem BRM niektóre cząsteczki mogą nie wpływać na zmianę jego stabilności termicznej. Wyniki fałszywie negatywne mogą występować częściej w przypadku dużych białek, takich jak BRM.

CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego

Kolejną z metod umożliwiających potwierdzenie oddziaływania białko – ligand poprzez zmiany w temperaturach topnienia białek jest CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego. Do jej przeprowadzenia użyto linię komórkową włókniakomięsaka HT1080, charakteryzującą

się obecnością zarówno białka BRM, jak i BRG1. W pierwszym etapie sprawdzono, czy denaturacja wspomnianych białek przebiega w zbliżony sposób. Zaletą wspomnianej metody jest możliwość równoczesnego sprawdzenia oddziaływania badanego związku z wieloma białkami o podobnej temperaturze topnienia, których poziom w danej linii komórkowej może zostać uwidoczniony metodą Western Blot. Doświadczenie pokazało mniejszą stabilność temperaturową białka BRM względem BRG1 (Rycina 4-15 A). Różnica nie była jednak tak duża by uniemożliwić optymalizację metody pod kątem oceny selektywności działania badanych związków z wykorzystaniem takiego samego gradientu temperatur. Wybrany zakres temperatur (40-65ºC) umożliwił uwidocznienie denaturacji obu białek do poziomu większego niż 55% (65ºC). Rozważano podniesienie najniższego punktu równego 40ºC do 44,5ºC w przypadku kolejnych eksperymentów w gradiencie temperatur. Zmiana dolnego punktu temperaturowego wynikała z faktu, że denaturacja białka rozpoczyna się dopiero w temperaturze 49,4ºC. Pod uwagę brano także poziom denaturacji kontroli endogennej, której stabilny poziom pożądany jest w analizie otrzymanego wyniku. Białko kontrolne GAPDH (ang. glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) denaturowało w podobnym zakresie temperatur, jak białka badane. Zdecydowano się na uwzględnienie dodatkowej kontroli w postaci białka winkulina w kolejnych eksperymentach.

Sprawdzono, czy związek referencyjny firmy Novartis powoduje stabilizację lub destabilizację termiczną badanych białek. Do przeprowadzenia pierwszego eksperymentu wybrano temperaturę równą 65ºC, w której metoda Western Blot uwidoczniła denaturację białek BRM i BRG1 odpowiednio na poziomie 63% i 44% (Rycina 4-15 B, DMSO_65ºC). Otrzymane wyniki umożliwiły dalszą analizę danych. Pomimo zastosowania stukrotnie wyższego stężenia (1 µM) związku Novartis, niż wartość IC50 ~ 10 nM wyznaczona w teście biochemicznym, poziom białek BRM i BRG1 w próbach traktowanych związkiem nie zmienił się w odniesieniu do próby DMSO. Otrzymany wynik świadczył o braku stabilizacji lub destabilizacji badanych białek spowodowanej działaniem związku referencyjnego (Rycina 4-15 B, Novartis_65ºC).

Rycina 4-15. CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego. A: Wynik denaturacji białek BRM i BRG, Western Blot oraz densytometria. B: Test zależnego od dawki działania związku Novartis. Do normalizacji wyników przedstawionych na wykresie wykorzystano kontrolę w postaci białka winkulina. C: Wpływ 10 µM związku Novartis na stabilizację termiczną białek BRM i BRG1. Sygnał Western Blot dla białek BRM i BRG1 został znormalizowany wobec sygnału dla białka winkulina. Przerywanymi liniami na wykresach zaznaczono wartości powyżej/poniżej, których wynik można uznać za znaczący (% TP<70%, 70%>Kontroli>130%). Zaprezentowana rycina jest wynikiem reprezentatywnym z jednego powtórzenia technicznego. Kolejne eksperymenty zostały wykonane w innym układzie doświadczalnym, lecz uzyskane dla nich wyniki były spójne.

W oparciu o zbiór danych literaturowych pokazujących, że w metodzie CETSA stosowane są zazwyczaj znacząco wyższe stężenia związków niż wartości IC50 wyznaczone w testach biochemicznych, inhibitor referencyjny przetestowano również w wyższym stężeniu (10 µM).

Ze względu na jedno testowane stężenie związku eksperyment przeprowadzono w gradiencie temperatur (44,5-65,0ºC). Jako białko kontrolne wybrano winkulinę, ponieważ poziom jej denaturacji nie przekroczył 30%, aż do temperatury 65ºC (Rycina 4-15 B, DMSO_65ºC). Przeprowadzona analiza uzyskanych danych wskazała słabą stabilizację zarówno białka BRM, jak i BRG1 w zakresie temperatur 44,5ºC – 51,3ºC (Rycina 4-15 C, bordowe strzałki). Otrzymany wynik dla białka BRG1 nie został uznany za wiążący, ze względu na nieprzekraczający 30% stopień denaturacji białka w próbie kontrolnej (DMSO) w tym zakresie temperatur. Poziom denaturacji białka BRM przekroczył 30% w temperaturach 47,2ºC i 51,3ºC. Poziom stabilizacji spowodowanej związkiem referencyjnym przekroczył 30% jedynie w temperaturze równej 51,3ºC. W związku z powyższym otrzymane wyniki wskazują, że referencyjny związek firmy Novartis powoduje bardzo słabą stabilizację białka BRM w lizacie komórkowym.

Test wnikania związku referencyjnego do komórek

Przeprowadzony eksperyment pokazał, że referencyjny związek firmy Novartis wnika do komórek linii HT1080 (Rycina 4-16). W doświadczeniu dowiedziono, że po upływie 4 godzin od potraktowania komórek związkiem w ilości 1,5 nmol (stężenie 3 µM w medium) do ich wnętrza wniknęło 0,03 nmol związku, a 1,2 nmol w dalszym ciągu było obecne w medium komórkowym. Suma ilości związku obecnego wewnątrz komórek oraz w medium nie jest równa z ilością, jaką dodano do pożywki hodowlanej, gdyż część związku mogła zostać zmetabolizowana przez komórki lub została związana do polistyrenowych ścianek studzienek. Oszacowanie potencjalnego stężenia inhibitora wewnątrz komórki wskazało wartość równą Ckom = 100 µM (Równanie 3-8). W oparciu o późniejsze wyniki komórkowe z wykorzystaniem inhibitora referencyjnego stwierdzono, że oznaczona ilość związku jest wystarczająca do wywołania efektu komórkowego.

1.6

1.4

1.2

nmol 1.0

0.06

0.04

0.02

0.00

Związek referencyjny Novartis

Mt	Mm	Mk

Rycina 4-16. Wynik testu wnikania związku referencyjnego do komórek HT1080. Mt/m/k- liczba moli badanego związku, odpowiednio w medium, którym traktowano komórki (t), w medium komórkowym zebranym znad komórek (m) lub w ekstrakcie komórkowym (k).

CETSA z wykorzystaniem żywych komórek

Do przeprowadzenia metody CETSA z wykorzystaniem żywych komórek także użyto linię komórkową HT1080. Test wykonano w zawężonym zakresie stężeń związku referencyjnego firmy Novartis, lecz z uwzględnieniem kilku temperatur denaturacji. Tak jak w przypadku metody CETSA na lizacie komórkowym, doświadczenie pokazało mniejszą stabilność temperaturową białka BRM względem BRG1. Temperatury denaturacji białek BRM i BRG1 były jednak na tyle zbliżone, że możliwe było przeprowadzenie metody w taki sposób by ocenić selektywność działania badanych związków. W doświadczeniach jako kontrolę do normalizacji wykorzystano winkulinę, która wykazała wysoką stabilność termiczną (brak denaturacji w 55°C, Rycina 4-17 A).

Rycina 4-17. CETSA z wykorzystaniem żywych komórek. Test zależnego od dawki działania związku Novartis na stabilizację termiczną białek BRM i BRG1 wykonany w trzech temperaturach denaturacji. Wirowanie 16900 x g, 20 minut, 4°C. A: Western Blot oraz wynik dla prób traktowanych DMSO dla poszczególnych białek przedstawiony za pomocą % TP (Równanie 3-3). B: Analiza % Kontroli (Równanie 3-4) dla wszystkich testowanych warunków. Przerywanymi liniami na wykresach zaznaczono wartości powyżej/poniżej których wynik można uznać za istotny (% TP<70%, 70%>Kontroli>130%). C: Dodatkowa analiza potwierdzająca (% TPnorm - Równanie 3-5). W tabeli przedstawiono kryteria dla poszczególnych punktów temperaturowych, które są większe lub mniejsze o 1/3 wartości dla próby traktowanej DMSO. Zaprezentowana rycina jest wynikiem reprezentatywnym z jednego powtórzenia technicznego. Kolejne eksperymenty zostały wykonane w innym układzie doświadczalnym, lecz uzyskane dla nich wyniki były spójne.

We wszystkich testowanych temperaturach % TP dla białek BRM i BRG1 był niższy niż 70%, co umożliwiło analizę danych dla wszystkich punktów temperaturowych. Przeprowadzony eksperyment pokazał stabilizację termiczną zarówno białka BRM, jak i BRG1. Dla białka BRM wyższy poziom (% Kontroli) pokazano dla wszystkich punktów temperaturowych (Rycina 4-17 B). W przypadku BRG1 znaczący wynik pokazano tylko przy 49,4 °C. Dla stężeń związku równych 1 µM i 10 µM zachowany był zależny od dawki wzrost stabilizacji badanych białek. Kolejne stężenie równe 30 µM nie pokazało dalszego wzrostu stabilizacji w większości przypadków.

Analiza uwidoczniła także wyższy o 30% poziom białka BRM w próbach traktowanych 10 µM i 30 µM związkiem, które nie zostały poddane denaturacji (Rycina 4-17 B). W celu zweryfikowania, czy opisana powyżej stabilizacja nie wynika z wyjściowego poziomu białka, dane przeanalizowano jako % TPnorm. Stabilizacja została potwierdzona w dwóch testowanych temperaturach (44,7 °C; 49,4 °C, Rycina 4-17 C).

Na podstawie zaobserwowanych zmian można stwierdzić, że związek referencyjny oddziałuje zarówno z białkiem BRM, jak i BRG1.

Izogeniczne linie komórkowe

Izogeniczne pary linii komórkowych, o identycznym podłożu genetycznym, są pożądanym narzędziem służącym do selekcji i określania selektywności działania nowych związków małocząsteczkowych. W ramach niniejszej rozprawy doktorskiej stworzono panel izogenicznych linii komórkowych, w których wyciszono za pomocą metody CRISPR geny SMARCA4 i SMARCA2. Do panelu włączono także linię kontrolną, w której przywrócono ekspresję genu SMARCA4 (przywrócenie fenotypu, ang. rescue).

Stworzenie linii komórkowej z usuniętym genem SMARCA4

W celu stworzenia linii komórkowej z wyłączoną za pomocą metod inżynierii genetycznej ekspresją genu SMARCA4, wybrano linie NCI-H460, NCI-H1437 oraz HT1080. Selekcja linii NSCLC (NCI-H460, NCI-H1437) opierała się na danych literaturowych, natomiast wybór linii włókniakomięsaka HT1080 bazował na danych wewnętrznych firmy Ryvu Therapeutics dotyczących możliwości jej wykorzystania w testach wysokoprzepustowych.

W wyniku modyfikacji genomu linii NCI-H460, NCI-H1437 za pomocą metody CRISPR otrzymano klony pozbawione białka BRG1 (Rycina 4-18 A). Fenotyp otrzymanych linii nie był jednak zgodny z założeniami. Nie wykazały one spadku żywotności po wyciszeniu genu SMARCA2 z wykorzystaniem dwóch różnych siRNA, którą zmierzono za pomocą

długoterminowego testu żywotności (Rycina 4-18 B, C). Otrzymane klony linii komórkowych NCI-H460 oraz NCI-H1437 nie zostały wykorzystane do dalszych badań.

Rycina 4-18. Charakterystyka linii NCI-H460 i NCI-H1437 z nokautem genu SMARCA4. A: Western Blot potwierdzający brak obecności białka BRG1 w wyselekcjonowanych klonach (bordowe ramki) otrzymanych po selekcji klonalnej linii komórkowych zmodyfikowanych metodą CRISPR. Przerywaną linią oddzielono próby znajdujące się na osobnych żelach. B, C: Wynik eksperymentu sprawdzającego odpowiedź proliferacyjną komórek na wyciszenie genu SMARCA2 w liniach z nokautem genu SMARCA4. Linia NCI-H460 (B): Western Blot - D0, Długoterminowy test żywotności (7 dni, płytka 12- dołkowa, 1000 komórek/dołek). Linia NCI-H1437 (C): Western Blot – D0, Długoterminowy test żywotności (8 dni, płytka 6-dołkowa, 15000 kom/dołek).

W przekazanych od firmy Applied StemCell liniach komórkowych z nokautem genu SMARCA4 (HT1080) określono poziom białek BRM i BRG1 (Rycina 4-19 A). Sytuacją idealną był całkowity brak detekcji BRG1 na żelu oraz brak znaczącego obniżenia poziomu BRM w odniesieniu do linii wyjściowej. Uzyskane wyniki dla klonu HT1080 c2 wskazały na niepełną utratę białka BRG1 oraz całkowity brak białka BRM, co było zjawiskiem niepożądanym, w związku z czym otrzymany klon c2 został wykluczony z dalszych analiz.

Dla klonu HT1080 c1, zgodnie z oczekiwaniami wykazano obecność białka BRM oraz całkowity brak białka BRG1. Dla tej linii spadek ekspresji genu SMARCA4 został także uwidoczniony za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym (Rycina 4-19 B). Reakcja qPCR nie pokazała jednak całkowitego braku transkryptu. Zamplifikowane mRNA było najprawdopodobniej niefunkcjonalną skróconą formą transkryptu SMARCA4, gdyż miejsce przyłączenia sondy TaqMan nie obejmuje miejsca, które zostało wycięte z genomu. Analiza qPCR uwidoczniła także mechanizm kompensacyjny prowadzący do zwiększenia ekspresji genu SMARCA2. Wzrost ilości mRNA nie miał jednak przełożenia na poziom białka BRM (które według analizy Western Blot było na nieco niższym poziomie niż w linii kontrolnej). Linia komórkowa HT1080 c1 została w dalszej części pracy nazwana HT1080 SM4KO.

Rycina 4-19 Charakterystyka linii HT1080 z nokautem genu SMARCA4. A: Western Blot, Do określenia ilości białka na membranie wykonano wizualizację z wykorzystaniem funkcji Stain Free. B: qPCR; jako gen konstytutywny wybrano GAPDH, próba kontrolna – cDNA komórek HT1080, n=2.

Odwrócenie fenotypu linii komórkowej z usuniętym genem SMARCA4

W celu pełnej charakterystyki linii HT1080 SM4KO oraz wykluczenia braku specyficzności modyfikacji uzyskanych metodą CRISPR przeprowadzono eksperyment mający na celu odwrócenie fenotypu badanej linii poprzez wprowadzenie do komórek dzikiej wersji genu SMARCA4. W celu uniknięcia artefaktów związanych ze zbyt wysoką nadekspresją białka BRG1 w procedurze wykorzystano konstytutywny promotor UBC o umiarkowanym poziomie ekspresji. Zbyt duża nadekspresja mogłaby doprowadzić do wyciągnięcia fałszywych wniosków dotyczących selektywności testowanych inhibitorów. Stworzenie linii komórkowej HT1080 SM4KO z przywróconą ekspresją genu SMARCA4 zostało wykonane we współpracy z Działem Inżynierii Komórkowej firmy Ryvu Therapeutics. Po przeprowadzeniu procedury transfekcji komórek plazmidem pcDNA3.1+UBC_SMARCA4_FLAG otrzymano 20 klonów, w których sprawdzono poziom białka BRG1 metodą Western Blot. Ze względu na założenie

102

eksperymentu mające na celu odwrócenie fenotypu linii HT1080 SM4KO oczekiwano, że poziom białka BRG1 powinien być porównywalny do linii komórkowej HT1080. Do dalszych analiz wyselekcjonowano klony K7, K15, K19 (Rycina 4-20).

Rycina 4-20. Poziom białka BRG1 w otrzymanych w wyniku selekcji klonalnej komórkach HT1080 SM4KO z przywróconą ekspresją genu SMARCA4. Western Blot. K - klon, Pula - komórki po transfekcji, przed selekcją klonalną. Czerwoną ramką zaznaczono klony, które wybrano do dalszych analiz.

W kolejnym kroku w testowanych klonach sprawdzono poziom białek BRM i BRG1 (Rycina 4-21). Wszystkie przetestowane klony charakteryzowały się porównywalnym do linii HT1080 poziomem badanych białek. Do dalszych badań wybrano klon K15, który nazwano w dalszej części niniejszej rozprawy doktorskiej linią HT1080 SM4R.

Rycina 4-21. Poziom białek BRM i BRG1 w wybranych klonach linii HT1080 SM4KO z przywróconą ekspresją genu SMARCA4. Western Blot. K - klon, Czerwoną ramką zaznaczono klon wybrany do dalszych analiz.

4.2.5.3 Stworzenie linii komórkowej z usuniętym genem SMARCA2

Do stworzenia linii izogenicznej z usuniętym genem SMARCA2 wykorzystano technikę CRISPR HDR i linię komórkową HT1080. W pierwszej kolejności określono potrzebne do selekcji komórek stężenie antybiotyku selekcyjnego. Minimalne stężenie puromycyny, które powinno być wykorzystane do przeprowadzenia procesu selekcji komórek, które przyjęły plazmid HDR jest równe najniższemu stężeniu, które spowodowało śmierć 100% niezmodyfikowanych komórek w przeciągu 3-5 dni. Ze względu na fakt, że stężenie 0,625 µg/ml jest stężeniem granicznym (punkt załamania krzywej) do selekcji wybrano kolejne stężenie puromycyny równe 1 µg/ml (Rycina 4-22).

Rycina 4-22. Krzywa oporności na antybiotyk selekcyjny (puromycyna). Komórki HT1080 wysiano na studzienki płytki 96-dołkowej w gęstości 2000 komórek/dołek. Następnego dnia zmieniono pożywkę hodowlaną na medium z pełnym zakresem stężeń puromycyny. Komórki hodowano przez 72 godziny w inkubatorze komórkowym, a następnie analizowano żywotność komórek zgodnie z procedurą krótkoterminowego testu żywotności. Wybrane stężenie zaznaczono na wykresie strzałką.

W wyniku modyfikacji genomu linii HT1080 za pomocą metody CRISPR oczekiwano całkowitego usunięcia białka BRM z komórek. Po selekcji otrzymano 224 klony, z których 223 zostały przetestowane za pomocą metody Western Blot w dwóch etapach (wyników nie pokazano). Po pierwszym etapie testów dla wybranych 4 klonów, w których nie wykryto obecności białka BRM, sprawdzono także poziom białka BRG1.W trzech klonach wykazano obecność białka BRG1, lecz w skróconej formie, natomiast Western Blot dla jednego klonu (1.71) uwidocznił białko BRG1 na przewidywanej wysokości. Po drugim etapie testów wyselekcjonowano 5 klonów pozytywnych (brak obecności białka BRM) (1.71, 1.77, 2.10,

2.33 i 2.127), w których sprawdzono poziom białka BRM i BRG1 w lizatach otrzymanych z frakcji cytozolowej i jądrowej (Rycina 4-23). Do kolejnych badań wybrano klon 1.77, który w dalszej części niniejszej rozprawy doktorskiej został nazwany HT1080 SM2KO.

Sprawdzenie fenotypu komórek linii izogenicznych po wyciszeniu ekspresji genu

SMARCA2 i/lub SMARCA4.

W celu scharakteryzowania panelu linii izogenicznych (Rycina 4-24), które posłużą jako narzędzie do badania selektywności potencjalnych inhibitorów białka BRM sprawdzono wpływ wyciszenia ekspresji genów SMARCA2 i/lub SMARCA4 na żywotność komórek. Ze względu na identyczne podłoże genetyczne linii HT1080, HT1080 SM4KO, HT1080 SM4R oraz HT1080 SM2KO optymalizację procedury transfekcji wykonano tylko na linii HT1080. Dla testowanych siRNA we wszystkich badanych liniach komórkowych uzyskano obniżenie poziomu białka BRM. Zmniejszenie ilości białka BRG1 przebiegło jednak z niższą wydajnością (Rycina 4-8 A, Rycina 4-25 A).

Rycina 4-23. Poziomy białek BRM i BRG1 we frakcji cytozolowej i jądrowej wybranych klonów uzyskanych w wyniku modyfikacji linii HT1080 metodą CRISPR SMARCA2. Western Blot. R - RIPA, lizat przygotowany z całych komórek, C – frakcja cytoplazmatyczna, J – frakcja jądrowa. WT - lizat otrzymany z linii HT1080.

Rycina 4-24. Charakterystyka linii izogenicznych. A: Western Blot. B: qPCR; jako gen konstytutywny wybrano GAPDH, próba kontrolna – cDNA komórek HT1080, n=2.

Komórki HT1080 SM4KO pokazały wrażliwość na wyciszenie ekspresji genu SMARCA2 (syntetyczna letalność), która została uwidoczniona zarówno w krótko- (spadek o 70%) jak i w długoterminowym teście żywotności. Wrażliwość linii HT1080 SM4KO została zniwelowana poprzez przywrócenie ekspresji genu SMARCA4, gdyż zaobserwowano znacznie mniejszy spadek żywotności linii HT1080 SM4R po wyciszeniu genu SMARCA2. Przeprowadzony eksperyment potwierdza założenie, że spadek żywotności komórek po wyciszeniu genu SMARCA2 jest zależny od braku białka BRG1 (Rycina 4-25 B, C). Zjawisko syntetycznej letalności zostało także pokazane w układzie odwrotnym, gdyż linia komórkowa HT1080 SM2KO była wrażliwa na wyciszenie genu SMARCA4 (Rycina 4-25 B, C).

Rycina 4-25. Zmiany w fenotypie komórek linii izogenicznych po wyciszeniu ekspresji genów SMARCA2 i/lub SMARCA4 za pomocą siRNA. A: Western Blot, płytka 6-dołkowa, 150 000 kom/dołek. B: Krótkoterminowy test żywotności (72 godziny), na wykresie przedstawiono uśrednione wartości dla wszystkich testowanych siRNA, 1000 komórek/dołek. * Test t-Studenta, p<0,05. C: Długoterminowy test żywotności (7dni), płytka 6-dołkowa, 1000 komórek/dołek. Mock – próba traktowana czynnikiem transfekcyjnym, NT – próba nietraktowana oraz KT - próba traktowana czynnikiem transfekcyjnym i siRNA kontrolnym.

Otrzymany wynik może świadczyć o szczególnej zależności tej linii od obecności białka BRG1, gdyż wyciszenie białka jedynie do poziomu równego 30% znacząco wpłynęło na jej żywotność mierzoną zarówno w krótko- jak i długoterminowym teście.

W celu weryfikacji, czy otrzymany dla linii HT1080 SM4KO wynik różni się od danych uzyskanych dla linii nowotworowych naturalnie niosących mutacje w genie SMARCA4, porównano wynik testu krótkoterminowego (A549, SK-HEP-1) i długoterminowego (A549, SK-HEP-1, NCI-H1299), który zweryfikowano względem poziomu białka BRM uzyskanego po czasie 72 godzin od transfekcji siRNA (Rycina 4-26). Dla wszystkich linii uzyskano porównywalny poziom wyciszenia. Analiza wyniku krótkoterminowego testu żywotności nie pokazała znaczących różnic pomiędzy liniami. Nie uwidoczniono także różnej odpowiedzi komórek mierzonej za pomocą testu długoterminowego (spadek żywotności wszystkich testowanych linii, Rycina 4-8, Rycina 4-25).

Rycina 4-26. Porównanie odpowiedzi linii komórkowych bez obecności białka BRG1 na wyciszenie ekspresji genu SMARCA2. Analizę statystyczną wykonano dla krótkoterminowego testu żywotności porównując żywotność prób w których wyciszono gen SMARCA2. Znormalizowany do białka winkulina poziom białka BRM przedstawiono na wykresie jako % próby traktowanej siRNA kontrolnym (KT). Mock - próba traktowana czynnikiem transfekcyjnym, NT – próba nietraktowana oraz KT - próba traktowana czynnikiem transfekcyjnym i siRNA kontrolnym.

Charakterystyka panelu linii izogenicznych

Stworzony w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej panel izogenicznych linii komórkowych posłuży jako narzędzie pozwalające na charakterystykę nowych inhibitorów białek BRM i BRG1 w układzie komórkowym. W celu wyboru rodzaju testu do oceny

żywotności komórek (krótko- lub długoterminowy) porównano wyniki uzyskane z wykorzystaniem inhibitora referencyjnego i siRNA. Wpływ wyciszenia ekspresji genów SMARCA2 i SMARCA4 po zastosowaniu specyficznych siRNA na żywotność komórek poszczególnych linii komórkowych widoczny był już w teście krótkoterminowym (72 godziny; Rycina 4-25), lecz doświadczenia przeprowadzone z wykorzystaniem związku Novartis pokazały, że jego wpływ na żywotność komórek powinien być analizowany po dłuższym czasie (Rycina 4-27).

Rycina 4-27. Wpływ inhibitora referencyjnego firmy Novartis na żywotność komórek linii izogenicznych. A: Krótkoterminowy test żywotności, 3 dni, CTG. B: Długoterminowy test żywotności, wynik testu z wykorzystaniem fioletu krystalicznego (lewa strona), wynik testu Alamar Blue (prawa strona); n=2.

W celu weryfikacji, czy zaobserwowana różnica wynika z układu eksperymentu przeprowadzono dwa doświadczenia kontrolne. W przypadku doświadczeń z wykorzystaniem siRNA procedura transfekcji przeprowadzana jest aż 72 godziny przed wysianiem komórek na płytkę testową, co wynika z założenia, że poziom białka BRM powinien być na jak najniższym poziomie w momencie rozpoczęcia testu żywotności (Rycina 4-28 A). Taki układ eksperymentu przekłada się jednak na wyciszenie genu SMARCA2 w czasie dłuższym niż w przypadku testu żywotności z wykorzystaniem inhibitora (poziom białka na poziomie 35% już w czasie 24 godzin od transfekcji, Rycina 4-28 B). W eksperymencie kontrolnym komórki na krótkoterminowy test żywotności wysiano po czasie równym 24 godziny od procedury transfekcji (Rycina 4-28 C). Przeprowadzone doświadczenia także pokazały znaczący spadek żywotności komórek HT1080 SM4KO po wyciszeniu genu SMARCA2.

Rycina 4-28. Wybór testu żywotności do oceny specyficzności i selektywności działania nowych inhibitorów. A: Przebieg doświadczeń z wykorzystaniem siRNA oraz inhibitora referencyjnego. B: Poziom wyciszenia genów SMARCA2 i SMARCA4 w poszczególnych punktach czasowych w linii HT1080. C: Przebieg i wynik eksperymentu kontrolnego z wykorzystaniem siRNA, procedura transfekcji została wykonana 24 godziny przed wysianiem komórek na krótkoterminowy test żywotności. D: Przebieg i wynik kontrolnego długoterminowego eksperymentu żywotności z wykorzystaniem inhibitora referencyjnego firmy Novartis, który został przeprowadzony w formacie płytki 96-dołkowej.

W kolejnym eksperymencie kontrolnym sprawdzono, czy otrzymany wynik jest spowodowany różnicami w procedurach krótko- i długoterminowego testu żywotności. W przypadku testu krótkoterminowego komórki traktowane są związkiem 24 godziny po wysianiu do studzienek płytki 96-dołkowej, natomiast w teście długoterminowym traktowanie związkiem następuje w momencie wysiewania komórek (Rycina 4-28 A). Eksperyment porównawczy przeprowadzono z wykorzystaniem inhibitora referencyjnego, który inkubowano z komórkami przez 7 dni zgodnie z procedurą kontrolnego długoterminowego testu żywotności w formacie płytki 96-dołkowej (Rycina 4-28 D). Wartości EC50, jak i parametru Zakres (Rycina 3-5) były zbieżne dla obu testów długoterminowych (Rycina 4-27 B, Rycina 4-28 D). W oparciu o otrzymane dane stwierdzono, że różnica pomiędzy testem krótko- a długoterminowym nie jest zależna od procedury eksperymentów, a wpływ małocząsteczkowego inhibitora referencyjnego na żywotność komórek uwidacznia się w późniejszym czasie.

Na podstawie powyższych analiz zdecydowano się na zastosowanie długoterminowego testu w celu oceny wpływu małocząsteczkowych inhibitorów białka BRM na żywotność komórek. Wykorzystując panel czterech linii izogenicznych przetestowano referencyjny związek firmy Novartis. W analizie wyniku przyjęto założenie, że związek wykazuje różnicowe działanie na poszczególne linie komórkowe, jeśli ich wartości EC50 obliczone na podstawie wyniku Alamar Blue różnią się minimum trzykrotnie.

Rycina 4-29. Wpływ inhibitora referencyjnego firmy Novartis na żywotność komórek panelu linii izogenicznych. Długoterminowy test żywotności, 7 dni, płytki 6-dołkowe, Wynik testu Alamar Blue, uśredniony wynik trzech powtórzeń biologicznych. Dla wszystkich testowanych linii parametr Zakres wynosi 100% (lewa strona). Wizualizacja za pomocą fioletu krystalicznego, wynik reprezentatywny (prawa strona), n=3.

Na podstawie określonych wartości EC50 (0,02 µM – 0,28 µM) oraz parametrów Zakres, równych 100%, stwierdzono, że inhibitor spowodował spadek żywotności komórek wszystkich przetestowanych linii izogenicznych (Rycina 4-29). Dla linii HT1080, HT1080 SM4KO oraz

HT1080 SM4R nie obserwowano znaczącej różnicowej cytotoksyczności. Natomiast wartość EC50 dla linii HT1080 SM2KO była ponad siedmiokrotnie niższa od pozostałych. Podsumowując, związek referencyjny nie wykazuje efektu syntetycznej letalności w liniach, w których białko BRG1 jest nieobecne, co może być związane z jego dualną aktywnością.

Selekcja i charakterystyka panelu linii nowotworowych

Pierwszy etap selekcji linii komórkowych do badania skuteczności i selektywności działania inhibitorów białka BRM bazował na analizach danych bioinformatycznych (Rycina 4-4), literaturowych, wcześniejszych informacjach dotyczących odpowiedzi komórek na wyciszenie genu SMARCA2 (A549, SK-HEP-1, NCI-H1299, NCI-H460, NCI-H1437,

HT1080, Rycina 4-8) oraz komercyjnej dostępności poszczególnych linii komórkowych [35, 68]. W trakcie przeprowadzanych analiz dążono do wyłonienia minimum 8 linii wrażliwych na zahamowanie genu SMARCA2, 8 linii opornych oraz 2 linii kontrolnych (opornych) z równoczesnymi mutacjami typu utrata funkcji w genach SMARCA2 i SMARCA4, przekładającymi się na brak białek BRM i BRG1.

W analizie bioinformatycznej wykorzystano głównie dane dostępne na portalu DepMap, które zostały uzyskane z wykorzystaniem RNAi, gdyż ten typ wyciszenia ekspresji genów ma lepsze przełożenie na wyniki uzyskane podczas inhibicji farmakologicznej. W niewielu przypadkach możliwe i pożądane jest uzyskanie całkowitego i długotrwałego zahamowania celu molekularnego, które następuje w przypadku metody CRISPR. Wyselekcjonowane na podstawie analiz linie płucne oraz przetestowana z wykorzystaniem siRNA linia wątrobowa SK-HEP-1 zostały przedstawione na rycinie poniżej (Rycina 4-30). Do panelu dobrano także linię kontrolną OVK-18 wywodzącą się z nowotworu SCCOHT, w którym współwystępowanie mutacji typu utrata funkcji w genach SMARCA2 i SMARCA4 jest na bardzo wysokim poziomie [152].

Rycina 4-30. Wpływ wyciszenia genu SMARCA2 na proliferację komórek NSCLC (analiza bioinformatyczna – DepMap). A: CRISPR, B: RNAi. Kolorem bordowym zaznaczono linie komórkowe z mutacją w genie SMARCA4 (według cBioPortal i literatury, wrażliwe); Kolorem czarnym zaznaczono linie komórkowe z dziką formą genu SMARCA4 (oporne); Kolorem szarym zaznaczono linie komórkowe z mutacją w genach SMARCA4 i SMARCA2 (oporne). Na portalu DepMap nie zostały uwzględnione dane DEMETER2 dotyczące linii OVK-18.

W celu weryfikacji danych literaturowych i bioinformatycznych, dotyczących występowania mutacji typu utrata funkcji w genach SMARCA2 i SMARCA4, w lizatach uzyskanych z wyselekcjonowanych linii komórkowych sprawdzono poziomy białek BRM i BRG1 (Rycina 4-31 A). We wszystkich liniach wrażliwych, z wyjątkiem NCI-H2126 oraz opornych liniach kontrolnych (A427 i OVK-18) nie wykryto obecności białka BRG1 lub wykryty prążek o bardzo niskiej intensywności został uwidoczniony na innej wysokości niż prążki widoczne dla linii opornych. Otrzymany wynik był zgodny z oczekiwaniami, gdyż linia NCI-H2126 posiada mutacje typu zmiany sensu obejmującą silnie konserwatywny aminokwas wchodzący w skład domeny ATPazowej (W764R), która prowadzi do powstania niefunkcjonalnego białka BRG1, lecz nie powoduje braku jego obecności. We wszystkich pozostałych liniach opornych wchodzących w skład panelu wykryto obecność białka BRG1. Obecność białka BRM została pokazana we wszystkich liniach wchodzących w skład panelu, z wykluczeniem linii kontrolnych (A427 i OVK-18). Brak BRM i BRG1 we wspomnianych kontrolnych liniach opornych był zgodny z oczekiwaniami, gdyż komórki te zostały dobrane do panelu w celu wykluczenia związków niespecyficznych.

Rycina 4-31. Charakterystyka panelu linii komórkowych. A: Analiza Western Blot pokazująca poziomy białek BRM i BRG1 w liniach komórkowych wybranych do panelu linii nowotworowych. B: Zoptymalizowane w długoterminowym teście żywotności gęstości komórek. Kolorem bordowym, czarnym i szarym zaznaczono odpowiednio wrażliwe, oporne i oporne ze względu na brak obecności zarówno białka BRM jak i BRG1 linie komórkowe. C: Reprezentatywny wynik optymalizacji gęstości komórek w długoterminowym teście żywotności. Płytki 6-dołkowe. Bordową ramką zaznaczono liczbę komórek wybraną do przeprowadzenia eksperymentów, ramka znajdująca się pomiędzy dołkami oznacza wartość średnią z sąsiadujących dołków.

W kolejnym kroku zoptymalizowano gęstości wysiewania wszystkich linii komórkowych wchodzących w skład panelu w celu przeprowadzenia długoterminowego testu żywotności (Rycina 4-31 B). Liczbę komórek dobierano w taki sposób, by ich finalna konfluencja w momencie odczytu żywotności oscylowała wokół 80% (Rycina 4-31 C). Oczekiwano, że dla potencjalnych inhibitorów białka BRM wartości EC50 linii wrażliwych i opornych będą się od siebie różnić, a średnia wartość EC50 dla linii komórkowych wrażliwych będzie minimum trzykrotnie niższa niż dla linii opornych. W analizie wyniku dla linii, których wartości EC50 były powyżej testowanego zakresu przyjmowano maksymalne testowane stężenie.

Inhibitor referencyjny firmy Novartis wykazał aktywność komórkową zarówno w liniach wrażliwych jak i opornych (Rycina 4-32 A, B, C). Parametr zakres dla związków aktywnych, z wyznaczoną wartością EC50, był większy od 60%. Wartości EC50 wyznaczone zarówno dla komórek wrażliwych, jak i opornych mieściły się w bardzo szerokim przedziale: od 0,024 µM dla linii NCI-H1693 do >10 µM dla linii NCI-H2126. Porównanie przebiegu krzywych w długoterminowym teście żywotności nie pokazało tendencji do pogrupowania linii

względem przynależności do grupy wrażliwej i opornej (Rycina 4-32 C), lecz analiza porównująca wartości EC50 uwidoczniła różnicowość pomiędzy grupami. Ponadto średnia wartość EC50 dla linii wrażliwych była ponad trzykrotnie niższa niż dla linii opornych (Rycina 4-32 D).

Rycina 4-32. Wpływ referencyjnego związku firmy Novartis na żywotność komórek, wchodzących w skład panelu nowotworowych linii komórkowych (długoterminowy test żywotności, 8 dni). A, B: wizualizacja za pomocą fioletu krystalicznego, wynik reprezentatywny, wartości EC50 i parametru Zakres zostały obliczone w oparciu o wyniki testu Alamar Blue. C: wynik testu Alamar Blue, uśredniony wynik dwóch powtórzeń biologicznych, Na wykresie przedstawiono krzywe estymacji nieliniowej opisanej równaniem krzywej czteroparametrycznej. Kolorem bordowym, czarnym i szarym zaznaczono odpowiednio wrażliwe, oporne i oporne ze względu na brak obecności zarówno białka BRM jak i BRG1 linie komórkowe. D: Analiza porównawcza zlogarytmowanych wartości EC50 pomiędzy grupą linii wrażliwych i opornych (lewa strona). Porównanie średniej wartości EC50 dla linii wrażliwych i opornych (prawa strona), na wykresie uwzględniono odchylenie standardowe (SD). Przerywaną linią zaznaczono trzykrotność średniej wartości EC50 dla linii wrażliwych, która wyniosła 1,24 µM.

Ważnym aspektem nowoodkrytych leków jest wpływ na komórki niezmienione nowotworowo, co przekłada się na ich potencjalną toksyczność. Analiza wpływu referencyjnego inhibitora firmy Novartis na żywotność ludzkich fibroblastów (linia komórkowa Wi-38, Rycina 4-33) pokazała znaczące obniżenie żywotności komórek (EC50 = 0.24 µM, Zakres=88,7%). Wynik testu jest przesłanką sugerującą potencjalną toksyczność związku. Przyjmuje się, że dziesięciokrotna różnica w wartości EC50 pomiędzy komórkami docelowymi (nowotworowymi), a pozostałymi komórkami organizmu powinna być wystarczająca do uzyskania okna terapeutycznego (odpowiedni dobór dawkowania). W przypadku związku referencyjnego Novartis wartość EC50 dla ludzkich fibroblastów była niższa niż średnia wartość EC50 dla linii komórkowych wrażliwych wchodzących w skład panelu linii komórkowych.

Rycina 4-33. Wpływ referencyjnego związku firmy Novartis na żywotność komórek nienowotworowych (ludzkie fibroblasty – Wi-38) Długoterminowy test żywotności, 7 dni, wynik testu Alamar Blue (lewa strona ryciny), wizualizacja za pomocą fioletu krystalicznego (prawa strona ryciny), n=1.

Biomarkery odpowiedzi komórkowej na zahamowanie białka BRM.

Analizy RNAseq

Przeprowadzenie eksperymentów wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA miało na celu wybór panelu genów (biomarkerów), których ekspresja zmienia się pod wpływem wyciszenia genu SMARCA2 lub farmakologicznej inhibicji białka BRM. Pierwsze eksperymenty wykonano na materiale uzyskanym metodami inżynierii genetycznej (transfekcja siRNA). Grupa badana obejmowała 4 próby potraktowane czteroma różnymi siRNA. Procedurę RNAseq przeprowadzono z wykorzystaniem dwóch linii komórkowych z niefunkcjonalnym białkiem BRG1 (A549 i HT1080 SM4KO) oraz jednej linii z prawidłową jego wersją (HT1080), którą wykorzystano w celu określenia specyficzności wyselekcjonowanych biomarkerów. Poziom białka BRM po wyciszeniu genu SMARCA2 sprawdzono metodą Western Blot (Rycina 4-34 A). Dla wszystkich testowanych linii pokazano ponad 85% poziom wyciszenia względem prób traktowanych siRNA kontrolnym (CT).

Kolejno sprawdzono rozkład prób na wykresach przedstawiających wynik analizy głównych składowych. Dla linii A549 nie pokazano różnicowości pomiędzy poszczególnymi siRNA (S205, S206, S207, S208), natomiast dla komórek HT1080 i HT1080 SM4KO konieczne było odrzucenie z analizy prób odstających, transfekowanych siRNA S206 (Rycina 4-34 B, C). Linie komórkowe A549 i HT1080 SM4KO pokazały różnicowość pomiędzy grupą kontrolną i badaną. Nie zaobserwowano rozbieżności pomiędzy poszczególnymi próbami w obrębie danej grupy. Ponadto dla tych linii komórkowych określono wysoką liczbę genów, których poziom ekspresji uległ zmianie po wyciszeniu SMARCA2 (A549 - 1892 i HT1080 SM4KO - 1580, Rycina 4-34 B, C). Próba badana i kontrolna linii HT1080 nie różniły się od siebie w znaczący sposób, a ilość genów o różnicowej ekspresji (DEG) wyniosła 35 (Rycina 4-34 D). W procesie selekcji genów biomarkerowych wybierano te, których ekspresja ulegała

zmianie w liniach komórkowych z niefunkcjonalnym białkiem BRG1, natomiast nie zmieniała się lub zmiana zachodziła w kierunku odwrotnym w liniach z dziką jego formą.

Rycina 4-34. Wynik sekwencjonowania RNA po wyciszeniu genu SMARCA2. A: Analiza Western Blot sprawdzająca poziom białka BRM po wyciszeniu genu SMARCA2 czterema różnymi siRNA. B, C, D: Wynik analizy głównych składowych oraz różnicowej ekspresji genów wykonanej dla linii komórkowych A549, HT1080 SM4KO i HT1080. E: Wykres reprezentujący liczbę genów o różnicowej ekspresji dla poszczególnych linii komórkowych oraz geny wspólne. Bordowym tłem zaznaczono pole, w którym znajdują się potencjalne geny biomarkerowe.

W wyniku analizy RNAseq określono 469 potencjalnych genów biomarkerowych (Rycina 4-34 E, bordowe tło), które poddano bardziej wnikliwej analizie. W wyborze genów kierowano się nie tylko istotnością statystyczną zaobserwowanych zmian (parametr p), lecz również krotnością zmiany. Kryterium selekcji stanowiła minimum dwukrotna różnica w poziomie ekspresji genów (krotność zmiany - log2RQ ≥ lub ≤1). Selekcję genów przeprowadzono niezależnie dla linii A549 (biomarkery oznaczone bordową gwiazdką) oraz pary linii izogenicznych (czarna gwiazdka, Tabela 4-2, kolumna: Nazwa genu). Analiza wyniku dla linii izogenicznych obejmowała wybór genów, które wykazały różnicową ekspresję po wyciszeniu genu SMARCA2 w linii HT1080 SM4KO oraz odrzucenie tych genów, dla których pokazano DGE dla linii HT1080. Ze względu na wysoką innowacyjność otrzymanych danych oraz ich wysoki potencjał wdrożeniowy nazwy genów zostały utajnione, a w pracy doktorskiej występują pod nazwą Biomarker z określonym kolejnym porządkowym.

Tabela 4-2. Wynik wysokoprzepustowego sekwencjonowania RNA oraz PCR w czasie rzeczywistym. Kolorem szarym (słupki) zaznaczono zmiany związane ze spadkiem ekspresji badanych genów. Kolor bordowy (słupki) reprezentuje geny o podwyższonej ekspresji. Bordowymi i czarnymi gwiazdkami zaznaczono geny wybrane na podstawie wyniku RNAseq odpowiednio dla linii A549 oraz linii izogenicznych (różnicowe dla HT1080 SM4KO i HT1080). Krotność zmiany wyznaczona na podstawie RNAseq jest przedstawiona za pomocą parametru log2fold, a krotność zmiany w przypadku qPCR reprezentuje parametr log2RQ. W kolumnie Analiza wyniku zaprezentowano za pomocą strzałek zmiany zachodzące w poziomach poszczególnych biomarkerów. Strzałki w górę i w dół reprezentują odpowiednio wartości krotności zmiany ≥ i ≤ od 1, które są równoznaczne z większą niż dwukrotna zmianą poziomu ekspresji genów. Strzałka skośna skierowana w górę oznacza brak zmian lub wzrost, a strzałka skośna skierowana w dół oznacza brak zmian lub spadek różnicowej ekspresji genów (pole Oczekiwany wynik). W kolumnie Panel genów pokazano wybrane na podstawie analizy biomarkery.

119

Zmiany w poziomach wyselekcjonowanych genów po wyciszeniu ekspresji SMARCA2 zweryfikowano za pomocą metody qPCR. Dla większości genów potwierdzono otrzymany w RNAseq wynik (Tabela 4-2, porównanie kolumny RNAseq i qPCR dla poszczególnych linii komórkowych). Listę potencjalnych biomarkerów podzielono na dwie grupy obejmujące geny, których ekspresja spada (kolor szary, geny o ograniczonej ekspresji) lub wzrasta (kolor bordowy, geny aktywowane) po wyciszeniu ekspresji SMARCA2. Z grupy genów aktywowanych wybrano cztery, których poziom wzrastał w liniach A549 i HT1080 SM4KO oraz pozostawał bez zmian, spadał lub był na bardzo niskim poziomie w linii HT1080. Z grupy genów o ograniczonej ekspresji wybrano pięć, których poziom spadał w liniach A549 i HT1080 SM4KO oraz pozostawał bez zmian lub wzrastał w linii HT1080 (Tabela 4-2, Okienko Oczekiwany wynik, Kolumny Analiza wyniku i Panel genów). Niektóre geny, takie jak m.in. Biomarker 2, nie zostały wyselekcjonowane ze względu na niski poziom ekspresji w liniach A549 lub HT1080 SM4KO. Dopuszcza się jednak, że np. białka przez nie kodowane mogą pełnić funkcję biomarkerów mierzonych za pomocą innych niż qPCR metod.

Kolejnym kluczowym krokiem prowadzącym do wyboru biomarkerów, które mają służyć testowaniu nowoodkrytych związków było sprawdzenie czy zmiany następujące na skutek wyciszenia białka docelowego za pomocą siRNA zachodzą także w wyniku inhibicji farmakologicznej. W przypadku wykorzystania siRNA białko docelowe nie jest fizycznie obecne w komórce, natomiast podczas inhibicji farmakologicznej (z wykorzystaniem związków małocząsteczkowych) obecność białka docelowego w większości przypadków nie jest zaburzona. W celu określenia genów, których ekspresja ulega zmianie pod wpływem farmakologicznej inhibicji białka BRM wykorzystano referencyjny związek firmy Novartis oraz linię komórkową HT1080 SM4KO. W oparciu o informacje opublikowane oraz dane wewnętrzne firmy Ryvu Therapeutics brano pod uwagę, że związek Novartis jest dualnym inhibitorem białek BRM i BRG1. Aktywność związku skierowana wobec białka BRG1 nie była jednak problematyczna, gdyż w linii HT1080 SM4KO pokazano brak obecności tego białka. Różnicową ekspresję genów za pomocą metody RNAseq sprawdzono po czasie równym 4 i 24 godziny od potraktowania komórek związkiem Novartis. Zaobserwowano znaczący wzrost liczby DEG w czasie (wzrost ze 197 genów po 4h do 1949 genów po 24h). Analiza głównych składowych także wykazała wzrost różnicowości pomiędzy grupą badaną (Novartis) i kontrolną (nośnik, 0,1% DMSO) w czasie (Rycina 4-35). Liczba DGE wspólnych dla obu czasów wyniosła 153 (Rycina 4-36 A).

Rycina 4-35. Wynik analizy głównych składowych oraz różnicowej ekspresji genów wykonanej dla linii HT1080 SM4KO potraktowanej związkiem referencyjnym firmy Novartis w stężeniu 0,1 µM (RNAseq) przez 4 (A) lub 24 godziny (B).

Rycina 4-36. Porównanie wyników po traktowaniu komórek siRNA lub związkiem Novartis (HT1080 SM4KO). A: Liczba DGE wspólnych i unikalnych dla czasu inkubacji ze związkiem Novartis równym 4 lub 24 godziny. B: Liczba DGE wspólnych i unikalnych dla siRNA specyficznego wobec genu SMARCA2 i związku Novartis. C: Western Blot pokazujący poziom białek BRM i BRG1 po traktowaniu związkiem referencyjnym. D: Wykres obrazujący krotność zmiany dla poszczególnych genów po wyciszeniu SMARCA2 lub po traktowaniu komórek związkiem Novartis w dwóch czasach (4h i 24h).

* - geny wchodzące w skład wyselekcjonowanego panelu genów, ** - geny wybrane w celu przetestowania na panelu 7 linii komórkowych.

Wyniki uzyskane z wykorzystaniem związku referencyjnego porównano z danymi RNAseq po zastosowaniu metod inżynierii genetycznej (siRNA). Zaobserwowano 668 DEG wspólnych (Rycina 4-36 B), które nie były wynikiem spadku poziomu białka BRM po traktowaniu inhibitorem (Rycina 4-36 C). Analiza RNAseq, wyłoniła także pulę 1278 genów, których ekspresja uległa zmianie po 24-godzinnym traktowaniu związkiem Novartis, lecz nie zmieniła się w wyniku wyciszenia ekspresji genu SMARCA2. Otrzymany wynik może być przesłanką o braku całkowitej specyficzności inhibitora Novartis wobec białek BRM i BRG1 lub wynikać z faktu, że ekspresja tylko części genów ulega zmianie zarówno po zahamowaniu aktywności białka (Novartis) oraz wyciszeniu BRM przez siRNA. Pomimo braku całkowitej pewności o selektywności związku Novartis zdecydowano się na jego wykorzystanie w kolejnych etapach badań prowadzących do selekcji biomarkerów. W analizie skupiono się jednak na wyborze tych markerów, których poziom ulegał zmianie zarówno w wyniku traktowania związkiem jak i po transfekcji siRNA.

Kolejno sprawdzono, czy krotność zmian dla genów wybranych na podstawie RNAseq z wykorzystaniem siRNA (Tabela 4-2, pełna lista genów, kolumna: Nazwa genu) jest zbieżna dla dwóch czasów traktowania związkiem i siRNA (Rycina 4-36 D). W porównaniu nie uwzględniono Biomarkerów 3, 4 i 7, gdyż analiza wyniku RNAseq po traktowaniu związkiem Novartis nie umożliwiła określenia dla nich krotności zmiany. Przeprowadzona analiza pokazała wzrost krotności zmian w czasie (po traktowaniu związkiem) dla większości genów (Rycina 4-36 D). Dwa potencjalne biomarkery (Biomarker 19 oraz 2) pokazały natomiast większą DGE dla czasu 4h, co może świadczyć, że są one markerami wczesnej odpowiedzi komórek na traktowanie związkiem. Dla wszystkich testowanych genów efekt uzyskany za pomocą siRNA był większy, co najprawdopodobniej spowodowane jest krótszym, niż obecność wyciszenia genu SMARCA2, czasem traktowania związkiem Novartis (Rycina 4-36 D).

W oparciu o otrzymane wyniki stwierdzono, że pierwsze eksperymenty potwierdzające wynik RNAseq metodą qPCR powinny zostać wykonane po 24h inkubacji komórek ze związkiem Novartis (linia HT1080 SM4KO). W analizie uwzględniono wszystkie geny wybrane na podstawie danych wygenerowanych z wykorzystaniem siRNA, które zostały przedstawione w tabeli powyżej (Tabela 4-2, kolumna Panel genów). Dla wszystkich wyselekcjonowanych genów, z wyjątkiem Biomarkera 4, zmiany zaobserwowane po wyciszeniu SMARCA2 zostały także potwierdzone za pomocą metody RNAseq z wykorzystaniem inhibitora Novartis (Rycina 4-36 D). Pomimo braku danych RNAseq dotyczących zmian w poziomie Biomarkera 4 po traktowaniu związkiem referencyjnym

zdecydowano się uwzględnić go w dalszej analizie, ponieważ zmiany w jego ekspresji po zastosowaniu siRNA były znaczące.

Dla linii HT1080 SM4KO potwierdzono zależny od dawki wzrost ekspresji 4 wchodzących w skład panelu genów aktywowanych (Biomarker 16, 19, 21, 22). Zmiana ekspresji spowodowana 24-godzinnym traktowaniem 10 µM związkiem Novartis była na różnym poziomie pomiędzy badanymi genami. Najbardziej aktywowanym genem okazał się Biomarker 22, natomiast najmniejszy wzrost ekspresji pokazano dla Biomarkera 16. Analiza potwierdziła także zależny od dawki spadek ekspresji 5 genów o ograniczonej ekspresji (KRT80, Biomarker 4, 10, 11, 12, Rycina 4-37). Największy spadek zaobserwowano dla Biomarkera 11, natomiast najmniejszą zmianę wykryto w przypadku Biomarkera 4.

Rycina 4-37. Zmiany w poziomach ekspresji genów po traktowaniu związkiem Novartis (24h, qPCR). Geny aktywowane: Biomarker 16, 19, 21, 22. Geny o ograniczonej ekspresji: KRT80, Biomarker 4, 10, 11, 12. Analiza PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki zostały znormalizowane do kontroli DMSO dla danej linii komórkowej (RQ, Równanie 3-1) n=2.

W doświadczeniu uwzględniono także linię HT1080, w której analiza qPCR wykazała mniejsze niż dla linii HT1080 SM4KO, zmiany poziomów mRNA większości (oprócz

Biomarkera 16 i 19) badanych genów po traktowaniu związkiem. W przypadku Biomarkera 16 i 19 zaobserwowano większy wzrost ekspresji w linii HT1080 niż w HT1080 SM4KO, co może wynikać z niskiego poziomu genów w próbie kontrolnej (DMSO).

Kolejno dla trzech wybranych genów (Biomarker 16, 19 i KRT80) sprawdzono, czy zmiany wywołane 1 µM związkiem referencyjnym zachodzą także w innych liniach komórkowych. W pierwszym kroku porównano wyjściowe poziomy genów pomiędzy liniami (Rycina 4-38 A). Profil ekspresji badanych genów był bardzo zróżnicowany. Nie zauważono jednak zależności poziomów mRNA od obecności białka BRG1 (linie wrażliwe i oporne). Jedynie w linii kontrolnej OVK-18 (bez obecności BRM i BRG1) poziom KRT80 był znacznie niższy (poniżej poziomu detekcji), a poziom Biomarkerów 16 i 19 był znacznie wyższy niż w innych liniach komórkowych (z wyjątkiem NCI-H460, Biomarker 19).

Dla wszystkich testowanych linii (z wyjątkiem OVK-18) pokazano zależny od czasu spadek ekspresji KRT80, wzrost ekspresji Biomarkera 16 oraz zmienny w czasie wzrost poziomu Biomarkera 19 pod wpływem badanego związku (Rycina 4-38 B-D). Wyjątkiem była także linia SK-HEP-1, w której nie zaobserwowano spadku ekspresji genu KRT80 w czasie. Tak jak w przypadku linii HT1080 SM4KO i HT1080 zmiany zaobserwowane dla linii opornych, były zbieżne ze zmianami w poziomach potencjalnych biomarkerów mierzonych w liniach wrażliwych. W dalszych etapach w głównej mierze skupiono się na genach o ograniczonej ekspresji ze względu na brak pewnej informacji jaki maksymalny wzrost ekspresji genów aktywowanych może zostać wyindukowany testowanymi związkami oraz fakt, że w niektórych komórkach wyjściowy poziom danego biomarkera może być na niskim poziomie.

Rycina 4-38. Zmiany w poziomach ekspresji genów po traktowaniu związkiem Novartis (1 µM, qPCR). Kolorami z palety barw czerwonych oznaczono linie komórkowe wrażliwe na zahamowanie ekspresji genu SMARCA2, natomiast kolory odcieni szarości reprezentują linie oporne. Analiza PCR w czasie rzeczywistym. Wyniki zostały znormalizowane do kontroli DMSO dla danej linii komórkowej w danym czasie. PD – poniżej detekcji, n=2.

Analizy ChIPseq

W celu określenia lokalizacji białek BRM i BRG1 w obrębie całego genomu przeprowadzono analizę ChIPseq, która została wykonana z użyciem przeciwciał specyficznych wobec białek BRM i BRG1 oraz linii komórkowych HT1080 i HT1080 SM4KO. Obecność białka BRM w próbkach uzyskanych z linii komórkowej HT1080 wykryto w obrębie 504 genów, które w 93% pokrywały się z sekwencjami oznaczonymi dla prób z linii HT1080 SM4KO (Rycina 4-39 A, B). Pula genów, z którymi oddziałuje białko BRM w linii HT1080 SM4KO była jednak znacznie większa i liczyła aż 8961 genów, z których większość pokrywała się z sekwencjami kodującymi oddziałującymi z białkiem BRG1 w linii HT1080 (Rycina 4-39 C). Na podstawie przeprowadzonej analizy wyciągnięto wniosek, że w linii HT1080 za kontrolę ekspresji genów odpowiada w głównej mierze białko BRG1, którego funkcję przejmuje białko BRM w linii HT1080 SM4KO.

Rycina 4-39. Wynik analizy ChIPseq. A: Liczba odczytów dla poszczególnych prób oraz finalna liczba oznaczonych genów. B: Liczba genów wspólnych i unikalnych dla linii HT1080 SM4KO i HT1080, w obrębie których pokazano obecność białka BRM. C: Rozkład pików ChIPseq w obrębie poszczególnych typów genów.

Rycina 4-40. Wykresy pozytywnych pików z analizy Macs2 oraz pików istotnych statystycznie dla genów wybranych na podstawie analizy RNAseq. Gwiazdką oznaczono geny wchodzące w skład panelu genów (Tabela 4-2, kolumna Panel genów) stworzonego w oparciu o wyniki analiz RNAseq.

127

Analiza wykresów dla wszystkich czterech testowanych prób, pokazująca pozytywne piki z analizy Macs2 oraz piki istotne statystycznie pozwoliła na wybór finalnej listy Biomarkerów. Pod uwagę brano 21 genów wyselekcjonowanych na podstawie pierwszych analiz RNAseq. W głównej mierze skupiono się na genach o ograniczonej ekspresji ze względu na brak pewnej informacji jaki maksymalny wzrost ekspresji genów aktywowanych może zostać wyindukowany testowanymi związkami (brak górnego plateau). Dla prawie wszystkich potencjalnych biomarkerów o ograniczonej ekspresji (z wyjątkiem Biomarkera10), które zostały uwzględnione w panelu genów (Rycina 4-40, oznaczone gwiazdką, Tabela 4-2, kolumna Panel genów) pokazano istotne statystycznie piki pochodzące od białek BRM w linii HT1080 SM4KO i BRG1 w linii HT1080. Ponadto analiza uwidoczniła obecność badanych białek w obrębie sekwencji Biomarkerów 2 i 6 (Rycina 4-40). Sprawdzono, czy testowanie zmian w poziomach tych biomarkerów mogłoby być wykonane na poziomie białka. Do przeprowadzenia testów wybrano Biomarker 2 ze względu na dostępny komercyjnie wysokoprzepustowy zestaw do badania poziomu tego białka z wykorzystaniem metody AlphaLISA, który umożliwiłby testowanie nowych inhibitorów na większą skalę. Przeprowadzone doświadczenia pokazały zależny od dawki inhibitora referencyjnego spadek stężenia Biomarkera 2 w kondycjonowanym medium komórkowym zebranym znad komórek A549 i HT1080 SM4KO, który nie był wynikiem spadku żywotności komórek (Rycina 4-41).

Rycina 4-41. Wpływ związku referencyjnego Novartis na poziom Biomarkera 2 oraz żywotność komórek. Wpływ związku referencyjnego firmy Novartis na poziom Biomarkera 2 w kondycjonowanym medium komórkowym zebranym znad komórek A549 lub HT1080 SM4KO (lewa strona). Żywotność komórek A549 i HT1080 SM4KO po traktowaniu związkiem referencyjnym. Krzywe zależności stężenia Biomarkera 2 od stężenia związku wykonane w celu określenia parametrów IC50 i Zakres (prawa strona), n=2.

Biomarkery odpowiedzi komórek na zahamowanie celu molekularnego nie są wykorzystywane jedynie w procesie rozwoju nowych inhibitorów, lecz stanowią także narzędzie pozwalające określić odpowiedź zwierzęcia (badania in vivo) lub pacjenta (badania kliniczne) na terapię. Najdogodniejsze byłoby testowanie zmian w sposób przyżyciowy, poprzez pobranie krwi i oznaczenie poziomów biomarkerów przed i w trakcie terapii.

Ze względu na fakt, że Biomarker 2 jest wydzielany z komórek do medium/przestrzeni międzykomórkowej brano pod uwagę, że zmiany w jego stężeniu mogłyby być oznaczone za pomocą metody AlphaLISA w próbkach osocza pobranych od zwierząt z utworzonymi ksenoprzeszczepami (Rozdział 4.2.8.1).

W tabeli poniżej (Tabela 4-3) zestawiono wyselekcjonowane biomarkery oraz metody ich detekcji. Do pierwszych badań in vivo wybrano gen KRT80 oraz Biomarker 2, dla których w eksperymentach in vitro pokazano najwyższy poziom w linii A549 (Rycina 4-41, Rycina 4-38 A).

Tabela 4-3. Wybrane biomarkery odpowiedzi komórek z mutacją typu utrata funkcji w genie SMARCA4 na farmakologiczne zahamowanie aktywności ATPazowej/helikazowej białka BRM. W tabeli uwzględniono metodę detekcji zmian poziomu biomarkerów po traktowaniu związkami. Gwiazdką zaznaczono biomarkery wyselekcjonowane do testów in vivo.

Badania in vivo

Celem badań in vivo przeprowadzonych w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej był wybór modelu badawczego, który umożliwi testowanie, spowodowanych działaniem inhibitorów BRM, zmian w poziomach biomarkerów farmakodynamicznych (PD). Ponadto wybrany model może posłużyć do badań wpływu związków na wzrost guza.

Wybór linii komórkowej do badań farmakodynamicznych

Pierwsze eksperymenty zostały wykonane z wykorzystaniem pary linii izogenicznych (HT1080 i HT1080 SM4KO), gdyż użycie obu linii komórkowych do badań dałoby możliwość oceny zarówno efektywności jak i selektywności działania związku w układzie in vivo. W pierwszym etapie do myszy szczepu NOD/SCID wszczepiono 5 mln komórek linii HT1080 lub HT1080 SM4KO. Po 21 dniach obserwowano istotny statystycznie większy przyrost objętości guza wywodzącego się z komórek HT1080 SM4KO (Rycina 4-42 A). Linia HT1080 SM4KO wykazała także wysoką inwazyjność w tym szczepie myszy objawiającą się spadkiem masy ciała, który oscylował wokół 5% przez cały czas trwania eksperymentu (Rycina 4-42 B) oraz wysoką śmiertelnością zwierząt (38%). Ponadto pobrane do badań guzy były luźne w konsystencji i ukrwione, zauważono także obecność żółtego płynu między skórą a otrzewną (obserwacja myszy podczas pobierania materiału do dalszych analiz). Dla jednego osobnika zanotowano przerzuty komórek nowotworowych do żołądka. Wszczepienie komórek linii HT1080 nie wpłynęło na śmiertelność zwierząt, lecz spowodowało większy niż w przypadku

komórek HT1080 SM4KO spadek masy ciała, który pod koniec trwania eksperymentu przekroczył 10% (Rycina 4-42 B).

W kolejnym etapie podjęto próbę zmniejszenia inwazyjności ksenoprzeszczepu. W tym celu zmieniono szczep myszy na BALB/c, w których według doniesień literaturowych kancerogeneza powinna zachodzić w wolniejszym tempie [153], co związane jest z mniejszym stopniem upośledzenia funkcji układu odpornościowego. Ponadto pięciokrotnie zmniejszono liczbę komórek wszczepionych do zwierząt. Zastosowane zmiany nie wpłynęły na szybkość wzrostu guza utworzonego z komórek HT1080 SM4KO. Co ciekawe, wzrost komórek linii HT1080 w szczepie myszy BALB/c przebiegał znacznie szybciej niż w myszach NOD/SCID (Rycina 4-42 A, C).

Rycina 4-42 Wzrost ksenoprzeszczepu (linie izogeniczne). A, C: Wykres obrazujący średnią objętość guza w danej grupie w kolejnych dniach eksperymentu. Dane przedstawione w sekcji A mają rozkład normalny (test Shapiro-Wilk). B, D: Wykres obrazujący średnią masę ciała zwierząt w danej grupie w kolejnych dniach eksperymentu. Dzień 0 – moment wszczepienia komórek nowotworowych do myszy. Słupki błędów przedstawione na wykresach reprezentują wartości SEM. OG - objętość guza (Równanie 3-9).

Dla szczepu BALB/c nude nie pokazano znaczącej różnicy w szybkości wzrostu guzów utworzonych z linii izogenicznych (Rycina 4-42 C). Zmierzony dla szczepu BALB/c nude spadek masy w 14 dniu od wszczepienia komórek nowotworowych wyniósł 4,1% (HT1080) i 4,8% (HT1080 SM4KO) oraz powiększał się wraz ze wzrostem guzów i przekroczył 10% w obu grupach w dniu 21. W grupie zwierząt zaszczepionych linią HT1080 śmiertelność

wyniosła 30%, w dniu 24 jeden osobnik został poddany eutanazji ze względu na znaczną objętość guza (>2000 mm3). Ponadto w dniu 26 uśmiercono dwie myszy ze względu na niską masę ciała (-23,6%) i ranę w miejscu guza oraz duże rozmiary guza (>2000 mm3). W drugiej grupie zwierząt (HT1080 SM4KO) 4 osobniki (40%) zostały poddane eutanazji w dniach 21 (3 myszy) i 24 (1 mysz) ze względu na niską masę ciała (od -11,4% do -20,1%), ranę podskórną oraz słabą kondycję zdrowotną.

Ze względu na wysoką inwazyjność linii komórkowych HT1080 i HT1080 SM4KO w obu testowanych szczepach myszy, nie mogą zostać one wykorzystane w modelu ksenoprzeszczepu do badania inhibitorów białka BRM. Biorąc pod uwagę wczesny etap projektu, niskie prawdopodobieństwo znalezienia odpowiedniego szczepu myszy oraz relatywnie wysokie koszty badań in vivo nie zdecydowano się na kontynuację tych eksperymentów z wykorzystaniem linii HT1080 i HT1080 SM4KO.

W kolejnym eksperymencie sprawdzono wzrost ksenoprzeszczepów utworzonych z linii komórkowych A549 (6 mln komórek/mysz), NCI-H2030 i NCI-H1944 (5 mln komórek/mysz) w dwóch szczepach myszy Athymic nude oraz SCID/beige. Szczepy myszy zostały wybrane na podstawie wcześniejszych doświadczeń (dane wewnętrzne firmy Ryvu Therapeutics). W żadnym z warunków eksperymentalnych nie zaobserwowano śmiertelności myszy. Spadek masy zwierząt odnotowano jedynie w dniu 8 dla pojedynczych osobników wchodzących w skład grup: A549 Athymic nude (najniższa wartość -5,8%), A549 SCID/beige (najniższa wartość -6,45%), NCI-H1944 SCID/beige (najniższa wartość -7,65%) (Rycina 4-43 A). Najszybszy wzrost guza obserwowano dla ksenoprzeszczepu linii NCI-H1944 w myszach szczepu Athymic nude, lecz ta sama linia komórkowa charakteryzowała się jedynie znikomym wzrostem objętości guza w czasie w szczepie SCID/beige (Rycina 4-43 B). Linia komórkowa NCI-H2030 pokazała znikomy wzrost zarówno w myszach szczepu SCID/beige, jak i Athymic nude. Ostatnia z testowanych linii komórkowych A549 wykazała zrównoważony wzrost w obu testowanych szczepach myszy. W dniu 20 objętość guza osiągnęła 120 mm3 w myszach Athymic nude i 70 mm3 w osobnikach szczepu SCID/beige.

Rycina 4-43 Porównanie wzrostu ksenoprzeszczepów w różnych szczepach myszy (A549, NCI-H2030, NCI-H1944). A: Wykres obrazujący średnią masę ciała zwierząt w danej grupie w kolejnych dniach eksperymentu. B: Wykres obrazujący średnią objętość guza w danej grupie w kolejnych dniach eksperymentu. Dzień 0 – moment wszczepienia komórek nowotworowych do myszy szczepu Athymic nude i SCID/beige. Przedstawiona za pomocą kolorowych gwiazdek analiza statystyczna reprezentuje różnice pomiędzy poszczególnymi szczepami myszy dla danej linii komórkowej. Słupki błędów przedstawione na wykresach reprezentują wartości SEM, OG - objętość guza.

Linia A549 została wybrana do dalszych badań ze względu na brak toksyczności oraz zrównoważony wzrost w obu testowanych szczepach myszy. Brano bowiem pod uwagę, że do oznaczeń zmian w poziomach biomarkerów konieczne będzie poszerzenie panelu testowanych szczepów zwierząt. Najwyższe prawdopodobieństwo powodzenia wiązało się z wyborem linii komórkowej A549.

W próbkach osocza pobranych od zwierząt z ksenoprzeszczepami linii A549, HT1080 i HT1080 SM4KO oznaczono stężenie Biomarkera 2 za pomocą metody AlphaLISA. Przeprowadzona analiza pokazała, że poziom Biomarkera 2 w osoczu jest poniżej poziomu detekcji. Pokazano natomiast, że stężenie Biomarkera 2 może zostać zmierzone w próbkach guza. Najwyższe stężenie oznaczono w ksenoprzeszczepie utworzonym z linii komórkowej A549 (Rycina 4-44), co było spójne z wynikami badań in vitro (Rycina 4-41).

Rycina 4-44 Stężenie Biomarkera 2 w guzach utworzonych z komórek HT1080, HT1080 SM4KO oraz A549.

Badania farmakokinetyczne i farmakodynamiczne

Do przeprowadzenia badań PK/PD dla związku referencyjnego firmy Novartis wybrano doustną drogę podania (doniesienia literaturowe [84]). Eksperyment pokazał relatywnie krótki czas półtrwania związku w osoczu równy 3 godziny i 8 minut. Maksymalne stężenie związku osiągnięte w czasie Tmax (30 minut) wyniosło 44,74 ng/ml, a parametr AUC był równy 57,41 ng/ml*h (Rycina 4-45).

Rycina 4-45 Wynik badania farmakokinetycznego związku referencyjnego firmy Novartis. A: Zmiany stężenia związku w osoczu zachodzące po podaniu doustnym (PO) związku w dawce 3 mg/kg. W czasie równym 24h poziom związku w osoczu był poniżej poziomu detekcji. B: Parametry farmakokinetyczne związku. h - godzina.

Pomimo słabych parametrów uzyskanych dla związku referencyjnego stwierdzono, że ma on szansę wywołać zmiany w poziomach wyselekcjonowanych biomarkerów (KRT80, Biomarker 2). Brano jednak pod uwagę, że brak istotności statystycznej otrzymanych danych nie powinien dyskredytować wybranego modelu do badań farmakodynamicznych. W modelu ksenoprzeszczepu linii A549 w szczepie myszy Athymic nude i po doustnym podaniu zwierzętom związku Novartis, po czasie 2, 8 i 24h sprawdzono poziom badanego związku w próbkach (LC-MS) oraz zbadano zmiany w poziomach biomarkerów, które zostały wyselekcjonowane w testach in vitro. Osobniki, dla których stężenie związku w osoczu i guzie było poniżej poziomu detekcji wykluczono z analizy zmian w poziomach biomarkerów (np. Rycina 4-46 A, B 8h Novartis, próbka NF).

Rycina 4-46 Wynik badania farmakodynamicznego związku referencyjnego firmy Novartis (A549, Athymic nude). A: Stężenie związku w osoczu (LC-MS). B: Stężenie związku w guzie (LC-MS). C: Poziom ekspresji KRT80 w guzach (qPCR, do normalizacji ilości cDNA w próbce wykorzystano poziom ekspresji aktyny). D: Poziom Biomarkera 2 w guzach (AlphaLISA), próby kontrolne zbierane były po czasie równym 8h, h - godzina.

Doświadczenie pokazało obecność związku Novartis w osoczu i guzach w punktach czasowych równych 2h i 8h (traktowanie związkiem w dawce 20 mg/kg). Stężenie inhibitora w osoczu po czasie 2h od podania wyniosło 6,2 µM i spadło do wartości 0,12 µM po czasie 8h. Poziom związku w guzach został oznaczony po upływie 2h na dwukrotnie niższym poziomie (3,2 µM), natomiast w czasie 8h od podania spadł do poziomu porównywalnego z osoczem (0,12 µM) (Rycina 4-46 A, B). Po upływie 24h od podania związku jego poziom nie został wykryty w próbkach. Oznaczone za pomocą metody LC-MS stężenia inhibitora w guzach wywołały zmiany w poziomach biomarkerów, które były już widoczne po 2h od podania związku. Po tym czasie zaobserwowano największy spadek ekspresji genu KRT80 (ok. 35%), który zmniejszał się w kolejnych punktach czasowych (Rycina 4-46 C). Zaobserwowane zmiany nie były jednak istotne statystycznie. Poziom Biomarkera 2 osiągnął maksymalny mierzalny spadek (>70%, poniżej limitu detekcji) po czasie 8h od podania związku Novartis. Otrzymany wynik nie był istotny statystycznie (Rycina 4-46 D). Tak późny czas odpowiedzi może być spowodowany faktem, że zmiany w poziomie Biomarkera 2 mierzone są na poziomie białka

(nie genu, jak w przypadku KRT80). Poziom obu biomarkerów po czasie 24h wracał do poziomu równemu kontroli.

Pomimo tego, że model ksenoprzeszczepu linii komórkowej A549 w szczepie myszy Athymic nude okazał się odpowiedni do badań zmian w poziomach markerów farmakodynamicznych, dodatkowo sprawdzono, czy wyjściowe stężenia Biomarkera 2 oraz zmiany zachodzące w poziomach obu biomarkerów po traktowaniu związkiem nie będą wyższe w przypadku zastosowania innego szczepu myszy. Do badań wybrano szczep myszy BALB/c nude i linię A549 bazując na danych wewnętrznych firmy Ryvu Therapeutics. Doświadczenie obejmowało szerszy zakres stężeń związku Novartis (2,5, 7 i 20 mg/ml) oraz dwa schematy dawkowania (QDx1, QDx3), guzy zbierane były natomiast w węższym zakresie czasowym (8h i 24h). W przypadku podania jednokrotnego (QDx1) wykryto inhibitor w osoczu i guzach jedynie w punkcie czasowym równym 8h dla stężenia związku równego 7 i 20 mg/kg (Rycina 4-47).

Rycina 4-47 Stężenie związku referencyjnego Novartis w osoczu i guzach myszy BALB/c nude z ksenoprzeszczepami utworzonymi z linii komórkowej A549 (LC-MS).

Oznaczone za pomocą metody LC-MS stężenie inhibitora w guzach w czasie 8h (20 mg/kg) było porównywalne ze stężeniem oznaczonym w myszach Athymic nude i wyniosło 0,1 µM. Osiągnięte stężenie związku było wystarczające do wywołania zmian w poziomie Biomarkera 2, natomiast nie wywołało znaczących zmian w ekspresji genu KRT80 (Rycina 4-48 A, B). Spadek poziomu Biomarkera 2 szacuje się na 85%, jednakże ze względu na niski poziom oznaczalny w próbie kontrolnej czułość metody nie pozwala na jego precyzyjne określenie. Niższy poziom Biomarkera 2 (zewnątrzkomórkowy) oraz brak znaczących zmian w poziomie ekspresji KRT80 może być spowodowany infiltracją komórek mysich do guza, która została uwidoczniona metodą Western Blot. Białko BRG1 wykryto w guzach myszy kontrolnych, które zostały stworzone z komórek A549 charakteryzujących się brakiem obecności wspomnianego białka (Rycina 4-48 C).

Rycina 4-48 Wynik badania farmakodynamicznego związku referencyjnego firmy Novartis w czasie 8 godzin (A549, BALB/c nude). A: Poziom KRT80 w guzach (qPCR, do normalizacji wykorzystano poziom ekspresji aktyny). B: Poziom Biomarkera 2 w guzach (AlphaLISA), QDx1-podanie raz dziennie przez jeden dzień. C: Analiza Western Blot. Jako kontrole w analizie uwzględniono ekstrakty białkowe uzyskane z komórek HT1080 charakteryzujących się obecnością białka BRG1 oraz komórek A549, które zostały wszczepione do myszy.

W eksperymencie uwzględniono także próby, w których podanie związku Novartis wykonano trzykrotnie (QDx3). Tak jak przewidywano, ze względu na szybki proces usuwania związku z organizmu (Rycina 4-45), nie zaobserwowano jego akumulacji w organizmie myszy (porównanie QDx1 i QDx3, Rycina 4-49 A-D). Zmiany w poziomach Biomarkera 2 były znikome, a jego poziom w próbie kontrolnej był znacząco niższy (160 pg/ml) niż w przypadku szczepu Athymic nude (770 pg/ml). Trzykrotne podanie związku nie wywołało także znaczących zmian w ekspresji genu KRT80 (Rycina 4-49 F, H).

Rycina 4-49 Wynik badania farmakodynamicznego związku referencyjnego firmy Novartis (A549, BALB/c nude, 20 mg/kg). A, B: Stężenie związku w osoczu w wybranych punktach czasowych (LC-MS). C, D: Stężenie związku w guzie (LC-MS). E, F: Poziom KRT80 w guzach (qPCR, do normalizacji ilości cDNA w próbce wykorzystano poziom ekspresji genu o konstytutywnej ekspresji: Aktyna). G, H: Poziom Biomarkera 2 w guzach (AlphaLISA), LD-limit detekcji, h-godzina, QDx1-podanie raz dziennie przez jeden dzień. QDx3-podanie raz dziennie przez trzy dni).

W oparciu o przeprowadzone eksperymenty stwierdzono, że model ksenoprzeszczepu linii komórkowej A549 w myszach szczepu Athymic nude jest odpowiedni do określania zmian w poziomach obu biomarkerów PD (KRT80 i Biomarker 2) metodami ilościowego PCR w czasie rzeczywistym oraz AlphaLISA. Wspomniany model został wybrany do testowania rozwijanych przez firmę Ryvu Therapeutics inhibitorów białka BRM.

Metoda umożliwiająca selekcję związków małocząsteczkowych celujących w nieopisany dotychczas cel molekularny

Ze względu na wysoką trudność uzyskania selektywnych inhibitorów białka BRM zdecydowano się na optymalizację wysokoprzepustowego fenotypowego testu przesiewowego (HTS). W wyniku testu zamierzano wyłonić związki aktywne w komórkach HT1080 SM4KO

o nowym mechanizmie działania.

Optymalizacja wysokoprzepustowego fenotypowego testu przesiewowego

Do zoptymalizowania warunków HTS wykorzystano linie komórkowe HT1080 i HT1080 SM4KO o podobnym tempie wzrostu (Rycina 4-50 A). Kolejno, ustalono najlepsze warunki do przeprowadzenia testu żywotności (CTG) w formacie płytki 384-dołkowej, dobrano optymalną liczbę komórek na dołek i określono czas inkubacji ze związkami w taki sposób, by nie dopuścić do ich przegęszczenia w dołku oraz zachować odpowiednie wartości parametrów S/B i Z’ (Równanie 3-11, Równanie 3-12). Analizę odczytów luminescencji testu CTG podparto obserwacją mikroskopową. Według zaleceń producenta (Promega) stosunek objętości odczynnika CTG do medium powinien wynosić 1:1 (50 µl CTG na 50 µl medium/dołek płytki). W celu sprawdzenia, czy możliwe jest zmniejszenie ilości zużywanego odczynnika porównano zależność liczby komórek HT1080 od odczytu luminescencji dla mniejszych objętości CTG (5 µl, 10 µl i 25 µl). Doświadczenie nie pokazało znaczących różnic, co wskazało na możliwość użycia najniższej testowanej objętości odczynnika (5 µl), lecz ze względu na wyższą dokładność dozowania większych objętości zdecydowano się na stosunek równy 1:5 (10 µl CTG na 50 µl medium; Rycina 4-50 B). W kolejnym kroku przetestowano trzy czasy inkubacji ze związkami (72, 96 i 120 godzin) oraz porównano różne gęstości komórek (Rycina 4-50 C). Założeniem eksperymentu był wybór jak najdłuższego czasu inkubacji w celu wyłonienia związków, w przypadku których efekt fenotypowy występuje w późniejszym czasie (tak jak inhibitory białek epigenetycznych). Jako kontrolę w eksperymentach optymalizacyjnych wykorzystano znany induktor apoptozy, staurosporynę w stężeniu równym 1 µM, które powodowało całkowity spadek żywotności komórek HT1080 i HT1080 SM4KO. Dla wszystkich testowanych gęstości, z wyjątkiem 31 komórek na dołek zaobserwowano spadek sygnału luminescencji (odczyt CTG) w punkcie czasowym 120h. Najniższa testowana gęstość pokazała jednak najgorsze parametry S/B oraz jej konfluencja na płytce eksperymentalnej w dniu odczytu była bardzo niska. W oparciu o ten wynik zdecydowano, że odczyt testu przesiewowego powinien być wykonywany po czasie równym

96 godzin. Oczekiwano, że konfluencja komórek w dniu odczytu (próby kontrolne) będzie oscylowała wokół 90%. Wybrano gęstość 200 komórek na dołek, dla której parametry S/B i Z’ spełniały założone kryteria (Rycina 4-50 C).

Rycina 4-50 Optymalizacja wysokoprzepustowego fenotypowego testu przesiewowego. A: Porównanie szybkości wzrostu linii komórkowych. Wykres wykonano w oparciu o krzywą standardową zależności liczby komórek od sygnału luminescencji. T1/2 – połowiczny czas podziału. B: Optymalizacja odczytu żywotności testem CTG wykonana na linii HT1080. C: Reprezentatywny wynik optymalizacji liczby komórek na dołek, czasu inkubacji ze związkami oraz parametrów jakości (Z’ – prawa oś y, S/B - tabela) dla poszczególnych warunków na linii HT1080 SM4KO. Dla linii HT1080 otrzymano wynik analogiczny. Czerwoną ramką zaznaczono warunki, pomiędzy którymi znajduje się wyselekcjonowana gęstość komórek. D: Test tolerancji na DMSO oraz różnicowego działania inhibitora VX-680 przeprowadzone w zoptymalizowanych warunkach testu przesiewowego. RLU – odczyt luminescencji pomniejszony o wartość RLU dla próby ślepej (medium), h - godzina.

W następnym etapie optymalizacji przeprowadzono test tolerancji na nośnik - DMSO oraz określono odpowiednie kontrole. Obie testowane linie komórkowe nie wykazały spadku żywotności pod wpływem DMSO poniżej 0,5% (Rycina 4-50 D). W końcowych warunkach testu przesiewowego przyjęto stężenie DMSO równe 0,2%. Ze względu na brak związku

o różnicowej aktywności względem linii izogenicznych w momencie optymalizacji fenotypowego testu przesiewowego sprawdzono dostępny komercyjnie inhibitor kinazy AURKA – VX-680, który według wiedzy literaturowej powinien silniej działać na komórki z mutacją typu utrata funkcji w genie SMARCA4 [90]. Różnica w żywotności komórek HT1080 i HT1080 SM4KO nie była wystarczająca by wykorzystać związek VX-680 jako kontrolę pozytywną w teście przesiewowym (Rycina 4-50 D). Ze względu na brak związków o różnicowym działaniu w teście fenotypowym jako kontrolę pozytywną wykorzystano staurosporynę w stężeniu równym 0,5 µM, która powodowała całkowity spadek żywotności obu linii izogenicznych (Rycina 4-50 C, nie pokazano wyniku dla linii HT1080 SM4KO). Kontrolę negatywną stanowił nośnik, 0,2% DMSO. W ostatnim kroku optymalizacji zwiększono przepustowość testu poprzez zmianę formatu traktowania komórek związkami, które dozowano na płytkę 384-dołkową przed wysianiem komórek. Zmiana formatu eksperymentu nie wpłynęła na zoptymalizowane parametry (dane nieuwzględnione w rozprawie).

Walidacja warunków fenotypowego testu przesiewowego

Wszystkie uwzględnione w eksperymencie płytki spełniły wymagania określone przez parametry jakości (Z’>0,5). Analiza Western Blot wykonywana przed każdym etapem testu przesiewowego potwierdziła brak białka BRG1 w linii HT1080 SM4KO (Rycina 4-51 A). Dla otrzymanych wyników, osobno dla linii HT1080 i HT1080 SM4KO, obliczono % inhibicji i utworzono histogramy reprezentujące rozkład otrzymanych danych. Nie wykazano różnic pomiędzy powtórzeniami technicznymi (Rycina 4-51 B). Kolejno, osobno dla każdego replikatu, obliczono średnią wartość % inhibicji. Przyjęto, że związek hamuje żywotność komórek (jest aktywny), jeśli jego % inhibicji był większy niż średnia wartość % inhibicji + trzy odchylenia standardowe (pionowe linie na histogramach, Rycina 4-51 B, C). Nie zaobserwowano zmian w kryterium określającym aktywność związku pomiędzy powtórzeniami technicznymi. W przypadku obu testowanych linii komórkowych liczba cząsteczek aktywnych zwiększała się wraz ze wzrostem stężenia związków z 0,1 µM do 10 µM.

Rycina 4-51 Wynik fenotypowego badania przesiewowego z wykorzystaniem biblioteki LOPAC oraz kryteria selekcji związków. A: Wynik Western Blot, kontrola jakości dla linii komórkowych. B: Histogramy reprezentujące rozkład odczytów w poszczególnych grupach badanych. C: Kryteria selekcji

związków w fenotypowym teście przesiewowym. standardowe.

̅𝑖𝑛̅ℎ̅𝑖𝑏̅̅𝑖𝑐̅𝑗̅𝑖

średni % inhibicji, σ – odchylenie

Analiza wyniku pierwszego etapu fenotypowego testu biblioteki LOPAC1280 doprowadziła do wyłonienia 72 związków. Podczas selekcji przyjęto, że dla danej cząsteczki wszystkie parametry muszą zostać spełnione dla dwóch stężeń danego związku oraz obu powtórzeń technicznych (Rycina 4-51 B). W kolejnym etapie wybrane 72 związki przetestowano w wyższym stężeniu równym 20 µM i poddano takim samym kryteriom selekcji jak w etapie pierwszym. W analizie potwierdzono działanie 15 cząsteczek, lecz żaden z wyselekcjonowanych związków nie pokazał obiecującej różnicowości w testach w pełnym zakresie stężeń, jak pokazano dla wybranych dwóch związków (Rycina 4-52). Zastosowane podejście, w którym założono, że parametr krotność zmiany we wszystkich punktach stężeniowych powinien przyjmować wartości większe od 1, doprowadził do wyboru cząsteczek o równoległym przebiegu krzywych obrazujących zależną od dawki aktywność związków.

Rycina 4-52 Przykładowy wynik uzyskany dla wyselekcjonowanych związków testowanych w szerszym zakresie stężeń. Cytosine-1-beta-D-arabinofuranoside hydrochloride – selektywny inhibitor syntezy DNA, inhibitor Topoizomerazy II.

Określenie algorytmu do selekcji związków w kolejnych fenotypowych testach przesiewowych

W oparciu o otrzymane wyniki stwierdzono, że w kolejnych testach przesiewowych konieczne jest uwzględnienie minimum trzech punktów stężeniowych już w pierwszym etapie testu przesiewowego. Jako najniższe stężenie wybrano wartość S1 - 0,1 µM, natomiast kolejne dawki były jego dziesięciokrotnością (S2 - 1 µM, S3 - 10 µM). Nie zmieniono formuł oraz kryteriów stosowanych do obliczania parametrów % inhibicji oraz B-score. Zdecydowano jednak, że parametr krotność zmiany powinien przyjmować wartości większe niż 1,5. Ponadto ustalono algorytm prowadzący do wyboru związków o potencjalnej różnicowej aktywności na podstawie poniższych założeń:

Selekcja związków, dla których w przynajmniej jednym punkcie stężeniowym (S1, S2 i/lub S3) % inhibicji był większy niż średnia wartość % inhibicji + trzy odchylenia standardowe (Rycina 4-51C);

Selekcja związków, dla których % inhibicji HT1080 SM4KO zwiększał się wraz ze wzrostem dawki testowanego związku;

Selekcja związków, dla których % inhibicji HT1080 zwiększał się wraz ze wzrostem dawki testowanego związku;

Selekcja związków, dla których parametr krotność zmiany (Równanie 3-13 B) był większy niż 1,5.

Dyskusja

5.1	Opracowanie koncepcji strategicznej projektu

W dzisiejszych czasach do walki z nowotworami wykorzystywane są różne metody leczenia takie jak zabiegi operacyjne, chemioterapia, radioterapia, czy też hormonoterapia. Obecnie coraz większe nadzieje kładzie się jednak na tzw. terapią celowaną, której rozwój możliwy jest dzięki coraz bardziej dokładnym i szczegółowym badaniom nowotworów na poziomie molekularnym. Pierwsze przesłanki o możliwości uznania białka BRM za cel terapeutyczny bazowały na doniesieniach o występowaniu zjawiska syntetycznej letalności pomiędzy mutacją typu utrata funkcji w genie SMARCA4 i wyciszeniem genu SMARCA2 [35]. Analizy bioinformatyczne oparte na danych wygenerowanych z wykorzystaniem zarówno RNAi, jak i CRISPR potwierdziły wspomnianą zależność, gdyż wskazały na gen SMARCA2 jako najbardziej istotny dla proliferacji komórek z niefunkcjonalnym genem SMARCA4. Założenia projektu zostały także potwierdzone w sposób eksperymentalny z wykorzystaniem trzech linii komórkowych posiadających mutacje typu utrata funkcji w genie SMARCA4 (A549, NCI-H1299, SK-HEP-1) oraz trzech z dziką formą tego genu (NCI-H460, NCI-H1437, HT1080). Wnioski wyciągnięte w ramach rozprawy są także spójne z innymi doniesieniami literaturowymi [33, 68, 154–156]. Kolejne analizy bioinformatyczne wskazały komórki niedrobnokomórkowego raka płuca jako typ nowotworu o najwyższej wrażliwości na wyciszenie genu SMARCA2. Doprowadziły także do niepokojącego w kontekście badań in vitro spostrzeżenia, że wysoki odsetek mutacji SMARCA4 w nowotworowych liniach komórkowych (12% ogółem, 23,7%, NSCLC dane cBioPortal) nie ma bezpośredniego odzwierciedlenia w próbkach klinicznych (4,5% ogółem, 8,63% NSCLC, dane cBioPortal). Inne grupy badawcze sprawdziły, czy występowanie alteracji genu SMARCA4 w próbkach klinicznych przekłada się na brak obecności białka BRG1. Barwienia immunohistochemiczne (IHC) pokazały brak badanego białka w znacznie wyższym odsetku próbek, niż wskazywały na to wyniki sekwencjonowania, a głębsza analiza biopsji pacjentów zasugerowała, że może być to spowodowane nieuwzględnionymi mutacjami powodującymi nieprawidłową procedurę składania genów (splicingu), zbyt niską czułością procedur sekwencjonowania lub innym, niezależnym od modyfikacji genomu mechanizmem [35, 157, 158]. Autorzy postulowali także możliwość wystąpienia epigenetycznej kontroli ekspresji genu SMARCA4, gdyż badania na liniach komórkowych (Panc-1, H1573, C33A) pokazały przywrócenie obecności białka BRG1 poprzez zahamowanie ścieżki PI3K/AKT/mTOR [157]. Epigenetyczny mechanizm

wyciszenia ekspresji genu SMARCA4 nie został jednak potwierdzony przez inne grupy badawcze. Dowiedziono jednak, że białko BRG1 oddziałuje z białkiem PI3K, a ścieżka PI3K/AKT/mTOR ulega aktywacji po wyciszeniu genu SMARCA4 w komórkach nabłonka dróg oddechowych astmatycznych myszy [159].

Według wstępnych badań odsetek prób klinicznych NSCLC, w których nie wykryto obecności białka BRG1 w badaniu IHC, może wynosić nawet 24% [145, 157], jednak podanie dokładnej wartości wymaga dalszych doświadczeń na większej grupie pacjentów. Otrzymany wynik jest zbieżny z odsetkiem mutacji w liniach komórkowych (23,7%, NSCLC), w których większość mutacji przekłada się na brak białka BRG1. Biorąc pod uwagę zachorowalność na nowotwory płuc na świecie, która w 2020 roku wyniosła 2,2 miliona przypadków (GLOBOCAN 2020), z czego 85% stanowią pacjenci zdiagnozowani w kierunku NSCLC (1,87 mln przypadków, Rycina 5-1), grupa docelowa chorych, którzy w przyszłości mogliby być leczeni inhibitorami białka BRM wynosiłaby od 80 000 (mutacje powodujące skrócenie BRG1) do 449 000 (brak białka BRG1) przypadków rocznie. Dla tej grupy pacjentów nie odkryto dotychczas terapii celowanej. Obecnie w procesie diagnostyki i doboru terapii raka płuca przeprowadza się m.in. analizę alteracji w genach EGFR, ALK i ROS1, DDR2, RET, FGFR, które nie współwystępują z mutacją typu utrata funkcji w genie SMARCA4 [160].

Rycina 5-1 Podział nowotworów płuc. Drobnokomórkowy rak płuca (SCLC, ang. small cell lung cancer), Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) [160–162].

Dalsze analizy zaprezentowane w rozprawie wykorzystujące linie komórkowe NSCLC pokazały, że komórki, dla których opisano równoczesną obecność mutacji typu utrata funkcji w SMARCA4 i SMARCA2 lub charakteryzujące się niskim poziomem ekspresji SMARCA2 nie są zależne od obecności białka BRM. Brak jest jednak wiarygodnych danych klinicznych pokazujących, czy w przypadku pacjentów z NSCLC występują przypadki, u których potwierdzono równoczesny brak białka BRG1 oraz brak lub niski poziom białka BRM. Jeśli w wyniku dalszych badań odsetek takich przypadków okaże się wysoki, konieczne będzie zastosowanie dwóch markerów predykcyjnych w postaci braku obecności białka BRG1 i obecności białka BRM, do przeprowadzenia stratyfikacji pacjentów mających szansę uzyskać

korzyść z terapii inhibitorami białka BRM. Istnieją przesłanki, że pacjenci z nowotworami, w których oba wspomniane białka będą nieobecne mogliby być leczeni inhibitorami białka EZH2 (ang. enhancer of zeste homolog 2) [62]. Powyższy wniosek wyciągnięto na podstawie badań nad grupą nowotworów SCCOHT, u których pokazano utratę zarówno białka BRG1 jak i BRM [68, 163, 164]. Żywotność komórek SCCOHT nie jest bowiem uwarunkowana funkcjami kompleksu SWI/SNF, lecz najprawdopodobniej zależy od aktywności kompleksu PRC2 (ang. polycomb repressive complex 2), którego katalityczną rolę pełni wspomniane białko EZH2 [163, 165–168]. W przypadku komórek NSCLC w rozprawie opisano dwie linie komórkowe (NCI-H1347, NCI-H460), w których równoczesne wyciszenie genów SMARCA2 i SMARCA4 nie wywołało zmian w poziomie żywotności. Potwierdzenie ewentualnej oporności niektórych nowotworów NSCLC na inhibicję SMARCA2 wymaga dalszych badań z wykorzystaniem selektywnych inhibitorów białka BRM.

Aby potwierdzone zjawisko syntetycznej letalności mogło zostać wykorzystane w kontekście terapii, konieczne jest określenie domeny, której zahamowanie za pomocą związku małocząsteczkowego ma szansę wywołać efekt terapeutyczny. W roku 2006 postulowano, że funkcja bromodomeny może być kluczowa do przeprowadzenia ATP-zależnej rearanżacji chromatyny [30]. Dane uzyskane z wykorzystaniem inhibitora bromodomeny,

o dowiedzionym wpływie na oddziaływanie białka BRM z chromatyną, nie pokazały jednak efektu na proliferację komórek nowotworowych z niefunkcjonalnym białkiem BRG1 [33, 34]. Wyniki zostały poparte badaniami przeprowadzonymi z użyciem metod inżynierii genetycznej, które dowiodły, że brak funkcjonalności bromodomeny białka BRM nie wpływa na szybkość podziału komórek z defektem białka BRG1. Ponadto, pokazano uzależnienie ich proliferacji od funkcjonalności domeny ATPazowo-helikazowej (Domena Tr) BRM [33, 35]. W aspekcie tych doniesień, kamieniem milowym projektu było zoptymalizowanie biochemicznego testu przesiewowego umożliwiającego selekcję pierwszych cząsteczek modulujących aktywność domeny ATPazowo-helikazowej, co zostało osiągnięte przez pracowników firmy Ryvu Therapeutics (Suplement). Bez tego typu testu dalsze badania nie byłyby możliwe.

Kolejnym, kluczowym w procesie opracowywania koncepcji strategicznej projektu aspektem jest potencjalna toksyczność rozwijanej terapii. Według doniesień literaturowych, opisanych we wstępie do niniejszej rozprawy doktorskiej, terapia inhibitorami białka BRM powinna być przez organizm dobrze tolerowana. Przewiduje się jednak wystąpienie toksyczności w przypadku dualnej inhibicji białek BRM i BRG, które charakteryzuje bardzo wysoka homologia. W obrębie domeny ATPazowo-helikazowej podobieństwo między białkami jest bardzo wysokie i wynosi 96-99%. Pomimo znacznego ryzyka związanego

145

z rozwojem selektywnych inhibitorów białka BRM zdecydowano się na kontynuację projektu, a podczas opracowywania kaskady testów przesiewowych i drugorzędowych szczególny nacisk położono na rozwój metod umożliwiających określenie selektywności związków. Ponadto, zdecydowano się także na próby identyfikacji nowych celów molekularnych dla nowotworów, w których określono brak obecności białka BRG1 w oparciu o podejście fenotypowe.

Metodyka	umożliwiająca	selekcję	i	charakterystykę	związków małocząsteczkowych celujących w białko BRM.

Choć w ostatnich dziesięcioleciach nastąpił znaczny postęp nauki, technologii oraz równoczesny wzrost nakładów pieniężnych dla sektora badań i rozwoju produkcja innowacyjnych leków pozostała statyczna. Przyczyny „kryzysu produktywności” w przemyśle mogą mieć swoje podłoże w zmienionych restrykcjach, narastającej niechęci do podejmowania ryzyka, wzrostu kosztów badań klinicznych, czy faktu, że obecnie poszukiwane są leki na bardziej skomplikowane choroby. Obecnie wierzy się jednak, że produktywność może zostać częściowo zwiększona poprzez zastosowanie tzw. zasady 5R. Według wspomnianej zasady konieczne jest dokładne określenie i sprawdzenie wymienionych w tabeli poniżej pięciu właściwości, które musi spełniać rozwijana cząsteczka (Tabela 5-1) [169]. W przypadku opisanego w rozprawie doktorskiej projektu mającego na celu rozwój inhibitorów białka BRM, podczas opracowywania koncepcji strategicznej projektu z wykorzystaniem danych literaturowych i własnych badań wstępnych określono wszystkie właściwości opisane przez zasadę 5R oraz dobrano testy wykorzystane do rozwoju związków.

Tabela 5-1 Podsumowanie kluczowych cech (5R) dotyczących odkrycia i opracowania inhibitora białka BRM.

Cel molekularny	Domena ATPazowo-helikazowa białka BRM
Docelowa grupa pacjentów	NSCLC, charakteryzujące się równoczesnym brakiem obecności białka BRG1 i obecnością białka BRM
Parametry bezpieczeństwa	Selektywność wobec białka BRM względem BRG1
Potencjał rynkowy	80 000 – 449 000 przypadków rocznie, brak obecnie stosowanej terapii ukierunkowanej

Metody pozwalające na walidację oddziaływań białko-ligand

Pierwsza grupa rozwijanych w ramach pracy testów mierzy zmiany w temperaturze topnienia białek, co umożliwia potwierdzenie specyficzności wiązania związku do białka. Wadą tej grupy technik jest wysoki odsetek wyników fałszywie negatywnych, gdyż brak wpływu związku na stabilność temperaturową białka nie świadczy o braku oddziaływania.

Jednak	wynik	pozytywny	jest	ważnym	dowodem	pokazującym	silną	interakcję wyselekcjonowanych związków z celem białkowym.

Standardowo wykorzystywaną metodą Thermal Shift jest różnicowa fluorymetria skaningowa (DSF) bazująca na zwiększeniu poziomu fluorescencji barwnika pod wpływem oddziaływania z resztami hydrofobowymi denaturującego białka. Metodę DSF zastosowali w swojej kaskadzie testów twórcy inhibitora referencyjnego [84], a do jej przeprowadzenia wykorzystali skrócone wersje białek BRM i BRG1 zawierające domeny ATPazową i SnAC. W ramach projektu, którego część stanowi niniejsza rozprawa, skrócone białko BRM zostało wykorzystane w metodach MST i SPR, dlatego w celu potwierdzenia oddziaływania na innym konstrukcie w procesie rozwoju metody Thermal Shift zdecydowano się na wykorzystanie białka BRM pełnej długości. Wielkość białka (200 kDa) oraz jego niska stabilność, którą ominięto dzięki wprowadzeniu do buforu innego białka stabilizującego, uniemożliwiły testowanie zmian w temperaturze topnienia za pomocą DSF. Różnicowa fluorymetria skaningowa nie umożliwia bowiem specyficznego badania zmian w stabilności temperaturowej w układach wielobiałkowych oraz jest przeznaczona dla małych globularnych białek. W zmodyfikowanej metodzie Thermal Shift wpływ obecności drugiego białka na metodę detekcji został ominięty dzięki wykorzystaniu przeciwciał specyficznych wobec białka BRM. Dodatkową przewagą zmodyfikowanej metody Thermal Shift nad standardową DSF był brak obecności barwnika fluorescencyjnego w buforze reakcyjnym. Należy podkreślić, że w przypadku niektórych związków obecność fluorofora może zaburzyć ich interakcję z badanym białkiem. Dotychczas opisano także inne metody sprawdzające zmiany w stabilności termicznej protein, które nie wymagają użycia barwników (dichroizm kołowy [170], różnicowa kalorymetria skaningowa [171], metoda statycznego rozpraszania światła [172]), lecz ich wykonanie także nie dopuszcza układów wielobiałkowych, wiąże się z niską przepustowością i koniecznością użycia sprzętu specjalistycznego.

Zmodyfikowana metoda Thermal Shift była jedyną możliwością badania zmian w temperaturze topnienia rekombinowanego białka BRM pełnej długości. Ponadto, odpowiednia zmiana warunków testu umożliwiła znaczne zwiększenie przepustowości metody. Proces optymalizacji był długotrwały, gdyż w przypadku tej metody konieczna była równoczesna zmiana dwóch etapów procedury (wirowanie oraz metoda detekcji), a zmiana każdego z nich wiązała się z obniżeniem jakości testu. Podczas optymalizacji konieczne było ustalenie kompromisu pomiędzy zwiększeniem przepustowości, a obniżeniem czułości testu mierzonej za pomocą przesunięcia przybliżonej temperatury denaturacji pod wpływem obecności DNA (Tabela 5-2). Końcowe warunki zmodyfikowanej metody Thermal Shift zostały

potwierdzone z wykorzystaniem potencjalnych inhibitorów białka BRM, które wykazały aktywność w teście biochemicznym (dane wewnętrzne Ryvu Therapeutics). Brak stabilizacji białka spowodowanej przez oddziaływanie ze związkiem referencyjnym oraz ADP jest najprawdopodobniej przykładem wyniku fałszywie negatywnego, co stwierdzono na podstawie pozostałych danych dotyczących cząsteczki Novartis.

Tabela 5-2 Przebieg optymalizacji prowadzącej do zwiększenia przepustowości zmodyfikowanej metody Thermal Shift. Kolor tła reprezentuje przepustowość metody (szary-niska, zielony-wysoka).

Główną wadą zmodyfikowanej metody Thermal Shift jest wykorzystanie rekombinowanego białka BRM oraz wysoki odsetek wyników fałszywie negatywnych. W związku z tym zdecydowano się na zoptymalizowanie dodatkowych technik sprawdzających zmiany w temperaturze denaturacji białka BRM (CETSA). Dodatkową zaletą tych narzędzi była możliwość równoczesnego testowania białek BRM i BRG1 (wykorzystanie linii HT1080). Ponadto CETSA z wykorzystaniem żywych komórek pozwoliła na badanie protein w ich naturalnym otoczeniu wielobiałkowego kompleksu SWI/SNF.

Za pomocą metody CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego pokazano słabą stabilizację białka BRM. Wyniki tej analizy sugerowały również, że związek referencyjny Novartis może oddziaływać także z białkiem BRG1. Wiarygodna stabilizacja obu badanych białek została natomiast uwidoczniona za pomocą metody CETSA z wykorzystaniem żywych komórek, gdzie zauważono spadek stabilizacji dla najwyższych stężeń związku referencyjnego. Podobne efekty zostały także opisane w literaturze, lecz nie podjęto dyskusji na temat ich przyczyny [173–175]. Może być ona spowodowana spadkiem tempa translacji zachodzącej w komórkach, która nie została uwidoczniona za pomocą poziomu białka kontrolnego (winkuliny). W celu weryfikacji tej hipotezy w kolejnych eksperymentach warto wdrożyć dodatkową wizualizację ilości białek na żelu za pomocą metody Stain free. Brak zmian w poziomie białka kontrolnego może wynikać np. z jego długiego czasu półtrwania.

Otrzymane dla związku referencyjnego wyniki są zgodne z oczekiwaniami ze względu na dualną aktywność referencyjnego inhibitora firmy Novartis wobec białek BRM i BRG1 (Suplement, Tabela uzupełniająca 2-1), która została także podparta wynikiem molekularnego

dokowania związku do struktury krystalicznej (Suplement, Rycina uzupełniająca 2-1). Pokazano bowiem, że allosteryczne miejsce wiązania inhibitora wykazuje 100% homologię pomiędzy wspomnianymi białkami. Powyższe stwierdzenia są spójne z danymi publikacyjnymi [83, 84]. Wyniki otrzymane w oparciu o metody Thermal Shift, CETSA na lizacie komórkowym oraz CETSA z wykorzystaniem żywych komórek pokazały, że techniki sprawdzające zmiany w stabilności temperaturowej białek pod wpływem związania liganda mogą zależeć od wielu czynników. W przypadku związku firmy Novartis stabilizacja białka BRM nie została uwidoczniona we wszystkich testach, lecz otrzymany wynik nie świadczy o tym, że inne związki małocząsteczkowe, których budowa lub miejsce wiązania będą odmienne, nie wywołają zmian w stabilności badanego białka mierzonej za pomocą metod Thermal Shift lub CETSA na lizacie komórkowym.

Test wnikania związku do komórek

W ramach optymalizowanych narzędzi uwzględniono także test wnikania związku do komórek nowotworowych. Uzyskane dla inhibitora referencyjnego dane wykorzystano jako punkt odniesienia do oszacowania liczby nmoli badanych związków, która powinna być wystarczająca do wywołania efektu komórkowego. Ze względu na różną aktywność nowoodkrytych inhibitorów zdecydowano, że uzyskany w teście wnikania związku wynik (liczba nanomoli) powinien być przeskalowany względem aktywności związków ocenionej za pomocą wartości IC50 wygenerowanych w teście biochemicznym ADP-Glo na białku BRM (Suplement).

Ze względu na fakt, że inhibitory małocząsteczkowe o odpowiednich parametrach ADME w większości przypadków są w stanie przejść przez błonę komórkową, test wnikania związku do komórek przeprowadzano jedynie dla nowych serii chemicznych oraz związków, dla których nie pokazano aktywności w kolejnych testach in vitro.

W przypadku braku aktywności komórkowej dla obiecujących cząsteczek potwierdzano czy nie wynika on z niewydajnej transmisji związku do wnętrza komórki (Rycina 5-2). W przypadku potwierdzenia obecności cząsteczki w wystarczająco wysokim do wywołania efektu biologicznego stężeniu decydowano, że aktywność związku powinna być ponownie zweryfikowana. Natomiast w sytuacji uzyskania wyniku negatywnego brano pod uwagę konieczność przeprowadzenia kolejnych doświadczeń sprawdzających powód braku obecności związku wewnątrz komórki. Część mechanizmów mogła być związana ze specyfiką linii komórkowej HT1080 (brak obecności swoistych transporterów, które są obecne w innych liniach komórkowych, wyrzucanie związku z komórki na drodze mechanizmu aktywnego).

Rycina 5-2. Schemat doświadczeń przeprowadzanych w przypadku braku potwierdzenia zmian w poziomach biomarkerów in vitro. Znakiem „+” oznaczono pozytywny wynik danego testu (zmiana poziomu biomarkerów, wnikanie związku do komórek). Znakiem „-” oznaczono negatywny wynik danego testu. EPI - inhibitory pomp efflux.

Udział aktywnego eksportu związku z komórek mógłby zostać zweryfikowany za pomocą znanych inhibitorów pomp efflux (EPI) takich jak np. werapamil [176] (Rycina 5-2). Do ustalenia wpływu specyficznych transporterów konieczne byłyby testy z wykorzystaniem komórek innych niż HT1080. Dobór linii wymagałby konkretnych analiz związanych ze strukturą związków oraz obecnością poszczególnych transporterów w różnych liniach komórkowych. Przed rozpoczęciem eksperymentów optymalizacyjnych należałoby też rozważyć opłacalność rozwoju danego inhibitora, gdyż wymóg obecności specyficznych transporterów znacznie ogranicza docelowe wskazanie terapeutyczne.

Linie izogeniczne

Wiele grup badawczych wykonywało próby stworzenia par linii izogenicznych różniących się obecnością białka BRG1. Jedną z takich analiz przeprowadziła firma Boehringer, wprowadzając prawidłową sekwencję genu SMARCA4 do linii komórkowej A549 (WO 2020/078933 A1). W patencie wspomniana linia nie była jednak wykorzystywana do badania żywotności komórek po traktowaniu związkami lub siRNA. Wymuszenie prawidłowej wersji genu SMARCA4 w komórkach nowotworowych bez obecności białka BRG1 prawdopodobnie nie odzwierciedla dobrze procesu kancerogenezy. W niniejszej rozprawie doktorskiej przyjęto podejście odwrotne (wyłączenie ekspresji genu SMARCA4 w komórkach opornych).

Stworzenie linii komórkowej, której odpowiedź na wyciszenie genu SMARCA2 byłaby równoznaczna z fenotypem linii nowotworowych, w których mutacja w genie SMARCA4 wystąpiła naturalnie, okazało się jednak problematyczne. Nie zaobserwowano spadku

żywotności dwóch linii komórkowych NCI-H460 i NCI-H1437, w których za pomocą ogólnie dostępnego zestawu CRISPR HDR wyłączono ekspresję genu SMARCA4. Pożądany fenotyp uzyskano jedynie w linii HT1080, którą zmodyfikowano metodą CRISPR NHEJ wykorzystując w tym celu sgRNA zaprojektowane przez firmę Applied StemCell. Otrzymany dla komórek NCI-H460 i NCI-H1437 wynik mógł być spowodowany ograniczeniami metody CRISPR, która w przypadku wykorzystania komercyjnie dostępnego zestawu mogła spowodować także niespecyficzne zmiany w komórkach lub może świadczyć o braku zależności tych linii od funkcji kompleksu SWI/SNF.

Wybór linii włókniakomięsaka HT1080 może wydawać się zaskakujący, gdyż linia nie reprezentuje docelowego wskazania terapeutycznego. Jej selekcja nie opierała się bowiem na doniesieniach literaturowych czy danych bioinformatycznych, lecz była uwarunkowana danymi wewnętrznymi firmy Ryvu Therapeutics, które dotyczyły jej podatności do przeprowadzenia testów wysokoprzepustowych. Ze względu na inne niż NSCLC pochodzenie komórek HT1080 utworzona linia HT1080 SM4KO została kolejno sprawdzona w wielu testach potwierdzających możliwość jej wykorzystania do charakterystyki nowych związków małocząsteczkowych. Za pomocą eksperymentów z wykorzystaniem transfekcji siRNA pokazano bardzo zbliżoną odpowiedź komórek HT1080 SM4KO oraz linii, w których mutacja w genie SMARCA4 nastąpiła w sposób spontaniczny (linie wrażliwe). Ponadto linia HT1080 SM4KO została scharakteryzowana z wykorzystaniem metod RNAseq i ChIPseq. W analizach RNAseq porównano stworzoną linię z komórkami A549. Doświadczenie pokazało bardzo zbliżony profil odpowiedzi komórek A549 i HT1080 SM4KO na wyciszenie genu SMARCA2 i wyłoniło 469 wspólnych DEG, które nie ulegały zmianie w linii HT1080. Ponadto analizy ChIPseq porównujące obecność białek BRM i BRG1 w poszczególnych lokalizacjach genomowych pokazały przejęcie funkcji białka BRG1 (HT1080) przez białko BRM w linii HT1080 SM4KO. W ostatnim etapie przeprowadzono doświadczenie mające na celu odwrócenie fenotypu linii poprzez ponowne wprowadzenie do komórek prawidłowej sekwencji genu SMARCA4. Stworzona linia komórkowa HT1080 SM4R miała fenotyp zbieżny z wyjściową linią HT1080. Na podstawie uzyskanych danych zakwalifikowano linię HT1080 SM4KO do grupy linii wrażliwych.

W kolejnych etapach, w celu umożliwienia określenia selektywności inhibitorów białka BRM wobec BRG1, uzyskano linię HT1080 SM2KO. Przydatność tej linii okazała się jednak znikoma, ponieważ komórki HT1080 SM2KO wykazały szczególną wrażliwość na wyciszenie genu SMARCA4. Zaobserwowana wrażliwość jest spójna z danymi uzyskanymi za pomocą ChIPseq dla linii HT1080, gdyż w tej linii białko BRM kontroluje w sposób bezpośredni

jedynie 504 geny, natomiast BRG1 aż 11655. Usunięcie z komórek genu SMARCA2 mogło w sposób szczególny uzależnić linie od funkcji białka BRG1.

Wyniki uzyskane za pomocą stworzonego w ramach rozprawy panelu czterech linii izogenicznych są w stanie podzielić związki na dwie grupy: potencjalne inhibitory białka BRM oraz związki selektywne wobec BRG1 lub wykazujące dualną aktywność względem BRM i BRG1. Interpretacja wyniku długoterminowego testu żywotności przeprowadzonego na panelu czterech linii izogenicznych powinna być przeprowadzana w czterech etapach:

Porównanie wartości EC50 dla linii HT1080 i HT1080 SM4KO;

Porównanie wartości EC50 dla linii HT1080 i HT1080 SM2KO;

Porównanie wartości EC50 dla linii HT1080 i HT1080 SM4R, które nie powinny się od siebie różnić w sposób znaczący.

Zakwalifikowanie związku do odpowiedniej grupy zgodnie tabelą przedstawioną poniżej (Rycina 5-3).

Rycina 5-3. Analiza wyniku otrzymanego z wykorzystaniem panelu linii izogenicznych. A: Przykładowy, schematyczny wynik długoterminowego testu żywotności dla poszczególnych typów inhibitorów. B: Parametry, które muszą zostać spełnione, by zakwalifikować inhibitor do dalszych badań. Wartości spoza określonych zakresów charakteryzują związki niespecyficzne wobec białek BRM i BRG1. Przyjęto, że ponad trzykrotne przesunięcie wartości EC50 pomiędzy badanymi liniami świadczy o różnicowej cytotoksyczności badanego związku.

Dane uzyskane dla związku referencyjnego wskazały na jego dualną aktywność wobec białek BRM i BRG1 lub selektywną aktywność wobec białka BRG1, co jest spójne z ogólną wiedzą na temat inhibitora (dualna aktywność, Suplement, [83, 84]).

Panel linii komórkowych

Większość badań z zakresu onkologii opiera się obecnie na doświadczeniach przeprowadzanych z wykorzystaniem hodowli komórkowych w układzie 2D. Należy jednak pamiętać, że takie podejście ma wiele ograniczeń, gdyż w hodowli dwuwymiarowej nie są zachowane prawidłowe oddziaływania międzykomórkowe, następuje zmiana sposobu podziału komórek, ich morfologii czy polarności. Wspomniane zmiany przekładają się na brak bezpośredniego przełożenia uzyskanych danych na wynik oczekiwany w badaniach in vivo. Ze względu na te ograniczenia naukowcy rozwinęli szereg metod hodowli komórek w układach 3D, lecz ich uwzględnienie we wczesnych etapach rozwoju leków wiąże się z wysokimi kosztami i niską przepustowością [177]. W ramach niniejszej rozprawy pomimo wspomnianych ograniczeń postanowiono przeprowadzić badania w modelach dwuwymiarowych.

W celu potwierdzenia różnicowej aktywności wybranych związków w zależności od obecności lub braku białka BRG1 wybrano długoterminowy test żywotności. Większość dobranych linii wrażliwych reprezentowała docelowe wskazanie terapeutyczne NSCLC BRM+ BRG1-, lecz w zestawieniu znalazły się także komórki innych typów nowotworów, takie jak linia raka wątrobowokomórkowego wywodzącego się z przerzutów do płynu puchlinowego (SK-HEP-1), czy linia HT1080 SM4KO. W panelu uwzględniono także komórki endometrialnego gruczolakoraka jajnika wywodzącego się z przerzutów do płynu puchlinowego (OVK-18), które tak jak A427 charakteryzują się brakiem zarówno białka BRM, jak i BRG1. Wykorzystanie linii kontrolnych pozwoliło na wstępne oszacowanie potencjalnej niespecyficzności związków. Brano pod uwagę, że inhibitory dualne białek BRM i BRG1 (nawet pomimo silniejszej aktywności skierowanej wobec białka BRM) mogą wpływać na żywotność komórek zarówno linii opornych, jak i wrażliwych, lecz ich aktywność wobec linii kontrolnych powinna być znacznie niższa. W wyniku przeprowadzonego testu możliwe było określenie czy różnicowa aktywność pomiędzy białkami BRM i BRG1, ustalona w poprzednich testach, jest wystarczająca do wywołania odmiennego efektu na żywotność linii opornych i wrażliwych.

Słuszność selekcji wchodzących w skład panelu linii komórkowych została także potwierdzona za pomocą późniejszych doniesień literaturowych, gdyż pokazano udział wyselekcjonowanych komórek w różnych panelach stworzonych przez inne firmy i jednostki naukowe (Rycina 5-4).

A549 NCI-H661 NCI-H2030 NCI-H1693 NCI-H1944 NCI-H838 NCI-H1568 SK-HEP-1 NCI-H1299 NCI-H2126 HT1080 SM4KO OVK-18 A427 HT1080 NCI-H460 PC9 HCC827 NCI-H1915 NCI-H1437 NCI-H441 NCI-H1792	[33, 35, 68, 83, 89], P1, P2 [35, 89, 178] [83, 89], P2 [83], P2 [83] [68, 83, 89], P1, P2 [83, 89], P2 [68] [35, 68, 83, 89, 178], P1, P2 [178], P2 Brak doniesień [165] [35, 89, 178] Brak doniesień [33, 68, 83], P1, P2 [89] [83, 89], P2 P2 [89], P2 [83], P2 P2

Rycina 5-4. Panel linii komórkowych do badania skuteczności i selektywności działania inhibitorów białka BRM. Dane literaturowe w oparciu, o które wybrano poszczególne linie komórkowe. P1 – patent US20160032402A1, P2 – patent WO2020023657A1. Kolorem bordowym oznaczono linie wrażliwe, szarym kontrolne, natomiast czarnym linie oporne.

Związek referencyjny przetestowany z wykorzystaniem dobranego panelu linii pokazał różnicową aktywność pomiędzy liniami opornymi i wrażliwymi, co było zaskakujące ze względu na jego dualną aktywność. Różnicową cytotoksyczność pokazali w swojej pracy także Jagani i in [83]. Otrzymany wynik może jednak świadczyć o konieczności obecności transporterów umożliwiających przejście związku Novartis do wnętrza komórki (ang. influx) lub występowania transporterów powodujących jego eliminację (ang. efflux) w niektórych liniach komórkowych wchodzących w skład panelu. Ponadto rozważano jego aktywność niezwiązaną z białkiem BRM. Potwierdzenie braku specyficzności związku wymaga jednak dalszych badań m.in. z wykorzystaniem linii komórkowych BRM-BRG1-.

Panel linii komórkowych wykorzystany w niniejszej rozprawie doktorskiej nie jest bezpośrednim odzwierciedleniem panelów opublikowanych w innych pracach badawczych, co przekłada się na jego unikalność. Jednak porównanie danych dla linii pokrywających się pokazało spójne wyniki dla związku referencyjnego oraz innego inhibitora o dualnej aktywności wobec białek BRM i BRG1 (Rycina 5-5).

Rycina 5-5. Porównanie wyników publikacyjnych z danymi uzyskanymi w rozprawie doktorskiej.

Wykorzystanie szerszego panelu linii jest konieczne w celu uzyskania większej ilości informacji o testowanych związkach. W przypadku wykorzystania jedynie panelu linii izogenicznych można by doprowadzić do selekcji cząsteczek, których aktywność będzie możliwa jedynie w linii o podłożu genetycznym komórek HT1080.

W celu wstępnego określenia, czy różnicowe działanie wyselekcjonowanych związków wobec białek BRM i BRG1 jest wystarczające do ominięcia efektu na komórki niezmienione nowotworowo, przeprowadzano test żywotności z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów (linia Wi-38). Jednak pozytywny wynik nie powinien dyskwalifikować związków do dalszych badań in vivo. Otrzymane dane są jednak ważną przesłanką dotyczącą toksyczności, która powinna być dokładnie zweryfikowana w dalszych etapach badań. Dla związku referencyjnego Novartis zgodnie z oczekiwaniami pokazano silne działanie na komórki niezmienione, co wiąże się z dualną specyficznością cząsteczki wobec BRM i BRG1.

Zmiany w poziomie biomarkerów in vitro i in vivo

Kluczowe z punktu widzenia opisywanych w tej pracy inhibitorów jest określenie nie tylko markerów predykcyjnych, lecz także wskaźników (biomarkerów) pokazujących czy dana cząsteczka podana do organizmu dotarła do miejsca docelowego (guz nowotworowy) i wywołała w nim efekt terapeutyczny. Proces poszukiwania biomarkerów przeprowadzono z wykorzystaniem linii komórkowych wrażliwych i opornych na wyciszenie genu SMARCA2 oraz technik RNAseq i ChIPseq. W pierwszym kroku wybrano geny specyficzne jedynie dla linii wrażliwych (brak zmian w linii opornej). W wyniku kolejnych eksperymentów dowiedziono, że DEG wywołane brakiem obecności białka BRM (na skutek transfekcji siRNA) w ponad 40% pokrywają się ze zmianami wywołanymi farmakologiczną inhibicją białka. Do pokrewnych wniosków doszedł w swojej pracy Jagani i in. [83]. W wyniku przeprowadzonych analiz stworzono listę genów, których przydatność zweryfikowano kolejno za pomocą metody ChIPseq. Ze względu na poufny charakter pracy nie ujawniono unikalnych nazw biomarkerów.

Metoda ChIPseq umożliwiła bowiem określenie lokalizacji kompleksu w obrębie chromatyny, co przełożyło się na możliwość oszacowania, czy zmiany ekspresji wybranych genów są pośrednio (np. poprzez działanie kompleksu PRC2 [62]) lub bezpośrednio wywołane przez kompleks SWI/SNF. Obecnie dąży się do wyboru biomarkerów bezpośrednich. Przeprowadzona analiza doprowadziła do wyboru genu KRT80, którego rola została także pokazana w literaturze [83, 84]. Wpływ kompleksu SWI/SNF, w którym funkcję katalityczną pełni białko BRM, na poziom ekspresji KRT80 został także pokazany przez inną grupę badawczą [179].

Metoda ChIPseq uwidoczniła także Biomarker 2 jako potencjalny wskaźnik w badanym układzie. Jego poziom ekspresji badany metodą qPCR był jednak na bardzo niskim poziomie, więc zdecydowano się sprawdzić poziom białka, które jest przez niego kodowane. Dodatkową zaletą odkrycia Biomarkera 2 jest jego lokalizacja zewnątrzkomórkowa, co stworzyło przesłanki o możliwości jego oznaczenia w płynnej biopsji. Badania na liniach komórkowych pokazały zależne od dawki zmiany w poziomie Biomarkera 2 w medium komórkowym, mierzone za pomocą metody AlphaLISA, lecz jego poziom w osoczu pobranym od myszy z rozwiniętymi ksenoprzeszczepami utworzonymi z komórek HT1080, HT1080 SM4KO i A549 był poniżej poziomu detekcji.

W celu oznaczenia zmian w poziomie biomarkerów, które nastąpiły po doustnym podaniu inhibitora referencyjnego stworzono ksenoprzeszczep linii A549 w myszach szczepu Athymic nude i BALB/c nude. Profil farmakokinetyczny testowanego związku pokazał relatywnie krótki czas półtrwania związku w osoczu, równy 3 godziny i 8 minut, co przełożyło się także na bardzo szybki spadek stężenia związku w guzach. Stężenie i czas obecności inhibitora w komórkach nowotworowych był jednak wystarczający, by wywołać słabe zmiany w poziomach wybranych biomarkerów farmakodynamicznych. Większe alteracje mogłyby zostać wywołane poprzez zwiększenie dawki związku, lecz nie było to możliwe ze względu na jego toksyczność, która została przedstawiona w literaturze [83].

Kaskada testów przesiewowych i ortogonalnych

Celem optymalizacji opisanych powyżej testów było określenie, czy mogą one zostać włączone do kaskady testów prowadzących do odkrycia nowych inhibitorów białka BRM. Stwierdzono, że wszystkie metody powinny znaleźć się w kaskadzie. Sekwencja eksperymentów została ustalona w taki sposób, aby umożliwić wyłonienie związków aktywnych w pierwszorzędowym teście przesiewowym, a następnie doprowadzić do wyboru finalnej, dobrze scharakteryzowanej pod kątem aktywności i selektywności działania cząsteczki wiodącej (Rycina 5-6). Wiele

wymienionych na rycinie testów przesiewowych opierało się na wykorzystaniu białek rekombinowanych, których zastosowanie jest niezbędne w początkowych etapach procesu odkrywania leków bazującego na podejściu celowanym (TDD, ang. target-based drug discovery), gdyż umożliwia wyselekcjonowanie pierwszych cząsteczek aktywnych. Jednak kluczową rolę etapów prowadzących do wyłonienia struktury wiodącej pełniły bardziej złożone modele, których rozwój został opisany w niniejszej rozprawie doktorskiej.

Rycina 5-6 Kaskada testów przesiewowych i ortogonalnych wybranych do identyfikacji i walidacji nowych inhibitorów białka BRM. Przebieg kaskady jest oparty na HTS (test biochemiczny) i dalszej analizie SAR dla potwierdzonych cząsteczek aktywnych. EPI – ang. efflux pump inhibitors, inhibitory białkowych pomp wyrzutu. Zasady testów oznaczonych gwiazdką zostały opisane w suplemencie.hBRG, mtBRG, scBRG

Zadaniem pierwszej grupy testów biochemicznych i biofizycznych było wyłonienie cząsteczek hamujących aktywność ATPazową i helikazową białka BRM, jednocześnie których działanie wobec białek hBRG1, mtBRM i scBRM (Suplement, Rozdział uzupełniający 1.2) byłoby na niższym poziomie. Określenie różnicowości cząsteczek pomiędzy białkiem BRM i BRG1 było kluczowe już we wstępnych etapach kaskady. Oczekiwano także, że wybrane związki nie będą interkalować z DNA oraz nie będą wykazywać kompetycji z ATP.

Po przeprowadzeniu pierwszego etapu kaskady możliwe jest wykonanie testów ortogonalnych umożliwiających określenie oddziaływania wyselekcjonowanych cząsteczek z rekombinowanym białkiem BRM (m.in. Zmodyfikowana metoda Thermal Shift) lub białkiem BRM z lizatu komórek HT1080 (CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego). Ta metodyka nie znalazła się w grupie testów przesiewowych, gdyż brak potwierdzenia oddziaływania za pomocą testów ortogonalnych nie dyskwalifikował związków z dalszych badań. Drugi etap kaskady miał na celu określenie wstępnych parametrów ADME takich jak rozpuszczalność i stabilność wyselekcjonowanych cząsteczek, gdyż w kolejnych doświadczeniach nie stosowano stężeń związków powyżej zakresu rozpuszczalności. Ponadto etap II wymagał spełnienia odpowiednich parametrów określających lipofilowość wyselekcjonowanych cząsteczek oraz w przypadku nowych serii chemicznych pozytywnego wyniku testu wnikania związku do komórek. Dla cząsteczek przechodzących przez błonę komórkową możliwe było wykonanie testu na potwierdzenie oddziaływania z białkiem BRM w komórkach (CETSA z wykorzystaniem żywych komórek). W etapie trzecim odrzucane były związki, które nie wywoływały zmian w poziomach biomarkerów oraz te, których wpływ na żywotność panelu linii izogenicznych nie klasyfikował w obrębie potencjalnych inhibitorów białka BRM. Równolegle sprawdzano czy wpływ związków na żywotność linii komórkowych opornych i wrażliwych jest różnicowy. Określano także przesunięcie pomiędzy średnią wartością EC50 dla linii nowotworowych, a EC50 dla komórek normalnych, tj. fibroblastów Wi-38, co stanowiło wstępną informację toksykologiczną (etap IV). W tym etapie określano też pozostałe parametry ADME. Natomiast w ostatnim kroku przeprowadzano badania farmakokinetyczne i farmakodynamiczne in vivo.

W wyniku przeprowadzenia opisanej kaskady oczekiwano uzyskania związków selektywnych wobec białka BRM, których aktywność i specyficzność działania została określona w testach biochemicznych, biofizycznych, komórkowych oraz doświadczeniach in vivo. Jednakże, biblioteki cząsteczek, które zostały przetestowane przez firmę Ryvu Therapeutics nie doprowadziły do wyłonienia małocząsteczkowych związków, których aktywność wobec białka BRG1 byłaby na tyle niska by umożliwić dalszy ich rozwój. Projekt dotyczący rozwoju związków małocząsteczkowych został zawieszony, lecz pracownicy firmy Ryvu Therapeutics podczas konferencji AACR pokazali pierwsze wyniki dotyczące rozwoju selektywnych związków typu PROTAC [180], które opisano również we wstępie pracy. W przeciwieństwie do klasycznych inhibitorów drobnocząsteczkowych, degradacja sterowana przez PROTAC ma charakter substechiometryczny, a zatem wymaga niższych ekspozycji ogólnoustrojowych, aby osiągnąć skuteczność. Cząsteczki typu PROTAC wykazują także

wyższy stopień selektywności niż sam docelowy ligand, co wynika z różnic w tworzeniu kompleksu trójskładnikowego z poszczególnymi białkami. Co więcej, dodatkowa selektywność może zostać uzyskana dzięki braku ograniczenia miejsca wiązania jedynie do domeny białkowej funkcjonalnie odpowiedzialnej za jednostkę chorobową (Domena ATPazowo-helikazowa białka BRM) [181, 182].

Metoda umożliwiająca selekcję związków małocząsteczkowych celujących w nieopisany dotychczas cel molekularny (podejście fenotypowe).

W celu stworzenia metody umożliwiającej odkrycie innych niż inhibitory białka BRM związków powodujących spadek żywotności komórek, w których nie wykryto obecności białka BRG1, zdecydowano się na wykorzystanie podejścia fenotypowego. Proces odkrywania cząsteczek terapeutycznych bazujący na podejściu fenotypowym (PDD) nie jest nowym podejściem, ale w ostatnim czasie ponownie pojawił się jako alternatywna platforma badań nad rozwojem nowych leków [183]. PDD zostało opisane w literaturze przez wielu autorów jako podejście pozwalające na ominięcie niskiej produktywności procesu TDD [184]. W ramach rozprawy zastosowanie PDD było możliwe dzięki stworzeniu pary linii izogenicznych HT1080 i HT1080 SM4KO oraz zoptymalizowaniu z ich wykorzystaniem wysokoprzepustowego fenotypowego testu przesiewowego. Założeniem testu było umożliwienie wyłonienia związków wpływających różnicowo na żywotność wspomnianych linii komórkowych. W tym celu określono warunki testu przesiewowego (etapy, punkty stężeniowe) i opisano algorytm pozwalający na odsianie związków nieaktywnych, wykazujących zbliżone działanie na obie testowane linie komórkowe oraz wpływających silniej na żywotność komórek HT1080. Dalsza dyskusja na temat przydatności zoptymalizowanego testu wymaga przeprowadzenia kampanii testu przesiewowego na większej bibliotece związków oraz analizy otrzymanych wyników pod kątem określenia ich celu terapeutycznego.

Podsumowanie i wnioski końcowe

W wyniku otrzymanych w pracy rezultatów udało się zrealizować postawione cele badawcze, które obejmowały:

Opracowanie koncepcji strategicznej projektu rozwijanego zgodnie z podejściem celowanym.

Zoptymalizowanie metodyki umożliwiającej selekcję i charakterystykę związków małocząsteczkowych celujących w określony cel molekularny (podejście celowane).

Zoptymalizowanie metody umożliwiającej selekcję związków małocząsteczkowych celujących w nieopisany dotychczas cel molekularny (podejście alternatywne, fenotypowe).

Badania prowadzone w ramach podejścia celowanego doprowadziły do określenia celu (Domena ATPazowo-helikazowa białka BRM) i wskazania terapeutycznego (niedrobnokomórkowy rak płuca, w którym nie pokazano obecności białka BRG1 oraz udowodniono obecność białka BRM). Zoptymalizowana w ramach rozprawy metodyka została uwzględniona w kaskadzie testów przesiewowych i ortogonalnych umożliwiających określenie nie tylko efektywności, lecz także selektywności nowych cząsteczek:

Metody sprawdzające wpływ związków na stabilność temperaturową białek BRM/BRG1 (Zmodyfikowana metoda Thermal Shift, CETSA z wykorzystaniem lizatu komórkowego, CETSA z wykorzystaniem żywych komórek);

Test wnikania związku do komórek;

Test wpływu związku na żywotność linii izogenicznych oraz komórek wchodzących w skład panelu linii (w sumie 23 linie komórkowe).

Wpływ związku na poziom Biomarkera 2 oraz ekspresji KRT80 in vitro;

Wpływ związku na poziom Biomarkera 2 oraz ekspresji KRT80 in vivo;

W oparciu o dane dotyczące wysokiego ryzyka związanego z rozwojem selektywnych inhibitorów białka BRM (wysoka homologia białek katalitycznych kompleksu SWI/SNF) zdecydowano się także wykroczyć poza wstępne założenia projektu i rozwinięto wysokoprzepustowy fenotypowy test przesiewowy umożliwiający wyłonienie nieopisanych dotychczas nowych celów terapeutycznych i cząsteczek z nimi oddziałujących.

Wyniki tych badań mogą mieć duże znaczenie kliniczne stwarzając nowe możliwości terapii skierowanej do pacjentów z nowotworami charakteryzującymi się niefunkcjonalnym białkiem BRG1.

Spis Literatury

Grunstein M (1990) Nucleosomes: regulators of transcription. Trends Genet TIG 6:395–400. https://doi.org/10.1016/0168-9525(90)90299-l

Svaren J, Chalkley R (1990) The structure and assembly of active chromatin. Trends Genet 6:52–56. https://doi.org/10.1016/0168-9525(90)90074-G

Morse RH (1989) Nucleosomes inhibit both transcriptional initiation and elongation by RNA polymerase III in vitro. EMBO J 8:2343–2351

Lorch Y, LaPointe JW, Kornberg RD (1987) Nucleosomes inhibit the initiation of transcription but allow chain elongation with the displacement of histones. Cell 49:203–210. https://doi.org/10.1016/0092-8674(87)90561-7

Wolffe AP (1994) Nucleosome positioning and modification: chromatin structures that potentiate transcription. Trends Biochem Sci 19:240–244. https://doi.org/10.1016/0968-0004(94)90148-1

Sacharowski SP, Sarnowski TJ (2019) Mechanizmy kontrolujące strukturę chromatyny. Postępy Biochem 65:9–20. https://doi.org/10.18388/pb.2019_252

Lee JJ, Murphy GF, Lian CG (2014) Melanoma epigenetics: novel mechanisms, markers, and medicines. Lab Invest 94:822–838. https://doi.org/10.1038/labinvest.2014.87

Sobczak M, Strachowska M, Robaszkiewicz A (2020) Udział kompleksów SWI/SNF opartych na aktywności BRG1 w determinowaniu fenotypu komórek nowotworowych: Rola BRG1 w nowotworach. Postępy Biochem 66:10–18. https://doi.org/10.18388/pb.2020_312

Stern M, Jensen R, Herskowitz I (1984) Five SW Genes are Required for Expression HO Gene in Yeast. J Mol Biol 178:853–868

Neigeborn L, Carlson M (1984) Genes affecting the regulation of SUC2 gene expression by glucose repression in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 108:845–58

Kennison JA, Tamkun JW (1988) Dosage-dependent modifiers of polycomb and antennapedia mutations in Drosophila. Proc Natl Acad Sci 85:8136–8140. https://doi.org/10.1073/pnas.85.21.8136

Tamkun JW, Deuring R, Scott MP, et al (1992) brahma: A regulator of Drosophila homeotic genes structurally related to the yeast transcriptional activator SNF2SWI2. Cell 68:561–572. https://doi.org/10.1016/0092-8674(92)90191-E

Muchardt C, Yaniv M (1993) A human homologue of Saccharomyces cerevisiae SNF2/SWI2 and Drosophila brm genes potentiates transcriptional activation by the glucocorticoid receptor. EMBO J 12:4279–4290

Khavari PA, Peterson CL, Tamkun JW, et al (1993) BRG1 contains a conserved domain of the SWI2/SNF2 family necessary for normal mitotic growth and transcription. Nature 366:170–174. https://doi.org/10.1038/366170a0

Kwon H, Imbalzano AN, Khavari PA, et al (1994) Nucleosome disruption and enhancement of activator binding by a human SW1/SNF complex. Nature 370:477– 481. https://doi.org/10.1038/370477a0

Mohrmann L, Verrijzer CP (2005) Composition and functional specificity of SWI2/SNF2 class chromatin remodeling complexes. Biochim Biophys Acta BBA - Gene Struct Expr 1681:59–73. https://doi.org/10.1016/j.bbaexp.2004.10.005

Nemes K, Frühwald MC (2018) Emerging therapeutic targets for the treatment of malignant rhabdoid tumors. Expert Opin Ther Targets 22:365–379. https://doi.org/10.1080/14728222.2018.1451839

Innis SM, Cabot B (2020) GBAF, a small BAF sub-complex with big implications: a systematic review. Epigenetics Chromatin 13:48. https://doi.org/10.1186/s13072-020- 00370-8

Ribeiro-Silva C, Vermeulen W, Lans H (2019) SWI/SNF: complex complexes in genome stability and cancer. DNA Repair. https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2019.03.007

Alpsoy A, Dykhuizen EC (2018) Glioma tumor suppressor candidate region gene 1 (GLTSCR1) and its paralog GLTSCR1-like form SWI/SNF chromatin remodeling subcomplexes. J Biol Chem 293:3892–3903. https://doi.org/10.1074/jbc.RA117.001065

Wilson BG, Roberts CWM (2011) SWI/SNF nucleosome remodellers and cancer. Nat Rev Cancer 11:481–492. https://doi.org/10.1038/nrc3068

Mashtalir N, D’Avino AR, Michel BC, et al (2018) Modular Organization and Assembly of SWI/SNF Family Chromatin Remodeling Complexes. Cell 175:1272- 1288.e20. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.09.032

Pulice JL, Kadoch C (2016) Composition and Function of Mammalian SWI/SNF Chromatin Remodeling Complexes in Human Disease. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 81:53–60. https://doi.org/10.1101/sqb.2016.81.031021

Hodges C, Kirkland JG, Crabtree GR (2016) The Many Roles of BAF (mSWI/SNF) and PBAF Complexes in Cancer. Cold Spring Harb Perspect Med 6:a026930. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a026930

Wang X, Wang S, Troisi EC, et al (2019) BRD9 defines a SWI/SNF sub-complex and constitutes a specific vulnerability in malignant rhabdoid tumors. Nat Commun 10:1881. https://doi.org/10.1038/s41467-019-09891-7

Wilson BG, Roberts CWM (2011) SWI/SNF nucleosome remodellers and cancer. Nat Rev Cancer 11:481–492. https://doi.org/10.1038/nrc3068

Olszewska MJ NUKLEOSOMY I REGULACJA AKTYWNOŒCI CHROMATYNY. 14

Clapier CR, Cairns BR (2009) The biology of chromatin remodeling complexes. Annu Rev Biochem 78:273–304. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.77.062706.153223

Clapier CR, Iwasa J, Cairns BR, Peterson CL (2017) Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol 18:407–422. https://doi.org/10.1038/nrm.2017.26

Hassan AH, Awad S, Prochasson P (2006) The Swi2/Snf2 bromodomain is required for the displacement of SAGA and the octamer transfer of SAGA-acetylated nucleosomes. J Biol Chem 281:18126–18134. https://doi.org/10.1074/jbc.M602851200

Awad S, Hassan AH (2008) The Swi2/Snf2 bromodomain is important for the full binding and remodeling activity of the SWI/SNF complex on H3- and H4-acetylated nucleosomes. Ann N Y Acad Sci 1138:366–375. https://doi.org/10.1196/annals.1414.038

Horn PJ, Peterson CL (2001) The bromodomain: a regulator of ATP-dependent chromatin remodeling? Front Biosci J Virtual Libr 6:D1019-1023. https://doi.org/10.2741/horn

Vangamudi B, Paul TA, Shah PK, et al (2015) The SMARCA2/4 ATPase Domain Surpasses the Bromodomain as a Drug Target in SWI/SNF-Mutant Cancers: Insights from cDNA Rescue and PFI-3 Inhibitor Studies. Cancer Res 75:3865–3878. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-14-3798

Fedorov O, Castex J, Tallant C, et al (2015) Selective targeting of the BRG/PB1 bromodomains impairs embryonic and trophoblast stem cell maintenance. Sci Adv 1:e1500723. https://doi.org/10.1126/sciadv.1500723

Oike T, Ogiwara H, Tominaga Y, et al (2013) A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res 73:5508–5518. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-12-4593

Allen MD, Bycroft M, Zinzalla G (2020) Structure of the BRK domain of the SWI/SNF chromatin remodeling complex subunit BRG1 reveals a potential role in protein–protein interactions. Protein Sci 29:1033–1039. https://doi.org/10.1002/pro.3820

Wu Q, Lian JB, Stein JL, et al (2017) The BRG1 ATPase of human SWI/SNF chromatin remodeling enzymes as a driver of cancer. Epigenomics 9:919–931. https://doi.org/10.2217/epi-2017-0034

Ho PJ, Lloyd SM, Bao X (2019) Unwinding chromatin at the right places: how BAF is targeted to specific genomic locations during development. Development 146:. https://doi.org/10.1242/dev.178780

Yun M, Wu J, Workman JL, Li B (2011) Readers of histone modifications. Cell Res 21:564–578. https://doi.org/10.1038/cr.2011.42

Patel DJ, Wang Z (2013) Readout of epigenetic modifications. Annu Rev Biochem 82:81–118. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-072711-165700

Wang Y, Han Y, Fan E, Zhang K (2015) Analytical strategies used to identify the readers of histone modifications: A review. Anal Chim Acta 891:32–42. https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.06.049

Wang R-R, Pan R, Zhang W, et al (2018) The SWI/SNF chromatin-remodeling factors BAF60a, b, and c in nutrient signaling and metabolic control. Protein Cell 9:207–215. https://doi.org/10.1007/s13238-017-0442-2

Gadaleta RM, Magnani L (2014) Nuclear receptors and chromatin: an inducible couple. J Mol Endocrinol 52:R137–R149. https://doi.org/10.1530/JME-13-0170

Belandia B, Orford RL, Hurst HC, Parker MG (2002) Targeting of SWI/SNF chromatin remodelling complexes to estrogen-responsive genes. EMBO J 21:4094–4103. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf412

Jeong KW, Lee Y-H, Stallcup MR (2009) Recruitment of the SWI/SNF Chromatin Remodeling Complex to Steroid Hormone-regulated Promoters by Nuclear Receptor Coactivator Flightless-I *. J Biol Chem 284:29298–29309. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.037010

Wallberg AE, Neely KE, Hassan AH, et al (2000) Recruitment of the SWI-SNF Chromatin Remodeling Complex as a Mechanism of Gene Activation by the Glucocorticoid Receptor τ1 Activation Domain. Mol Cell Biol 20:2004–2013

Nagaich AK, Walker DA, Wolford R, Hager GL (2004) Rapid Periodic Binding and Displacement of the Glucocorticoid Receptor during Chromatin Remodeling. Mol Cell 14:163–174. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(04)00178-9

Grøntved L, Hager GL (2012) Impact of chromatin structure on PR signaling: Transition from local to global analysis. Mol Cell Endocrinol 357:30–36. https://doi.org/10.1016/j.mce.2011.09.006

Peng G, Yim E-K, Dai H, et al (2009) BRIT1/MCPH1 Links Chromatin Remodeling to DNA Damage Response. Nat Cell Biol 11:865–872. https://doi.org/10.1038/ncb1895

Neve B, Jonckheere N, Vincent A, Van Seuningen I (2020) Long non-coding RNAs: the tentacles of chromatin remodeler complexes. Cell Mol Life Sci. https://doi.org/10.1007/s00018-020-03646-0

Grossi E, Raimondi I, Goñi E, et al (2020) A lncRNA-SWI/SNF complex crosstalk controls transcriptional activation at specific promoter regions. Nat Commun 11:936. https://doi.org/10.1038/s41467-020-14623-3

Flynn RA, Do BT, Rubin AJ, et al (2016) 7SK-BAF axis controls pervasive transcription at enhancers. Nat Struct Mol Biol 23:231–238. https://doi.org/10.1038/nsmb.3176

Leisegang MS, Bibli S-I, Günther S, et al (2019) Pleiotropic effects of laminar flow and statins depend on the Krüppel-like factor-induced lncRNA MANTIS. Eur Heart J 40:2523–2533. https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehz393

Jégu T, Blum R, Cochrane JC, et al (2019) Xist RNA antagonizes the SWI/SNF chromatin remodeler BRG1 on the inactive X chromosome. Nat Struct Mol Biol 26:96– 109. https://doi.org/10.1038/s41594-018-0176-8

Chen Z, Gao Y, Yao L, et al (2018) LncFZD6 initiates Wnt/β-catenin and liver TIC self-renewal through BRG1-mediated FZD6 transcriptional activation. Oncogene 37:3098–3112. https://doi.org/10.1038/s41388-018-0203-6

Zhao K, Wang W, Rando OJ, et al (1998) Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling. Cell 95:625–636. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)81633-5

Rando OJ, Zhao K, Janmey P, Crabtree GR (2002) Phosphatidylinositol-dependent actin filament binding by the SWI/SNF-like BAF chromatin remodeling complex. Proc Natl Acad Sci U S A 99:2824–2829. https://doi.org/10.1073/pnas.032662899

Wang X, Haswell JR, Roberts CWM (2014) Molecular pathways: SWI/SNF (BAF) complexes are frequently mutated in cancer--mechanisms and potential therapeutic insights. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res 20:21–27. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-0280

Helming KC, Wang X, Roberts CWM (2014) Vulnerabilities of mutant SWI/SNF complexes in cancer. Cancer Cell 26:309–317. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2014.07.018

Shain AH, Pollack JR (2013) The Spectrum of SWI/SNF Mutations, Ubiquitous in Human Cancers. PLoS ONE 8:e55119. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0055119

Kadoch C, Hargreaves DC, Hodges C, et al (2013) Proteomic and bioinformatic analysis of mammalian SWI/SNF complexes identifies extensive roles in human malignancy. Nat Genet 45:592–601. https://doi.org/10.1038/ng.2628

Pyziak K, Sroka-Porada A, Rzymski T, et al (2021) Potential of enhancer of zeste homolog 2 inhibitors for the treatment of SWI/SNF mutant cancers and tumor microenvironment modulation. Drug Dev Res. https://doi.org/10.1002/ddr.21796

Zehir A, Benayed R, Shah RH, et al (2017) Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospective clinical sequencing of 10,000 patients. Nat Med 23:703–713. https://doi.org/10.1038/nm.4333

Morel D, Almouzni G, Soria J-C, Postel-Vinay S (2016) Targeting chromatin defects in selected solid tumors based on oncogene addiction, synthetic lethality and epigenetic antagonism. Ann Oncol mdw552. https://doi.org/10.1093/annonc/mdw552

Pagliarini R, Shao W, Sellers WR (2015) Oncogene addiction: pathways of therapeutic response, resistance, and road maps toward a cure. EMBO Rep 16:280–296. https://doi.org/10.15252/embr.201439949

Schick S, Rendeiro AF, Runggatscher K, et al (2019) Systematic characterization of BAF mutations provides insights into intra-complex synthetic lethalities in human cancers. Nat Genet 51:1399–1410. https://doi.org/10.1038/s41588-019-0477-9

Sasaki M, Ogiwara H (2020) Synthetic lethal therapy based on targeting the vulnerability of SWI/SNF chromatin remodeling complex‐deficient cancers. Cancer Sci 111:774–782. https://doi.org/10.1111/cas.14311

Hoffman GR, Rahal R, Buxton F, et al (2014) Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proc Natl Acad Sci 111:3128–3133. https://doi.org/10.1073/pnas.1316793111

Michel BC, D’Avino AR, Cassel SH, et al (2018) A non-canonical SWI/SNF complex is a synthetic lethal target in cancers driven by BAF complex perturbation. Nat Cell Biol 20:1410–1420. https://doi.org/10.1038/s41556-018-0221-1

Helming KC, Wang X, Wilson BG, et al (2014) ARID1B is a specific vulnerability in ARID1A-mutant cancers. Nat Med 20:251–254. https://doi.org/10.1038/nm.3480

The Cancer Genome Atlas Research Network (2014) Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature 511:543–550. https://doi.org/10.1038/nature13385

Medina PP, Carretero J, Fraga MF, et al (2004) Genetic and Epigenetic screening for gene alterations of the chromatin-remodeling factor, SMARCA4/BRG1, in lung tumors. Genes Chromosomes Cancer 41:170–177. https://doi.org/10.1002/gcc.20068

Jelinic P, Mueller JJ, Olvera N, et al (2014) Recurrent SMARCA4 mutations in small cell carcinoma of the ovary. Nat Genet 46:424–426. https://doi.org/10.1038/ng.2922

Ramos P, Karnezis AN, Craig DW, et al (2014) Small cell carcinoma of the ovary, hypercalcemic type, displays frequent inactivating germline and somatic mutations in SMARCA4. Nat Genet 46:427–429. https://doi.org/10.1038/ng.2928

Pugh TJ, Weeraratne SD, Archer TC, et al (2012) Medulloblastoma exome sequencing uncovers subtype-specific somatic mutations. Nature 488:106–110. https://doi.org/10.1038/nature11329

Love C, Sun Z, Jima D, et al (2012) The genetic landscape of mutations in Burkitt lymphoma. Nat Genet 44:1321–1325. https://doi.org/10.1038/ng.2468

Wong AK, Shanahan F, Chen Y, et al (2000) BRG1, a component of the SWI-SNF complex, is mutated in multiple human tumor cell lines. Cancer Res 60:6171–6177

Naito T, Umemura S, Nakamura H, et al (2019) Successful treatment with nivolumab for SMARCA4‐deficient non‐small cell lung carcinoma with a high tumor mutation burden: A case report. Thorac Cancer 10:1285–1288. https://doi.org/10.1111/1759- 7714.13070

Reyes, Barra, J, Muchardt, C, et al (1998) Altered control of cellular proliferation in the absence of mammalian brahma (SNF2alpha). EMBO J 17:6979–91. https://doi.org/10.1093/emboj/17.23.6979

Bultman, Gebuhr, Tom, Yee, Della, et al (2000) A Brg1 Null Mutation in the Mouse Reveals Functional Differences among Mammalian SWI / SNF Complexes. Mol Cell 6:1287–1295. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(00)00127-1

Holik AZ, Krzystyniak J, Young M, et al (2013) Brg1 is required for stem cell maintenance in the murine intestinal epithelium in a tissue-specific manner. Stem Cells Dayt Ohio 31:2457–2466. https://doi.org/10.1002/stem.1498

Jagani Z, Hoffman G, Stegmeier FP, Mickanin CS (2018) Biomarkers Associated with BRM inhibition, Patent US20160032402A1

Jagani Z, Chenail G, Xiang K, et al (2019) In-Depth Characterization and Validation in BRG1-Mutant Lung Cancers Define Novel Catalytic Inhibitors of SWI/SNF Chromatin Remodeling. bioRxiv 812628. https://doi.org/10.1101/812628

Papillon JPN, Nakajima K, Adair CD, et al (2018) Discovery of Orally Active Inhibitors of Brahma Homolog (BRM)/SMARCA2 ATPase Activity for the Treatment of Brahma Related Gene 1 (BRG1)/SMARCA4-Mutant Cancers. J Med Chem 61:10155–10172. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.8b01318

Bultman SJ, Holley DW, G de Ridder G, et al (2016) BRG1 and BRM SWI/SNF ATPases redundantly maintain cardiomyocyte homeostasis by regulating cardiomyocyte mitophagy and mitochondrial dynamics in vivo. Cardiovasc Pathol Off J Soc Cardiovasc Pathol 25:258–269. https://doi.org/10.1016/j.carpath.2016.02.004

Willis MS, Holley DW, Wang Z, et al (2017) BRG1 and BRM function antagonistically with c-MYC in adult cardiomyocytes to regulate conduction and contractility. J Mol Cell Cardiol 105:99–109. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2017.02.003

Willis MS, Homeister JW, Rosson GB, et al (2012) Functional redundancy of SWI/SNF catalytic subunits in maintaining vascular endothelial cells in the adult heart. Circ Res 111:e111-122. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.112.265587

Pfister SX, Ashworth A (2017) Marked for death: targeting epigenetic changes in cancer. Nat Rev Drug Discov 16:241–263. https://doi.org/10.1038/nrd.2016.256

Xue Y, Meehan B, Fu Z, et al (2019) SMARCA4 loss is synthetic lethal with CDK4/6 inhibition in non-small cell lung cancer. Nat Commun 10:557. https://doi.org/10.1038/s41467-019-08380-1

Tagal V, Wei S, Zhang W, et al (2017) SMARCA4-inactivating mutations increase sensitivity to Aurora kinase A inhibitor VX-680 in non-small cell lung cancers. Nat Commun 8:. https://doi.org/10.1038/ncomms14098

Huang A, Garraway LA, Ashworth A, Weber B (2020) Synthetic lethality as an engine for cancer drug target discovery. Nat Rev Drug Discov 19:23–38. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0046-z

Hyman DM, Taylor BS, Baselga J (2017) Implementing Genome-Driven Oncology. Cell 168:584–599. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.12.015

O’Neil NJ, Bailey ML, Hieter P (2017) Synthetic lethality and cancer. Nat Rev Genet 18:613–623. https://doi.org/10.1038/nrg.2017.47

LaFargue CJ, Dal Molin GZ, Sood AK, Coleman RL (2019) Exploring and comparing adverse events between PARP inhibitors. Lancet Oncol 20:e15–e28. https://doi.org/10.1016/S1470-2045(18)30786-1

Fong PC, Boss DS, Yap TA, et al (2009) Inhibition of Poly(ADP-Ribose) Polymerase in Tumors from BRCA Mutation Carriers. N Engl J Med 361:123–134. https://doi.org/10.1056/NEJMoa0900212

Macarron R, Banks MN, Bojanic D, et al (2011) Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov 10:188–195. https://doi.org/10.1038/nrd3368

Murray CW, Rees DC (2009) The rise of fragment-based drug discovery. Nat Chem 1:187–192. https://doi.org/10.1038/nchem.217

Li Q (2020) Application of Fragment-Based Drug Discovery to Versatile Targets. Front Mol Biosci 7:. https://doi.org/10.3389/fmolb.2020.00180

Prieto-Martínez FD, López-López E, Eurídice Juárez-Mercado K, Medina-Franco JL (2019) Chapter 2 - Computational Drug Design Methods—Current and Future Perspectives. In: Roy K (ed) In Silico Drug Design. Academic Press, pp 19–44

Katsila T, Spyroulias GA, Patrinos GP, Matsoukas M-T (2016) Computational approaches in target identification and drug discovery. Comput Struct Biotechnol J 14:177–184. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2016.04.004

Hughes JP, Rees S, Kalindjian SB, Philpott KL (2011) Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol 162:1239–1249. https://doi.org/10.1111/j.1476- 5381.2010.01127.x

Mavromoustakos T, Durdagi S, Koukoulitsa C, et al (2011) Strategies in the rational drug design. Curr Med Chem 18:2517–2530. https://doi.org/10.2174/092986711795933731

Mandal S, Moudgil M, Mandal SK (2009) Rational drug design. Eur J Pharmacol 625:90–100. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2009.06.065

Fedorov O, Castex J, Tallant C, et al (2015) Selective targeting of the BRG/PB1 bromodomains impairs embryonic and trophoblast stem cell maintenance. Sci Adv 1:e1500723. https://doi.org/10.1126/sciadv.1500723

Carmony KC, Kim KB (2012) PROTAC-induced proteolytic targeting. Methods Mol Biol 832:627–638. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-474-2_44

Li X, Song Y (2020) Proteolysis-targeting chimera (PROTAC) for targeted protein degradation and cancer therapy. J Hematol OncolJ Hematol Oncol 13:50. https://doi.org/10.1186/s13045-020-00885-3

Farnaby W, Koegl M, Roy MJ, et al (2019) BAF complex vulnerabilities in cancer demonstrated via structure-based PROTAC design. Nat Chem Biol 15:672–680. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0294-6

Swinney DC, Lee JA (2020) Recent advances in phenotypic drug discovery. F1000Research 9:. https://doi.org/10.12688/f1000research.25813.1

Kubota K, Funabashi M, Ogura Y (2019) Target deconvolution from phenotype-based drug discovery by using chemical proteomics approaches. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics 1867:22–27. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2018.08.002

Gao J, Aksoy BA, Dogrusoz U, et al (2013) Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal 6:pl1. https://doi.org/10.1126/scisignal.2004088

Meyers RM, Bryan JG, McFarland JM, et al (2017) Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR–Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nat Genet 49:1779–1784. https://doi.org/10.1038/ng.3984

McFarland JM, Ho ZV, Kugener G, et al (2018) Improved estimation of cancer dependencies from large-scale RNAi screens using model-based normalization and data integration. Nat Commun 9:4610. https://doi.org/10.1038/s41467-018-06916-5

Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337:816–821. https://doi.org/10.1126/science.1225829

Costa JR, Bejcek BE, McGee JE, et al (2004) Genome Editing Using Engineered Nucleases and Their Use in Genomic Screening. In: Sittampalam GS, Grossman A, Brimacombe K, et al (eds) Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD)

Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans. Nature 391:806–811. https://doi.org/10.1038/35888

Hattori Y (2017) Progress in the development of Lipoplex and Polyplex modified with Anionic Polymer for efficient Gene Delivery. J Genet Med Gene Ther 1:003–018

Weil D, Garçon L, Harper M, et al (2002) Targeting the kinesin Eg5 to monitor siRNA transfection in mammalian cells. BioTechniques 33:1244–1248. https://doi.org/10.2144/02336st01

Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods 25:402–408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262

Wang Z, Gerstein M, Snyder M (2009) RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet 10:57–63. https://doi.org/10.1038/nrg2484

Lahens NF, Ricciotti E, Smirnova O, et al (2017) A comparison of Illumina and Ion Torrent sequencing platforms in the context of differential gene expression. BMC Genomics 18:602. https://doi.org/10.1186/s12864-017-4011-0

Golan D, Medvedev P (2013) Using state machines to model the Ion Torrent sequencing process and to improve read error rates. Bioinformatics 29:i344–i351. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt212

Dart ML, Machleidt T, Jost E, et al (2018) Homogeneous Assay for Target Engagement Utilizing Bioluminescent Thermal Shift. ACS Med Chem Lett 9:546–551. https://doi.org/10.1021/acsmedchemlett.8b00081

Brandts JF, Lin LN (1990) Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry 29:6927–6940. https://doi.org/10.1021/bi00481a024

Crothers DM (1971) Statistical thermodynamics of nucleic acid melting transitions with coupled binding equilibria. Biopolymers 10:2147–2160. https://doi.org/10.1002/bip.360101110

Schellman JA (1975) Macromolecular binding. Biopolymers 14:999–1018. https://doi.org/10.1002/bip.1975.360140509

Matulis D, Kranz JK, Salemme FR, Todd MJ (2005) Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor. Biochemistry 44:5258–5266. https://doi.org/10.1021/bi048135v

Molina DM, Jafari R, Ignatushchenko M, et al (2013) Monitoring Drug Target Engagement in Cells and Tissues Using the Cellular Thermal Shift Assay. Science 341:84–87. https://doi.org/10.1126/science.1233606

Jafari R, Almqvist H, Axelsson H, et al (2014) The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nat Protoc 9:2100–2122. https://doi.org/10.1038/nprot.2014.138

Datta J, Ghoshal K, Denny WA, et al (2009) A New Class of Quinoline-Based DNA Hypomethylating Agents Reactivates Tumor Suppressor Genes by Blocking DNA Methyltransferase 1 Activity and Inducing Its Degradation. Cancer Res 69:4277–4285. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-08-3669

Yoo J, Choi S, Medina-Franco JL (2013) Molecular modeling studies of the novel inhibitors of DNA methyltransferases SGI-1027 and CBC12: implications for the mechanism of inhibition of DNMTs. PloS One 8:e62152. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062152

Oprea-Lager DE, Kanten MP van, Moorselaar RJA van, et al (2015) [ 18 F]Fluoromethylcholine as a Chemotherapy Response Read-Out in Prostate Cancer Cells. Mol Imaging Biol 17:319–327. https://doi.org/10.1007/s11307-014-0803-7

Lu Y, Shen Y, Warren W, Walter R (2016) Next Generation Sequencing in Aquatic Models. IntechOpen

Beaudet L, Rodriguez-Suarez R, Venne M-H, et al (2008) AlphaLISA immunoassays: the no-wash alternative to ELISAs for research and drug discovery. Nat Methods 5:an8–an9. https://doi.org/10.1038/nmeth.f.230

Zhang J-H, Chung TDY, Oldenburg KR (1999) A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen 4:67–73. https://doi.org/10.1177/108705719900400206

Iversen PW, Beck B, Chen Y-F, et al HTS Assay Validation. 31

Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR (1999) A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen 4:67–73. https://doi.org/10.1177/108705719900400206

Bruno S, Ardelt B, Skierski JS, et al (1992) Different effects of staurosporine, an inhibitor of protein kinases, on the cell cycle and chromatin structure of normal and leukemic lymphocytes. Cancer Res 52:470–473

Chae H-J, Kang J-S, Byun J-O, et al (2000) Molecular mechanism of staurosporine- induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacol Res 42:373–381. https://doi.org/10.1006/phrs.2000.0700

Tanramluk D, Schreyer A, Pitt WR, Blundell TL (2009) On the Origins of Enzyme Inhibitor Selectivity and Promiscuity: A Case Study of Protein Kinase Binding to Staurosporine. Chem Biol Drug Des 74:16–24. https://doi.org/10.1111/j.1747- 0285.2009.00832.x

Zhang XD (2007) A New Method with Flexible and Balanced Control of False Negatives and False Positives for Hit Selection in RNA Interference High-Throughput Screening Assays. J Biomol Screen 12:645–655. https://doi.org/10.1177/1087057107300645

Zhang XD, Ferrer M, Espeseth AS, et al (2007) The Use of Strictly Standardized Mean Difference for Hit Selection in Primary RNA Interference High-Throughput Screening Experiments. J Biomol Screen 12:497–509. https://doi.org/10.1177/1087057107300646

Brideau C, Gunter B, Pikounis B, Liaw A (2003) Improved statistical methods for hit selection in high-throughput screening. J Biomol Screen 8:634–647. https://doi.org/10.1177/1087057103258285

Liu X, Vogt I, Haque T, Campillos M (2013) HitPick: a web server for hit identification and target prediction of chemical screenings. Bioinformatics 29:1910– 1912. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt303

Malo N, Hanley JA, Cerquozzi S, et al (2006) Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol 24:167–175. https://doi.org/10.1038/nbt1186

Dagogo-Jack I, Schrock AB, Kem M, et al (2020) Clinicopathologic Characteristics of BRG1-Deficient NSCLC. J Thorac Oncol 15:766–776. https://doi.org/10.1016/j.jtho.2020.01.002

Trotter KW, Archer TK (2008) The BRG1 transcriptional coregulator. Nucl Recept Signal 6:. https://doi.org/10.1621/nrs.06004

Wu Q, Lian JB, Stein JL, et al (2017) The BRG1 ATPase of human SWI/SNF chromatin remodeling enzymes as a driver of cancer. Epigenomics 9:919–931. https://doi.org/10.2217/epi-2017-0034

Wong AKC, Shanahan F, Chen Y, et al (2000) BRG1, a Component of the SWI-SNF Complex, Is Mutated in Multiple Human Tumor Cell Lines. Cancer Res 60:6171–6177

Watanabe H, Mizutani T, Haraguchi T, et al (2006) SWI/SNF complex is essential for NRSF-mediated suppression of neuronal genes in human nonsmall cell lung carcinoma cell lines. Oncogene 25:470–479. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1209068

Glaros S, Cirrincione GM, Muchardt C, et al (2007) The reversible epigenetic silencing of BRM: implications for clinical targeted therapy. Oncogene 26:7058–7066. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1210514

Guerrero-Martínez JA, Reyes JC (2018) High expression of SMARCA4 or SMARCA2 is frequently associated with an opposite prognosis in cancer. Sci Rep 8:1–17. https://doi.org/10.1038/s41598-018-20217-3

Auguste A, Blanc-Durand F, Deloger M, et al (2020) Small Cell Carcinoma of the Ovary, Hypercalcemic Type (SCCOHT) beyond SMARCA4 Mutations: A Comprehensive Genomic Analysis. Cells 9:. https://doi.org/10.3390/cells9061496

Wu J, Zhang J, Jiang M, et al (2018) Comparison between NOD/SCID mice and BALB/c mice for patient-derived tumor xenografts model of non-small-cell lung cancer. Cancer Manag Res 10:6695–6703. https://doi.org/10.2147/CMAR.S181272

Wilson BG, Helming KC, Wang X, et al (2014) Residual complexes containing SMARCA2 (BRM) underlie the oncogenic drive of SMARCA4 (BRG1) mutation. Mol Cell Biol 34:1136–1144. https://doi.org/10.1128/MCB.01372-13

D’Antonio M, Guerra RF, Cereda M, et al (2013) Recessive cancer genes engage in negative genetic interactions with their functional paralogs. Cell Rep 5:1519–1526. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2013.11.033

Marquez SB, Thompson KW, Lu L, Reisman D (2015) Beyond Mutations: Additional Mechanisms and Implications of SWI/SNF Complex Inactivation. Front Oncol 4:. https://doi.org/10.3389/fonc.2014.00372

Marquez SB, Thompson K, Lu L, Reisman D (2016) Mechanism of BRG1 silencing in primary cancers. Oncotarget 7:56153–56169. https://doi.org/10.18632/oncotarget.10593

Rodriguez-Nieto S, Cañada A, Pros E, et al (2011) Massive parallel DNA pyrosequencing analysis of the tumor suppressor BRG1/SMARCA4 in lung primary tumors. Hum Mutat 32:E1999-2017. https://doi.org/10.1002/humu.21415

Zou W, Ding F, Niu C, et al (2018) Brg1 aggravates airway inflammation in asthma via inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochem Biophys Res Commun 503:3212–3218. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.08.127

Krzakowski M, Jassem J, Antczak A (2019) Cancer of the lung, pleura and mediastinum. Oncol Clin Pr. https://doi.org/10.5603/OCP.2018.0056

Molina JR, Yang P, Cassivi SD, et al (2008) Non–Small Cell Lung Cancer: Epidemiology, Risk Factors, Treatment, and Survivorship. Mayo Clin Proc Mayo Clin 83:584–594

Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM (2008) Lung Cancer. N Engl J Med 359:1367– 1380. https://doi.org/10.1056/NEJMra0802714

Karnezis AN, Wang Y, Ramos P, et al (2016) Dual loss of the SWI/SNF complex ATPases SMARCA4/BRG1 and SMARCA2/BRM is highly sensitive and specific for small cell carcinoma of the ovary, hypercalcaemic type: SMARCA4/SMARCA2 loss in small cell carcinoma, hypercalcaemic type. J Pathol 238:389–400. https://doi.org/10.1002/path.4633

Jelinic P, Schlappe BA, Conlon N, et al (2016) Concomitant loss of SMARCA2 and SMARCA4 expression in small cell carcinoma of the ovary, hypercalcemic type. Mod Pathol 29:60–66. https://doi.org/10.1038/modpathol.2015.129

Chan-Penebre E, Armstrong K, Drew A, et al (2017) Selective Killing of SMARCA2- and SMARCA4-deficient Small Cell Carcinoma of the Ovary, Hypercalcemic Type Cells by Inhibition of EZH2: In Vitro and In Vivo Preclinical Models. Mol Cancer Ther 16:850–860. https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-16-0678

Januario T, Ye X, Bainer R, et al (2017) PRC2-mediated repression of SMARCA2 predicts EZH2 inhibitor activity in SWI/SNF mutant tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 114:12249–12254. https://doi.org/10.1073/pnas.1703966114

Wang Y, Chen SY, Colborne S, et al (2018) Histone Deacetylase Inhibitors Synergize with Catalytic Inhibitors of EZH2 to Exhibit Antitumor Activity in Small Cell Carcinoma of the Ovary, Hypercalcemic Type. Mol Cancer Ther 17:2767–2779. https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-18-0348

Wang Y, Chen SY, Karnezis AN, et al (2017) The histone methyltransferase EZH2 is a therapeutic target in small cell carcinoma of the ovary, hypercalcaemic type. J Pathol 242:371–383. https://doi.org/10.1002/path.4912

Cook D, Brown D, Alexander R, et al (2014) Lessons learned from the fate of AstraZeneca’s drug pipeline: a five-dimensional framework. Nat Rev Drug Discov 13:419–431. https://doi.org/10.1038/nrd4309

Weichsel A, Kievenaar JA, Curry R, et al (2019) Instability in a coiled-coil signaling helix is conserved for signal transduction in soluble guanylyl cyclase. Protein Sci 28:1830–1839. https://doi.org/10.1002/pro.3707

He F, Hogan S, Latypov RF, et al (2010) High throughput thermostability screening of monoclonal antibody formulations. J Pharm Sci 99:1707–1720. https://doi.org/10.1002/jps.21955

Nettleship JE, Brown J, Groves MR, Geerlof A (2008) Methods for Protein Characterization by Mass Spectrometry, Thermal Shift (ThermoFluor) Assay, and Multiangle or Static Light Scattering. In: Kobe B, Guss M, Huber T (eds) Structural Proteomics: High-Throughput Methods. Humana Press, Totowa, NJ, pp 299–318

Martinez NJ, Asawa RR, Cyr MG, et al (2018) A widely-applicable high-throughput cellular thermal shift assay (CETSA) using split Nano Luciferase. Sci Rep 8:9472. https://doi.org/10.1038/s41598-018-27834-y

Langebäck A, Bacanu S, Laursen H, et al (2019) CETSA-based target engagement of taxanes as biomarkers for efficacy and resistance. Sci Rep 9:19384. https://doi.org/10.1038/s41598-019-55526-8

Axelsson H, Almqvist H, Seashore-Ludlow B (2018) Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells. JoVE J Vis Exp e58670. https://doi.org/10.3791/58670

Xing H, Luo X, Li Y, et al (2020) Effect of verapamil on the pharmacokinetics of hydroxycamptothecin and its potential mechanism. Pharm Biol 58:152–156. https://doi.org/10.1080/13880209.2020.1717550

Kapałczyńska M, Kolenda T, Przybyła W, et al (2018) 2D and 3D cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci AMS 14:910–919. https://doi.org/10.5114/aoms.2016.63743

Medina PP, Romero OA, Kohno T, et al (2008) Frequent BRG1/SMARCA4inactivating mutations in human lung cancer cell lines. Hum Mutat 6

Kobayashi K, Sakurai K, Hiramatsu H, et al (2015) The miR-199a/Brm/EGR1 axis is a determinant of anchorage-independent growth in epithelial tumor cell lines. Sci Rep 5:8428. https://doi.org/10.1038/srep08428

Mazan A, Wróbel A, Dreas A, et al (2020) Abstract 3656: Development of novel, selective SMARCA2 (BRM) degraders for treatment of SMARCA4 (BRG1) mutated tumors. Cancer Res 80:3656–3656. https://doi.org/10.1158/1538-7445.AM2020-3656

Kargbo RB (2020) SMARCA2/4 PROTAC for Targeted Protein Degradation and Cancer Therapy. ACS Med Chem Lett 11:1797–1798. https://doi.org/10.1021/acsmedchemlett.0c00347

Wang Y, Jiang X, Feng F, et al (2020) Degradation of proteins by PROTACs and other strategies. Acta Pharm Sin B 10:207–238. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2019.08.001

Szabo M, Svensson Akusjärvi S, Saxena A, et al (2017) Cell and small animal models for phenotypic drug discovery. Drug Des Devel Ther Volume 11:1957–1967. https://doi.org/10.2147/DDDT.S129447

Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective | Nature Reviews Drug Discovery. https://www.nature.com/articles/nrd.2017.111. Accessed 10 May 2020

Uniwersytet Jagielloński

Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Zakład Biotechnologii Medycznej

Suplement

Dane uzupełniające do rozprawy doktorskiej zatytułowanej:

„Rozwój metod i modeli badawczych umożliwiających selekcję oraz potwierdzenie specyficzności i mechanizmu działania innowacyjnych związków małocząsteczkowych celujących w białka kompleksu SWI/SNF”

Rozprawa doktorska: Karolina Pyziak Promotor rozprawy: Dr hab. Agnieszka Łoboda Promotor pomocniczy: Dr Anna Wróbel

Spis treści

Wykaz skrótów 177

Materiały i metody uzupełniające	178

Dane umieszczone na portalu DepMap	178

Testy biochemiczne i biofizyczne	179

Testy biochemiczne sprawdzające aktywność ATP-azową białek BRM i BRG1	180

Testy biochemiczne sprawdzające aktywność domeny helikazowej	182

Termoforeza mikroskalowa (MST)	184

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)	185

Spektrometria mas sprzężona z wysokosprawną chromatografią cieczową	186

Analiza wyniku RNAseq	187

Analiza wyniku ChIPseq	188

Badanie przesiewowe biblioteki LOPAC1280	189

Wyniki uzupełniające i dyskusja190

Testy biochemiczne	190

Dokowanie molekularne	191

Metody biofizyczne	193

Spis Literatury 194

Wykaz skrótów

CCLE – encyklopedia komórek rakowych, ang. cancer cell line encyclopedia

CERES – parametr zależności genowej dla techniki CRISPR, ang. CERESdependency score

CRISPR – zgrupowane, regularnie przerywane, krótkie powtórzenia palindromiczne, ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats

DEMETER2 – parametr zależności genowej dla techniki RNAi, ang. DEMETERdependency score DMPK – metabolizm środków leczniczych i ich parametry farmakokinetyczne, ang. drug metabolism and pharmacokinetics

IR – laser podczerwony, ang. infrared

LC-MS – spektrometria mas sprzężona z wysokosprawną chromatografią cieczową, ang. liquid chromatography - mass spectrometry

MST – mikrotermoforeza kapilarna, ang. microscale thermophoresis

SPR – powierzchniowy rezonans plazmonowy, ang. surface plasmon resonance

Materiały i metody uzupełniające

Dane umieszczone na portalu DepMap

Analizy bioinformatyczne wykonane w rozprawie doktorskiej opierały się m.in. na danych umieszczonych na portalu DepMap. Portal umożliwia bowiem korzystanie z danych dotyczących zależności genowych, zapewnia dostęp do informacji omicznych zawartych w CCLE (encyklopedia linii komórek nowotworowych, ang. cancer cell line encyclopedia), które zostały uzupełnione o dane proteomiczne oraz umożliwia weryfikację wrażliwości linii komórkowych na działanie leków [1–8]. W niniejszej rozprawie w głównej mierze wykorzystano dane zależności genowych, które zostały uzyskane poprzez przeprowadzenie wysokoprzepustowych testów z użyciem techniki CRISPR oraz techniki wyciszenia ekspresji genów za pomocą interferencji RNA (RNAi) (Rycina uzupełniająca 2-1). Na portalu DepMap dane uzyskane za pomocą metody CRISPR są zaprezentowane na wykresach z wykorzystaniem parametru CERES (ang. CERESdependency score), który został szczegółowo opisany przez Meyers i in. [9]. Natomiast zależności genowe, do określenia których wykorzystano metodę RNAi, są przedstawione z wykorzystaniem parametru DEMETER2 (ang. DEMETER2dependency score), który został szczegółowo opisany przez McFarland i in. [10]. Parametry CERES i DEMETER2 zostały wprowadzone ze względu na konieczność zmniejszenia ilości wyników fałszywie pozytywnych wynikających z niespecyficzności poszczególnych sgRNA czy shRNA oraz różnic w wynikach zależnych od ilości kopii danych genów w poszczególnych liniach komórkowych. Wprowadzenie powyższych parametrów pozwoliło na ujednolicenie wyników otrzymanych w poprzednich testach przesiewowych z wykorzystaniem innych bibliotek sgRNA czy shRNA.

Interpretacja wyników otrzymanych za pomocą portalu DepMap bazuje na założeniu, że im niższa wartość parametrów CERES i DEMETER2 dla badanego genu, tym pełni on bardziej kluczową funkcję w danej linii komórkowej. Wartość -1 jest medianą dla wszystkich znanych niezbędnych do funkcjonowania komórki genów. Natomiast wartości parametrów równe 0 wskazują, że dany gen nie jest kluczowy dla danej linii komórkowej i nie powoduje zmian w szybkości jej namnażania. Kolejnym parametrem uwzględnionym na portalu DepMap jest prawdopodobieństwo zależności określane za pomocą parametru p. Parametr p jest obliczany dla każdej wartości CERES i DEMETER2, która jest przeskalowana i skorygowana w celu usunięcia ogólnie znanych, opisanych w literaturze, zakłóceń i zależności. Finalnie, dla poszczególnych wartości zależności genowych (CERES lub DEMETER2) w każdej

z badanych linii komórkowych obliczane jest prawdopodobieństwo, czy dana zależność reprezentuje prawdziwy, biologiczny fenotyp [11].

Rycina uzupełniająca 2-1. Przebieg eksperymentu pozwalającego na określenie zależności genowych dla poszczególnych linii komórkowych. A: CRISPR, B: RNAi (shRNA), zmodyfikowany schemat z pracy Cowley i in. [12]. Warunki eksperymentu komórek zastały dobrane w taki sposób, by każda komórka uległa transdukcji tylko jedną cząstką wirusową zawierającą sgRNA lub shRNA.

Testy biochemiczne i biofizyczne

Testy biochemiczne i biofizyczne zostały zoptymalizowane i wykonane we współpracy z Działem Rozwoju Nowych Testów oraz Platformą Badań Przesiewowych firmy Ryvu Therapeutics. Do przeprowadzenia eksperymentów wykorzystano wyprodukowane przez Dział Biochemiczny firmy białka BRM i BRG1, które zostały przedstawione na rycinie poniżej (Rycina 3-11).

Rycina uzupełniająca 2-2. Schemat reprezentujący wyprodukowane przez Dział Biochemiczny firmy Ryvu Therapeutics białka. A: hBRM – ludzkie białko BRM, mtBRM – białko BRM pochodzące od gatunku Myceliophthora thermophila, scBRM - białko BRM pochodzące od gatunku Saccharomyces cerevisiae, hBRG1 – ludzkie białko BRG1, w tabeli opisano funkcję poszczególnych domen zaprezentowanych białek. Na rycinie zaznaczono % identyczności sekwencji oraz stopień podobieństwa w obrębie domen ATPazowej i Helikazowej. B: Ludzkie białko BRM pełnej długości oraz dwa skrócone białka służące do oszacowania miejsca wiązania związków drobnocząsteczkowych. Różnokolorowe prostokąty reprezentują poszczególne domeny białek BRM i BRG1, które zostały opisane w tabeli (A).

Testy biochemiczne sprawdzające aktywność ATP-azową białek BRM i BRG1

Testy sprawdzające aktywność ATP-azową białek BRM i BRG1 zostały wykonane z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie zestawu ADP-Glo™ Kinase Assay (Promega, V9101) oraz białek hBRM (pełnej długości, skrócone, bez domeny BRK), mtBRM, scBRM i hBRG1 (Rycina 3-11). Do produkcji białek wykorzystano różne konstrukty w celu określenia specyficzności działania związków oraz oszacowania domeny, z którą oddziałują. Przebieg testu został zaprezentowany poniżej (Rycina uzupełniająca 2-3). W sytuacji, w której aktywność ATP-azowa badanych białek nie jest zahamowana, następuje konwersja ATP do ADP. W

kolejnym kroku, po dodaniu odczynnika ADP-GloTM następuje zatrzymanie reakcji katalizowanej przez białko BRM/BRG1 oraz usunięcie nieprzereagowanego ATP. Następnie po dodaniu odczynnika do detekcji dochodzi do konwersji wyprodukowanego w reakcji katalizowanej przez białko BRM/BRG1 ADP do ATP, które jest wykorzystane przez lucyferazę do wygenerowania luminescencji (Rycina uzupełniająca 2-3 A). W przypadku, gdy w układzie znajdzie się związek drobnocząsteczkowy hamujący w 100% ATP-azową aktywność białka nie obserwuje się sygnału luminescencji, ponieważ w reakcji nie powstaje ADP, a całe ATP obecne w mieszaninie reakcyjnej zostaje usunięte po dodaniu odczynnika ADP-GloTM (Rycina uzupełniająca 2-3 B).

Rycina uzupełniająca 2-3. Schemat reprezentujący przebieg testu sprawdzającego aktywność ATP- azową białek BRM i BRG1 (ADP-GloTM). A: Przebieg reakcji bez obecności inhibitora białka BRM lub BRG1. B: Przebieg reakcji w obecności inhibitora białka BRM lub BRG1 powodującego całkowite zahamowanie aktywności badanych białek.

Podczas mniejszej niż 100% inhibicja aktywności ATP-azowej badanych białek obserwuje się zależny od dawki spadek sygnału w określonym punkcie czasowym, na bazie którego oblicza się wartość IC50 oraz parametr Zakres (Rycina uzupełniająca 2-4 A). W celu wykluczenia związków, które nie są inhibitorami białek BRM i/lub BRG1, lecz hamują aktywność lucyferazy przeprowadza się dodatkowy test, w którym do mieszaniny reakcyjnej dodaje się ATP, badany związek oraz odczynnik do detekcji (Reakcja nr 5 – Rycina

uzupełniająca 2-3 A). Spadek sygnału luminescencji w tym teście świadczy o wyniku fałszywie pozytywnym.

Rycina uzupełniająca 2-4. Schemat reprezentujący wykres zależności sygnału luminescencji otrzymanego w teście ADP-GloTM od stężenia związku. A: Na wykresie zaznaczono parametry, które są wykorzystywane do określenia działania związków drobnocząsteczkowych (inhibitorów aktywności BRM i BRG1). B: Na wykresie zobrazowano przykładowy wynik testu kompetycji z ATP dla kompetytora ATP. Stężenie związku na osi x jest przedstawione w skali logarytmicznej. Km(ATP) – stała Michaelisa- Menten dla ATP. x* Km(ATP) – stężenie ATP użyte w teście równe x-krotnej wartości Km.

Test ADP-Glo™ został także wykorzystany do określenia, czy badane związki wykazują kompetycję z ATP. W tym celu przeprowadzono test ADP-GloTM z wykorzystaniem skróconego białka hBRM w obecności różnych ilości ATP, równych 0.3*Km, 1*Km, 3*Km i 5*Km (Km - stała Michaelisa-Menten). Dla związków ATP-kompetycyjnych obserwuje się wzrost wartości IC50 wraz ze wzrostem stężenia ATP w mieszaninie reakcyjnej (Rycina uzupełniająca 2-4 B). Wartość IC50 dla związków niewykazujących kompetycji z ATP nie ulega zmianie.

Testy biochemiczne sprawdzające aktywność domeny helikazowej

Testy sprawdzające aktywność domeny helikazowej białek BRM i BRG1 zostały wykonane z wykorzystaniem dostępnego komercyjnie zestawu: ang. Nucleosome Remodeling Assay (EpiCypher, SKU: 16-4201) oraz wyprodukowanych przez Dział Biochemiczny Ryvu Therapeutics białek hBRM (pełnej długości) i hBRG1 (Rycina 3-11). Poszczególne etapy optymalizacji zgodnie z zaleceniami producenta obejmowały: określenie stężeń badanych białek (BRM lub BRG1), stężenia ATP oraz stężenia substratu EpiDyne. Przebieg testu został zaprezentowany poniżej (Rycina uzupełniająca 1-6). W początkowej fazie reakcji pomiędzy cyjaniną 3 (Cy3) i 5 (Cy5) zachodzi zjawisko FRET (ang. Fluorescence Resonance Energy Transfer) polegające na przeniesieniu energii między dwoma chromoforami na drodze innej niż promieniowanie, które zachodzi, gdy chromofory znajdują się w odległości mniejszej niż 10 nm. W sytuacji, gdy aktywność białka BRM lub BRG1 nie jest hamowana przez związki

drobnocząsteczkowe następuje rozwinięcie fragmentu DNA z nukleosomu (remodeling), co prowadzi do zwiększenia odległości pomiędzy Cy3 i Cy5 oraz zatrzymania transferu energii do Cy5 (Rycina uzupełniająca 2-5. A). Podczas pomiaru w czasie następuje wzrost stosunku sygnału pomiędzy Cy3 i Cy5 (Rycina uzupełniająca 2-5. C, sytuacja A - niebieska linia). W przypadku, gdy w układzie znajduje się związek drobnocząsteczkowy hamujący w 100% helikazową aktywność białka, nie dochodzi do wzrostu stosunku sygnału pomiędzy Cy3 a Cy5 (Rycina uzupełniająca 2-5. B, C, sytuacja B - żółta linia). Podczas mniejszej niż 100% inhibicji aktywności domeny helikazowej badanych białek obserwuje się zależny od dawki spadek sygnału w określonym punkcie czasowym, na bazie którego oblicza się wartość IC50 oraz parametr Zakres (Rycina uzupełniająca 2-5. D).

Rycina uzupełniająca 2-5. Schemat reprezentujący przebieg testu sprawdzającego aktywność domen helikazowych białek BRM i BRG1 (EpiDyne-FRET). A: Przebieg reakcji bez obecności inhibitora białka BRM lub BRG1. B: Przebieg reakcji w obecności inhibitora białka BRM lub BRG1 powodującego całkowite zahamowanie aktywności badanych białek. C: Schemat obrazujący wyniki otrzymane za pomocą testu w sytuacjach przedstawionych w sekcjach A i B niniejszej ryciny. D: Schemat obrazujący sposób obliczenia parametrów IC50 oraz zakres. Zmodyfikowany schemat zaczerpnięty ze strony producenta: https://www.epicypher.com/content/EpiDyne_FRET.pdf.

Termoforeza mikroskalowa (MST)

Technika MST (ang. microscale thermophoresis) wykorzystuje zjawisko ukierunkowanego ruchu cząsteczek pod wpływem gradientu temperatury (termoforeza) [13], którego szybkość w rozcieńczonych roztworach zmienia się pod wpływem oddziaływania badanego białka ze związkiem drobnocząsteczkowym. W technice MST badane próbki znajdują się w szklanych kapilarach, a gradient temperaturowy wzbudzony jest laserem podczerwonym (IR, ang. infrared), który skupiony jest na małym obszarze kapilary. Ruch białka w obszarze, który został naświetlony wiązką laserową może zostać wykryty poprzez pomiar fluorescencji, gdyż badane metodą MST białka znakuje się przed pomiarem m.in poprzez przyłączenie znacznika do metki histydynowej białka. Poniżej przedstawiono schemat reprezentujący przebieg pomiaru oraz przykładowy wynik otrzymany metodą MST (Rycina uzupełniająca 2-6. ). Oprogramowanie do analizy danych firmy Nanotemper umożliwia przeprowadzenie analizy prowadzącej do wyznaczenia stałej powinowactwa (KD).

Rycina uzupełniająca 2-6. Schemat reprezentujący wynik uzyskany metodą MST. A: Wykres odczytu fluorescencji w metodzie MST wraz z wizualizacją ruchu cząsteczek w obrębie miejsca wzbudzonego wiązką laserową. F1 - odczyt fluorescencji w „zimnym” polu, przed włączeniem lasera IR. F2 - odczyt fluorescencji w „gorącym” polu. Na wykresie, pod osią x, zaznaczono za pomocą gwiazdek moment włączenia (*) i wyłączenia (*) lasera IR. B: Wykres reprezentujący zależność zmiany fluorescencji od stężenia związku wykreślony w celu wyznaczenia wartości KD. ΔFnorm(%)=F2/F1. Zmodyfikowany schemat zaczerpnięty z publikacji [13].

Badania metodą MST prowadzone były z użyciem urządzenia NT.Automated (Nanotemper). Białka hBRM (skrócone) i mtBRM znakowane były poprzez metkę histydynową (kit: Monolith His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA, Nanotemper). Wszystkie testowane próbki przygotowywane były z maksymalnym udziałem DMSO 5% na płytkach 384-dołkowych (Corning #4513). Skład buforu wykorzystanego w metodzie MST objęty jest tajemnicą przedsiębiorstwa. We wszystkich eksperymentach testujących białko-ligand próbki były inkubowane przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie pomiar odbywał się

przy następujących parametrach: kapilary typu Premium coated, (Monolith NT.Automated Premium Capillary Chips, Nanotemper), pomiar w kanale czerwonym, MST Power: Medium, Led Power: 10%.

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)

Technika SPR (ang. surface plasmon resonanse), czyli plazmonowy rezonans powierzchniowy wykorzystuje zjawisko całkowitego wewnętrznego odbicia na granicy ośrodków (pryzmat-woda) [14]. Pomiędzy pryzmatem a wodą znajduje się cienka warstwa złota pokryta organicznym filmem, do którego immobilizowane jest testowane białko hBRM za pomocą reszt histydynowych (chip NTA) (Rycina uzupełniająca 2-7. A). Nad powierzchnią z białkiem następuje przepływ testowanego związku. Źródło światła wzbudzającego umieszczone jest po stronie pryzmatu, w przypadku zjawiska całkowitego wewnętrznego odbicia światło wzbudzające nie może przedostać się przez granicę faz, lecz propaguje na granicy ośrodków tworząc tak zwaną falę zanikającą. Na granicy ośrodków znajdują się także tzw. plazmony powierzchniowe, które są ściśle związane z powierzchnią i mogą być wzbudzone przez wspomnianą falę zanikającą [15]. Jednakże, wzbudzenie następuje tylko w przypadku wystąpienia zjawiska rezonansu, gdy składowe x (wzdłuż granicy ośrodków) wektora plazmonów i fali zanikającej są równe. Wartość składowej x dla wektora plazmonów zależy od stałych dielektrycznych metalu i dielektryka (frakcja wodna), które zmieniają się pod wpływem oddziaływania związku z immobilizowanym białkiem (hBRM). Natomiast wartość składowej x dla fali zanikającej zależy od współczynnika załamania światła (niezmienny w tym układzie) oraz kąta padania światła. Istnieje zatem tylko jeden kąt padania wiązki światła, pod którym zajdzie zjawisko rezonansu, na które zostanie wykorzystana energia wiązki wzbudzającej (brak detekcji wiązki odbitej przez detektor - czarna linia (Rycina uzupełniająca 2-7. A). Podsumowując, oddziaływanie białka ze związkiem może zostać wykryte poprzez określenie czy kąt odbicia, przy którym zanika sygnał wykryty przez detektor ulega zmianie. Przykładowy wynik uzyskany metodą SPR dla związku oddziałującego z białkiem (jednorazowe wprowadzenie związku do układu, jedno stężenie związku) został zobrazowany poniżej (Rycina uzupełniająca 2-7. B). Tak jak metoda MST (pomiar w stanie równowagi), SPR umożliwia wyznaczenie stałej dysocjacji KD [M], lecz ze względu na fakt, że pomiar obejmuje także fazę asocjacji i dysocjacji, za jego pomocą można wyznaczyć dodatkowo stałe kinetyczne.

Rycina uzupełniająca 2-7. Schemat reprezentujący przebieg metody SPR. A: Schemat przedstawiający budowę aparatu do SPR oraz układ pomiarowy w momencie nastrzyku analitu. B: Przykładowy wynik uzyskany metodą SPR. Analit – badany związek. Zmodyfikowany schemat zaczerpnięty z publikacji [16].

Badania metodą SPR przeprowadzone były z użyciem aparatu Biacore T200, GE Healthcare. Wszystkie odczynniki zostały zakupione w firmie GE Healthcare. Białko hBRM (skrócone) zostało zimmobilizowane na metalowym sensorze NTA, po uprzednim obsadzeniu powierzchni sensora jonami niklu – NiCl2 0,5 mM, przez standardową procedurę immobilizacji z wykorzystaniem metki His-Tag zaimplementowaną w oprogramowaniu sprzętu, w buforze HBS-P+ (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05% P20). Uzyskany poziom immobilizacji dla kilku wykonanych eksperymentów był powtarzalny i wynosił 7200-8900 RU. Wiązanie związków do białka hBRM (forma skrócona) zostało przeprowadzone przy następujących parametrach pomiarowych:

Czas wiązania: 60 sekund

Prędkość przepływu: 15 µl/min

Czas dysocjacji: 60 sekund

Roztwór regeneracyjny: brak

Korekcja rozpuszczalnika: DMSO

Bufor: HBS-P+

Typ eksperymentu: Multi-cycle kinetics mode (5 stężeń związku podawanych sekwencyjnie)

Spektrometria mas sprzężona z wysokosprawną chromatografią cieczową

Spektrometrię mas sprzężoną z wysokosprawną chromatografią cieczową (LC-MS, ang. liquid chromatography - mass spectrometry) wykonano we współpracy z grupą badawczą DMPK (ang. drug metabolism and pharmacokinetics) Ryvu Therapeutics. Do przeprowadzenia analiz wykorzystano HPLC Dionex Ultimate 3000 RS (Dionex) oraz spektrofotometr masowy

TSQ Quantiva (Thermo Fisher Scientific). Do rozdziału użyto kolumnę Zorbax XDB (2.1 cm x 75 mm, 3,5 µm) (Agilent), z zachowaniem objętości nastrzyku równą 1 µl. Do rozdziału wykorzystano gradient acetonitrylu (A: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie oraz C: 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu) przy stałym przepływie fazy ruchomej równym 0,6 ml/min (Tabela 2-1). Analizę próbek przeprowadzono w trybie monitorowania jonów fragmentacyjnych pochodzących od wybranego prekursora (SRM). Jonizację przeprowadzono metodą elektrorozpylania (H-ESI, ang. heated-electrospray ionization source) w trybie jonizacji dodatniej (ang. positive polarity). Główne parametry wynosiły: wielkość napięcia pola elektrycznego - 3.5 kV, przepływ gazu rozpraszającego - 52, przepływu gaz suszącego - 16, przepływ gazu wspomagającego - 2, temperatura gazu suszącego – 420ºC, temperatura kapilary

– 356ºC. Poniżej (Tabela 2-2) przedstawiono wartości m/z dla jonu prekursora oraz jonów fragmentacyjnych, czas retencji oraz energię kolizji, które zostały zoptymalizowane do identyfikacji związków.

Tabela 2-1 Program rozdziału HPLC. C - 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu.

Tabela 2-2. Parametry spektroskopii masowej (tryb SRM).

Związek	Masa molowa [g/mol]	Prekursor m/z	Produkt m/z	Energia kolizji (V)	Czas retencji (min)
Novartis	318,27	319,122	125,111	27,14	2,57

168,968	16,522

301,111	15,36

Analiza wyniku RNAseq

Dane dostarczone przez zespół dr hab. n. med. Michała Mikuli i firmę Macrogen zostały przeanalizowane we współpracy z Działem Bioinformatycznym firmy Ryvu Therapeutics. Sprawdzono jakość otrzymanych wyników i przeprocesowano je z wykorzystaniem narzędzi FastQC i MultiQC. Przeprowadzona analiza obejmowała m.in. sprawdzenie ilości odczytów we wszystkich badanych próbkach, wykonanie histogramów reprezentujących jakość otrzymanych sekwencji, sprawdzenie udziału każdego nukleotydu w otrzymanych sekwencjach oraz określenie czy udział sekwencji GC ma rozkład normalny. Kolejno ze zbioru danych

usunięto odczyty pochodzące m.in. od sekwencji adapterów, starterów czy sekwencji poliadenylacji oraz innych niepożądanych fragmentów RNA. Usunięto także odczyty niskiej jakości (Trim_galore). Kolejno, przeprowadzono mapowanie i pomiar liczby odczytów z wykorzystaniem programu Salmon (v0.13.1) i wersji Grch37 sekwencji ludzkiego genomu (hg19). Wyniki przedstawione w niniejszej rozprawie doktorskiej przeszły pozytywnie kontrolę jakości.

W celu zwizualizowania różnicowości pomiędzy grupą kontrolną (traktowaną DMSO lub siRNA kontrolnym) i badaną (traktowaną związkiem Novartis lub siRNA specyficznym wobec genu SMARCA2) przeprowadzono analizę głównych składowych (ang. principal component analysis, PCA), której wynik przedstawiono na wykresach. Kolejno przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji genów (DGE) z wykorzystaniem pakietu DESeq2 (program R). Jako referencję przyjęto grupę kontrolną. W wyniku analizy otrzymano wartość parametru krotność zmiany (log2fold), który obliczono poprzez estymację Bayesowską (ang. maximum a posteriori estimation with zero-mean normal prior - Tikhonov/ridge regularization). Dla każdego genu określono wartość parametru P (FDR-corrected P value) zgodnie z procedurą Benjamini-Hochberg [17].

Analiza wyniku ChIPseq

Dane dostarczone przez firmę ActiveMotif zostały przeanalizowane we współpracy z Działem Bioinformatycznym firmy Ryvu Therapeutics. Sprawdzono jakość otrzymanych wyników i przeprocesowano je z wykorzystaniem narzędzi FastQC i MultiQC. Ze zbioru danych usunięto odczyty pochodzące m.in. od sekwencji adapterów oraz odczyty niskiej jakości (Trim_galore). Następnie przeprowadzono mapowanie odczytów z wykorzystaniem programu Bowtie2 i wersji Grch38 sekwencji ludzkiego genomu (hg38). Otrzymane dane znormalizowano tak, by wynik wszystkich testowanych prób obejmował taką samą liczbę znaczników (ang. tags), a następnie za pomocą algorytmu Macs2 zidentyfikowano regiony genomu, które zostały wzbogacone w dopasowane odczyty (ang. peak calling). Za pomocą zestawu narzędzi Homer przypisano wartości znalezionym pikom (ang. peak annotation) tworząc pliki BIGWIG, które przeanalizowano za pomocą programu Integrative Genomics Viewer.

Badanie przesiewowe biblioteki LOPAC1280

W celu sprawdzenia parametrów fenotypowego testu przesiewowego oraz określenia algorytmu do selekcji związków przetestowano 1280 cząsteczek wchodzących w skład biblioteki LOPAC1280 (ang. library of pharmacologically active compounds). Badanie przesiewowe oraz analizę otrzymanych danych przeprowadzono we współpracy z Działem Badań Przesiewowych oraz CADD firmy Ryvu Therapeutics. Wspomniana biblioteka zawiera ogólnie znane inhibitory, ligandy receptorów, związki narzędziowe oraz zatwierdzone leki, które mają wpływ na większość ścieżek sygnałowych i obejmują wszystkie główne klasy celów terapeutycznych.

W pierwszym etapie komórki HT1080 i HT1080 SM4KO traktowano 0,1 µM oraz 10 µM stężeniem związków wchodzących w skład biblioteki (dwa powtórzenia techniczne). Dla otrzymanych wyników, osobno dla linii HT1080 SM4KO i HT1080, obliczono % inhibicji i utworzono histogramy reprezentujące rozkład otrzymanych danych. Dla otrzymanych wyników (osobno dla każdego replikatu) obliczono średnią wartość % inhibicji. Przyjęto, że związek hamuje żywotność komórek, jeśli jego % inhibicji był większy niż średnia wartość

% inhibicji + trzy odchylenia standardowe.

Zakładano, że większe biblioteki związków będą testowane w jednym powtórzeniu technicznym, co wiąże się z koniecznością wprowadzenia odpowiedniego parametru sprawdzającego wiarygodność otrzymanego wyniku. W tym celu wykorzystano parametr B-score, który weryfikuje czy dany wynik nie jest efektem odchylenia zachodzącego w danej kolumnie lub wierszu, w których znajduje się próba badana. Ponadto sprawdza on, czy wynik nie jest efektem danej płytki eksperymentalnej, gdyż wartości r dla danej próby są dzielone przez medianę odchylenia bezwzględnego wszystkich płytek. Uznano, że aktywność danego związku jest wiarygodna, jeśli parametr B był niższy niż -5.

W wyniku przeprowadzenia testu przesiewowego oczekiwano wyłonienia związków wywołujących większy spadek żywotności komórek HT1080 SM4KO i HT1080. W tym celu wprowadzono parametr krotność zmiany porównujący % inhibicji dla linii HT1080 SM4KO wobec HT1080. Przyjęto, że parametr krotność zmiany powinien przyjąć wartości większe od 1. Ustalono także, że w przypadku testowania linii komórkowych w różnych dniach konieczne jest przeprowadzenie każdorazowo testu kontroli jakości w postaci poziomu białek BRM i BRG1 mierzonego za pomocą Western Blot.

W kolejnym etapie, komórki HT1080 SM4KO i HT1080 potraktowano wybranymi związkami w stężeniu 20 µM. Otrzymane wyniki przeanalizowano analogicznie jak podczas

pierwszego etapu, a działanie wyselekcjonowanych związków sprawdzono w pełnym zakresie stężeń i określono parametry opisujące cząsteczki o różnicowym działaniu. Związek uważano za działający różnicowo, jeśli wartość EC50 dla linii HT1080 SM4KO była minimum 3-krotnie niższa niż dla linii HT1080.

Wyniki uzupełniające i dyskusja

Testy biochemiczne

Wykorzystując testy biochemiczne sprawdzono wpływ związku referencyjnego firmy Novartis na aktywność poszczególnych białek. Związek wykazał nanomolową aktywność (IC50 = 9,7 nM, Zakres = 91,3%) w stosunku do białka hBRM pełnej długości oraz nie hamował aktywności lucyferazy. Przeprowadzone dalsze doświadczenia pokazały również nanomolową aktywność związku wobec białek hBRM (wersja skrócona) oraz hBRM (bez BRK) (Tabela uzupełniająca 3-1).

Tabela uzupełniająca 3-1 Wyniki testów biochemicznych dla związku referencyjnego firmy Novartis. A: Testy sprawdzające aktywność ATP-azową (ADP-GloTM) i helikazową (EpiDyne-FRET) białek BRM i BRG1. B: Wyniki testu kompetycji ATP dla białka hBRM (skrócone).

Z wykorzystaniem białka hBRM (skrócone) sprawdzono także, czy związek wykazuje zjawisko kompetycji względem ATP (Tabela uzupełniająca 3-1 B). Nie zaobserwowano zmiany w wartościach IC50 spowodowanej wzrastającym stężeniem ATP w mieszaninie reakcyjnej, co świadczy o tym, że inhibitor referencyjny firmy Novartis nie jest kompetytorem ATP. Kolejno sprawdzono selektywność związku wobec białek hBRG1, scBRM i mtBRM. Wartość IC50 dla białka hBRG1 (IC50 = 7,2 nM, Zakres = 94.6%) osiągnęła wartości porównywalne

z IC50 dla białka hBRM (Tabela uzupełniająca 3-1 A), co świadczy o braku selektywności pomiędzy białkami. Związek nie był aktywny białek scBRM i mtBRM, co wskazało na jego specyficzność wobec ludzkich białek BRM/BRG1.

Brak selektywności związku referencyjnego został także potwierdzony w teście sprawdzającym aktywność domeny helikazowej. Inhibitor pokazał nanomolową aktywność wobec obu testowanych białek: hBRM (IC50 = 8,5 nM, Zakres = 100,1%), hBRG1 (IC50 = 15,9 nM, Zakres = 127,2%). Otrzymane z wykorzystaniem najkrótszej formy białka hBRM (bez BRK) dane sugerują, że miejsce wiązania związku referencyjnego znajduje się w obrębie domeny ATP-azowej, helikazowej, SnAC lub fragmentu domeny HSA. Ponadto brak aktywności inhibitora wobec białek scBRM i mtBRM wskazuje, że związek wiąże się w miejscach, w których nie jest zachowana homologia pomiędzy białkami różnych gatunków (znacząco niższy stopień podobieństwa białek do hBRM, 78-79%, Rycina 3-11 A). Ponadto, dwa niezależne testy sprawdzające ATP-azową i helikazową aktywność białka pokazały brak selektywności związku referencyjnego wobec białka BRM względem BRG1.

Dokowanie molekularne

W celu weryfikacji czy uzyskane metodą biochemiczną dane są spójne z informacjami dotyczącymi miejsca wiązania inhibitora Novartis, porównano sekwencje aminokwasowe badanych białek. Aminokwasy oddziałujące ze związkiem określono na podstawie dokowania molekularnego inhibitora do opublikowanej struktury krystalicznej białka BRM[18] (metodyka nieuwzględniona w rozprawie, doświadczenia wykonane przez grupę CADD (ang. computer- aided drug design) firmy Ryvu Therapeutics). Doświadczenie pokazało całkowitą identyczność reszt aminokwasowych pomiędzy ludzkimi białkami BRM i BRG1 w allosterycznym miejscu wiązania inhibitora referencyjnego, co tłumaczy brak jego selektywności pomiędzy badanymi białkami (Rycina uzupełniająca 3-1. A, B). Reszty aminokwasowe białek mtBRM i scBRM były identyczne w porównaniu do hBRM odpowiednio w 76% i 78%, co może tłumaczyć brak wpływu związku na ich aktywność. Dokowanie molekularne udowodniło również, że wspomniana przez Papillon i in. [18] częściowa kompetycja związku z ATP (wykryta metodą SPR) nie jest spowodowana wiązaniem inhibitora do kieszeni wiążącej ATP. Wskazuje to, że związek Novartis nie jest kompetytorem ATP, co jest także spójne z wynikiem testów biochemicznych.

Rycina uzupełniająca 3-1. Analiza sekwencji aminokwasowych białek BRM i BRG1. A: Wynik dokowania molekularnego rdzenia związku referencyjnego firmy Novartis do struktury krystalicznej białka opublikowanej przez Papillon i in. [18]. B: Porównanie reszt aminokwasowych białek hBRM, mtBRM, scBRM i BRG1 znajdujących się w odległości do 5Å od miejsca wiązania związku (czerwone prostokąty). C: Porównanie sekwencji aminokwasowych poszczególnych domen białek BRM i BRG1.

W kolejnym kroku, w celu określenia szansy na uzyskanie związków selektywnych, porównano sekwencje aminokwasowe poszczególnych domen białek BRM i BRG1 (Rycina uzupełniająca 3-1. C). W analizie oznaczono procent identyczności sekwencji oraz stopień jej podobieństwa uwzględniający reszty aminokwasowe, które mogą w podobny sposób oddziaływać ze związkami drobnocząsteczkowymi. Według doniesień literaturowych inhibitory mające szansę wywołać efekt terapeutyczny w komórkach nowotworowych z niefunkcjonalnym białkiem BRG1 powinny powodować zahamowanie aktywności domeny ATPazowej/helikazowej białka BRM [19, 20]. W obrębie wspomnianych domen podobieństwo między białkami jest bardzo wysokie i wynosi 96-99%. Jednakże dopuszcza się możliwość odkrycia inhibitorów allosterycznych, wiążących się do innych części białka, lecz powodujących dezaktywację funkcjonalności domeny ATPazowej/helikazowej. Pomimo wysokiej homologii białek BRM i BRG1 podjęto próby odkrycia selektywnych inhibitorów.

Metody biofizyczne

W celu potwierdzenia oddziaływania białka BRM ze związkiem referencyjnym firmy Novartis wykorzystano metody biofizyczne sprawdzające wpływ związku na zmiany ukierunkowanego ruchu cząsteczek pod wpływem gradientu temperatury (MST) oraz stałej dielektrycznej powierzchni (SPR). Pokazano oddziaływanie związku z ludzkim białkiem zarówno metodą MST, jak i SPR otrzymując porównywalne nanomolowe wartości stałych dysocjacji równe odpowiednio 16,3 nM i 10,8 nM (Tabela uzupełniająca 3-2). Wyznaczono także wartość KD dla białka mtBRM za pomocą metody MST, która pokazała znacząco wyższą wartość, równą 9362,3 nM. Otrzymany wynik jest spójny z rezultatami otrzymanymi z wykorzystaniem metod biochemicznych. Ponadto, za pomocą wyniku otrzymanego metodą SPR stwierdzono, że badany inhibitor wiąże się z białkiem hBRM w sposób całkowicie odwracalny (Rycina uzupełniająca 3-2. ). Powyższe stwierdzenie oparto na obserwacji, że stała dielektryczna powierzchni wraca do wartości wyjściowych po zakończeniu nastrzyku związku.

Tabela uzupełniająca 3-2. Tabela przedstawiająca wyniki testów biofizycznych dla związku referencyjnego firmy Novartis.

Rycina uzupełniająca 3-2. Reprezentatywny wynik otrzymany metodą SPR. Pionowymi liniami zaznaczono punkty czasowe nastrzyku kolejnych stężeń związku Novartis (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM, 10000 nM). Bordowe trójkąty reprezentują moment zakończenia nastrzyku związku.

Spis Literatury

Tsherniak A, Vazquez F, Montgomery PG, et al (2017) Defining a Cancer Dependency Map. Cell 170:564-576.e16. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.06.010

Ghandi M, Huang FW, Jané-Valbuena J, et al (2019) Next-generation characterization of the Cancer Cell Line Encyclopedia. Nature 569:503–508. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1186-3

Nusinow DP, Szpyt J, Ghandi M, et al (2020) Quantitative Proteomics of the Cancer Cell Line Encyclopedia. Cell 180:387-402.e16. https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.023

McDonald ER, de Weck A, Schlabach MR, et al (2017) Project DRIVE: A Compendium of Cancer Dependencies and Synthetic Lethal Relationships Uncovered by Large-Scale, Deep RNAi Screening. Cell 170:577-592.e10. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.005

Behan FM, Iorio F, Picco G, et al (2019) Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR–Cas9 screens. Nature 568:511–516. https://doi.org/10.1038/s41586- 019-1103-9

Yang W, Soares J, Greninger P, et al (2013) Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC): a resource for therapeutic biomarker discovery in cancer cells. Nucleic Acids Res 41:D955–D961. https://doi.org/10.1093/nar/gks1111

Yu C, Mannan AM, Yvone GM, et al (2016) High-throughput identification of genotype-specific cancer vulnerabilities in mixtures of barcoded tumor cell lines. Nature Biotechnology 34:419–423. https://doi.org/10.1038/nbt.3460

Cancer Target Discovery and Development Network, Schreiber SL, Shamji AF, et al (2010) Towards patient-based cancer therapeutics. Nat Biotechnol 28:904–906. https://doi.org/10.1038/nbt0910-904

Meyers RM, Bryan JG, McFarland JM, et al (2017) Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR–Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics 49:1779–1784. https://doi.org/10.1038/ng.3984

McFarland JM, Ho ZV, Kugener G, et al (2018) Improved estimation of cancer dependencies from large-scale RNAi screens using model-based normalization and data integration. Nature Communications 9:4610. https://doi.org/10.1038/s41467-018- 06916-5

Dempster JM, Rossen J, Kazachkova M, et al (2019) Extracting Biological Insights from the Project Achilles Genome-Scale CRISPR Screens in Cancer Cell Lines. bioRxiv 720243. https://doi.org/10.1101/720243

Cowley GS, Weir BA, Vazquez F, et al (2014) Parallel genome-scale loss of function screens in 216 cancer cell lines for the identification of context-specific genetic dependencies. Scientific Data 1:140035. https://doi.org/10.1038/sdata.2014.35

Jerabek-Willemsen M, André T, Wanner R, et al (2014) MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond. Journal of Molecular Structure 1077:101–113. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2014.03.009

Szabo A, Stolz L, Granzow R (1995) Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology 5:699– 705. https://doi.org/10.1016/0959-440X(95)80064-6

Tang Y, Zeng X, Liang J (2010) Surface Plasmon Resonance: An Introduction to a Surface Spectroscopy Technique. J Chem Educ 87:742–746. https://doi.org/10.1021/ed100186y

Ritzefeld M, Sewald N (2012) Real-Time Analysis of Specific Protein-DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance. J Amino Acids 2012:816032. https://doi.org/10.1155/2012/816032

Benjamini Y, Hochberg Y (1995) Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological) 57:289–300. https://doi.org/10.1111/j.2517- 6161.1995.tb02031.x

Papillon JPN, Nakajima K, Adair CD, et al (2018) Discovery of Orally Active Inhibitors of Brahma Homolog (BRM)/SMARCA2 ATPase Activity for the Treatment of Brahma Related Gene 1 (BRG1)/SMARCA4-Mutant Cancers. J Med Chem 61:10155–10172. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.8b01318

Vangamudi B, Paul TA, Shah PK, et al (2015) The SMARCA2/4 ATPase Domain Surpasses the Bromodomain as a Drug Target in SWI/SNF-Mutant Cancers: Insights from cDNA Rescue and PFI-3 Inhibitor Studies. Cancer Res 75:3865–3878. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-14-3798

Oike T, Ogiwara H, Tominaga Y, et al (2013) A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res 73:5508–5518. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-12-4593