Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Wydział Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej Aleksandra Radko Nr albumu: 1083055 Właściwości fizyczne i samoorganizacja kompleksów DNA-surfaktant kationowy: wpływ rodzaju DNA oraz struktury surfaktantu. Praca doktorska na kierunku Biofizyka, dziedzina nauk ścisłych i przyrodniczych, dyscyplina: nauki fizyczne 𝜃 𝛾𝐿𝑉 𝛾𝑆𝐿 𝛾𝑆𝑉 Promotor: prof. dr hab. Monika Marzec, Promotor pomocniczy: dr Robert Ekiert, 10 kpz 500 pz Wydział Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej 1 2 1517 pz 100 pz 1 2 Uniwersytet Jagielloński 100 pz 10 pz 766 pz 25 pz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kpz 500 pz 10 kpz 500 pz 766 pz 25 pz Oświadczenie Ja niżej podpisana/podpisany Aleksandra Radko (nr indeksu: 1083055) doktorantka Wydziału Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej Uniwersytetu Jagiellońskiego oświadczam, że przedłożona przeze mnie rozprawa doktorska pt. ,,Właściwości fizyczne i samoorganizacja kompleksów DNA-surfaktant kationowy: wpływ rodzaju DNA oraz struktury surfaktantu” jest oryginalna i przedstawia wyniki badań wykonanych przeze mnie osobiście, pod kierunkiem prof. dr hab. Moniki Marzec i dr Roberta Ekiera. Pracę napisałam samodzielnie. Oświadczam, że moja rozprawa doktorska została opracowana zgodnie z Ustawą o prawie autorskim i prawach pokrewnych z dnia 4 lutego 1994 r. (Dziennik Ustaw 1994 nr 24 poz. 83 wraz z późniejszymi zmianami). Jestem świadoma, że niezgodność niniejszego oświadczenia z prawdą ujawniona w dowolnym czasie, niezależnie od skutków prawnych wynikających z ww. ustawy, może spowodować unieważnienie stopnia nabytego na podstawie tej rozprawy. Kraków, dnia …………………… ………………………………… podpis doktorantki/doktoranta Podziękowania Składam serdecznie podziękowania wszystkim Osobom, które przyczynił się do powstania tej pracy doktorskiej w obecnej formie. W szczególności dziękuję Opiekunom naukowym mojej pracy: Pani profesor Monice Marzec za umożliwienie prowadzenia badań wykraczających poza przyjęte zainteresowania badawcze w Jej grupie. Dziękuję za dobre słowo, pomoc w przeprowadzeniu badań i pokierowanie w odpowiednią stronę. Panu doktorowi Robertowi Ekiertowi dziękuję za umożliwienie realizacji badań dotyczących oczyszczania DNA oraz syntezy kompleksów, wsparcie oraz pomoc w ich przeprowadzeniu. Dziękuję także za możliwość testowania alternatywnych sposobów prowadzenia eksperymentów. Pani doktor Katarzynie Makyle-Juzak, dziękuję za wsparcie i pomoc w uzyskaniu wyników na wadze Langmuira, cenne wskazówki dotyczące opracowania i przedstawienia wyników. Panu doktorowi Pawłowi Dąbczyńskiemu dziękuję za pomoc w uzyskaniu obrazów AFM, oraz dobre rady. Dziękuję Współautorom moich publikacji, za cenne wskazówki, pomoc w zbieraniu i opracowaniu wyników. Za pomoc i przeprowadzenie części badań dziękuję: - Pani doktor Natalii Górskiej (spektroskopia w podczerwieni FTIR) - Panu profesorowi Damianowi Pociecha (badania strukturalne SAXS) - Panu doktorowi Andrzejowi Góreckiemu (rozdział DNA metodą chromatografii jonowymiennej) - Pani doktor Aleksandrze Deptuch oraz Pani doktor Teresie Jaworskiej-Gołąb (dyfrakcja rentgenowska) - Panu magistrowi Sebastianowi Lalikowi (spektroskopia dielektryczna) Dziękuję także wszystkim Pracownikom i doktorantom Zakładu Inżynierii Nowych Materiałów w Instytucie Fizyki na Wydziale Fizyki, Astronomii i Informatyki Stonowanej oraz Zakładu Biofizyki Molekularnej na Wydziale Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ, za pomoc, wsparcie i dobrą radę w czasie prac badawczych. Na końcu dziękuję moim Rodzicom, Dziadkom i Bratu, a także całej mojej Rodzinie za nieustające wsparcie i zainteresowanie moją pracą naukową. Spis Treści Streszczenie ............................................................................................................................... 7 Abstract ..................................................................................................................................... 8 Wstęp, motywacja i cel pracy ................................................................................................ 10 Część teoretyczna ................................................................................................................... 13 I. Historia badań DNA ...................................................................................................... 13 II. Budowa DNA ............................................................................................................ 17 III. Surfaktanty................................................................................................................. 21 IV. Kompleksy DNA – surfaktant ................................................................................... 22 Część Eksperymentalna ......................................................................................................... 25 1. Metody badawcze .......................................................................................................... 25 1.1. Elektroforeza ............................................................................................................. 25 1.2. Waga Langmuira ....................................................................................................... 27 1.3. Mikroskopia sił atomowych ...................................................................................... 30 1.4. Chromatografia jonowymienna ................................................................................. 32 1.5. Spektroskopia w podczerwieni .................................................................................. 33 1.6. Spektroskopia dielektryczna ..................................................................................... 34 1.7. Dyfrakcja rentgenowska ............................................................................................ 37 1.8. Kąt zwilżania ............................................................................................................. 39 2. Metody wynoszenia cienkich warstw ........................................................................... 41 2.1. Metoda nanoszenia wirowego ................................................................................... 42 2.2. Metoda listwy rozciągającej ...................................................................................... 42 2.3. Metoda Langmuir-Blodgett ....................................................................................... 43 3. Materiał badawczy ........................................................................................................ 44 3.1. Charakterystyka materiału badawczego .................................................................... 44 3.2. Metody przygotowania materiału badawczego ......................................................... 48 3.3. Synteza kompleksów DNA ....................................................................................... 54 4. Badanie właściwości próbek objętościowych kompleksów .......................................... 56 4.1. Badania metodą spektroskopii w podczerwieni ........................................................ 56 4.2. Badania strukturalne metodą dyfrakcji rentgenowskiej ............................................ 63 4.3. Badania metodą spektroskopii dielektrycznej ........................................................... 71 5. Badania właściwości cienkich warstw kompleksów ..................................................... 80 5.1. Swobodna energia powierzchniowa czystych substratów ........................................ 80 5.2. Cienkie warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA otrzymane różnymi metodami .......................................................................................................................................... 83 5.3. Cienkie warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA otrzymane metodą Langmuir-Blodgett ............................................................................................................................ 85 5.4. Cienkie warstwy kompleksów z CTMA na bazie różnych rodzajów DNA ............. 92 5.5. Cienkie warstwy kompleksów DNA z różnymi surfaktantami ............................... 102 Podsumowanie i wnioski ...................................................................................................... 116 Bibliografia ........................................................................................................................... 120 Spis Tabel .............................................................................................................................. 124 Spis ilustracji wykorzystanych w pracy ............................................................................. 126 Dodatek - Historia badań DNA ........................................................................................... 130 Skróty pojawiające się w pracy AFM Mikroskopia Sił Atomowych BAC chlorek benzyldimetyloheksaamonowy BAM mikroskop kąta Brewstera (ang. Brewster angle microscopy) CTMA chlorek cetyltrimetyloamonowy dsDNA podwójna nić DNA (ang. double stranded DNA) FFT Szybka transformata Fouriera (ang: Fast Fourier transform) FTIR spektroskopia fourierowska w podczerwieni (ang. Fourier-transform infrared spectroscopy) HDP chlorek heksadecylopirydynowy LB technika Langmuir-Blodgett pDNA DNA w formie plazmidu pz / bp pary zasad / (ang. base pairs) SAXS niskokątowe rozpraszanie promieni rentgenowskich (ang. Small-angle X-ray scattering) SCR Stopień pokrycia powierzchni (ang. Surface coverage ratio) XRD dyfrakcja rentgenowska (z ang. X-ray Diffraction) Streszczenie W ramach niniejszej pracy przygotowano osiem kompleksów DNA-surfaktant kationowy, opartych o cztery rodzaje DNA (trzy DNA liniowe, jedno DNA plazmidowe) oraz trzy surfaktanty kationowe (chlorek cetyltrimetyloamonowy, CTMA; chlorek benzyldimetylo-heksaamonowy, BAC; chlorek heksadecylopirydynowy, HDP). Wybrane DNA różnią się rozkładem długości łańcuchów DNA występujących w próbce (liniowe) lub ułożeniem przestrzennym łańcuchów (plazmidowe). Surfaktanty, z kolei charakteryzują się tą samą długością łańcucha węglowego (16 atomów węgla) a różnią grupą funkcyjną. Kompleksy badano w dwóch postaciach: próbek objętościowych oraz cienkich warstw. Do badania próbek objętościowych posłużono się metodami spektroskopii w podczerwieni, dyfrakcji rentgenowskiej oraz spektroskopii dielektrycznej. Badania potwierdziły utworzenie kompleksów (spektroskopia w podczerwieni), pozwoliły określić parametry komórki elementarnej dla wybranych kompleksów (dyfrakcja rentgenowska) oraz umożliwiły określenie ich właściwości elektrycznych i identyfikację procesów relaksacyjnych pojawiających się w zsyntezowanych kompleksach (spektroskopia dielektryczna). Cienkie warstwy kompleksów wytworzono metodą Langmuir-Blodgett. Opisano zachowanie się monowarstw na granicy faz ciecz-gaz i zoptymalizowano metodę wynoszenia warstw na podłoże stałe. Uzyskane warstwy zobrazowano metodą mikroskopii sił atomowych i przeprowadzono ich analizę metodą FFT. Wykazano, że w zależności od warunków wynoszenia, rodzaju DNA, surfaktantu i podłoża, metodą LB można wytworzyć monowarstwy o różnych strukturach powierzchniowych. Słowa kluczowe: Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA), surfaktanty kationowe, cienkie warstwy powierzchniowe, monowarstwa Langmuira, technika Langmuir-Blodgett (LB), Mikroskopia Sił Atomowych (AFM) ABSTRACT In the framework of PhD thesis, eight DNA-cationic surfactant complexes were prepared, based on four types of DNA (three linear, one plasmid) and three cationic surfactants (cetyltrimethylammonium chloride, CTMA; benzyldimethyl-hexaammonium chloride, BAC; hexadecylpyridinium chloride, HDP). The selected types of DNA differ in the distribution of the DNA chain length (linear) or the spatial arrangement of the chains (plasmid). In turn, surfactants are characterized by the same carbon chain length (16 carbon atoms) and differ in their functional groups. The complexes were studied in two forms: as bulk samples (powder) and thin layers. The methods of infrared spectroscopy, X-ray diffraction and dielectric spectroscopy were used to study bulk samples. The research confirmed the formation of complexes (infrared spectroscopy), allowed to determine the unit cell parameters for selected complexes (X-ray diffraction), and allowed to determine their electrical properties and to identify the relaxation process occurring in the synthesized complexes (dielectric spectroscopy). Thin layer of the complexes were created by using the Langmuir-Blodgett deposition technique. The behavior of the monolayers at the liquid-gas interface was described and the method of lifting the layer onto a solid substrate was optimized. The obtained thin layers were imaged by atomic force microscopy and the image was analyzed by using the FFT method. It has been shown that, depending on the lifting conditions, DNA type, structure of surfactant and kind of substrate, the different surface structures of monolayer can be obtained. Key words: Deoxyribonucleic acid, DNA, surfactant, cationic surfactant, thin films, monolayers, Langmuir-Blodgett, Atomic Force Microscopy Wyniki przedstawione w tej pracy zostały częściowo opublikowane w recenzowanych czasopismach: Nizioł, J., Makyła-Juzak, K., Radko, A., Ekiert, R., Zemła, J., Górska, N., Chachaj-Brekiesz, A., Marzec, M., Harańczyk, H., Dynarowicz-Latka, P. (2019). Linear, self-assembled patterns appearing spontaneously as a result of DNA-CTMA lipoplex Langmuir-Blodgett deposition on a solid surface. Polymer, 178. https://doi.org/10.1016/j.polymer.2019.121643 Radko, A., Nizioł, J., Makyła-Juzak, K., Ekiert, R., Górska, N., Górecki, A., Marzec, M. (2021). Properties of DNA-CTMA monolayers obtained by Langmuir-Blodgett technique. Materials Science and Engineering B: Solid-State Materials for Advanced Technology, 263. https://doi.org/10.1016/j.mseb.2020.114859 Radko, A., Lalik S., Deptuch A., Jaworska-Gołąb T., Ekiert, R., Górska, N, Makyła-Juzak, K., Nizioł, J., Marzec, M. (2021). Physicochemical characterization of the DNA complexes with different surfactants. Polymer, 235. https://doi.org/10.1016/j.polymer.2021.124277 Wyniki przedstawione w tej pracy zaprezentowano podczas konferencji naukowych: 2016 Pomiędzy Naukami - Zjazd Fizyków i Chemików; komunikat naukowy pt: "Metody otrzymywania uporządkowanej cienkiej warstwy kompleksu DNA-CTMA" 2017 X Ogólnopolska Konferencja „Rozpraszanie neutronowe i metody komplementarne w badaniach materii skondensowanej” – referat pt. „Cienkie warstwy DNA-CTMA do zastosowań w urządzeniach elektroniki organicznej” 2018 Seminarium Krakowsko-Katowickiego 2018 r. referat pt.” Metody otrzymywania zdefiniowanego DNA - ocena ich przydatności do otrzymywania cienkich warstw” 2019 XI Ogólnopolska Konferencja „Rozpraszanie neutronowe i metody komplementarne w badaniach materii skondensowanej” – referat pt. "Wpływ warunków wynoszenia na topologię cienkiej warstwy kompleksu DNA-CTMA" Międzynarodowa konferencja Multiscale phenomena in molecular matter, 2019 plakat pt. „Self-assembled patterns of monolayer prepared on solid surface from DNA-CTMA complex” WSTĘP, MOTYWACJA I CEL PRACY Biopolimery, takie jak kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) od dłuższego czasu są przedmiotem intensywnych badań. W ostatnich dziesięcioleciach znaleziono dla nich wiele zastosowań poza naukami biologicznymi, najczęściej w formie kompleksów DNA-surfaktant kationowy. Takie kompleksy charakteryzują się bardzo dużym potencjałem zastosowawczym z możliwością implementacji w różnych dziedzinach, od elektroniki organicznej [1] do medycyny [2]. Zbudowane są ze szkieletu, na który składa się pojedyncza lub podwójna nić DNA oraz surfaktantu przyłączającego się, poprzez oddziaływania elektrostatyczne, do ujemnie naładowanej reszty fosforanowej [3,4]. Ich struktura sprawia, że są doskonałymi „kandydatami” do wykorzystania jako matryce dla barwników organicznych [5-7], warstw blokujących elektrony w urządzeniach optoelektronicznych (diody BioLED lub ogniwa fotowoltaiczne) [8,9] czy systemy dostarczania leków [10,11]. Kompleksy DNA mogą być wykorzystywane także jako rusztowania wykorzystujące ich unikalne właściwości, takie jak spontaniczna samoorganizacja [12,13]. Biofizyczne właściwości objętościowych roztworów DNA są dobrze przebadane i znane, natomiast wciąż istnieje potrzeba badań właściwości, obserwacji zjawisk i zachowań próbek objętościowych i cienkich warstw kompleksów DNA. W przeciwieństwie do naturalnego DNA, kompleks-surfaktant kationowy jest nierozpuszczalny w wodzie a rozpuszczalny w alkoholach i cieczach niepolarnych, co ułatwia znacznie pracę z takim związkiem (znacznie mniejszy wpływ wilgotności na jego właściwości), a w szczególności otrzymywanie cienkich warstw. Kompleksy DNA – surfaktant kationowy często są badane właśnie jako cienkie warstwy na różnego rodzaju podłożach, zwykle wytwarzane metodą odwirowania (ang. spin-casting) poprzez odparowanie alkoholowego rozpuszczalnika [8,14], a także ultracienkie warstwy otrzymane poprzez rozpylanie z wiązki molekularnej [15]. Warstwy tak otrzymane mają statystyczną morfologię i grubość, zależną ściśle od warunków wynoszenia. Zastosowanie cienkich warstw w elektronice organicznej wymaga jednak bardziej precyzyjnej kontroli morfologii i grubości wytwarzanej cienkiej warstwy. Przez lata badań kompleksów DNA-surfaktant wiele związków powierzchniowo czynnych zostało przetestowanych. Jak wspomniano, łączenie surfaktantu z helisą DNA zachodzi poprzez oddziaływania elektrostatyczne, zwykle w wyniku zmieszania wodnych roztworów obu składników. Literatura wskazuje, że długość łańcucha węglowego surfaktantu jest istotna dla utworzenia kompleksu. Związki o długości łańcucha większej od 16 atomów węgla są zwykle nierozpuszczalne w wodzie, co utrudnia proces syntezy kompleksu. Ponadto silne oddziaływania pomiędzy długimi łańcuchami surfaktantów mogą rozerwać wiązania wodorowe występujące w DNA. Z drugiej strony, zbyt krótki łańcuch węglowy nie zapewni odpowiednich właściwości mechanicznych produktowi syntezy. Grupa funkcyjna (tzw. głowa surfaktantu) również będzie wpływała na proces syntezy kompleksu. Zaobserwowano, że dodatek pierścienia aromatycznego może mieć podobny wpływ na syntezę kompleksu jak wydłużenie łańcucha węglowego [16-19]. Celem niniejszej pracy doktorskiej jest określenie wpływu rozkładu długości i konformacji DNA oraz struktury surfaktantu na właściwości zsyntetyzowanego kompleksu. W tym celu przygotowano cztery rodzaje DNA (trzy DNA liniowe i jedno DNA plazmidowe), w oparciu o które utworzono kompleksy z jednym z trzech wybranych surfaktantów kationowych: chlorku cetyltrimetyloamonowym (CTMA), chlorku benzyldimetyloheksa-amonowym (BAC) lub chlorku heksadecylopirydynowego (HDP). Wybrane surfaktanty charakteryzują się tą samą długością łańcucha węglowego (16 atomów węgla) a różnią się jedynie grupą funkcyjną. Ogółem przebadano osiem kompleksów. Praca doktorska ma za zadanie weryfikację hipotezy: właściwości kompleksu DNA-surfaktant kationowy zależą zarówno od rodzaju DNA, jak i struktury surfaktantu. Motywacją podjęcia tych badań był brak, w większości przypadków, informacji w literaturze o rodzaju DNA użytego do syntezy kompleksu, a tym samym doniesienia o różnych jego właściwościach i brak możliwości porównania otrzymanych wyników. Praca składa się z trzech głównych części podzielonych na rozdziały. W części pierwszej, teoretycznej, przedstawiono skróconą historię badań dotyczących budowy, podstawowych funkcji oraz struktury DNA, opis budowy tego biopolimeru, charakterystykę związków powierzchniowo czynnych a także ogólny opis właściwości i zastosowań kompleksów DNA-surfaktant. Drugą część, doświadczalną, podzielono na 5 rozdziałów. Rozdział pierwszy opisuje techniki analityczne i pomiarowe zastosowane w pracy do określenia właściwości kompleksów. Rozdział ten zawiera także opis zestawów doświadczalnych wykorzystanych w ramach tej pracy, z uwzględnieniem geometrii pomiarów. W rozdziale drugim przedstawiono metody takie jak: nanoszenie wirowe (spin-casting), rozciąganie poziome (H-dipping), czy Langmuir-Blodgett (LB), które posłużyły do wytworzenia cienkich warstw kompleksów DNA-surfaktant na podłożu stałym. Metoda LB jest najobszerniej opisana, ponieważ jest to podstawowa technika stosowana do wynoszenia cienkich warstw w ramach niniejszej pracy. Materiał badawczy, jak również techniki wykorzystane do jego przygotowania opisano w rozdziale trzecim części doświadczalnej. Znajduje się tu także uzasadnienie wyboru metod mających na celu ograniczenie rozkładu długości łańcuchów DNA w próbce, a także opis syntezy kompleksów. Rozdziały czwarty i piąty poświęcone zostały opisowi i interpretacji otrzymanych wyników badań kompleksów DNA-surfaktant w postaci proszków (rozdział 4) oraz w formie cienkich warstw utworzonych na swobodnej powierzchni wody i wyniesionych na podłoże stałe metodą Langmuir-Blodgett (rozdział 5). Pracę zamyka podsumowanie i wnioski płynące z przeprowadzonych badań. Dołączono również spis tabel i ilustracji. Na końcu pracy, w Dodatku, zamieszczono tekst o charakterze popularnonaukowym dotyczący historii badań DNA z kalendarium najważniejszych wydarzeń, będący rozszerzeniem i uzupełnieniem informacji przedstawionych w zasadniczej części pracy. CZĘŚĆ TEORETYCZNA I. Historia badań DNA Badania DNA są nierozerwalnie związane i motywowane głównie przez naukę zwaną „genetyką” natomiast odkrywanie innych, potencjalnie użytecznych właściwości DNA rozpoczęło się dopiero w XXI wieku. Pierwsze naukowe, udokumentowane badania skupiające się na genetyce i DNA pojawiły się dopiero w połowie XIX w., kiedy w 1859 roku Karol Darwin w swojej przełomowej pracy „O powstawaniu gatunków” [20], zaproponował teorię ewolucji i selekcji naturalnej. Praca ta miała ogromny wpływ na dalsze losy nauki o dziedziczeniu, mimo że autor nie zaproponował w niej mechanizmu transmisji cech dziedzicznych. Historię genetyki, zatem także badań dotyczących budowy i właściwości DNA, rozpoczęły prace mnicha Grzegorza Mendla [21-23], który udowodnił, że dziedziczenie podlega szeregowi praw, tzw. „Prawa Mendla”. Pierwsze DNA wyizolował Friedrich Miescher w 1869 roku, z jądra komórkowego (z łac. nucleus) uzyskanego z próbki pobranej z wydzielin ran pacjentów pobliskiego szpitala [24,25] i nazwał nukleiną. Opracował także protokoły izolacji nukleiny, określił zawartość reszty kwasu fosforowego (P2O5) w spermie łososia na 22,5% (obecnie ta zawartość jest określona na 22,9%), potwierdził kwasowy charakter związku (kwas wielozasadowy o masie atomowej 500 – 600 daltonów) oraz zaproponował możliwe wzory chemiczne, np. C22H32N6P2O16 lub C29H49N9P3O22 [26]. W 1889 roku Richard Altmann [27,28] jako pierwszy rozdzielił nukleinę na część białkową (zawierającą protaminę i histony) i kwasową, którą nazwał kwasem nukleinowym [29]. Porównując kwasy nukleinowe pochodzące z różnych źródeł (drożdży, nasienia łososia, grasicy czy żółtka jaj), stwierdził brak różnic pomiędzy nimi, co zapoczątkowało zmianę nazewnictwa: określenie nukleina zostało zastąpione przez kwas nukleinowy. W latach 1885 – 1901 odkryto, że kwasy nukleinowe (DNA i RNA) składają się z pięciu zasad azotowych: adeniny (A), cytozyny (C), guaniny (G), tyminy (T, w DNA) i uracylu (U, w RNA) [30]. Schemat budowy zasad azotowych występujących w DNA zaproponowany w oryginalnej pracy przedstawiony jest na Rys. 1. Z kolei Phoebus Levene odkrył sposób połączenia trzech głównych składników pojedynczego nukleotydu, a także rybozę i deoksyrybozę - czyli cukry występujące w DNA i RNA, oraz zaproponował model "polinukleotydu" [32] do opisania budowy kwasów nukleinowych. Zgodnie z tym modelem, składają się one z grupy połączonych ze sobą nukleotydów, z których każdy zbudowany jest z zasady azotowej, cukru i grupy fosforanowej. Rys. 1 Schemat budowy zasad azotowych, wykład noblowski A. Kossela [31]. Na początku lat 50. XX wieku próbowano rozwikłać strukturę DNA. Ervin Schrödinger twierdził, że jest to pewnego rodzaju kryształ aperiodyczny [33], a Rosalind Franklin, że DNA ma gęsto upakowaną strukturę helikalną zawierającą 2, 3 lub 4 skręcone łańcuchy kwasu nukleinowego, z grupami fosforanowymi skierowanymi na zewnątrz [34]. Natomiast Ervin Chargaff podał liczbę nukleotydów zawierających poszczególne zasady azotowe. Pokazano także, że aby struktura DNA była stabilna, adenina musi łączyć się z tyminą za pomocą dwóch wiązań wodorowych, a guanina z cytozyną za pomocą trzech wiązań wodorowych [35,36]. Jako poprawny i ostateczny uznano model DNA, przedstawiony w 1953 roku przez Francisa Cricka oraz Jamesa Watsona [37], który opierał się na wynikach badań rentgenowskich Rosalind Franklin i Raymonda Goslinga. DNA okazało się być podwójną helisą skręconą w prawą stronę, o szkielecie zbudowanym z reszty fosforanowej i deoksyrybozy, łączącej się z jedną z zasad azotowych. Zasady azotowe skierowane są do środka i dobierają się specyficznie w pary A-T oraz C-G. Na jeden skręt helisy proponowanej przez Watsona i Cricka przypadało 10 par zasad [37,38]. Właściwości DNA są stale badane, a samo DNA można wykorzystać na wiele sposobów. W ciągu ostatnich dwóch dekad znalazło ono swoje zastosowanie także w nanotechnologii. DNA w konstrukcji nanourządzeń może być wykorzystane m.in. na jeden z poniższych sposobów: • wytwarzanie sztucznych sieci z wykorzystaniem natywnego DNA; • przyłączenie cząsteczki DNA do powierzchni stałej, taka immobilizacja na powierzchni pozwala m.in. na konstrukcję biosensorów; • formowanie cząsteczek metalu lub półprzewodnika wzdłuż łańcucha DNA np. poprzez przyłączanie dodatnio naładowanego koloidu do ujemnie naładowanych reszt grup fosforanowych. DNA z uwagi na swoje właściwości samoorganizacyjne może także tworzyć matryce dla różnych cząsteczek (np. półprzewodników), które na jej podstawie tworzą struktury dwu- lub trójwymiarowe. DNA pozwala także tworzyć układy przestrzenne z wykorzystaniem kropek kwantowych, nanodrutów, a także może być wykorzystywane do funkcjonalizowania nanorurek. Najczęściej jednak naturalne DNA wykorzystywane jest w dziedzinach związanych z biomedycyną, diagnostyką czy analizą biologiczną. Cząsteczki DNA wchodzą w skład nanosensorów służących głównie do detekcji i analizy biomolekuł, takich jak kwasy nukleinowe, białka, komórki czy jony metali. Główną przeszkodą, do szerokiego wykorzystania DNA, poza naukami biologicznymi czy medycznymi, są jego właściwości hydrofilowe. DNA jest niezmierne podatne na wszelkie zmiany wilgotności powietrza, co sprawia, że prowadzenie badań jest utrudnione, a wyniki zależą od wilgotności otoczenia. W związku z tym, poza naukami biologicznymi, DNA stosuje się w postaci kompleksów [39-41]. Pierwsze przesłanki sugerujące zainteresowanie badaniami kompleksów DNA pojawiły się w literaturze w połowie lat 80. XX wieku. Od tamtej pory zainteresowanie tą klasą związków stale rośnie ze względu na ich właściwości i potencjalne możliwości wykorzystania w różnych dziedzinach, od optoelektroniki po biomedycynę. DNA może tworzyć związki kompleksowe z szeregiem różnych substancji, jednak najczęściej są to kompleksy DNA z surfaktantami kationowymi oraz lipidami, chociaż połączenie DNA z cząsteczkami metali także uznaje się za kompleksy. Warto zwrócić uwagę, że pomimo iż kompleksy DNA powstają na zasadzie oddziaływań elektrostatycznych bez wytworzenia formalnego wiązania koordynacyjnego [42], to w literaturze takie elektrostatyczne połączenie DNA np. z surfaktantem kationowym często określane jest mianem kompleksu lub lipopleksu. W porównaniu do natywnego DNA utworzenie kompleksu zmienia jego właściwości. Związki takie są znacznie mniej czułe na różnice wilgotności otoczenia, przez co poszerza się ich potencjał aplikacyjny. Kompleks jest też bardziej stabilny niż czyste DNA. Kompleksy DNA z surfaktantem kationowym są nierozpuszczalne w wodzie, w związku z tym znalazły zastosowanie w wielu dziedzinach nauki, także poza naukami biologicznymi. Najczęściej badane są w postaci warstw lub jako ciekłe kryształy, zwykle w środowiskach o dużej wilgotności. W obu tych formach zachowują dobrze zdefiniowane struktury, są stabilne i stosunkowo łatwo można je przetwarzać. Przykładowo, kompleksy DNA stosuje się [40]: • w terapii genowej w formie liotropowych ciekłych kryształów; • do kontrolowania zakresu temperaturowego występowania właściwości ciekłokrystalicznych; • do tworzenia hydrożeli i efektywnych systemów uwalniania substancji; • do zmiany właściwości elektrycznych cienkich warstw; • do zmiany właściwości optycznych i optoelektronicznych warstw; • do konstrukcji urządzeń elektroniki molekularnej, np.: OLED. Badania kompleksów DNA w ciągu ostatnich lat w dużej mierze skupiają się na implementacji cienkiej warstwy kompleksu do urządzeń elektroniki molekularnej. Zbadano między innymi anizotropowe przewodnictwo odpowiednio przygotowanej cienkiej warstwy kompleksu DNA-surfaktant, obserwując znaczne różnice w przewodnictwie wzdłuż nici DNA w zależności od ich orientacji względem elektrod [43]. Stwierdzono, że właściwości optyczne warstwy kompleksu DNA zależą od wielu parametrów, m.in. typu surfaktantu, długości DNA czy ilości wprowadzonego do kompleksu barwnika, otrzymując np. dla kompleksu DNA-CTMA dużą transmisję w zakresie bliskiej podczerwieni i światła widzialnego [44]. W innych badaniach warstwy tego kompleksu okazały się być stabilne w temperaturze do 200 °C i wykazywały opór elektryczny w zakresie 10-105 GΩ, co sugeruje możliwość wykorzystania takich warstw jako falowody optyczne, czy elementy w nieliniowych modulatorach optycznych [45]. Kompleksy DNA z surfaktantami stosuje się także w celu uniknięcia zmniejszenia fluorescencji wraz ze wzrostem stężenia barwnika. Pełni on tam rolę matrycy oddzielającej cząsteczki barwnika, co pozwala na uzyskanie wysokiej fluorescencji przy wysokich stężeniach barwników [44]. Na bazie kompleksów DNA-surfaktant powstał szereg urządzeń optoelektronicznych. Dla przykładu: skonstruowano diodę OLED, w której warstwa kompleksu DNA-CTMA pełni rolę warstwy blokującej elektrony, znacząco zwiększając jasność diod oraz jej wydajność w porównaniu do tradycyjnej diody OLED [8]. Zbudowano także urządzenie OLED z warstwą kompleksu DNA/polianilina/ Ru(bpy)32+, które może zmieniać kolor świecenia w zależności od natężenia pola elektrycznego [46]. Raportuje się także wykorzystanie warstw kompleksu DNA-CTMA w konstrukcji ogniw fotowoltaicznych zastępując nimi powszechnie używaną warstwę PEDOT: PSS. Badania laboratoryjne wskazują na odpowiednie zachowanie takich ogniw, choć wciąż potrzebują one jeszcze dopracowania [47]. Publikacje opisujące badania właściwości cienkich warstw kompleksów DNA (grubości rzędu kilkudziesięciu – kilkuset nm) często nie zawierają informacji na temat rodzaju wykorzystanego DNA, rozkładu jego długości, itp. W związku z tym, w ramach niniejszej pracy postanowiono zbadać wpływ rozkładu długości DNA wykorzystanego do syntezy kompleksu i jego konformacji na właściwości kompleksów utworzonych z trzema różnymi surfaktantami. Badania prowadzono zarówno dla cienkich warstw wynoszonych na powierzchnię stałą, jak i dla próbek objętościowych. II. Budowa DNA Z chemicznego punku widzenia DNA należy do grupy wielkocząsteczkowych związków organicznych z grupy kwasów nukleinowych, do których, poza DNA (kwasem deoksyrybonukleinowym), zalicza się także RNA (kwas rybonukleinowy). Kwas deoksyrybonukleinowy jest liniowym, nierozgałęzionym biopolimerem i, jako polimer, składa się z monomerów. W skład monomeru cząsteczki DNA wchodzi cukier deoksyryboza (2-deoksyryboza – nazwy używane są wymiennie) o wzorze sumarycznym C5H10O4 (wzór strukturalny przedstawiono na Rys. 2 Wzór strukturalny deoksyrybozy.Rys. 2 [48,49], która przez węgiel 5’ łączy się z resztą fosforanową PO4. Atom węgla C1 z kolei tworzy wiązanie N-glikozydowe z jedną z zasad azotowych, które są pochodnymi puryny (adenina A, guanina G) i pirymidyny (tymina T, cytozyna C). Wzory strukturalne zasad azotowych wchodzących w skład DNA są przedstawione na Rys. 3 Obraz zawierający tekst, urządzenie Opis wygenerowany automatycznie . Rys. 2 Wzór strukturalny deoksyrybozy. Obraz zawierający mapa Opis wygenerowany automatycznie Obraz zawierający mapa Opis wygenerowany automatycznie Rys. 3 Wzory strukturalne zasad azotowych występujących w DNA. Szkielet DNA łączy się wiązaniem 5’- 3’ fosfodiestrowym, czyli poprzez resztę fosforanową usytuowaną pomiędzy atomami węgla 5’ a 3’ dwóch kolejnych cząsteczek cukru [50]. Nić DNA ma określony kierunek, dlatego rozróżnia się dwa możliwe końce: koniec 5’ oraz koniec 3’. Końcem 5’ nazywamy skrajny nukleotyd, przy którym występuje wolna grupa fosforanowa przyłączona do węgla 5’. Z drugiej strony występuje koniec 3’, w którym do grupy hydroksylowej położonej przy atomie węgla 3’ nie przyłącza się atom tlenu z kolejnej grupy fosforanowej. Grupy fosforanowe znajdujące się na zewnątrz szkieletu cukrowego są naładowane negatywnie, co sprawia, że powierzchnia jest silnie hydrofilowa. DNA jest rozpuszczalne jedynie w wodzie i buforach na bazie wody. Najczęściej spotykane jest DNA dwuniciowe (Rys. 4), oznaczane jako dsDNA, (ang. double stranded DNA) jednak występują także inne jego formy: DNA jednoniciowe (ssDNA, ang. single stranded DNA), DNA trójniciowe i czteroniciowe. W przypadku dsDNA nici łączą się w sposób antyrównoległy. Oznacza to, że koniec 5’ jednej nici leży dokładnie naprzeciwko końca 3’ drugiej nici komplementarnej (Rys. 4). Wiązania szkieletu DNA (cukier – reszta fosforanowa) usytuowane są po zewnętrznej stronie podwójnej helisy, a do wnętrza helisy skierowane są zasady azotowe (Rys. 4), które między sobą łączą się za pomocą wiązań wodorowych oraz oddziaływań hydrofobowych [51,52]. Wiązanie wodorowe powstaje zawsze pomiędzy komplementarnymi parami zasad azotowych: adenina - tymina i cytozyna - guanina, co pozwala na odtworzenie sekwencji jednej nici na podstawie sekwencji nici komplementarnej. Rys. 4 Schemat budowy DNA. Wzajemne oddziaływanie nici DNA między sobą i ich charakterystyczne zwinięcie prowadzi do powstania dwóch rowków między nićmi: większego i mniejszego (Rys. 5) [53,54]. Rys. 5 Schematyczne przedstawienie rowka większego i mniejszego w podwójnej helisie DNA. Podwójna helisa ma średnio około 10,5 par zasad na jeden skręt helisy, jednak zależy to od szeregu czynników zewnętrznych, takich jak wilgotność, pH, otoczenie chemiczne, zawartość soli, sekwencja nukleotydów, obecność w środowisku zmodyfikowanych zasad azotowych lub poliamidów. Najczęściej występującymi typami konformacji DNA są A-DNA, B-DNA oraz Z-DNA. Formy A-DNA oraz B-DNA są do siebie podobne, A-DNA powstaje w momencie obniżonej wilgotności (dehydratacji) formy B-DNA. Obie są prawoskrętne. Z-DNA natomiast jest cząsteczką lewoskrętną występującą w środowisku z dużą zawartością soli [55]. W Tabeli 1 przedstawiono charakterystyczne parametry podwójnej helisy DNA typu A i B. Widocznym jest, że forma A-DNA jest nieco szersza i krótsza od formy B-DNA. Tabela 1 Charakterystyczne parametry budowy DNA typu B i A [51]. Parametr Forma A Forma B Odległość między zasadami 0,23 nm 0,332 nm Szerokość helisy 2,55 nm 2,37 nm Rotacja Prawoskrętna Prawoskrętna Liczba par zasad na skręt helisy 11 10,5 Skok helisy 2,53 nm 3,54 nm DNA może także występować w formie małych kolistych molekuł zwanych plazmidami [56]. Cząsteczki plazmidu są zwykle mniejsze od cząsteczek DNA chromosomalnego (u człowieka DNA chromosomalne ma długość od ok. 4700 kpz – ok. 250 Mpz [57]) i składają się z 300 pz do 2400 kpz [58]. W wyniku pęknięcia jednej nici DNA powstaje forma kolista ocDNA (ang. open circle, Rys. 6 b), natomiast w przypadku przecięcia obu nici plazmidu kolistego otrzymuje się formę liniową DNA. Przyczyną pęknięcia (lub przecięcia) nici DNA mogą być czynniki chemiczne, fizyczne lub trawienie enzymatyczne. DNA plazmidowe występuje także w formie kowalencyjnie zamkniętego koła (cccDNA, ang. covalently closed circle), inaczej nazywane formą superskręconą [59]. Każda z nici plazmidowego DNA jest połączona dwoma wiązaniami 5’- 3’ w formę kolistą, jednak w wyniku dodania lub usunięcia skrętów helisy (niezbędnych do zamknięcia struktury) powstaje dodatkowe napięcie torsyjne, które skutkuje zwinięciem cząsteczki wokół siebie i upakowaniem jej w bardziej zwartą formę superskręconą (Rys. 6c). (a) (b) (c) Rys. 6 Trzy możliwe konformacje DNA plazmidowego (a) liniowe, (b) koliste, (c) superskręcone. III. Surfaktanty Nazwa surfaktant pochodzi od angielskiego opisu właściwości tych cząsteczek (ang. surface active agent [60]) czyli środek powierzchniowo czynny. W literaturze pojawiła się w 1950 roku jako zbiorcza nazwa dla związków chemicznych będących powierzchniowo aktywnymi, np. środki zwilżające, emulgatory, detergenty czy środki spieniające [61]. Zgodnie z obecnie obowiązującą definicją, surfaktant to substancja, która występując w niewielkim stężeniu, adsorbuje na powierzchni lub na granicy faz i zmniejsza w znacznym stopniu swobodną energię powierzchni lub granic fazowych. Surfaktanty cechuje charakterystyczna, amfifilowa budowa. Posiadają one grupy hydrofilowe i hydrofobowe (Rys. 7), co pozwala im adsorbować na granicy dwóch faz np. cieczy i gazu układając się tak, aby hydrofilowa głowa (wykazująca powinowactwo do rozpuszczalnika polarnego) zanurzona była w wodzie, a hydrofobowy ogon (wykazujący powinowactwo do rozpuszczalnika niepolarnego) był poza nią – wystawiony na działanie np. gazu. Rys. 7 Schemat budowy cząsteczki amfifilowej. Duże stężenie surfaktantów może prowadzić do ich agregacji w roztworze. Tworzą wtedy struktury zwane micelami tak, aby eksponowane do cieczy były jedynie hydrofilowe fragmenty cząsteczki. Surfaktanty mogą także łączyć się w dwuwarstwy. Ostateczny wygląd agregatów surfaktantów zależy od stężenia surfaktantu w roztworze i struktury chemicznej surfaktantu (rozmiaru części hydrofilowej i hydrofobowej). IV. Kompleksy DNA – surfaktant Kompleksy DNA mogą wykazywać właściwości samoorganizacyjne lub przyjmować bardzo konkretne formy. Generalnie zbudowane są ze szkieletu DNA i przyłączonych do niego wiązaniem niekowalencyjnym łańcuchów bocznych. Wiązanie chemiczne zachodzi pod wpływem przyciągania elektrostatycznego DNA i cząsteczki surfaktantu, wymaga zatem obecności przeciwnie naładowanych jonów. DNA ma ładunek ujemny i do utworzenia kompleksu potrzebuje surfaktantu kationowego. Powstanie kompleksu DNA z surfaktantem anionowym wymaga zastosowania dodatkowej cząsteczki pośredniczącej. Proces tworzenia kompleksów DNA-surfaktant kationowy zachodzi dla stosunkowo niewielkich stężeń, ponieważ dla większych stężeń dochodzi do niepożądanych agregacji lub tworzenia miceli, które utrudniają efektywne tworzenie się kompleksu. Już od niewielkich stężeń kompleksu można zaobserwować formy separacji fazowej, tworzą się żele, fazy ciekłokrystaliczne czy osady. Na rodzaj otrzymanego agregatu wpływ mają m.in. zasolenie, długość łańcucha węglowego surfaktantu czy grupa funkcyjna głowy. Tworzenie kompleksu jest procesem dwuetapowym: i. Cząsteczka surfaktantu wiąże się na zasadzie oddziaływań elektrostatycznych do wolnej grupy fosforanowej DNA, ii. W wyniku silnych oddziaływań hydrofobowych między łańcuchami surfaktantu łańcuchy ustawiają się w odpowiednich pozycjach. Z badań dotyczących interakcji surfaktantów z DNA wynika, że istnieje wiele czynników wpływających na szybkość i efektywność tworzenia kompleksów. Spośród tych czynników warto wymienić: a) Długość łańcucha surfaktantu. Surfaktant z dłuższym łańcuchem węglowym prowadzi do otrzymania osadu kompleksu przy niższym stężeniu DNA, z kolei łańcuchy surfaktantów dłuższe niż 16 – 18 atomów węgla mogą powodować zniszczenie struktury DNA [16,3]. b) Charakter grupy funkcyjnej „głowy” surfaktantu. Surfaktanty posiadające ładunek ujemny lub nieposiadające ładunku nie łączą się bezpośrednio z DNA, do utworzenia kompleksu konieczne jest dodanie cząsteczki pośredniczącej [17,62]. c) Hydrofobowość surfaktantu. Zwiększenie hydrofobowości surfaktantu (np. poprzez dodanie pierścienia aromatycznego pomiędzy grupę „głowy” i łańcuch węglowy) ma podobny skutek jak wydłużenie łańcucha węglowego surfaktantu [63,64]. Kompleksy DNA mogą występować w różnych formach: 1) Termotropowe ciekłe kryształy, które otrzymuje się poprzez reakcję kompleksacji kwasów nukleinowych z surfaktantem kationowym posiadającym dwa łańcuchy alifatyczne, a następnie dehydratację produktu syntezy. Dla uzyskania żądanych właściwości ciekłokrystalicznych krytyczne jest wykorzystanie DNA jednoniciowego. Długości DNA i łańcuchów alifatycznych surfaktantów również mają duży wpływ na właściwości ciekłego kryształu, np. ze wzrostem długości surfaktantu rośnie lepkość związku. 2) Liotropowe ciekłe kryształy, które powstają poprzez reakcję dwuniciowego DNA z cieczami kationowymi, np. DOTAP (dioeleoyltrimethylammonium propane). 3) Struktury lamellarne, wielowarstwowe, powstające w roztworach wodnych kompleksów DNA, charakterystyczne dla liotropowych ciekłych kryształów. Jak już wspomniano, kompleksy DNA – surfaktant kationowy tworzą się na podstawie oddziaływań elektrostatycznych pomiędzy atomem azotu posiadającym ładunek dodatni w cząsteczce surfaktantu, a ujemnie naładowaną grupą fosforanową DNA. Możliwy sposób przyłączenia CTMA do DNA przedstawiono na Rys. 8. (a) Obraz zawierający tekst Opis wygenerowany automatycznie (b) Rys. 8 Możliwy sposób przyłączenia CTMA do szkieletu DNA przy założeniu wiązania surfaktantu do każdej reszty fosforanowej. Rzut z boku (a) i z góry (b). CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA 1. Metody badawcze W tej części przedstawiono metody badawcze zastosowane do badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy. Jako pierwsze opisano metody pozwalające na określenie parametrów otrzymanego materiału, następnie metody badania zarówno cienkich warstw jak i próbek objętościowych wytworzonych kompleksów DNA. Metody wykorzystane do wytworzenia cienkich warstw przedstawiono w następnym rozdziale. 1.1. Elektroforeza Terminem „elektroforeza” określa się zarówno zjawisko elektrokinetyczne jak i metodę analityczną. Elektroforeza jest zjawiskiem elektrokinetycznym zachodzącym w zewnętrznym polu elektrycznym, które polega na ruchu nieobojętnych elektrycznie cząstek rozpuszczonych lub zawieszonych w roztworze elektrolitu (buforze) pod wpływem przyłożonego napięcia. Metoda elektroforezy pozwala na rozdział makrocząsteczek ze względu na ich charakterystyczne cechy, takie jak np. wielkość i ładunek. Separacja może być prowadzona bezpośrednio w roztworze elektrolitu lub za pośrednictwem nośników elektroforetycznych (np. bibuła, żele), które zwiększają zwykle rozdzielczość podziału. I tak, żele agarozowe lub poliakrylamidowe o określonym stężeniu, tworzą przestrzennie usieciowane struktury działające na zasadzie sita molekularnego. Żele poliakrylamidowe zwykle charakteryzują się gęstszym upakowaniem i drobniejszymi porami, co pozwala na separację mniejszych peptydów, białek czy kwasów nukleinowych. Z kolei struktura żeli agarozowych jest mniej upakowana i bogata w większe pory co umożliwia separację większych cząstek. Stopień usieciowania zależny jest od stężenia wykorzystanego żelu i wynosi od 0,4% do ok. 4% (żele agarozowe) oraz do 20% (żele poliakrylamidowe) [65]. Metoda elektroforezy, stosowana do badania białek, peptydów czy kwasów nukleinowych, jest obecnie szeroko wykorzystywana m.in. w medycynie sądowej, weterynarii, kontroli jakości żywności czy diagnostyce laboratoryjnej. Elektroforeza DNA [66] jako technika analityczna pojawiła się już ok. 1942 roku, a w latach 70. XX w. po raz pierwszy techniki elektroforetyczne zostały wykorzystane do określenia względnej molarności oraz długości fragmentów DNA. Na przebieg procesu elektroforezy wpływają następujące czynniki: ➢ Siła jonowa – zależna od oddziaływań międzyjonowych i ich zachowania w polu elektrycznym, zależy od stężenia molowego, ładunku jonów oraz ich liczby. ➢ Temperatura – utrzymanie stałej temperatury jest istotne dla właściwości materiału badawczego (zbyt wysoka temperatura może spowodować denaturację białek) oraz powtarzalności wyników (ciepło może powodować nieregularności w usieciowaniu nośnika). ➢ pH – w zależności od rodzaju przeprowadzanej elektroforezy gradient pH może mieć bardzo duży wpływ na rozdział materiału. W celu jak najbardziej precyzyjnego określenia długości otrzymanych fragmentów rozdzielanego materiału stosuje się drabinki kalibracyjne dostosowane do przewidywanej długości produktu rozdziału. Drabinki kalibracyjne wykorzystywane podczas prowadzonych badań, wraz z odpowiadającymi im długościami fragmentów DNA, przedstawiono na Rys. 9. (a) (b) (c) (d) (e) Obraz zawierający stół Opis wygenerowany automatycznie Rys. 9 Drabinki kalibracyjne, drabinka 1kbp – zakres 500 pz– 10 000 pz (a); drabinka 10 bp – zakres 10 pz – 100 pz (b); drabinka 100 bp – zakres 100 pz – 1517 pz (c); drabinka małocząsteczkowa/25 bp – zakres 25 pz – 766 pz (d); drabinka 50 bp – zakres 50 pz – 1350 pz (e). 1.2. Waga Langmuira Monowarstwa Langmuira to nierozpuszczalna monomolekularna warstwa cząsteczek utworzonych przez związki powierzchniowo czynne (surfaktanty) na granicy faz ciecz-gaz [67-68]. Monowarstwy Langmuira, ze względu na swoją strukturę można potraktować jako model biologicznej błony (stanowiącej połowę naturalnej dwuwarstwy) [69]. Podstawowym urządzeniem służącym do tworzenia cienkich warstw powierzchniowych na swobodnej powierzchni cieczy oraz wynoszenia ich na powierzchnię ciała stałego jest waga Langmuira [70], której główną część stanowi teflonowa wanienka (Rys. 10) wypełniona najczęściej wodą lub wodnym roztworem rozpuszczonej w niej soli. W środku wanienki znajduje się studnia umożliwiająca transfer utworzonej monowarstwy na powierzchnię ciała stałego (miki, krzemu, szkła) [71], dodatkowo waga wyposażona jest w jedną lub dwie ruchome barierki wykonane zazwyczaj z materiału hydrofobowego tj. politetrafluoroetylenu (tzw. teflonu), rzadziej z materiału hydrofilowego tj. polioksymetylenu (tzw. delrinu). Ruchome barierki pozwalają na symetryczną kompresję utworzonej na subfazie wodnej cienkiej monowarstwy, a zmiana wartości ciśnienia powierzchniowego monowarstwy w trakcie jej kompresji monitorowana jest metodą Wilhelmy’ego (płytka Wilhelmy’ego wykonana najczęściej z bibuły filtracyjnej czy platyny jest zanurzona w subfazie wodnej). Przy powierzchni płytki występuje menisk wklęsły, a siły napięcia powierzchniowego wciągają płytkę w głąb cieczy. Ciężar cieczy wznoszącej się ponad powierzchnię subfazy po płytce jest równoważony przez napięcie powierzchniowe. Każda zmiana napięcia powierzchniowego wywołana np. dodaniem cząsteczek związku powierzchniowo czynnego, czy kompresją monowarstwy powoduje zmiany, które przetwarzane są przez sensor na podstawie różnic w ciężarze płytki. Rys. 10 Schemat budowy powierzchniowej wagi Langmuira. 1 - teflonowa wanienka, 2 - barierki ograniczające, 3 - studzienka, 4 - płytka Wilhelmy’ego, 5 - sensor ciśnienia powierzchniowego, 6 - urządzenie zanurzające z podłożem stałym. W celu utworzenia monowarstwy Langmuira, na powierzchnię cieczy wypełniającej teflonową wanienkę, przy użyciu mikrostrzykawki, nakrapiany jest roztwór zawierający cząsteczki amfifilowe rozpuszczone w lotnym rozpuszczalniku (np. chloroform czy benzen). Po odparowaniu rozpuszczalnika i ustaleniu równowagi termodynamicznej na swobodnej powierzchni cieczy tworzy się monowarstwa Langmuira, którą następnie się kompresuje. W trakcie kompresowania monowarstwy rejestrowany jest graficzny zapis zależności ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni zajmowanej przez cząsteczkę w monowarstwie, nazywany izotermą π-A. Analiza kształtu zarejestrowanej izotermy, dostarcza informacji o stanie fizycznym badanej monowarstwy. Różnice, jakie występują pomiędzy tymi stanami, są wywołane zróżnicowanym upakowaniem cząsteczek oraz ich wzajemnym oddziaływaniem. Na Rys. 11 przedstawiono izotermę π-A wraz ze schematycznym ułożeniem cząsteczek monowarstwy na powierzchni cieczy. Obraz zawierający tekst, jasne, ciemny, zrzut ekranu Opis wygenerowany automatycznie Rys. 11 Przykładowa izoterma π-A z zaznaczonymi charakterystycznymi stanami fizycznymi monowarstwy. Rysunek własny na podstawie [72]. Maksymalna kompresja monowarstwy prowadzi do tzw. załamania monowarstwy, czyli momentu, w którym cząsteczki przestają tworzyć monomolekularną warstwę, a zaczynają tworzyć strukturę trójwymiarową. Ciśnienie powierzchniowe przy którym następuje załamanie monowarstwy określa się jako ciśnienie kolapsu (πcoll). W celu określenia stanu fizycznego monowarstwy wyznacza się współczynnik ściśliwości, który opisuje wzór (1): 𝐶𝑆−1=−𝐴(𝜕𝜋𝜕𝐴)𝑇,𝑝,𝑛 (1) gdzie: 𝐶𝑆−1 – współczynnik ściśliwości, A powierzchnia przypadająca na cząsteczkę, π – ciśnienie powierzchniowe. Przybliżone wartości współczynnika ściśliwości wraz z odpowiadającymi im stanami warstwy monomolekularnej przedstawiono w Tabeli 2. Tabela 2 Przybliżone wartości współczynników ściśliwości dla stanów warstw monomolekularnych [73]. Stan błonki monomolekularnej 𝐶𝑆−1 [mN/m] Stan gazowy 0 – 12,5 Stan ciekły Stan cieczy rozprężonej (LE/L1) 12,5 – 50 Stan pośredni (LE-LC) 50 - 100 Stan cieczy skondensowanej (LC/L2) 100 – 250 Stan stały >250 Metodą pozwalającą badać morfologię monowarstwy jest opracowana w 1991 roku mikroskopia kąta Brewstera (BAM) [74], która pozwala na wizualizację i obserwację zmian zachodzących w monowarstwie Langmuira w czasie rzeczywistym. Zasada działania mikroskopu kąta Brewstera opiera się na zachowaniu światła spolaryzowanego padającego na granicę faz ciecz-gaz pod kątem Brewstera (53o) [75,76]. Kąt Brewstera jest tak dobrany, że w momencie padania na wodę promień świetlny ugina się i nie następuje odbicie. W przypadku, kiedy promień pada na monowarstwę następuje odbicie, które rejestrowane jest przez detektor i zapisywane w postaci tzw. obrazów BAM komputera. Analiza obrazów BAM pozwala na [77]: • optymalizację parametrów wynoszenia monowarstwy na powierzchnię ciała stałego, • badanie organizacji i wzajemnego oddziaływania cząsteczek w warstwie powierzchniowej, • Określenie, w przybliżeniu, morfologii oraz grubości utworzonej warstwy powierzchniowej. W ramach niniejszej pracy, izotermy (π–A) zostały zarejestrowane na wadze Langmuira firmy NIMA z dwoma barierkami ograniczającymi, o łącznej powierzchni 503 cm2. Ciśnienie powierzchniowe zmierzono z dokładnością do 0,1 mN/m wykorzystując płytkę Wilhelmy’ego wykonaną z bibuły chromatograficznej (Whatman). Kompleksy DNA-surfaktant przed nakropieniem na wagę rozpuszczono w etanolu, do którego w późniejszym etapie dodano chloroform uzyskując stosunek objętościowy 1:4. Roztwór nanoszono na powierzchnię subfazy po kropli wykorzystując strzykawkę Hamilton o pojemności 250 μl, po czym warstwa osiągała równowagę przez 5 minut przed rozpoczęciem kompresji. Zmiany wyglądu monowarstwy podczas kompresji rejestrowano za pomocą mikroskopu kąta Brewstera tzw. BAM (Accurion GmbH, Niemcy), wyposażonego w 50 mW laser emitujący światło p-spolaryzowane o długości fali 658 nm. Mikroskop znajdował się nad wagą Langmuira KSV NIMA z dwoma barierkami ograniczającymi o całkowitej powierzchni 841 cm2. Przykładową izotermę zarejestrowaną dla kompleksu DNA-CTMA wraz z obrazem BAM przedstawiono na Rys. 12. W oparciu o izotermy (π–A) można było określić różnice w ułożeniu cząsteczek budujących monowarstwę oraz wyznaczyć ciśnienia powierzchniowe do transferu monowarstwy na powierzchnię stałą. Rys. 12 Przykładowa izoterma wraz z obrazem BAM dla kompleksu DNA-CTMA. 1.3. Mikroskopia sił atomowych Mikroskopia sił atomowych (AFM, ang. Atomic Force Microscopy) opracowana została w 1986 roku i jest jedną z wielu form mikroskopii wykorzystujących sondę skanującą. Pozwala na uzyskanie obrazów powierzchni z bardzo dobrą zdolnością rozdzielczą, rzędu pojedynczych atomów. Ogólna zasada działania mikroskopów z sondą skanującą polega na przemiataniu ostrza nad powierzchnią próbki. W metodzie AFM ostrze znajduje się na końcu dźwigni nazywanej także belką (ang. cantilever), która ugina się pod wpływem sił występujących pomiędzy atomami ostrza a atomami badanej powierzchni [78]. Wyróżnia się trzy główne tryby pracy mikroskopu AFM: • kontaktowy (ang. contact mode), • przerywanego kontaktu (ang. tapping mode), • bezkontaktowy (ang. non-contact mode). Rys. 13 Zakresy sił w badaniach AFM. Rysunek własny na podstawie [77]. Obraz zawierający tekst Opis wygenerowany automatycznie Głównym czynnikiem różnicującym te tryby pracy są siły występujące pomiędzy ostrzem a badaną powierzchnią (Rys. 13). W przypadku trybu kontaktowego występują silne oddziaływania odpychające, a ostrze jest w stałym kontakcie z podłożem lub porusza się w stałej odległości (mniej niż 1Å) od niego. Tryb bezkontaktowy wykorzystuje słabe oddziaływania przyciągające, a ostrze przez cały czas trwania pomiaru wprowadzone jest w drgania, które zmieniają się pod wpływem oddziaływań z powierzchnią. W trybie przerywanego kontaktu występują silne oddziaływania odpychające, ale w przeciwieństwie do trybu kontaktowego igła skanująca wprawiona jest w ciągłe drgania. Pomiary metodą mikroskopii sił atomowych wykonano w trybie bezkontaktowym w temperaturze pokojowej przy pomocy mikroskopu Agilent 5500 AFM Microscope. Dla każdej warstwy zebrano kilka obrazów, z losowo wybranych miejsc na próbce. Przykładowy obraz zarejestrowany dla kompleksu pDNA-CTMA przedstawiono na Rys. 14. Obrazy AFM topografii powierzchni pozwoliły na zaobserwowanie, w jaki sposób kompleksy DNA układają się na powierzchni ciała stałego oraz na identyfikację różnic w wyglądzie monowarstwy w zależności od warunków pomiarowych. Pozwoliły także na określenie stopnia pokrycia (SCR, ang. Surface Coverage Ratio) obrazu przez kompleks DNA-surfaktant, wyznaczając stosunek powierzchni obrazu zajęty przez struktury powierzchniowe do całej powierzchni próbki. W tym celu zastosowano program ImageJ. Rys. 14 Przykładowy obraz AFM uzyskany dla kompleksu pDNA-CTMA. 1.4. Chromatografia jonowymienna Doniesienia o wykorzystywaniu chromatografii jonowymiennej pochodzą już z 1850 roku, kiedy Thompson badał adsorpcję jonów amonowych do gleby [79]. Od 1956 roku technikę tę przystosowano przede wszystkim do rozdzielania białek [79], a obecna postać chromatografii została opracowana w drugiej połowie lat 70. XX wieku jako chromatografia anionowa (1979 r.) i chromatografia kationowa (1980 r.) [80]. Chromatografia jonowymienna jest ważną techniką analityczną wykorzystywaną do rozdzielania i oznaczania związków jonowych. Odgrywa istotą rolę w rozdzielaniu peptydów, białek, kwasów nukleinowych i pokrewnych biopolimerów, gdzie separacja opiera się na tworzeniu wiązań jonowych pomiędzy naładowanymi molekułami a złożem o przeciwnym ładunku [81]. Obejmuje ona fazę stacjonarną i ruchomą. Faza stacjonarna tzw. jonit jest matrycą umożliwiającą wymianę jonów z otoczeniem, która składa się z nieruchomego i nierozpuszczalnego rusztowania o pewnym ładunku elektrycznym, do którego dołączony jest jon zobojętniający całość. Jony te mogą, na drodze dysocjacji, odrywać się od rusztowania i być zastępowane jonami analizowanej substancji. Warunkiem wymiany jest zachowanie równowagi ładunku [82]. Natomiast faza ruchoma to wodny roztwór buforu z rozpuszczoną mieszaniną do rozdzielenia. Jony, będące w stanie równowagi między fazą ruchomą a stacjonarną, nazywamy przeciwjonami. Wymienne przeciwjony matrycy mogą obejmować protony (H+), grupy wodorotlenowe (OH-), pojedynczo i podwójnie naładowane jony (Na+, K+, Cl- Ca2+, Mg2+) i wieloatomowe jony nieorganiczne (SO42+, PO43-), zasady organiczne i kwasy (NR2H+, COO-). Separacja oparta jest na wiązaniu analitów (roztworu, którego rozdział jest prowadzony) z odpowiednio nakładowymi grupami w fazie stacjonarnej. Jony rozdzielanej substancji i jony eluentu (roztworu służącego do płukania kolumny) konkurują o wiązanie się z przeciwnie naładowanymi grupami na powierzchni fazy stacjonarnej. Adsorpcja analitu do fazy stacjonarnej i jego desorpcja, wymuszona przez jony eluentu, powtarza się na całej długości kolumny i umożliwia separację w wyniku wymiany jonowej. Chromatografia jonowymienna wykorzystana została do redukcji rozkładu długości łańcuchów DNA w próbce. Rozdział prowadzono na urządzeniu do chromatografii cieczowej ÄKTA Purifier 10 zaopatrzonym w anionowymienną kolumnę chromatograficzną MonoQ HR10/10 (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden). 50 ml roztworu DNA o stężeniu 5 mg/ml zostało nałożone na kolumnę. Separację prowadzono z prędkością przepływu 2,5 ml/min roztworem NaCl o stężeniu gradientowym wzrastającym do 1M. 1.5. Spektroskopia w podczerwieni Spektroskopia w podczerwieni (FTIR, ang. Fourier – Transform Infrared Spectroscopy) [83] jest techniką pozwalającą na uzyskanie widma emisji lub absorpcji badanego ciała. Technika ta wykorzystuje fakt, że zdecydowana większość molekuł absorbuje światło w zakresie podczerwieni i przekształca je na wibracje. Absorpcja ta jest charakterystyczna dla poszczególnych wiązań i pozwala stworzyć „odcisk palca” molekuły. Spektrometr FTIR pozwala na rejestrację danych w całym zakresie spektralnym (zwykle między 4000-600 cm-1) a jako rezultat badań otrzymuje się interferogram, który w wyniku transformaty Fouriera przekształcany jest na tzw. widmo FT-IR. Głównymi zaletami tej techniki jest szybkość zbierania danych, lepszy stosunek sygnału do szumu oraz lepsza dokładność w porównaniu do spektroskopii IR [84]. Widma spektroskopii absorpcyjnej w środkowej podczerwieni rejestrowano w zakresie 400-4000 cm-1 z rozdzielczością 2 cm-1, w temperaturze pokojowej z wykorzystaniem aparatu Bruker VERTEX 70v. Przykładowe widmo FTIR zarejestrowane dla czystego surfaktantu CTMA przedstawia Rys. 15. Próbki przygotowano w formie pastylek wymieszanych z KBr. Zastosowanie tej metody pozwoliło na potwierdzenie utworzenia kompleksów i zaobserwowanie przesunięcia charakterystycznych drgań pochodzących od składników reakcji. Rys. 15 Przykładowe widmo FT-IR dla próbki proszkowej surfaktantu CTMA. 1.6. Spektroskopia dielektryczna Spektroskopia dielektryczna jest metodą pozwalającą na badanie właściwości elektrycznych i procesów relaksacyjnych różnych grup materiałów w szerokim zakresie częstotliwości przyłożonego pola elektrycznego o małej amplitudzie. Umożliwia zatem określenie odziaływań przyłożonego zewnętrznego pola elektrycznego z momentami dipolowymi badanej próbki [85]. Wynikiem zastosowania tej metody jest otrzymanie widma dielektrycznego, czyli zależności od częstości dyspersji 𝜀′(𝑓)i absorpcji 𝜀′′(𝑓) dielektrycznej, które związane są wzorami (2-4): 𝜀∗=𝜀′−𝑖𝜀′′ (2) gdzie 𝐶𝑝′ jest rzeczywistą częścią pojemności kondensatora wypełnionego badaną substancją, a 𝑡𝑔𝛿 współczynnikiem strat dielektrycznych. W oparciu o te wartości można wyznaczyć rzeczywistą 𝑍′(𝑓) i urojoną 𝑍′′(𝑓) składową impedancji: 𝑍 (5) oraz rzeczywistą 𝜎′(𝑓) i urojoną 𝜎′′(𝑓) część przewodnictwa : 𝜎∗=𝜎′+𝑖𝜎′′ 𝜎′(𝑓)=2𝜋𝑓𝜖0𝜀′′(𝑓)=𝜎𝐷𝐶+𝜎𝐴𝐶(𝑓) 𝜎′′(𝑓)=2𝜋𝑓𝜖0𝜀′(𝑓) (8) We wzorach (2-10) zastosowano oznaczenia: i – jednostka urojona, f – częstotliwość, C0 – pojemność pustego kondensora, 𝜖0 – przenikalność dielektryczna próżni, σDC, σAC – przewodnictwo stało-/zmiennoprądowe. Obraz zawierający żywność, brudne Opis wygenerowany automatycznie Rys. 16 Elektrody okrągłe wykorzystane do wykonania pomiarów dielektrycznych. Pomiary dielektryczne prowadzone były na spektrometrze dielektrycznym Turnkey Impedance Spectrometer Concept 81 (Novocontrol Technologies) w zakresie częstotliwości od 0,5 Hz do 3 MHz przy napięciu mierzącym 1V, w temperaturze 25 oC ± 0,5 oC. Próbki kompleksów i surfaktantów przygotowano w formie pastylek o średnicy 9,6 mm (Rys. 16), których grubość określono śrubą mikrometryczną (Tabela 3). Z powodu dość dużych i twardych agregatów dla próbki dsDNA(krótkie)-HDP nie udało się uzyskać cieńszej pastylki. Z uwagi na silne właściwości hydrofilowe czystego DNA nie przeprowadzono badań dla DNA przed utworzeniem kompleksu. Wyniki badań silnie zależały od uwodnienia materiału (które zmieniało się w trakcie pomiaru). Tabela 3 Grubość pastylek zastosowanych w pomiarach dielektrycznych. Próbka Grubość [mm] BAC 0,27(1) CTMA 0,25(1) HDP 0,21(1) dsDNA(krótkie)-CTMA 0,22(1) dsDNA(długie)-CTMA 0,26(1) dsDNA(chrom)-CTMA 0,50(1) pDNA-CTMA 0,35(1) dsDNA(krótkie)-BAC 0,24(1) dsDNA(krótkie)-HDP 0,89(1) pDNA–BAC 0,30(1) pDNA-HDP 0,35(1) Przykładowe widmo dielektryczne (krzywe absorpcji i dyspersji dielektrycznej) jest przedstawione na Rys. 17a, natomiast te same dane w reprezentacji impedancji na Rys. 17b. Przedstawienie krzywych w reprezentacji impedancji daje możliwość obserwacji niskoczęstościowych procesów, które uwidaczniają się w tej reprezentacji [86]. Metodę zastosowano w celu obserwacji i opisu właściwości dielektrycznych badanych kompleksów. (a) (b) Rys. 17 Przykładowe widmo dielektryczne (absorpcja i dyspersja dielektryczna) (a) oraz te same dane w reprezentacji impedancji (b) dla kompleksu pDNA-CTMA. 1.7. Dyfrakcja rentgenowska Metoda dyfrakcji rentgenowskiej (XRD) wykorzystuje rozpraszanie elastyczne promieniowania X (o długości rzędu 10-10 m). Z uwagi na fakt, że odległości pomiędzy atomami w ciele stałym są właśnie tego rzędu metoda dyfrakcji rentgenowskiej może zostać wykorzystana do określania tych odległości. Głównymi źródłami tego rodzaju promieniowania są lampy rentgenowskie i synchrotrony. Dyfrakcję rentgenowską teoretycznie wyjaśnił Max von Laue [87], a eksperymentalnie potwierdził ją w 1912 roku Walter Friedrich i Paul Knippling. Określono, że promieniowanie rentgenowskie oddziałuje z elektronami w materiałach, powodując, że emitują one promieniowanie o częstotliwości równej częstotliwości promieniowania padającego. Opierając się na pracach Lauego, William Henry Bragg i Wiliam Lawrence Bragg określili, że do interferencyjnego wzmocnienia promieni odbitych od równoległych płaszczyzn sieciowych może dochodzić jedynie, gdy różnica dróg promieni odbitych jest równa całkowitej wielokrotności długości padającej fali. Parametr ten nazywamy rzędem odbicia [88]. Do określenia charakterystycznych odległości między płaszczyznami sieciowymi wykorzystuje się równanie Bragga (11): 𝑛𝜆=2𝑑𝑠𝑖𝑛𝜃 (11) gdzie: d – odległość międzypłaszczyznowa, θ– kąt rozbłysku, n – rząd odbicia, λ – długość fali. W dyfraktometrii proszkowej stosuje się dwa typy geometrii pomiarowej: Debye’a-Scherrera i Bragga-Brentano. W geometrii Debye’a-Scherrera, nazywanej także geometrią transmisyjną, próbka umieszczona jest w kapilarze obracającej się wokół własnej osi. Geometria Bragga-Brentano jest z kolei geometrią odbiciową, w której płaska próbka umieszczona jest w kuwecie pomiarowej, która również może rotować. Pomiary w geometrii Debye’a-Scherrera wymagają mniej materiału badawczego, z uwagi jednak na fakt, że niektóre substancje bardzo trudno wprowadzić do kapilary, nie zawsze można ją wykorzystać. W wyniku pomiaru otrzymuje się dyfraktogram proszkowy (rentgenogram), w którym kształt i położenie maksimów zależy od właściwości badanego materiału [89]. Rys. 18 Przykładowy dyfraktogram rentgenowski kompleksu DNA-CTMA. Badania strukturalne metodą dyfrakcji rentgenowskiej w ramach niniejszej pracy wykonano dla próbek kompleksów DNA-surfaktant umieszczonych w kapilarach ze szkła borokrzemowego o średnicy 0,5 mm. Pomiary przeprowadzono na spektrometrze Empyrean 2 (PANalytical) w zakresie 2θ = 2-40° z wykorzystaniem promieniowania CuKα (λ = 0,154 nm), w temperaturze pokojowej. Przykładowy dyfraktogram zarejestrowany dla kompleksu dsDNA(chrom)-CTMA przedstawiono na Rys. 18. Czarna linia to zarejestrowany dyfraktogram, a czerwony dyfraktogram otrzymano po usunięciu tła pochodzącego od kapilary. Z kolei badania czystych surfaktantów w formie płaskich próbek na szkiełkach przeprowadzono w zakresie kątowym 2θ = 2-40° w geometrii Bragga-Brentano, na tym samym urządzeniu. Badania niskokątowe (SAXS, ang. Small-Angle X-ray Scattering) wykonano w zakresie 2θ = 0,4-6,8° na dyfraktometrze Nanostar (Bruker) z wykorzystaniem promieniowania CuKα (λ = 0,154 nm) na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego, dzięki uprzejmości Profesora Damiana Pociechy. Metoda dyfrakcji XRD pozwoliła na określenie parametrów komórki elementarnej. 1.8. Kąt zwilżania Zwilżalność powierzchni, czyli jej właściwość w oddziaływaniu z cieczami, jest ważnym parametrem, istotnym z punktu widzenia zastosowań tej powierzchni. Największy wpływ na ten parametr ma swobodna energia powierzchniowa (SFE, ang. Surface Free Energy), którą można wyznaczyć w oparciu o pomiary kąta zwilżania. Kątem zwilżania θ nazywa się kąt utworzony przez powierzchnię płaską ciała stałego z płaszczyzną styczną do powierzchni cieczy graniczącej z tą powierzchnią (Rys. 19). Ciała stałe charakteryzują się określoną zwilżalnością, o ściśle określonych zakresach kątów zwilżania (Tabela 4). Materiały nie zwilżalne przez wodę, materiały hydrofobowe, to materiały, dla których kropla wody tworzy z powierzchnią kąt większy niż 90o i mniejszy niż 180o, natomiast dla materiałów dobrze zwilżanych przez wodę, hydrofilowych, kąt ten jest mniejszy niż 90o [90]. Tabela 4 Zakresy kątów zwilżania dla poszczególnych kategorii powierzchni. Zakres kątów zwilżania Zwilżalność powierzchni 0o – 90o Ciecz dobrze zwilża powierzchnię 90o – 180o Ciesz źle zwilża powierzchnię > 180o Całkowity brak zwilżalności Zgodnie z definicją, swobodna energia powierzchniowa γ jest liczbowo równa pracy potrzebnej do utworzenia nowej powierzchni podczas rozdziału dwóch faz, które wcześniej znajdowały się w stanie równowagi [91] i jest odpowiednikiem napięcia powierzchniowego występującego w cieczach, jednostką jest [mN/m]. W obliczeniach swobodnej energii powierzchniowej wykorzystywana jest koncepcja podzielenia tej energii na składowe przy założeniu, że swobodna energia powierzchniowa jest sumą energii wynikających z różnych oddziaływań oraz zależy od właściwości badanej powierzchni i wybranej cieczy pomiarowej. Fowkes zakładał, że wśród tych składowych można wyróżnić składowe dyspersyjne, polarne, wodorowe, indukcyjne lub kwasowo zasadowe [92]. Obecnie istnieje wiele modeli teoretycznych pozwalających obliczyć energię powierzchniową z pomiarów kąta zwilżania. Najważniejsze z nich zaprezentowano w Tabeli 5. Rys. 19 Schemat określania kąta zwilżania θ, γSL - napięcie międzyfazowe między ciałem stałym a cieczą, γLV – napięcie powierzchniowe cieczy, γSV – napięcie powierzchniowe powierzchni (swobodna energia powierzchniowa). Rysunek własny na podstawie [93]. Tabela 5 Modele teoretyczne obliczania energii powierzchniowej wraz z ich zastosowaniem. Model Ilość cieczy pomiarowych Zastosowanie Owen-Wendt [OW] 2; dyspersyjna i polarna Polimery, aluminium, warstwy powierzchniowe Wu 2; dyspersyjna i polarna Polimery, roztwory organiczne, pigmenty organiczne Kwasowo – zasadowa 3; dyspersyjna i 2 polarne Układy biologiczne, biopolimery, białka, leki Schultz 2; dyspersyjna i polarna Powierzchnie o dużej energii powierzchniowej np. Metale Eqs 1 Dla bardzo ogólnego przybliżenia energii na powierzchniach o charakterze niepolarnym Zisman Teoretycznie 2, ale powinno się zastosować więcej cieczy z danego szeregu Niskoenergetyczne, powierzchnie o charakterze niepolarnym W ramach niniejszej pracy statyczne pomiary kąta zwilżania wykonano w temperaturze pokojowej z wykorzystaniem urządzania Krus EasyDrop (DSA15). Kąty były średniowane po 10 pomiarach wykonanych w różnych miejscach warstwy. Pomiary kąta zwilżania prowadzono w celu wyznaczenia swobodnej energii powierzchniowej badanych warstw oraz porównania jej ze swobodną energią powierzchniową czystych podłoży stałych. 2. Metody wynoszenia cienkich warstw Właściwości materiałów silnie zależą od ich grubości – nanomateriały (np. nanowarstwy, nanocząstki) różnią się właściwościami od swoich odpowiedników objętościowych (ang. bulk materials). Celem wytwarzania cienkich warstw jest m.in. poprawa wydajności, dodatkowa funkcjonalność, większa efektywność i otrzymanie właściwości niemożliwych do osiągnięcia w materiale objętościowym. Istnieje wiele technik pozwalających na otrzymywanie cienkich warstw materiałów. Inżynieria powierzchni, zajmująca się wytwarzaniem cienkich warstw, skupia się na technikach pozwalających na modyfikowanie właściwości powierzchni tak, aby spełniały one określone zadania. Znaczna część metod pozwalających na wytwarzanie cienkich warstw jest szeroko stosowana w przemyśle, znajdując zastosowanie m.in. w biomedycynie, energetyce, itd. Cienka warstwa (ang. thin-film) to warstwa materiału o grubości poniżej 1 µm, naniesiona na dwuwymiarowe podłoże (tzw. podkład lub substrat). Warstwy grubsze niż 1 µm nazywane są pokryciami (ang. coatings) lub grubymi warstwami (ang. thick-films). Cienkie warstwy umożliwiają między innymi: ✓ Formowanie nanostruktur lub nanokompozytów na powierzchni, ✓ Polepszenie właściwości istniejących produktów, ✓ Wytworzenie nowych możliwości technicznych, ✓ Zmniejszenie zużycia materiału (przesłanki ekologiczne). Proces formowania się cienkiej warstwy jest procesem nierównowagowym, w związku z tym nie jest przedstawiany na diagramach fazowych. Metoda depozycji cienkiej warstwy determinuje jej ostateczne właściwości, takie jak morfologia powierzchni, mikrostruktura, właściwości elektryczne, właściwości optyczne czy biokompatybilność. Powszechnie używaną w badaniach naukowych jest metoda nanoszenia wirowego, a metody pokrewne są stosowane w przemyśle. Poniżej przedstawiono metody nanoszenia cienkich warstw, które zastosowano w ramach niniejszej pracy. Do przygotowania wszystkich warstw wykorzystano roztwory kompleksów DNA o stężeniu 0,4 mg/ml rozpuszczone w mieszaninie rozpuszczalników etanol-chloroform w stosunku objętościowym 1:4. Kompleks po odważeniu rozpuszczano w etanolu, a następnie dodawano chloroformu, aby przyspieszyć parowanie. 2.1. Metoda nanoszenia wirowego Metoda nanoszenia wirowego (ang. spin-casting, spin-coating) jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych metod wytwarzania cienkich warstw, wykorzystywaną w preparatyce cienkich i utlracienkich warstw (najczęściej polimerowych). Metoda ta polega na gwałtownym odparowaniu rozpuszczalnika z mieszaniny nakropionej na podłoże stałe wprawione w stały, szybki ruch obrotowy [94]. Pomimo bardzo dużej popularności metody, brakuje nadal dokładnej i jednolitej teorii tłumaczącej procesy fizyczne zachodzące podczas stosowania tej metody. Jedna z najpopularniejszych teorii dzieli proces nanoszenia warstwy na trzy etapy: zrzucenie większości roztworu z podkładu, rozciąganie radialne pozostałej części materiału, odparowanie rozpuszczalnika [95]. Schematycznie proces tworzenia cienkiej warstwy metodą nanoszenia wirowego jest zaprezentowany na Rys. 20. (a) (b) (c) (d) Obraz zawierający znak, stół, lampa Opis wygenerowany automatycznie Rys. 20 Schemat wynoszenia cienkiej warstwy metodą nanoszenia wirowego: (a) nakropienie materiału, (b) rozprowadzenie substancji po całej powierzchni podkładu, (c) odparowywanie rozpuszczalnika, (d) gotowa warstwa. 2.2. Metoda listwy rozciągającej Metoda listwy rozciągającej (ang. H-dipping) polega na umieszczeniu pomiędzy podłożem stałym a listwą rozciągającą (w formie walca) roztworu nanoszonego materiału [96]. Schematycznie proces tworzenia cienkiej warstwy tą metodą jest zaprezentowany na Rys. 21. Listwa rozciągająca jest ustawiona w stałym położeniu, a pomiędzy nią i podłożem tworzy się menisk z nanoszonego materiału. Podłoże stałe przesuwa się pod listwą rozciągającą ze stałą prędkością, która nie zmienia kształtu menisku. Grubość warstwy uzyskanej tą metodą zależy, między innymi, od średnicy listwy rozciągającej, odległości między listwą a podkładem i prędkości przesuwania podłoża. Obraz zawierający tekst Opis wygenerowany automatycznie Rys. 21 Schemat wynoszenia cienkiej warstwy metodą listwy rozciągającej. Rysunek własny na podstawie [96]. 2.3. Metoda Langmuir-Blodgett Metoda Langmiur-Blodgett (LB) wynoszenia cienkich warstw wykorzystuje wagę Langmuira i polega na transferze monowarstwy Langmuira, tzw. subfazy, z powierzchni cieczy (najczęściej wody) na podłoże stałe. Proces przygotowywania warstw LB jest dwuetapowy: (1) tworzenie monowarstwy na swobodnej powierzchni cieczy oraz (2) transfer monowarstwy na powierzchnię stałą, przy zachowaniu stałej wartości ciśnienia powierzchniowego [71]. Przed nakropieniem substancji i kompresją monowarstwy do określonego ciśnienia powierzchniowego, powierzchnia ciała stałego na którą wynosi się monowarstwę (podłoże) jest umieszczana wewnątrz studzienki pod warstwą powierzchniową subfazy (Rys. 22a). Następnie na powierzchnię subfazy nakrapiany jest roztwór cząsteczek powierzchniowo czynnych, które tworzą cienką warstwę (Rys. 22b), kolejno następuje symetryczna kompresja monowarstwy (Rys. 22c), a po osiągnięciu określonego ciśnienia powierzchniowego podłoże jest powoli wyciągane ze studzienki w kierunku pionowym i podczas pokonywania granicy faz ciecz-gaz, monowarstwa jest przenoszona z subfazy na wyciągane podłoże (Rys. 22d). Wartość ciśnienia powierzchniowego, przy którym następuje transfer monowarstwy na powierzchnię stałą określa się w oparciu o przeprowadzoną wcześniej analizę izoterm π-A. (a) (b) (c) (d) Rys. 22 Schemat wynoszenia cienkich warstw metodą Langmiur-Blodgett: (a) nakropienie substancji na powierzchnię subfazy; (b), (c) kompresja monowarstwy; (d) transfer warstwy na powierzchnię stałą. 3. Materiał badawczy W niniejszej pracy jako materiał badawczy zastosowano dwuniciowe DNA pozyskiwane z nasienia łososia oraz DNA plazmidowe pozyskiwanie z hodowli bakterii. 3.1. Charakterystyka materiału badawczego 3.1.1. DNA łososiowe DNA łososiowe jest najczęściej stosowanym materiałem w badaniach naukowych, a wykorzystane w ramach niniejszej pracy pochodziło z dwóch źródeł: a) Chitose Institute of Science and Technology (CIST) Japan, oznaczane w dalszej części pracy jako dsDNA(długie), b) SIGMA-Aldrich, Deoxyribonucleic acid, low molecular weight from salmon sperm, nr. katalogowy 31149, oznaczane w dalszej części pracy jako dsDNA(krótkie). Materiał pochodzący z nasienia łososia zawiera mieszaninę fragmentów DNA o różnej długości (masie), których zakres nie jest precyzyjnie definiowany przez producenta. Aby określić rozkład długości fragmentów DNA w zakupionym materiale zastosowano metodę elektroforezy w żelu agarozowym (rozdział 1.1. Elektroforeza). Migrację w żelu badanego materiału porównywano z migracją drabinek kalibracyjnych, które składają się z mieszaniny fragmentów DNA o dobrze znanych długościach. Ponieważ migracja fragmentów DNA w żelu agarozowym ma charakter liniowy jedynie w wąskim zakresie ich długości (zależnym od gęstości agarozy), jak wspomniano wcześniej, w pracy używano różnych drabinek kalibracyjnych (Rys. 9). Do określenia rozkładu długości łańcuchów w próbce posłużono się dwoma drabinkami kalibracyjnymi o częściowo pokrywających się zakresach długości. W tym celu sporządzono wykres zależności położenia prążka w żelu agarozowym od długości łańcucha DNA dla szerokiego zakresu długości. Zastosowano podejście matematyczne (równanie opisujące zależność położenia prążka na żelu od długości DNA na podstawie dopasowanej wcześniej krzywej) do określenia średniej długości oraz średniej masy molowej DNA w każdej z badanych próbek. Przykładowy proces wyznaczania długości łańcuchów DNA w próbce, dla pojedynczej drabinki kalibracyjnej w zakresie długości fragmentów DNA od 25 do 766 pz, przedstawiono na Rys. 23. W oparciu o wynik elektroforezy (Rys. 23a) przygotowano wykres zależności intensywności wybarwienia żelu od położenia (Rys. 23b) przy użyciu programu ImageJ [97], a następnie przeprowadzono jego analizę programem OriginPro 2019. Każde maksimum widoczne na wykresie (Rys. 23c) zostało zidentyfikowane jako prążek odpowiadający DNA o określonej długości, zgodnie z danymi podanymi przez producenta drabinki (na wykresie podano kilka wybranych długości). W oparciu o otrzymane dane sporządzono wykres zależności położenia od długości (Rys. 23d), a do otrzymanych punktów dopasowano funkcję logarytmiczną, która lepiej niż funkcja liniowa opisuje położenie punktów pomiarowych w całym zakresie drabinki. Parametry dopasowanej funkcji posłużyły w kolejnych krokach do numerycznego określenia długości DNA odpowiadających początkowi i końcowi rozkładu masy DNA w badanych próbkach (widocznych jako smugi na Rys. 23a). Analogiczną procedurę obliczeniową zastosowano do określenia rozkładu długości łańcuchów DNA we wszystkich przygotowanych i badanych próbkach. a) b) c) d) Rys. 23 Procedura wyznaczania rozkładu długości łańcuchów DNA w próbce: (a) wyjściowy obraz żelu: ścieżka 1 - przykładowa drabinka, ścieżki 2, 3 - przykładowe wyniki; (b) profil wysokościowy dla drabinki referencyjnej; (c) przypisanie wartości (długości fragmentu DNA) do położenia prążka na żelu; (d) dopasowanie zależności długości DNA od położenia na żelu. Tabela 6 przedstawia wyznaczone przedziały długości łańcuchów DNA występujące w próbkach dsDNA(krótkie) i dsDNA(długie). Oba typy DNA składają się z fragmentów DNA o różnej długości. Duże różnice pomiędzy najdłuższymi i najkrótszymi fragmentami łańcuchów DNA w próbce utrudniają określenie średniej masy molowej, a dodatkowo brak zależności intensywności wybarwienia żelu agarozowego od ilości DNA w danym miejscu nie pozwala określić procentowego udziału w próbce DNA o danej długości łańcucha. Dlatego też, po oszacowaniu długości najkrótszych i najdłuższych fragmentów łańcuchów DNA obliczono ich średnią arytmetyczną (12) i średnią ważoną (13) i na tej podstawie określono średnią masę molową, przy założeniu, że średnia masa jednego monomeru (deoksyryboza + reszta fosforanowa + zasada azotowa) wynosi 660 g/mol (należy jednak zaznaczyć, że w rzeczywistości masy monomerów zawierających różne zasady azotowe nieznacznie się od siebie różnią). Wyniki obliczeń zawarto w Tabeli 6. 𝑀𝑛=∑𝑀𝑖𝑁𝑖/∑𝑁𝑖 (12) 𝑀𝑛=∑𝑀𝑖2𝑁𝑖/∑𝑀𝑖𝑁𝑖 (13) Tabela 6 Oszacowane rozkłady długości oraz średnia masa cząsteczkowa i molowa dwóch typów DNA. Średnia długość Typ DNA Oszacowana długość [pz] Arytmetyczna średnia masa cząsteczkowa Ważona średnia masa cząsteczkowa dsDNA(krótkie) 5– 240 82 𝑝𝑧 5,41 ∙104 𝑔 /𝑚𝑜𝑙 117 𝑝𝑧 7,72 ∙104 𝑔 /𝑚𝑜𝑙 dsDNA(długie) 25 – 10 000 4200 𝑝𝑧 2,77 ∙106 𝑔 /𝑚𝑜𝑙 6500 𝑝𝑧 4,29 ∙106 𝑔 /𝑚𝑜𝑙 3.1.2. DNA plazmidowe – hodowla bakteryjna DNA plazmidowe (phMGFP, Promega), oznaczane w dalszej części pracy jako pDNA, pochodziło z bakterii Escherichia coli wyhodowanych w laboratorium. Hodowla bakteryjna przebiegała w trzech krokach, według standardowej procedury [98]: a) Wysianie bakterii na pożywkę stałą LB-agar, b) Przeniesienie pojedynczej kolonii bakterii do 30 ml pożywki płynnej, c) Przeniesienie namnożonych bakterii do 1 litra pożywki. Każdy z tych kroków trwał około 20 godzin. Bakterie namnażały się w temperaturze 37°C, pożywki płynne były poddane ciągłemu mieszaniu (160 rpm), zawierały antybiotyk (ampicylinę) umożliwiający wzrost tylko bakteriom posiadającym plazmid (plazmid phMGFP zawiera gen odporności na ampicylinę). Po zakończonej hodowli bakterie zostały zwirowane (6 000 g, 30 min., 4°C) w celu oddzielenia ich od pozostałej pożywki, a następnie poddane procesowi ekstrakcji DNA. Ekstrakcja DNA przeprowadzona została zgodnie z procedurą producenta zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA (Macherey-Nagel NucleoBond 10 000 EF). Schemat hodowli oraz zdjęcia preparatów przedstawiono na Rys. 24. (a) (b) (c) (d) (e) (f) Obraz zawierający tekst Opis wygenerowany automatycznie Obraz zawierający muzyka Opis wygenerowany automatycznie Obraz zawierający wewnątrz Opis wygenerowany automatycznie Obraz zawierający wewnątrz, butelka Opis wygenerowany automatycznie Rys. 24 Schemat hodowli komórkowej wraz z fotografiami procesu: hodowla na szalce Petriego (a,d); hodowla w małej objętości pożywki – 30 ml LB (b,e); hodowla w dużej objętości pożywki – 2l LB (c,f). W celu wyznaczenia długości łańcuchów DNA w otrzymanej próbce DNA plazmidowego zastosowano metodę elektroforezy a wynik zaprezentowano na Rys. 25. Ponieważ widoczne są trzy osobne prążki na elektroforegramie, stwierdzono, że DNA plazmidowe po ekstrakcji występuje we wszystkich trzech możliwych konformacjach, tj. liniowej, kolistej i superskręconej. Plazmid phMGFP ma długość 4707 pz a jego średnia masa molowa wynosi: 3,1·106 g/mol. kolista liniowa (4707 pz) superskręcona 1 2 Obraz zawierający tekst, sprzęt elektroniczny Opis wygenerowany automatycznie Rys. 25 Wynik elektroforezy DNA plazmidowego: ścieżka 1 - drabinka 1kbp, ścieżka 2 - DNA plazmidowe. Trzy prążki odpowiadają trzem konformacjom, zaznaczonym schematycznie po prawej stronie. 3.2. Metody przygotowania materiału badawczego Podjęto szereg prób mających na celu zmniejszenie rozkładu długości łańcuchów DNA w próbkach, aby pracować na materiale o dobrze zdefiniowanych parametrach. Dobrze określona masa DNA jest konieczna, aby otrzymane metodą wagi Langmuira izotermy przedstawić jako zależność ciśnienia powierzchniowego od pola powierzchni przypadającego na jedną molekułę badanego związku (dla bardzo dużego rozkładu mas nie jest to możliwe). W celu zmniejszenia rozkładu mas otrzymanego materiału biologicznego zastosowano metody opisane w tym podrozdziale. 3.2.1. Trawienie enzymatyczne Trawienie enzymatyczne jest metodą wykorzystującą enzymy restrykcyjne (restryktazy), które pozwalają na przecięcie nici DNA w miejscu wyznaczonym przez specyficzną sekwencję DNA. Rozpoznawana sekwencja ma zazwyczaj długość kilku par zasad. W celu określenia odpowiednich miejsc działania enzymów skorzystano z interaktywnej mapy wektorowej DNA plazmidowego phMGFP (Rys. 26), dostarczonej przez producenta (Promega Corporation). Wybrano trzy enzymy (EcoO109I, AleI i BseYI), które zgodnie z mapą powinny wykonać trzy nacięcia na podwójnej helisie, a wynikiem tej operacji powinny być trzy fragmenty liniowych DNA o zbliżonych długościach 1567 pz, 1568 pz oraz 1572 pz. Rys. 26 Mapa wektorowa plazmidu phMGFP z zaznaczonymi miejscami działania wykorzystywanych enzymów restrykcyjnych. W pierwszej fazie dokonano wstępnego rozcięcia podwójnej helisy DNA (Rys. 27a). Można zaobserwować, że działając trzema enzymami: BseYI, EcoO109I oraz AleI (ścieżka 2) otrzymuje się 5 prążków, odpowiadających kolejno DNA kolistemu o długości 4707 pz, DNA liniowemu o długości 4707 pz, frakcji superskręconej o długości 4707 pz, frakcji liniowej o długości około 3500 pz oraz frakcji liniowej o długości 1565 ± 10 pz (która miała być końcowym wynikiem eksperymentu). Po kilku dniach działania enzymów zastosowano trawienie enzymatyczne, a rezultat otrzymany w postaci elektroforegramu zaprezentowano na Rys. 27b. Ścieżka pierwsza przedstawia DNA przed trawieniem trzema enzymami restrykcyjnymi, natomiast ścieżka druga w trakcie tego procesu. Widoczna jest znaczna redukcja długości łańcuchów DNA w próbce. Po dwóch tygodniach ciągłego prowadzenia eksperymentu, podczas rutynowego sprawdzania postępów okazało się, że w próbce nie występuje DNA o mierzalnej długości. Stwierdzono, że czas działania enzymów był zbyt długi i DNA w próbce uległo rozpadowi. Biorąc pod uwagę czas trwania eksperymentu obejmujący hodowlę bakterii, oczyszczanie DNA plazmidowego, a następnie trawienie enzymatyczne, zaniechano dalszych prób stosowania tej techniki do otrzymania próbek DNA o dobrze zdefiniowanych długościach łańcuchów. (a) (b) Obraz zawierający tekst Opis wygenerowany automatycznie Plazmid nieprzecięty Plazmid częściowo przecięty Plazmid przecięty trzema enzymami (~1565 pz) Rys. 27 Wynik elektroforezy po wstępnym rozcięciu DNA: (a) ścieżka 1 – drabinka 100bp, ścieżka 2 - wynik eksperymentu; (b) wynik elektroforezy: ścieżka 1- DNA przed trawieniem, ścieżka 2 - DNA plazmidowe w trakcje trawienia trzema enzymami restrykcyjnymi. 3.2.2. Elektroforeza Elektroforeza, opisana w rozdziale 1.1. Elektroforeza, jest jedną z najczęściej stosowanych metod w badaniach DNA, RNA i białek, która pozwala rozdzielić cząsteczki według ich masy i określić wielkość badanego materiału (lub rozkład jego długości) poprzez porównanie z drabinkami referencyjnymi. W ramach niniejszej pracy metodę elektroforezy zastosowano do zawężenia rozkładu długości fragmentów DNA w próbce dsDNA(krótkie). Rys. 28 Schemat eksperymentu wykorzystującego elektroforezę do redukcji rozkładu długości DNA. W tym celu, podczas przygotowywania żelu zastosowano 2 rzędy grzebieni, aby uzyskać dwa rzędy otworów, tzw. dołków (Rys. 28). Górne dołki standardowo wykorzystano do wprowadzenia próbki na żel. Drugi rząd dołków, umieszczony w około ¾ długości żelu, posłużył do wybierania z żelu fragmentów próbki. Podczas rozdziału elektroforetycznego, DNA wędrowało w dół żelu przechodząc przez dolne dołki. W określonych odstępach czasu, za pomocą pipety, pobierano z dolnych dołków taką samą ilość roztworu DNA o mniejszym rozkładzie mas niż w wyjściowej próbce (przykład elektroforezy preparatywnej prezentuje Rys. 29a). Zastosowanie elektroforezy pozwoliło na otrzymanie szeregu próbek (wybranych w różnych miejscach żelu) o relatywnie wąskim rozkładzie mas (Rys. 29b). Niestety, wadą tej metody jest niewielka ilość materiału odzyskiwana z dołków w porównaniu do początkowej ilości próbki nakładanej na żel, a także małe stężenie DNA w buforze wybieranym z dołków. Biorąc pod uwagę zarówno czasochłonność jak i niską efektywność tej metody, zaniechano jej stosowania w celu otrzymania DNA o wąskim rozkładzie mas. (a) (b) Rys. 29 Wynik elektroforezy: (a) ścieżka 1- drabinka 50 bp; ścieżki 2, 3, oraz 4 – dsDNA(krótkie) z widoczną wybraną częścią materiału badawczego; ścieżka 5- drabinka 10 bp oraz (b) rozkład długości otrzymanych fragmentów: ścieżki 1 i 8 - drabinka 10 bp; ścieżki 2-7 - fragmanty DNA wybrane na różnych etapach elektroforezy. 3.2.3. Chromatografia jonowymienna Chromatografia jonowymienna jest metodą pozwalającą na oczyszczanie materiału biologicznego, zazwyczaj stosowana do białek. Jednak można ją także zastosować do rozdziału DNA według jego masy, a zaletą tej metody jest możliwość automatycznego rozdziału dużych objętości próbki i zbierania frakcji o zadanych parametrach. W niniejszej pracy zastosowano tę metodę do znacznej redukcji rozkładu mas w próbce dsDNA(długie). Fazą stacjonarną w eksperymencie było złoże krzemionkowe, a fazą ruchomą roztwór dsDNA(długie) w buforze Tris-HCl o pH = 8 i stężeniu 100 mM. Elucję związanego DNA prowadzono buforem Tris-HCl o wzrastającej ilości NaCl. W wyniku zastosowania tej metody uzyskano 24 frakcje zawierające fragmenty DNA o różnym rozkładzie długości (Rys. 31). W celu otrzymania ilości DNA wystarczającej do dalszych badań połączono trzy frakcje o najmniejszym rozkładzie mas i otrzymano próbkę o rozkładzie długości porównywalnym z komercyjnym dsDNA(krótkie), jednak z nieznacznie zwiększonym udziałem dłuższych łańcuchów DNA w próbce (Rys. 30). Ostatecznie chromatografia jonowymienna pozwoliła na znaczną redukcję rozkładu mas dsDNA(długie) dlatego próbka po chromatografii została wykorzystana do dalszych badań, a oznaczana jest dsDNA(chrom). 10 kpz 500 pz 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1517 pz 100 pz Rys. 31 Wynik elektroforezy DNA po chromatografii jonowymiennej: ścieżka 1 - drabinka 100 bp, ścieżki wewnętrze (2-16) – rozkład długości wybranych frakcji, ścieżka 17 - drabinka 1 kbp. Rys. 30 Wynik elektroforezy : porównanie rozkładu długości DNA kupionego dsDNA(krótkie) z wybraną do badań frakcją DNA otrzymanego w wyniki chromatografii jonowymiennej próbki dsDNA(długie). Ścieżka 1 - drabinka 25 bp; ścieżka 2 - drabinka 10 bp; ścieżka 3 - dsDNA(chrom); ścieżka 4 - dsDNA(krótkie). dsDNA(krótkie) dsDNA(chrom) 766 pz 25 pz 1 2 3 4 5 Podsumowując, w celu otrzymania materiału DNA o zmniejszonym rozkładzie długości łańcuchów przetestowano kilka metod, których porównanie wraz z oceną ich przydatności zebrano w Tabeli 7. Tabela 7 Metody redukcji rozkładu mas wraz z oceną ich przydatności pod kątem badań w pracy. Metoda Zalety Wady Ocena Trawienie enzymatyczne W początkowej fazie eksperymentu bardzo dobre wyniki. Przydatne dla niewielkich ilości materiału. Degradacja próbki. - Elektroforeza Szybkość metody. Zadowalająca redukcja rozkładu mas. Wydajność niewystarczająca na żądaną skalę - Chromatografia jonowymienna Szybkość metody, automatyzacja. Zadowalająca redukcja rozkładu mas. Duże stężenie soli w finalnym produkcie. + Ostatecznie do dalszych badań wybrano DNA dostępne komercyjnie, dsDNA(krótkie) i dsDNA(długie), DNA po chromatografii jonowymiennej oznaczane dalej jako dsDNA(chrom) oraz DNA plazmidowe - pDNA. Zgodnie z procedurą przedstawioną na Rys. 23 określono rozkład długości łańcuchów w poszczególnych próbkach, wybranych do dalszych badań, dla których wyniki elektroforezy oraz odpowiadające im wykresy zależności intensywności wybarwienia żelu od ilości par zasad przedstawia Rys. 32. Zestawienie rozkładów długości zastosowanego DNA przedstawiono w Tabeli 8. (a) Obraz zawierający tekst, sprzęt elektroniczny Opis wygenerowany automatycznie (b) Rys. 32 Wynik elektroforezy: (a) zestawienie 3 żeli: ścieżka 1- dsDNA(krótkie); ścieżka 2- dsDNA(chrom); ścieżka 3- drabinka 10 bp; ścieżka 4- drabinka 25 bp; ścieżka 5- drabinka 1kbp; ścieżka 6- pDNA; ścieżka 7 – dsDNA(długie); ścieżka 8 - drabinka 25 bp; ścieżka 9 - drabinka 1 kbp oraz (b) wykresy zależności intensywności wybarwienia żelu od ilości par zasad. Tabela 8 Rozkład długości DNA stosowanego w niniejszej pracy. Materiał Rozkład długości łańcuchów dsDNA(chrom) 6 – 190 pz dsDNA(krótkie) 5 – 240 pz dsDNA(długie) 25 – 10 000 pz pDNA 4707 pz w trzech konformacjach 3.3. Synteza kompleksów DNA W niniejszym rozdziale opisano proces syntezy kompleksów DNA z trzema wybranymi surfaktantami kationowymi: CTMA, BAC i HDP, których wzory strukturalne przedstawiono na Rys. 33. Wszystkie wybrane surfaktanty mają łańcuch węglowy składający się z 16 atomów węgla. Czynnikiem różnicującym jest grupa funkcyjna. W przypadku CTMA grupę funkcyjną surfaktantu stanowi połączenie azotu z trzema grupami CH3 (Rys. 33a), HDP ma bezpośrednie połączenie łańcucha węglowego z pierścieniem aromatycznym (Rys. 33b) natomiast dla BAC występuje połączenie azotu z grupami CH3 jak również pierścień aromatyczny (Rys. 33c). W badaniach skupiono się na wpływie obecności i położenia pierścienia aromatycznego na właściwości otrzymanych kompleksów, tj. efektywność kompleksacji, właściwości elektryczne, mikrostrukturę i topografię otrzymanych cienkich warstw. a) b) Obraz zawierający tekst Opis wygenerowany automatycznie c) Rys. 33 Wzory strukturalne surfaktantów zastosowanych do syntezy kompleksów: CTMA (a), HDP (b) i BAC (c). Proces syntezy wszystkich kompleksów DNA-surfaktant przebiegał podobnie, a główne różnice przedstawia Tabela 9. Kolejne kroki wszystkich syntez były następujące: • Odważenie odpowiedniej ilości reagentów (patrz Tabela 10) oraz rozpuszczenie ich w wodzie (surfaktanty) lub wodzie z dodatkiem buforu Tris-HCl (DNA), • Wkroplenie rozpuszczonego surfaktantu do roztworu wodnego DNA, • Mieszanie składników reakcji na mieszadle magnetycznym (12 h, 4 °C), • Płukanie produktu reakcji wodą, • Liofilizacja. Tabela 9 Porównanie parametrów syntezy poszczególnych kompleksów DNA-surfaktant kationowy. DNA-CTMA DNA-BAC DNA-HDP Stosunek wagowy reagentów (DNA: surfaktant) 1:1 1:3 1:2* Metoda połączenia składników wkraplanie surfaktantu do roztworu wodnego DNA Mieszanie min. 12 godzin na mieszadle magnetycznym w niskiej temperaturze Oczyszczanie wirowanie i płukanie Straty po płukaniu niskie duże niskie Suszenie liofilizacja *Surfaktant HDP otrzymano w postaci monohydratu, co oznacza, że na każdą cząsteczkę surfaktantu przypadała cząsteczka wody, z tego względu odważono więcej proszku w stosunku do DNA. Do badań wpływu struktury surfaktantu na właściwości kompleksów DNA-surfaktant kationowy wybrano jednego przedstawiciela DNA liniowego (dsDNA(krótkie)) oraz DNA plazmidowe (pDNA) (Tabela 10). Tabela 10 Połączenia składników kompleksów DNA-surfaktant. CTMA BAC HDP dsDNA(krótkie) + + + dsDNA(długie) + - - dsDNA(chrom) + - - pDNA + + + 4. Badanie właściwości próbek objętościowych kompleksów W niniejszym rozdziale przedstawiono wyniki oraz dyskusję badań właściwości surfaktantów oraz kompleksów DNA-surfaktant w postaci proszków metodami spektroskopii w podczerwieni i dielektrycznej oraz dyfrakcji rentgenowskiej. 4.1. Badania metodą spektroskopii w podczerwieni W celu potwierdzenia efektywnego utworzenia kompleksu DNA-surfaktant oraz zidentyfikowania pasm charakterystycznych dla tych związków wykonano badania metodą spektroskopii absorpcyjnej w środkowej podczerwieni. Przeprowadzono badania dla wszystkich utworzonych kompleksów oraz ich składników (dsDNA(krótkie), pDNA, CTMA, BAC oraz HDP). 4.1.1. Czyste surfaktanty Widma FTIR dla czystych surfaktantów wraz z ich wzorami strukturalnymi pokazano na Rys 34, natomiast położenie charakterystycznych pasm zestawiono w Tabeli 11. Rys. 34 Widma FTIR czystych surfaktantów wraz z ich wzorami strukturalnymi. W widmach HDP oraz BAC można zauważyć pasma odpowiadające drganiom rozciągającym pierścienia aromatycznego w zakresie 1470–1510 cm-1. Widoczne są także, dla wszystkich trzech surfaktantów, charakterystyczne pasma odpowiadające drganiom rozciągającym grup CH2 w łańcuchu węglowym w zakresie powyżej 2800 cm-1. Tabela 11 Pozycje pasm (w cm–1) w widmie IR czystych surfaktantów. CTMA HDP BAC Interpretacja 719 723 shp ρ(CH2) al,n 1472 1508 1471 1490 ν(C=C) ar ν(C=C) ar 2849 2849 νs(CH2) © 2917 2914 2921 νas (CH2) © Charakterystyka drgań: ν – rozciągające; δ – zginające; 𝜌 – kołyszące; s – symetryczne; as – asymetryczne; ar – w pierścieniu aromatycznym; © – w łańcuchu alifatycznym; n – długi łańcuch alifatyczny; shp – pasmo ostre. 4.1.2. Kompleksy DNA-CTMA Widma FTIR kompleksów DNA-CTMA syntezowanych z różnych typów DNA przedstawiono na Rys 35. Potwierdzają one utworzenie efektywnego wiązania pomiędzy DNA a CTMA w każdym przypadku. Widma są do siebie bardzo podobne, biorąc pod uwagę kształt, położenie i intensywność pasm. Jedyną widoczną różnicą jest niewielkie przesunięcie pasm związanych z drganiami rozciągającymi νas(CH2) oraz νs(CH2) w stronę większych liczb falowych, w przypadku kompleksu z DNA plazmidowym w porównaniu do trzech pozostałych kompleksów. Może to świadczyć o mniejszym uporządkowaniu łańcuchów CTMA wokół DNA plazmidowego. Szczegółowy opis widm kompleksów na bazie DNA liniowego oraz plazmidowego z różnymi surfaktantami przedstawiono w dalszej części niniejszego rozdziału. Rys. 35 Widma FTIR dla kompleksów DNA-CTMA z różnymi rodzajami DNA. 4.1.3. Kompleksy dsDNA(krótkie) z różnymi surfaktantami Widma FTIR czystych składników (dsDNA(krótkie), BAC, HDP i CTMA), fizycznej mieszaniny dsDNA(krótkie)+surfaktant oraz kompleksów dsDNA(krótkie)–CTMA, dsDNA(krótkie)–HDP i dsDNA(krótkie)–BAC zaprezentowano na Rys. 36. Widmo dla czystego dsDNA(krótkie) wykorzystanego do przygotowania kompleksów, na podstawie obserwacji pasm charakterystycznych w położeniach 831, 966 oraz 1224 cm–1 potwierdza, że występuje ono w formie B-DNA. Rys. 36 Widma FTIR czystych składników, fizycznej mieszaniny DNA+surfaktant oraz kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) z surfaktantami CTMA (a), HDP (b) i BAC (c) [99]. Dla widm kompleksów w rejonie dużych liczb falowych (powyżej 2800 cm-1) pasma związane z rozciąganiem łańcuchów węglowych surfaktantów są przesunięte w stronę większych liczb falowych w stosunku do ich położenia w widmach czystych surfaktantów oraz w widmach mieszanin fizycznych. Sugeruje to, że po utworzeniu kompleksu na bazie dsDNA(krótkie), opartego o oddziaływania elektrostatyczne, łańcuchy surfaktantów stały się mniej uporządkowane. Pasma obserwowane przy 1468 i 720 cm-1 (związane odpowiednio z drganiami zginającymi i kołyszącym grup metylowych), w przypadku kompleksów dsDNA(krótkie)-CTMA, dsDNA(krótkie)-BAC i dsDNA(krótkie)-HDP, nie są dobrze rozdzielone, jak ma to miejsce w przypadku czystych surfaktantów. Wskazuje to na występowanie słabych oddziaływań pomiędzy łańcuchami węglowymi surfaktantu i luźnym ich upakowaniu. W zakresie spektralnym 1500-1800 cm-1 pojawiają się pasma związane z oddziaływaniem zasad azotowych A-T oraz C-G. W widmie kompleksów można zaobserwować nowe pasmo w okolicach 1570 cm-1, natomiast pasmo w 1538 cm-1 (występujące w widmie czystego DNA oraz mieszaniny fizycznej DNA-surfaktant) jest przesunięte w stronę mniejszych liczb falowych w każdym z rozpatrywanych przypadków. Charakterystyczne pasmo związane z asymetrycznym drganiem rozciągającym grup fosforanowych νas(PO2-), w widmie kompleksów występuje przy 1244 cm-1 (dsDNA(krótkie)-CTMA) oraz przy 1243 cm-1 (dsDNA(krótkie)-BAC i dsDNA(krótkie)-HDP) i jest przesunięte w stronę większych liczb falowych. Jednocześnie zmienia się jego kształt – jest znacznie bardziej intensywne i ostrzejsze niż analogiczne pasmo w widmie czystego dsDNA(krótkie) i mieszaniny. Przesunięcie tego pasma w stronę większych liczb falowych (powyżej 1240 cm-1), potwierdza powstanie wiązania chemicznego w kompleksach i sugeruje, że dominującą formą DNA w kompleksie jest forma A-DNA. Utworzenie kompleksu wpływa także na drganie rozciągające symetryczne grup fosforanowych (zmiany obserwowane w zakresie 1080–1120 cm-1). W zakresie poniżej 900 cm-1, pojawiają się pasma związane ze szkieletem cukrowym DNA. Pasmo przy 824 cm-1 związane z formą B-DNA, jest przesunięte w widmie kompleksu w stronę mniejszych liczb falowych, podczas gdy pasma przy 648 i 533 cm-1 przesuwają się w stronę większych liczb falowych. Na podstawie analizy spektroskopowej można wywnioskować, że między polarną częścią surfaktantu a szkieletem fosforanowym DNA występują oddziaływania niekowalencyjne, co zgadza się z wiedzą teoretyczną. Przesunięcia wybranych pasm i zmiany ich kształtu obserwowane we wszystkich kompleksach są podobne. Podsumowując, porównanie widm FTIR produktu syntezy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA, dsDNA(krótkie)-BAC i dsDNA(krótkie)-HDP z czystymi substratami i ich mieszaniną fizyczną wskazuje na istnienie efektywnego połączenia elektrostatycznego między dsDNA(krótkie) a każdym z surfaktantów. Proces tworzenia kompleksu nie zmienia w znacznym stopniu konformacji podwójnej helisy DNA. Surfaktanty oddziałują z grupami fosforanowymi na zewnątrz helisy, zmieniając charakter związku na hydrofobowy. Najbardziej istotne różnice między położeniem pasm w przypadku składników kompleksów i produktów syntezy zestawiono w Tabeli 12. Tabela 12 Zmiany w pozycji pasm IR (w cm–1) dla kompleksów dsDNA-surfaktant w porównaniu do czystego DNA oraz czystych surfaktantów [100-102]. dsDNA BAC HDP CTMA dsDNA dsDNA dsDNA Interpretacja 524 529 529 533 Deformacja pierścienia w adeninie 642 647 647 648 723 shp 719 728 br 722 ρ(CH2) al,n 830B 823 824 Fosfodiester 966B 959 959 962 δ(O-P-O) / C-C i C-O w szkielecie węglowym 1013 1008 1009 1010 ν(C-O) w pierścieniu deoksyrybozy ~1090 sh 1092 shp 1095 shp 1093 shp νs(PO2-) 1224B 1244A 1243A 1243A νas (PO2-) 1280B 1277 1278 1277 Deoksyroboza-tymina 1471 1468 δ(CH2) al 1471 1490 1472 1468 1485 1468 ν(C=C) ar ν(C=C) ar 1538 1528 1529 1529 Deoksytydyna – 1573 1573 1574 2849 2849 2851 2852 νs(CH2) al 2921 2914 2917 2924 2920 2921 νas(CH2)al A lub B pozycje pasm FTIR charakterystyczne dla danej formy DNA (A lub B). Charakterystyka drgań: ν – rozciągające; δ – zginające;  – kołyszące; s – symetryczne; as – asymetryczne; ar – w pierścieniu aromatycznym; al – w łańcuchu alifatycznym; n – długi łańcuch alifatyczny; charakterystyka pasm: sh – boczne; shp – ostre; br – szerokie. 4.1.4. Kompleksy pDNA z różnymi surfaktantami Badania metodą FTIR przeprowadzono także dla czystych składników oraz kompleksów DNA-surfaktant utworzonych na bazie DNA plazmidowego pDNA. Zarejestrowane widma prezentuje Rys. 37. Dla widma czystego pDNA obserwuje się pasma w położeniach 860, 1176, 1208 oraz 1238 cm-1, które są charakterystyczne dla form A i Z DNA, co oznacza, że właśnie te formy występują w badanej próbce. Zaobserwowano przesunięcie pasma odpowiadającego asymetrycznym drganiom rozciągającym grup fosforanowych as(PO2-) w stronę większych wartości liczby falowej (początkowe płożenie ok. 1240 cm-1), co wskazuje, że po kompleksacji dominującą formą DNA jest A-DNA. Zmiany w położeniu pasm po kompleksacji potwierdzają utworzenie kompleksu głównie poprzez oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy polarną głową surfaktantu a szkieletem pDNA w przypadku wszystkich surfaktantów. Najważniejsze zmiany pozycji pasm obserwowanych po utworzeniu kompleksu zestawiono w Tabeli 13. Tabela 13 Zmiany w pozycji pasm FTIR (w cm–1) dla kompleksów pDNA-surfaktant w porównaniu do czystego DNA oraz czystych surfaktantów [100-102]. pDNA CTMA HDP BAC pDNA pDNA pDNA Interpretacja 719 723 shp 724 725 ρ(CH2) al,n 832B 860A 822 825 – 823 – Fosfodiester 962 960 956 δ(O-P-O) / C-C i C-O w szkielecie DNA 1176A 1168 1172 1166 C3’-cukier-grupa fosforanowa 1208Z 1201Z 1201Z νas (PO2-) 1238A 1243 1246A 1241A νas (PO2-) 1274 1278 1278 Deoksyryboza-tymina δ(CH2) al 1472 1508 1471 1490 1470 1485 1468 1504 1467 1484 ν(C=C) ar ν(C=C) ar od ligandu lub zasady azotowej w DNA 1531 1471 1527 1528 Deoksytydyna 1696Z 1666 1690 1690 1689 ν(C=O), ν(C=N) między dwoma zasadami azotowymi 2849 2849 2854 2853 2854 νs(CH2) al 2917 2914 2921 2925 2925 2924 νas (CH2) al A, B lub Z pozycje pasm FTIR charakterystyczne dla danej formy DNA (A, B lub Z). Charakterystyka drgań: ν – rozciągające; δ – zginające;  – kołyszące; s – symetryczne; as – asymetryczne; ar – w pierścieniu aromatycznym; al – w łańcuchu alifatycznym; n – długi łańcuch alifatyczny; charakterystyka pasm: shp – ostre. Rys. 37 Widma FTIR czystych składników, fizycznej mieszaniny DNA+surfaktant oraz kompleksów na bazie pDNA z surfaktantami CTMA (a), HDP (b) i BAC (c). 4.2. Badania strukturalne metodą dyfrakcji rentgenowskiej Wyniki badań metodą FTIR sugerują, że wszystkie badane rodzaje DNA tworzą z wybranymi surfaktantami kompleksy DNA-surfaktant, które różnią się od mieszanin fizycznych DNA+surfaktant. Aby poznać budowę strukturalną wytworzonych kompleksów przeprowadzono badania metodą dyfrakcji rentgenowskiej. Dyfraktogramy czystych surfaktantów zaprezentowano na Rys. 38. Na dyfraktogramach widoczne są maksima charakterystyczne dla poszczególnych surfaktantów. Refleks przy 2θ ≈ 3° widoczny jest również na dyfraktogramie czystego szkiełka (opisanym jako tło na Rys. 38), więc nie pochodzi od żadnego z surfaktantów. Rys. 38 Dyfraktogramy dla czystych surfaktantów na płytce szklanej. Dyfraktogramy dla czystego dsDNA(krótkie) oraz kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA są przedstawione na Rys. 39. Na dyfraktogramie dla czystego dsDNA(krótkie) widoczne jest szerokie maksimum w okolicy 2θ ≈ 20°, odpowiadające odległościom rzędu 0,42-0,43 nm, co może wskazywać na odległości wewnątrz helisy. Maksimum to występuje także na dyfraktogramach kompleksów, jest jednak przesunięte nieznacznie w stronę mniejszych wartości 2θ (Tabela 14). W przypadku kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA obserwuje się niskokątowy refleks w zakresie 2θ = 2-6° oraz szerokie maksimum dla 2θ ≈ 20° (jest ono jednak węższe niż dla czystego DNA). W zakresie niskokątowym widoczne jest wyraźne, silne maksimum dyfrakcyjne dla 2θ= 2,70(1)°, które odpowiada odległości 3,32 nm. Dodatkowo, dla jednej z próbek kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA widoczne jest drugie ostre maksimum dla 2θ ≈ 3,4° (środkowy wykres na Rys. 39). W celu interpretacji tego maksimum przeprowadzono także badania metodą niskokątowego rozpraszania SAXS, którego wyniki dla czystego CTMA oraz kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA zaprezentowano na Rys. 40. Porównanie dyfraktogramów otrzymanych metodą XRD i SAXS prowadzi do wniosku, że położenie dodatkowego maksimum na dyfraktogramie kompleksu (dla 2θ ≈ 3,4°) zgadza się z położeniem maksimum charakterystycznego dla czystego CTMA, widocznym na Rys. 40. Oznacza to, że w badanej próbce występowała niezwiązana frakcja czystego surfaktantu, a metoda dyfrakcji rentgenowskiej, poza informacjami strukturalnymi, może posłużyć do sprawdzenia jakości otrzymanego kompleksu. Rys. 39 Dyfraktogramy dla czystego dsDNA(krótkie) oraz kompleksów dsDNA(krótkie)-CTMA. Rys. 40 Dyfraktogramy (SAXS) dla czystego CTMA oraz kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA. 4.2.1. Kompleksy DNA-CTMA z różnymi rodzajami DNA Badania rentgenowskie przeprowadzono także dla próbek kompleksów zsyntezowanych z różnych typów DNA oraz CTMA, a otrzymane dyfraktogramy przedstawiono na Rys. 41. Dla wszystkich próbek obserwuje się dwa maksima: ostry refleks w zakresie niskich kątów oraz szerokie maksimum dla 2θ ≈ 20°. Dla wszystkich kompleksów refleks niskokątowy występuje w okolicy 2θ ≈ 2,7° - 2,8°, co odpowiada odległościom ok. 3,2 nm, natomiast nie występuje dodatkowy refleks niskokątowy, który mógłby być utożsamiany z niezwiązanym surfaktantem. Jedynie na dyfraktogramie kompleksu dsDNA(chrom)-CTMA widoczne są ostre refleksy w zakresie wyższych kątów, co może sugerować występowanie zanieczyszczeń w próbce, jednak nie można jednoznacznie rozstrzygnąć, od czego one pochodzą. Rys. 41 Dyfraktogramy dla kompleksów na bazie różnego typu DNA z CTMA. 4.2.2. Kompleksy dsDNA(krótkie) z różnymi surfaktantami Dyfraktogramy dla kompleksów dsDNA(krótkie) z różnymi surfaktantami zaprezentowano na Rys. 42. Wszystkie utworzone kompleksy w zakresie niskokątowym wykazują silne maksimum dyfrakcyjne dla 2θ ≈ 2,6°, odpowiadające odległości ok. 3,3 nm. Podobnie jak dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA z resztką surfaktantu, widoczne jest dodatkowe maksimum dla 2θ ≈ 3,4°, dla kompleksu dsDNA(krótkie)-HDP pojawia się maksimum dla 2θ ≈ 3,88°, jest ono jednak znacznie mniejsze i słabiej wykształcone niż w przypadku kompleksu z CTMA. Na dyfraktogramach kompleksów dsDNA(krótkie)-HDP i dsDNA(krótkie)-CTMA widoczny jest również refleks położony w zakresie wyższych kątów, odpowiednio przy 20° i 19°. Z kolei obecność refleksu przy 2θ ≈ 3,88°, dla próbki dsDNA(krótkie)-HDP także może sugerować niewypłukane resztki surfaktantu. Na dyfraktogramach niskokątowych (SAXS) dla wszystkich kompleksów widoczne są małe maksima w miejscu charakterystycznym dla refleksu pochodzącego od czystego surfaktantu (Rys. 43), najlepiej jest to widoczne dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA. Rys. 42 Dyfraktogramy dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) z trzema różnymi surfaktantami Rys. 43 Dyfraktogramy (SAXS) dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) z trzema różnymi surfaktantami oraz czystych surfaktantów. 4.2.3. Kompleksy pDNA z różnymi surfaktantami Przeprowadzono także badania dla kompleksów zsyntezowanych na bazie DNA plazmidowego a wyniki zaprezentowano na Rys. 44. Otrzymane dyfraktogramy są podobne do tych uzyskanych dla kompleksów zsyntezowanych w oparciu o DNA liniowe. Struktury tworzone przez kolistą i superskręconą formę DNA są zbyt duże (szacowana średnica hydrodynamiczna formy kolistej plazmidu o długości ok. 4500 pz, wynosi 320 nm [103]), by można je było zaobserwować na dyfraktogramach uzyskanych standardową metodą XRD, która pozwala na badanie struktur o rozmiarach do ok. 18 nm (odległość odpowiadająca kątowi 2θ ≈ 0,5° i promieniowaniu CuKα). Dyfraktogramy dla kompleksów pDNA zawierają ostry refleks w zakresie niskich kątów 2θ ≈ 2,5°-2,7° oraz szerokie maksimum w okolicy 2θ ≈ 20°. Rys. 44 Dyfraktogramy dla kompleksów na bazie pDNA z trzema różnymi surfaktantami. Położenia wszystkich refleksów pojawiających się na dyfraktogramach badanych próbek wraz z odpowiadającymi im odległościami zebrano w Tabeli 14. Wydaje się, że refleks występujący dla niskich kątów może odpowiadać szerokości helisy z dołączonymi surfaktantami, ponieważ nie występuje na dyfraktogramach czystego DNA. Natomiast szerokie maksimum obserwowane dla wyższych kątów prawdopodobnie odpowiada odległościom wewnątrz helisy. Warto zauważyć, że po utworzeniu kompleksu odległości te zwiększają się, co sugeruje, że szerokie maksimum związane jest nie tylko z rozkładem odległości wewnątrz helisy DNA, ale także ze średnimi odległościami między długimi łańcuchami węglowymi surfaktantów. Tabela 14 Zestawienie pozycji maksimów dla kompleksów DNA z charakterystycznymi odległościami obliczonymi na podstawie równania Bragga. Refleks niskokątowy Szerokie maksimum w okolicy 20° związek 2θ [deg] Odległość [nm] 2θ [deg] Odległość [nm] czyste dsDNA(krótkie) - - 21,09(2) 0,43(1) dsDNA(krótkie)–CTMA (1) 2,62(1) 3,37(2) 19,98(4) 0,46(2) dsDNA(krótkie)–CTMA (2) 2,76(1) 3,20(2) 19,59(3) 0,46(2) dsDNA(krótkie)–BAC 2,65(1) 3,33(2) 19,55(2) 0,46(1) dsDNA(krótkie)–HDP 2,65(1) 3,33(2) 20,01(2) 0,45(1) dsDNA(długie)–CTMA 2,74(1) 3,22(2) 19,10(8) 0,47(4) dsDNA(chrom)–CTMA 2.68(1) 3,29(2) 20,24(2) 0,45(2) pDNA–CTMA 2,77(1) 3,19(2) 19,69(3) 0,46(1) pDNA–BAC 2,52(1) 3,50(2) 19,88(2) 0,45(2) pDNA–HDP 2,60(1) 3,39(2) 20,54(2) 0,44(2) 4.2.4 Modelowanie cząsteczek surfaktantu i określenie komórki elementarnej Przeprowadzono także modelowanie cząsteczek surfaktantów półempiryczną metodą PM7 w programie MOPAC2016 [104]. Długość surfaktantów przyjęto jako odległość od dwóch najbardziej wysuniętych atomów nie wodorowych. Wyniki modelowania, tj. przestrzenne ułożenie atomów w cząsteczkach, przedstawiono na Rys. 45. Obraz zawierający strzałka Opis wygenerowany automatycznie Rys. 45 Modele cząsteczkowe surfaktantów wykorzystanych w pracy (rysunki wygenerowane w programie Avogadro [105]). W oparciu o wyniki badań FTIR oraz XRD oszacowano długości cząsteczek surfaktantów oraz szerokości kompleksów dla wszystkich trzech surfaktantów. Do obliczeń przyjęto szerokość helisy charakterystyczną dla formy A-DNA, która zgodnie z wynikami FTIR, jest dominującą formą w cząsteczkach kompleksu (szerokość helisy A-DNA: 𝑊𝐷𝑁𝐴 = 2,55 nm [51]). Cząsteczki surfaktantu przyłączają się do helisy z obu stron poprzez oddziaływanie elektrostatyczne z resztami fosforanowymi. Oszacowana szerokość kompleksów DNA (liczona jako szerokość helisy DNA i podwojona długość surfaktantu) wynosi 6,3 nm-7,6 nm, co podzielone na dwa jest w przybliżeniu równe 3,4 nm, tj. odległości wyznaczonej z badań XRD. Oszacowane długości surfaktantów i szerokości kompleksów przedstawiono w Tabeli 15. Obliczona szerokość kompleksów jest poprawna przy założeniu, że łańcuchy surfaktantu są w najbardziej rozciągniętej pozycji. W rzeczywistości odległości te mogą być mniejsze, w wyniku zginania się łańcuchów węglowych. Szczególnie dobrze widać to w przypadku kompleksu z surfaktantem BAC. W obliczeniach założono, że cząsteczka po przyłączeniu się do DNA jest w formie rozciągniętej (stąd oszacowania szerokość połowy kompleksu wynosząca 3,8 nm), podczas gdy ten surfaktant powinien dołączać się do DNA atomem azotu (który ma ładunek dodatni), a zatem pierścień aromatyczny musi się ugiąć, aby pozwolić na łączenie się azotu z resztą fosforanową oddziaływaniami elektrostatycznymi. Zatem szerokość kompleksu będzie mniejsza, co potwierdzają wyniki XRD (szerokość wynosi ok. 3,33 nm). Tabela 15 Dlugość cząsteczki surfaktantu L (maksymalna) wraz z oszacowaną szerokością kompleksu WDNA + 2L, gdzie WDNA = 2,55 nm – szerokość formy A-DNA. Surfaktant L [nm] WDNA+2L (WDNA+2L) /2 BAC 2,52 7,59 3,80 HDP 2,27 7,09 3,55 CTMA 1,89 6,33 3,12 Komórka elementarna struktury kompleksów DNA jest dwuwymiarowa, co oznacza, że opisują ją dwie stałe sieciowe a i b, przy czym a < b. Odległości międzypłaszczyznowe 𝑑ℎ𝑘 można wyrazić za pomocą zależności (14): 1 (14) gdzie h i k to wskaźniki Millera (w przypadku, gdy rozważamy przypadek dwuwymiarowy nie bierzemy pod uwagę trzeciego wskaźnika Millera). Przy spełnionym warunku 𝑏=𝑎√3 (jak dla dsDNA(krótkie)-CTMA) odległości d02 oraz d11 są równe, co oznacza, że refleksy dla nich również mają to samo położenie. Wartości tych odległości można, zatem wyliczyć korzystając z przekształconego równania Bragga: 𝑑 (15) Kąt 𝜃𝑑 odpowiada położeniu refleksu niskokątowego dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA. Podobną procedurę zastosowano do obliczenia stałych sieciowych w komórce elementarnej dla pozostałych kompleksów. Refleks niskokątowy dla DNA-BAC i DNA-HDP ma trzy składowe (Rys. 43). Jedna z nich ma podobne położenie jak refleks dla DNA-CTMA, więc zinterpretowano ją jako pochodzącą od sieci heksagonalnej. Dwie pozostałe składowe można uznać za refleksy (02) i (11) od zniekształconej sieci heksagonalnej (𝑑02≠𝑑11), przy czym położenie silniejszej składowej odpowiada odległości 𝑑11 (z uwagi na to, że na natężenie refleksu (11) składają się zarówno płaszczyzny (11), jak i (11̅). Wyniki obliczeń przedstawia Tabela 16, natomiast schemat komórki elementarnej dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA pokazano na Rys. 46. Tabela 16 Wartości obliczonych parametrów sieciowych dla dla sieci heksagonalnej (hex) i zniekształconej heksagonalnej (ps-hex) badanych kompleksów a [nm] b [nm] dsDNA(krótkie)–BAC (ps-hex) 4,51(3) 7,05(5) dsDNA(krótkie)–BAC (hex) 4,89(6) 8,5(1) dsDNA(krótkie)–HDP (ps-hex) 4,00(5) 7,57(6) dsDNA(krótkie)–HDP (hex) 4,8(2) 8,3(4) dsDNA(krótkie)–CTMA (hex) 4,83(1) 8,37(2) W kompleksie dsDNA(krótkie)-CTMA występuje jedynie faza heksagonalna, podczas gdy dla pozostałych surfaktantów mamy do czynienia ze zniekształconą fazą heksagonalną z domieszką fazy heksagonalnej. Dla struktury heksagonalnej połowa przekątnej komórki elementarnej jest równa stałej sieciowej a (odległości między dwoma najbliższymi sąsiadami), co prowadzi do zależności 𝑏=𝑎√3. Dla zniekształconej sieci heksagonalnej ta zależność nie występuje Obraz zawierający tekst, woda, mapa Opis wygenerowany automatycznie Rys. 46 Model upakowania kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA na podstawie badań metodą SAXS 4.3. Badania metodą spektroskopii dielektrycznej Badania metodą spektroskopii dielektrycznej zsyntezowanych kompleksów dsDNA(krótkie) oraz czystych surfaktantów przeprowadzono w temperaturze pokojowej w celu określenia ich właściwości elektrycznych. 4.3.1. Czyste surfaktanty Widma dielektryczne zarejestrowane dla surfaktantów BAC, CTMA oraz HDP przedstawiono na Rys. 47a,b. W badanym zakresie częstotliwości nie zaobserwowano procesów relaksacyjnych dla żadnego z badanych surfaktantów. Największą wartość dyspersji dielektrycznej wykazuje surfaktant HDP w zakresie częstotliwości 10 Hz – 3 MHz. Z kolei, w obszarze niskich częstotliwości obserwuje się dość gwałtowny wzrost wartości dyspersji dielektrycznej dla BAC, która w wyższych częstotliwościach (> 1kHz) przyjmuje wartości najmniejsze wśród badanych surfaktantów. Zachowanie zarówno dyspersji jak i absorpcji dielektrycznej dla próbek HDP oraz CTMA jest bardzo podobne, jednak HDP w całym zakresie pomiarowym przyjmuje wartości dyspersji wyższe o ok. 0,3 w porównaniu z CTMA. Rys. 47 Widma dielektryczne dla surfaktantów BAC, CTMA, HDP: dyspersja (a) i absorpcja (b). Zależność części rzeczywistej (c) i urojonej (d) impedancji od częstotliwości. W celu sprawdzenia czy występują niskoczęstościowe procesy relaksacyjne wykreślono zależność części rzeczywistej i urojonej impedancji (Rys. 47c,d), jednak podobnie jak w przypadku widm dielektrycznych nie pojawiają się tam żadne procesy. Na podstawie tych obserwacji można stwierdzić, że w badanym zakresie częstotliwości nie występują żadne procesy relaksacyjne dla badanych surfaktantów. W przypadku przewodności elektrycznej właściwej (Rys. 48), zależności od częstości dla CTMA i HDP pokrywają się do częstotliwości ok. 10 kHz, a następnie obserwuje się niewielki jej wzrost dla CTMA w stosunku do HDP. Z kolei BAC wykazuje największe wartości przewodności eklektycznej w szerokim zakresie częstotliwości. Wartości przewodnictwa dla częstości 0,5 Hz przedstawiono w Tabeli 17. Różne wartości przewodności elektrycznej właściwej badanych surfaktantów prawdopodobnie są związane z położeniem atomu azotu w cząsteczce surfaktantu. Tabela 17 Wartość przewodności elektrycznej właściwej dla czystych surfaktantów dla f=0,5 Hz. σ [pS/cm] BAC 8,98(4) CTMA 3,55(2) HDP 3,37(2) Rys. 48 Zależność przewodnictwa właściwego od częstotliwości dla badanych próbek czystych surfaktantów. 4.3.2. Kompleksy DNA-CTMA z różnymi rodzajami DNA Widma dielektryczne dla próbek kompleksu DNA-CTMA zsyntezowanego z różnymi typami DNA: dsDNA(krótkim), dsDNA(długim), dsDNA(chrom) oraz pDNA przedstawiano na Rys. 49 a,b. Widma zarejestrowane dla kompleksu z DNA po chromatografii, dsDNA(chrom)- CTMA, są wyraźnie różne od pozostałych kompleksów. Poniżej 100 Hz wartości dyspersji i absorpcji szybko rosną, a w zależności 𝑡𝑔𝛿(𝑓) wyraźnie widoczny jest proces relaksacyjny (Rys. 49 c). Z pozostałych kompleksów, w obszarze niskich częstości, wyróżnia się kompleks dsDNA(krótkie)-CTMA. Dla tego zakresu obserwujemy znacznie gwałtowniejszy wzrost zarówno dyspersji, jak i absorpcji w stosunku do pozostałych dwóch kompleksów (dsDNA(długie)–CTMA, pDNA-CTMA). Dla tych trzech kompleksów nie obserwuje się wyraźnego procesu relaksacyjnego ani w absorpcji dielektrycznej ani w zależności 𝑡𝑔𝛿(𝑓) (Rys. 49c) Rys. 49 Widma dielektryczne: dyspersja (a), absorbcja (b), zależność tgδ od częstotliwości (c), zależność części rzeczywistej (d) i urojonej (e) impedancji od częstotliwości oraz zależność przewodności właściwej od częstotliwości (f) dla kompleksów DNA–CTMA zsyntezowanych z czterema typami DNA. Podobnie jak dla czystych surfaktantów, wykreślono część rzeczywistą i urojoną impedancji w celu sprawdzenia występowania niskoczęstościowego procesu relaksacji we wszystkich czterech kompleksach DNA-CTMA i zaobserwowano dobrze widoczne procesy relaksacyjne dla wszystkich czterech kompleksów (Rys. 49 d, e). Procesy te są także możliwe do zaobserwowania na wykresach Eulera-Argand’a (Rys. 50). Najsilniejszy proces relaksacyjny występuje dla kompleksu pDNA-CTMA, a kolejno, coraz słabsze, dla dsDNA(długie)-DNA i dsDNA(krótkie)-DNA. Rys. 50 Zależność Eulera-Argand’a dla kompleksów DNA-CTMA. W celu określenia parametrów zarejestrowanych procesów, do danych pomiarowych (w zakresie częstotliwości do 1 MHz) dopasowano model Cole-Cole opisany równaniem [106]: 𝑍 (16) gdzie: Z’s, Z∞′ to wartości impedancji w granicy niskich i wysokich częstotliwości, ∆Z′ to inkrement impedancji, fR – częstotliwość relaksacji, α – parametr rozkładu czasów relaksacji, 0< α <1, (im mniejsza jego wartość, tym mniejszy rozkład czasów relaksacji; dla α = 0 otrzymujemy proces typu Debye’a). Wyniki dopasowania przedstawia Tabela 18. Tabela 18 Otrzymane z dopasowania wartości inkrementu impedancji, częstotliwości relaksacji i parametru α oraz przewodności elektrycznej właściwej. ∆𝒁′[𝑮𝜴] f 𝜶 σ [pS/cm] dsDNA(krótkie)–CTMA 0,321(2) 5,84(11) 0,369(3) 9330(463) dsDNA(długie)–CTMA 1,223(7) 6,35(7) 0,22(02) 27(2) dsDNA(chrom)–CTMA 0,002(1) 3322(216) 0,28(2) 8747(2110 pDNA-CTMA 2,82(2) 4,09(4) 0,217(3) 14,6(4,8) W roztworach DNA występuje szereg różnych procesów relaksacyjnych. Relaksacja w niskich częstotliwościach, zwykle od 1 do 100 Hz, jest związana z podłużną polaryzacją powłoki jonów otaczających cząsteczkę DNA [107]. W ramach niniejszej pracy badano nie roztwory DNA a jego kompleksy, co komplikuje interpretację pojawiających się procesów relaksacyjnych. Oddziaływania pomiędzy surfaktantem i DNA są złożone: głowa surfaktantu wiąże się do szkieletu fosforanowego DNA poprzez oddziaływania elektrostatyczne, podczas gdy ogon posiada pewną mobilność. Przyłączona głowa surfaktantu częściowo ekranuje ładunek czystego DNA, a łańcuchy węglowodorowe mogą poruszać się wokół helisy. Zatem, poprzez analogię do roztworów DNA, wydaje się, że to oscylacje łańcuchów surfaktantów są widoczne jako procesy relaksacyjne w kompleksach, a wiązanie pomiędzy DNA a surfaktantem prawdopodobnie przesuwa częstotliwość relaksacji do niższych częstotliwości. 4.3.3. Badania dsDNA(krótkie) i pDNA z różnymi surfaktantami. Zbadano wpływ struktury surfaktantu na właściwości elektryczne powstałych kompleksów dla jednego kompleksu na bazie DNA liniowego – dsDNA(krótkie) oraz kompleksu na bazie DNA plazmidowego – pDNA. Widma dielektryczne zarejestrowane dla tych kompleksów przedstawiano na Rys. 51. W całym zakresie pomiarowym kompleks dsDNA(krótkie)-BAC charakteryzuje się najmniejszą wartością stałej dielektrycznej, natomiast pozostałe kompleksy, dsDNA(krótkie)-CTMA i dsDNA(krótkie)-HDP, wykazują znacznie większą wartość absorpcji i dyspersji dielektrycznej, szczególnie w zakresie niskich częstości (Rys. 51a, b). Warto zwrócić uwagę, że dla wszystkich kompleksów zarówno wartość dyspersji ε’, jak i absorpcji ε’’ dielektrycznej wzrastają dość gwałtownie w obszarze niskich częstotliwości, co może być związane ze zjawiskiem polaryzacji elektrod lub procesem relaksacyjnym występującym w rejonie bardzo niskich częstotliwości. Dla kompleksów pDNA największą wartość stałej dielektrycznej wykazuje kompleks pDNA-HDP (Rys. 51c, d), podczas gdy pozostałe kompleksy wykazują wartości znacznie mniejsze. W celu sprawdzenia występowania procesu relaksacyjnego w zakresie niskich częstotliwości wykreślono zależność rzeczywistej i urojonej części impedancji dla kompleksów syntezowanych na bazie DNA liniowego oraz plazmidowego (Rys. 51e-h) oraz wykresy Eulera-Argand’a dla tych związków (Rys. 52). Rys. 51 Widma dielektryczne: dyspersja (a,c) i absorpcja (b,d) dla kompleksów utworzonych odpowiednio na bazie dsDNA(krótkie) i pDNA. Widma we wstawkach przedstawiają te same dane w innej skali na osi Y. Zależność części rzeczywistej (e,g) i urojonej (f,h) impedancji od częstotliwości dla kompleksów utworzonych odpowiednio na bazie dsDNA(krótkie) i pDNA. Rys. 52 Zależności Eulera-Argand’a dla próbek kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) (a) oraz pDNA (b). Dla wszystkich badanych kompleksów widoczne są wyraźne procesy relaksacyjne, wobec czego do otrzymanych zależności dopasowano model Cole-Cole (16) w celu określenia parametrów zarejestrowanych procesów. Inkrement impedancji, częstość relaksacji oraz parametr α procesów relaksacji zarejestrowanych dla poszczególnych kompleksów, otrzymane w wyniku dopasowania, zebrano w Tabeli 19. Porównując te wyniki z otrzymanymi dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA można stwierdzić, że procesy relaksacyjne występujące w kompleksach dsDNA(krótkie)-BAC i dsDNA(krótkie)-HDP, prawdopodobnie także związane są z oscylacjami łańcuchów surfaktantów. Tabela 19 Otrzymane z dopasowania wartości inkrementu impedancji, częstotliwości relaksacji, parametru α i przewodności elektrycznej właściwej dla częstotliwości 0,5 Hz. ∆𝒁′[𝑮𝜴] f 𝜶 σ [pS/cm] dsDNA(krótkie)–BAC 1,743(6) 5,34(5) 0,195(3) 1900(870) dsDNA(krótkie)–CTMA 0,349(2) 4,87(9) 0,385(3) 9330(463) dsDNA(krótkie)–HDP 1,173(4) 8,71(8) 0,286(2) 10870(1673) pDNA-BAC 15,2(1) 1,43(1) 0,097(2) 2,55(2) pDNA-CTMA 2,82(2) 4,09(4) 0,217(3) 14,6(4,8) pDNA–HDP 0,0461(1) 92,1(5) 0,316(2) 1020(334) Na Rys. 53 przedstawiono zależność przewodności elektrycznej kompleksów od częstotliwości. Zauważyć można podobne zachowanie wszystkich próbek – przewodność rośnie wraz ze wzrostem częstotliwości. Kompleks dsDNA(krótkie)-BAC charakteryzuje się najmniejszą przewodnością w całym zakresie częstości, tak w kompleksie z DNA liniowym, jak i plazmidowym. Zatem dodatek BAC do czystego DNA zmniejsza przewodność materiału, co jest dużo bardziej widoczne dla kompleksu na bazie pDNA. Tabela 19 przedstawia także wartości przewodności dla częstotliwości 0,5 Hz, która w przypadku tych próbek utożsamiana jest z przewodnością elektryczną właściwą (𝜎𝐷𝐶). Wartości przewodności dla kompleksów dsDNA(krótkie)-CTMA oraz dsDNA(krótkie)-HDP są bardzo zbliżone w całym zakresie częstości. Dla kompleksów pDNA-BAC oraz pDNA-CTMA obserwuje się znaczny spadek przewodności w porównaniu do kompleksów tych surfaktantów z DNA liniowym (w przypadku pDNA-HDP spadek ten jest mniejszy – jeden rząd wielkości). Rys. 53 Zależność przewodności właściwej od częstotliwości dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) (a) oraz pDNA (b). Dodatkowo, w przypadku próbek kompleksów z różnymi surfaktantami zaobserwowano możliwość kontrolowania przewodności elektrycznej właściwej w zależności od użytego surfaktantu. Efekt ten lepiej widoczny jest w przypadku kompleksów syntezowanych na bazie pDNA. Dodatkowo, po syntezie kompleksu odwraca się trend związany z wartością przewodności - dla czystych surfaktantów BAC przyjmuje największe wartości przewodności (Tabela 17), podczas gdy dla kompleksów z BAC przewodność jest najmniejsza zarówno dla kompleksów syntezowanych na bazie DNA liniowego, jak i plazmidowego. Niewykluczone, że związane jest to ze zmianą konformacji surfaktantu po związaniu się z DNA. Podsumowując, przeprowadzono badania metodą spektroskopii dielektrycznej dla ośmiu zsyntezowanych kompleksów DNA-surfaktant kationowy oraz trzech surfaktantów (badania dla czystego DNA, z powodu jego higroskopijności były niemożliwe). Parametry procesów relaksacyjnych zarejestrowanych w kompleksach oraz wartości przewodnictwa dla wszystkich badanych materiałów zebrano w Tabeli 20. Widoczny jest duży wpływ długości łańcuchów i formy DNA (liniowy lub plazmid) na te parametry, a także duży wpływ surfaktantu na właściwości elektryczne próbki (przewodność właściwą). Dla próbek kompleksów DNA-CTMA syntezowanych z różnego typu DNA zaobserwowano odstające od innych zachowanie kompleksu dsDNA(chrom)-CTMA. Kompleks ten charakteryzuje się znacznie większymi wartościami przenikalności dielektrycznej i wykazuje wyraźne procesy relaksacyjne. Tak duże odstępstwa od pozostałych próbek DNA liniowego mogą być spowodowane przygotowaniem materiału do badań: dsDNA(chrom) było wypłukiwane ze złoża przy pomocy buforu zawierającego NaCl. Pozostałości NaCl, pomimo etapu płukania w procedurze otrzymywania kompleksu dsDNA(chrom)-CTMA, najprawdopodobniej wpłynęły na właściwości elektryczne tego kompleksu. Tabela 20 Zestawienie wszystkich parametrów dielektrycznych otrzymanych z dopasowania. ∆𝒁′[𝑮𝛀] f 𝜶 σ [pS/cm] dsDNA(krótkie)–CTMA 0,321(2) 5,84(11) 0,369(3) 9325(463) dsDNA(długie)–CTMA 1,223(7) 6,35(7) 0,22(02) 27(2) dsDNA(chrom)–CTMA 0,002(1) 3322(216) 0,28(2) 8747(211) pDNA-CTMA 2,82(2) 4,09(4) 0,217(3) 14,6(4,8) dsDNA(krótkie)–BAC 1,743(6) 5,34(5) 0,195(3) 1900(870) dsDNA(krótkie)–CTMA 0,349(2) 4,87(9) 0,385(3) 9330(463) dsDNA(krótkie)–HDP 1,173(4) 8,71(8) 0,286(2) 10870(1673) pDNA–BAC 15,2(1) 1,43(1) 0,097(2) 2,55(2) pDNA–HDP 0,0461(1) 92,1(5) 0,316(2) 1020(334) BAC - - - 8,98(4) CTMA - - - 3,55(2) HDP - - - 3,37(2) 5. Badania właściwości cienkich warstw kompleksów W niniejszym rozdziale opisano badania skoncentrowane na wyborze metody i określeniu optymalnych warunków otrzymywania powtarzalnych, cienkich warstw kompleksów DNA oraz przedstawiono wyniki i dyskusję badań właściwości wytworzonych warstw. W pierwszym etapie dokonano wyboru substratu (rodzaju powierzchni do wyniesienia materiału), następnie zbadano topografię wytworzonych różnymi metodami (spin-castingu, H-dippingu, drop- castingu i LB) cienkich warstw kompleksu DNA-surfaktant kationowy. Do testów wybrano kompleks dsDNA(krótkie)-CTMA. W oparciu o uzyskane wyniki wybrano metodę LB i zbadano wpływ warunków eksperymentalnych (prędkość wynoszenia i ciśnienie powierzchniowe) na zachowanie warstwy kompleksu na granicy faz przed transferem na powierzchnię stałą, a następnie ustalono optymalne warunki wynoszenia warstw kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA. Optymalne warunki określone dla kompleksu na bazie dsDNA(krótkie), zastosowano do wyniesienia cienkich warstw kompleksów z CTMA utworzonych na bazie różnych typów DNA, na dwóch różnych substratach (krzem, mika). Kolejnym krokiem było wyniesienie cienkich warstw dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) z dwoma innymi surfaktantami kationowymi (BAC, HDP): dsDNA(krótkie)–BAC i dsDNA(krótkie)-HDP. W ostatnim etapie wyniesiono warstwy kompleksów na bazie plazmidowego DNA pDNA ze wszystkimi trzema surfaktantami kationowymi (CTMA, BAC i HDP). 5.1. Swobodna energia powierzchniowa czystych substratów Jako substraty do wynoszenia cienkich warstw badanych materiałów wybrano mikę i krzem. W celu obliczenia swobodnej energii powierzchniowej wybranych substratów oraz określenia ich charakteru (hydrofilowości lub hydrofobowości) zmierzono kąty zwilżania trzech cieczy: wody, gliceryny i dijodometanu na świeżo łupanej mice i oczyszczonym krzemie. Wyniki pomiarów kąta zwilżania zaprezentowano w Tabeli 21. Widocznym jest, że kąt zwilżania dla krzemu jest zbliżony dla wszystkich zastosowanych cieczy pomiarowych, a dla miki silnie zależy od rodzaju cieczy pomiarowej. Tabela 21 Średnia wartość kąta zwilżania trzech różnych cieczy na dwóch substratach dijodometan [o] woda [o] gliceryna [o] mika 33(3) 9(1) 29(3) krzem 43(2) 41(3) 42(4) Swobodną energię powierzchniową określono poprzez zastosowanie trzech modeli: • Owensa-Wendta dla dwóch par cieczy pomiarowych (woda i dijodometan oraz gliceryna i dijodometan), • metody kwasowo-zasadowej (trzy ciecze pomiarowe: woda, dijodometan oraz gliceryna), • podejścia Wu dla dwóch par cieczy pomiarowych (woda i dijodometan oraz gliceryna i dijodometan). Zastosowano wzory analityczne przedstawione w Tabeli 22, obliczenia prowadzono w programie Mathematica, a wyznaczone wartości poszczególnych składowych swobodnej energii powierzchniowej zestawiono w Tabela 23. Metody Owensa-Wendta i Wu zaimplementowano dwukrotnie, a następnie wyciągnięto wartość średnią w celu otrzymania dokładniejszych wartości. Tabela 22 Zestawienie wzorów wykorzystanych do obliczenia swobodnej energii powierzchniowej. Metoda Wykorzystane wzory Owensa - Wendta { 𝛾𝑠=𝛾𝑠𝑑+𝛾𝑠𝑝12𝛾𝐿1(1+cos𝜃1)=√𝛾𝑠𝑑𝛾𝐿1𝑑+√𝛾𝑠𝑝𝛾𝐿1𝑝12𝛾𝐿2(1+cos𝜃2)=√𝛾𝑠𝑑𝛾𝐿2𝑑+√𝛾𝑠𝑝𝛾𝐿2𝑝 Kwasowo - zasadowy { √𝛾𝑆𝑑𝛾𝑑𝑖𝑗𝑜𝑑𝑜𝑚𝑒𝑡𝑎𝑛𝑑=0.5𝛾𝐿(1+cos𝜃𝑑𝑖𝑗𝑜𝑑𝑜𝑚𝑒𝑡𝑎𝑛)√𝛾𝑆𝑑𝛾𝐿𝑑𝑑+√𝛾𝑆𝑎𝑐𝑖𝑑𝛾𝐿𝑤𝑏𝑎𝑠𝑒+√𝛾𝑆𝑏𝑎𝑠𝑒𝛾𝐿𝑤𝑎𝑐𝑖𝑑=0.5𝛾𝐿𝑉𝑤(1+cos𝜃𝑤𝑜𝑑𝑎)√𝛾𝑆𝑑𝛾𝐿𝑑𝑑+√𝛾𝑆𝑎𝑐𝑖𝑑𝛾𝐿𝑔𝑏𝑎𝑠𝑒+√𝛾𝑆𝑏𝑎𝑠𝑒𝛾𝐿𝑔𝑎𝑐𝑖𝑑=0.5𝛾𝐿𝑉𝑔(1+cos𝜃𝑔𝑙𝑖𝑐𝑒𝑟𝑦𝑛𝑎) Wu { 𝛾𝑠𝑑𝛾𝐿𝑣1𝑑(𝛾𝑠𝑑+𝛾𝐿1𝑑)+𝛾𝑠𝑝𝛾𝐿𝑣1𝑝(𝛾𝑠𝑝+𝛾𝐿1𝑝)=0,25𝛾𝐿𝑣1(1+𝑐𝑜𝑠𝜃1)𝛾𝑠𝑣𝑑𝛾𝐿𝑣2𝑑(𝛾𝑠𝑑+𝛾𝐿2𝑑)+𝛾𝑠𝑣𝑝𝛾𝐿𝑣2𝑝(𝛾𝑠𝑝+𝛾𝐿2𝑝)=0,25𝛾𝐿𝑣2(1+𝑐𝑜𝑠𝜃2) 𝛾𝑠 – swobodna energia powierzchniowa (SEP) badanego podłoża; 𝛾𝑠𝑑– część dyspersyjna SEP badanej powierzchni; 𝛾𝑠𝑝– część polarna SEP badanej powierzchni 𝛾𝐿 – napięcie powierzchniowe cieczy 𝛾𝐿𝑑; 𝛾𝐿𝑝 – kolejno składowa dyspersyjna i polarna napięcia powierzchniowego cieczy. Występują we wzorach dla modelu Owensa-Wendta i modelu Wu z dodatkowymi indeksami 1, 2 oznaczającymi kolejne ciecze pomiarowe. Każdy z tych modeli wykorzystano 2 razy dla dwóch par cieczy pomiarowych: wody i dijodometanu oraz gliceryny i dijodometanu. 𝛾𝐿𝑑/𝐿𝑤/𝐿𝑔- napięcie powierzchniowe cieczy pomiarowych kolejno dijodometanu, wody i gliceryny. 𝛾𝐿𝑑; 𝛾𝐿𝑏𝑎𝑠𝑒;𝛾𝐿𝑎𝑐𝑖𝑑 – kolejno składowa dyspersyjna, zasadowa i kwasowa cieczy pomiarowej określonej w indeksie dolnym przy L Tabela 23 Średnie wartości swobodnej energii powierzchniowej dla czystych substratów. Metoda Część Część Suma Część Część mika Owens-Wendt 42,7(3,1) 25,1(1,9) 67,7(4,1) kwasowo- zasadowa 42,7(2,3) 56,8(6,3) 0,9(0,5) 53,5(3,5) Wu 43,0(2,4) 27,5(1,9) 70,5(4,0) krzem Owens-Wendt 38,0(1,2) 13,1(1,8) 56,5(6,3) kwasowo- zasadowa 38,0(1,8) 50,7(3,9) 1,2(0,4) 34,2(0,1) Wu 38,7(1,6) 21,1(1,5) 59,8(3,1) Podsumowując, w oparciu o analizę otrzymanych wartości kąta zwilżania i swobodnej energii powierzchniowej można stwierdzić, że oba substraty (krzem i mika) mają charakter hydrofilowy, przy czym mika jest bardziej hydrofilowa niż krzem, a krzem charakteryzuje się mniejszą energią powierzchniową niż mika. 5.2. Cienkie warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA otrzymane różnymi metodami W celu wyboru najlepszej metody wynoszenia cienkich warstw kompleksów DNA-surfaktant kationowy jako testowy materiał wybrano kompleks dsDNA(krótkie)-CTMA, a jako substrat mikę. Zastosowano wszystkie metody wynoszenia omówione w rozdziale 2. Dla każdej wyniesionej warstwy określono stopień pokrycia powierzchni oraz zbadano topografię otrzymanej powierzchni metodą mikroskopii sił atomowych (Rys. 54). Warstwy uzyskane metodą nanoszenia wirowego (spin-casting) były bardzo cienkie i niepowtarzalne (pokrycie powierzchni ok. 62%) – wynikiem każdego eksperymentu było uzyskanie różnych warstw. Generalnie kompleks tworzył na powierzchni miki monowarstwę chaotycznie rozmieszczonych łańcuchów tworzących strukturę przypominającą sieć (Rys. 54a). Podczas nanoszenia warstwy metodą listwy rozciągającej (H-dipping) zaobserwowano nierównomierne zwilżanie substratu kompleksem i w efekcie uzyskana warstwa była niejednorodna, zawierała dużą ilość defektów powierzchniowych. W tym przypadku także nie zaobserwowano samoorganizacji łańcuchów kompleksów DNA (Rys. 54b). Warstwy otrzymane tą metodą były grubsze niż otrzymane metodą nanoszenia wirowego, a pokrycie powierzchni wynosiło ok. 56%. Z kolei warstwy uzyskane poprzez odparowanie rozpuszczalnika, pomimo największego stopnia pokrycia wynoszącego ok. 78%, były bardzo niejednorodne zarówno pod wzglądem grubości, jak i topografii powierzchni, widoczne były również chaotycznie rozmieszczone łańcuchy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA (Rys. 54c). W przeciwieństwie do metod opisanych powyżej cienkie warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA otrzymane metodą Langmuir-Blodgett wykazywały cechy samoorganizacji na powierzchni - łańcuchy kompleksu ułożyły się równolegle do kierunku wyciągania, tworząc wydłużone struktury. Stopień pokrycia powierzchni wynosił 42%, a przy określonych warunkach wynoszenia otrzymywano podobne warstwy. Podsumowując, ze wszystkich zastosowanych metod wytwarzania cienkich warstw, tylko metoda Langmuir-Blodgett pozwoliła otrzymać powtarzalne warstwy cechujące się samoorganizacją. W związku z tym, w dalszym etapie badań zbadano wpływ warunków wynoszenia na jakość i topografię warstw kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA wynoszonych tą metodą. (c) (d) Rys. 54 Topografia cienkiej warstwy dsDNA(krótkie)-CTMA otrzymana metodami: nanoszenia wirowego (a), listwy rozciągającej (b), odparowania rozpuszczalnika (c), Langmuir-Blodgett, 15 mN/m (d). 5.3. Cienkie warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA otrzymane metodą Langmuir-Blodgett Przeprowadzono szereg eksperymentów wstępnych mających na celu określenie właściwości kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA na granicy faz ciecz-gaz. Sprawdzono wpływ takich czynników, jak szybkość ściskania monowarstwy, szybkość wynoszenia, ilość nakropionej substancji czy temperatura subfazy na kształt izotermy, a w szczególności na ciśnienie załamania monowarstwy. Stwierdzono, że nie mają one istotnego wpływu na zachowanie kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA na granicy faz ciecz-gaz [108]. W następnej kolejności przeprowadzono badania stabilności monowarstw po kompresji do wybranych wartości ciśnienia powierzchniowego (Rys. 55). Badania takie pozwalają określić, jak szybko monowarstwa powierzchniowa relaksuje po kompresji do zadanego ciśnienia powierzchniowego, i dlatego po uzyskaniu odpowiedniego ciśnienia powierzchniowego rejestrowano ewentualne zmiany wartości tego ciśnienia w czasie 30 minut (Rys. 55). Widocznym jest, że dla każdego ciśnienia następuje relaksacja monowarstwy i finalny spadek ciśnienia powierzchniowego, przy czym największe zmiany występują dla 20 mN/m. Molekuły kompleksu relaksują, co powoduje rozpłynięcie się warstwy i spadek ciśnienia powierzchniowego. Podobny efekt, ale w mniejszej skali, można zaobserwować dla monowarstw skompresowanych do niższych wartości ciśnienia powierzchniowego (Rys. 55). Rys. 55 Badania stabilności monowarstwy, na podstawie [108]. Analiza izoterm π-A dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA wykazała, że załamanie monowarstwy następuje dla ciśnienia powierzchniowego równego 25±0,2 mN/m (Rys. 56). W związku z tym wynoszenie warstw przeprowadzono dla ciśnień powierzchniowych równych 5 mN/m, 10 mN/m, 15 mN/m oraz 20 mN/m. Rys. 56 Zależność ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni dostępnej na molekułę. Wstawka przedstawia zależność współczynnika ściśliwości od ciśnienia powierzchniowego. Metodą mikroskopii kąta Brewstera obserwowano zmiany stanów błony podczas kompresji monowarstwy (Rys. 57) i stwierdzono, że w przypadku cienkich warstw kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA nie są widoczne żadne zmiany w obrazie BAM w czasie kompresji (Rys. 57a), dopiero po załamaniu monowarstwy obraz wskazuje na obecność defektów w monowarstwie (Rys. 57b). (a) (b) Rys. 57 Obrazy z mikroskopu BAM w trakcie kompresji (a) i po załamaniu monowarstwy (b). Jak wspomniano w Rozdziale 1.2, monowarstwa może występować, w zależności od gęstości upakowania molekuł, w stanie gazowym, ciekłym lub stałym (Rys. 11), a określa się go w oparciu o wartość współczynnika ściśliwości 𝐶𝑠−1 (1). Najczęściej wyznacza się maksymalną wartość współczynnika ściśliwości, wskazując, jaki stan monowarstwa przybierała tuż przed załamaniem. Dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA maksymalna wartość tego współczynnika wynosi 31 mN/m, co oznacza, że przy maksymalnej kompresji warstwa pozostaje w stanie cieczy rozprężonej. Kolejnym etapem badań było sprawdzenie jak ciśnienie powierzchniowe oraz szybkość wynoszenia wpływają na topografię otrzymywanych cienkich warstw. Warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA wynoszono dla wybranych ciśnień powierzchniowych 5, 10, 15 oraz 20 mN/m oraz szybkości wynoszenia równej 1, 5 i 25 mm/min, a ich topografię zarejestrowano metodą mikroskopii sił atomowych (Rys. 58). Niezależnie od szybkości wynoszenia można zauważyć następujący trend: wraz ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego otrzymywane są coraz bardziej uporządkowane warstwy. Oznacza to, że pomimo braku różnic na obrazach BAM w trakcie kompresji i późniejszego transferu na powierzchnię miki, cząsteczki kompleksu tworzą pewne uporządkowanie, a grubość wszystkich warstw jest porównywalna i wynosi ok. 3 nm. Próbki wynoszone z prędkością 1 i 5 mm/min charakteryzują się formowaniem wydłużonych struktur dla ciśnień powierzchniowych powyżej 10 mN/m. Dobrze uformowane struktury są widoczne dla warstw wyniesionych przy ciśnieniu powierzchniowym 15 i 20 mN/m. Szybki transfer, v = 25 mm/min, skutkuje pojawieniem się uporządkowania dopiero przy ciśnieniu powierzchniowym 20 mN/m, natomiast przy ciśnieniach powierzchniowych 5, 10 i 15 mN/m tworzone warstwy są niejednorodne z dobrze widocznymi pojedynczymi granulami. Z kolei dla próbek wynoszonych przy największym badanym ciśnieniu powierzchniowym (20 mN/m), można zauważyć zmianę grubości struktur wraz ze zwiększającą się szybkością wynoszenia, co jest dobrze widoczne na profilach wysokościowych (Rys. 59). Średnią szerokość występujących struktur obliczono jako średnią wartość szerokości połówkowej maksimów na wykresach profili prostopadłych do tych struktur (wykorzystano maksima z 10 profili wysokościowych dla danej próbki). Średnią szerokość struktur wraz z odchyleniem standardowym przedstawia Tabela 24. 1 mm/min 5 mm/min 25 mm/min 5 mN/m 10 mN/m 15 mN/m 20 mN/m Rys. 58 Topografia cienkich warstw kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA wynoszonych przy różnych warunkach eksperymentalnych. Rozmiar wszystkich obrazów: 2,5x2,5 µm; skala wysokości 0-4 nm. Struktury pojawiają się równolegle do kierunku wyciągania próbki z subfazy wodnej. Tabela 24 Średnia szerokość struktur na warstwach wyniesionych przy π = 20 mN/m wraz z błędem. Rys. 59 Wybrane, pojedyncze profile wysokościowe dla obrazów AFM warstw kompleksów dsDNA(krótkie)-CTMA wyniesionych przy ciśnieniu powierzchniowym 20 mN/m. Szybkość wynoszenia [mm/min] Szerokość struktur [nm] 1 38,4(13,3) 5 37,6(12,3) 25 36,4(11,2) Zarejestrowane obrazy AFM poddano analizie FFT (szybka transformacja Fouriera - ang. Fast Fourier Transform), mającej na celu sprawdzenie, czy rzeczywiście, jak jest to widoczne na obrazach AFM, anizotropowe pokrycie powierzchni wzrasta ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego oraz spadkiem szybkości wynoszenia. Metoda FFT jest narzędziem numerycznym, które pozwala zidentyfikować periodyczność danych w sygnale charakteryzującym się dużym tłem. Dla każdego obrazu wybrano 20 przypadkowych, równomiernie rozmieszczonych na obrazie profili intensywności w kierunku prostopadłym oraz równoległym do kierunku wynoszenia. Przykładowe profile wysokościowe wybrane dla obrazów AFM zarejestrowanych dla warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA zaprezentowano na Rys. 60. (a) (b) Rys. 60 Przykłady profili wysokości warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA prostopadłego (a) i równoległego (b) do kierunku wynoszenia warstwy. Każdy z 20 profili wysokościowych danego obrazu AFM został poddany analizie FFT, a następnie obliczono ich średnią, w celu określenia periodu, który pojawia się najczęściej na całej powierzchni próbki (na całym obrazie). Procedurę wykonano dla profili prostopadłych i równoległych do kierunku wynoszenia próbki, dla wszystkich zarejestrowanych obrazów AFM, a jej wyniki przedstawiono na Rys. 61. Jeśli na wykresie zależności amplitudy od liczby falowej pojawia się maksimum, oznacza to periodyczność danych, w przeciwnym razie obserwuje się monotoniczny spadek amplitudy wraz ze wzrostem liczby falowej. Analiza profili prostopadłych do kierunku wynoszenia próbki potwierdziła wyniki inspekcji wizualnej, czyli pojawiania się coraz lepiej wykształconych, anizotropowych struktur powierzchniowych wraz ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego i ze spadkiem szybkości wynoszenia. Analiza profili równoległych do kierunku wyciągania próbki nie wykazała maksimów, lecz monotoniczny spadek amplitudy. Podsumowując, na podstawie przeprowadzonej analizy stwierdzono, że struktury periodyczne powstają w kierunku równoległym do kierunku wyciągania próbki. Dodatkowo zaobserwowano, że najlepszymi warunkami wynoszenia cienkich warstw kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA są ciśnienie powierzchniowe wynoszące 15 lub 20 mN/m oraz szybkość wynoszenia 5 mm/min. Przy zachowaniu tych parametrów otrzymuje się powtarzalne warstwy z uformowanymi strukturami. 1 mm/min 5 mm/min 25 mm/min 5 mN/m 10 mN/m 15 mN/m 20 mN/m Rys. 61 Wyniki analizy FFT dla obrazów AFM przedstawionych na Rys. 58. 5.4. Cienkie warstwy kompleksów z CTMA na bazie różnych rodzajów DNA Po określeniu optymalnych warunków otrzymywania cienkich warstw dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA przystąpiono do wynoszenia cienkich warstw kompleksów na bazie CTMA i trzech innych rodzajach DNA: - dsDNA(długie)-CTMA, - dsDNA(chrom)-CTMA, - pDNA-CTMA. Rys. 62 Zależność ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni dostępnej na molekułę dla kompleksów dsDNA(krótkie)–CTMA (a), dsDNA(chrom)–CTMA (b), dsDNA(długie)–CTMA (c) i pDNA–CTMA (d). Wstawki przedstawiają zależność współczynnika ściśliwości od ciśnienia powierzchniowego. W pierwszym etapie zarejestrowano izotermy wymienionych kompleksów (Rys. 62) wraz z obrazami z mikroskopu kąta Brewstera (Rys. 63), w celu potwierdzenia możliwości wynoszenia cienkich warstw w zaplanowanym przedziale ciśnień powierzchniowych. Na Rys. 62 i Rys. 63 zamieszczono także dla porównania wyniki dla dsDNA(krótkie)-CTMA (zsyntezowanego ponownie), a dla ułatwienia porównania położenia izoterm, na Rys. 62 zastosowano jednakowe skale poziome dla par kompleksów z podobnym rozkładem długości: dsDNA(krótkie)-CTMA i dsDNA(chrom)-CTMA oraz osobną dla dsDNA(długie)-CTMA i pDNA-CTMA. Dla nowego kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA kształt izotermy oraz charakterystyczne wielkości są takie same jak dla kompleksu zsyntezowanego wcześniej (porównanie Rys. 56 i Rys. 62). Obrazy BAM w trakcie kompresji monowarstwy nie ulegają zmianie (nie jest widoczna organizacja molekuł na powierzchni w czasie kompresji warstwy, Rys. 63a), dopiero po przekroczeniu ciśnienia kolapsu i załamaniu monowarstwy na obrazach BAM pojawiają się granulowate struktury (Rys. 63b), podobnie jak to zaprezentowano na Rys. 57 dla wcześniej zsyntezowanego kompleksu. Tym samym potwierdzono powtarzalność wyników dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) otrzymanych z syntez wykonanych w odstępach czasowych. Jak wcześniej pokazano, rozkład długości dsDNA(chrom) jest zbliżony do rozkładu długości dla dsDNA(krótkie) (Tabela 7). Kształt i przebieg izotermy π-A dla kompleksów z CTMA tych związków również jest do siebie zbliżony (Rys. 62 a,b). Jednak dla kompleksu dsDNA(chrom)-CTMA gwałtowny wzrost ciśnienia powierzchniowego zachodzi dla mniejszej powierzchni przypadającej na cząsteczkę (co może być związane z nieznacznie mniejszym rozkładem długości w tej próbce), a dodatkowo nie udało się uzyskać obrazu, który pokazywałby zachowanie monowarstwy na powierzchni subfazy wodnej (ani podczas kompresji, ani po załamaniu monowarstwy) dla tego kompleksu (Rys. 63c,d). Dla kompleksu dsDNA(długie)-CTMA kształt izotermy (Rys. 62c) jest podobny do omówionych powyżej kompleksów opartych na krótszych DNA liniowych. Warto jednak zwrócić uwagę, że cząsteczki tego kompleksu zajmują wyraźnie większą powierzchnię w przeliczeniu na jedną molekułę, co jest spowodowane znacznie większym rozkładem długości cząsteczek DNA w tej próbce. Obrazy BAM dla kompleksu dsDNA(długie)-CTMA, podobnie jak w przypadku kompleksów z dsDNA(krótkie), w czasie kompresji nie wykazują żadnych obrazów (Rys. 63e), z których można wnioskować na temat organizacji monowarstwy na powierzchni, natomiast widoczną warstwę otrzymuje się już po załamaniu monowarstwy (Rys. 63f). Zarejestrowano także izotermę π-A dla kompleksu pDNA-CTMA (Rys. 62d). Powierzchnia przypadająca na jedną cząsteczkę tego kompleksu podczas załamania monowarstwy jest dwukrotnie większa niż w przypadku kompleksu na bazie liniowego dsDNA(długie). Jest to spowodowane tym, że DNA plazmidowe może występować w kilku formach przestrzennych i zajmować więcej miejsca niż DNA liniowe. W przeciwieństwie do kompleksów syntezowanych z DNA liniowego, w przypadku kompleksu pDNA-CTMA w obrazach BAM obserwujemy zmianę obrazu powierzchni monowarstwy podczas kompresji (Rys. 63 g,h). (a) (c) (e) (g) (b) ____ 200 µm (d) ____ 200 µm (f) ____ 200 µm (h) ____ 200 µm Rys. 63 Obrazy BAM otrzymane podczas kompresji monowarstwy (górny rząd) i po przekroczeniu ciśnienia kolapsu (dolny rząd): dsDNA(krótkie)-CTMA (a-b), dsDNA(chrom)-CTMA (c-d), dsDNA(długie)-CTMA (e-f) i pDNA-CTMA (g-h). W Tabeli 25 zebrano wielkości charakterystyczne opisujące izotermy zarejestrowane dla poszczególnych kompleksów: ciśnienie załamania monowarstwy, współczynnik ściśliwości oraz przewidywany stan fizyczny monowarstwy. Badane kompleksy charakteryzują się podobnym ciśnieniem załamania monowarstwy (24 – 27 mN/m) oraz zbliżonymi współczynnikami ściśliwości (34 – 40 mN/m), które wskazują, że w każdym z badanych przypadków monowarstwa występuje w stanie cieczy rozprężonej, czyli cząsteczki kompleksu luźno rozkładają się po całej dostępnej powierzchni subfazy (Rys. 11). Podsumowując, potwierdzono możliwość wynoszenia cienkich warstw kompleksów DNA-CTMA metodą Langmuir-Blodgett przy następujących warunkach: ciśnienie powierzchniowe 15 mN/m oraz szybkość wynoszenia v = 5 mm/min. Tabela 25 Charakterystyczne wielkości izoterm zarejestrowanych dla warstw kompleksów DNA-CTMA na granicy faz ciecz-gaz. πcoll [mN/m] CS-1 [mN/m] Stan monowarstwy dsDNA(krótkie)-CTMA 25(0,2) 30(1) ciecz rozprężona dsDNA(długie)-CTMA 27(0,7) 38(1) ciecz rozprężona dsDNA(chrom)-CTMA 27(0,5) 40(1) ciecz rozprężona pDNA-CTMA 23(0,9) 42(1) ciecz rozprężona W toku dalszych badań wyniesiono cienkie warstwy wszystkich czterech kompleksów na dwóch rodzajach podłoży: mice i krzemie. Wygląd warstw wyniesionych na mice (Rys. 64) różni się w zależności od rodzaju DNA wykorzystanego do syntezy kompleksu, jednak ich cechą wspólną jest występowanie wydłużonych struktur powierzchniowych. Potwierdzono zatem istnienie wyróżnionego kierunku tworzenia się struktur, zgodnego z kierunkiem wynoszenia warstw. Dla kompleksów utworzonych z DNA liniowego charakterystyczne linie widoczne są na obrazach o wymiarach 2,5x2,5 µm. Przy ciśnieniu powierzchniowym równym 15 mN/m kompleks dsDNA(długie)-CTMA utworzył najszersze struktury. Kompleksy dsDNA(chrom)-CTMA oraz dsDNA(krótkie)-CTMA, które zgodnie z ich charakterystyką (Tabela 7) mają porównywalny rozkład długości, tworzą bardzo podobne wizualnie struktury, przy czym dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA są one węższe. Z kolei obraz powierzchni miki pokrytej kompleksem pDNA-CTMA (2,5x2,5 µm) charakteryzuje się bardzo dużym upakowaniem z pewną strukturą w prawym górnym rogu, podczas gdy na obrazie o wymiarach 10x10 µm (Rys. 65) widoczne są charakterystyczne wydłużone struktury (są one tak duże, że nie widać ich na wybranym obrazie 2,5x2,5 µm, Rys. 64). Dlatego powiększono wybrany inny fragment obrazu 2,5x2,5 µm i uwidoczniła się struktura podobna do obserwowanej dla DNA liniowych (prawy dolny obraz na Rys. 65). Wszystkie warstwy kompleksów na bazie DNA liniowych w mniejszym powiększeniu (10x10 µm) wykazują charakterystyczne wydłużone struktury, w szczególności kompleks dsDNA(długie)-CTMA (Rys. 64b). (a) SCR (b) SCR dsDNA(krótkie)-CTMA 32% 35% dsDNA(długie)-CTMA 44% 43% dsDNA(chrom)- CTMA 36% 49% pDNA-CTMA 58% 51% Rys. 64 Obrazy AFM dla cienkich warstw kompleksów wyniesionych na powierzchnię miki: obrazy o rozmiarze 2,5x2,5 µm (a), obrazy o rozmiarze 10x10 µm (b). SCR – obliczony stopień pokrycia powierzchni przez kompleks. Obraz zawierający mapa Opis wygenerowany automatycznie Rys. 65 Obrazy AFM kompleksu pDNA-CTMA na mice. Zdjęcie górne – rozmiar 10x10 µm, zdjęcia dolne – rozmiar 2,5x2,5 µm. Z kolei obrazy AFM kompleksów wyniesionych na krzemie (2,5x2,5 µm) wykazują delikatnie granulowatą powierzchnię o dość wysokim stopniu pokrycia, co potwierdza wartość stopnia pokrycia powierzchni (Rys. 66). W przypadku DNA liniowych nie zaobserwowano żadnego uporządkowania, a dla kompleksu pDNA-CTMA występuje pewne charakterystyczne pokrycie całej powierzchni. Warstwa w tym przypadku jest mniej jednorodna i stopień pokrycia powierzchni wynosi 55%. Dodatkowo, zaobserwowano znacznie mniejszą grubość warstw otrzymywanych na krzemie w porównaniu z warstwami wyniesionymi na mice, tj.: 1 – 1,8 nm dla krzemu i 2 – 4 nm na powierzchni miki. dsDNA(krótkie) SCR dsDNA(długie)-CTMA SCR 59% 68% dsDNA(chrom)- CTMA SCR pDNA-CTMA SCR 78% 55% Rys. 66 Obrazy AFM dla cienkich warstw kompleksów wyniesionych na powierzchni krzemu, obrazy o rozmiarze 2,5x2,5 µm. SCR – stopień pokrycia powierzchni przez kompleks. mika krzem dsDNA(krótkie)-CTMA dsDNA(długie)-CTMA dsDNA(chrom)-CTMA pDNA-CTMA Rys. 67 Reprezentatywne przykłady profili wysokościowych obrazów AFM cienkich warstw przedstawionych na Rys. 64 i Rys. 66. Przykładowe pojedyncze, profile wysokościowe obrazów AFM cienkich warstw kompleksów wyniesionych na mice i krzemie, wykorzystane do przeprowadzenia analizy FFT, przedstawiono na Rys. 67. Widocznym jest, że dla każdego kompleksu wysokość profilu (grubość warstwy) jest mniejsza na krzemie niż na mice. Na profilach warstw wyniesionych na krzemie widać dość równomierne pokrycie, a na mice widoczna jest wyraźna zmiana wysokości profilu w kierunku prostopadłym do struktur. Średnią szerokość występujących struktur obliczono ponownie jako średnią wartość szerokości połówkowej maksimów na wykresach profili prostopadłych do struktur (wykorzystano maksima z 10 profili wysokościowych dla danej próbki). Zaobserwowano, że szerokości maksimów dla kompleksów dsDNA(krótkie)-CTMA i dsDNA(chrom)-CTMA są porównywalne i wynoszą odpowiednio 21(9) nm oraz 26(10) nm. Dla kompleksu dsDNA(długie)-CTMA średnia szerokość struktur wynosi 33(12) nm, przy czym w tych profilach częściej pojawiały się struktury o szerokości ok. 50 – 70 nm. Z kolei na podstawie profili wysokościowych warstw kompleksu pDNA-CTMA nie można potwierdzić występowania wydłużonych struktur. Wyniki analizy FFT przeprowadzonej dla obrazów o wymiarach 2,5x2,5 µm warstw kompleksów wyniesionych na mice i krzemie są przedstawione na Rys. 68. Nie są widoczne żadne wyraźne maksima amplitudy dla wszystkich kompleksów wynoszonych na krzem, co potwierdza brak periodyczności na obrazach AFM (Rys. 66). W przypadku obrazów dla kompleksów wyniesionych na powierzchnię miki wykresy FFT różnią się między sobą w zależności od kierunku ekstrakcji profili. Dla profili równoległych do kierunku wyciągania próbki obserwuje się monotoniczny spadek amplitudy, czyli brak periodyczności. Natomiast dla profili prostopadłych do kierunku wynoszenia warstwy wykresy FFT przedstawiają wyraźne maksima, co potwierdza występowanie periodycznych struktur widocznych na obrazach AFM. Z położenia tych maksimów określono odległości pomiędzy poszczególnymi strukturami, które dla kompleksów zbudowanych z krótszych łańcuchów DNA (dsDNA(krótkie) i dsDNA(chrom)) wynoszą ok. 0,1 µm, a dla dsDNA(długie) ok. 0,25 µm. Szczególnym przypadkiem jest obraz warstwy kompleksu pDNA-CTMA wyniesiony na mice (2,5x2,5 µm), którego wykres FFT wykazuje w obu kierunkach monotoniczny spadek, oznaczający brak periodyczności. Obszerna analiza wyniesionych warstw kompleksu pDNA-CTMA jest przedstawiona w rozdziale 5.5.2. mika krzem dsDNA(krótkie) dsDNA(długie) dsDNA(chrom) pDNA Rys. 68 Wyniki analizy FFT wykonanej na profilach wysokoścowych obrazów AFM, dla warstw wyniesionych na mice i krzemie. Amplitudy znormalizowane, analiza obrazów o rozmiarze 2,5x2,5 µm z Rys. 64 oraz Rys. 66. 5.5. Cienkie warstwy kompleksów DNA z różnymi surfaktantami W kolejnym kroku postanowiono sprawdzić wpływ struktury surfaktantu na właściwości wynoszonych cienkich warstw kompleksów DNA-surfaktant kationowy. W tym celu wybrano dwa rodzaje DNA: pDNA oraz dsDNA(krótkie) oraz dwa surfaktanty kationowe BAC i HDP. Przy wyborze surfaktantów kierowano się ich budową chemiczną. Wszystkie trzy wybrane surfaktanty (CTMA, BAC i HDP) mają tę samą długość łańcucha (16 atomów węgla), a różnią się grupami funkcyjnymi. Natomiast o wyborze rodzaju DNA zadecydowały wyniki dotychczasowych badań - wybrano dwa rodzaje DNA, które uznano za najciekawsze i różne od siebie. Wyniesiono zestawy warstw kompleksów dsDNA(krótkie) i pDNA dla obu surfaktantów BAC i HDP. Podobnie jak dla kompleksów z CTMA, warstwy obrazowano metodą AFM, a analizę obrazów przeprowadzono metodą FFT. Obliczono także zmianę swobodną energię powierzchniową utworzonych warstw. Zarejestrowano izotermy wraz z obrazami BAM oraz obliczono współczynnik ściśliwości otrzymanych monowarstw i określono charakterystyczne wielkości monowarstw Langmuira. 5.5.1. Kompleksy na bazie dsDNA(krótkie) z różnymi surfaktantami Badania na wadze Langmuira przeprowadzono w celu określenia zachowania się monowarstwy kompleksów tego samego rodzaju DNA (dsDNA(krótkie)) z trzema różnymi surfaktantami, a zarejestrowane izotermy π-A przedstawiono na Rys. 69. Analiza wyników wskazuje, na brak istotnego wpływu struktury surfaktantu na kształt i położenie izoterm kompleksów dsDNA(krótkie)-surfaktant kationowy. Wartości ciśnienia kolapsu, współczynnika ściśliwości oraz stanu monowarstwy dla wszystkich trzech kompleksów zestawiono w Tabeli 26. Dla kompleksu dsDNA(krótkie)-BAC zarejestrowano największą wartość ciśnienia kolapsu spośród wszystkich badanych DNA liniowych, podczas gdy dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA był on najmniejszy. Wszystkie kompleksy załamały się będąc w stanie cieczy rozprężonej. Podobnie jak w przypadku kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA, oba nowe kompleksy wyniesiono na podłoże stałe (mikę) dla ciśnień powierzchniowych równych 5 mN/m, 10 mN/m, 15 mN/m i 20 mN/m i zobrazowano metodą mikroskopii sił atomowych (Rys. 70), a następnie przeprowadzono analizę FFT (Rys. 71). Na obu rysunkach wyniki dla kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA są dodane dla bezpośredniego porównania. Rys. 69 Zależność ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni dostępnej na molekułę dla kompleksów: (a) dsDNA(krótkie)-CTMA, (b) dsDNA(krótkie)-BAC oraz (c) dsDNA(krótkie)-HDP. Wstawka przedstawia zależność współczynnika ściśliwości od ciśnienia powierzchniowego. Tabela 26 Charakterystyczne wielkości izoterm zarejestrowanych dla warstw kompleksów dsDNA(krótkie)-surfaktant kationowy. πcoll [mN/m] Cs-1 [mN/m] Stan dsDNA(krótkie)-CTMA 25(0,2) 30(1) ciecz rozprężona dsDNA(krótkie)-BAC 29(0,5) 36(2) ciecz rozprężona dsDNA(krótkie)-HDP 26(0,5) 35(1) ciecz rozprężona dsDNA(krótkie) dsDNA(krótkie)-HDP dsDNA(krótkie) 5 mN/m 10 mN/m 15 mN/m 20 mN/m Rys. 70 Obrazy AFM warstw wyniesionych dla kompleksów dsDNA(krótkie)-BAC, dsDNA(krótkie)-HDP i dsDNA(krótkie)-CTMA na powierzchnię miki dla wybranych ciśnień powierzchniowych. Rozmiar obrazów 2,5x2,5 µm. dsDNA(krótkie) dsDNA(krótkie)-HDP dsDNA(krótkie) 5 mN/m 10 mN/m 15 mN/m 20 mN/m Rys. 71 Wyniki analizy FFT wykonanej na profilach wysokoścowych obrazów AFM warstw wyniesionych na mice dla kompleksów dsDNA(krótkie)-BAC, dsDNA(krótkie)-HDP i dsDNA(krótkie)-CTMA dla wybranych ciśnień powierzchniowych. Amplitudy znormalizowane, analiza obrazów o rozmiarze 2,5x2,5 µm z Rys. 70. W przypadku warstw dsDNA(krótkie)-BAC zaobserwowano spontaniczne tworzenie się wydłużonych struktur dla próbek wyniesionych dla ciśnień powierzchniowych 10 i 20 mN/m, natomiast ich brak dla ciśnień powierzchniowych 5 i 15 mN/m. Obecność struktur (dla ciśnień 10 i 20 mN/m) i pewną periodyczność potwierdziła analiza FFT w kierunku prostopadłym do kierunku wynoszenia próbek. W przypadku kompleksu dsDNA(krótkie)-HDP stwierdzono sukcesywne tworzenie się wydłużonych struktur kompleksów wraz ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego, podobnie jak w przypadku kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA. Nie obserwuje się zaburzenia tego trendu dla ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m (jak dla dsDNA(krótkie)-BAC), a analiza FFT potwierdza obecność obserwowanych struktur (Rys. 71). Analizując profile wysokościowe kompleksów dla ciśnienia powierzchniowego 20 mN/m, określono średnią szerokość struktur (Tabela 27) i stwierdzono, że kompleks dsDNA(krótkie)-CTMA tworzy najszersze struktury (ok. 37 nm), podczas gdy kompleksy z pozostałymi dwoma surfaktantami (BAC i HDP) charakteryzują się porównywalną szerokością struktur (ok. 25 nm). Tabela 27 Średnia szerokość struktur powierzchniowych dla ciśnienia powierzchniowego 20 mN/m. Szerokość struktur dsDNA(krótkie)-CTMA 38(12) dsDNA(krótkie)-BAC 23(10) dsDNA(krótkie)-HDP 26(10) W toku dalszych badań zbadano właściwości fizyczne powierzchni warstwy kompleksów. W tym celu wykonano pomiary kąta zwilżania dla warstw kompleksów wyniesionych przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m dla trzech cieczy pomiarowych (dijodometanu, wody oraz gliceryny) i porównano z wartościami otrzymanymi dla substratu, na który wynoszono warstwy (mika). Zaobserwowano, że powierzchnia miki pokryta kompleksami zmienia charakter - następuje wzrost kąta zwilżania, szczególnie w przypadku wody (Tabela 28). Tabela 28 Kąty zwilżania dla kompleksów dsDNA(krótkie)-surfaktant kationowy oraz miki. Dijodometan [o] Woda [o] Gliceryna [o] dsDNA(krótkie)-CTMA 53,2(2,3) 66,0(3,6) 71,3(5,3) dsDNA(krótkie)-BAC 54,8(0,9) 72,6(1,8) 70,9(2,4) dsDNA(krótkie)-HDP 54,3(1,2) 62,0(2,3) 68,8(5,9) mika 33,6(3,0) 9,5(1,6) 29,8(8,5) Na podstawie wyznaczonych kątów zwilżania (Tabela 28) i korzystając ze wzorów przedstawionych w Tabeli 22, obliczono swobodną energię powierzchniową warstw kompleksów metodami Owensa-Wendta, kwasowo-zasadową oraz metodą Wu (Tabela 29). Swobodna energia powierzchniowa cienkiej warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-surfaktant kationowy dla każdego zsyntezowanego kompleksu jest mniejsza niż dla czystej miki. Spośród przebadanych warstw, najmniejszą swobodną energią powierzchniową charakteryzuje się warstwa kompleksu DNA(krótkie)-BAC, a największą kompleks DNA(krótkie)-HDP. Jednak różnice w wartości swobodnej energii powierzchniowej pomiędzy badanymi surfaktantami są niewielkie, co wskazuje że na wartość swobodnej energii powierzchniowej większy wpływ ma łańcuch DNA niż dołączone do niego cząsteczki surfaktantu. Tabela 29 Swobodna energia powierzchniowa dla warstw kompleksu DNA(krótkie)-surfaktant kationowy wyniesionego na mice przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m. Metoda Czysta ds ds ds średnia OW 67,7(4,1) 39,3(3,6) 34,1(1,4) 38,5(2,2) kwasowo- zasadowa 56,8(6,3) 36,9(3,1) 31,8(1,1) 38,5(1,8) Wu 70,5(4,0) 44,1(4,9) 42,4(2,0) 45,1(5,4) 5.5.2. Kompleksy na bazie pDNA z różnymi surfaktantami Podobnie jak kompleksy na bazie dsDNA(krótkie) z surfaktantami BAC i HDP, przebadano kompleksy z tymi surfaktantami w oparciu o DNA plazmidowe (pDNA). Zarejestrowane izotermy π-A dla kompleksów pDNA-BAC i pDNA-HDP wraz z wykresem współczynnika ściśliwości przedstawiono na Rys. 72. Kształt wszystkich zaprezentowanych izoterm jest zbliżony i podobny do kompleksów syntezowanych na DNA liniowym (Rys. 69). Dla kompleksu pDNA-CTMA zaobserwowano podnoszenie się izotermy (zwiększanie ciśnienia powierzchniowego) dla powierzchni ok. 600 kÅ2/molekułę, tj. dla powierzchni mniejszej niż w pozostałych rozpatrywanych przypadkach kompleksów - pDNA-BAC i pDNA-HDP (ok. 800 kÅ2/molekułę), natomiast ciśnienia załamania monowarstw są zbliżone (Tabela 30). Wyznaczone współczynniki ściśliwości wskazują, że monowarstwy dla kompleksów pDNA-CTMA i pDNA-HDP znajdują się w stanie cieczy rozprężonej a pDNA-BAC w stanie pośrednim między cieczą rozprężoną a cieczą skondensowaną. Wszystkie współczynniki ściśliwości dla kompleksów na bazie pDNA są wyraźnie większe od analogicznych współczynników dla kompleksów na bazie DNA liniowego. Różnice te prawdopodobnie wynikają z trzech konformacji przestrzennych, w których występuje DNA plazmidowe. Tabela 30 Charakterystyczne wielkości izoterm zarejestrowanych dla warstw kompleksów pDNA. πcoll [mN/m] Cs-1[mN/m] Stan monowarstwy pDNA-CTMA 22(0,4) 42(1) ciecz rozprężona pDNA-BAC 25(0,7) 52(1) stan ciekły pośredni pDNA-HDP 23(0,7) 48(2) ciecz rozprężona Rys. 72 Zależność ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni dostępnej na molekułę dla kompleksów (a) pDNA-CTMA, (b) pDNA-BAC oraz (c) pDNA–HDP. Wstawka przedstawia zależność współczynnika ściśliwości od ciśnienia powierzchniowego. Cienkie warstwy kompleksów pDNA wyniesiono w całym zakresie ciśnień pomiarowych przy prędkości wynoszenia v = 5 mm/min i zobrazowano metodą AFM dla dwóch różnych powiększeń. Zarówno na obrazach 10x10 µm (Rys. 73) jak i 2,5x2,5 µm (Rys. 76) dla wszystkich kompleksów z DNA plazmidowym pojawiają się struktury w kierunku równoległym do kierunku wynoszenia próbki. Dla kompleksów pDNA-BAC oraz pDNA-CTMA struktury pojawiają się od najniższego ciśnienia powierzchniowego 5 mN/m, natomiast dla pDNA-HDP dla tego ciśnienia powierzchniowego nie udało się uzyskać klarownego obrazu (warstwa była dość jednorodna, bez wyraźnych charakterystycznych wydłużonych struktur, chociaż jak pokazano niżej, analiza FFT oraz analiza profili wysokościowych je zidentyfikowała). Na obrazach 10x10 µm, dla najmniejszych ciśnień powierzchniowych, obserwuje się spontaniczne tworzenie wydłużonych struktur, podobnych do tych obserwowanych na dla kompleksów na bazie DNA liniowego (Rys. 64). Struktury powstałe dla kompleksów na bazie pDNA są jednak dość szerokie, ich średnia szerokość określona na podstawie profili wysokościowych (Rys. 75) wynosi 115(44) nm dla pDNA-CTMA, 158(66) nm dla pDNA-HDP i 172(72) nm dla pDNA-BAC, przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m. Dla porównania w przypadku kompleksów dsDNA(długie)-CTMA szerokość ta wyniosła 33(12) nm, przy tym samym ciśnieniu powierzchniowym. Średnie szerokości struktur dla poszczególnych ciśnień powierzchniowych zebrano w Tabeli 31. Dla warstw kompleksu pDNA-BAC obserwuje się poszerzenie otrzymywanych struktur wraz ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego, co jest dobrze widoczne także na wykresach profili wysokościowych obrazów 10x10 µm (Rys. 75), a analiza obrazów przy większym powiększeniu (obrazy 2,5x2,5 µm) to potwierdza. Z kolei warstwy kompleksów pDNA-CTMA oraz pDNA-HDP przy ciśnieniu 20 mN/m wydają się być znacznie mocniej ściśnięte, przez co struktury wydają się ciaśniej upakowane. Potwierdza to także parametr SCR, który dla tych próbek jest najwyższy. Mimo bardziej ściśniętej warstwy, szerokość obserwowanych struktur nie jest znacząco mniejsza niż dla warstw otrzymanych przy niższym ciśnieniu powierzchniowym. Tabela 31 Średnia szerokość struktur utworzonych przez kompleksy pDNA-surfaktant kationowy. Ciśnienie pDNA pDNA pDNA 5 mN/m 120(49) 134(57) 150(63) 10 mN/m 114(50) 178(76) 160(68) 15 mN/m 115(44) 182(85) 162(65) 20 mN/m 122(47) 195(71) 159(70) pDNA-BAC pDNA-HDP pDNA-CTMA 5 mN/m Obraz zawierający tekst, drzewo Opis wygenerowany automatycznie 10 mN/m 15 mN/m Obraz zawierający tekst, drzewo Opis wygenerowany automatycznie 20 mN/m Obraz zawierający tekst, drzewo Opis wygenerowany automatycznie Rys. 73 Obrazy AFM dla cienkich warstw kompleksów DNA plazmidowego wyniesionych na powierzchnię miki dla ciśnień powierzchniowych 5 mN/m – 20 mN/m. Rozmiar obrazów: 10x10 µm. pDNA-BAC pDNA-HDP pDNA-CTMA 5 mN/m 10 mN/m 15 mN/m 20 mN/m Rys. 74 Wyniki analizy FFT wykonanej na profilach wysokoścowych obrazów AFM, dla warstw wyniesionych na mice. Amplitudy znormalizowane, analiza obrazów o rozmiarze 10x10 µm z Rys. 73. Dla wszystkich obrazów AFM prezentowanych na Rys. 73 i Rys. 76 wykonano komplementarną analizę FFT (odpowiednio Rys. 74 i Rys. 77) i potwierdzono występowanie periodycznych struktur dla profili prostopadłych do kierunku wynoszenia próbki, a także ich brak dla profili w kierunku równoległym. Analiza FFT obrazów AFM w kierunku równoległym do kierunku wyciągania próbki dla obu rozmiarów obrazów daje takie same rezultaty – monotoniczny spadek wartości oznaczający brak periodyczności. Na wykresach profili prostopadłych do kierunku wyciągania próbki obserwowane jest ostre maksimum w analizie obrazów 2,5x2,5 µm oraz szerokie maksimum dla obrazów 10x10 µm. Rys. 75 Reprezentatywne przykłady profili wysokościowych obrazów AFM cienkich warstw pDNA-BAC. pDNA-BAC pDNA-HDP pDNA-CTMA 5 mN/m 10 mN/m 15 mN/m 20 mN/m Rys. 76 Obrazy AFM dla cienkich warstw kompleksówna bazie pDNA wyniesionych na powierzchnię miki, obrazy o rozmiarze 2,5x2,5 µm. pDNA-BAC pDNA-HDP pDNA-CTMA 5 mN/m 10 mN/m 15 mN/m 20 mN/m Rys. 77 Wyniki analizy FFT wykonanej na profilach wysokościowych obrazów AFM, dla warstw wyniesionych na mice. Amplitudy znormalizowane, analiza obrazów o rozmiarze 2,5x2,5 µm z Rys 78. Główną różnicą obserwowaną pomiędzy warstwami kompleksów na bazie pDNA (Rys. 73, Rys. 76) a warstwami kompleksów na bazie DNA liniowego (Rys. 64, Rys. 70) jest grubość struktur oraz minimalne ciśnienia powierzchniowe, przy których formowały się wydłużone struktury. Dla kompleksów na bazie pDNA w każdym przypadku obserwowano struktury już od najniższego ciśnienia powierzchniowego 5 mN/m. Dla kompleksu pDNA-BAC obserwowano wyraźny wzrost szerokości struktur wraz ze wzrostem ciśnienia powierzchniowego. Dla pozostałych badanych warstw szerokość otrzymanych kształtów była zbliżona (patrz Rys. 75 i Tabela 31). Analiza FFT potwierdziła brak periodyczności w kierunku równoległym do kierunku wynoszenia próbki, natomiast prostopadle do tego kierunku wykazała występowanie maksimów funkcji pozwalające określić odległości pomiędzy strukturami. W przypadku kompleksu pDNA-BAC, dla ciśnienia powierzchniowego 20 mN/m, obserwuje się bardzo dobrze odseparowane struktury (odległość między nimi określono na ok. 0,78 µm), a bardziej upakowane struktury dla kompleksów pDNA-CTMA i pDNA-HDP (odległość odpowiednio ok. 0,4 µm i 0,6 µm). Odległości te dobrze korelują z analizą wizualną obrazów AFM – warstwa pDNA-CTMA dla ciśnienia powierzchniowego 20 mN/m wydaje się być najbardziej ściśnięta. PODSUMOWANIE I WNIOSKI Celem niniejszej pracy było sprawdzenie wpływu rodzaju i długości DNA oraz struktury surfaktantu kationowego na właściwości fizyczne zsyntezowanych kompleksów w formie próbek objętościowych oraz na topografię i właściwości cienkich warstw kompleksu wyniesionych metodą Langmuir-Blodgett na powierzchnię stałą. Obecnie uważa się, że takie kompleksy można zastosować w różnych dziedzinach, od elektroniki organicznej (matryce dla barwników organicznych, warstwy blokujące elektrony w diodach BioLED lub ogniwa fotowoltaiczne) po medycynę (systemy dostarczania leków). Z uwagi na mnogość potencjalnych zastosowań tak ważne są badania właściwości kompleksów DNA-surfaktant kationowy zarówno jako materiałów objętościowych jak i w postaci cienkich warstw. Należy jeszcze zaznaczyć, że w dostępnych publikacjach często brakuje informacji o długości wykorzystanego DNA, co praktycznie uniemożliwia porównywanie właściwości kompleksów DNA z surfaktantami uzyskiwanymi przez różne grupy badawcze. W ramach niniejszej pracy przygotowano osiem kompleksów DNA-surfaktant kationowy, opartych o cztery rodzaje DNA (trzy DNA liniowe - dsDNA(krótkie), dsDNA(długie) i dsDNA(chrom), jedno DNA plazmidowe - pDNA) oraz trzy surfaktanty kationowe (chlorek cetyltrimetyloamonowy, CTMA; chlorek benzyldimetylo-heksaamonowy, BAC; chlorek heksadecylopirydynowy, HDP). Wybrane DNA liniowe różnią się rozkładem długości łańcuchów DNA występujących w próbce (Tabela 32). Z kolei surfaktanty charakteryzują się tą samą długością łańcucha węglowego (16 atomów węgla) a różnią się jedynie grupą funkcyjną. Jednym z bardzo ważnych aspektów pracy było wybranie odpowiedniego materiału DNA. Ponieważ wśród zadań badawczych było zbadanie wpływu długości DNA na właściwości kompleksów, przetestowano kilka metod pozwalających na redukcję rozkładu długości DNA, wyłoniono najbardziej efektywną metodę, którą można zastosować w skali preparatywnej oraz przeprowadzono syntezę kompleksów: • trzy kompleksy na bazie dsDNA(krótkie): dsDNA(krótkie)–CTMA, dsDNA(krótkie)–BAC, dsDNA(krótkie)–HDP; • jeden kompleks na bazie dsDNA(długie): dsDNA(długie)–CTMA; • jeden kompleks na bazie dsDNA(chrom): dsDNA(chrom)–CTMA; • trzy kompleksy na bazie pDNA: pDNA–CTMA, pDNA–BAC, pDNA–HDP. Najważniejsze parametry opisujące właściwości zsyntezowanych kompleksów DNA-surfaktant kationowy (w formie zarówno objętościowej jak i cienkich warstw) zostały zebrane w Tabeli 32. Tabela 32 Parametry charakterystyczne badanych kompleksów, surfaktantów i substratów wraz z rozkładem długości DNA w próbkach. P C Spektroskopia dielektryczna Dyfrakcja rentgenowska Badania monowarstwy na granicy faz Średnia szerokość struktur Zmiana zwilżalności powierzchni ∆𝒁′[𝑮𝛀] fR [Hz] 𝜶 σ [pS/cm] a [nm] b [nm] d1 [nm] πcoll [mN/m] 𝑪𝒔−𝟏 [mN/m] stan monowar-stwy A2 [nm] B3 [nm] 𝜽4[°] SEP5 [mN/m] dsDNA(długie)–CTMA 1,223(7) 6,35(7) 0,22(02) 27(2) - - - 27(0,7) 38(1) ciecz rozprężona 33(12) - - - dsDNA(chrom)–CTMA 0,002(1) 3322(216) 0,28(2) 8747(211) - - - 27(0,7) 40(1) ciecz rozprężona 26(10) - - - dsDNA(krótkie)–CTMA 0,321(2) 5,84(11) 0,369(3) 9330(463) 4,83(1) 8,37(2) 6,33 25(0,2) 30(1) ciecz rozprężona 21(9) 38(12) 66,0(3,6) 40,1(3,9) dsDNA(krótkie)–BAC 1,743(6) 5,34(5) 0,195(3) 1900(870) 4,51(3) 7,05(5) 7,59 29(0,5) 36(2) ciecz rozprężona - 23(10) 72,6(1,8) 36,1(1,5) dsDNA(krótkie) –HDP 1,173(4) 8,71(8) 0,286(2) 10870(1673) 4,00(5) 7,57(6) 7,09 26(0,5) 35(1) ciecz rozprężona - 26(10) 62,0(2,3) 40,7(3,1) pDNA–CTMA 2,82(2) 4,09(4) 0,217(3) 14,6(4,8) - - - 22(0,4) 42(1) ciecz rozprężona 115(44) 122 (47) - - pDNA–BAC 15,2(1) 1,43(1) 0,097(2) 2,55(2) - - - 25(0,7) 52(1) stan ciekły pośredni 182(85) 195(71) - - pDNA–HDP 0,0461(1) 92,1(5) 0,316(2) 1020(334) - - - 23(0,7) 48(2) ciecz rozprężona 159(70) 159(70) - - BAC - - - 8,98(4) Długość DNA mika 9,5(1,6) 64,8(4,8) CTMA - - - 3,55(2) dsDNA(krótkie) dsDNA(chrom) dsDNA(długie) pDNA krzem 41,2(2,5) 55,7(4,4) HDP - - - 3,37(2) 5 – 240 pz 6 – 190 pz 25 – 10 000 pz 4707 pz 1 d – obliczona szerokość kompleksu, 2A – szerokość struktur dla ciśnienia powierzchniowego 15 mN/m, 3B – szerokość struktur dla ciśnienia powierzchniowego 20 mN/m, 4𝜃 – kąt zwilżania, 5SEP – swobodna energia powierzchniowa Kompleksy jako próbki objętościowe badano metodami spektroskopii w podczerwieni, dyfrakcji rentgenowskiej (XRD i SAXS) oraz spektroskopii dielektrycznej. Badania metodą FTIR m.in. potwierdziły utworzenie kompleksów, a dyfrakcja rentgenowska pozwoliła na określenie parametrów komórki elementarnej dla wybranych kompleksów. Z kolei spektroskopia dielektryczna pozwoliła na określenie ich właściwości elektrycznych oraz na identyfikację procesów relaksacyjnych pojawiających się w zsyntezowanych kompleksach. Przeprowadzone badania próbek objętościowych kompleksów DNA-surfaktant kationowy pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków: 1. Wszystkie badane rodzaje DNA wiążą się efektywnie poprzez oddziaływane elektrostatyczne z surfaktantami kationowymi (CTMA, BAC, HDP), tworząc kompleks, co potwierdzają badania FTIR oraz XRD, wskazując na różnice pomiędzy czystymi składnikami reakcji i jej produktem. Po kompleksacji następuje zmiana dominującej formy DNA liniowego z B-DNA na A-DNA. 2. Najmniejszą szerokość kompleksu na bazie dsDNA(krótkie) wykazuje kompleks z CTMA - dsDNA(krótkie)-CTMA, a największą dsDNA(krótkie)-BAC, przy założeniu całkowitego rozciągnięcia surfaktantu. Struktura dsDNA(krótkie)-CTMA jest heksagonalna, podczas gdy kompleksy dsDNA(krótkie) z pozostałymi surfaktantami wykazują zniekształconą strukturę heksagonalną. Parametry komórki elementarnej dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) są zbliżone (Tabela 32). 3. Badania dyfrakcji rentgenowskiej są użytecznym narzędziem w określaniu czystości otrzymanych kompleksów - na rentgenogramie kompleksu można zidentyfikować maksima pochodzące od niezwiązanych frakcji surfaktantu. 4. Właściwości elektryczne kompleksów DNA można modyfikować poprzez dobór odpowiedniego surfaktantu oraz rozkładu długości łańcuchów DNA. Im dłuższe łańcuchy DNA, tym mniejsza przewodność właściwa: największą przewodność właściwą wykazuje kompleks dsDNA(krótkie)-CTMA, a znacznie mniejszą dsDNA(długie)-CTMA i pDNA-CTMA. Z kolei kompleksy z surfaktantem BAC wykazują najmniejszą przewodność właściwą, podczas gdy kompleksy z HDP największą (Tabela 32). 5. Procesy relaksacyjne zarejestrowane w kompleksach DNA-surfaktant kationowy związane są z oscylacją łańcuchów surfaktantów, a wiązanie pomiędzy DNA i surfaktantem prawdopodobnie przesuwa częstotliwości relaksacji do niższych wartości (w porównaniu do relaksacji rejestrowanych w roztworach DNA). Do przygotowania cienkich warstw kompleksów wybrano, spośród czterech przetestowanych, metodę Langmuir-Blodgett. Opisano zachowanie się monowarstw na granicy faz ciecz-gaz, zoptymalizowano metodę wynoszenia warstw na podłoże stałe oraz zobrazowano wyniesione warstwy metodą mikroskopii sił atomowych i przeprowadzono ich analizę metodą FFT. Na podstawie wyników badań cienkich warstw kompleksów wykazano, że w zależności od warunków wynoszenia, rodzaju DNA, surfaktantu i podłoża, metoda LB pozwala na uzyskanie monowarstw o różnych strukturach. Przeprowadzone badania cienkich warstw kompleksów DNA-surfaktant kationowy pozwoliły na sformułowanie następujących wniosków: 1. Kompleksy DNA tworzą monowarstwę na granicy faz ciecz-gaz, która podczas przenoszenia na powierzchnię miki spontanicznie ulega samoorganizacji przy określonych warunkach brzegowych (ciśnienie 10-20 mN/m, prędkość wynoszenia 5 mm/min). Analiza FFT obrazów AFM potwierdza występowanie wydłużonych struktur wzdłuż kierunku wynoszenia warstw. 2. Na wygląd struktur powierzchniowych główny wpływ ma rodzaj DNA (liniowe lub plazmidowe), a znacznie słabszy - rozkład długości DNA czy struktura surfaktantu. 3. Rodzaj DNA nie wpływa znacząco na zmianę kształtu izotermy, w tym ciśnienia kolapsu monowarstwy, natomiast wraz ze wzrostem długości DNA wzrasta powierzchnia przypadająca na jedną molekułę (zmiana położenia izotermy). 4. Grubość warstw kompleksów wynoszonych na powierzchnię miki jest porównywalna dla wszystkich badanych kompleksów i wynosi ok. 3,5 nm. Z kolei na powierzchni krzemu grubość utworzonych warstw jest mniejsza (ok. 2 nm) i nie zaobserwowano samoorganizacji struktur powierzchniowych. 5. Energia powierzchniowa cienkiej warstwy kompleksu DNA-surfaktant nie zależy od struktury surfaktantu tworzącego kompleks. Podsumowując, w oparciu o przeprowadzone badania, udowodniono tezę, że właściwości kompleksu DNA-surfaktant kationowy zależą zarówno od rodzaju i długości DNA, jak i struktury surfaktantu w przypadku próbek objętościowych. Natomiast w przypadku cienkich warstw, stwierdzono jedynie wpływ rodzaju DNA (plazmidowe lub liniowe), a nie jego długości. Podobnie, nie zaobserwowano wpływu struktury surfaktantu na właściwości cienkich warstw kompleksów DNA-surfaktant kationowy. Nie można jednak wykluczyć wpływu rodzaju DNA, jego długości oraz struktury surfaktantu na właściwości elektryczne cienkiej warstwy kompleksu DNA-surfaktant kationowy. Niestety, na obecnym etapie badań grubość wytwarzanych warstw była zbyt mała do przeprowadzenia badań związanych np. z przewodnictwem warstwy, zatem niezbędna jest dalsza optymalizacja metody wytwarzania warstw DNA-surfaktant kationowy i dalsze badanie ich właściwości. Bibliografia [1] N. Kobayashi. BiOLED with DNA/Conducting Polymer Complex as Active Layer. Nonlinear Optics, Quantum Optics: Concepts in Modern Optics 42 (2011). [2] S. Gajria, T. Neumann, M. Tirrell. Self-assembly and applications of nucleic acid solid-state films. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology 3.5 (2011): 479-500. [3] P. Smith, R. Lynden-Bell W. Smith Surfactant structure around DNA in aqueous solution. Physical Chemistry Chemical Physics 2.6 (2000): 1305-1310. [4] R. Dias B. Lindman. DNA Interactions with Polymers and Surfactants. Hoboken, John Wiley & Sons, 2008. [5] Y. Kawabe, L. Wang, S. Horinouchi, N. Ogata, Amplified Spontaneous Emission from Fluorescent-Dye-Doped DNA–Surfactant Complex Films. Advanced Materials 12.17 (2000): 1281-1283. [6] G. Zhang, H. Takahashi, L. Wang, J. Yoshida, S. Kobayashi, S. Horinouchi, N. Ogata, Nonlinear optical materials derived from biopolymer (DNA)-surfactant azo dye complex. Materials and Devices for Optical and Wireless Communications. Vol. 4905. International Society for Optics and Photonics, 2002. [7] Y. Kawabe, L. Wang, T. Koyama, S. Horinouchi, N. Ogata, Light amplification in dye-doped DNA-surfactant complex films. Linear, Nonlinear, and Power-Limiting Organics. Vol. 4106. International Society for Optics and Photonics, 2000. [8] A. Steckl, H. Spaeth, H. You, E. Gomez, J. Grote, DNA as an Optical Material. Optics and Photonics News 22.7 (2011): 34-39. [9] Z. Yu, W. Li, J. Hagen, Y. Zhou, D. Klotzkin, J. G Grote, A. J Steckl, Photoluminescence and lasing from deoxyribonucleic acid (DNA) thin films doped with sulforhodamine. Applied optics 46.9 (2007): 1507-1513. [10] J. Wolf, M. Kurpiers, R. Baus, R. Gotz, J. Griesser, B. Matuszczak, A. Bernkop-Schnurch, Characterization of an amino acid based biodegradable surfactant facilitating the incorporation of DNA into lipophilic delivery systems. Journal of colloid and interface science 566 (2020): 234-241. [11] L. Xu, Y. Wang, G. Wei, L. Feng, S. Dong, J. Hao Ordered DNA-Surfactant Hybrid Nanospheres Triggered by Magnetic Cationic Surfactants for Photon- and Magneto-Manipulated Drug Delivery and Release. Biomacromolecules 16.12 (2015): 4004-4012. [12] H. Sun, W. Li, L. Wu, Honeycomb-Patterned Films Fabricated by Self-Organization of DNA−Surfactant Complexes. Langmuir 25.18 (2009): 10466-10472. [13] M. Vos, P. Bomans, F. de Haas, P. Frederik, J. Jansen, R. Nolte, N. Sommerdijk, Insights in the Organization of DNA−Surfactant Monolayers Using Cryo-Electron Tomography. Journal of the American Chemical Society 129.39 (2007): 11894-11895. [14] Q. Sun, G. Subramanyam, L. Dai, M. Check, A. Campbell, R. Naik, J. Grote, Y. Wang, Highly efficient quantum-dot light-emitting diodes with DNA− CTMA as a combined hole-transporting and electron-blocking layer. Acs Nano 3.3 (2009): 737-743. [15] J. Hagen, W. Li, H. Spaeth, J. Grote, A. Steckl, Molecular beam deposition of DNA nanometer films. Nano Letters 7.1 (2007): 133-137. [16] R. Dias, S. Mel'nikov, B. Lindman, M.G. Miguel, DNA phase behavior in the presence of oppositely charged surfactants. Langmuir 16.24 (2000): 9577-9583. [17] V. Jadhav, S. Maiti, A. Dasgupta, P. Das, R. Dias M. Miguel, B. Lindman, Effect of the head-group geometry of amino acid-based cationic surfactants on interaction with plasmid DNA. Biomacromolecules 9.7 (2008): 1852-1859. [18] A. Dasgupta, P. Das, R. Dias, M. Miguel, B. Lindman, V. Jadhav, M. Gnanamani, S. Maiti, Effect of headgroup on DNA− cationic surfactant interactions. The Journal of Physical Chemistry B 111.29 (2007): 8502-8508. [19] L. Piculell, B. Lindman, Association and segregation in aqueous polymer/polymer, polymer/surfactant, and surfactant/surfactant mixtures: similarities and differences. Advances in Colloid and Interface Science 41 (1992): 149-178 [20] C. Darvin The Origin of Species By Means of Natural Selection, or the Preservation of Favoured Races in the Struggle for Life. Cambridge University Press, 2009 (oryginał 1876). [21] S. Muller-Wille, Gregor Mendel and the History of Heredity. Handbook of the Historiography of Biology. Springer International Publishing AG, 2018. [22] E. Schwarzbach, P. Smykal, O. Dostál Gregor J. Mendel - Genetics Founding Father. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 50.2 (2014): 43-51. [23] G. Mendel, Experiments in Plant Hybridization. 1865. Verhandlungen des naturforschenden Vereins Brünn.) Available online: www. mendelweb. org/Mendel. html (accessed on 1 January 2013) (1996) [24] R. Dahm From discovering to understanding. 2010, EMBO reports 11.3 (2010): 153-160. [25] R. Dahm Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years. Human genetics 122.6 (2008): 565-581. [26] F. Meischer. Die Spermatozoen einiger Wirbeltiere. Ein Beitrag zur Histochemie. Konferencja towarzystwa nauk przyrodniczych w Bazylei, 1874. [27] A. Zubek, A. Belter, M. Z. Naskręt-Barciszewska, S. Jurga, W. T. Markiewicz, J. Barciszewski 150. rocznica odkrycia DNA. Zapomniany Richard Altmann z Iławy, Nauka (2019): 137-148. [28] M. Cobb, A Speculative History of DNA: What If Oswald Avery Had Died in 1934? PLoS biology 14.12 (2016): e2001197 [29] R. Altmann Archiv für Anatomie und Physiologie. Physiologie, 1889, str. 524. [30] Albrecht Kossel – Facts. [Online] Nobel Media AB 2021. [Zacytowano: 11.01.2021.] https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1910/kossel/facts/. [31] A. Kossel, The Chemical Composition of the Cell Nucleus. [Online] Nobel Media AB 2021, 12.12.1910. [Zacytowano: 11.01.2021.] https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1910/kossel/lecture/. [32] P. Levene The structure of yeast nucleic acid. Journal of Biological Chemistry 31.3 (1917): 591-598. [33] E. Schrödinger Czym jest życie? Fizyczne aspekty żywej komórki. Cambridge University Press, 1944. [34] A. Sayre Rosalind Franklin and DNA. W. W. Norton & Company, 2000. [35] D. Elson, E. Chargaff On the deoxyribonucleic acid content of sea urchin gametes. Experientia 8.4 (1952): 143-145. [36] E. Chargaff, R. Lipshitz, C. Green Composition of the deoxypentose nucleic acids of four genera of sea-urchin. Journal of Biological Chemistry. 1952, Tom 195, 1, strony 155-160. [37] J. Watson F. Crick. Genetical Implications of the Structure of Deoxyribonucleic Acid. Nature 171.4361 (1953): 964-967. [38] M. Wilkins, A. Stokes, H. Wilson, Molecular Structure of Nucleic Acids: Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic Acids. Nature 171 (1953): 738-740. [39] N. C. Seeman, Nanomaterials Based on DNA. Annual review of biochemistry 79 (2010): 65-87. [40] K. M. Abu-Salah A. A. Ansari, S. A. Alrokayan. DNA-Based Applications in Nanobiotechnology. Journal of biomedicine and biotechnology 2010 (2010). [41] S Yu, T Chen, Q Zhang, M Zhou, X Zhu Application of DNA nanodevices for biosensing. Analyst. 145.10 (2020): 3481-3489. [42] Encyklopedia PWN: związki koordynacyjne. [Online] https://encyklopedia.pwn.pl/haslo/zwiazki-koordynacyjne;3925511.html. [43] Y Okahata, T Kobayashi, K Tanaka, M. Shimomura, Anisotropic electric conductivity in an aligned DNA cast film. Journal of the American Chemical Society 120.24 (1998): 6165-6166. [44] J. Grote, J. Hagen, J. Zetts, R. Nelson, D. Diggs, M. Stone, P. Yaney, E. Heckman, C. Zhang, W. Steier, A. Jen, L. Dalton, N. Ogata, M. Curley, S. Clarson, F. Hopkins. Investigation of polymers and marine-derived DNA in optoelectronics. The Journal of Physical Chemistry B 108.25 (2004): 8584-8591. [45] J. Grote, D. Diggs, R. Nelson. J. Zetts, F. Hopkins, N. Ogata, J. Hagen, E. Heckman, P. Yaney, M. Stone, L. Dalton, DNA photonics [deoxyribonucleic acid] Molecular Crystals and Liquid Crystals 426.1 (2005): 3-17. [46] K. Nakamura, T. Ishikawa, D. Nishioka, T. Ushikubo, N. Kobayashi, Color-tunable multilayer organic light emitting diode composed of DNA complex and tris (8-hydroxyquinolinato) aluminum. Applied Physics Letters 97.19 (2010): 235. [47] Y. Kurokawa, S. Tomita, S. Miyajima, A. Yamada, M. Konagai, M. San Diego (2008). Proceedings of the 33rd IEEE Photovoltaic Specialists Conference. [48] G. Cooper, R. Hausman, The Cell: A Molecular Approach. Vol. 4. Washington, DC: ASM press, 2007. [49] A. Ghosh M. Bansal, A glossary of DNA structures from A to Z. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 59.4 (2003): 620-626. [50] D. Wong The ABCs of Gene Cloning, Springer, 2006. [51] J. Berg J. Tymoczko, H. Stryer. Biochemia Wyd. 5. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN, 2018. [52] P. Yakovchuk E. Protozanova, MD. Frank-Kamenetskii Base-stacking and base-pairing contributions into thermal stability of the DNA double helix. Nucleic acids research 34.2 (2006): 564-574. [53] R. Wing H. Drew, T. Takano, C. Broka, S. Tanaka, K. Itakura, R. Dickerson, Crystal structure analysis of a complete turn of B-DNA. Nature 287.5784 (1980): 755-758. [54] C. Pabo R. Sauer, Protein-DNA recognition. Annual review of biochemistry 53.1 (1984): 293-321. [55] Different Forms of DNA (A-DNA, B-DNA and Z-DNA). [Online] [Zacytowano: 11.01.2021.] https://www.easybiologyclass.com/different-forms-of-dna-a-dna-b-dna-and-z-dna-a-comparison-table-with-ppt/. [56] Ancestry.com. [Online] [Zacytowano: 14.09.2020.] https://www.ancestry.com/lp/where-is-dna-found/cells. [57] Archive Esembly, CHromosome summary [Online] [ Zacytowan 07.11.2021.] http://feb2021.archive.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/Chromosome?r=1:1-1000000 [58] C. Kado. Origin and evolution of plasmids. Antonie Van Leeuwenhoek 73.1 (1998): 117-126. [59] C. Mielke, S. Benham. DNA mechanics. Annual Review of Biomedical Engineering, 7 (2005): 21-53. [60] M. Rosen, J. Kunjappu Surfactants and Interfacial Phenomena (4th ed.). John Wiley & Sons., 2012. [61] Oxford English Dictionary - surfactant. [Online] Oxford University Press. [Zacytowano: 08 02 2021.] https://oed.com/search?searchType=dictionary&q=surfactant. [62] R. Dias, L. Magno, A. Valente, D. Das, P. Das, S. Maiti, M. Miguel, B. Lindman. Interaction between DNA and cationic surfactants: effect of DNA conformation and surfactant headgroup. The Journal of Physical Chemistry B 112.46 (2008): 14446-14452. [63] K. Liu L. Zheng, C. Ma, R. Gostl, A. Hermann. DNA–surfactant complexes: self-assembly properties and applications. Chemical Society Reviews 46.16 (2017): 5147-5172. [64] L. Goracci R. Germani, G. Savelli, D. M. Bassani. Hoechst 33258 as a pH‐Sensitive Probe to Study the Interaction of Amine Oxide Surfactants with DNA. ChemBioChem 6.1 (2005): 197-203. [65] Metody Biofizyki Molekularnej/ Elektroforeza. [Online] [Zacytowano: 08 01 2021.] http://brain.fuw.edu.pl/edu/index.php?title=Metody_Biofizyki_Molekularnej/Elektroforeza&. [66] J. Brody, S. Kern, History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis. Analytical biochemistry 333.1 (2004): 1-13. [67] A. Wilkinson, A. McNaught IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the "Gold Book"). Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1997. [68] G. Shemer Advances Physical Chemistry Lab - Langmuir Monolayers. [Online] 2003. [Zacytowano: 11.01.2021.] https://www.tau.ac.il/~physchem/Langmuir/new_page_9.htm. [69] J. Giner-Casares, G. Brezesinski, H. Möhwald. Langmuir monolayers as unique physical models. Current opinion in colloid & interface science 19.3 (2014): 176-182. [70] A. Katsuhiko, Y Yamauchi, T Mori, JP Hill 25th Anniversary Article: What Can Be Done with the Langmuir-Blodgett Method? Recent Developments and its Critical Role in Materials Science. Advanced Materials 25.45 (2013): 6477-6512. [71] M. Velázquez, T Alejo, D López‐Díaz, B Martín‐García, M. Merchán, Langmuir‐Blodgett Methodology: A Versatile Technique to Build 2D Material Films. TWO-DIMENSIONAL MATERIALS (2016): 21 [72] Z. Czyż Aktualne zagadnienia inżynierii. Lublin, Wydawnictwo Naukowe TYGIEL, 2018. [73] J. Davies. Interfacial Phenomena. Elsevier, 2012. [74] J. Meunier Why a Brewster angle microscope? Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 171.1-3 (2000): 33-40. [75] D. Honig, D. Mobius. Direct visualization of monolayers at the air-water interface by Brewster angle microscopy. The Journal of Physical Chemistry 95.12 (1991): 4590-4592.strony 4590-4592. [76] S. Lauren. Brewster angle microscopy – A powerful tool for thin film visualization. [Online] Biolin Scientific. [Zacytowano: 12.01.2021.] https://www.biolinscientific.com/blog/brewster-angle-microscopy-a-powerful-tool-for-thin-film-visualization. [77] NIMA KSV. Imaging the Structure of Thin Films: Brewster Angle Microscopy. Biolin Scientifc. [78] U. Maver T. Maver, Z. Persin, K. Stana-Kleinschek, M. Mozetic, Al. Vesel. Polymer Characterization with the Atomic Force Microscope. Polymer science 4 (2013). [79] J. Fritz. Early milestones in the development of ion-exchange chromatography: a personal account. Journal of Chromatography A 1039.1-2 (2004): 3-12. [80] Ö. Bahadir. Ion-Exchange Chromatography and Its Applications. Column chromatography 10 (2013): 55744. [81] P. Cummins, O. Dowling, B. O’Connor; Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application to the Partial Purification of Soluble Mammalian Prolyl Oligopeptides. Protein Chromatography. Humana Press, 2011. 215-228. [82] E. Kłoczko Wymiana jonów i chromatografia jonowymienna. Metody eksperymentalne w chemii. Warszawa: PWN, 1978. 117-123. [83] P. Griffiths, J. de Hasseth Fourier Transform Infrared Spectrometry. Vol. 171. John Wiley & Sons, 2007. [84] BRUKER. Guide to Infrared Spectroscopy. [Online] BRUKER. [Zacytowano: 17.05.2021.] https://www.bruker.com/pl/products-and-solutions/infrared-and-raman/ft-ir-routine-spectrometer/what-is-ft-ir-spectroscopy.html. [85] F. Kremer, A. Schönhals, Broadband dielectric spectroscopy. Springer Science & Business Media, 2002. [86] S. Urban, S. Lalik, A. Różycka, A. Iwan, M. Marzec, Dielectric studies in the isotropic phase of six symmetrical azomethines with various number of benzene rings. Influence of the ionic conductivity. Journal of Molecular Liquids 328 (2021): 115477. [87] M. von Laue, Concerning the detection of X-ray interferences. Nobel Lecture, 1915. [88] P. Luger. Rentgenografia strukturalna monokryształów. Warszawa, PWN, 1989. [89] G. Cichowicz Grzegorz. Dyfrakcja rentgenowska na materiale proszkowym. Warszawa, Laboratorium Zaawansowanej Inżynierii Kryształów im. Jana Czochralskiego, Centrum Nauk Biologiczno-Chemicznych, Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego, 2017. [90] D. Kwok, A. Neumann. Contact angle measurement and contact angle interpretation. Advances in colloid and interface science 81.3 (1999): 167-249. [91] M. Zenkiewicz Methods for the calculation of surface free energy of solids. Journal of Achievements in Materials and Manufacturing Engineering 24.1 (2007): 137-145. [92] F. Fowkes Attractive forces at interfaces. Industrial & Engineering Chemistry 56.12 (1964): 40-52. [93] S. Lauren, Surface free energy – what is it and how to measure it? Biolin Scienific. [Online] [Zacytowano 10.03.2021.] https://www.biolinscientific.com/blog/what-is-surface-free-energy [94] Zakład Inżynierii Nowych Materiałów. Instrukcje do ćwiczenia - separacja fazowa polimerów. [Online] [Zacytowano: 18.09.2020.] http://www.zinm.if.uj.edu.pl/documents/5807277/143905027/Instrukcja+FMZ3/d182e939-7628-44a0-83bc-00bb2c63353f. [95] C. Lawrence The mechanics of spin coating of polymer films. The Physics of fluids 31.10 (1988): 2786-2795. [96] J. Rysz M. Josiek, MM. Marzec, E Moons, Pattern replication in blends of semiconducting and insulating polymers casted by horizontal dipping. Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics 51.19 (2013): 1419-1426. [97] https://imagej.nih.gov/ij/ [98] M. Green, J. Sambrook, P. MacCallum. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Molecular cloning: a laboratory manual. 2012. 1890-1890. [99] A. Radko, S. Lalik, A. Deptuch, T. Jaworska-Gołąb, R. Ekiert, N. Górska, J. Nizioł, M. Marzec. Physicochemical characterization of the DNA complexes with different surfactants. Polymer (2021): 124277. [100] C. Braun, G. Jas, S. Choosakoonkriang, G. Koe, J. Smith, C. Middaugh. The Structure of DNA within Cationic Lipid/DNA Complexes. Biophysical journal 84.2 (2003): 1114-1123. [101] C. Muntean, R. Stefan, M. Bindea, V. Cozma Fourier transform infrared spectroscopy of DNA from Borrelia burgdorferi sensu lato and Ixodes ricinus ticks. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 110 (2013): 185-192. [102] B. Wood The importance of hydration and DNA conformation in interpreting infrared spectra of cells and tissues. Chemical Society Reviews 45.7 (2016): 1980-1998. [103] E. Arkhangelskya, Y. Sefib, B. Hajajb, G. Rothenbergc, V. Gitis Kinetics and mechanism of plasmid DNA penetration through nanopores Journal of Membrane Science 371.1-2 (2011): 45-51. [104] MOPAC2016, J. Stewart Stewart Computational Chemistry, Colorado Springs, CO, USA." (2016). [105] M. Hanwell, D. Curtis, D. Lonie, T. Vandermeerschd, E. Zurek, G. Hutchison, Avogadro: an advanced semantic chemical editor, visualization, and analysis platform. Journal of cheminformatics 4.1 (2012): 1-17. [106] K. Cole, R. Cole Dispersion and absorption in dielectrics I. Alternating current characteristics. The Journal of chemical physics 9.4 (1941): 341-351. [107] J. Baker-Jarvis, C. Jones, B. Riddle Electrical properties and dielectric relaxation of DNA in solution 1998 [108] A. Radko Optymalizacja procesu wynoszenia cienkich warstw DNA-CTMA. Kraków, 2016, praca magisterska. Spis Tabel Tabela 1 Charakterystyczne parametry budowy DNA typu B i A [51]. ............................................................... 20 Tabela 2 Przybliżone wartości współczynników ściśliwości dla stanów warstw monomolekularnych [73]. ....... 29 Tabela 3 Grubość pastylek zastosowanych w pomiarach dielektrycznych. .......................................................... 36 Tabela 4 Zakresy kątów zwilżania dla poszczególnych kategorii powierzchni. ................................................... 39 Tabela 5 Modele teoretyczne obliczania energii powierzchniowej wraz z ich zastosowaniem. ........................... 40 Tabela 6 Oszacowane rozkłady długości oraz średnia masa cząsteczkowa i molowa dwóch typów DNA. ......... 46 Tabela 7 Metody redukcji rozkładu mas wraz z oceną ich przydatności pod kątem badań w pracy..................... 53 Tabela 8 Rozkład długości DNA stosowanego w niniejszej pracy. ...................................................................... 54 Tabela 9 Porównanie parametrów syntezy poszczególnych kompleksów DNA-surfaktant kationowy................ 55 Tabela 10 Połączenia składników kompleksów DNA-surfaktant. ........................................................................ 55 Tabela 11 Pozycje pasm (w cm–1) w widmie IR czystych surfaktantów............................................................... 57 Tabela 12 Zmiany w pozycji pasm IR (w cm–1) dla kompleksów dsDNA-surfaktant w porównaniu do czystego DNA oraz czystych surfaktantów [100-102]. ........................................................................................................ 60 Tabela 13 Zmiany w pozycji pasm FTIR (w cm–1) dla kompleksów pDNA-surfaktant w porównaniu do czystego DNA oraz czystych surfaktantów [100-102]. ........................................................................................................ 61 Tabela 14 Zestawienie pozycji maksimów dla kompleksów DNA z charakterystycznymi odległościami obliczonymi na podstawie równania Bragga. ........................................................................................................ 68 Tabela 15 Dlugość cząsteczki surfaktantu L (maksymalna) wraz z oszacowaną szerokością kompleksu WDNA + 2L, gdzie WDNA = 2,55 nm – szerokość formy A-DNA. ....................................................................................... 69 Tabela 16 Wartości obliczonych parametrów sieciowych dla dla sieci heksagonalnej (hex) i zniekształconej heksagonalnej (ps-hex) badanych kompleksów .................................................................................................... 70 Tabela 17 Wartość przewodności elektrycznej właściwej dla czystych surfaktantów dla f=0,5 Hz. .................... 72 Tabela 18 Otrzymane z dopasowania wartości inkrementu impedancji, częstotliwości relaksacji i parametru α oraz przewodności elektrycznej właściwej. .................................................................................................................. 74 Tabela 19 Otrzymane z dopasowania wartości inkrementu impedancji, częstotliwości relaksacji, parametru α i przewodności elektrycznej właściwej dla częstotliwości 0,5 Hz. ......................................................................... 77 Tabela 20 Zestawienie wszystkich parametrów dielektrycznych otrzymanych z dopasowania. .......................... 79 Tabela 21 Średnia wartość kąta zwilżania trzech różnych cieczy na dwóch substratach ...................................... 80 Tabela 22 Zestawienie wzorów wykorzystanych do obliczenia swobodnej energii powierzchniowej. ................ 81 Tabela 23 Średnie wartości swobodnej energii powierzchniowej dla czystych substratów. ................................. 82 Tabela 24 Średnia szerokość struktur na warstwach wyniesionych przy π = 20 mN/m wraz z błędem. .............. 89 Tabela 25 Charakterystyczne wielkości izoterm zarejestrowanych dla warstw kompleksów DNA-CTMA na granicy faz ciecz-gaz. ............................................................................................................................................ 95 Tabela 26 Charakterystyczne wielkości izoterm zarejestrowanych dla warstw kompleksów dsDNA(krótkie)-surfaktant kationowy. .......................................................................................................................................... 103 Tabela 27 Średnia szerokość struktur powierzchniowych dla ciśnienia powierzchniowego 20 mN/m. ............. 106 Tabela 28 Kąty zwilżania dla kompleksów dsDNA(krótkie)-surfaktant kationowy oraz miki............................ 106 Tabela 29 Swobodna energia powierzchniowa dla warstw kompleksu DNA(krótkie)-surfaktant kationowy wyniesionego na mice przy ciśnieniu powierzchniowym 15 mN/m. .................................................................. 107 Tabela 30 Charakterystyczne wielkości izoterm zarejestrowanych dla warstw kompleksów pDNA. ................. 108 Tabela 31 Średnia szerokość struktur utworzonych przez kompleksy pDNA-surfaktant kationowy. ................. 109 Tabela 32 Zestawienie najważniejszych wyników uzyskanych w ramach pracy doktorskiej. ............................ 117 Spis ilustracji wykorzystanych w pracy Rys. 1 Schemat budowy zasad azotowych, wykład noblowski A. Kossela [31]. .................................................. 14 Rys. 2 Wzór strukturalny deoksyrybozy. .............................................................................................................. 17 Rys. 3 Wzory strukturalne zasad azotowych występujących w DNA. .................................................................. 18 Rys. 4 Schemat budowy DNA. ............................................................................................................................. 19 Rys. 5 Schematyczne przedstawienie rowka większego i mniejszego w podwójnej helisie DNA. ...................... 20 Rys. 6 Trzy możliwe konformacje DNA plazmidowego (a) liniowe, (b) koliste, (c) superskręcone. ................... 21 Rys. 7 Schemat budowy cząsteczki amfifilowej. .................................................................................................. 22 Rys. 8 Możliwy sposób przyłączenia CTMA do szkieletu DNA przy założeniu wiązania surfaktantu do każdej reszty fosforanowej. Rzut z boku (a) i z góry (b). ................................................................................................. 24 Rys. 9 Drabinki kalibracyjne, drabinka 1kbp – zakres 500 pz– 10 000 pz (a); drabinka 10 bp – zakres 10 pz – 100 pz (b); drabinka 100 bp – zakres 100 pz – 1517 pz (c); drabinka małocząsteczkowa/25 bp – zakres 25 pz – 766 pz (d); drabinka 50 bp – zakres 50 pz – 1350 pz (e). ................................................................................................. 26 Rys. 10 Schemat budowy powierzchniowej wagi Langmuira. 1 - teflonowa wanienka, 2 - barierki ograniczające, 3 - studzienka, 4 - płytka Wilhelmy’ego, 5 - sensor ciśnienia powierzchniowego, 6 - urządzenie zanurzające z podłożem stałym. .................................................................................................................................................. 27 Rys. 11 Przykładowa izoterma π-A z zaznaczonymi charakterystycznymi stanami fizycznymi monowarstwy. Rysunek własny na podstawie [72]. ...................................................................................................................... 28 Rys. 12 Przykładowa izoterma wraz z obrazem BAM dla kompleksu DNA-CTMA. .......................................... 30 Rys. 13 Zakresy sił w badaniach AFM. Rysunek własny na podstawie [77]. ....................................................... 31 Rys. 14 Przykładowy obraz AFM uzyskany dla kompleksu pDNA-CTMA. ........................................................ 32 Rys. 15 Przykładowe widmo FT-IR dla próbki proszkowej surfaktantu CTMA. ................................................. 34 Rys. 16 Elektrody okrągłe wykorzystane do wykonania pomiarów dielektrycznych. .......................................... 35 Rys. 17 Przykładowe widmo dielektryczne (absorpcja i dyspersja dielektryczna) (a) oraz te same dane w reprezentacji impedancji (b) dla kompleksu pDNA-CTMA. ................................................................................. 36 Rys. 18 Przykładowy dyfraktogram rentgenowski kompleksu DNA-CTMA. ...................................................... 38 Rys. 19 Schemat określania kąta zwilżania θ, γSL - napięcie międzyfazowe między ciałem stałym a cieczą, γLV – napięcie powierzchniowe cieczy, γSV – napięcie powierzchniowe powierzchni (swobodna energia powierzchniowa). Rysunek własny na podstawie [93]. ........................................................................................ 40 Rys. 20 Schemat wynoszenia cienkiej warstwy metodą nanoszenia wirowego: (a) nakropienie materiału, (b) rozprowadzenie substancji po całej powierzchni podkładu, (c) odparowywanie rozpuszczalnika, (d) gotowa warstwa. ................................................................................................................................................................ 42 Rys. 21 Schemat wynoszenia cienkiej warstwy metodą listwy rozciągającej. Rysunek własny na podstawie [96]. .............................................................................................................................................................................. 43 Rys. 22 Schemat wynoszenia cienkich warstw metodą Langmiur-Blodgett: (a) nakropienie substancji na powierzchnię subfazy; (b), (c) kompresja monowarstwy; (d) transfer warstwy na powierzchnię stałą. ............... 43 Rys. 23 Procedura wyznaczania rozkładu długości łańcuchów DNA w próbce: (a) wyjściowy obraz żelu: ścieżka 1 - przykładowa drabinka, ścieżki 2, 3 - przykładowe wyniki; (b) profil wysokościowy dla drabinki referencyjnej; (c) przypisanie wartości (długości fragmentu DNA) do położenia prążka na żelu; (d) dopasowanie zależności długości DNA od położenia na żelu. ..................................................................................................................... 45 Rys. 24 Schemat hodowli komórkowej wraz z fotografiami procesu: hodowla na szalce Petriego (a,d); hodowla w małej objętości pożywki – 30 ml LB (b,e); hodowla w dużej objętości pożywki – 2l LB (c,f). ........................... 47 Rys. 25 Wynik elektroforezy DNA plazmidowego: ścieżka 1 - drabinka 1kbp, ścieżka 2 - DNA plazmidowe. Trzy prążki odpowiadają trzem konformacjom, zaznaczonym schematycznie po prawej stronie. ............................... 48 Rys. 26 Mapa wektorowa plazmidu phMGFP z zaznaczonymi miejscami działania wykorzystywanych enzymów restrykcyjnych. ...................................................................................................................................................... 49 Rys. 27 Wynik elektroforezy po wstępnym rozcięciu DNA: (a) ścieżka 1 – drabinka 100bp, ścieżka 2 - wynik eksperymentu; (b) wynik elektroforezy: ścieżka 1- DNA przed trawieniem, ścieżka 3 - DNA plazmidowe w trakcje trawienia trzema enzymami restrykcyjnymi. ........................................................................................................ 50 Rys. 28 Schemat eksperymentu wykorzystującego elektroforezę do redukcji rozkładu długości DNA. .............. 50 Rys. 29 Wynik elektroforezy: (a) ścieżka 1- drabinka 50 bp; ścieżki 2, 3, oraz 4 – dsDNA(krótkie) z widoczną wybraną częścią materiału badawczego; ścieżka 5- drabinka 10 bp oraz (b) rozkład długości otrzymanych fragmentów: ścieżki 1 i 8 - drabinka 10 bp; ścieżki 2-7 - fragmanty DNA wybrane na różnych etapach elektroforezy. ........................................................................................................................................................ 51 Rys. 30 Wynik elektroforezy DNA po chromatografii jonowymiennej: ścieżka 1 - drabinka 100 bp, ścieżki wewnętrze (2-16) – rozkład długości wybranych frakcji, ścieżka 17 - drabinka 1 kbp. ....................................... 52 Rys. 31 Wynik elektroforezy : porównanie rozkładu długości DNA kupionego dsDNA(krótkie) z wybraną do badań frakcją DNA otrzymanego w wyniki chromatografii jonowymiennej próbki dsDNA(długie). Ścieżka 1 - drabinka 25 bp; ścieżka 2 - drabinka 10 bp; ścieżka 3- dsDNA(chrom); ścieżka 4 - dsDNA(krótkie). ................ 52 Rys. 32 Wynik elektroforezy: (a) zestawienie 3 żeli: ścieżka 1- dsDNA(krótkie); ścieżka 2- dsDNA(chrom); ścieżka 3- drabinka 10 bp; ścieżka 4- drabinka 25 bp; ścieżka 5- drabinka 1kbp; ścieżka 6- pDNA; ścieżka 7 – drabinka 1 kbp; ścieżka 8- dsDNA(długie) oraz (b) wykresy zależności intensywności wybarwienia żelu od ilości par zasad. .............................................................................................................................................................................. 53 Rys. 33 Wzory strukturalne surfaktantów zastosowanych do syntezy kompleksów: CTMA (a), HDP (b) i BAC (c). .............................................................................................................................................................................. 54 Rys. 34 Widma FTIR czystych surfaktantów wraz z ich wzorami strukturalnymi. .............................................. 56 Rys. 35 Widma FTIR dla kompleksów DNA-CTMA z różnymi rodzajami DNA. .............................................. 57 Rys. 36 Widma FTIR czystych składników, fizycznej mieszaniny DNA+surfaktant oraz kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) z surfaktantami CTMA (a), HDP (b) i BAC (c) [99]. ................................................................. 58 Rys. 37 Widma FTIR czystych składników, fizycznej mieszaniny DNA+surfaktant oraz kompleksów na bazie pDNA z surfaktantami CTMA (a), HDP (b) i BAC (c). ....................................................................................... 62 Rys. 38 Dyfraktogramy dla czystych surfaktantów na płytce szklanej. ................................................................ 63 Rys. 39 Dyfraktogramy dla czystego dsDNA(krótkie) oraz kompleksów dsDNA(krótkie)-CTMA. ..................... 64 Rys. 40 Dyfraktogramy (SAXS) dla czystego CTMA oraz kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA. ........................ 64 Rys. 41 Dyfraktogramy dla kompleksów na bazie różnego typu DNA z CTMA. ................................................ 65 Rys. 42 Dyfraktogramy dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) z trzema różnymi surfaktantami. ................. 66 Rys. 43 Dyfraktogramy (SAXS) dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) z trzema różnymi surfaktantami oraz czystych surfaktantów. .......................................................................................................................................... 66 Rys. 44 Dyfraktogramy dla kompleksów na bazie pDNA z trzema różnymi surfaktantami. ................................ 67 Rys. 45 Modele cząsteczkowe surfaktantów wykorzystanych w pracy (rysunki wygenerowane w programie Avogadro [105]). ................................................................................................................................................... 68 Rys. 46 Model upakowania kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA na podstawie badań metodą SAXS. ................ 70 Rys. 47 Widma dielektryczne dla surfaktantów BAC, CTMA, HDP: dyspersja (a) i absorpcja (b). Zależność części rzeczywistej (c) i urojonej (d) impedancji od częstotliwości. ............................................................................... 71 Rys. 48 Zależność przewodnictwa właściwego od częstotliwości dla badanych próbek czystych surfaktantów. 72 Rys. 49 Widma dielektryczne: dyspersja (a), absorbcja (b), zależność tgδ od częstotliwości (c), zależność części rzeczywistej (d) i urojonej (e) impedancji od częstotliwości oraz zależność przewodności właściwej od częstotliwości (f) dla kompleksów DNA–CTMA zsyntezowanych z czterema typami DNA. ............................. 73 Rys. 50 Zależność Eulera-Argand’a dla kompleksów DNA-CTMA. ................................................................... 74 Rys. 51 Widma dielektryczne: dyspersja (a,c) i absorpcja (b,d) dla kompleksów utworzonych odpowiednio na bazie dsDNA(krótkie) i pDNA. Widma we wstawkach przedstawiają te same dane w innej skali na osi Y. Zależność części rzeczywistej (e,g) i urojonej (f,h) impedancji od częstotliwości dla kompleksów utworzonych odpowiednio na bazie dsDNA(krótkie) i pDNA. ......................................................................................................................... 76 Rys. 52 Zależności Eulera-Argand’a dla próbek kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) (a) oraz pDNA (b). ...... 77 Rys. 53 Zależność przewodności właściwej od częstotliwości dla kompleksów na bazie dsDNA(krótkie) (a) oraz pDNA (b). .............................................................................................................................................................. 78 Rys. 54 Topografia cienkiej warstwy dsDNA(krótkie)-CTMA otrzymana metodami: nanoszenia wirowego (a), listwy rozciągającej (b), odparowania rozpuszczalnika (c), Langmuir-Blodgett, 15 mN/m (d). .......................... 84 Rys. 55 Badania stabilności monowarstwy, na podstawie [108]. ......................................................................... 85 Rys. 56 Zależność ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni dostępnej na molekułę. Wstawka przedstawia zależność współczynnika ściśliwości od ciśnienia powierzchniowego. ............................................ 86 Rys. 57 Obrazy z mikroskopu BAM w trakcie kompresji (a) i po załamaniu monowarstwy (b). ......................... 86 Rys. 58 Topografia cienkich warstw kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA wynoszonych przy różnych warunkach eksperymentalnych. Rozmiar wszystkich obrazów: 2,5x2,5 µm; skala wysokości 0-4 nm. Struktury pojawiają się równolegle do kierunku wyciągania próbki z subfazy wodnej. ............................................................................ 88 Rys. 59 Wybrane, pojedyncze profile wysokościowe dla obrazów AFM warstw kompleksów dsDNA(krótkie)-CTMA wyniesionych przy ciśnieniu powierzchniowym 20 mN/m. ...................................................................... 89 Rys. 60 Przykłady profili wysokości warstwy kompleksu dsDNA(krótkie)-CTMA prostopadłego (a) i równoległego (b) do kierunku wynoszenia warstwy. ............................................................................................ 90 Rys. 61 Wyniki analizy FFT dla obrazów AFM przedstawionych na Rys. 58. .................................................... 91 Rys. 62 Zależność ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni dostępnej na molekułę dla kompleksów dsDNA(krótkie)–CTMA (a), dsDNA(chrom)–CTMA (b), dsDNA(długie)–CTMA (c) i pDNA–CTMA (d). Wstawki przedstawiają zależność współczynnika ściśliwości od ciśnienia powierzchniowego. .......................... 92 Rys. 63 Obrazy BAM otrzymane podczas kompresji monowarstwy (górny rząd) i po przekroczeniu ciśnienia kolapsu (dolny rząd): dsDNA(krótkie)-CTMA (a-b), dsDNA(chrom)-CTMA (c-d), dsDNA(długie)-CTMA (e-f) i pDNA-CTMA (g-h). .............................................................................................................................................. 94 Rys. 64 Obrazy AFM dla cienkich warstw kompleksów wyniesionych na powierzchnię miki: obrazy o rozmiarze 2,5x2,5 µm (a), obrazy o rozmiarze 10x10 µm (b). SCR – obliczony stopień pokrycia powierzchni przez kompleks. .............................................................................................................................................................................. 96 Rys. 65 Obrazy AFM kompleksu pDNA-CTMA na mice. Zdjęcie górne – rozmiar 10x10 µm, zdjęcia dolne – rozmiar 2,5x2,5 µm. .............................................................................................................................................. 97 Rys. 66 Obrazy AFM dla cienkich warstw kompleksów wyniesionych na powierzchni krzemu, obrazy o rozmiarze 2,5x2,5 µm. SCR – stopień pokrycia powierzchni przez kompleks. ..................................................................... 98 Rys. 67 Reprezentatywne przykłady profili wysokościowych obrazów AFM cienkich warstw przedstawionych na Rys. 64 i Rys. 66. .................................................................................................................................................. 99 Rys. 68 Wyniki analizy FFT wykonanej na profilach wysokoścowych obrazów AFM, dla warstw wyniesionych na mice i krzemie. Amplitudy znormalizowane, analiza obrazów o rozmiarze 2,5x2,5 µm z Rys. 64 oraz Rys. 66. ............................................................................................................................................................................ 101 Rys. 69 Zależność ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni dostępnej na molekułę dla kompleksów: (a) dsDNA(krótkie)-CTMA, (b) dsDNA(krótkie)-BAC oraz (c) dsDNA(krótkie)-HDP. Wstawka przedstawia zależność współczynnika ściśliwości od ciśnienia powierzchniowego............................................................... 103 Rys. 70 Obrazy AFM warstw wyniesionych dla kompleksów dsDNA(krótkie)-BAC, dsDNA(krótkie)-HDP i dsDNA(krótkie)-CTMA na powierzchnię miki dla wybranych ciśnień powierzchniowych. Rozmiar obrazów 2,5x2,5 µm. ......................................................................................................................................................... 104 Rys. 71 Wyniki analizy FFT wykonanej na profilach wysokoścowych obrazów AFM warstw wyniesionych na mice dla kompleksów dsDNA(krótkie)-BAC, dsDNA(krótkie)-HDP i dsDNA(krótkie)-CTMA dla wybranych ciśnień powierzchniowych. Amplitudy znormalizowane, analiza obrazów o rozmiarze 2,5x2,5 µm z Rys. 70. 105 Rys. 72 Zależność ciśnienia powierzchniowego od średniej powierzchni dostępnej na molekułę dla kompleksów (a) pDNA-CTMA, (b) pDNA-BAC oraz (c) pDNA–HDP. Wstawka przedstawia zależność współczynnika ściśliwości od ciśnienia powierzchniowego. ....................................................................................................... 108 Rys. 73 Obrazy AFM dla cienkich warstw kompleksów DNA plazmidowego wyniesionych na powierzchnię miki dla ciśnień powierzchniowych 5 mN/m – 20 mN/m. Rozmiar obrazów: 10x10 µm. ......................................... 110 Rys. 74 Wyniki analizy FFT wykonanej na profilach wysokoścowych obrazów AFM, dla warstw wyniesionych na mice. Amplitudy znormalizowane, analiza obrazów o rozmiarze 10x10 µm z Rys. 73. ................................ 111 Rys. 75 Reprezentatywne przykłady profili wysokościowych obrazów AFM cienkich warstw pDNA-BAC. .... 112 Rys. 76 Obrazy AFM dla cienkich warstw kompleksówna bazie pDNA wyniesionych na powierzchnię miki, obrazy o rozmiarze 2,5x2,5 µm........................................................................................................................... 113 Rys. 77 Wyniki analizy FFT wykonanej na profilach wysokościowych obrazów AFM, dla warstw wyniesionych na mice. Amplitudy znormalizowane, analiza obrazów o rozmiarze 2,5x2,5 µm z Rys 78. ............................... 114 Dodatek - Historia badań DNA Badania DNA są nierozerwalnie związane i motywowane głównie nukleiną, ponieważ wyizolował ją z jądra komórkowego (z łac. nucleus). Opracował także pierwszą procedurę izolacji i oczyszczania DNA oraz stwierdził, że wyizolowany związek przypomina mucynę (związek chemiczny z grupy glikoprotein czyli białek związanych wiązaniem kowalencyjnym z oligosacharydami) [10] i zawiera w swojej budowie pierwiastki charakterystyczne dla związków organicznych: węgiel, wodór, tlen i azot. W odróżnieniu od białek, nukleina zawierała znaczące ilości fosforu, którego proporcje do innych pierwiastków były niespotykane wśród znanych molekuł organicznych. Przeprowadzone analizy pozwoliły stwierdzić, że nukleina jest „fundamentalnie nowym typem związku organicznego” [11]. W 1871 roku w czasopiśmie „Badania medyczno – chemiczne” ukazały się trzy artykuły dotyczące nukleiny. W pierwszym Miescher pisał o składzie chemicznym nukleiny [12], w drugim P. Plósz [13] donosił o obecności nukleiny w jądrach komórkowych erytrocytów ptaków i węży, a w trzecim Hoppe-Slayer [14] potwierdzał odkrycie przez Mieschera nukleiny i w niej niespodziewanie dużą zawartość fosforu. W toku dalszych badań, Miescher opracował nowe protokoły izolacji nukleiny, wyizolował duże jej ilości, korzystając ze spermy łososia i powtórzył analizę jej składu chemicznego. Stwierdził dodatkowo dużą zawartość fosforu w formie kwasu fosforowego. Określił zawartość reszty kwasu fosforowego (P2O5) w spermie łososia na 22,5% (obecnie ta zawartość jest określona na 22,9%), potwierdził, wcześniej postulowany, kwasowy charakter związku, określił nukleinę jako kwas wielozasadowy o dużej masie atomowej (500-600 daltonów) oraz zaproponował kilka możliwych wzorów chemicznych tej substancji, między innymi: C22H32N6P2O16 lub C29H49N9P3O22 [15]. Przez 25 lat badań nukleiny Miescher przedstawił kilka teorii na temat jej funkcji. Postulował między innymi wspomnianą już funkcję magazynu fosforu i roli prekursora dla innych molekuł w jądrze atomowym. Pod koniec XIX wieku, po swoich odkryciach dużej ilości nuklein w plemnikach różnych gatunków zwierząt, Miescher zaproponował związek nukleiny z transmisją cech dziedzicznych między pokoleniami. Odrzucał jednak ideę, że nukleina samodzielnie jest odpowiedzialna za przenoszenie cech dziedzicznych, natomiast 1871 Friedrich Miescher, Felix Hoppe-Seyler i Pal Plósz publikują pierwsze prace naukowe opisujące nukleinę 1881 Albrecht Kossel stwierdza kwasową naturę nukleiny, później izoluje 5 zasad azotowych budujących DNA i RNA przypuszczał że informacje dotyczące cech dziedzicznych będą zakodowane w stereochemicznych stanach atomów węgla. W latach 70. i 80. XIX wieku inny badacz, Walter Flemming [16], prowadził badania dotyczące podziału komórek, a zaobserwowany przez niego podział został nazwany mitozą (przekształcanie się jądra komórkowego w niciopodobne struktury, późniejszy ich podział na dwie części i formowanie nowych jąder komórkowych). Z kolei w 1888 r. Heinrich Wilhelm Waldeyer nazwał opisywane przez Flemminga niciopodobe struktury lub nicie jądrowe (ang. nuclear threads) chromosomami (gr. Chroma – kolor, soma – ciało; nazwa jest związana ze stosunkowo łatwym barwieniem chromosomów). Chromosomy mogą dzielić się na dwa sposoby: które określono mianem mitozy i mejozy. W wyniku mitozy powstają dwie komórki z taką samą jak na początku liczbą chromosomów, a podczas procesu mejozy powstają nowe komórki, z których każda ma połowę początkowych chromosomów. Lata 80. XIX wieku przyniosły kolejne interesujące odkrycia i teorie dotyczące dziedziczenia. Albert Weismann w 1880 r. dowodził, że „substancja dziedziczenia” znajduje się w komórkach rozrodczych i przenosi z pokolenia na pokolenie cechy dziedziczne (niezmienne i pozbawione wpływu doświadczeń z życia organizmu rodzicielskiego) [17]. Podważył tym samym dotychczasowe poglądy Lamarcka, i częściowo Darwina, na temat zmian w gatunkach poprzez ćwiczenia i doświadczenia podczas życia [18,19]. Weismann stworzył i upowszechnił także teorię plazmy zarodkowej tj. dziedziczenia w organizmach wielokomórkowych za pomocą komórek jajowych i plemników, bez wpływu pozostałych komórek ciała na komórki rozrodcze [20]. Ważny wkład w rozwój nauki o dziedziczeniu miał Edward Strasburger, [21,22] botanik z polsko-niemieckimi korzeniami, który opracował sposób barwienia jąder komórek rozrodczych roślin, co pozwoliło obrazować chromosomy i umożliwiło obserwację podziału jąder komórkowych. Jego badania doprowadziły do wniosku, że jądra komórkowe powstają zawsze w wyniku podziału jądra macierzystego [23]. 1882 Walter Flemming opisuje chromosom i bada jego zachowanie podczas podziału komórkowego 1884 - 1885 Oscar Hertwig, Albrecht von Kflliker, Eduard Strasburger oraz August Weismann niezależnie dostarczają dowodów na to, że nukleina komórki zawiera "podstawę dziedziczenia" W następnych latach Oscar Hertwig [24] ogłosił, że nukleina odgrywa ważną rolę w procesie podziału chromosomów [25] oraz wprowadził „zasadę długiej osi”, mówiącą o tym, w której płaszczyźnie dochodzi do podziału komórki [26,27]. W 1889 r. Richard Altmann [28,29] opracował metodę izolacji nukleiny z drożdży i jako pierwszy rozdzielił ją na część białkową (zawierającą protaminę i histony) i część kwasową, którą nazwał kwasem nukleinowym [30]. W trakcie swoich dalszych badań porównał kwasy nukleinowe pochodzące z różnych źródeł: drożdży, nasienia łososia, grasicy czy żółtka jaj i stwierdził brak różnic pomiędzy nimi. Odkrycia Altmana zapoczątkowały zmianę nazewnictwa: określenie „nukleina” zostało zamienione na „kwas nukleinowy”. Przełom XIX i XX wieku to czas zmiany podejścia naukowców do kwestii dziedziczenia za sprawą opublikowania wyników badań, z których wnioski były zbieżne z wnioskami Mendla. Przed 1900 rokiem istniało kilka alternatywnych teorii dotyczących mechanizmu dziedziczenia np. teoria pangenezy wewnętrznej autorstwa Hugo de Vriesa, czy wspomniana wcześniej teoria plazmy zarodkowej. Jednak to teorie zgodne z podejściem Mendla sprawiły, że narodziła się nowa dziedzina nauki – genetyka. We wspomnianym 1900 roku pojawiły się trzy niezależne prace autorstwa: Hugo de Vriesa, Carla Corrensa oraz Erlicha von Tshermarka [31, 32] którzy prowadzili badania nad krzyżowaniem organizmów. Zaskoczeniem dla badaczy było odkrycie, że wyniki ich badań zgodne są z teorią przedstawioną prawie 40 lat wcześniej przez austriackiego botanika. Prawa dziedziczenia, znane obecnie jako Prawa Mendla, weszły do kanonu wiedzy [33]. Zaraz po potwierdzeniu założeń Praw Mendla wielu naukowców zainteresowało się podobnymi eksperymentami. Szczególnie interesującym było pytanie, czy zaobserwowane na roślinach prawa dziedziczenia mają swoje przełożenie także na inne organizmy, m.in. zwierzęta. W 1902 r. wielu naukowców badało to zagadnienie, m. in. Teodor Boveri (jeżowce) Walter Sutton (pasikoniki) czy Austin Cannon (bawełna). Otrzymane przez nich wyniki były zbliżone i wskazywały na istotną rolę chromosomów w procesie dziedziczenia cech. Wnioski 1889 Richard Altmann zmienia nazwę z nukleiny na kwas nukleinowy 1900 Carl Correns, Hugo de Vries i Erich von Tschermak odkrywają ponownie "Prawa Mendla” 1902 Theodor Boveri i Walter Sutton postulują, że jednostki dziedziczenia znajdują się w chromosomach zostały zebrane przez Wilsona i za jego sprawą rozpropagowane jako Teoria Suttona-Boveriego (lub Boveriego-Suttona), znane również pod nazwą: chromosomowa teoria dziedziczenia [34,35]. W latach 1902 – 1909 sir Archibald Garrod [36,37] prowadził badania naukowe mające na celu znaleźć powiązanie między wynikami badań biochemicznych z regułami dziedziczenia określonymi przez Mendla. Zaobserwował, w jaki sposób dziedziczone są pewne choroby genetyczne. Sformułował także tezę, znaną obecnie jako reguła „jeden gen, jeden enzym” i wprowadził określenie „wrodzonych błędów metabolizmu”, oznaczające mutacje [38]. Postulował także, że defekty genetyczne skutkują wystąpieniem utraty pewnych enzymów oraz dziedziczenia chorób metabolicznych. W 1909 roku duński profesor Wilhelm Johansen przedstawił pracę, w której podjął się wstępnego opisu i uporządkowania koncepcji wczesnej genetyki, w szczególności kwestii terminologii [39]. Zaproponował wprowadzenie terminów: gen, genotyp, fenotyp, biotyp, itd. Definiował gen jako „nic innego jako przydatne słówko, które łatwo połączyć z innymi, może być więc zamiennikiem dla ‘jednostek dziedziczenia’, ‘elementów’ czy ‘allelomorfów w gametach’”. Genotyp został zdefiniowany jako suma genów w gamecie lub zygocie. Ostatecznie terminy „gen”, „genotyp” czy „genetyka” weszły do powszechnego użycia [40,41]. W 1906 roku profesor Thomas Hunt Morgan badał mechanizmy odpowiedzialne za określenie płci osobnika [42]. Twierdził wtedy, że czynnikiem determinującym płeć jest jakiś składnik cytoplazmy. W wyniku analizy własnych eksperymentów zanegował później tę teorię i skłonił się ku dominującej roli chromosomów. Do podobnych wniosków, trochę wcześniej, doszła także Nettie Stevens, która podczas badania mączniaków zaobserwowała, że samice tych owadów posiadały 20 takich samych (normalnych) chromosomów, podczas gdy samce miały 19 chromosomów normalnych i jeden mniejszy. Stevens nazwała chromosomy występujące u obu płci X natomiast ten mniejszy, występujący jedynie u samców Y. 1902 – 1909 Archibald Garrod postuluje, że defekty genetyczne skutkują wystąpieniem utraty pewnych enzymów oraz dziedzicznych chorób metabolicznych 1909 Wilhelm Johannsen po raz pierwszy używa słowa "gen" do opisu jednostki dziedziczenia 1910 Thomas Hunt Morgan wykorzystuje muszki owocówki (Drosophila) jako model dziedziczenia i odkrywa pierwsze mutacje W 1908 r. rozpoczęły się badania Thomasa Morgana mające sprawdzać teorię ewolucji i mechanizmu tworzenia się osobników o cechach niewystępujących wcześniej w populacji. Badania prowadzone były na muszkach owocówkach (Drosophila melanogaster). Krótko po tym, jak w 1910 roku Morgan określił swój eksperyment jako „dwa zmarnowane lata”, w populacji muszek pojawił się samiec z innym kolorem oczu (białe zamiast czerwonych). Dalsze obserwacje pozwoliły stwierdzić, że białe oczy w populacji pojawiały się prawie zawsze u samców. Znaleziono także podobne powiązania innych cech z płcią, a także cechy, które prawie zawsze występowały w parach. W wyniku tych obserwacji wywnioskowano, że cechy dziedziczne przenoszone są w konkretnym miejscu ściśle określonego chromosomu. Dalsze badania muszek owocówek pozwoliły w 1913 roku przedstawić konkretną mapę powiązań genetycznych dla tego gatunku. W 1933 roku Thomas Hunt Morgan odebrał Nagrodę Nobla za odkrycia skupiające się na roli chromosomu w dziedziczeniu. W roku 1910 niemiecki naukowiec Albrecht Kossel otrzymał Nagrodę Nobla z medycyny „za wkład w naszą wiedzę o chemii komórkowej dokonanej poprzez prace nad białkami, w tym substancjami nukleinowymi”. W latach 1885 – 1901 odkryto, że kwasy nukleinowe (DNA i RNA) składają z pięciu zasad azotowych: adeniny, cytozyny, guaniny, tyminy (w DNA) i uracylu (w RNA) [43]. Kossel uważał także, że obok części zawierającej azot (zasady azotowe) występuje element zawierający sześć atomów węgla połączonych z tlenem i wodorem w sposób charakterystyczny dla węglowodorów oraz drugi element – nie zawierający węgla kwas fosforowy. Z kolei Phoebus Levene odkrył sposób połączenia trzech głównych składników pojedynczego nukleotydu. Opisał także rybozę i deoksyrybozę - czyli cukry występujące w DNA i RNA i zaproponował model "polinukleotydu" [45] do opisania budowy kwasów nukleinowych, zgodnie z którym kwasy nukleinowe miały składać się z połączonych ze sobą nukleotydów, z których każdy był zbudowany z zasady azotowej, cukru i grupy fosforowej. Sugerował także bardzo uporządkowaną kolejność występowania zasad azotowych w nukleotydach twierdząc, że 1913 Alfred Sturtevant i Thomas Hunt Morgan przedstawiają pierwszą mapę powiązań genetycznych dla muszki owocówki (Drosophila) 1928 Frederick Griffith postuluje, że "zasada przekształcania" (ang. "transforming principle") umożliwia transfer właściwości między dwoma różnymi typami bakterii 1929 Phoebus Levene identyfikuje elementy budujące DNA wraz z czterema zasadami azotowymi: adeniną (A), cytozyną (C), guaniną (G) i tyminą (T) powinny zawsze występować w tej samej kolejności (np.. G-C-T-A-G-C-T-A…) - co ostatecznie zostało obalone [46]. Badania Georgea Beadlea oraz Edwarda Tatuma z 1941 roku ostatecznie potwierdziły doświadczalnie teorię mówiącą, że jeden gen koduje jeden konkretny enzym, ogłoszoną wcześniej przez Archibalda Garroda [47]. We wczesnych etapach eksperymentu pracowano na genomie muszki owocówki, ostatecznie zdecydowano się badać organizm o prostszej budowie – pleśń chlebową Neurospora crassa [48]. Z punktu widzenia badaczy istotnym okazał się fakt, że ta pleśń może rosnąć w laboratorium na pożywce o znanym składzie, ma także jeden zestaw niesparowanych chromosomów, przez co każda mutacja będzie łatwa do zaobserwowania. Beadle i Tatum dopasowali geny (z zaobserwowanymi mutacjami) do ich przeznaczenia – syntezy konkretnych enzymów – potwierdzając hipotezę: „jeden gen – jeden enzym”. Obecnie wiadomo, że niektóre geny kodują nie tylko enzymy, ale też inne białka spełniające rozmaite funkcje. Niektóre geny mogą kodować funkcjonalne cząsteczki RNA [49,50]. W latach 40. XX wieku geny były określane jako jednostki dziedziczenia, które dodatkowo produkowały enzymy pozwalające kontrolować funkcje metaboliczne. Sugerowano, że z chemicznego punktu widzenia geny mogłyby być białkami. W 1928 roku Frederick Griffith pokazał, że technikami, uznawanymi dzisiaj za typowe dla biologii molekularnej, jest możliwa zmiana właściwości bakterii [51]. Badał on dwa szczepy bakterii Pneumococcus: szczep S, który wywoływał chorobę, oraz szczep R, który mógł być szybko pokonany przez układ odpornościowy. Okazało się, że chociaż wstrzyknięto myszom podgrzane (zabite) bakterie ze szczepu S to nie powodowały choroby. Jednak, jeśli zmieszano je przed wstrzyknięciem z bakteriami ze szczepu R, to mysz chorowała [52]. Griffith postulował istnienie „czynnika transformującego” pochodzącego od zabitych bakterii, który wywoływał zmiany w niegroźnym wcześniej szczepie bakterii. Mechanizm będący przyczyną tej transformacji wyjaśnili w 1944 roku Oswald Avery, Colin MacLeod oraz Maclyn McCarty, którzy badali, jaka substancja jest odpowiedzialna za tę przemianę. W swoich badaniach 1941 George Beadle i Edward Tatum demonstrują, że każdy gen jest odpowiedzialny za produkcję jakiegoś enzymu 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod, i Maclyn McCarty prezentują, że "zasada przekształcania" Griffith’a związana jest nie z białkami, a z DNA. Sugerują, że DNA jest materiałem genetycznym wykazali, że to właśnie kwas deoksyrybonukleinowy pełni główną rolę w zmianie właściwości bakterii, co w rozwinięciu prowadziło do teorii, że gen zbudowany jest z DNA [53-55]. Praca Avery’ego i współpracowników została przez środowisko przyjęta dość sceptycznie, chociaż nie brakowało także naukowców, którzy na jej podstawie rozpoczęli własne badania [56]. Jednym z nich był Erwin Chargaff, który po zapoznaniu się z wynikami badań Avery’ego oraz z pracą popularnonaukową Erwina Schrödingera „Czym jest życie?”, rozpoczął własne badania nad DNA [57,58]. Główną tezą badań było twierdzenie, że różnice między gatunkami są zależne od różnic w DNA. Erwin Chargaff pokazał, że różnice w DNA różnych gatunków polegają na różnym udziale procentowym poszczególnych zasad azotowych, oraz że w dowolnej próbce DNA ilość nukleotydów zawierających tyminę jest taka sama jak ilość nukleotydów zawierających adeninę - ta sama zależność występuje dla nukleotydów zawierających cytozynę i guaninę. Odkrycia te znane są jako reguły Chargaffa i można je zapisać w uproszczeniu: T+C = A+G T= A C = G Chargaffowi przypisuje się także obalenie teorii Phoebusa Levene’a mówiącej, że DNA to powtarzający się wielokroć zbiór nukleotydów występujących zawsze w tej samej kolejności. Na początku lat 50. XX wieku kilka grup badawczych na całym świecie podejmowało próby rozwikłania struktury DNA. Między innymi, Erwin Schrödinger rozważając wymogi fizyczne genu stwierdził, że musi to być pewnego rodzaju kryształ aperiodyczny [59]. Rosalind Franklin sugerowała w 1951 roku, że DNA ma gęsto upakowaną strukturę helikalną zawierającą 2, 3 lub 4 skręcone łańcuchy kwasu nukleinowego, a grupy fosforanowe skierowane powinny być na zewnątrz [60]. Natomiast Chargaff podał informacje dotyczące ilości nukleotydów zawierających poszczególne zasady azotowe [61]. Odkryto także, że aby struktura DNA była stabilna, adenina musi łączyć się z tyminą za pomocą dwóch wiązań wodorowych, a guanina z cytozyną za pomocą trzech 1949 Colette i Roger Vendrely oaz André Boivin okrywają, że jądra komórek zarodkowych zawierają połowę ilości DNA znajdującego się w komórkach somatycznych. Oznacza to zmniejszenie liczby chromosomów podczas gametogenezy. Jest też kolejnym dowodem na to, że DNA jest materiałem genetycznym 1949 – 1950 Erwin Chargaff odkrywa, że podstawowy skład DNA różni się między gatunkami, ale w obrębie jednego gatunku zawsze występuje w ustalonych proporcjach. 1952 Alfred Hershey i Martha Chase używają wirusa (bakteriofag T2) aby potwierdzić tezę, że DNA jest materiałem genetycznym. wiązań wodorowych. Jako poprawny i ostateczny, uznano model DNA przedstawiony w 1953 roku przez Francisa Cricka oraz Jamesa Watsona, który opierał się na wynikach badań rentgenowskich Rosalind Franklin i Raymonda Goslinga. DNA okazało się być podwójną helisą skręconą w prawą stronę, o szkielecie zbudowanym z reszty fosforanowej i deoksyrybozy, cukru, który łączy się z jedną z zasad azotowych. Zasady azotowe skierowane są do środka i dobierają się specyficznie w pary A-T oraz C-G. Na jeden skręt helisy proponowanej przez Watsona i Cricka przypadało dziesięć par zasad. W kwietniu 1953 roku w czasopiśmie „Nature” poza pracą Watsona i Cricka opisującą strukturę DNA, pojawiły się także wyniki badań Franklin i Goslinga oraz Mauricego Wilkinsa ze współpracownikami, które również dotyczyły struktury DNA [62-64]. W 1952 roku Nagrodę Nobla z dziedziny medycyny otrzymali Francis Crick, James Watson oraz Maurice Wilkins „za odkrycia dotyczące struktury molekularnej kwasów nukleinowych i ich znaczenia dla przekazywania informacji w materiale żywym”. Następnym ważnym odkryciem było otrzymanie polimerazy DNA – enzymu, który pozwala syntezować lub powielać DNA. W 1956 roku po raz pierwszy udało się to Arthurowi Kornbergowi, nagrodzonemu wraz z Severo Ochoa w 1959 roku Nagrodą Nobla w dziedzinie medycyny „za odkrycie mechanizmów biologicznej syntezy kwasu rybonukleinowego i dezoksyrybonukleinowego” [65]. W 1957 roku podczas wykładu dla Towarzystwa Biologii Eksperymentalnej Francis Crick przedstawił centralny dogmat biologii molekularnej [66] mówiący o kierunku przepływu informacji. Watson i Crick już wcześniej twierdzili, że nadrzędną funkcją DNA jest produkcja białek, a także, że RNA (znajdujące się w cytoplazmie) musi kopiować informację genetyczną z DNA, zamkniętego w jądrze komórkowym [67]. Dogmat centralny mówi, że informacja genetyczna jest przekazywana z DNA poprzez RNA do białek, ale nie może być przekazana z białek do DNA (obecnie wiemy, że kierunek przekazu informacji z DNA do RNA nie zawsze jest zachowany i np. w przypadku retrowirusów zachodzi odwrotnie). W toku dalszych badań potwierdzono istnienie kilku wyspecjalizowanych grup RNA, w tym cząsteczkę mRNA – messenger 1953 Rosalind Franklin i Maurice Wilkins przy pomocy badań dyfrakcji Rentgenowskiej pokazują, że DNA posiada regularnie powtarzającą się strukturę 1953 James Watson i Francis Crick rozwiązują strukturą molekularną DNA: podwójna helisa w której zasada adenina zawsze łączy się z tyminą, a guanina zawsze z cytozyną. 1956 Arthur Kornberg odkrywa polimerazę DNA – enzym, który pozwala na replikację DNA 1957 Francis Crick proponuje „central dogma” („dogmat centralny”), mówiący, że informacje w DNA ulegają translacji do białek poprzez RNA oraz spekuluje, że trzy kolejne zasady zawsze określają jeden aminokwas w białku RNA – pełniącą rolę posłańca między cząsteczką DNA a białkiem. Odkrycia tego w 1960 roku dokonali: Sydney Brenner, Francois Jacob i Jacques Monod [68,69]. Na początku lat 60. XX wieku wiadome już było, że to DNA za pomocą RNA przekazuje do cytoplazmy informację o potrzebie syntezy konkretnego białka. Sposób zapisu tej informacji został przedstawiony po raz pierwszy w 1961 roku przez Marshalla Nirenberga na przykładzie pierwszego kodonu. Okazało się, że kod genetyczny tworzą trzy następujące po sobie nukleotydy. Mając do wykorzystania cztery możliwe zasady azotowe obliczono, że istnieją sześćdziesiąt cztery różne konfiguracje. Każda trójka koduje konkretny aminokwas, który wchodzi w skład danego białka. Istnieją także trójki oznaczające STOP, które przerywają syntezę aminokwasów. Z początkiem lat 60. XX w. udało się określić, jakie sekwencje DNA kodują każdy z możliwych dwudziestu aminokwasów, składających się na białka w organizmach żywych. Za złamanie kodu genetycznego Marshall Nirenberg wraz z Har Gobind Khorana oraz Robertem Holleyem zostali uhonorowani Nagrodą Nobla z medycyny w 1968 roku [70,71]. Bardzo ważnym krokiem w badaniach nad genomem było odkrycie enzymów pozwalających na manipulację DNA. W latach 50. XX w. szwajcarski mikrobiolog Werner Arber mówił o tym, że bakterie oddziałują z wirusami je atakującymi (tzw. fagami lub bakteriofagami) przez „modyfikację restrykcyjną”, czyli reakcję enzymatyczną kontrolowaną genetycznie. Enzym restrykcyjny ma na celu identyfikację specyficznej grupy nukleotydów i przecięcie DNA w określonym miejscu. Reakcja ta, ze względu na swoje potencjalne zastosowania, budziła duże zainteresowanie. W 1972 roku Hamilton Smith wyizolował po raz pierwszy enzym restrykcyjny typu II (nazwany Hind II), który opisał teoretycznie w 1970 r. [72,73]. W toku dalszych badań ustalono, że enzymy restrykcyjne rozpoznają zwykle fragment DNA o długości 4-8 par zasad. Wykorzystanie enzymów restrykcyjnych pozwala na identyfikowanie konkretnych sekwencji w łańcuchu DNA i na manipulowanie DNA, w połączeniu z dodatkowymi metodami biologii molekularnej. Obecnie znamy ponad 3000 enzymów restrykcyjnych. Za 1958 Matthew Meselson i Franklin Stahl opisują mechanizm replikacji DNA 1961 – 1966 Marshall Nirenberg, Robert Holley, Har Gobind Khorana, Heinrich Matthaei wraz z współpracownikami łamią kod genetyczny 1968 – 1970 Werner Arber, Hamilton Smith i Daniel Nathans wykorzystują enzymy restrykcyjne do przecięcia DNA w określonym miejscu swoje badania Hamilton Smith, Werner Arber oraz Daniel Nathans trzymali Nagrodę Nobla z medycyny w 1978 roku [74]. W tym samym roku, w którym wyizolowano pierwszy enzym restrykcyjny (1972), Paul Berg doniósł o pierwszej udanej próbie syntezy rekombinowanego DNA. Za pomocą enzymów restrykcyjnych przeciął w odpowiednich miejscach koliste cząsteczki dwóch wirusów (małpi wirus SV40 oraz bakteriofag L), a następnie połączył je ze sobą po serii reakcji chemicznych [75]. Swoją metodę określił jako „ogólną, oferującą podejście do kowalencyjnego łączenia razem dowolnych dwóch cząsteczek DNA”. Berg zrezygnował z wcześniejszych planów wprowadzenia rekombinowanego DNA do komórki z powodów etycznych i nacisków środowiska [76]. W 1973 roku Herbert Boyer i Stanley Cohen przeprowadzili eksperymenty dotyczące rekombinowanego DNA, wprowadzając produkt swoich badań do organizmu żywego. Badania prowadzono na plazmidowym fragmencie bakterii E. coli odpornym na tetracyklinę. W trakcie badań, za pomocą enzymu restrykcyjnego rozrywali kolistą formę plazmidu i wprowadzali dodatkowy gen kodujący odporność na inny antybiotyk – kanamycynę. Po wprowadzeniu genu plazmid ponownie zamykano do postaci kolistej i wprowadzano do żywej bakterii [77]. Bakterie potomne okazały się być oporne zarówno na tetracyklinę, jak i na kanamycynę. Badania te w dużym stopniu wpłynęły na postępy w genetyce molekularnej i biochemii [78]. W 1980 roku Berg został jednym z nagrodzonych Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii za „fundamentalne badania nad biochemią kwasów nukleinowych ze szczególnym uwzględnieniem rekombinacji DNA” [79,80]. Innymi nagrodzonymi tą prestiżową nagrodą w tym samym roku zostali Walter Gilbert oraz Frederick Sanger za „wkład w określenie sekwencji zasad w kwasach nukleinowych”. W 1977 roku opracowano nowe metody pozwalające na szybkie sekwencjonowanie DNA. Metoda Gilberta-Maxama zakładała namnażanie fragmentu DNA w bakteriach i znakowanie radioaktywne każdej z nici w celu rozszczepienia ich wzdłuż zasad azotowych. Następnie fragment DNA był rozbijany na mniejsze kawałki o różnej 1972 Paul Berg wykorzystuje enzymy restrykcyjne do przygotowania pierwszego fragmentu rekombinowanego DNA 1977 Frederick Sanger, Allan Maxam i Walter Gilbert udoskonalają metodę sekwencjo-nowania DNA długości i poddawany elektroforezie żelowej pozwalającej na rozdzielenie DNA ze względu na długość łańcucha. Analiza końcowych punktów przecięcia umożliwiała określenie kolejności poszczególnych zasad azotowych [81]. Innym sposobem sekwencjonowania DNA jest metoda Sangera, wykorzystująca cząsteczki „kończące łańcuch” („chain-terminating”). W tej metodzie używa się DNA jednoniciowego, którego kopie syntezuje z pomocą polimerazy DNA. Próbkę dzieli się na cztery części i do każdej dołącza się zmodyfikowaną, znakowaną zasadę azotową (tzw. dideoks), która kończy łańcuch DNA. W następnym kroku sekwencja zasad odczytywana była z wyniku elektroforezy żelowej [82]. Opisane tu metody sekwencjonowania DNA pozwoliły na odczytanie sekwencji nukleotydów dla całych genów (długość od 1000 do 30 000 par zasad) [83]. W toku dalszych badań nad sekwencjonowaniem udoskonalano opisane metody, a w 1986 roku firma Applied Biosystem Incorporated (API) przedstawiła pierwszy automatyczny sekwenser, czyli urządzenie oparte na metodzie sekwencjonowania enzymatycznego Sangera (będącej obecnie standardem laboratoryjnym). Automatyczny sekwenser nie wykorzystuje jednak znaczników radioaktywnych, ale barwniki fluorescencyjne, które kolorystycznie różnicują poszczególne zasady azotowe [84]. W 1983 roku [85] rozpoczęły się prace nad metodą pozwalająca na powielanie materiału genetycznego, która wykorzystywała odkrytą przez Arthura Kornberga w 1955 roku polimerazę DNA. Polimeraza w naturalnych warunkach wykorzystywana jest do naprawy i replikacji fragmentów łańcuchów poprzez dobudowywanie komplementarnej nici do pojedynczego łańcucha DNA [86]. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) powielająca DNA opracowana została przez Karry’ego Mullisa i składa się z następujących po sobie sekwencji: a. Rozdzielenie DNA na pojedyncze łańcuchy poprzez podgrzanie (denaturacja); b. Wiązanie starterów – krótkich oligonukleotydów komplementarnych do poszczególnych końców pojedynczej nici DNA (hybrydyzacja); c. Synteza nici komplementarnej (elongacja) [87]. 1982 Na rynku pojawia się pierwszy lek oparty na rekombinowanym DNA – ludzka insulina 1983 Kary Mullis opracowuje technikę PCR pozwalającą na powielanie DNA in vitro Reakcję PCR szeroko wykorzystuje się w badaniach genetycznych, ponieważ jest łatwo automatyzowalna, specyficzna i czuła. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzi DNA, które ma być powielone, mieszanina nukleotydów (wykorzystywane do budowy nowych nici DNA), startery oraz polimeraza DNA. W 2020 roku jedna z modyfikacji reakcji PCR (real time PCR) znalazła zastosowanie w diagnostyce wirusa SARS-Cov-2. Mając techniczne narzędzia pozwalające na odczytywanie sekwencji DNA, w połowie lat 80. XX wieku rozpoczęły się dyskusje o projekcie, który pozwoliłby poznać genom człowieka. W 1990 roku Departament Energii USA i Narodowe Instytuty Zdrowia USA podjęły decyzję o rozpoczęciu projektu Human Genome Project, przeznaczając na ten cel 3 mld USD. Zakładano, że w ciągu 15 lat naukowcy przedstawią pełną sekwencję DNA człowieka. Do projektu włączone zostały różne państwa (poza Stanami Zjednoczonymi m.in. Chiny, Francja, Wielka Brytania, Niemcy czy Japonia). Od rozpoczęcia badań, mających na celu poznanie kompletnej sekwencji ludzkiego DNA, grupy badawcze kolejno donosiły o następnych sukcesach. Już w 1995 roku przedstawiono kompletny genom pierwszego organizmu – bakterii Haemophilus influenzae Rd [88]. 2000 rok przyniósł kompletną sekwencję genetyczną zasłużonej w badaniach nad DNA muszki owocówki Drosphili [89], a w 2002 roku gotowy był cały genom pierwszego ssaka – myszy [90]. Ostatecznie 14 kwietnia 2003 roku naukowcy podsumowali projekt Human Genome Project stwierdzając, że udało się zsekwencjonować 99,9% genomu człowieka z trafnością 99,99% [91]. W wyniku badań okazało się, że ludzki genom tworzy 3 300 000 000 par zasad składających się na około 22 000 różnych genów. Obecnie prowadzone są prace mające na celu określenie sekwencji genowych pozostałych organizmów żywych [92]. Poznanie genomu ludzkiego może okazać się przydatne w wielu dziedzinach m. in. medycynie, biologii molekularnej, wiedzy o ewolucji, kryminalistyce, bioarcheologii czy antropologii. 1990 Rozpoczynają się prace nad sekwencjono-waniem ludzkiego genomu (Human Genome Project) 1995 Zaprezentowano pierwszy kompletny genom dla bakterii „Haemophilus influenzae” 1996 Pierwsze w historii udane klonowanie ssaka – owca Dolly 1999 Opublikowano pełną sekwencję ludzkiego chromosomu (22) 2002 Określono dokładnie genom pierwszego ssaka – myszy 2003 Prace nad sekwencjono-waniem genomu ludzkiego zakończyły się sukcesem 2013 Odkryto różnice w składzie genomu u bliźniąt jednojajowych Bibliografia [1] DNA Worldwide [Online]. Available: https://www.dna-worldwide.com/resource/160/history-dna-timeline. [Accessed 05 2020]. [2] Luna DNA [Online]. Available: https://www.lunadna.com/blog/history-of-dna/. [Accessed 05 2020] [3] J. Pickrell, New Scientist 2006. [Online]. Available: https://www.newscientist.com/article/dn9966-timeline-genetics/. [Accessed 05 2020]. [4] C. Darvin The Origin of Species By Means of Natural Selection, or the Preservation of Favoured Races in the Struggle for Life. Cambridge University Press, 2009 (oryginał 1876). [5] S. Müller-Wille, Gregor Mendel and the History of Heredity. Handbook of the Historiography of Biology (2021): 105-126. [6] E. Schwarzbach, P. Smykal, O. Dostál Gregor J. Mendel - Genetics Founding Father. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 50.2 (2014): 43-51 [7] G. Mendel, Experiments in Plant Hybridization. 1865. Verhandlungen des naturforschenden Vereins Brünn.) Available online: www. mendelweb. org/Mendel. html (accessed on 1 January 2013) (1996) [8] R. Dahm From discovering to understanding. 2010, EMBO reports 11.3 (2010): 153-160. [9] R. Dahm Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years. Human genetics 122.6 (2008): 565-581. [10] E. Haeckel,. Generelle Morphologie der Organismen: Bd. Allgemeine Entwickelungsgeschichte der Organismen. Vol. 2. G. Reimer, 1866. [11] W. His, Histochemiczne i fizjologiczne prace Friedricha Mieschera Z korespondencji naukowej F. Mieschera, 1869 – 1871 [12] F. Miescher, Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen, Medicinisch-chemische Untersuchungen 4 (1871) [13] P. Plósz, Ueber das chemische Verhalten der Kerne der Vogel-und Schlangenblutkörperchen, Medicinisch-chemische Untersuchungen 4 (1871) [14] F. Hoppe-Seyler, Medicinisch-chemische Untersuchungen 4 (1871) [15] F. Meischer. Die Spermatozoen einiger Wirbeltiere. Ein Beitrag zur Histochemie. Konferencja towarzystwa nauk przyrodniczych w Bazylei, 1874 [16] N. Paweletz, Walther Flemming: pioneer of mitosis research Nature reviews Molecular cell biology 2.1 (2001): 72-75. [17] L. Bromham, An introduction to molecular evolution and phylogenetics. Oxford University Press, 2016. [18] A. Weismann, Ueber die Vererbung: ein Vortrag. Verlag von Gustav Fischer, 1883. [19] D. Noble, Central dogma or central debate? journals.physiology.org (2018): 246-249. [20] A. Weismann, The germ-plasm: a theory of heredity, Scribner's, 1893. [21] Encyklopedia Britannica, Eduard Adolf Strasburger, Encyclopædia Britannica , 28 01 2020. [Online]. Available: https://www.britannica.com/biography/Eduard-Adolf-Strasburger. [Accessed 15 05 2020] [22] B. Hryniewiecki, Prof. dr. Edward Strasburger (1844–1912). Jego życie i dzieła. Polskie Towarzystwo Botaniczne, 1938. [23] E. Strasburger, Historja rozwoju zarodników u glewika : studjum nad dzieleniem się komórek Wiadomości z Nauk Przyrodzonych, 1880. [24] D. Clift, M. Schuh, Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis, Nature reviews Molecular cell biology 14.9 (2013): 549-562. [25] O. Hertwig, Das Problem der Befruchtung und der Isotropie des Eies: eine Theorie der Vererbung. G. Fischer, 1884. [26] M. Cobb, An amazing 10 years: the discovery of egg and sperm in the 17th century Reproduction in Domestic Animals 47 (2012): 2-6. [27] M. Lesney, The Scientists: A History of Science Told through the Lives of Its Greatest Inventors: Gribbin, John: New York: Random House 672 pp., Publication Date: October 2003." (2004): 91-92. [28] A. Zubek, A. Belter, M. Z. Naskręt-Barciszewska, S. Jurga, W. T. Markiewicz, J. Barciszewski 150. rocznica odkrycia DNA. Zapomniany Richard Altmann z Iławy, Nauka (2019): 137-148. [29] M. Cobb, A Speculative History of DNA: What If Oswald Avery Had Died in 1934? PLoS biology 14.12 (2016): e2001197 [30] R. Altmann Archiv für Anatomie und Physiologie. Physiologie, 1889, str. 524. [31] M. Kottler, Hugo de Vries and the rediscovery of Mendel's laws, Annals of science 36.5 (1979): 517-538. [32] M. Simunek, U. Hoßfeld, V. Wissemann, ‘Rediscovery’revised–the cooperation of Erich and Armin von Tschermak‐Seysenegg in the context of the ‘rediscovery’of Mendel’s laws in 1899–1901 1, Plant Biology 13.6 (2011): 835-841. [33] H. Rheinberger, When did Carl Correns read Gregor Mendel's paper? A research note. Isis 86.4 (1995): 612-616. [34] LA-CP. Martins, Did Sutton and Boveri propose the so-called Sutton-Boveri chromosome hypothesis?. (1999): 261-272. [35] F. Maderspacher, Theodor Boveri and the natural experiment. Current Biology 18.7 (2008): R279-R286. [36] DNA from the begginig, [Online]. Available: http://www.dnaftb.org/13/bio.html. [Zacytowano grudzień 2020]. [37] A.E. Garrod, The incidence of alkaptonuria: a study in chemical individuality. The Lancet 160.4137 (1902): 1616-1620. [38] A.E. Garrod, Inborn errors of metabolism. Frowde. (1909). [39] W. Johannsen, The genotype conception of heredity. The American Naturalist 45.531 (1911): 129-159. [40] J. Wanscher, The history of Wilhelm Johannsen's genetical terms and concepts from the period 1903 to 1926. Centaurus 19.2 (1975): 125-147. [41] R. Falk, Commentary: A century of Mendelism: on Johannsen's genotype conception, International journal of epidemiology 43.4 (2014): 1002-1007. [42] D. Kenney, G. Borisy, Thomas Hunt Morgan at the marine biological laboratory: naturalist and experimentalist. Genetics 181.3 (2009): 841-846. [43] Albrecht Kossel – Facts. [Online] Nobel Media AB 2021. [Zacytowano: 11.01.2021.] https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1910/kossel/facts/. [44] A. Kossel, The Chemical Composition of the Cell Nucleus. [Online] Nobel Media AB 2021, 12.12.1910. [Zacytowano: 11.01.2021.] https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1910/kossel/lecture/. [45] P. A. Levene, The structure of yeast nucleic acid, Journal of Biological Chemistry 31.3 (1917): 591-598. [46] L. Pray, Discovery of DNA Structure and Function: Watson and Crick, Nature Education, 2008. [Online]. Available: https://www.nature.com/scitable/topicpage/discovery-of-dna-structure-and-function-watson-397/. [Accessed 11 01 2021]. [47] G. Beadle, E. Tatum. Genetic control of biochemical reactions in Neurospora. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 27.11 (1941): 499. [48] G. Beadle, E. Tatum. Neurospora. II. Methods of producing and detecting mutations concerned with nutritional requirements. American Journal of Botany 32.10 (1945): 678-686. [49] Khan Academy Jeden gen, jeden enzym, [Online]. Available: https://pl.khanacademy.org/science/biology/gene-expression-central-dogma/central-dogma-transcription/a/one-gene-one-enzyme-hypothesis. [Accessed 06 02 2021]. [50] Genetics and Genomics Timeline, Genome News Network, [Online]. Available: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1941_Beadle_Tatum.php. [Accessed 06 02 2021]. [51] F. Griffith, The significance of pneumococcal types." Epidemiology & Infection 27.2 (1928): 113-159. [52] A. W. Downie, Pneumococcal Transformation-A Backward View Fourth Griffith Memorial Lecture. Microbiology 73.1 (1972): 1-11. [53] O. Avery, C. MacLeod, M. McCarty. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III." Journal of experimental medicine 79.2 (1944): 137-158. [54] Genetics and Genomics Timeline, Genome News Network, [Online]. Available: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1944_Avery.php. [Accessed 06 02 2021]. [55] Gene is made of DNA., DNA from the beginning, [Online]. Available: http://www.dnaftb.org/17/. [Accessed 06 02 2021]. [56] J. Barciszewski, W. Markiewicz, Kwasy nukleinowe. Kod genetyczny, Polskie i światowe osiągnięcia nauki. Nauki biologiczne, Gliwice, Fundacja im. Wojciecha Świętosławskiego na Rzecz Wspierania Nauki i Rozwoju Potencjału Naukowego w Polsce, 2010, p. 54. [57] D. Elson, E. Chargaff, On the desoxyribonucleic acid content of sea urchin gametes. Experientia 8.4 (1952): 143-145. [58] E. Chargaff, R. Lipshitz, C. Green. Composition of the desoxypentose nucleic acids of four genera of sea-urchin. J Biol Chem 195.1 (1952): 155-160. [59] E. Schrödinger, Czym jest życie?: fizyczne aspekty żywej komórki; Umysł i materia; Szkice autobiograficzne. Prószyński i S-ka, 1998. [60] A. Sayre Rosalind Franklin and DNA. W. W. Norton & Company, 2000. [61] E. Chargaff, R. Lipshitz, C. Green Composition of the deoxypentose nucleic acids of four genera of sea-urchin. Journal of Biological Chemistry. 1952, Tom 195, 1, strony 155-160. [62] J. Watson, F. Crick. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature 171.4361 (1953): 964-967. [63] R. Franklin, R. Gosling. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature 171.4356 (1953): 740-741. [64] F. Crick, J. Watson. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids. Nature 171 (1953): 738-740. [65] I. Lehman, M. Bessman, E. Simms, A. Kornberg, Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid: I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 233.1 (1958): 163-170. [66] F. Crick, F. Sanders. Symposia of the Society for Experimental Biology, Number XII: The Biological Replication of Macromolecules. (1958): 138-163. [67] F. Crick, Central dogma of molecular biology. Nature 227.5258 (1970): 561-563. [68] Genetics and Genomics Timeline 1957, 1960, Genome News Network, [Online]. Available: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1960_mRNA.php. [Accessed 06 02 2021]. [69] M. Cobb, Who discovered messenger RNA?. Current Biology 25.13 (2015): R526-R532. [70] P. Leder, M. Nirenberg. RNA codewords and protein synthesis, III. On the nucleotide sequence of a cysteine and a leucine RNA codeword. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 52.6 (1964): 1521. [71] M. Nirenberg, F.Sjoestrand, Polyribosomes and dna-dependent amino acid incorporation in Escherichia coli extracts. Journal of molecular biology 10 (1964): 536-540. [72] H. Smith, K. Welcox. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: I. Purification and general properties. Journal of molecular biology 51.2 (1970): 379-391. [73] T. Kelly, H. Smith. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae: II. Base sequence of the recognition site. Journal of molecular biology 51.2 (1970): 393-409. [74] Genetics and Genomica Timeline 1970, Genome News Network, [Online]. Available: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1970_Smith.php. [Accessed 07 02 2021]. [75] D. Jackson, R. Symons, P. Berg. Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences 69.10 (1972): 2904-2909. [76] Genetics and Genomics Timeline 1972, Genome News Network, [Online]. Available: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1972_Berg.php. [Accessed 07 02 2021]. [77] S. Cohen, A. Chang, H. Boyer, R. Helling, Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences 70.11 (1973): 3240-3244. [78] Genetics and Genomics Timeline 1973, Genome News Ntwork, [Online]. Available: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1973_Boyer.php. [Accessed 07 02 2021]. [79] The Nobel Prize in Chemistry 1980, The Nobel Prize, [Online]. Available: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1980/summary/. [Accessed 07 02 2021]. [80] Paul Berg, The Paul Berg Papers, Recombinant DNA Technologies and Researchers Responsibilities, 1973-1980, U.S. National Library of Medicine , [Online]. Available: https://profiles.nlm.nih.gov/spotlight/cd/feature/dna. [Accessed 07 02 2021]. [81] A. Maxam, W. Gilbert. A new method for sequencing DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 74.2 (1977): 560-564. [82] F. Sanger, S. Nicklen, A. Coulson. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the national academy of sciences 74.12 (1977): 5463-5467. [83] Genetics and Genomics Timeline 1977, Genone News Network, [Online]. Available: http://www.genomenewsnetwork.org/resources/timeline/1977_Gilbert.php. [Accessed 07 02 2021]. [84] L. Smith, J. Sanders, R. Kaiser, P. Hughes, C. Dodd, C,Connell, C. Heiner, S.Kent, L. Hood. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 321.6071 (1986): 674-679. [85] K. Mullis, The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American 262.4 (1990): 56-65. [86] R. Saiki, D. Gelfand, S. Stoffel, S. Scharf, R. Higuchi, G. Horn, K. Mullis, H. Erlich. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239.4839 (1988): 487-491. [87] K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Horn, H. Erlich. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology. Vol. 51. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. [88] R. Fleischmann, M. Adams, O. White, R. Clayton, E., Kirkness, A. Kerlavage, ... J. Venter, Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269.5223 (1995): 496-512. [89] E. Myers, G. Sutton, A. Delcher, I. Dew, D. Fasulo, M. Flanigan, ... J. Venter, A whole-genome assembly of Drosophila. Science 287.5461 (2000): 2196-2204. [90] R. Waterston, L. Pachter. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature 420.6915 (2002): 520-562. [91] Institut de biologie François Jacob – Accueil, www.genoscope.cns.fr, 14 04 2003. [Online]. Available: https://web.archive.org/web/20060420000816/http://www.genoscope.cns.fr/externe/English/Actualites/Presse/HGP/HGP_press_release-140403.pdf. [Accessed 08 02 2021]. [92] Genomic Science Program, U.S Department of Energy, [Online]. Available: https://genomicscience.energy.gov/. [Zacytowano 08 02 2021].