The role of AT4G25290 protein in Arabidopsis thaliana responses to abiotic stress: UV and high temperature

AT4G25290 jest niescharakteryzowanym dotąd białkiem występującym u Arabidopsis thaliana. Na jego N-końcu występuje domena fotoliazowa, która mogłaby brać udział w naprawie dimerów pirymidynowych powstających w DNA pod wpływem UV-B, jednak aktywność fotoliazowa AT4G25290 nie została potwierdzona. C-końcowa domena hydrolazowa, pełniąca nieznaną funkcję, wykazuje homologię do feofitynazy, biorącej udział w procesie degradacji chlorofilu podczas starzenia się liści u A. thaliana. Celem pracy było zbadanie wpływu AT4G25290 na indukowaną UV degradację chlorofilu i odpowiedź roślin na stres wysokiej temperatury oraz wklonowanie genu AT4G25290 do plazmidu pEAQ-HT w celu późniejszej produkcji tego białka. W pracy zastosowano szereg metod obejmujących klonowanie molekularne, ilościowy PCR, pomiary fluorescencji chlorofilu a, wysokosprawną chromatografię cieczową oraz test histochemiczny. Wykazano, że wysoka temperatura indukuje ekspresję AT4G25290 na poziomie mRNA. W teście histochemicznym wykonanym na roślinach transgenicznych z genem reporterowym pod kontrolą promotora AT4G25290 nie zaobserwowano ani zahamowania, ani zwiększenia aktywności tego promotora w warunkach szoku cieplnego. Porównano również fenotyp siewek typu dzikiego i mutantów at4g25290 stresowanych wysoką temperaturą. Na podstawie uzyskanych wyników można przypuszczać, że brak funkcjonalnego białka AT4G25290 obniża termotolerancję A. thaliana, jednak na obecnym etapie badań nie można tej hipotezy jednoznacznie potwierdzić. Zaobserwowane różnice w zawartości barwników fotosyntetycznych (np. wyższa zawartość chlorofilu a i b u mutantów at4g25290 niż u roślin typu dzikiego) oraz wydajności fotosyntezy w roślinach poddanych działaniu UV nie są istotne statystycznie. Nie udało się osiągnąć ostatniego celu pracy, jakim było wklonowanie genu AT4G25290 do plazmidu pEAQ-HT. W pracy wskazano na konieczność modyfikacji warunków niektórych eksperymentów oraz zaproponowano kierunek dalszych badań.

AT4G25290 is an uncharacterized Arabidopsis thaliana protein. N-terminal photolyase domain could be involed in repair of UV-B-induced pyrimidine dimers in DNA, but photolyase activity of AT4G25290 has not been confirmed yet. C-terminal hydrolase domain of unknown function exhibits homology with pheophytinase, which participates in chlorophyll degradation during leaf senescence in A. thaliana. The aim of this work was to investigate the impact of AT4G25290 on chlorophyll degradation induced by UV and plant responses to heat stress as well as cloning of AT4G25290 gene into pEAQ-HT vector with the goal of subsequent protein production. A range of methods was used during this work, including molecular cloning, real time PCR, chlorophyll a fluorescence measurements, high-performance liquid chromatography and histochemical staining. It was shown that high temperature induces AT4G25290 expression on mRNA level. Histochemical staining with the use of transgenic plants with reporter gene under control of AT4G25290 promoter demonstrated neither inhibition nor induction of this promoter by heat stress. Phenotypes of wild type and at4g25290 mutant seedlings treated with high temperature were compaired. On the basis of the results obtained it can be assumed that the loss of functional AT4G25290 protein decreases thermotolerance in A. thaliana. However, this hipothesis cannot be confirmed at this stage of research. The observed differences in photosynthetic efficiency and photosynthetic pigments content (e.g. higher content of chlorophyll a and chlorophyll b in at4g25290 mutant than in wild type) were found to be statistically insignificant. Cloning of AT4G25290 gene into pEAQ-HT vector was unsuccessful. It was indicated that some experiments need to be modified and directions for futher research were proposed.