Określenie struktury i badania funkcjonalne dehydrogenazy 2-hydroksykwasów z Sinorhizobium meliloti

Rodzina dehydrogenaz 2-hydroksykwasów zawiera w sobie szeroką grupę enzymów należących do oksydoreduktaz NAD(P)(H) zależnych, które pełną kluczową rolę w metabolizmie wielu organizmów. Enzymy te przeprowadzają odwracalną redukcję ketokwasów karboksylowych do hydroksykwasów. Ta stereospecyficzna redukcja grupy karbonylowej jest szczególnie interesująca z punktu widzenia wytwarzania chiralnych związków, które mają szerokie zastosowanie jako środki farmaceutyczne. Wiele enzymów z tej rodziny jest dobrze scharakteryzowanych, zarówno strukturalnie jak i biochemicznie. Jednakże funkcja wielu przedstawicieli z tej grupy nie może być przewidziana jedynie na podstawie dopasowania sekwencji, ze względu na niskie podobieństwo sekwencji. Przeprowadzone badania skupione są na przedstawicielu rodziny dehydrogenaz 2-hydroksykwasów pochodzącego z Sinorhizobium meliloti: bakterii żyjącej w symbiotycznej relacji z roślinami strączkowymi. S. meliloti posiada zdolność do przemiany azotu atmosferycznego w amoniak, który jest następnie wykorzystywany przez rośliny jako źródło azotu.Celem niniejszych badań było określenie struktury enzymu nalężącego do rodziny dehydrogenaz 2-hydroksykwasów pochodzącego z S. meliloti (NYSGRC białko 011884), identyfikacja najlepszego kofaktora oraz substratów na podstawie badań kinetyki reakcji, klasyfikacja na podstawie zidentyfikowanej funkcji katalitycznej oraz charakteryzacja funkcji enzymu w symbiotycznym organizmie. Białko zostało wyekspresjonowane, oczyszczone, a następnie przy wykorzystaniu krystalografii rentgenowskiej została określona jego struktura przestrzenna. Dwie struktury zostały rozwiązane i zdeponowane w PDB: kompleks z NADP i siarczanem (4WEQ, 2.0 Å) oraz kompleks z NADPH i kwasem szczawiowym (4Z0P, 1.7 Å). Struktura ze związanym NADPH i kwasem szczawiowym jest szczególnie ważna, ze względu na substrat związany w centrum aktywnym enzymu. Związek posiada grupę chemiczną, na której powinien działać enzym, i tym samym ów potrójny kompleks białko-NADPH-kwas szczawiowy reprezentuje analog kompleksu Michaelisa. Analiza kompleksu, poszerza wiedzę na temat rodziny dehydrogenaz 2-hydroksykwasów.

The 2-hydroxyacid dehydrogenase family (2HADH) contains a broad enzyme group of NAD(P)(H)-dependent oxidoreductases with key roles in many organisms’ metabolism. Those enzymes perform reversible reduction of 2-ketocarboxylic acids to hydroxyacids. The stereospecific reduction of carbonyl group is of interest for the production of chiral compounds which are broadly used as pharmaceuticals. Many members of the family are well characterized both structurally and biochemically. However, the function of a number of members cannot be predicted solely based on sequence alignments due to low sequence identity. This study is focused on a 2HADH family member from Sinorhizobium meliloti: a symbiotic bacterium living in common soil and inhabiting nodules on the roots of legumes. It has an ability to convert atmospheric nitrogen into ammonia which is used by the plants as a source of nitrogen, a process called nitrogen fixation.The goal of the study is to determine the crystal structures of a member of 2HADH from S. meliloti (NYSGRC target 011884), identify its best cofactor and substrates based on kinetic assay analysis calculated parameters, classify it according to the identified catalytic function, and characterize its function in the symbiotic organism.The protein was expressed, purified, crystallized and subsequently the 3-D structures were determined by X-ray crystallography. Two structures have been solved, refined and deposited in the PDB: a complex with NADP and sulfate (4WEQ, 2.0 Å) and complex with NADPH and oxalate (4Z0P, 1.7 Å). The complex with NADPH and oxalate is of particular importance, because it was crystallized with oxalate bound in active site of the enzyme. This compound contains the chemical group on which enzyme is supposed to act, and therefore the triple complex protein-NADP-oxalate represents the dead-end analogue of Michaelis complex. The complex analysis, broadens the structure-functional knowledge about the 2HADH family.