Staphylococcus aureus jest szeroko rozpowszechnionym drobnoustrojem, który w sposób bezobjawowy, stale lub przejściowo, kolonizuje blisko 60% populacji ludzkiej. Gronkowiec złocisty odpowiedzialny jest za szerokie spektrum zakażeń, rozciągające się od niegroźnych dolegliwości skórnych, aż do poważnych stanów zagrażających życiu i zdrowiu, takich jak zapalenie opon mózgowych czy zapalenie płuc. W ostatnich latach zaobserwowano alarmujący wzrost oporności gronkowca na dostępne antybiotyki, który doprowadził do wzrostu liczby ciężkich do wyleczenia zakażeń. Powstała sytuacja spowodowała, że fizjologia i patogeneza S. aureus jest przedmiotem intensywnych badań naukowych, zwłaszcza w kontekście poszukiwania nowych strategii terapeutycznych. Gronkowiec złocisty posiada zdolność oddziaływania na organizm gospodarza dzięki wytwarzaniu wielu czynników wirulencji, wśród których ważną rolę odgrywają proteazy sekrecyjne. Bakterie te wydzielają do dziewięciu proteaz serynowych (proteaza V8, toksyna epidermolityczna A, toksyna epidermolityczna B, SplA, SplB, SplC, SplD, SplE, SplF), dwie proteazy cysteinowe (stafopaina A, stafopaina B) i jedną metaloproteazę (aureolizyna). Proteazy modulują przebiegający procesu infekcji poprzez inaktywację inhibitorów proteaz gospodarza oraz peptydów antybakteryjnych, degradację immunoglobulin, białek kaskady dopełniacza, modyfikację powierzchni bakterii czy też interakcję z komponentami szlaku krzepnięcia lub fibrynolizy. Mimo to, dostępna w literaturze charakterystyka składników gronkowcowego systemu proteolitycznego jest nadal daleka od pełnego zrozumienia. Jedna z proponowanych strategii zwalczania gronkowca zakłada skierowanie terapii na proteazy zewnątrzwydzielnicze. Podejście to wymaga jednak dalszych badań, szerszego zrozumienia i wyjaśnienienia wkładu proteaz sekrecyjnych w patogenezę gronkowca. Celem niniejszej pracy, jest charakterystyka biochemiczna i strukturalna wybranych proteaz serynowych, których geny zgrupowane są w obrębie operonu spl. Białka te są najmniej poznaną grupą proteaz gronkowcowych. Proteazy Spl wykazują duży stopień podobieństwa sekwencji do proteazy V8 oraz toksyn epidermolitycznych, które są ważnymi czynnikami wirulencji produkowanymi przez S. aureus. Pozwala to sądzić, że białka Spl są interesującym przedmiotem badań w kontekście zajadliwości patogenu. W chwili rozpoczęcia prac scharakteryzowano cztery z sześciu białek znajdujących się w tej grupie, a mianowicie: SplA, SplB, SplC oraz SplD. Pozostałe dwie proteazy SplE i SplF są przedmiotem badań opisanych w pracy doktorskiej. Prace rozpoczęto od uzyskania różnych konstruktów ekspresyjnych białka SplF, a następnie opracowano wydajną metodę produkcji i oczyszczania otrzymanych białek rekombinowanych. Uzyskane preparaty białkowe były wykorzystywane do dalszych badań. Otrzymano kryształy muteiny His39Ala białka SplF, które posłużyły do rozwiązania struktury krystalograficznej, która pomogła w wytłumaczeniu aktywności enzymatycznej analizowanej proteazy. Używając metody kombinatorycznych bibliotek syntetycznych substratów tetrapeptydowych LSTS (ang. Libraries of Synthetic Tetrapeptide Substrates), określono wstępnie specyficzność substratową proteazy SplF. Specyficzność ta została potwierdzona w dalszych badaniach polegających na trawieniu biblioteki białek, oraz analizie uzyskanych fragmentów przy pomocy spektrometrii mas. Otrzymane wyniki jednoznacznie wskazują, że proteaza SplF preferencyjnie rozpoznaje substraty zawierające leucynę lub metioninę w pozycji P1. Ponadto przeprowadzona została szczegółowa analiza kinetyczna, która pozwoliła wyjaśnić udział N-końca białka w kontroli jego aktywności. Druga część pracy obejmuje strukturalną analizę porównawczą dwóch białek rodziny Spl -białka SplB oraz SplE, która umożliwiła stworzenie modelu oddziaływania enzym-substrat. Wstępnie wytypowano reszty aminokwasowe odpowiedzialne za wąską specyficzność substratową obu białek, które zostały potwierdzone w szczegółowej analizie mutacyjnej. Przy użyciu techniki PS-SCL (ang. Positional Scanning Synthetic Combinatilonal Libraries) określono specyficzność substratową uzyskanych mutein. Potwierdzono, że na drodze ukierunkowanej mutagenezy muteina SplB uzyskała specyficzność substratową charakterystyczną dla proteazy SplE - tym samym zweryfikowano model rozpoznawania substratu. Każda z proteaz Spl charakteryzuje się indywidualną specyficznością substratową, która ma ścisłe powiązanie z ich swoistą budową przestrzenną, a tym samym czyni je ciekawym modelem do badań zależności pomiędzy specyficznością substratową, a strukturą przestrzenną enzymu. Wykazano, że subtelene zmiany kilku reszt aminokwasowych dają możliwość programowania potencjału proteolitycznego enzymu, co może znaleźć zastosowanie aplikacyjne. Ponadto, aktywność proteolityczna jest sciśle kontrolowana przez wewnętrzne mechanizmy zabezpieczając bakterie przed efektem nieporządanej aktywności wewnątrz komórki S. aureus. Przedstawione w pracy doktorskiej badania pozwoliły na stworzenie spójnego obrazu mechanizmu działania proteaz Spl, oraz możliwości manipulacji ich specyficznością.

Staphylococcus aureus is a prevalent microorganism. Approximately 60% of population have been reported as permanent or intermittent carriers of S. aureus. These bacteria are responsible for many health problems from minor skin infections to serious life-threatening illnesses, like meningitis and pneumonia. Recently, there has been an alarming increase in resistance of staphylococci to available antibiotics. A current situation requires a better understanding of physiology and pathogenesis of S. aureus in the context of the development of new therapeutic strategies. Therefore, these bacteria have become a subject of extensive research. S. aureus possesses an ability to colonize its host because of the production of many virulence factors, mainly extracellular proteases, which are important in microbial pathogenesis. A potential extracellular virulence factors with proteolytic activity consist of nine serine proteases (V8 protease, epidermolytic toxin A, epidermolytic toxin B, SplA, SplB, SplC, SplD, SplE, SplF), two cysteine porteases (staphopain A, staphopain B) and one metalloprotease (aureolysin). Secreted bacterial proteases probably play an important role in the infection process, for example by inactivation of host protease inhibitors and antibacterial peptides, decompose immunoglobulins and complement system components, play a role in surface modification, or interaction with components of the coagulation cascade. However, the characterization of the staphylococcal proteolytic system available in the literature is still far from completion. The doctoral thesis contains the biochemical and structural characterization of two serine proteases encoded in the spl operon. So far, these proteins were the least described group of staphylococcal proteases. The Spl proteases have a high sequence homology with the protease V8 and epidermolytic toxins, which are well-known virulence factors. Based on these premises it has been suggested that the Spl proteases are an interesting subject of research in the context of pathogenesis. At the moment, four of the six proteins in this group have been characterized, namely: SplA, SplB, SplC and SplD. The other two SplE and SplF proteases are the subjects of the research described in this doctoral dissertation. Various variants of the expression constructs of the SplF protease were obtained, and an efficient method of protein production and purification was developed for structural research and specificity studies. In order to explain the structural basis of substrate specificity of SplF, the crystal structure of His39Ala mutein was solved. The substrate specificity at position P1 was initially confirmed by using two combinatorial libraries of fluorogenic substrates (Ac-Ala-Arg-Leu-P1-ACC and Ac-Leu-Arg-Ser-P1-ACC). With the purpose of selecting the most kinetically preferred substrate and determining the substrate preference of SplF beyond the P1 subsite, libraries of synthetic tetrapeptide substrates (LSTS) were deconvoluted. The substrate specificity at position P1 was primarily selective for leucine and methionine. Additionally, the kinetic studies demonstrated the effect of the elongated N-terminus of SplF on proteolytic activity. The obtained results confirmed previous reports, indicating that the appropriately formed N-terminus is necessary for full proteolytic activity. Structural comparative analysis of the SplB and SplE proteins was performed in the context of substrate specificity. The amino acids responsible for the unique specificity of SplB and SplE were initially determined. In order to verify the hypothesis, a number of mutants of both proteases were designed. The substrate specificity of the obtained muteins was determined using the PS-SCL (Positional Scanning Synthetic Combinational Libraries) technique. The experiments partially confirmed the role of the tested amino acid residues in determining the unique substrate specificity of analysed proteases. Spl proteases have individual substrate specificities, which are closely related to their specific spatial structure, and makes them an interesting model for investigating the relationship between substrate specificity and the spatial structure of the enzyme. Investigations revealed, that the subtle change of several amino acid residues gives the opportunity to program the proteolytic potential of the enzyme, which can be used for application. In addition, the proteolytic activity is closely controlled by internal mechanisms, which are protecting the bacteria from an undesired activity within the S. aureus cell. The research, presented in the doctoral thesis, allowed to draw coherent picture of the mechanisms of action of Spl proteases, and the possibility of manipulating their specificity.