Krew pępowinowa (KP), jako bogate źródło komórek macierzystych (KM) - w szczególności KM krwiotwórczych (ang. hematopoietic stem cells; HSCs), stanowi obiecującą alternatywę dla przeszczepów szpiku kostnego u pacjentów z koniecznością rekonstytucji układu krwiotwórczego. Jej wykorzystanie w hematologii transplantacyjnej niesie ze sobą dodatkowe korzyści wynikające z nieinwazyjnego pobrania, mniej restrykcyjnych wymagań dopasowania antygenów zgodności tkankowej, a także zmniejszonego ryzyka wystąpienia choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. Z drugiej jednak strony, zastosowanie KP u dorosłych pacjentów wiąże się z ryzykiem opóźnionego wszczepienia u biorcy, będącego efektem niedostatecznej liczby podanych komórek HSCs obecnych w materiale, limitowanej objętością pobranej podczas porodu KP. Stąd też, skuteczne wykorzystanie preparatów KP w transplantologii, w tym u osób dorosłych, wciąż wymaga poszukiwania nowych strategii ekspansji komórek HSCs ex vivo, z jednoczesnym zwiększeniem ich potencjału hematopoetycznego i efektywności zasiedlania nisz szpikowych po przeszczepie. Z badań przeprowadzonych dotychczas w naszym zespole wynika, że zastosowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (ang. extracellular vesicles; EVs) - obłonionych struktur o średnicy od 30 nm do 1 μm, wydzielanych przez indukowane komórki macierzyste pluripotencjalne (ang. human induced pluripotent stem cells; hiPS) może zwiększać proliferację i modulować szereg funkcji innych komórek. EVs zawierają aktywne biologicznie molekuły, w tym receptory, białka cytoplazmatyczne, czynniki transkrypcyjne oraz kwasy nukleinowe (w szczególności mRNA oraz miRNA), które mogą być przenoszone pomiędzy komórkami, stanowiąc istotne parakrynne czynniki wymiany informacji. Stąd też, sukcesywnie wzrasta zainteresowanie badaczy próbami zastosowania EVs do modyfikacji funkcji biologicznych komórek docelowych. Dotychczasowe, nieliczne badania nad zastosowaniem EVs w modulacji potencjału regeneracyjnego komórek HSCs z KP koncentrują się głównie na pęcherzykach wydzielanych przez komórki stromalne niszy, a wciąż niewiele wiadomo na temat wpływu EVs pochodzących z innych typów KM na właściwości biologiczne komórek krwiotwórczych. W kontekście tych prac, interesującym było zbadanie czy EVs z komórek hiPS (hiPS-EVs) będą także wykazywać funkcjonalny efekt na komórki krwiotwórcze z KP, w kontekście możliwości ich potencjalnego zastosowania w hematologii transplantacyjnej. W związku z powyższym, celem niniejszej rozprawy doktorskiej było zbadanie wpływu hiPS-EVs na właściwości biologiczne i potencjał hematopoetyczny komórek HSCs z KP, zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo w modelu rekonstytucji szpikowej u myszy szczepu NOD/SCID. Przeprowadzone badania wykazały m.in., że hiPS-EVs mogą skutecznie oddziaływać z wysokooczyszczonymi frakcjami komórek KP, wzbogaconymi w HSCs i poddanymi ekspansji ex vivo. Pomimo braku znaczącego wpływu na tempo proliferacji, stymulacja za pomocą hiPS-EVs zwiększała aktywność metaboliczną komórek HSCs oraz ich różnicowanie w kierunku poszczególnych linii komórek hematopoetycznych in vitro. Wykazano również, że potencjał klonogenny komórek HSCs z KP ulega zwiększeniu po kontakcie z hiPS-EVs in vitro, a wyniki te korelowały ze wzrostem ekspresji genów związanych z hematopoezą w tych komórkach. Ponadto, przeprowadzone doświadczenia wskazują, że hiPS-EVs wykazują właściwości cytoprotekcyjne wobec komórek HSCs poddanych działaniu czynników cytotoksycznych. Dalsze analizy wykazały także wzrost właściwości adhezyjnych komórek HSCs oraz ich chemotaktycznej migracji in vitro, poddanych działaniu czynników obecnych w hiPS-EVs. W komórkach HSCs poddanych działaniu hiPS-EVs, zaobserwowano też istotne zmiany aktywności szeregu kinaz białkowych zaangażowanych w ważne szlaki sygnałowe, uczestniczące w regulacji wymienionych procesów. Uzyskane wyniki badań in vitro świadczą o zwiększeniu aktywności biologicznej oraz potencjału hematopoetycznego komórek HSCs z KP w wyniku działania bioaktywnej zawartości hiPS-EVs. Wyniki badań in vivo potwierdzają obserwacje uzyskane w badaniach in vitro. W szczególności, wykazano pozytywny wpływ hiPS-EVs na zdolność komórek HSCs z KP do zasiedlania nisz szpikowych i rekonstytucji układu krwiotwórczego u myszy NOD/SCID, poddanych uprzednio radiacyjnej mieloablacji. Podsumowując, w niniejszej rozprawie doktorskiej po raz pierwszy wykazano, że hiPS-EVs mogą modulować aktywność biologiczną komórek HSCs izolowanych z KP, a tym samym wpływać na ich cechy funkcjonalne istotne z punktu widzenia zastosowania tych komórek w hematologii transplantacyjnej. Otrzymane rezultaty badań stanowią podstawę do dalszych prac badawczych nad próbą zastosowania hiPS-EVs do zwiększenia potencjału regeneracyjnego tych komórek, a tym samym potencjalnego poszerzenia możliwości zastosowania KP w praktyce klinicznej.

Umbilical cord blood (CB) as a rich source of stem cells (SCs), especially hematopoietic stem cells (HSCs), is a promising material alternative for bone marrow transplantation in patients requiring the hematopoietic system reconstitution. Its utilization in the hematology provides additional benefits resulting from non-invasive collection, less stringent requirements for the donor matching as well as a reduced risk of graft-versus host disease. On the other hand, the use of CB cells in adult patients is associated with the risk of delayed engraftment resulting from the insufficient number of HSCs present in the transplanted material, which may be limited by the volume of CB unit collected during the delivery. Therefore, effective utilization of CB in the transplantology still requires the development of novel strategies of HSCs expansion ex vivo, with simultaneous increase in their hematopoietic potential and efficiency to engraft into the bone marrow niches after the transplantation. So far, the research conducted in our laboratory have shown that the use of extracellular vesicles (EVs) - vesicular structures with a diameter ranging from 30 nm to 1 μm, secreted by human induced pluripotent stem cells (hiPS) - can increase proliferation and modulate several functions of target cells. EVs are known to contain biologically active molecules including receptors, cytoplasmic proteins, transcription factors and nucleic acids (in particular mRNA and miRNA) that can be transferred between the cells mediating the exchange of biological information via transferring several paracrine factors. Hence, the scientific interest attempting the use of EVs to modify the biological functions of target cells is gradually increasing. Currently, few studies conducted on the use of EVs in modulation of the regenerative potential of CB-derived HSCs are mainly focused on vesicles secreted by stromal cells. Importantly, still little is known about the impact of EVs from other SCs types on the biological properties of hematopoietic cells. Thus, it was interesting to investigate whether EVs from hiPS cells (hiPS-EVs) will also possess a functional effect on CB-derived HSCs, in the context of their potential use in the hematology. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of hiPS-EVs on biological properties and hematopoietic potential of HSCs isolated from CB, both in vitro as well as in vivo, in the murine model of bone marrow reconstitution after mieloablative irradiation. The results obtained in this study showed that hiPS-EVs can effectively interact with highly purified CB-derived CD34+ fraction enriched in HSCs, subjected to ex vivo expansion. Despite the lack of a significant effect on the proliferation rate, the stimulation with hiPS-EVs significantly increased the metabolic activity of HSCs and their capacity to differentiate toward hematopoietic lineages in vitro. It was also shown that the clonogenic potential of CB-derived HSCs was enhanced after the contact with hiPS-EVs in vitro, and these results correlated with the increase in the expression of hematopoietic genes in those cells. In addition, performed experiments revealed that hiPS-EVs have a great cytoprotective effect on HSCs exposed to cytotoxic agents. Further analyzes have also shown an increase in the adhesion efficacy and chemotactic migration of CB-HSCs in vitro following the treatement with factors present in hiPS-EVs. Additionally, we also observed significant changes in the activity of a number of protein kinases involved in important signaling pathways in HSCs cells after the treatment with hiPS-EVs. Thus, obtained results of in vitro studies indicated that bioactive content of hiPS-EVs increased biological activity and hematopoietic potential of CB-derived HSCs. In next step, I also performed in vivo study supporting the results obtained from experiments conducted in vitro. In particular, it has been demonstrated that hiPS-EVs may have the positive effect on the ability of HSCs isolated from CB to home and engraft to bone marrow niches, as well as on the effectiveness of reconstitution of the hematopoietic system after the myeloablation in NOD/SCID mice. In conclusion, for the first time we demonstrated that hiPS-EVs can modulate the biological activity of CB-derived HSCs impacting on their functional properties important for their use in hematology. Our results constitute important basis for further research on potential employment of hiPS-EVs as effective agents increasing the regenerative potential of hematopoietic cells and in consequence enhancing the possibility for clinical applications of CB samples.