Komórki macierzyste (KM) od lat stanowią przedmiot szeregu badań, których celem jest m.in. poznanie biologii i mechanizmów działania tych komórek w odbudowie tkankowej, co daje nadzieje na ich praktyczne zastosowania w regeneracji uszkodzonych tkanek i narządów. Dotychczasowe wyniki wskazują, że jednym z istotnych mechanizmów odpowiedzialnych za efekty regeneracyjne zależne od KM jest ich aktywność parakrynna, związana z wydzielaniem szeregu bioaktywnych związków mających bezpośredni efekt na komórki endogenne w miejscu uszkodzenia. Populacją komórek, której w szczególności przypisuje się działanie parakrynne w stymulacji procesów naprawy tkankowej są komórki macierzyste mezenchymalne (ang. mesenchymal stem/ stromal cells, MSCs), pozyskiwane z różnych źródeł, w tym m.in. ze szpiku kostnego. Bioaktywne związki o działaniu parakrynnym mogą być wydzielane do środowiska bezpośrednio lub uwalniane w formie zamkniętej w tzw. pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (ang. extracellular vesicles, EVs) uwalnianych przez komórki, w tym KM, w warunkach fizjologicznych, jak i po aktywacji. EVs stanowią sferyczne obłonione pęcherzyki, które są nośnikami bioaktywnych cząsteczek pomiędzy komórkami, w tym m.in.: białek błonowych i cytoplazmatycznych, cząsteczek mRNA i mikroRNA oraz lipidów. Dzięki temu EVs odgrywają istotną rolę w komunikacji międzykomórkowej, zapewniając wymianę bioaktywnych związków pomiędzy różnymi komórkami wpływając wzajemnie na ich funkcje. Rosnąca liczba doniesień z badań światowych wskazuje, że również EVs wydzielane przez KM mogą modulować funkcje innych komórek, w tym endogennych komórek somatycznych, progenitorowych i macierzystych rezydujących w tkankach, zwiększając tym samym również procesy regeneracyjne zachodzące w tkankach. Celem badań wykonanych w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej było zbadanie właściwości biologicznych EVs wydzielanych przez mysie szpikowe komórki MSCs (MSC-EVs), w tym m.in. ich morfologii, fenotypu i składu molekularnego oraz ich wpływu na funkcje wybranych komórek somatycznych in vitro, a także potencjału regeneracyjnego MSC-EVs w mysich modelach uszkodzenia tkankowego in vivo, w tym: i) ostrego niedotlenienia mięśnia sercowego oraz ii) niedokrwiennego uszkodzenia kończyny. W pierwszym etapie wyizolowano oraz oceniono profil wieloantygenowy mysich szpikowych komórek MSCs, jako komórek rodzicielskich dla badanych EVs. Następnie z pożywek kondycjonowanych z hodowli komórek MSCs izolowano MSC-EVs - z zastosowaniem metody sekwencyjnego wirowania obejmującego ultrawirowanie. Wykazano, że MSC-EVs stanowią heterogenną populację pęcherzyków z przeważającą komponentą mikrofragmentów błonowych (ektosomów) o wielkości około 170 nm. Dalsze badania izolatów MSC-EVs wykazały m.in. obecność frakcji wykazujących ekspresję tetraspanin (CD9, CD63, CD81), co świadczy o zawartości frakcji egzosomalnej, a także potwierdziły wzbogacenie badanych EVs we frakcję ektosomów przenoszących na swojej powierzchni antygeny błonowe typowe dla komórek rodzicielskich, w tym antygenów CD29, CD44, CD90, Sca-1 oraz receptora dla VEGF. W kolejnych etapach obejmujących m.in. poszerzoną analizę proteomiczną oraz transkryptomiczną, wykazano, że MSC-EVs przenoszą szereg białek regulujących m.in. morfogenezę tkanek i struktur anatomicznych, odpowiedź na uszkodzenie, gojenie się uszkodzeń oraz odpowiedzialnych za komunikację i adhezję międzykomórkową, jak również transkrypty mRNA dla genów o działaniu proangiogennym oraz prokardiomiogennym, a także cąsteczki mikroRNA zaangażowane m.in. w regulację procesów regeneracji tkanek. W dalszych badaniach in vitro wykazano także wpływ MSCEVs na wybrane funkcje dojrzałych komórek śródbłonka naczyń serca, w tym na ich potencjał angiogenny. Wykazano także efekt cytoprotekcyjny MSC-EVs względem tych komórek, w warunkach imitujących mikrośrodowisko stanu zapalnego in vitro. W kolejnym etapie oceniono potencjał regeneracyjny izolowanych MSC-EVs w dwóch mysich modelach niedokrwiennego uszkodzenia tkankowego in vivo. W modelu ostrego niedotlenienia mięśnia sercowego obserwowano istotną poprawę parametrów hemodynamicznych pracy serca oraz zmniejszenie rozmiarów blizny pozawałowej u zwierząt, którym MSC-EVs przeszczepiano domięśniowo w strefie okołozawałowej miokardium - w porównaniu do zwierząt kontrolnych, po miesiącu od przeszczepu. Uzyskane wyniki potwierdziły pozytywny wpływ MSC-EVs na anatomię i funkcję uszkodzonego miokardium in vivo. W mysim modelu niedokrwiennego uszkodzenia kończyny in vivo, po 24 godzinach od dożylnego podania MSC-EVs, obserwowano ich akumulację w niedotlenionych tkankach, w porównaniu ze zdrową kończyną oraz innymi tkankami. Po dłuższym czasie obserwacji (po 21 dniach od przeszczepu) zaobserwowano zwiększenie perfuzji tkanek w uszkodzonej kończynie po dożylnym podaniu MSC-EVs - w porównaniu do myszy grupy kontrolnej, która korelowała m.in. z aktywacją szlaków proangiogennych oraz wyższą liczbą kapilar obecnych w tkankach. Wyniki uzyskane w tym modelu wskazują m.in. na proangiogenny efekt MSC-EVs w niedotlenionych tkankach in vivo. Podsumowując, w przeprowadzonych badaniach objętych niniejszą rozprawą doktorską wykazano, że EVs wydzielane przez mysie szpikowe komórki MSCs mogą przenosić szereg bioaktywnych cząsteczek, w tym białka zaangażowane m.in. w procesy naprawy uszkodzonych tkanek i organów oraz komunikację międzykomórkową, jak również transkrypty mRNA genów zaangażowanych w procesy angiogenezy i kardiomiogenezy oraz mikroRNA regulujące te procesy. MSC-EVs przenoszą także na swej powierzchni szereg antygenów charakterystycznych dla komórek MSCs, w tym cząsteczki adhezyjne i receptory biorące udział m.in. w angiogenezie. W badaniach in vitro, wykazano proangiogenny i cytoprotekcyjny efekt MSC-EVs w mysich komórkach śródbłonka naczyń, co może być wynikiem działania bioaktywnych cząsteczek przenoszonych przez MSC-EVs. Natomiast w mysich modelach niedokrwiennego uszkodzenia tkanek, wykazano poprawę anatomii oraz funkcji uszkodzonych organów, co potwierdza potencjał regeneracyjny MSC-EVs in vivo.

Stem cells (SCs) have been recently an important subject of many studies focusing on their biology and mechanisms of action in tissue regeneration, which may result in their practical application in regeneration of several damaged tissues and organs. Current evidence from in vitro and in vivo studies strongly indicate that major mechanisms of stem cell-mediated tissue repair include not only effective stem cell differentiation, but also secretion of several factors impacting on endogenous cells in a paracrine manner. The population, which particular is attributed to such paracrine effects in the stimulation of tissue repair processes, are mesenchymal stem/ stromal cells (MSCs) obtained from various sources including bone marrow. Bioactive compounds exerting paracrine activity can be released either directly into the environment or enclosed in extracellular vesicles (EVs) - secreted by cells (including SCs) under physiological conditions as well as after activation. EVs represent membraneenclosed spherical vesicles, which are carriers of bioactive molecules between cells such as e.g. membrane and cytoplasmic proteins, mRNAs, microRNAs and lipids. As a result, EVs play an important role in cell-to-cell communication ensuring an exchange of bioactive compounds between different cells and affecting their functions. Growing number of reports indicate that also EVs secreted by the SCs may modulate functions of other cells including endogenous somatic cells, progenitors and SCs residing in tissues, thereby increasing regenerative processes in the tissues. The aim of the research carried out under this doctoral thesis was to investigate the biological properties of EVs secreted by murine bone marrow- derived MSCs (MSC-EVs) including their morphology, phenotype and molecular composition as well as their influence on functions of selected somatic cells in vitro as well as their regenerative potential in murine models of tissue damage in vivo including in: i) acute myocardial infarction and ii) limb ischemia models. In the first step, bone marrow-derived MSCs were isolated and then their multiantigen profile was examined. MSCs were cultured under conditions in vitro that ensure their normal growth and phenotype and they constitute the parental cells for the EV studies. Then, MSC-EVs were isolated from the MSC conditioned media using a sequential centrifugation method including ultracentrifugation. MSC-EVs have been shown to contain a heterogeneous population of vesicles with the predominant component of membrane microfragments (ectosomes) of approximately 170 nm. Further studies conducted on EVs isolates showed presence of fractions expressing tetraspanins (CD9, CD63, CD81), which proves the content of exosomal fraction and confirmed the enrichment of the EVs in the ectosomal fraction possesing on their surface antigens typical for parental cells including CD29, CD44, CD90, Sca-1 antigens and the VEGFR2 receptor. In the next stages, molecular content of MSC-EVs was characterized and extended proteomic and transcriptomic analysis revealed that MSC-EVs carry a great number of regulatory proteins - including proteins involved in morphogenesis of tissues and anatomical structures, response to injury, wound healing and responsible for communication and intercellular adhesion, as well as mRNA transcripts for proangiogenic and procardiomyogenic genes and microRNA molecules involved in regulation of tissue regeneration processes. Further in vitro studies have also demonstrated the effect of MSCEVs on selected functions of mature vascular endothelial cells (ECs) including on their angiogenic potential. Then, the cytoprotective effect of MSC-EVs on ECs have also been demonstrated under inflammatory conditions in vitro. In the next stage, the regenerative potential of isolated MSC-EVs was evaluated in two murine models of ischemic tissue damage in vivo. In the first model of acute myocardial infarction (AMI), MSC-EVs were transplanted intramuscularly in the border zone of the AMI. One month after administration, in the group of mice treated with MSCEVs, a significant improvement in hemodynamic parameters of the heart and a reduction in the size of the post-infarction scar was observed when compared to animals in control groups. The obtained results confirmed the positive effect of MSC-EVs on the anatomy and function of damaged myocardium in vivo. The regenerative potential of MSC-EVs was then examined in a murine model of limb ischemia (LI) in vivo. At 24 hours after intravenous (i.v.) administration of MSC-EVs, retention of MSC-EVs was observed mainly in hypoxic tissues when compared to healthy limb and other tissues. At 21 days post injury, we observed statistically significant improvement of tissue perfusion in the injured limb when compared to control healthy limb after i.v. administration of MSC-EVs, compared to control groups, which correlated with the activation of proangiogenic pathways and a greater number of capillaries present in the muscle tissues. The results obtained in this model indicate the proangiogenic effect of MSC-EVs exerted in hypoxic tissues in vivo. In conclusion, the conducted studies have shown that EVs secreted by murine MSCs carry a great number of bioactive molecules including proteins involved e.g. in the processes of repairing damaged tissues and organs and intercellular communication, as well as mRNA transcripts for genes involved in angiogenesis and cardiomyogenesis and microRNAs involved in these processes. MSC-EVs also possess on their surface antigens characteristic for MSCs including adhesion molecules and receptors involved in angiogenesis. In in vitro studies, both pro-angiogenic and cytoprotective effects of MSCEVs have been demonstrated in murine ECs, which may be the result of the activity of bioactive molecules carried by MSC-EVs. In contrast, in murine models of ischemic tissue injury, improved anatomy and function of damaged organs has been demonstrated, which confirms the regenerative potential of MSC-EVs in vivo.