Do pozyskiwania czystych preparatów białkowych wykorzystuje się m.in. metody takie jak chromatografia jonowymienna, odziaływań hydrofobowych czy powinowactwa. Największą specyficznością charakteryzuje się ostatni z wyżej wymienionych typów chromatografii adsorpcyjnej polegającej na specyficznym oddziaływaniu dwóch cząsteczek - ligandu unieruchomionego na złożu oraz analitu obecnego np. w mieszaninie białek. Ze względu na swe właściwości chromatografia powinowactwa (CP) pozwala na uproszczenie procedury prowadzącej do pozyskiwania preparatu pożądanego białka charakteryzującego się wysokim stopniem czystości jak i aktywnością biologiczną. W metodzie CP powszechnie stosuje się tzw. metki peptydowe lub białkowe, które fuzjowane z białkami rekombinowanymi wykorzystywane są w procesie oczyszczania preparatów białkowych. Dotychczas opracowano kilka układów ligand/analit na potrzeby chromatografii powinowactwa białek rekombinowanych, przykładowo jony Ni2+/ metka histydylowa (His-Tag) czy też glutation/ transferaza S-glutationowa (GST). Rozwój metod biologii molekularnej umożliwia produkcję coraz większej liczby różnorodnych białek. Jednak uzyskanie preparatów tych białek o zadawalających parametrach nie zawsze jest możliwe przy zastosowaniu dostępnych obecnie systemów chromatografii powinowactwa. W związku z powyższym jedną z dróg dalszego rozwoju tej metody jest poszukiwanie nowych układów ligand/ metka. Jako ligandy do wiązania metek peptydowych wykorzystywane mogą być m.in. aptamery, czyli krótkie jednoniciowe cząsteczki DNA albo RNA, których długość zazwyczaj wynosi od 40 do 120 nukleotydów. Przybierają one charakterystyczną strukturę drugo- i trzeciorzędową, która umożliwia im specyficzne wiązanie substancji drobnocząsteczkowych (w tym jonów metali), peptydów, białek, a nawet całych komórek. Aptamery znajdują szerokie zastosowanie między innymi do tworzenia biosensorów, cząsteczek terapeutycznych czy też obrazowania. Jedną z metek peptydowych, której wykorzystanie do oczyszczania białek rekombinowanych z zastosowaniem chromatografii jonowymiennej zostało zaproponowane w XX wieku, jest peptyd lizylowy. Lizyna jest aminokwasem polarnym o ładunku dodatnim w pH neutralnym. Pośród atutów omawianej metki można wymienić jej zdolność do poprawy stabilności białek czy też fakt, że metkę tą z łatwością można odciąć za pomocą karboksypeptydazy C. Co więcej oligopeptyd lizylowy może być wykorzystywany także jako czynnik wspomagający przechodzenie peptydów przez błonę komórkową czy wspomagający adhezję komórek eukariotycznych i tkanek zwierzęcych do tworzyw takich jak szkło czy plastik. Co ciekawe jak do tej pory nie opracowano układu specyficznego powinowactwa ligand/ analit wykorzystującego tą metkę. W związku z powyższymi celem zrealizowanej pracy doktorskiej było opracowanie nowego układu chromatografii powinowactwa, opartego na oddziaływaniu aptamer DNA/metka lizylowa, przeznaczonego do oczyszczania białek rekombinowanych. W tym celu w pierwszym etapie badań przy pomocy metody SELEX (ang. Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) używając dwóch różnych bibliotek ssDNA (ang. single-stranded DNA, jednoniciowego DNA) przeprowadzono odpowiednią liczbę cykli selekcyjnych w celu uzyskania aptamerów DNA wiążących metkę lizylową. Przy użyciu techniki ilościowego PCR z analizą w czasie rzeczywistym (qPCR) dla każdej z dwóch przeprowadzonych selekcji zidentyfikowano pulę aptamerów, charakteryzujących się najwyższym współczynnikiem wzbogacenia względem peptydu lizylowego, którą sklonowano i następnie zsekwencjonowano. Z otrzymanych sekwencji wyłonione zostały te, które wykazywały najwyższy poziom wiązania do metki lizylowej. Aptamer o najlepszym współczynniku wzbogacenia wyselekcjonowany z biblioteki B i M nazwano odpowiednio aptamerem B7 i M13. Następnie wykazano, że obydwie wyselekcjonowane cząsteczki z wysokim powinowactwem i specyficznością wiążą analizowane białko rekombinowane połączone z metką lizylową, natomiast nie wiążą białka bez metki. W kolejnym etapie badań wykazano, że minimalna długość metki lizylowej konieczna do wydajnego wiązania badanych aptamerów wynosi 5 lizyn (5K). Skracanie wyjściowych cząsteczek aptameru B7 oraz M13 od końca 5' lub 3' pozwoliło ustalić kluczowy rejon sekwencji wyselekcjonowanych aptamerów, który jest niezbędny do wiązania metki 5K. Ostateczne (skrócone) formy aptamerów B7 i M13 nazwano odpowiednio B5K oraz M5K. Następnie, dla obydwu aptamerów, zoptymalizowano bufor wiążący metkę 5K wykazując, że do wiązania metki przez aptamer B5K niezbędna jest obecność jonów potasu. W dalszej części badań przeprowadzono charakterystykę struktury drugorzędowej badanych aptamerów techniką dichroizmu kołowego (CD). Natomiast za pomocą metody izotermicznej kalorymetrii miareczkowej wyznaczono stałą dysocjacji dla kompleksu aptamer B5K/ metka lizylowa. Z uwagi na zbyt niskie powinowactwo metki lizylowej do aptameru M5K, w porównaniu z aptamerem B5K, został on wykluczony z dalszych badań. W kolejnym etapie ustalono skład buforu umożliwiającego elucję metki lizylowej ze złoża ze zimmobilizowanym aptamerem B5K. Wykazano, że w celu destabilizacji kompleksu aptamer B5K/ metka lizylowa należy zastosować bufor pozbawiony KCl suplementowany 200 mM chlorowodorkiem guanidyny. Ostatecznie zademonstrowano, że złoże chromatograficzne ze zimmobilizowanym na powierzchni aptamerem B5K może być użyte do wielokrotnego oczyszczania białek rekombinowanych sprzęgniętych z metką lizylową, z ekstraktu białkowego uzyskanego z komórek bakterii Escherichia coli. Dodatkowo wykazano, że aptamer B5K może być używany w metodzie ELONA (ang. Enzym Linked OligoNucleotide Assay) jako narzędzie do detekcji białek zawierających metką lizylową. Podsumowując, w efekcie przeprowadzonych doświadczeń opracowano i scharakteryzowano system chromatografii powinowactwa bazujący na specyficznym oddziaływaniu pomiędzy aptamerem DNA i metką składającą się z pięciu lizyn. Wykazano, że z powodzeniem może być on wykorzystany do oczyszczania białek z metką lizylową. Ponadto udowodniono, że aptamer B5K może być wykorzystany jako narzędzie do detekcji białek z metką 5K.

Pure proteins are received by various chromatographic methods such as ion exchange, hydrophobic interaction or affinity chromatography (AC). The highest specificity possesses the last of listed adsorption chromatography method, which is based on the specific interaction between two molecules, which are ligand, immobilized on a resin, and analyte presented e.g. in a complex protein mixture. Special properties of affinity chromatography allow to simplify protein purification procedure while a purified protein keeps its native structure and activity. In AC methods so called peptide or protein tags fused with recombinant protein are often used for purification of recombinant proteins. The ligand/ analyte used in AC are for example Ni2+ ions/ histidile tag (His-Tag) or glutathione/ glutathione S-transferase. Molecular biology development enables production of various proteins. However, preparation of pure samples of these proteins is limited for example by available methods of affinity chromatography. Therefore, one of the future directions for its development is searching for new ligand/ analyte systems. Among molecules which can be used for binding of peptide/ protein tags are aptamers. They are short, single stranded DNA or RNA molecules which usually consist from 40 to 120 nucleotides. Aptamers have a unique secondary and tertiary structure, which enables specific binding of small molecules, peptides, proteins or even whole cells. What is more, they are used for many purposes among the others for biosensors, therapeutic particles or imaging. Lysyl tag is one of the peptides that was proved to be useful for purification of recombinant proteins. Lysine in neutral pH is a positively charged amino acid. The advantages of using lysyl tag result from the fact that it can stabilize a recombinant protein and can be easily removed by enzyme digestion for example using carboxypeptidase C. Recently there has been no ligand/ lysyl tag pair employing this tag, although it is used in ion exchange chromatography. Considering all above, the aim of the study was to develop a new affinity chromatography system based on the DNA aptamer/ lysyl tag interaction dedicated for purification of recombinant proteins. In the first part of the experiment a selection of DNA aptamers by SELEX method (ang. Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) was performed using two different ssDNA (single-stranded DNA) libraries. After appropriate number of selection rounds one aptamer pool from the library M and one from the library B, with the best binding to a molecular target, was cloned and sequenced. One aptamer molecule from each of the sequenced aptamer pools, with the best binding to the target, was chosen. Identified molecules selected from both libraries were named M13 and B7, respectively. These molecules bound recombinant proteins only when fused with lysyl tag. In the following experiments the minimal length of the lysyl tag was determined to be 5 lysine residues (5K). Shortening aptamers M13 and B7 from 3' and 5' ends enabled for identification of a region necessary for binding of lysine tag. Final (shortened) form of aptamer M13 and B7 were called M5K and B5K, respectively. Additionally, a composition of buffer optimal for binding between identified aptamers and lysyl tag was determined. It was found that KCl is necessary for binding of B5K aptamer to 5K tag. Structural analysis of M13 and B7 was performed by using circular dichroism. Dissociation constant of B5K/ lysyl peptide complex was also determined. Given the fact that M5K aptamer had significantly lower affinity to lysyl tag compared to B5K aptamer, further studies were conducted only on B5K. In the next step a composition of buffer, which enables elution of lysyl tag from resin with immobilised aptamer B5K was determined. It was shown that destabilisation of B5K aptamer/ lysyl tag complex occured when KCl was removed from the buffer and 200 mM of hydrochloride guanidine was added. Finally, it was demonstrated that the chromatographic resin with immobilized B5K aptamer could be used for multiple purification of recombinant proteins fused with lysyl tag from Escherichia coli crude extract. Additionally, it was proven that the aptamer B5K can be used in ELONA (Enzyme Linked OligoNucleotide Assay) method as a tool for detection of recombinant protein fused with lysyl tag. To conclude, as a result of performed experiments, for the first time, DNA aptamer specifically binding peptide tag consisted of 5 lysines was identified and characterized. It was shown that it can be used as a ligand for the purification of recombinant proteins fused with lysyl tag as well as a tool for their detection in ELONA method.